ES2560433T3 - Cebadores para la detección del bacilo de la tuberculosis y procedimiento de detección del bacilo de la tuberculosis humana con los mismos - Google Patents

Cebadores para la detección del bacilo de la tuberculosis y procedimiento de detección del bacilo de la tuberculosis humana con los mismos Download PDF

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Abstract

Un par de cebadores para detectar Mycobacterium tuberculosis que consiste en un cebador que consiste en un oligonucleótido que consiste en una secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 2 y un cebador que consiste en un oligonucleótido que consiste en una secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 4.

Description

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modo comparativo. Además, la secuencia del producto de la PCR derivado de Mycobacterium triviale obtenido de la fracción (o) se designa como la 2ª secuencia de nucleótidos, y se muestra en la parte inferior de este listado de secuencias.
Fig 4
La Figura 4 muestra el resultado de la detección por PCR en tiempo real realizada en el Ejemplo 3, que es una curva de calibración obtenida representando el valor de Ct (eje y) frente al número de copias del genoma de cada muestra de ADN para la PCR (eje x, valor logarítmico).
Figura 5
La Figura 5 muestra el resultado de la electroforesis obtenida en el Ejemplo 4. En la Figura 5, el número de cada carril muestra los resultados obtenidos mediante el uso de las siguientes muestras, respectivamente.
M: Marcador de peso molecular
(1)
Sin muestra
(2)
Mycobacterium tuberculosis + M. avium + M. intracellulare+ M. kansasii
(3)
Mycobacterium tuberculosis
(4)
M. avium + M. intracellulare + M. kansasii
(5)
Mycobacterium tuberculosis (10 copias) + M. avium + M. intracellulare+ M. kansasii
(6)
M. avium
(7)
Mycobacterium tuberculosis + M. avium + M. kansasii
La dirección de la migración electroforética se indica a la izquierda del patrón electroforético, y se muestra el orden de aparición de la fracción de cada producto amplificado. "TB" indica M. tuberculosis; "avium" indica M. avium; "intra" indica M. intracellulare; y "kansasii" indica M. kansasii.
Figura 6
La Figura 6 muestra el resultado de la detección por PCR en tiempo real realizada en el Ejemplo 5, que es una curva de calibración obtenida representando el valor de Ct (eje y) frente al número de copias del genoma de cada muestra de ADN para la PCR (eje x, valor logarítmico).
Mejor modo de llevar a cabo la invención
El gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis de la presente invención consiste en una secuencia de bases con una longitud completa de 885 pares de bases, cuya secuencia total de bases se encuentra descrita, por ejemplo, en el artículo publicado por el Instituto Pasteur, "Nucleic acid Res. 1990, 18(1): p.188" (documento no de patente 11).
El oligonucleótido de la presente invención incluye un oligonucleótido que comprende una parte o una secuencia completa de la secuencia de ácido nucleico descrita en la SEC ID N.º 2, la SEC ID N.º 4 o la SEC ID N.º 7, o una parte o una secuencia completa de la secuencia complementaria de la misma, en el que el oligonucleótido tiene una propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis (denominado en lo sucesivo en el presente documento un oligonucleótido de la presente invención).
El oligonucleótido que comprende una parte o una secuencia completa de la secuencia de ácido nucleico descrita en la SEC ID Nº. 2, SEC ID Nº. 4 o SEC ID Nº. 7 de la presente invención incluye, por ejemplo, un oligonucleótido que comprende una secuencia de bases que comparte aproximadamente un 70 % o más, preferentemente aproximadamente un 80 % o más, más preferentemente aproximadamente un 90 % o más, y adicionalmente preferentemente aproximadamente un 95 % o más de homología con la secuencia de ácido nucleico descrita en la SEC ID Nº. 2, SEC ID Nº. 4 o SEC ID Nº. 7, o un oligonucleótido que comprende una parte o una secuencia completa de la secuencia de ácido nucleico descrita en la SEC ID Nº. 2, SEC ID Nº. 4 o SEC ID Nº. 7 del listado de secuencias, y que consiste en 10 o más bases, preferentemente 20 o más bases.
El oligonucleótido que comprende una parte o la secuencia completa de la secuencia complementaria de una parte o la secuencia completa de la secuencia de ácido nucleico descrita en la SEC ID N.º 1, SEC ID N.º 4 o SEC ID N.º 7 de la presente invención incluye, por ejemplo, un oligonucleótido que comprende una parte o una secuencia completa de la secuencia de ácido nucleico que tiene una propiedad de hibridarse con el oligonucleótido que comprende una parte o una secuencia completa de la secuencia de ácido nucleico descrita en la SEC ID N.º 1, SEC ID N.º 4 o SEC ID N.º 7 de la presente invención.
