ES2555106T3 - Ensayos biológicos codificados espacialmente - Google Patents

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Abstract

Un método para determinar patrones espaciales de abundancia o de actividad o de ambos de múltiples dianas de ácido nucleico en múltiples sitios en una muestra, comprendiendo las siguientes etapas: proporcionar una muestra fijada a un soporte; administrar sondas oligonucleotídicas para múltiples dianas de ácido nucleico a los múltiples sitios en la muestra; permitir que las sondas oligonucleotídicas hibriden con las dianas de ácido nucleico; lavar las sondas oligonucleotídicas no hibridadas de la muestra; administrar agentes de codificación a localizaciones de los múltiples sitios en la muestra de acuerdo con un patrón espacial conocido, en donde al menos dos agentes codificantes se administran a cada uno de los múltiples sitios y la combinación de los agentes de codificación administrados a cada sitio es diferente; acoplar los agentes de codificación a las sondas oligonucleotídicas hibridadas a las dianas de ácido nucleico para formar sondas codificadas; determinar la totalidad o parte de una secuencia de las sondas codificadas; y asociar la abundancia o la actividad o ambas de las múltiples dianas biológicas a las localizaciones de múltiples sitios en la muestra.

Description

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DESCRIPCION
Ensayos biologicos codificados espacialmente Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a ensayos de moleculas biologicas, y mas particularmente a ensayos para determinar las distribuciones espaciales de un gran numero de moleculas biologicas en una muestra solida de manera simultanea.
Antecedentes de la invencion
En la presente discusion se describiran determinados artlculos y metodos con la finalidad introductoria y de information de antecedentes. Nada contenido en el presente documento debe entenderse como una "admision" de la tecnica anterior. El solicitante se reserva el derecho de demostrar, en los casos donde sea adecuado, que los artlculos y metodos citados en el presente documento no constituyen tecnica anterior segun las disposiciones legales aplicables.
El analisis exhaustivo de la expresion genica y el analisis de protelnas han sido herramientas utiles para entender los mecanismos de la biologla. El uso de estas herramientas ha permitido la identification de genes y protelnas implicadas en el desarrollo y en varias enfermedades, tales como el cancer y enfermedades autoinmunes. Los metodos convencionales, tales como la hibridacion in situ y otras detecciones multicanal de diferentes transcritos han revelado patrones espaciales de la expresion genica y han ayudado a arrojar luz acerca de la base molecular del desarrollo y las enfermedades. Otras tecnologlas que han posibilitado el analisis cuantitativo de muchas secuencias de ARN por muestra incluyen micromatrices (vease Shi, et al., Nature Biotechnology, 24(9): 1151-61 (2006); y Slonim y Yanai, Plos Computational Biology, 5(10):e1000543 (2009)); analisis en serie de la expresion genica (SAGE) (vease Velculescu, et al., Science, 270(5235):484-87 (1995)), implementation de alto rendimiento de la qPCR (vease Spurgeon, et al., Plos ONE, 3(2):e1662 (2008), y PcR in situ (vease Nuovo, Genome Res:, 4:151-67 (1995)). Aunque estos metodos son utiles, sin embargo, no permiten la medida simultanea de la expresion de muchos genes o la presencia y/o actividad de multiples protelnas en muchas localizaciones espaciales en una muestra. La microdiseccion de captura laser ha permitido el analisis de muchos genes en un pequeno numero de localizaciones, pero es muy extensivo, trabajoso y no se escala bien. Determinados ensayos PCR en formato 2D conservan informacion espacial (vease Armani, et al., Lab on a Chip, 9(24): 3526-34 (2009)), pero estos metodos tienen una baja resolution espacial debido a que se basan en la transferencia flsica del tejido a los pocillos, lo que tambien evita el acceso al azar a muestras de tejido y altos niveles de multiplexacion.
Actualmente no existen metodos practicos para analizar a alta resolucion los patrones de expresion espacial de grandes numeros de genes, protelnas, u otras moleculas biologicamente activas de manera simultanea. Por lo tanto hay una necesidad de mapas reproducibles, de alta resolucion espacial de moleculas biologicas en tejidos. La presente invencion aborda esta necesidad.
El documento WO 2010/019826 describe la detection y cuantificacion de moleculas diana individuales en muestras biomoleculares usando sondas nanoindicadoras estables con una senal unica detectable.
MIR KALIM et al., NUCLEIC ACIDS RESEARCH, OXFORD UNIVERSITY PRESS, R.U., vol. 37, n.° 1, 1 de enero de 2009 (01/01/2009), paginas e5-1, describen la secuenciacion mediante ligation y escision clclica (CycLiC) directamente sobre un molde capturado en una micromatriz.
Sumario de la invencion
Se proporciona este sumario para introducir una selection de conceptos de manera simplificada que se describen adicionalmente despues en la description detallada. Este sumario no tiene por objeto identificar caracterlsticas clave o esenciales de la materia objeto reivindicada, ni tampoco se preve su uso para limitar el alcance de la materia objeto reivindicada. Otras caracterlsticas, detalles, utilidades y ventajas de la materia objeto reivindicada seran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada escrita que incluye aquellos aspectos ilustrados en los dibujos adjuntos y definidos en las reivindicaciones adjuntas.
La divulgation se refiere a sistemas de ensayo que proporcionan mapas espaciales de alta resolucion de la actividad biologica en tejidos. El sistema de ensayo comprende un ensayo capaz de altos niveles de multiplexacion donde se proporcionan sondas codificadas para una muestra biologica en patrones espaciales definidos; instrumentation capaz de administrar de manera controlada el reactivo de acuerdo con los patrones espaciales; y un esquema de descodificacion que proporciona una lectura que es de naturaleza digital. En pocas palabras, la presente invencion proporciona la capacidad para observar muchas dianas biologicas en muchas localizaciones, proporcionando la resolucion de la hibridacion in situ con el analisis altamente paralelo de datos de la secuenciacion.
Por lo tanto, la invencion proporciona un metodo de acuerdo con la revindication 1 y un metodo de acuerdo con la reivindicacion 2.
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En aspectos particulares de la invention, las dianas biologicas comprenden acidos nucleicos y las sondas codificadas son oligonucleotidos, y en algunos aspectos, hay dos sondas codificadas para cada una de las multiples dianas de acido nucleico. En algunos aspectos, las multiples dianas biologicas comprenden protelnas, las regiones de sonda de las sondas codificantes son protelnas y los marcadores codificantes comprenden oligonucleotidos. En algunos aspectos, las multiples dianas biologicas comprenden enzimas. En algunos aspectos las regiones de sonda de las sondas codificadas comprenden anticuerpos, aptameros o moleculas pequenas.
Algunos aspectos del sistema de ensayo comprenden ademas una etapa de amplification entre la etapa de separation y la etapa de determination. En algunos aspectos, la etapa de determination se lleva a cabo mediante secuenciacion de acidos nucleicos, y en aspectos preferidos, la secuenciacion es secuenciacion de acido nucleico digital de alto rendimiento.
En algunos aspectos de la invencion, el producto de las multiples dianas biologicas que se estan ensayando y los multiples sitios en la muestra es mayor de 20, en algunos aspectos, el producto de las multiples dianas biologicas que se estan ensayando y los multiples sitios en la muestra es mayor de 50, en algunos aspectos, el producto de las multiples dianas biologicas que se estan ensayando y los multiples sitios en la muestra es mayor de 75, 100, 150, 500, 750, 1.000, 5.000, 10.000, 25.000, 50.000, 100.000, 500.000, o 1.000.000 o mas. En otros aspectos, se determinan en paralelo las secuencias de al menos cincuenta mil sondas codificantes, en otros aspectos se determinan en paralelo las secuencias de al menos cien mil sondas codificantes, en algunos aspectos se determinan en paralelo las secuencias de al menos quinientas mil sondas codificantes, y en algunos aspectos se determinan en paralelo las secuencias de al menos un millon, diez millones, cien millones, mil millones, diez mil millones, cien mil millones o mas sondas codificantes.
En algunos aspectos, el patron espacial conocido se determina mediante caracterlsticas histologicas de la muestra. Tambien en algunos aspectos, un equipo programado por un programa informatico efectua al menos dos etapas de la etapa de administration, la etapa de separacion, la etapa de determinacion y la etapa de asociacion.
En algunos aspectos, las regiones de sonda de las sondas codificadas son protelnas y la etapa de separacion se lleva a cabo mediante sondas codificadas que interactuan con las dianas biologicas que se esten capturando mediante un agente de captura por afinidad. En algunos aspectos, las regiones de sonda de las sondas codificantes son acidos nucleicos y la etapa de separacion se lleva a cabo mediante un lavado de la muestra.
La divulgation tambien se refiere a un sistema de ensayo para determinar patrones espaciales de abundancia o actividad o ambas de multiples dianas de protelna en multiples sitios en una muestra, donde el sistema de ensayo lleva a cabo las siguientes etapas: proporcionar una muestra fijada a un soporte; administrar sondas codificadas para las multiples dianas proteicas a los multiples sitios en la muestra con un patron espacial conocido, donde cada sonda codificada comprende una region de sonda de protelna que puede interactuar con las dianas de protelna y un marcador de codification que identifica una ubicacion del sitio al que se administro la sonda y de la region de sonda de protelna de la sonda codificante de la que forma parte el marcador codificante; permitir que las sondas codificadas interactuen con las dianas de protelna; separar las sondas codificadas que interactuan con las dianas de protelna de sondas codificadas que no interactuan con las dianas de protelna; determinar la totalidad o parte de una secuencia de las sondas codificadas mediante secuenciacion de alto rendimiento, y asociar la abundancia o actividad o ambas de las multiples dianas de protelna a las localizaciones de los multiples sitios en la muestra.
La divulgacion tambien se refiere a un sistema de ensayo para determinar patrones espaciales de abundancia o actividad o ambas de multiples dianas biologicas en multiples sitios en una muestra, donde el sistema de ensayo lleva a cabo las siguientes etapas: proporcionar una muestra fijada a un soporte; administrar sondas codificadas para las multiples dianas biologicas a los multiples sitios en la muestra con un patron espacial conocido, donde cada sonda codificada comprende una region de sonda que puede interactuar con las dianas biologicas y un marcador de codificacion que identifica una localizacion del sitio al que se administro la sonda codificada e identifica a la diana biologica; permitir que las sondas codificadas interactuen con las dianas biologicas; determinar la totalidad o parte de una secuencia de las sondas codificadas, y asociar la abundancia o actividad o ambas de las multiples dianas biologicas a las localizaciones de los sitios en la muestra.
La invencion puede utilizar diversos mecanismos de detection, basandose en las moleculas que se van a detectar y en los reactivos necesarios para dicho sistema de deteccion. Los metodos ejemplares que pueden usarse con la invencion se describen en mas detalle a continuation.
Descripcion de las figuras
La figura 1 proporciona una vision general simplificada del sistema de ensayo usando la presente.
La figura 2 proporciona una vision general simplificada de una realization de los sistemas de ensayo usando la
presente invencion para detectar acidos nucleicos.
La figura 3 es una ilustracion representativa de una realizacion del ensayo visto de manera general en la figura 2.
