ES2560847T3 - Células madre procedentes de tejido adiposo y células diferenciadas procedentes de estas células - Google Patents

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Yves Saint Laurent Parfums SA
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Abstract

Célula madre humana multipotente y adulta aislada, caracterizada por que presenta: i) una actividad telomerasa endógena de al menos un 20% de la actividad telomerasa de la línea humana transformada HEK293T, ii) un fenotipo HLA Clase I negativo, incluso en presencia del 10% de suero fetal de ternero, iii) un cariotipo normal, iv) una capacidad para entrar en quiescencia después de 50 a 80 duplicaciones de la población, v) una capacidad de auto-renovación conservada durante al menos 130 duplicaciones de la población, y vi) un porcentaje de senescencia inferior al 0,05% en la fase de 60 duplicaciones de la población.

Description

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confluencia, por ejemplo entre un 50% y un 90% de confluencia, más particularmente entre un 60% y un 70% de confluencia.
Una característica importante de las células de la invención es su multipotencialidad. En efecto, son capaces de diferenciarse en al menos dos tipos celulares. Más particularmente, son capaces de diferenciarse en células de origen endodérmico (por ejemplo el hígado) o ectodérmico (células nerviosas: astrocitos, oligodendrocitos y neuronas) o también mesodérmico. Como ejemplos de células del linaje mesodérmico, se pueden citar los adipocitos, los osteoblastos, los miocitos, las células endoteliales y los condrocitos.
En particular, se ha demostrado que las células de la invención, incluso en fases tardías, son capaces de diferenciarse en adipocitos funcionales (demostrado por lipolisis, actividad GPDH, marcadores adipocitarios), en osteoblastos funcionales (demostrado por la presencia de marcadores osteoblásticos y calcificación de la matriz extracelular), en miocitos funcionales, y en células endoteliales. Esta diferenciación puede tener lugar in vitro e in vivo.
Se ha demostrado en particular que las células "CA" de la invención tienen, a nivel clonal, la capacidad de diferenciarse en adipocitos, en osteoblastos, en miocitos, y en células endoteliales, es decir cada célula CA de la invención es capaz de diferenciarse en estos cuatro tipos celulares. Contrariamente a las células adipocitarias, osteoblásticas y miocitarias que pertenecen al "Limb bud mesoderm", las células endoteliales derivan del mesodermo visceral. Las células de la invención no están, por lo tanto, limitadas a una diferenciación en células del linaje mesenquimal, pero pueden diferenciarse más generalmente en células del linaje mesodérmico.
Los inventores han investigado la presencia de marcadores sobre las células madre de la invención. Estos han constatado que expresan los factores de transcripción Oct-4 y Rex-1, y el antígeno de superficie ABCG2 (portador ABC responsable del fenotipo "SP": Zhou S et al., Nature Medicine, 7, n° 9, septiembre de 2001, 1028-1034). Los factores de transcripción Oct-4 y Rex-1 son expresados específicamente en las células madre embrionarias de ratones y humanos. El Oct-4 es indispensable para el mantenimiento de la pluripotencialidad de las células embrionarias de ratones. Se ha mostrado asimismo que el Oct-4 está expresado por las células madre embrionarias humanas.
Se ha podido también observar que las células madre de la invención no reaccionan al "Leukemia Inhibitory Factor" (LIF), a concentraciones de aproximadamente 10 ng/ml. El LIF no produce ningún cambio de morfología o de proliferación de las células. Conforme a los resultados obtenidos por otros investigadores con unas células madre humanas, en particular unas células madre embrionarias, se puede concluir por lo tanto que las células de la invención no expresan aparentemente el receptor para el LIF ("LIF-R") y por lo tanto son LIF-R negativo.
Preferentemente, las células de la invención, después de alcanzar la quiescencia, presentan de manera estable el fenotipo siguiente in vitro:
HLA Clase I negativo,
HLA Clase II negativo,
CD3 negativo,
CD13 positivo,
Oct-4 positivo,
Rex-1 positivo,
ABCG2 positivo.