El oligonucleótido descrito anteriormente que comprende una parte o una secuencia completa de la secuencia de
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ácido nucleico que tiene una propiedad de hibridarse con el oligonucleótido que comprende una parte o una secuencia completa de la secuencia de ácido nucleico descrita en la SEC ID N.º 1, SEC ID N.º 4 o SEC ID N.º 7 de la presente invención incluye, específicamente, un oligonucleótido que comprende una parte o una secuencia completa de la secuencia de ácido nucleico que tiene la propiedad de hibridarse en condiciones muy restrictivas o en condiciones restrictivas con el oligonucleótido que comprende una parte o una secuencia completa de la secuencia de ácido nucleico descrita en la SEC ID N.º 1, SEC ID N.º 4 o SEC ID N.º 7 de la presente invención.
A este respecto, las “condiciones muy restrictivas” significa una condición de la hibridación en formamida al 50 % a de 42 a 70 ºC, preferentemente a de 60 a 70 °C, seguido de lavado con dodecilsulfato sódico al 0,1 % (SDS) a 25 a 70 ºC en de 0,2 a 2 x SSC.
Además, “condiciones restrictivas” significa, específicamente, por ejemplo, una condición en la que la hibridación se realiza a de 50 a 70 ºC durante 16 horas en la solución de hibridación de 6 × SSC o una concentración equivalente de una sal del mismo y el producto hibridado se lava con 1 × SSC o una concentración equivalente de una sal del mismo, si es necesario después del lavado preliminar con la solución de 6 × SSC o una concentración equivalente de una sal del mismo.
El oligonucleótido que tiene una propiedad de hibridar con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis de la presente invención incluye un oligonucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene la propiedad de hibridarse en condiciones muy restrictivas o en condiciones restrictivas con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis descrita anteriormente en el presente documento. Las condiciones muy restrictivas o las condiciones restrictivas son las descritas anteriormente en el presente documento.
El oligonucleótido de la presente invención puede ser ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN). En el ácido ribonucleico, el residuo de timidina (T) ha de estar sustituido de manera natural para que se lea como un residuo de uridina (U). El ADN puede ser ADN que contenga un residuo de uridina en el que la T de cualquier posición sea sustituida por U en la síntesis. El ARN puede ser ARN que contenga un residuo de timidina en el que la U de cualquier posición sea sustituida por T en la síntesis, también. Además, se pueden eliminar, insertar o sustituir uno o varios nucleótidos, o puede haber un nucleótido modificado, tal como inosina (I).
Para obtener el oligonucleótido de la presente invención, se puede usar el oligonucleótido preparado según la síntesis química conocida hecha pública. Por consiguiente, se puede obtener fácilmente el oligonucleótido de la misma calidad, en gran cantidad y a un bajo precio, en comparación con el procedimiento de clonación para obtener un oligonucleótido o un polinucleótido.
Por ejemplo, el oligonucleótido objetivo de la presente invención se puede obtener usando un sintetizador de ADN elaborado convencionalmente en la síntesis de ADN, sintetizando el oligonucleótido mediante el procedimiento convencional de la fosfoamidita y purificando mediante cromatografía en columna de intercambio aniónico.
El cebador para detectar Mycobacterium tuberculosis de la presente invención (denominado en lo sucesivo en el presente documento el cebador de la presente invención) incluye un cebador para detectar Mycobacterium tuberculosis que comprende el oligonucleótido que comprende una parte o una secuencia completa de la secuencia de ácido nucleico descrita en la SEC ID N.º 2 o l SEC ID N.º 4, o una parte o una secuencia completa de la secuencia complementaria de la misma, en el que el oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis.
El ejemplo específico del oligonucleótido que comprende una parte o una secuencia completa de la secuencia de ácido nucleico descrita en la SEC ID N.º 1 o la SEC ID N.º 4, o una parte o una secuencia completa de la secuencia complementaria a la misma, en el que el oligonucleótido tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis usado como el cebador de la presente invención es como se describe en la explicación del oligonucleótido de la presente invención descrito anteriormente en el presente documento.