La figura 4 ilustra un mecanismo general para una realizacion de un esquema de codificacion combinatoria de los
sistemas de ensayo usando la invencion.
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La figura 5 proporciona un ejemplo simplificado especifico de la realizacion de un esquema de codificacion combinatoria mostrado en la figura 4.
Definiciones
Los terminos y expresiones usados en el presente documento pretenden tener el significado sencillo y convencional entendido por los expertos habituales en la materia. Las siguientes definiciones pretenden ayudar al lector en la comprension de la presente invencion, pero no pretenden variar o de otro modo limitar el significado de dichos terminos, a menos que se indique especlficamente.
El termino "anticuerpo", tal como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a una inmunoglobulina o anticuerpo completo o a cualquier fragmento funcional de una molecula de inmunoglobulina que sea capaz de unirse especlficamente a un antlgeno (los anticuerpos y antlgenos son "companeros de union", tal como se definen en el presente documento). Un "anticuerpo", tal como se usa en el presente documento, pretende incluir al anticuerpo completo as! como a cualquier fragmento de anticuerpo capaz de unirse al antlgeno o fragmento antigenico de interes. Los ejemplos de dichos peptidos incluyen moleculas de anticuerpo completas, fragmentos de anticuerpo, tales como Fab, F(ab')2, CDR, VL, VH, y cualquier otra porcion de un anticuerpo que sea capaz de unirse especlficamente a un antlgeno. Los anticuerpos para los ensayos de la invencion son inmunorreactivos o inmunoespeclficos para, Y Por lo tanto se unen especlficamente y de manera selectiva a, protelnas ya sean detectadas (es decir, dianas biologicas) o usadas para la deteccion (es decir, sondas) en los ensayos de la invencion.
La expresion "agente de union", tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier agente que se una especlficamente a una molecula biologica de interes.
"Complementaria" o "sustancialmente complementaria" se refiere a la hibridacion o emparejamiento de bases o a la formacion de un duplex entre nucleotidos o acidos nucleicos, tales como, por ejemplo, entre las dos hebras de una molecula de ADN bicatenario o entre un cebador oligonucleotldico y un sitio de union a cebador en un acido nucleico monocatenario. Los nucleotidos complementarios son, en general, A y T (o A y U), o C y G. Se dice que dos moleculas monocatenarias de ARN o ADN son sustancialmente complementarias cuando los nucleotidos de una hebra, alineados y comparados de manera optima con inserciones o deleciones de nucleotidos adecuadas, se emparejan con al menos aproximadamente el 80 % de la otra hebra, normalmente con al menos de aproximadamente el 90 % a aproximadamente el 95 %, e incluso con de aproximadamente un 98 % a aproximadamente un 100 %.
La "hibridacion" se refiere al proceso mediante el cual dos polinucleotidos monocatenarios se unen de manera no covalente para formar un polinucleotido bicatenario estable. El polinucleotido resultante (normalmente) bicatenario es un "hlbrido" o un "duplex". Las "condiciones de hibridacion" incluiran normalmente concentraciones de sal de aproximadamente menos de 1 M, a menudo de menos de aproximadamente 500 mM y pueden ser menores de aproximadamente 200 mM. Un "tampon de hibridacion" es una solucion salina tamponada, tal como SSPE al 5 %, u otros tampones similares conocidos en la tecnica. Las temperaturas de hibridacion pueden ser tan bajas como 5 °C, pero normalmente son mayores de 22 °C, y mas normalmente mayores de aproximadamente 30 °C, y normalmente superiores a 37 °C. A menudo, las hibridaciones se llevan a cabo en condiciones rigurosas, es decir, condiciones en las que un cebador hibridara con su subsecuencia diana pero no hibridara con las otras secuencias no complementarias. Las condiciones rigurosas son dependientes de secuencia y son diferentes en circunstancias distintas. Por ejemplo, los fragmentos mas largos pueden necesitar mayores temperaturas de hibridacion para una hibridacion especlfica que los fragmentos cortos. Ya que otros factores pueden afectar a la rigurosidad de la hibridacion, incluyendo la composicion de la base y la longitud de las hebras complementarias, la presencia de disolventes organicos, y el alcance del emparejamiento erroneo de bases, la combinacion de parametros es mas importante que la medicion absoluta de cualquier otro parametro de manera individual. En general, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5 °C mas bajas que la Tf para la secuencia especlfica a una fuerza ionica y pH definidos. Las condiciones rigurosas ejemplares incluyen una concentration de sal de al menos 0,01 M a no mas de 1 M de concentracion de ion sodio (o de otra sal) a un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,3 y una temperatura de al menos 25 °C. Por ejemplo, condiciones de SSPE 5x (NaCl 750 mM, fosfato de sodio 50 mM, EDTA 5 mM a pH 7,4) y una temperatura de aproximadamente 30 °C son adecuadas para hibridaciones especlficas de alelos, aunque una temperatura adecuada depende de la longitud y/o contenido de GC de la region hibridada.
"Ligadura" significa formar un enlace o engarce covalente entre los extremos de dos o mas acidos nucleicos, por ejemplo, oligonucleotidos y/o polinucleotidos, en una reaction dirigida por molde. La naturaleza del enlace o engarce puede variar ampliamente y la ligadura puede llevarse a cabo enzimatica o qulmicamente. Tal como se usa en el presente documento, las ligaduras se llevan a cabo normalmente de manera enzimatica para formar un engarce fosfodiester entre un nucleotido terminal de carbono 5' de un nucleotido con un carbono 3' de otro nucleotido.
"Acido nucleico", "oligonucleotido", "oligo" o los equivalentes gramaticales usados en el presente documento se refieren generalmente a al menos dos nucleotidos unidos covalentemente entre si. Un acido nucleico contendra generalmente enlaces fosfodiester, aunque en algunos casos pueden incluirse analogos de acido nucleico que tengan armazones alternativos, tales como de engarces de fosforamidita, fosforoditioato, o de metilfosforamidita; o armazones
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y engarces de acidos peptidonucleicos. Otros acidos nucleicos analogos incluyen aquellos con estructuras biciclicas, incluyendo acidos nucleicos bloqueados, armazones positivos, armazones no ionicos y armazones sin ribosa. Pueden efectuarse modificaciones del armazon ribosa-fosfato para aumentar la estabilidad de las moleculas; por ejemplo, los hlbridos APN:ADN pueden mostrar mayor estabilidad en algunos ambientes.
"Cebador" significa un oligonucleotido, ya sea natural o sintetico, que es capaz, tras formar un duplex con un molde polinucleotldico, de actuar como punto de inicio de la slntesis de acido nucleico y de extenderse desde su extremo 3' a lo largo del molde de tal forma que se forma un duplex extendido. La secuencia de nucleotidos anadida durante el proceso de extension se determina mediante la secuencia del polinucleotido de molde. Normalmente se extienden los cebadores mediante una ADN polimerasa.
El termino "SNP" o la expresion "polimorfismo de un solo nucleotido" se refiere a una variacion genetica entre individuos; por ejemplo, una sola posicion de base nitrogenada en el ADN de organismos que es variable. Los SNP se encuentran por todo el genoma; gran parte de la variacion genetica entre individuos se debe a variaciones en locus de SNP, y esta variacion genetica da a menudo como resultado una variacion fenotlpica entre individuos. Los SNP para su uso en la presente invencion y sus alelos respectivos pueden proceder de cualquier numero de fuentes, tales como bases de datos publicas (U.C. Santa Cruz Human Genome Browser Gateway (
http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway) o el sitio web dbSNP del NCBI (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/), o pueden determinarse experimentalmente tal como se describe en la Patente de Estados unidos n.° 6.969.589; y en la Publication de Estados Unidos n.° 2006/0188875 titulada "Human Genomic Polymorphisms". Aunque se describe el uso de SNP en algunas de las realizaciones presentadas en el presente documento, se entendera que tambien puedan usarse otros marcadores geneticos bialelicos o multialelicos. Un marcador genetico bialelico es uno que tiene dos formas polimorficas, o alelos. Tal como se ha mencionado anteriormente, para un marcador genetico bialelico que esta asociado con un rasgo, el alelo que es mas abundante en la composition genetica de un grupo de caso en comparacion con un grupo de control se denomina el "alelo asociado" y el otro alelo puede citarse como el "alelo no asociado". Por lo tanto, para cada polimorfismo bialelico que esta asociado con un rasgo dado (por ejemplo, una enfermedad o una respuesta a farmaco), hay un alelo asociado correspondiente. Otros polimorfismos bialelicos que pueden usarse con los metodos presentados en el presente documento incluyen, pero sin limitation, cambios multinucleotido, inserciones, eliminaciones, y traslocaciones. Se apreciara ademas que las referencias a ADN en el presente documento pueden incluir ADN genomico, ADN mitocondrial, ADN episomico, y/o derivados de ADN, tales como amplicones, transcritos de ARN, ADNc, analogos de ADN, etc. Los locus polimorficos que se exploran en un estudio de asociacion pueden ser en un estado diploide o haploide y, de manera ideal, seran de sitios a lo largo del genoma.
Las expresiones "se une de manera selectiva", "union selectiva" y similares, tal como se usan en el presente documento, cuando se refieren a un companero de union (por ejemplo, protelna, acido nucleico, anticuerpo u otro agente de captura por afinidad, etc.), se refiere a una reaction de union de dos o mas companeros de union con alta afinidad y/o complementariedad para asegurar una hibridacion selectiva en condiciones de ensayo determinadas. Normalmente, la union especlfica sera al menos tres veces la desviacion estandar de la senal de fondo. Por lo tanto, en condiciones determinadas, el companero de union se une a su molecula "diana" particular y no se une en una cantidad significativa a otras moleculas presentes en la muestra.
"Secuenciacion", "determination de secuencia" y similares significan la determination de la information relacionada con la secuencia de bases nucleotldicas de un acido nucleico. Dicha informacion puede incluir la identification o determinacion de informacion de secuencia parcial as! como total del acido nucleico. La informacion de secuencia puede determinarse con diversos grados de fiabilidad o confianza estadlstica. En un aspecto, el termino incluye la determinacion de la identidad y orden de una diversidad de nucleotidos contiguos en un acido nucleico. La "secuenciacion digital de alto rendimiento" o la "secuenciacion de ultima generacion" significa determinacion de secuencia usando metodos que determinan muchas (normalmente de miles a miles de millones) de secuencias de acido nucleico de una manera intrlnsecamente paralela, es decir, donde se preparan moldes de ADN para su secuenciacion no de uno en uno, sino en un proceso por lotes, y donde se leen muchas secuencias preferentemente en paralelo, o como alternativa usando un proceso en serie de ultra-alto rendimiento que en si puede disponerse en paralelo. Dichos metodos incluyen, pero sin limitacion, pirosecuenciacion (por ejemplo, tal como se comercializa por 454 Life Sciences, Inc., Branford, cT); secuenciacion mediante ligadura (por ejemplo, tal como se comercializa en la tecnologla SOLiD™, Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA); secuenciacion mediante slntesis usando nucleotidos modificados (tal como se comercializa en la tecnologla TruSeq™ y HiSeq™ de Illumina, Inc., San Diego, CA, HeliScope™ de Helicos Biosciences Corporation, Cambridge, MA, y PacBio RS de Pacific Biosciences of California, Inc., Menlo Park, CA), secuenciacion mediante tecnologlas de detection de iones (Ion Torrent, Inc., South San Francisco, CA); secuenciacion de nanobolas de ADN (Complete Genomics, Inc., Mountain View, CA); tecnologlas de secuenciacion basadas en nanoporos (por ejemplo, tal como se han desarrollado por Oxford Nanopore Technologies, LTD, Oxford, R. U.), y metodos de secuenciacion dispuestos en paralelo altamente similares.