Estas características fenotípicas se asocian a un cariotipo normal y a una actividad telomerasa significativa. Preferentemente, las células son también LIF-R negativas. Este fenotipo se conserva in vitro de manera estable, es decir en ausencia o en presencia de FGF-2, y a concentraciones de suero fetal de ternera que pueden superar el 10%. El fenotipo se conserva también a densidades de inoculación elevadas, y más allá de 140 duplicaciones de la población.
El tiempo de duplicaciones de la población celulares de la invención varía en función de la proporción de células madre presentes. Por ejemplo, antes de alcanzar la quiescencia, el tiempo de duplicación es de aproximadamente de 36 a 40 horas, lo que refleja la presencia de precursores en la población CA. A medida que la proporción de células madre aumenta, el tiempo de duplicación aumenta también, para alcanzar aproximadamente de 70 a 80 horas en quiescencia. En efecto, las células madre se dividen mucho más lentamente que los precursores. Después de la quiescencia, la adición de factores de crecimiento tales como el bFGF permite reducir de manera significativa el tiempo de duplicación, por ejemplo hasta 36 horas aproximadamente, lo que permite una producción intensiva y
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medio de cultivo se cambia en ausencia de FGF-2 durante 48 horas. Después, las células se mantienen en un medio de diferenciación durante 10 días.
Las células madre y poblaciones de células madre de la invención son particularmente aptas para una utilización en terapia y en cosmetología.
Las utilizaciones terapéuticas de las células madre y poblaciones de células madre de la invención comprenden, entre otro, unas utilizaciones en trasplante y en terapia génica.
Por ejemplo, para una utilización en trasplante, las células de la invención se multiplican en el estado indiferenciado in vitro, seguido de la introducción de las células en un individuo. Las células pueden ser o bien inyectadas en la circulación, o bien implantadas en un sitio anatómico. Las células se diferencian entonces in vivo en función del sitio anatómico lesionado. Por ejemplo, el trasplante intramuscular de células madre de la invención en un individuo que presenta lesiones musculares, dará lugar a una diferenciación y regeneración del músculo. Asimismo, la regeneración de tejido adiposo se puede considerar por diferenciación in vivo de las células en adipocitos.
El trasplante de las células de la invención se puede por lo tanto utilizar para la regeneración de tejido in vivo, por ejemplo un tejido óseo, un tejido adiposo, o un tejido muscular.
Llegado el caso, el trasplante se puede acompañar de la implantación de una matriz susceptible de mejorar la regeneración del tejido, por ejemplo proporcionando un soporte físico para la proliferación de las células o proporcionando unas sustancias tales como unos factores de crecimiento, etc. La matriz puede ser biodegradable.
Según la invención, el trasplante puede ser autólogo o alogénico. Las células de la invención son particularmente adaptadas a los alo-trasplantes debido a su carácter HLA Clase I negativo. Las células pueden por lo tanto ser utilizadas en cualquier individuo independientemente de su genotipo, sin riesgo de rechazo.
Según otra variante, las células madre de la invención se pueden utilizar en el estado diferenciado, por ejemplo en adipocitos, en condrocitos, en osteoblastos, en miocitos, etc. Según esta variante de la invención, las células madre se someten a una diferenciación in vitro, seguida por la introducción de las células diferenciadas en un individuo.
Para las aplicaciones terapéuticas de la invención, las células madre pueden ser genéticamente modificadas o no. Cuando las células son genéticamente modificadas, pueden ser utilizadas en terapia génica para aportar un producto de expresión en un paciente, por ejemplo una proteína heteróloga. Las células modificadas pueden ser cultivadas in vitro en el estado indiferenciado, después ser introducidas en el recipiente. Alternativamente, las células pueden ser multiplicadas in vivo en el estado diferenciado y después ser introducidas en el recipiente.
La invención se refiere también a la realización de métodos quirúrgicos y terapéuticos que emplean las células madre de la invención. Se refiere también a las composiciones farmacéuticas que comprenden las células madre de la invención o a una población de células madre según la invención en asociación con un excipiente fisiológicamente aceptable.