Adicionalmente, el cebador de la presente invención se puede usar en una región apropiada y una longitud apropiada seleccionada entre el oligonucleótido que comprende una parte o una secuencia completa de la secuencia de ácido nucleico descrito en la SEC ID N.º 1 o la SEC ID N.º 4 o el oligonucleótido que comprende una parte o una secuencia completa de la secuencia complementaria a la misma, de acuerdo con las condiciones objetivo de hibridación del ácido nucleico y teniendo en cuenta la temperatura de disociación (valor de Tm). Preferentemente es una longitud de 10 o más bases, más preferentemente 20 o más bases, que se piensa que es un número de bases necesario para mantener la especificidad como la secuencia del cebador.
En un ejemplo de cebador de la presente invención para su uso en la PCR, por ejemplo, el cebador directo es, preferentemente, un oligonucleótido que comprende una parte o una secuencia completa de la secuencia de ácido nucleico descrita en la SEC ID N.º 2 o una parte o una secuencia completa de la secuencia complementaria de la misma; y el cebador inverso es preferentemente un oligonucleótido que comprende una parte o una secuencia completa de la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID Nº. 4, o una parte o una secuencia completa de la secuencia complementaria a la misma.
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(4)
Detección
Los 5 µl de la solución de reacción obtenida mediante PCR en el apartado (3) anterior se sometieron a electroforesis usando gel de agarosa al 1,5%. Las condiciones eléctricas de la electroforesis fueron de un voltaje constante de 100 V durante 30 minutos. El procedimiento operativo y otras condiciones se realizaron conforme al procedimiento de uso general descrito en "Bio–Experiments Illustrated”, Vol. 2, p. 53–63 (de Nakayama Hiroki, Shujunsha Co. Ltd.). Posteriormente, después del tratamiento con tinción de bromuro de etidio se detectó la fluorescencia inducida por radiación ultravioleta usando el dispositivo de obtención de imágenes de muestras por UV, el sistema FAS–III (Toyobo Co. Ltd.). Simultáneamente, se sometió a electroforesis el marcador del peso molecular junto con la solución de reacción, y se calcula la longitud de la fracción de ADN detectado comparando estas velocidades de migración relativas. La fracción digerida con X 174/HaeIII (marcador 4, Nippon Gene Co. Ltd) se usó como marcador del peso molecular.
(5)
Resultados Los resultados obtenidos de este modo mediante electroforesis se muestran en la Figura 1. En la Figura 1, el número de cada carril muestra los resultados obtenidos mediante el uso de las siguientes
muestras, respectivamente. M4: marcador del peso molecular (marcador 4)
a: Escherichia coli
b: Mycobacterium tuberculosis
c: Mycobacterium kansasii
d: Mycobacterium marinum
e: Mycobacterium simiae
f: Mycobacterium scrofulaceum
g: Mycobacterium gordonae
h: Mycobacterium szulgai
i: Mycobacterium avium
j: Mycobacterium intracellulare
k: Mycobacterium gastri
l: Mycobacterium xenopi
m: Mycobacterium nonchromogenicum
n: Mycobacterium terrae
o: Mycobacterium triviale
p: Mycobacterium fortuitum
q: Mycobacterium chelonei
r: Mycobacterium abscessus
s: Mycobacterium peregrinum
Se predijo el fragmento de ADN de 182 pares de bases (SEC ID N.º 7) de la secuencia de ácido nucleico de IS6110 para su amplificación como el resultado de la PCR usando IS_F6 como cebador directo e IS_R6 como cebador inverso. Por consiguiente, se determinó como positiva una muestra en la que se confirmó la banda fluorescente correspondiente a 182 pares de bases.
Como resulta evidente a partir de los resultados de la Figura 1, como resultado de realizar la PCR usando el cebador IS_F6 y el cebador IS_R6 de la presente invención, solo cuando se usó Mycobacterium tuberculosis como la muestra (b) se puedo confirmar una banda fluorescente de 182 pares de bases y se determinó que la muestra era positiva. Por el contrario, cuando se usaron otras especies bacterianas del género Mycobacterium y una bacteria de otro género, Escherichia coli, como las muestras (a y c a s), no se pudo confirmar la correspondiente banda fluorescente, y, por consiguiente, se determinó que estas muestras determinadas eran negativas.
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l: Mycobacterium xenopi
m: Mycobacterium nonchromogenicum
n: Mycobacterium terrae
o: Mycobacterium triviale
p: Mycobacterium fortuitum
q: Mycobacterium chelonei
r: Mycobacterium abscessus
s: Mycobacterium peregrinum
Según los resultados de la PCR usando el cebador directo IS_F5 y el cebador inverso IS_R5, se puede predecir que hay un fragmento de ADN amplificado de 178 pares de bases (SEC ID N.º 6) en la secuencia de ácido nucleico de IS6110. Por consiguiente, se determinó como positiva una muestra en la que se confirmó una banda fluorescente correspondiente a 178 pares de bases.