El termino "Tf" se usa en referencia a la "temperatura de fusion". La temperatura de fusion es la temperatura a la cual una poblacion de moleculas de acido nucleico bicatenario se disocia a la mitad en hebras individuales. Se conocen bien en la tecnica varias ecuaciones para calcular la Tf de acidos nucleicos. Tal como se indica por las referencias convencionales, se calcula una estimation sencilla del valor de Tf mediante la ecuacion Tm=81,5+0,41 ( % G+C),
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cuando un acido nucleico se encuentra en solucion acuosa con NaCI 1 M (vease, por ejemplo, Anderson y Young, Quantitative Filter Hybridization, en Nucleic Acid Hybridization (1985)). Otras referencias (por ejemplo, Allawi y SantaLucia, Jr., Biochemistry, 36:10581-94 (1997)) incluyen metodos alternativos de imputacion que tienen en cuenta caracterlsticas estructurales y ambientales as! como de secuencia para el calculo de la Tf.
Descripcion detallada de la invencion
La practica de las tecnicas descritas en el presente documento puede emplear, salvo que se indique lo contrario, tecnicas y descripciones convencionales de qulmica organica, tecnologla de pollmeros, biologla molecular (incluyendo tecnicas recombinantes), biologla celular, bioqulmica, y tecnologla de secuenciacion que se encuentran dentro de las capacidades de los expertos en la materia. Dichas tecnicas convencionales incluyen slntesis de matrices polimericas, hibridacion y ligadura de polinucleotidos, y deteccion de la hibridacion usando un marcador. Pueden obtenerse ilustraciones especlficas de tecnicas adecuadas por referencia a los ejemplos en el presente documento. Sin embargo, se pueden usar, por supuesto, otros procedimientos convencionales equivalentes. Dichas tecnicas y descripciones convencionales pueden encontrarse en manuales de laboratorio convencionales tales como Green, et al., Eds., Genome Analysis: A Laboratory manual Series (Vol. I-IV) (1999); Weiner, Gabriel, Stephens, Eds., Generic Variation: A Laboratory Manual (2007); Dieffenbach, Dveksler, Eds., pGr Primer: A Laboratory Manual (2003); Bowtell y Sambrook, DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual (2003); Mount, Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis (2004); Sambrook y Russell, Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2006); y Sambrook y Russell, Molecular Cloning: Laboratory Manual (2002) (todos de Cold Spring Harbour Laboratory Press); Stryer, Biochemistry (4a Ed.) (1995) W.H. Freeman; Nueva York, N. Y.; Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" (2002) IRL Press, Londres; Nelson y Cox, Lehninger. Principles of Biochemistry (2000) 3a Ed., W. H. Freeman Pub., Nueva York, N.Y.; y Berg, et al., Biochemistry (2002) 5a Ed., W.H. Freeman Pub., Nueva York, N.Y.
Cabe destacar que tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas del singular "un", "una" y "el" o "la" incluyen referencia en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un acido nucleico" se refiere a uno o mas acidos nucleicos, y la referencia a "el ensayo" incluye la referencia a etapas y metodos equivalentes conocidos para los expertos en la materia, y as! sucesivamente.
A menos que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientlficos utilizados en este documento tienen el mismo significado que el normalmente entendido por un experto habitual en la materia a la cual pertenece esta invencion.
En los casos donde se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio entre el llmite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor indicado o intermedio en dicho intervalo indicado esta abarcado en la invencion. Los llmites superiores e inferiores de estos intervalos mas pequenos pueden incluirse independientemente en los intervalos mas pequenos, y tambien estan abarcados en la invencion, salvo cualquier llmite excluido especlficamente en el intervalo indicado. En los casos donde el intervalo indicado incluya uno o ambos llmites, los intervalos que excluyan a cualquiera de estos llmites incluidos estan tambien incluidos en la invencion.
En la siguiente descripcion, se exponen numerosos detalles especlficos para proporcionar una comprension mas exhaustiva de la presente invencion. Sin embargo, sera evidente para los expertos en la materia que la presente invencion puede ponerse en practica sin uno o mas de estos detalles especlficos. En otros casos, no se han descrito caracterlsticas y procedimientos bien conocidos para los expertos en la materia con el fin de no oscurecer la invencion.
La invencion en general (La invencion se define en las reivindicaciones.)
La invencion se refiere a ensayos multiplexados codificados espacialmente que comprenden 1) un ensayo capaz de altos niveles de multiplexacion con un esquema de codificacion espacial eficaz; 2) instrumentacion capaz de suministrar reactivos de acuerdo con un patron espacial; y 3) descodificacion determinada mediante una lectura que es de naturaleza digital. Los sistemas de ensayo detectan la presencia o ausencia y la cantidad relativa de una diana biologica o actividad biologica indicativa de una diana biologica, as! como la localizacion de la diana biologica o la actividad en una muestra biologica, por ejemplo, una seccion de tejido u otra estructura biologica dispuesta sobre un soporte, tal como un portaobjetos de microscopla o una placa de cultivo.
El sistema de ensayo proporciona ademas instrumentacion con capacidad para administrar reactivos con un patron espacialmente definido. Esta instrumentacion, junto con programas informaticos, reactivos y protocolos, proporciona un componente clave del sistema de ensayo altamente innovador, permitiendo medir numerosas dianas o actividades biologicas en un ambiente espacial significativo, incluyendo la expresion genica y la localizacion del peptido. Un esquema de codificacion usado en estos sistemas de ensayo permiten determinar la localizacion o actividad de dianas biologicas (o la ausencia de las mismas en las muestras biologicas despues de que se hayan retirado los productos del ensayo multiplexado de la muestra biologica y se hayan agrupado para su analisis). La descodificacion del esquema de codificacion puede efectuarse mediante, por ejemplo, secuenciacion de ultima generacion, que proporciona facilmente de millones a miles de millones de puntos de datos a bajo coste. Los resultados del ensayo, tales como la cantidad o actividad de dianas biologicas, pueden volver a mapearse a una localizacion especlfica en la muestra
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biologica. Los sistemas de ensayo abren una nueva ventana analltica hacia los complejos patrones espaciales de la funcion y regulacion celular en muestras biologicas.
En la figura 1 se proporciona una vista general simplificada del sistema 100 de ensayo usando la presente invencion. En la etapa 110, se proporciona una muestra biologica fijada a un soporte. La muestra biologica contiene dianas biologicas de interes. Las dianas biologicas pueden incluir cualquier molecula de interes, tal como acidos nucleicos (incluyendo, por ejemplo, transcritos de ARN, secuencias de ADN genomico, ADNc, amplicones, u otras secuencias de acido nucleico) y protelnas, enzimas y similares. En la etapa 120, se suministran sondas codificadas a la muestra biologica de acuerdo con un patron espacial. Las sondas codificadas comprenden sondas que pueden interactuar con dianas biologicas de interes, y marcadores de codificacion, que identifican las posiciones en la muestra de las dianas biologicas que se estan ensayando, y por lo tanto pueden usarse para vincular los resultados del ensayo de nuevo a las localizaciones en la muestra. Los marcadores de codificacion en la mayorla de realizaciones son oligonucleotidos. Sin embargo, los marcadores de codificacion tambien pueden ser marcadores de masa, marcadores fluorescentes, u otros restos.
En algunas realizaciones, las porciones de sonda y marcador de codificacion de la sonda codificada se acoplan previamente antes de administrarse a la muestra biologica. Por ejemplo, en el caso donde las sondas codificadas son oligonucleotidos, tanto la sonda como la secuencia de marcador de codificacion pueden sintetizarse como un solo oligonucleotido. Como alternativa, la sonda y las porciones de marcador de codificacion de las sondas de codificacion pueden sintetizarse u obtenerse por separado y combinarse antes de la administracion a la muestra biologica (por ejemplo, pueden sintetizarse dos oligonucleotidos separados y acoplarse mediante, por ejemplo, ligadura; o pueden prepararse un anticuerpo y un oligonucleotido por separado y combinarse antes de la administracion a la muestra biologica). Asimismo, tal como se describe en las figuras 2-5, las sondas y los marcadores de codificacion (en oligonucleotidos codificantes) se sintetizan por separado, y se administran a la muestra biologica en diferentes etapas (por ejemplo, en primer lugar las sondas y posteriormente los marcadores de codificacion, o vice versa) del ensayo.
En la etapa 130, se deja que las sondas codificadas reacciones o interaction con las dianas biologicas, es decir, se proporcionan condiciones para permitir, por ejemplo, que los oligonucleotidos hibriden con dianas de acido nucleico, que las dianas catalicen reacciones con dianas de protelna, que los anticuerpos se unan a epltopos, etc. En el caso donde las dianas biologicas son acidos nucleicos, las sondas codificadas son normalmente oligonucleotidos e hibridan con los acidos nucleicos diana. En caso de que las dianas biologicas sean protelnas, las sondas codificadas son normalmente aptameros, moleculas pequenas, o protelnas conjugadas a oligonucleotidos que interaction con protelnas diana uniendose a ellas o reaccionando con ellas (es decir, una de las protelnas es un sustrato para la otra). Los oligonucleotidos codificantes pueden acoplarse a las sondas (protelnas) mediante conjugacion, reticulacion qulmica o fotonica mediante grupos adecuados y similares.
Una vez han interactuado las sondas codificadas con las dianas biologicas, las sondas codificadas que interactuaron con las dianas biologicas tienen que separarse de las sondas codificadas que no interactuaron con las dianas biologicas en la etapa 140. En el caso donde las dianas biologicas sean acidos nucleicos y las sondas codificadas sean oligonucleotidos, la separacion puede lograrse mediante, por ejemplo, el lavado de las sondas codificadas no hibridadas de la muestra. De manera similar, para otros ensayos que se basan en la union por afinidad, incluyendo aquellos que usan sondas de aptamero, molecula pequena, y de protelna, pueden usarse etapas de lavado para eliminar moleculas de union de baja afinidad. En el caso donde la sonda se transforme mediante interaccion con la diana, por ejemplo, en el caso de un peptido, por ejemplo, mediante escision por una proteasa o fosforilacion mediante una cinasa, es conveniente recoger todas las sondas codificadas, tanto las sondas codificadas que interactuaron con las dianas biologicas y que se transformaron como las sondas codificadas que no se transformaron. Despues de la recogida o agrupamiento, puede usarse un anticuerpo u otro agente de captura por afinidad para capturar sondas que se transformaron mediante la adicion de un resto (por ejemplo, un grupo fosfato). En los casos donde las sondas se han transformado mediante escision, pueden separarse las sondas transformadas, por ejemplo, mediante la captura de las sondas no transformadas mediante un marcador que se retira de las sondas transformadas durante la transformacion (por ejemplo, mediante escision), o anadiendo un nuevo marcador en el sitio de escision.