Las células madre de la invención pueden también ser utilizadas para la producción in vitro de proteínas, recombinantes o no, particularmente de proteínas terapéuticas. En efecto, las células de la invención pueden ser cultivadas in vitro durante al menos 100, por ejemplo al menos 200 duplicaciones de la población, y constituyen por lo tanto una fuente casi inagotable de productos de expresión. Las proteínas en cuestión pueden ser unos productos de expresión de genes endógenos a las células madre, o alternativamente, pueden ser unos productos de expresión de genes heterólogos.
Las células o poblaciones de células de la invención pueden también ser utilizadas en sistemas de cribado para identificar unos agentes activos, por ejemplo unos productos de genes, unos extractos séricos, unos medios acondicionados, unos productos de origen animal o vegetal, unos bancos de agentes farmacológicos, etc.
Por ejemplo, la invención comprende un procedimiento de cribado que permite identificar unos agentes susceptibles de modular la diferenciación de células en células del linaje mesodérmico, caracterizado por:
a) el cultivo de células madre o de una población de células madre según la invención en condiciones que permiten su diferenciación en células del linaje mesodérmico (por ejemplo en adipocitos, en osteoblastos o en miocitos) en presencia de un agente candidato,
b) la comparación de la diferenciación de las células en presencia del agente candidato con la diferenciación en ausencia del agente candidato.
El agente en ensayo puede ser un agente susceptible de aumentar la diferenciación, o un agente susceptible de impedir o ralentizar o disminuir la diferenciación (sustancia anti-diferenciadora) o también una sustancia susceptible de modificar la vía de diferenciación.
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La invención comprende también un procedimiento de cribado que permite identificar unos agentes susceptibles de presentar una actividad lipolítica, caracterizado por:
a) la puesta en cultivo de células madre o de una población de células madre según la invención en condiciones que permiten su diferenciación en adipocitos,
b) la puesta en contacto de los adipocitos así obtenidos con un agente candidato, y la evaluación de la actividad lipolítica del agente candidato.
La invención comprende también un procedimiento de cribado que permite identificar unos agentes susceptibles de presentar una actividad anti-lipolítica, caracterizado por:
a) la puesta en cultivo de células madre o de una población de células madre según la invención en condiciones que permiten u diferenciación en adipocitos,
b) la puesta en contacto de los adipocitos así obtenidos con un agente candidato, en presencia de un agente lipolítico,
c) la evaluación de la actividad antilipolítica del agente candidato.
La invención comprende también un procedimiento de cribado que permite identificar unos agentes susceptibles de presentar una actividad insulino-sensibilizante, caracterizado por:
a) la puesta en cultivo de células madre o de una población de células madre según la invención en condiciones que permiten su diferenciación en adipocitos,
b) la puesta en contacto de los adipocitos así obtenidos con un agente candidato,
c) la evaluación de la actividad insulino-sensibilizante del agente candidato, comparado con adipocitos no tratados.
La invención se refiere también a la utilización de las células madre o de una población de células madre según la invención en la cosmética.
En la medida en la que las células madre de la invención pueden diferenciarse en adipocitos, estas pueden ser utilizadas en cirugía estética o reparadora, por ejemplo para reducir el aspecto arrugado de la piel, para difuminar las cicatrices o marcas cutáneas diversas, para efectuar un relleno tisular. La invención se refiere por lo tanto a la realización de estos métodos quirúrgicos que emplean las células de la invención.
Las células madre o poblaciones de células madre según la invención pueden también ser incluidas en unas composiciones cosméticas que comprenden unos excipientes, vehículos, disolventes, colorantes, perfumes, antibióticos u otros productos y aditivos habitualmente utilizados en los productos cosméticos. La inclusión de las células en cremas, pomadas, ungüentos, geles, fluidos diversos, etc. permite su aplicación directamente sobre la piel u otros tejidos o faneras. La invención se refiere por lo tanto también a las composiciones cosméticas que contienen las células madre de la invención en el estado no diferenciado, o que contienen unas células diferenciadas derivadas de las células madre.