Ejemplo comparativo 1
La detección de Mycobacterium tuberculosis se realizó mediante un procedimiento de detección usando una secuencia de cebador preparada según la secuencia de IS6110 conocida públicamente (JP–A–11–514522, Documento de patente 11).
(1) Síntesis del cebador para PCR para detectar Mycobacterium tuberculosis
Entre las secuencias de cebador reveladas en el documento JP–A–11–514522, se sintetizaron un oligonucleótido que tenía la secuencia de "TTCGGACCACCAGCACCTAACC" (SEC ID N.º 9, denominado en lo sucesivo en el presente documento IS_F2) y un oligonucleótido que tenía la secuencia de "CCTTCTTGTTGGCGGGTCCAG" (SEC ID N.º 10denominado en lo sucesivo en el presente documento IS_R2).
La síntesis se realizó mediante el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1 (1).
(2)
Preparación de muestras Se usaron las muestras de ADN obtenidas en el Ejemplo 1 (2).
(3)
PCR
Se usó el IS_F2 preparado en el apartado (1) anterior como cebador directo y el IS_R2 preparado en el apartado (1) anterior se usó como cebador inverso, y la PCR se realizó como se describe a continuación en el presente documento.
En primer lugar se preparó como solución de reacción 10 mM de Tris–HCl (pH 8,9) que contiene 1 µM de cada uno del cebador IS_F2 y del cebador IS_R2, 1,5 mM de MgCl2, 80 mM de KCl, 500 µg/ml de BSA, 0,1 % de colato de sodio, 0,1 % de Triton X–100, 0,2 de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, y 40 unidades/ml de Taq ADN polimerasa (Nippon Gene Co. Ltd.).
Como muestra para la PCR se usó una solución obtenida mediante la adición de 1 ng de muestra de ADN a 20 µl de la solución de reacción para PCR, y se realizó la PCR mediante el mismo equipo que se usó en el Ejemplo 1 (3), en las mismas condiciones de reacción.
(4)
Detección
La detección se realizó mediante el mismo procedimiento del Ejemplo 1 (4), es decir, electroforesis con agarosa al 1,5 %, tinción con bromuro de etidio y detección de fluorescencia inducida por ultravioleta. Se usaron la fracción digerida con λ/Hind III (marcador 1) (carril M1) y la fracción digerida X174/Hae III (marcador 4) (Nippon gene Co. Ltd.) como marcador del peso molecular.
(5)
Resultados Los resultados obtenidos de este modo mediante electroforesis se muestran en la Figura 3–1. En la 3–1, el número de cada carril muestra los resultados obtenidos mediante el uso de las siguientes muestras,
respectivamente. M1: marcador del peso molecular (marcador 1)
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procedimiento de secuenciación directa de PCR usando el kit Sequence de ABI Inc.
En la Figura 3–2, se muestra la secuencia obtenida. Entre las secuencias mostradas en la Figura 3–2, la secuencia del producto de la PCR derivada de la muestra de de Mycobacterium tuberculosis de la fracción (b) se designa como la 1ª secuencia de nucleótidos, que se muestra en la parte superior del listado de secuencias (SEC ID N.º 12). Además, la secuencia del producto de la PCR derivado de la muestra de Mycobacterium triviale obtenido de la fracción (o) se designa como la 2ª secuencia de nucleótidos, y se muestra en la parte inferior de este listado de secuencias (SEC ID N.º 13).
Como resultado del análisis de la secuencia del fragmento de ADN, se confirma que esta secuencia es la secuencia de ácido nucleico derivada de Mycobacterium triviale y se confirma que es idéntica a la secuencia de ácido nucleico de IS6110 específica de Mycobacterium tuberculosis solo en la región de la secuencia del cebador IS_F2 y del cebador IS_R2 usados en el Ejemplo comparativo 1. Por consiguiente, se entiende que cuando se realiza la PCR usando los cebadores públicamente conocidos IS_F2 e IS_R2, también se amplifica una secuencia de ácido nucleico distinta de Mycobacterium tuberculosis y que, por tanto, el cebador tiene un defecto obvio en su diseño.