Una vez que las sondas codificadas que han reaccionado (transformadas) o interactuado se separan de las sondas codificadas que no han reaccionado o interactuado, se determina la secuencia de las sondas codificadas que han reaccionado y/o interactuado mediante, preferentemente, secuenciacion. La secuencia de las sondas codificadas permite el mapeo de los resultados de ensayo de nuevo a localizaciones en la muestra biologica.
La figura 2 proporciona una vision general simplificada de un sistema de ensayo usando la presente invencion que realiza una implementacion eficaz de un esquema de codificacion combinatoria para la codificacion de la informacion espacial. Para los fines de esta vision general, las sondas son oligonucleotidos, pero tal como se explica en otras partes, tambien pueden usarse otros tipos de sondas. En la etapa 210, se proporciona una muestra biologica fijada a un soporte, por ejemplo, una muestra de tejido u otra estructura biologica. En la etapa 220 se suministran una o mas sondas oligonucleotldicas a la muestra biologica, donde las sondas oligonucleotldicas son capaces de hibridar con dianas biologicas en la muestra biologica. En la etapa 230, se deja que las sondas oligonucleotldicas interaction con (hibriden con) dianas de acido nucleico; es decir, se proporcionan condiciones adecuadas donde las sondas oligonucleotldicas pueden hibridar con los acidos nucleicos diana.
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En la etapa 240, se retiran las sondas oligonucleotidicas que no hibridan con acidos nucleicos diana, y de este modo se separan de las sondas oligonucleotidicas que hibridaron con acidos nucleicos diana. En esta realizacion, la separacion puede efectuarse mediante, por ejemplo, lavado de la muestra y eliminacion de las sondas oligonucleotidicas no hibridadas. A continuacion, en la etapa 250, los oligonucleotidos codificantes (los agentes codificantes) se administran a la muestra biologica de acuerdo con un patron espacial seleccionado, donde los oligonucleotidos codificantes comprenden marcadores de codificacion que se usan para codificar la localizacion de las dianas biologicas en la muestra biologica. Notese que a diferencia del sistema de ensayo en la figura 1, en este caso las sondas y los agentes codificantes (oligonucleotidos codificantes) se administran en etapas separadas. En la etapa 260, los oligonucleotidos codificantes se acoplan a las sondas oligonucleotidicas para crear sondas codificadas. En este caso donde las sondas son oligonucleotidos, los oligonucleotidos codificantes pueden acoplarse a las sondas oligonucleotidicas mediante, por ejemplo, ligadura. Como alternativa, puede transferirse la informacion en los oligonucleotidos codificantes usando una ADN polimerasa para extender una sonda oligonucleotidica que actua como cebador, y de este modo copiar e incorporar la secuencia de los oligonucleotidos codificantes.
En la etapa 270, se determina la secuencia de los marcadores de codificacion en las sondas codificadas asi como la secuencia o una parte de la secuencia de la sonda en si, y en la etapa 280, se vuelven a mapear los acidos nucleicos en la muestra biologica. En algunas realizaciones, la abundancia de secuencias revela la cantidad relativa de dianas biologicas en la localizacion. Aunque esta realizacion muestra las etapas individuales en un orden concreto, para explicar mejor la invencion, puede variarse el orden de las etapas. Por ejemplo, pueden combinarse las etapas 220 y 250, de tal forma que se administra una mezcla de las sondas y oligonucleotidos de acuerdo con un patron espacial seleccionado. La etapa de acoplamiento 260 puede llevarse a cabo entonces inmediatamente despues de las etapas combinadas 220 y 250, o de manera concomitante con estas. En este caso, la etapa 240 puede tener lugar despues de la etapa 260. Por lo tanto puede apreciarse que los dos resultados clave de esta serie de etapas, es decir, la codificacion especifica de localizacion de las moleculas de sonda y la separacion de moleculas de sonda basandose en su capacidad para interactuar con las moleculas diana correspondientes, puede lograrse con cierta flexibilidad en la implementacion de las etapas concretas. De manera similar, hay una flexibilidad considerable en el diseno del esquema de codificacion. Tal como se describe mas adelante, los ensayos de la invencion son particularmente susceptibles a metodos combinatorios.
Por lo tanto, la presente invencion proporciona una capacidad para observar muchas dianas biologicas diferentes en muchas localizaciones, proporcionando la resolucion de la hibridacion in situ con el analisis altamente paralelo de datos de la secuenciacion. En algunas realizaciones, la suma de las multiples dianas biologicas que se estan ensayando y los multiples sitios en la muestra biologica es mayor de 20, en otras realizaciones, la suma de las multiples dianas biologicas que se estan ensayando y los multiples sitios en la muestra biologica es mayor de 50, en otras realizaciones, la suma de las multiples dianas biologicas que se estan ensayando y los multiples sitios en la muestra biologica es mayor de 100, mayor de 500, 1.000, 10.000, 25.000, 100.000, 500.000, 1.000.000. Se apreciara que, debido a la dimension de codificacion espacial de la invencion, pueden contemplarse numeros incluso mas grandes. Por ejemplo, el ensayo de 10.000 dianas por localizacion x 10.000 localizaciones podria generar 108 ensayos diferentes, y pueden contemplarse facilmente numeros incluso mayores que estos, particularmente si se usan localizaciones espaciales con resolucion en el orden de las celulas individuales. Ademas, en realizaciones donde se emplea secuenciacion digital de alto rendimiento, se determinan en paralelo normalmente las secuencias de al menos
1.000 sondas codificantes. Mas normalmente, usando una lectura digital, es deseable obtener multiples lecturas de secuencia para cada ensayo (definidas mediante una sonda y un codigo de localizacion espacial). Es deseable obtener una media de al menos 3 copias por ensayo, y mas normalmente de al menos 10 o al menos 30 copias por ensayo, dependiendo del diseno del experimento y de las necesidades del ensayo. Para una lectura cuantitativa con un intervalo dinamico adecuado, puede ser deseable obtener al menos 1.000 lecturas por ensayo. Por lo tanto, si se llevan a cabo 1.000.000 de ensayos, el numero de lecturas de secuencia puede ser de 1.000 millones o mas. Con la secuenciacion digital de alto rendimiento, y permitiendo redundancia, se determinan las secuencias de al menos
10.000 sondas codificantes en paralelo o se determinan las secuencia de al menos 100.000, 500.000, 1.000.000, 10.000.000, 100.000.000, 1.000.000.000 o mas sondas codificantes en paralelo.
Ensayos
La parte de ensayo de los sistemas de ensayo comprende las siguientes etapas generales: administrar las sondas y agentes codificantes donde los agentes codificantes, (en algunas realizaciones acoplados previamente a las sondas) se administran a la muestra de acuerdo con un patron espacial conocido, permitiendo que las sondas interactuen o reaccionen con dianas biologicas en la muestra, y, si no se han acoplado previamente las sondas y los agentes codificantes, acoplando los agentes codificantes a las sondas.
Las muestras incluyen virtualmente cualquier muestra biologica o muestras que pueden fijarse a un soporte o proporcionarse esencialmente de un modo bidimensional, donde es importante la capacidad para anclar una diana biologica ensayada o una actividad de nuevo a la localizacion dentro de la muestra biologica. Las muestras biologicas ejemplares incluyen secciones de tejido (por ejemplo, incluyendo secciones completas de animales y biopsias de tejido), poblaciones de celulas en portaobjetos o placas de cultivo, y similares. Los sistemas de ensayo son particularmente ventajosos en tanto que son compatibles con numerosos tipos de muestra biologica, incluyendo
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muestras frescas, tales como secciones de tejido primario, y muestras conservadas (incluyendo, pero sin limitacion, muestras congeladas y muestras fijadas en paraformalina, incluidas en parafina (FFPE). Un aspecto importante de los sistemas de ensayo es que las muestras biologicas se inmovilizan sobre una superficie de sustrato que tiene areas discretas, medibles de manera independiente.
Las dianas biologicas que se van a detectar pueden ser cualquier molecula biologica incluyendo, pero sin limitacion, protelnas, acidos nucleicos, llpidos, hidratos de carbono, iones, o complejos multicomponente que contienen cualquiera de los anteriores. Los ejemplos de dianas subcelulares incluyen organulos, por ejemplo, mitocondrias, aparato de Golgi, retlculo endoplasmatico, cloroplastos, veslculas de endocitosis, veslculas de exocitosis, vacuolas, lisosomas, etc.
En algunas realizaciones particulares, el sistema de ensayo se usa para analizar acidos nucleicos, por ejemplo, mediante genotipado, cuantificacion del numero de copias de ADN o de transcritos de ARN, localizacion de transcritos concretos dentro de las muestras, y similares. La figura 3 ilustra un esquema general para un ensayo ejemplar para, por ejemplo, detectar polimorfismos de nucleotidos individuales (SNP) que pueden usarse con el sistema de ensayo. En la figura 3, se proporcionan dos sondas oligonucleotldicas. Cada sonda oligonucleotldica comprende una region especlfica de diana (situada a cada lado del SNP que va a analizarse) observada en 305 y 307, y las regiones de ligadura, observadas en 301 y 303. Se deja que las sondas oligonucleotldicas hibriden con un acido nucleico diana (no mostrado) en la muestra biologica. En la etapa 302, se extiende una de las sondas oligonucleotldicas para que incorpore la secuencia del SNP y se liga a la otra sonda para formar una sonda extendida que comprende la region 309 de acido nucleico diana y las regiones 301 y 303 de ligadura.
Dos agentes codificantes, comprendiendo cada uno un marcador de codificacion (observado en 315 y 317), una region de ligadura (observada en 311 y 313) y una region de cebador (observada en 319 y 321) se combinan con y se ligan a la sonda extendida en la etapa 304 para formar un oligonucleotido especlfico de diana codificado. De nuevo, a diferencia de la figura 1, las sondas y los agentes codificantes se administran en etapas separadas. Hacer eso permite el uso de las realizaciones combinatorias descritas mas adelante. En realizaciones preferidas, los oligonucleotidos codificantes en un par de oligonucleotidos codificantes se ligan especlficamente a un lado de la secuencia diana o de la otra (es decir, en 5' o 3' de la secuencia diana). Asimismo, normalmente, las regiones de ligadura y de cebador de los oligonucleotidos y sondas codificantes son universales; es decir, el conjunto de regiones de ligadura y cebador usadas para construir las sondas y oligonucleotidos codificantes es constante, y solo difieren las regiones especlficas de diana de las sondas y los marcadores de codificacion de los oligonucleotidos codificantes. Sin embargo, de nuevo en realizaciones alternativas, las regiones de ligadura y de cebador no son universales y difieren entre sondas y agentes codificantes.