Leyendas de las figuras
En la figuras, se ilustran diferentes aspectos de la invención:
Figura 1: actividad -galactosidasa endógena de las células CA y CS detectada a pH 6.
Una coloración Xgal, que revela la actividad -galactosidasa endógena (que traduce la senescencia de las células), efectuada en la fase de 60 duplicaciones de la población, que corresponde a la transferencia celular 20 ("T20") revela que la población CS es senescente (porcentaje de senescencia 0,415 ± 0,025%), mientras que la población CA es simplemente quiescente (porcentaje de senescencia 0,045 ± 0,01%).
Figura 2: efecto del bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) a la concentración de 5 ng/ml de medio) en las poblaciones CA y CS, en fases tardías, es decir después de 50 duplicaciones de la población.
La figura 2 muestra la proliferación de CA ± bFGF y CS ± bFGF (abscisas: días después del esparcimiento de 12000 células/caja de 35 mm de diámetro; ordenadas: número de células (x 1000)/caja). Sólo las células de la población CA responden de manera eficaz a bFGF. Después de 50 duplicaciones de la población, el bFGF no tiene ningún efecto significativo sobre la población CS. Estas observaciones confirman el estado de quiescencia de la población CA y el estado de senescencia de la población CS.
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Línea gruesa: anticuerpo de interés
Figura 21: diferenciación miocitaria in vitro después de 4 días.
Detección por inmuno-histoquimia de la miogenina, factor precoz de la diferenciación micocitaria. La figura 21 ilustra unos micrográficos de células primo2 CA a 150 duplicaciones de la población, después de 4 días en presencia de un medio de diferenciación en micocitos. Las células se fijan con el 4% de paraformaldehído durante 10 minutos a temperatura ambiente, y se permeabilizan en presencia de PBS/0,1% tritón X100 durante 10 minutos; se procede después al bloqueo de la actividad peroxidasa endógena incubando las células con el 3% de H2O2 durante 5 minutos. Las células son después incubadas con el anticuerpo primario: anticuerpo anti-miogenina (espuma antihumano IgG) (1:100) entre 30 minutos y una hora a temperatura ambiente, después con el anticuerpo secundario (antiespuma IgG acoplado con peroxidasa).
Figura 22: diferenciación miocitaria in vitro después de 21 días.
Después de 21 días en presencia de medio de diferenciación en miocitos, detección de la miosina de las fibras musculares rápidas ("fast twitch myosin" o "FT myosin"), marcador tardío de la diferenciación miocitaria (marcador intra-celular). Detección por FACS: después del despegue de las células primo2 CA (150 duplicaciones de la población) estas se fijan en presencia de PBS/1% de formaldehído durante 15 minutos a temperatura ambiente y después se permeabilizan con una solución de digitonina (10 µg/ml de PBS) durante 7 a 8 minutos a temperatura ambiente. Después, se procede al marcado del anticuerpo siguiendo el protocolo descrito para la expresión de los marcadores de superficie (figura 20). El anticuerpo utilizado es un anticuerpo de ratón conjugado directamente con ficoeritrina y que reconoce la FT-miosina humana.
Línea delgada: IgG control
Línea gruesa: FT-miosina
Figura 23: diferenciación en células endoteliales in vitro
Detección por inmuno-histoquimia del "factor von willebrandt" (vWF), marcador específico de las células endoteliales. La figura 23 ilustra la expresión del vWF por las células primo2 CA con 150 duplicaciones de la población, después de 21 días en presencia de medio angiogénico. Las células se fijan con un 4% de paraformaldehído durante 10 minutos a temperatura ambiente y se permeabilizan en presencia de PBS/0,1% tritón X100 durante 10 minutos; se procede después al bloqueo de la actividad peroxidasa endógena incubando las células con un 3% de H2O2 durante 5 minutos. Las células se incuban después con el anticuerpo primario: anti-vWF (Goat IgG que reconoce al mismo tiempo el vWF humano, de rata y de ratón) entre 30 minutos y 1 hora a temperatura ambiente y después con el anticuerpo secundario, anti-goat-IgG acoplado con peroxidasa (1:100). Después de 21 días de mantenimiento en un medio compuesto de DMEM y de hVEGF121 (10ng/ml), las células de primo 2CA expresan el vWF.