Teniendo en cuenta lo anterior, se entiende que se puede excluir la consideración de falso positivo y que es posible detectar Mycobacterium tuberculosis de manera específica y precisa en comparación con los cebadores convencionales y el procedimiento de detección de Mycobacterium tuberculosis usando los cebadores, cuando la detección de Mycobacterium tuberculosis se realiza mediante PCR con el oligonucleótido de la presente invención como cebador. En este aspecto, el procedimiento de la presente invención es extremadamente superior en comparación con el procedimiento de detección de Mycobacterium tuberculosis que usa los cebadores convencionales.
Ejemplo 3
Detección de Mycobacterium tuberculosis mediante un sistema de amplificación de PCR en tiempo real
(1)
Síntesis del cebador para PCR para detectar Mycobacterium tuberculosis
Se sintetizaron los oligonucleótidos de IS_F5 e IS_R5 mediante el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1, usando el mismo equipo que en el Ejemplo 1 (1).
(2)
Preparación de la sonda para detectar Mycobacterium tuberculosis
Se diseñó una secuencia "ACCGACGCCTACGCTCGCAG" para utilizar como la sonda a partir de la secuencia oligonucleotídica de SEC ID N.º 6, que se amplificará mediante PCR usando IS_F5 e IS_R5 como cebador, y después se sintetizó el oligonucleótido que tenga esta secuencia (denominado en lo sucesivo en el presente documento IS_F5R5_FANTAM, SEC ID N.º 11). El colorante indicador FAM se ligó al extremo 5’ de este oligonucleótido y el indicador atenuador TAMRA se eligió al extremo 3’ para obtener una sonda oligonucleotídica marcada (sonda marcada fluorescente TaqMan™, Applied Biosystems Japan Inc.).
(3)
Preparación de la muestra de ADN para PCR
Con respecto a la muestra de ADN obtenida de Mycobacterium tuberculosis, preparada en el Ejemplo 1(2), se midió una cantidad de ADN de la muestra midiendo la absorbancia. Se determinó la cantidad de ADN genómico (número de copias del genoma) comparando la cantidad de ADN obtenido con la cantidad conocida del ADN genómico de Mycobacterium tuberculosis. Se obtuvo ADN genómico que tenía 108 copias/µl.
Posteriormente, se diluyó la muestra de ADN para dar series de dilución de 105, 104, 103, 102, 10, 5 y 2 copias/µl usando 10mM de tampón Tris–HCl, pH 8,9 para preparar las muestras de ADN para la PCR.
(4) PCR en tiempo real
La PCR en tiempo real se realizó usando IS_F5 preparado en (1) anteriormente en el presente documento como cebador directo e IS_R5 preparado en (1) anteriormente como cebador inverso de la siguiente manera.
En concreto, se preparó como solución de reacción 10 mM de Tris–HCl (pH 8,9) que contiene 1 µM de cada uno del cebador IS_F5 y del cebador IS_R5, 195 nM de la sonda marcada con fluorescencia IS_F5R5FAMTAM preparada en el apartado (1) anterior,1,5 mM de MgCl2, 80 mM de KCl, 500 µg/ml de BSA, 0,1 % de colato de sodio, 0,1 % de Triton X–100, 0,2 de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, y 40 unidades/ml de Taq ADN polimerasa (Nippon Gene Co. Ltd.).
Una solución preparada mediante la adición de 1 ng de la muestra de ADN de cada serie de dilución a 20 µl de la solución de reacción se usó como muestra para la PCR. Se añadió la muestra para PCR al pocillo de una placa de reacción de 96 pocillos (placa de reacción de 96 pocillos MicroAmp Optical, Applied Biosystems Japan, Inc.) y se realizó la PCR en tiempo real usando el termociclador -sistema de detección de secuencias especificado para la PCR TagMan™ (ABI7000, Applied Biosystems Japan, Inc.). Las condiciones de los ciclos de la PCR fueron 95 ºC durante 10 minutos para mantener el calor, seguidos de 50 ciclos de reacción a 95 ºC durante 15 segundos y a 60
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ºC durante 1 minuto, con la medición del valor de fluorescencia generado por el colorante indicador en cada ciclo. El valor de fluorescencia se midió en cada uno de los pocillos de la placa de reacción de 96 pocillos usando la función del termociclador usado en la medición para digitalizar la proporción relativa de la intensidad de fluorescencia.