Despues de la ligadura, se eluyen las sondas codificantes, se agrupan, y, opcionalmente, se anaden adaptadores de secuenciacion a las sondas codificantes mediante PCR. En realizaciones alternativas, pueden ligarse cebadores de secuenciacion a los oligonucleotidos codificantes, o pueden incluirse secuencias de cebador de secuenciacion como parte del oligonucleotido codificante. Tal como se observa en la figura 3, cada adaptador de secuenciacion comprende la region 319 o 321 de cebador, compatible con las regiones 319 y 321 de cebador en las sondas codificadas. La construccion final que comprende el primer adaptador 327, la primera region de cebador 319, el primer marcador de codificacion 315, las regiones 311 y 301 de ligadura, la region diana 309, las regiones 313 y 303 de ligadura, el segundo marcador de codificacion 317, la segunda region 325 de cebador y el segundo adaptador 329 esta ahora preparado para la entrada en un proceso de secuenciacion digital de alto rendimiento.
En la figura 3 se ejemplifica una combinacion de reacciones de extension y de ligadura, pero debe apreciarse que pueden usarse una diversidad de reacciones para acoplar los oligonucleotidos codificantes a los oligonucleotidos especlficos de diana, incluyendo unicamente ligadura (por ejemplo, para oligonucleotidos que hibridan con porciones contiguas de la secuencia de acido nucleico diana). Como alternativa, puede emplearse un ensayo que utilice un oligonucleotido adicional, tal como en el ensayo GOLDENGATE® (vease Fan, et al., Cold Spring Symp. Quant. Biol., 68:69-78 (2003); (Illumina, Inc., San Diego, cA)).
En otras realizaciones, tambien puede usarse el sistema de ensayo para analizar peptidos o protelnas, la presencia de anticuerpos, actividades enzimaticas o de otras protelnas, modificaciones postraduccionales, formas activas y no activas de peptidos, as! como isoformas de peptidos en una muestra biologica. Por consiguiente, las sondas pueden comprender una region activa de una enzima, un dominio de union de una inmunoglobulina, dominios de protelnas definidos, protelnas completas, peptidos sinteticos, peptidos con mutaciones introducidas, aptameros y similares.
En determinados aspectos, las sondas son sustratos para enzimas o proenzimas, por ejemplo, cinasas, fosfatasas, zimogenos, proteasas, o fragmentos de las mismas. En determinados aspectos, las sondas son sustratos de fosforilacion usados para detectar protelnas implicadas en una o mas rutas de transduccion de senales, por ejemplo, una cinasa o una fosfatasa. En otra estrategia especlfica, las sondas son sustratos de proteasas especlficos que se asocian unicamente con proteasas individuales o clases de proteasas. En otras estrategias, las sondas son diferentes formas procesadas, isoformas y/o dominios de una enzima. Las sondas basadas en protelnas estan normalmente conjugadas o de otro modo ligadas a agentes codificantes de oligonucleotidos. Los agentes codificantes de oligonucleotidos en este caso tambien podrlan incluir un componente de secuencia nucleotldica que permita la
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identification de la sonda de protelna.
En determinados aspectos, la presente invention proporciona ensayos para evaluar diferencias en la cantidad y/o actividad de dianas biologicas entre diferentes localizaciones en una muestra y/o entre muestras. El metodo incluye determinar una diversidad de resultados codificados de la muestra biologica y evaluar las diferencias en cantidad de las dianas biologicas en cada localization en la muestra biologica.
Realizaciones combinatorias
Para maximizar la eficacia de la codification, puede usarse una estrategia combinatoria que usa pares de marcadores de codification en los oligonucleotidos codificantes. Al desacoplar la information especlfica de diana y los marcadores de codification, se reduce dramaticamente el numero de oligonucleotidos necesario, con la consiguiente disminucion de los costes.
La figura 4 ilustra un mecanismo general para una realization de un esquema de codification combinatorio de la invention, donde se ensayan acidos nucleicos en una section de tejido representativa (mostrada en 416). La figura 4 muestra en A dos construcciones de oligonucleotido especlfico de diana/codificante 420 y 422 (por ejemplo, formado entre las etapas 302 y 304 de la figura 3) unidas especlficamente a un acido nucleico diana 402 de interes. La primera sonda codificada 420 comprende el marcador 408 de codification asociado con, por ejemplo, un sitio de cebado universal para la amplification de los productos de ensayo o un adaptador para permitir la identification de los identificadores de codification usando tecnologlas de secuenciacion 404. La segunda sonda codificada 422 comprende el marcador 406 de codification asociado con, por ejemplo, un sitio de cebado universal para la amplification de los productos de ensayo o un adaptador para permitir la identification de los identificadores de codification usando tecnologlas de secuenciacion 4l0.
La figura 4 muestra en B el patron espacial que puede usarse para veinte marcadores de codification diferentes, al a a10 (marcador 406 de codification en la sonda codificada 420) y b1 a b10 (marcador 408 de codification en la sonda codificada 422). El marcador codificante a1, por ejemplo, se deposita sobre la muestra biologica en diez areas o puntos discretos (mostrados como la primera llnea horizontal de puntos en 412). El marcador de codification a2 se deposita sobre la muestra biologica en diez puntos sobre la segunda llnea horizontal en 412. El marcador de codification a3 se deposita sobre la muestra biologica en diez puntos sobre la tercera llnea horizontal en 412, y as! sucesivamente. Mientras que los marcadores "a" se depositan en diez filas horizontales, los marcadores "b" se depositan en tres filas verticales, tal como se muestra en 414. Por ejemplo, el marcador de codification b1 se deposita sobre la muestra biologica en diez puntos discretos en la primera fila vertical de 414, el marcador de codification b2 se deposita sobre la muestra biologica en diez puntos discretos en la segunda fila vertical de 414, y as! sucesivamente. El uso de dicha configuration permite que veinte marcadores de codification definan de manera unica 100 localizaciones diferentes sobre la muestra biologica.
La figura 4 muestra en c una section de tejido 416 representativa coincidente con la cuadrlcula 418 del marcador de codification. Las flechas muestran como los marcadores de codification "a" y los marcadores de codification "b" se depositan sobre la cuadrlcula 418 que es coincidente con la section de tejido 416. Si, una vez secuenciados, los marcadores de codification a1 y b4, por ejemplo, se asocian con una secuencia de acido nucleico diana, entonces esta secuencia de acido nucleico diana (es decir, diana biologica) estaba presente en la section de tejido en la localization a1, b4.
La figura 5 proporciona un ejemplo especlfico simplificado del esquema de codification de los sistemas de ensayo usando la invention. La figura 5 muestra los oligonucleotidos codificantes 510, que comprenden a1, a2, a3, a4 y b1, b3, b3 y b4. Los oligonucleotidos especlficos de diana (TSO) (sondas) 1 y 2 se muestran en 520. Se muestra un esquema de deposito o de dispersion en 530. Al igual que la cuadrlcula ejemplificada en la figura 4, los oligonucleotidos codificantes a1 a a4 se depositan en puntos en un patron (en este caso, en un patron vertical), y los oligonucleotidos codificantes b1 a b4 se depositan en puntos en un patron (en este caso, un patron horizontal). La cuadrlcula, aunque se muestra como un cuadrado con puntos, es realmente un patron de deposition sobre una muestra biologica (no mostrada), tal como la section de tejido 416 mostrada en la figura 4.
Los oligonucleotidos especlficos de diana se administran a la muestra biologica, donde los oligonucleotidos especlficos de diana hibridan con acidos nucleicos diana en la muestra biologica si estan presente los acidos nucleicos diana. Entonces se eliminan los oligonucleotidos especlficos de diana no hibridados, por ejemplo, mediante lavado. Los oligonucleotidos codificantes se administran entonces a la muestra biologica de acuerdo con el patron espacial mostrado en 530. Se ligan los oligonucleotidos codificantes (o, por ejemplo, se extienden y ligan) a cualquier oligonucleotido especlfico de diana que hibrido con el acido nucleico diana en la muestra biologica, y despues las construcciones ligadas se eluyen de la muestra biologica, se agrupan, y se anaden adaptadores de secuenciacion mediante, por ejemplo, PCR o ligadura, si no se hablan incluido las secuencias previamente en los oligonucleotidos codificantes. Las construcciones ligadas se secuencian mediante, por ejemplo, secuenciacion de alto rendimiento o de "ultima generacion".
El grupo de secuencias resultante se muestra en 540. Se obtuvo una lectura de secuencia para el oligonucleotido especlfico de diana 1 solo en a4b1, a4b2, a1b3, a2b3, a3b3, a4b3 y a4b4 (posiciones mostradas con llneas
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horizontales). Se obtuvo una lectura de secuencia para el oligonucleotido especifico de diana 2 solo en a1 b1 (posicion mostrada con llneas verticales). Se obtuvo una lectura de secuencia para ambos oligonucleotidos especlficos de diana 1 y 2 en las posiciones a2b1, a3b1, a1b2, a2b2, y a3b2 (posiciones mostradas con llneas cruzadas). No se obtuvo lectura de secuencia para los oligonucleotidos especlficos de diana en a1b4, a2b4 o a3b4 (posiciones mostradas sin sombreado). Por lo tanto, en la muestra biologica en la que tuvo lugar el ensayo se detecto el primer acido nucleico diana en una gran porcion del lado izquierdo y en la parte inferior de la muestra biologica, el segundo acido nucleico diana se detecto solo en la parte superior izquierda de la muestra biologica, y no se detecto ningun acido nucleico en la parte superior derecha de la muestra biologica. La expresion diferencial de los dos acidos nucleicos diana ahora puede volver a mapearse en la muestra biologica y en las estructuras biologicas o tipos celulares en estas localizaciones en la muestra biologica.
Ademas de la informacion de localizacion, puede obtenerse informacion relativa a la abundancia de los marcadores codificados. Por ejemplo, se observa que hay diez veces mas secuencias a4T1b1 en el conjunto de datos en comparacion con las secuencias a4T 1 b2, esto podrla indicar que la secuencia de acido nucleico diana 1 es diez veces mas abundante en la localizacion a4T1b1 que en la localizacion a4T1b2.
En el caso del analisis de nucleotidos tal como se muestra en la figura 3, al ligar los marcadores de codificacion directamente a oligonucleotidos especlficos de diana, solo se necesitan 2n oligonucleotidos especlficos de diana para las dianas. Por ejemplo, al usar la estrategia combinatoria indicada en la figura 2, el ensayo de 100 dianas diferentes en 10.000 localizaciones espaciales requerirla de 2 x 100 oligonucleotidos especlficos de diana y de 2 x 100 oligonucleotidos codificantes: El recuento total de oligonucleotidos de ensayo serla unicamente de 400 (200 especlficos de diana y 200 codificantes), sin contar los cebadores universales. Por el contrario, si no se desacoplan los oligonucleotidos codificantes de los oligonucleotidos especlficos de diana, se necesitarlan (n x X codigos de posicion) + (n x Y codigos de posicion), o en el ejemplo anterior, 20.000 oligonucleotidos, sin contar las secuencias de cebador universales. Ademas, aunque las realizaciones mostradas en las figuras 2-5 ilustran un esquema combinatorio usando dos agentes de codificacion (marcadores de codificacion), pueden usarse tres, cuatro o mas agentes de codificacion y marcadores de codificacion, y unirse a la sonda o entre si mediante diversos medios y con diversas combinaciones de etapas.