(5) Resultados y análisis
La curva de calibración se preparó de acuerdo con el procedimiento convencional usado en la PCR en tiempo real. Concretamente, para preparar una curva de amplificación se representa el valor de la fluorescencia generada por el colorante indicador (Rn, eje y) frente a cada número de ciclo de la PCR (eje x) en cada muestra de ADN para PCR. Posteriormente, se seleccionó la región Rn en la que el valor de la fluorescencia se amplificó exponencialmente y se trazó una línea umbral (Th). Se estableció como ciclo umbral (Ct) un punto de cruce de Th y el valor de fluorescencia de cada muestra de ADN para la PCR. Se representó el valor Ct (eje y) frente al número de copias del genoma de cada muestra de ADN para la PCR usado (eje x, valor logarítmico) y como curva de calibración se usó la curva aproximada obtenida con respecto a cada valor Ct. La curva de calibración obtenida se muestra en la Figura 4.
Y = –3,555 x + 39,13
R2 = 0,996
A partir de los resultados anteriores, dado que se detectó fluorescencia en la PCR en tiempo real, se entiende que se puede detectar Mycobacterium tuberculosis mediante el uso del oligonucleótido de la presente invención como cebador en la PCR y diseñando la sonda marcada de la secuencia de la región de amplificación y realizando la PCR en tiempo real.
Además, como se pudo preparar la curva de calibración, se entiende que es posible determinar cuantitativamente Mycobacterium tuberculosis aplicando la PCR en tiempo real usando el cebador y la sonda de la presente invención. Adicionalmente, a partir de la Figura 4 se entiende que es posible detectar Mycobacterium tuberculosis mediante la PCR en tiempo real usando el cebador y la sonda de la presente invención, incluso en caso de que solo existan dos copias de ADN genómico de Mycobacterium tuberculosis como nivel inicial.
Adicionalmente, cuando se utiliza la PCR en tiempo real, es posible determinar cuantitativamente un nivel inicial de un molde de ADN con exactitud mediante la monitorización de la intensidad de la fluorescencia en tiempo real y, por tanto, el procedimiento es eficaz para detectar Mycobacterium tuberculosis.
Ejemplo 4
Se intentó realizar un diagnóstico simultáneo (diagnóstico selectivo) entre micobacteriosis tuberculosas y no tuberculosas (MNT) utilizando Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium avium (M. avium), Mycobacterium intracellulare (M. intracellulare)o Mycobacterium kansasii (M. kansasii) mediante PCR multiplex, que fue un procedimiento que amplificó simultáneamente múltiples fragmentos en un solo tubo usando varios pares del cebador.
(1)
Síntesis del cebador
(i)
Síntesis del cebador para PCR para detectar Mycobacterium tuberculosis
Se prepararon IS_F5 (SEC ID N.º 1) e IS_R6 (SEC ID N.º 4) mediante el mismo procedimiento del Ejemplo 1 (1) y se usaron como cebador directo y cebador inverso.
(i)
Síntesis del cebador para PCR para detectar M avium
Se prepararon MAV19K F1 (CGGCTGTTCGAGTGGCAACAAGTC mostrado como la SEC ID N.º 15 en el presente documento, en lo sucesivo en el presente documento designado como "cebador directo para detectar M. avium") y MAV19K R1 (CCGTCGATGATGACCTTGGTCCC mostrado como la SEC ID N.º 16, en lo sucesivo en el presente documento designado como "cebador inverso para detectar M. avium"), que fueron "los cebadores oligonucleotídicos específicos de la región genética de la proteína de 19 kDa de avium" descritos en la reivindicación 5 del documento JP–A–11–69999, mediante el mismo procedimiento del ejemplo 1 (1) y se usaron como el cebador directo y el cebador inverso.
(iii) Síntesis del cebador para PCR para detectar M. intracellulare
Se prepararon l secuencia rps1 F1 (CGGGACAAGGTCGCCAAGGTCAAGA mostrada como la SEC ID N.º 17 en el presente documento, en lo sucesivo en el presente documento designado como "cebador directo para detectar M. intracellulare") y la secuencia rps1 R1 (GGGATGTAGGCCGTCACCTCAAC mostrada como la SEC ID N.º 18, en lo sucesivo en el presente documento designado como "cebador inverso para detectar M. intracellulare"), que fueron "los cebadores oligonucleotídicos específicos de la región genética de la proteína del ribosoma s1 de intracellulare" descritos en la reivindicación 6 del documento JP–A–11–69999, mediante el mismo procedimiento del ejemplo 1 (1) y se usaron como el cebador directo y el cebador inverso.