Debido al aspecto de codificacion espacial de este sistema de ensayo, puede generarse una gran cantidad de informacion con incluso un numero modesto de ensayos. Por ejemplo, cinco o mas dianas biologicas ensayadas en cinco o mas posiciones en la muestra generan 25 o mas combinaciones. Al usar secuenciacion digital como lectura, el numero optimo de lecturas de secuencia por combinacion depende de la sensibilidad e intervalo dinamico necesario, y puede ajustarse. Por ejemplo, si para cada combinacion se muestrean de media 100 lecturas, el total para 25 combinaciones es de 25.000 lecturas. Si se ensayan 1.000 dianas en 1.000 localizaciones con una media de profundidad de muestreo de 1.000, se requieren entonces 109 lecturas. Estos numeros, aunque son grandes, se encuentran dentro de la capacidad de los metodos de secuenciacion digitales intrlnsecamente paralelos, que pueden generar conjuntos de datos de miles de millones o de billones de lecturas en un espacio de tiempo razonable y con un coste por lectura muy bajo. Por lo tanto, al variar el numero de posiciones interrogadas o de dianas biologicas ensayadas, o ambas, y usando secuenciacion digital, pueden obtenerse grandes cantidades de informacion. En aspectos especlficos, se interrogan multiples localizaciones para dos o mas moleculas biologicas.
Sistemas de administracion de reactivo
El sistema de administracion de reactivos incluye instrumentacion que permite la administracion de reactivos a partes discretas de la muestra biologica, manteniendo la integridad de los patrones espaciales del esquema de codificacion. Los sistemas de administracion de reactivo de los sistemas de ensayo comprenden medios de obtencion de imagenes opcionales; equipamiento de administracion de reactivo y programas informaticos de control. La administracion del reactivo puede lograrse de una cantidad de formas diferentes. Cabe destacar que la administracion puede ser a muchas muestras biologicas a la vez. En el presente documento se ha ejemplificado una sola seccion de tejido; sin embargo, pueden fijarse y analizarse simultaneamente multiples muestras biologicas. Por ejemplo, pueden analizarse secciones en serie de una muestra de tejido en paralelo y combinarse los datos para construir un mapa en 3D.
La instrumentacion que permite la formation de patrones espaciales de reactivos en la muestra biologica es una parte integral del sistema de ensayo. Las tecnologlas para formular y administrar ambas moleculas biologicas (por ejemplo, oligonucleotidos o anticuerpos) y reactivos qulmicos (por ejemplo, moleculas pequenas o dNTP) se conocen en la tecnica, y el uso de estos sistemas instrumentales se conoce por los expertos en la materia y son facilmente adaptables a los sistemas de ensayo. Un ejemplo de un sistema de administracion de reactivo adecuado es el manipulador de llquidos acustico Labcyte™ Echo, que puede usarse para administrar gotas a escala de nanolitro que contienen moleculas biologicas con alta precision y reproducibilidad. Un experto en la materia podrla incorporar este dispositivo de administracion de reactivo al sistema general, usando programas informaticos para especificar las localizaciones sobre las que deben administrarse los reactivos.
Otros instrumentos que pueden usarse para la deposition de agentes y/o identificadores de codificacion sobre muestras biologicas incluyen, pero sin limitation, deposicion por chorro de tinta; deposicion mecanica mediante un punzon, bollgrafo o capilar; impresion de micro contacto; metodos fotoqulmicos o fotolitograficos; y similares. Para
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varias aplicaciones, puede preferirse segmentar o secuestrar determinadas areas de las muestras biologicas en una o mas areas de ensayo para diferentes distribuciones de reactivo y/o determinaciones de diana biologica. Las zonas de ensayo pueden separarse flsicamente usando barreras o canales.
En un aspecto ejemplar, el sistema de administracion de reactivo puede ser un sistema basado en flujo. Los sistemas basados en flujo para la administracion de reactivo en la presente invencion pueden incluir instrumentation, tal como una o mas bombas, valvulas, depositos de fluido, canales, y/o celdas de almacenamiento de reactivo. Los sistemas de administracion de reactivo estan configurados para mover fluido para que entre en contacto con una section discreta de la muestra biologica. El movimiento de los reactivos puede estar dirigido por una bomba dispuesta, por ejemplo, aguas abajo de los reactivos fluidos. La bomba puede dirigir cada reactivo fluido hacia (y atravesar) el compartimento de reaction. Como alternativa, los reactivos pueden dirigirse hacia el fluido mediante gravedad. Las publicaciones de Estados Unidos n.° 20070166725 y 20050239192 divulgan determinadas herramientas de manejo de fluidos de proposito general que pueden usarse con los sistemas de ensayo, permitiendo la manipulation precisa de los materiales de vidrio, llquidos y solidos para lograr manipulaciones anallticas muy complejas con un equipo relativamente sencillo.
En un ejemplo mas especlfico, pueden unirse una o mas celdas de flujo a la muestra biologica fijada al sustrato desde arriba. La celda de flujo puede incluir tubos de entrada y salida conectados a esta y se usa opcionalmente una bomba externa para administrar reactivos a la celda de flujo y a traves de la muestra biologica. Las celdas de flujo se configuran para administrar reactivos unicamente a determinadas partes de la muestra biologica, restringiendo la cantidad y tipo de reactivo administrado a cualquier seccion especlfica de la muestra biologica.
En otro aspecto, puede integrarse un sistema de microfluidos al sustrato sobre el que se dispone la muestra biologica o unirse externamente sobre el sustrato. Los pasadizos de microfluidos para mantener y portar el fluido pueden formarse sobre y/o por encima del sustrato plano mediante una capa de fluidos apoyada sobre el sustrato. Los reactivos fluidos pueden seleccionarse y administrarse segun la apertura y cierre de valvulas dispuestas entre depositos de reactivo.
Las bombas incluyen generalmente cualquier mecanismo para mover fluidos y/o reactivos dispuestos en un fluido. En algunos ejemplos, puede configurarse la bomba para que mueva fluidos y/o reactivos a traves de los pasadizos con volumenes pequenos (es decir, estructuras microfluidas). La bomba puede operar de manera mecanica ejerciendo una presion positiva o negativa en el fluido y/o en una estructura que porta el fluido, electricamente mediante la aplicacion adecuada de campos electricos, o ambas, entre otros medios. Las bombas mecanicas ejemplares pueden incluir bombas de jeringa, bombas peristalticas, bombas rotatorias, gas a presion, pipeteadores, etc. Las bombas mecanicas pueden estar micromecanizadas, moldeadas, etc. Las bombas electricas ejemplares pueden incluir electrodos y pueden funcionar mediante electroforesis, electroendoosmosis, electrocapilaridad, dielectroforesis (incluyendo formas de viaje de onda de las mismas), y/o similares.
Las valvulas incluyen generalmente cualquier mecanismo para regular el paso de fluidos a traves de un canal. Las valvulas pueden incluir, por ejemplo, miembros deformables que puedan deformarse de manera selectiva para cerrar parcial o completamente un canal, una proyeccion movil que pueda extenderse de manera selectiva dentro de un canal para bloquear total o parcialmente un canal, una estructura de electrocapilaridad, y/o similares.
Puede acoplarse una junta abierta a la parte superior de la muestra biologica y la muestra y los reactivos pueden inyectarse en la junta. Los materiales de junta adecuados incluyen, pero sin limitation, neopreno, nitrilo, y silicona. Como alternativa, puede formarse una camara de reaccion estanca al agua mediante una junta dispuesta en sandwich entre la muestra biologica o el sustrato y un material qulmicamente inerte resistente al agua tal como, pero sin limitacion, aluminio negro anodizado, termoplasticos (por ejemplo, poliestireno, policarbonato, etc), vidrio, etc.
En una realization opcional, el sistema de ensayo comprende medios para la obtencion de imagenes para determinar caracterlsticas y la organization de la muestra biologica de interes. Las imagenes obtenidas, por ejemplo, pueden usarse para disenar el patron de deposition de los reactivos. Los medios para la obtencion de imagenes son opcionales, ya que un individuo puede en su lugar observar la muestra biologica usando, por ejemplo, un microscopio, analizar la organizacion de la muestra biologica, y especificar un patron espacial para la administracion de los reactivos de ensayo. En caso de incluirse, el sistema de administracion puede comprender una disposition de microcircuitos que incluya un dispositivo de imagen, tal como un dispositivo para la obtencion de imagenes basado en CCD o en IGFET (por ejemplo, basado en CMOS) y un pulverizador ultrasonico para la administracion de reactivos, tal como se describe en la publication de Estados Unidos n.° 20090197326. Asimismo, cabe destacar que aunque las figuras 4 y 5 ilustran el uso de una configuration de cuadrlcula x,y, pueden usarse otras configuraciones, tales como, por ejemplo, siguiendo la topologla de una muestra de tejido; usando como dianas determinados grupos de celulas, capas de celulas y/o tipos celulares en un tejido, y similares.
En otra alternativa mas, el sistema de administracion de reactivo controla la administracion de los reactivos a patrones especlficos en la superficie de una muestra biologica usando tecnicas de semiconductor, tales como enmascaramiento y pulverization. Las areas especlficas de una muestra biologica pueden protegerse de la exposition a los reactivos mediante el uso de una mascara para proteger areas especlficas de la exposicion. Los reactivos pueden introducirse
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en la muestra biologica usando tecnicas convencionales, tales como pulverizacion o flujo de fluido. El uso de una administracion con mascara da como resultado un esquema de administracion patronado sobre la superficie del sustrato.
En una estrategia preferida, la instrumentacion de administracion de reactivo se basa en la tecnologla de impresion de chorro de tinta. Hay una diversidad de diferentes mecanismos de impresion por chorro de tinta (por ejemplo, termica, piezoelectrica) y se ha demostrado su compatibilidad con formulaciones de tinta acuosas y organicas. Pueden usarse conjuntos de boquillas activadas para administrar multiples reactivos a la vez, y pueden lograrse resoluciones muy altas.
Para dirigirse a sitios especlficos de interes, puede usarse una imagen informativa de la muestra biologica que se va a ensayar como ayuda en los metodos de administracion de reactivos y el esquema de codificacion asociado. Las regiones de muestra de la muestra biologica pueden identificarse usando procesamiento de imagen (por ejemplo, imagenes de tipos celulares diferenciadas mediante inmunohistoqulmica u otras qulmicas de tincion) integradas con otras caracterlsticas del sistema de ensayo. En algunos aspectos, se usan programas informaticos para traducir automaticamente la informacion de la imagen en un patron de administracion de reactivo. Por lo tanto, un mecanismo para registrar y alinear de manera muy precisa la muestra biologica para la administracion de reactivo es un componente importante de los sistemas de ensayo que usa la invencion. Los mecanismos, tales como el uso de marcadores fiduciales sobre portaobjetos y/u otros sistemas de posicionamiento flsico muy preciso pueden adaptarse para este fin.
La invencion se usa preferentemente con un conjunto completo de programas informaticos disenados a medida para el sistema de ensayo. De manera opcional, se usan programas informaticos de diseno de oligonucleotidos para disenar los nucleotidos codificantes (y en realizaciones en las que se ensayan acidos nucleicos, los oligonucleotidos especlficos de diana) para ejecutar el ensayo especlfico, y pueden integrarse como parte del sistema. Tambien opcionalmente, pueden integrarse algoritmos y programas informaticos para la administracion de reactivos y el analisis de datos (es decir, analisis de secuencia) para determinar los resultados del ensayo. El analisis integrado de datos es particularmente util, ya que el tipo de conjunto de datos que se genera puede ser masivo a consecuencia de la escala. Los algoritmos y herramientas informaticas que estan especialmente disenados para el analisis de los datos asociados espacialmente generados por los sistemas de ensayo, incluyendo programas informaticos de analisis de patrones y herramientas de visualizacion, potencian el valor de los datos generados por los sistemas de ensayo.
En determinados aspectos, el sistema de ensayo comprende procesos para producir y llevar a cabo el control de calidad de los reactivos, por ejemplo, la integridad y fidelidad de la secuencia de los grupos de oligonucleotidos. En particular, los reactivos se formulan segun factores tales como la volatilidad, estabilidad a temperaturas clave, y la compatibilidad qulmica para la compatibilidad con la instrumentacion de administracion de reactivo y pueden analizarse mediante instrumentacion integrada en el sistema de ensayo.
Secuenciacion
Pueden usarse numerosos metodos para identificar los marcadores de codificacion y secuencias de sonda en las sondas codificadas de los sistemas de ensayo. Los marcadores de codificacion pueden detectarse usando tecnicas, tales como espectrometrla de masa (por ejemplo, Maldi-Tof, CL-EM/EM), obtencion de imagenes por resonancia magnetica nuclear, o preferentemente, secuenciacion de acidos nucleicos. Los ejemplos de tecnicas para descodificar los marcadores de descodificacion pueden encontrarse, por ejemplo, en la publicacion de Estados Unidos n.° 20080220434. Por ejemplo, los marcadores de codificacion pueden ser marcadores de masa de oligonucleotidos (OMT o massTag). Dichos marcadores se describen, por ejemplo, en la publicacion de Estados Unidos n.° 20090305237. En otra alternativa mas, las sondas codificadas pueden amplificarse e hibridarse a una micromatriz. Esto podrla requerir que se lleven a cabo reacciones de amplificacion separadas, en las que cada amplificacion sea especlfica para un codigo espacial o subconjunto de codigos particular, efectuada usando cebadores especlficos de codigo. Cada amplificacion tambien podrla incorporar un marcador resoluble diferente (por ejemplo, un fluoroforo). Despues de la hibridacion, pueden determinarse las cantidades relativas de una diana particular mapeando en diferentes localizaciones espaciales en la muestra por medio de las abundancias relativas de los marcadores resolubles.
En un aspecto particularmente preferido, los marcadores de codificacion resultantes de acuerdo con el sistema de ensayo son sustratos para secuenciacion de alto rendimiento de ultima generation, y se usan metodos de secuenciacion de ultima generacion altamente paralelos para confirmar la secuencia de los marcadores de codificacion, por ejemplo, con la tecnologla SOLiD™ (Life Technologies, Inc.) o Genome Analyzer (Illumina, Inc.). Dichos metodos de secuenciacion de ultima generacion pueden llevarse a cabo, por ejemplo, usando un metodo de secuenciacion en un pase o usando secuenciacion de extremo emparejado. Los metodos de secuenciacion de ultima generacion incluyen, pero sin limitation, metodos basados en hibridacion, tales como los divulgados en, por ejemplo, Drmanac, patentes de Estados Unidos n.° 6.864.052; 6.309.824; y 6.401.267; y Drmanac et al, publicacion de Estados Unidos 2005/0191656; metodos de secuenciacion mediante slntesis, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos n° 6.210.891; 6.828.100; 6.969.488; 6.897.023; 6.833.246; 6.911.345; 6.787.308; 7.297.518; 7.462.449 y 7.501.245; las solicitudes de publicacion de Estados Unidos n.° 20110059436; 20040106110; 20030064398; y 20030022207;
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Ronaghi, et al, Science, 281: 363-365 (1998); y Li, et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 100: 414-419 (2003); metodos basados en ligadura, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos n.° 5.912.148 y 6.130.073; y las solicitudes de patente de Estados Unidos n.° 20100105052, 20070207482 y 20090018024; secuenciacion nanopore, por ejemplo, las solicitudes de patente de Estados Unidos n.° 20070036511; 20080032301; 20080128627; 20090082212; y Soni y Meller, Clin Chem 53: 1996-2001 (2007)), as! como otros metodos, por ejemplo, las solicitudes de patente de Estados Unidos n.° 20110033854; 20090264299; 20090155781; y 20090005252; tambien veanse, McKernan, et al., Genome Res., 19:1527-41 (2009) y Bentley, et al., Nature 456:53-59 (2008).
Aplicaciones del sistema de ensayo
Sera evidente para un experto en la materia tras la lectura de la presente divulgacion que hay numerosas areas importantes de investigacion biologica, diagnosticos, y desarrollo de farmacos que se beneficiarlan de un sistema de ensayo multiplexado de alto rendimiento que pueda medir de manera simultanea la cantidad y localizacion espacial de una diana biologica en una muestra biologica. Por ejemplo, la combinacion de la agilidad para estimar la abundancia relativa de diferentes transcritos de ARN con la capacidad para reconstruir una imagen de patrones espaciales de abundancia a lo largo de muchas localizaciones, que pueden ser tan pequenas como o incluso mas pequenas que las celulas individuales, en un tejido posibilita muchas areas diferentes de investigacion basica. Lo siguiente son usos ejemplares y en ningun modo se pretende que sean limitativos en cuanto a su alcance.
En un ejemplo, se determinan patrones en 3 dimensiones de la expresion genica analizando una serie de secciones de tejido, de una manera analoga a la reconstruccion de imagenes en un barrido TC. Dicho metodo puede usarse para medir cambios en la expresion genica en una patologla, por ejemplo, en tejido canceroso y/o un tejido tras lesionarse, inflamarse o infectarse. Con los sistemas de ensayo que usan la invencion, se obtiene information mas detallada de la expresion genica y de la localizacion de protelnas en tejidos complejos, dando lugar a nuevas perspectivas acerca de la funcion y la regulation en estados tanto normales como patologicos, y proporciona que puedan probarse nuevas hipotesis. Por ejemplo, un sistema de ensayo que use la invencion puede posibilitar algunas de las perspectivas obtenidas con muchos estudios individuales y programas mas grandes, tales como ENCODE (Birney, et al., Nature, 447:799-816 (2007)) y modENCODE para su integration a nivel de tejido. Los sistemas de ensayo tambien asisten en los esfuerzos computacionales para modelar redes interconectadas de expresion genica en el campo de la biologla de sistemas.
Los sistemas de ensayo tambien proporcionan una nueva estrategia para el analisis de la variation somatica, por ejemplo, mutaciones somaticas en el cancer, variabilidad en respuesta a organismos infecciosos. Por ejemplo, los tumores son normalmente altamente heterogeneos, conteniendo celulas cancerosas as! como celulas geneticamente normales en un ambiente local anormal. Las celulas cancerosas sufren mutation y selection, y en este proceso no es infrecuente que se desarrollen clones. La identification de mutaciones somaticas relativamente raras en el contexto de tumores puede permitir el estudio de mutaciones clave en la seleccion de variantes clonales. Los patrones transcripcionales asociados con la angiogenesis, inflamacion, u otros procesos relacionados con el cancer en celulas tanto cancerosas como geneticamente normales pueden analizarse para obtener una vision de la biologla del cancer y ayudar en el desarrollo de nuevos agentes terapeuticos para el tratamiento de canceres. En otro ejemplo, los individuos tienen una susceptibilidad variable a organismos infecciosos, y pueden usarse los sistemas de ensayo que usan la invencion para estudiar la interaction entre microbios y tejidos o los diferentes tipos celulares dentro del tejido.
De manera importante, ademas de proporcionar informacion asociada espacialmente, la invencion permite un gran aumento en la sensibilidad de la detection de mutaciones raras, ya que puede aumentarse dramaticamente la relation de senal a ruido al ensayarse unicamente una pequena localizacion en una reaction dada. En un ensayo tlpico para mutaciones raras en una muestra mixta, la muestra se trata en bruto, es decir, se extraen los acidos nucleicos de muchas celulas en un solo grupo. Por lo tanto, si una mutacion esta presente en una de cada 10.000 celulas, tiene que detectarse contra un fondo de ADN normal de ~10.000 celulas. Por el contrario, pueden analizarse muchas celulas con los sistemas de ensayo que usan la invencion, pero se identificarlan las celulas individuales o grupos de celulas mediante el sistema de codification espacial. Por lo tanto, en los sistemas de ensayo que usan la presente invencion, el fondo se reduce en ordenes de magnitud, aumentando enormemente la sensibilidad. Ademas, puede observarse la organization espacial de celulas mutantes, lo que puede ser particularmente importante para detectar mutaciones clave en secciones de tejido de un cancer. Los analisis histologicos moleculares ya estan proporcionando perspectivas en la biologla del cancer y pueden tener un potencial para su uso en diagnosticos. La tecnologla de la invencion es prometedora para aumentar la potencia de dichas estrategias.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se han incluido para proporcionar a las personas normalmente expertas en la materia una divulgacion y description completas de como preparar y usar la presente invencion, y no pretenden limitar el alcance de lo que el inventor considera como su invencion, ni tampoco pretenden representar o implicar que los experimentos a continuation sean todos o los unicos experimentos llevados a cabo. Las presentes realizaciones, por lo tanto, deben considerarse en todos los aspectos ilustrativas y no restrictivas.
Se han realizado esfuerzos para asegurar la fiabilidad con respecto a los numeros utilizados (por ejemplo, cantidades,
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temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es un peso molecular promedio, la temperatura esta en grados centlgrados, y la presion es o esta proxima a la atmosferica.
EJEMPLO 1: Prueba de concepto inicial del esquema de codificacion
Como prueba inicial de concepto, se desarrolla un sistema modelo usando una micromatriz para demostrar un ensayo funcional monoplexado. El diseno basico valida el concepto del ensayo, y establece un ensayo funcional antes de abordar asuntos relacionados con el analisis de una muestra biologica mas complicada. Se usa secuenciacion convencional como lectura para esta prueba de concepto.
Se usa una micromatriz como aproximacion a una seccion de tejido. Las secuencias diana de la micromatriz estan completamente especificadas, de tal forma que se conoce la composition de las dianas y pueden variarse de manera sistematica. Se acoplan moldes de oligonucleotidos sinteticos a un portaobjetos de vidrio mediante una modification de amino 5'. Cada portaobjetos tiene una unica secuencia de molde de oligonucleotido, y los ensayos que se llevan a cabo pueden emplear ligadura o extension seguida de ligadura ya que esto puede ser util para determinar determinados polimorfismos.