22
(iv) Síntesis del cebador para PCR para detectar M. kansasii
Se prepararon la secuencia (GTCCCTGGCTGCTCTTGA mostrada como SEC ID N.º 19 en la presente memoria, denominada en lo sucesivo en el presente documento "cebador directo para detectar M. kansasii") , que era la secuencia en la que se desplazó una base en sentido 5' en el cebador 15 que se designa por la secuencia KATS2
5 de M. kansasii descrita en la Figura 1 del documento JP–A–11–155589, y cebador E3 (GCTGGTGGAGATGGAGATGTT mostrada como SEC ID N.º 20 de la presente memoria, denominado en lo sucesivo "cebador inverso para detectar M. kansasii") , mediante el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1 (1) y se usaron como cebador directo y cebador inverso.
(2) Preparación de muestras
10 Se usaron las muestras de ADN de Mycobacterium tuberculosis, M. avium, M. intracellulare y M. kansasii obtenidas en el Ejemplo 1 (2).
(3) PCR
Se preparó una solución que contenía 1 µM de cada concentración final del cebador directo y el cebador inverso sintetizados anteriormente en el presente documento (1) , 10mM de Tris–HCl (pH 8,9), 1,5mM de MgCl2, 80mM de
15 KCl, 500 µg/ml de BSA, 0,1 % de colato de sodio, 0,1 % de Triton X–100, 0,2mM de cada de dATP, dCTP, dGTP, dTTP y 40 unidades/ml de polimerasa de Taq (Nippon Gene Co. Ltd.) y se usó como solución de reacción para la PCR.
Las muestras para PCR (1) a (7) se prepararon añadiendo 1 µl (de 0 a 1.000 copias) de cada una de las muestras de ADN a 20 µl de la solución de reacción para PCR como se muestra en la Tabla 1 que figura a continuación, y se 20 realizó la PCR para cada muestra usando el mismo equipo usado en el Ejemplo 1 (3) en las mismas condiciones de reacción. A este respecto, en la Tabla 1, cada uno de los términos avium, intracellulare y kansasii indican M. avium,
M. intracellulare y M. kansasii, respectivamente. Del mismo modo, X indica sin adición de muestra de ADN; ○ indica con adición de muestra de ADN; y el número entre paréntesis de debajo de la marca ○ indica la concentración de la muestra de ADN añadida (número de copias).
25 (Tabla 1)
Adición de la muestra de ADN
ADN de la muestra
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7)
kansasii
× ○ (1.000 copias) × ○ (1.000 copias) ○ (1.000 copias) × ○ (1.000 copias)
○
○
○
○
M. tuberculosis
× (1.000 copias) (1.000 copias) × (10 copias) × (1.000 copias)
intracellulare
× ○ (1.000 copias) × ○ (1.000 copias) ○ (1.000 copias) × ○ (1.000 copias)
avium
× ○ (1.000 copias) × ○ (1.000 copias) ○ (1.000 copias) ○ (1.000 copias) ×
(4) Detección La detección se realizó mediante el mismo procedimiento del Ejemplo 1 (4), es decir, electroforesis con agarosa al 1,5 %, tinción con bromuro de etidio y detección de fluorescencia inducida por ultravioleta. 30 (5) Resultados
Los resultados obtenidos de este modo mediante electroforesis se muestran en la Figura 5. 23
imagen16
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Se usó el mismo cebador que en el Ejemplo 4 (1) (iv).
(2)
Preparación de sonda
(i)
Preparación de la sonda para detectar Mycobacterium tuberculosis
Se diseñó la secuencia "ACCGACGCCTACGCTCGCAG" para utilizar como la sonda a partir de la secuencia oligonucleotídica de SEC ID N.º 6, que se amplificará mediante PCR usando IS_F5 e IS_R5 como cebador, y se sintetizó el oligonucleótido que tenga esta secuencia (denominado en lo sucesivo en el presente documento IS_F5R5_FANTAM, SEC ID N.º 11). Un colorante indicador FAM se ligó al extremo 5’ de este oligonucleótido y el indicador atenuador TAMRA se eligió al extremo 3’ para obtener una sonda oligonucleotídica marcada (sonda marcada fluorescente TaqMan™, Applied Biosystems Japan Inc.).