Una vez que se ha completado la parte in situ del ensayo, se eluyen los productos de reaction y se analizan mediante qPCR para determinar la presencia o ausencia de un producto y estimar el rendimiento, y mediante secuenciacion convencional para determinar la estructura de los productos de ensayo. Los ensayos monoplexados que se ensayan incluyen controles positivos y negativos adecuados, y una variante de un solo nucleotido (SNV) para comprobar la capacidad para distinguir variantes de una sola base.
EJEMPLO 2: Escalabilidad
La complejidad del sistema de ensayo se aumenta para establecer la escalabilidad del ensayo para su uso en estudios de alto rendimiento. La escalabilidad de la codificacion espacial y de los sistemas de ensayo se demuestra llevando a cabo un ensayo de 24 canales x 24 sitios usando un sistema modelo de micromatriz.
La cantidad de diana biologica, en este caso una secuencia diana de ADN, en cada localization de ensayo se varla sistematicamente sobre el sustrato de la micromatriz. Por ejemplo, en una micromatriz con un tamano de punto de 50 micrometros (de centro a centro), un area de 1 mm2 contiene ~400 puntos. La region alrededor de cada sitio esta ocupada opcionalmente por una region que esta desprovista de estos puntos para permitir la resolubilidad individual de las secuencias diana. Como alternativa, pueden agruparse los puntos con dos o mas puntos directamente adyacentes rodeados por o adyacentes a una region que esta desprovista de secuencias diana.
Para demostrar que la codificacion espacial es precisa, los sitios comprenden diferentes composiciones de diana para demostrar que la lectura del ensayo coincide con la composicion esperada de cada sitio. Con 24 secuencias diana, se efectua un patron digital simple, teniendo cada sitio un conjunto diferente de 12 dianas presentes y 12 dianas ausentes, para producir un codigo binario (0 = ausente, 1 = presente). Entonces se determina la lectura del ensayo para demostrar que las regiones detectadas coinciden con la senal esperada despues de la descodificacion espacial. En este ejemplo en particular, el codigo espacial es lo suficientemente grande (224), de tal forma que incluso unos pocos errores no darlan como resultado que se mezclasen diferentes codigos. Ademas, este diseno permite la identification de errores y permite una estimation no solo de la precision de la codificacion espacial, sino tambien de la precision mostrando la presencia o ausencia de secuencias diana.
Se evalua la capacidad para detectar diferencias cuantitativas generando curvas de respuesta a la dosis para cada uno de los 24 ensayos que se llevan a cabo en cada sitio de un ensayo de 24 sitios. Esto permite la estimacion del llmite de detection, del intervalo dinamico, y de la potencia para detectar un cambio multiplo dado a lo largo del intervalo.
En un aspecto, se usa una disposition en cuadro latino para representar dianas individuales en diferentes proporciones variando el numero de caracterlsticas para cada diana. En otras palabras, con multiples puntos en un sitio, el numero de puntos ubicados en cada una de las 24 secuencias diana pueden variarse y cada uno de los 24 sitios puede tener una composicion distinta. Una micromatriz de 2,54 x 7,62 cm es lo suficientemente grande como para permitir multiples replicados. Este conjunto mayor de 24 secuencias necesitara desconvolucion, y esto se logra usando tecnicas de alto rendimiento, tales como tecnologlas de secuenciacion de ultima generation (por ejemplo, la tecnologla SOLiD™ (Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA) o Genome Analyzer (Illumina, Inc., San Diego, cA)). El uso del ensayo de 24 canales demuestra tanto la precision de la codificacion y descodificacion espacial, como la respuesta cuantitativa del sistema de ensayo.
EJEMPLO 3: Adaptacion del ensayo a muestras conservadas
Se ensaya ADN genomico como prueba de concepto para ensayar ARN, ya que proporciona una forma de establecer una senal de referencia de una sola copia. Una vez que se ha desarrollado un ensayo funcional para muestras de
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FFPE, se adapta a un ensayo de ARN. Para este fin, se ensayan concentraciones de oligonucleotido de ensayo para asegurar la compatibilidad con una alta multiplexacion. Asumiendo un diametro celular de 10 micrometros, y una administracion de una gota de reactivo de 10 micrometros de diametro a una celula individual, el volumen de la gota sera de ~500 ml y puede contener ~3 x 1011 moleculas a una concentration de 1 pM. Para ensayar 1.000 secuencias diana en 10.000 celulas, se necesitaran ~2.000 oligonucleotidos diana en una gota. Por lo tanto, cada gota podrla contener ~160 millones de copias de cada oligo de ensayo, un gran exceso frente a los pocos miles de secuencias en una celula.
La manipulation de numeros absolutos pequenos de moleculas de producto generados a partir de muestras muy pequenas o comprometidas esta potenciada para contrarrestar el problema de la baja eficacia de recuperation; es decir, la eficacia de la elucion y se evitan las perdidas resultantes de la absorcion de las moleculas en las superficies. Una estrategia para abordar el ultimo problema es incluir un material transportador, tal como glucogeno o acidos nucleicos transportadores.
EJEMPLO 4: Adaptacion del ensayo a una muestra biologica.
Se inmoviliza un molde de ARN de control sobre un soporte solido para crear un sistema artificial. El ensayo se lleva a cabo usando ADN ligasa de T4, que puede reparar danos en los hlbridos de ADN/ARN. Los ensayos se llevan a cabo en portaobjetos emparejados, o en diferentes secciones del mismo portaobjetos, donde se ensaya en un caso ADNg y en el otro se ensaya ARN. Cuando se ensaya ADNg, puede tratarse previamente al portaobjetos con RNasa, y cuando se ensaya ARN el portaobjetos se trata previamente con DNasa. Los resultados del ensayo se confirman extrayendo ADNd o ARN y cuantificando las cantidades relativas mediante qPCR o TR-qPCR, respectivamente.
Para hacer que los ensayos de ARN de section de tejido sean lo mas informativos posibles, se usa information preexistente acerca de los niveles de expresion en tejidos biologicos para dirigirse a los transcritos a lo largo de un intervalo de abundancias en el diseno del ensayo. Los transcritos tanto de alta abundancia, as! como algunos transcritos de media y baja abundancia, se usan como diana para permitir una evaluation inicial de las caracterlsticas de rendimiento cuantitativo del ensayo.
Lo anterior solo ilustra los principios de la invention. Ademas, todos los ejemplos y el lenguaje condicional citado en el presente documento pretenden ayudar al lector a comprender los principios de la invencion y los conceptos aportados por los inventores para desarrollar la tecnica, y deben entenderse como pertenecientes sin limitation a dichos ejemplos y condiciones citados especlficamente. Ademas, todas las afirmaciones en el presente documento que citan principios, aspectos, y realizaciones de la invencion as! como ejemplos especlficos de la misma pretenden abarcar equivalentes tanto estructurales como funcionales de los mismos. Ademas, se pretende que dichos equivalentes incluyan tanto equivalentes conocidos en la actualidad como equivalentes desarrollados en el futuro, es decir, cualquier elemento desarrollado que cumpla la misma funcion, independientemente de la estructura. El alcance de la presente invencion, por lo tanto, no pretende estar limitado a las realizaciones ejemplares mostradas y descritas en el presente documento.

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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para determinar patrones espaciales de abundancia o de actividad o de ambos de multiples dianas de acido nucleico en multiples sitios en una muestra, comprendiendo las siguientes etapas:
    proporcionar una muestra fijada a un soporte; administrar sondas oligonucleotldicas para multiples dianas de acido nucleico a los multiples sitios en la muestra;
    permitir que las sondas oligonucleotldicas hibriden con las dianas de acido nucleico; lavar las sondas oligonucleotldicas no hibridadas de la muestra;
    administrar agentes de codificacion a localizaciones de los multiples sitios en la muestra de acuerdo con un patron espacial conocido, en donde al menos dos agentes codificantes se administran a cada uno de los multiples sitios y la combinacion de los agentes de codificacion administrados a cada sitio es diferente;
    acoplar los agentes de codificacion a las sondas oligonucleotldicas hibridadas a las dianas de acido nucleico para formar sondas codificadas;
    determinar la totalidad o parte de una secuencia de las sondas codificadas; y
    asociar la abundancia o la actividad o ambas de las multiples dianas biologicas a las localizaciones de multiples sitios en la muestra.
  2. 2. Un metodo para determinar patrones espaciales de abundancia o de actividad o de ambos de multiples dianas biologicas en multiples sitios en una muestra, comprendiendo las siguientes etapas:
    proporcionar una muestra fijada a un soporte;
    administrar sondas codificadas para multiples dianas biologicas con un patron espacial conocido a los multiples sitios en la muestra, en de cada sonda codificada comprende una region de sonda capaz de interactuar con una diana biologica y un marcador de codificacion que comprende un oligonucleotido que identifica la localization del sitio al que se administra la sonda codificada;
    permitir que las sondas codificadas interactuen con las dianas biologicas;
    determinar una secuencia de las sondas codificadas, en donde la secuencia comprende la secuencia oligonucleotldica del marcador de codificacion, identificando de este modo la localizacion del sitio al que se administra la sonda codificada; y
    asociar la abundancia o la actividad o ambas de las multiples dianas biologicas a las localizaciones de los sitios en la muestra.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 2, que ademas comprende despues de la etapa en que se deja reaccionar y antes de la etapa de determination una etapa de separation de las sondas codificadas que interactuan con las dianas biologicas de las sondas codificadas que no interactuan con las dianas biologicas.
  4. 4. El metodo de la reivindicacion 3, en el que las dianas biologicas son acidos nucleicos y las sondas codificadas son sondas oligonucleotldicas.
  5. 5. El metodo de las reivindicaciones 1 o 4, en el que hay dos sondas oligonucleotldicas para cada una de las dianas biologicas de acido nucleico.
  6. 6. El metodo de la reivindicacion 3, en el que las multiples dianas biologicas son protelnas, las regiones de sonda de las sondas codificantes son protelnas y los marcadores codificantes comprenden oligonucleotidos.
  7. 7. El metodo de la reivindicacion 3, en el que las multiples dianas biologicas comprenden enzimas.
  8. 8. El metodo de la reivindicacion 3, en el que las regiones de sonda de las sondas codificadas comprenden anticuerpos, aptameros, moleculas pequenas, sustratos enzimaticos, sustratos enzimaticos putativos o agentes de captura por afinidad.
  9. 9. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 y 6, que ademas comprende una etapa de amplification entre la etapa de separacion o la etapa de acoplamiento y la etapa de determinacion.
  10. 10. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la etapa de determinacion se lleva a cabo mediante secuenciacion de acido nucleicos o secuenciacion de alto rendimiento.
  11. 11. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la etapa de acoplamiento se lleva a cabo mediante ligadura o mediante extension seguida de ligadura.
  12. 12. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el producto de las multiples dianas biologicas que se estan ensayando y los multiples sitios en la muestra es mayor de 1.000.000.
  13. 13. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y 6, en el que se determinan las secuencias de al menos un millon de sondas codificantes en paralelo.
  14. 14. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el patron espacial conocido se determina mediante caracteristicas histologicas de la muestra.
  15. 15. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que un hardware programado por un programa 5 informatico efectua al menos dos etapas de la etapa de administracion, la etapa de separacion, la etapa de
    determinacion y la etapa de asociacion.
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