(ii)
Preparación de la sonda para detectar Mycobacterium avium
Se diseñó la secuencia "CAGCTCGAGCACCAGTGCGTCGG" para utilizarla como sonda, a partir de la secuencia oligonucleotídica que sería amplificada mediante PCR usando el cebador directo para detectar M. avium y el cebador inverso para detectar M. avium como cebadores, y se sintetizó el oligonucleótido que tenía esta secuencia (denominado en lo sucesivo en el presente documento, Mab_F1R1m2_Cy5BHQ, SEC ID N.º 21). El colorante indicador Cy5 se ligó al extremo 5’ de este oligonucleótido y el indicador atenuador BHQ2 se eligió al extremo 3’ para obtener una sonda oligonucleotídica marcada (sonda marcada terminalmente dual para la PCR en tiempo real SIGMA GENOSYSInc..).
(iii) Preparación de la sonda para detectar M. intracellulare
Se diseñó la secuencia "CCTGGCTCGTCAGCTTCACGCG" para utilizarla como sonda, a partir de la secuencia oligonucleotídica que sería amplificada mediante PCR usando el cebador directo para detectar M. intracellulare y el cebador inverso para detectar MM. intracellulare como cebadores, y se sintetizó el oligonucleótido que tenía esta secuencia (denominado en lo sucesivo en el presente documento, Int_F1R1m_VICMGB, SEC ID N.º 22). El colorante indicador VIC se ligó al extremo 5’ de este oligonucleótido y el indicador atenuador MGB se eligió al extremo 3’ para obtener una sonda oligonucleotídica marcada (sonda marcada fluorescente TaqMan™, Applied Biosystems Japan Inc.).
(iv)
Preparación de la sonda para detectar M. kansasii
Se diseñó la secuencia "ATCGTATCCACCATCCTCGACAGCGT" para utilizarla como sonda, a partir de la secuencia oligonucleotídica que sería amplificada mediante PCR usando el cebador directo para detectar M. kansasii y el cebador inverso para detectar M. kansasii como cebadores, y se sintetizó el oligonucleótido que tenía esta secuencia (denominado en lo sucesivo en el presente documento, KATS2_TAMBHQ2, SEC ID N.º 23). El colorante indicador TAMRA se ligó al extremo 5’ de este oligonucleótido y el indicador atenuador BHQ2 se eligió al extremo 3’ para obtener una sonda oligonucleotídica marcada (sonda marcada terminalmente dual para la PCR en tiempo real SIGMA GENOSYSInc..).
(3)
Preparación de muestras
Con respecto a las muestras de ADN obtenidas de Mycobacterium tuberculosis, M avium, M. intracellulare y M. kansasii preparadas en el Ejemplo 1(2), se midió una cantidad de ADN de cada muestra midiendo la absorbancia. Se determinó la cantidad de ADN genómico (número de copias del genoma) comparando la cantidad de ADN obtenido con la cantidad conocida del ADN genómico de Mycobacterium tuberculosis. Se obtuvo ADN genómico que tenía 108 copias/µl.
Posteriormente, se diluyó la muestra de ADN para dar series de dilución de 105, 104, 103, 102, 10, 5 y 2 copias/µl usando 10mM de tampón Tris–HCl, pH 8,9 para preparar la muestra de ADN para la PCR.
(4) Detección mediante PCR en tiempo real
Se preparó una solución que contenía 1 µM de cada concentración final del cebador directo y el cebador inverso sintetizados anteriormente en el presente documento (1), 195 nM de cada uno en una concentración final de la sonda marcada con fluorescencia, 10 mM de Tris–HCl (pH 8,9), 1,5 mM de MgCl2, 80 mM de KCl, 500 µg/ml de BSA, 0,1 % de colato de sodio, 0,1 % de Triton X–100, 0,2m M de cada uno de dATP, dCTP, dGTP, dTTP y 40 unidades/ml de polimerasa de Taq (Nippon Gene Co. Ltd.) y se usó como solución de reacción para la PCR.
Una solución preparada mediante la adición de 1 µl de la muestra de ADN de cada serie de dilución a 20 µl de la solución de reacción se usó como muestra para la PCR. Se añadió la muestra para PCR al pocillo de una placa de reacción de 96 pocillos (placa de reacción de 96 pocillos MicroAmp Optical, Applied Biosystems Japan, Inc.) y se realizó la PCR en tiempo real usando el termociclador -sistema de detección de secuencias especificado para la PCR TagMan™ (ABI7000, Applied Biosystems Japan, Inc.). Las condiciones de los ciclos de la PCR fueron 95 ºC durante 10 minutos para mantener el calor, seguidos de 50 ciclos de reacción a 95 ºC durante 15 segundos y a 60 ºC durante 1 minuto, con medición del valor de fluorescencia generado por el colorante indicador en cada ciclo.
25
imagen17

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  1. imagen1
    imagen2
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