Figuras 24 a 27: poder de regeneración muscular in vivo de las células de la primo 2 CA después de 10 días, 50 días, 80 días y 6 meses de trasplante en el ratón mdx sin inmunosupresor: las Figuras 24, 25, 26 y 27 ilustran la colocalización, después de 10 días (Fig 24), 50 días (Fig. 25), 80 días (Fig. 26) y 6 meses (Fig. 27) de trasplante de células Primo 2CA en el Tibial Anterior, de huesos humanos con las fibras musculares que reexpresan la distrofina. Esta co-localización se efectuó por doble marcado de la distrofina por inmunofluorescencia y de los huesos humanos por FISH. Las células trasplantadas son unas células Primo 2CA a 160 duplicaciones de la población, en número de 150000.
La etapa de detección de la distrofina por inmunofluorescencia se efectuó antes de proceder al marcado de los huesos humanos por FISH:
-detección de la distrofina por inmunofluorescencia: las muestras de músculos se incuban durante una hora con un anticuerpo que reconoce la distrofina humana, previamente acoplado con la fluoresceína. Los anticuerpos utilizados son:
o bien un anticuerpo específico de la distrofina humana y de ratón (mouse anti-human IgG1: NCL-DYS2 de Novocastra, dirigido contra el extremo C-terminal de la distrofina humana y de ratón),
o bien un anticuerpo específico de la distrofina humana (mouse anti-human IgG2a: NCL-DYS3 de Novocastra, dirigida contra el extremo N-terminal de la distrofina humana)
-detección de los huesos humanos por FISH: la sonda utilizada para detectar los huesos humanos es una sonda específica de todos los centrómeros humanos (-satélites) acoplada con digoxigenina (CP5095-DG.5, Appligene Oncor). La etapa de detección consiste en la aplicación sobre las láminas de un anticuerpo anti-digoxigenina acoplado con rodamina. Antes del análisis de las muestras, se procede a la coloración de la totalidad de los huesos
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37°C) después a una fijación con metanol/ácido acético (3/1). Los cromosomas se identifican después mediante la técnica de las bandas R (RHG-banding techniques)
3.2 Resultados de la determinación del cariotipo:
5 Se ha realizado el cariotipo de las células. Se efectuaron estos cariotipos sobre las 2 sub-poblaciones CA y CS, en presencia o no de bFGF y en diferentes pasos (T21, T23 y T34 para primo2 CA).
En todos los casos, los cariotipos son totalmente normales. Las células no han sufrido por lo tanto ninguna 10 reestructuración cromosómica. La Figura 4 muestra el cariotipo de las células de la Primo 2CA.
4. Plasticidad celular de las células madre
La plasticidad de las células madre se evalúa según las técnicas siguientes: 15
4.1 Metodología para evaluar la plasticidad celular:
4.1.1. Condiciones de diferenciación en diferentes tipos celulares:
20 Las células son tripsinadas y después inoculadas a 20000 células/cm2. Las células alcanzan la confluencia 24 a 48h después. Al ser la confluencia una etapa crítica para la diferenciación, las células son mantenidas en confluencia durante 24h suplementarias antes de proceder a la diferenciación (adipocitos, osteoblastos, miocitos).
i) Condiciones de diferenciación en adipocitos
25 Las células confluentes son incubadas en un medio DMEM/ Ham's F12 (vol/vol, 1:1) suplementado de 100U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, 5 µg/ml de insulina humana (Sigma), 10 µg/ml de transferrina humana (Sigma), 1 µM de activador de PPAR (por ejemplo BRL49653), 100 a 250 µM de isobutil-metilxantina (IBMX) y 1 µM de dexametasona. Cuarenta y ocho a setenta y dos horas después, este medio se sustituye por el medio
30 anteriormente descrito pero que no contiene ya IBMX y dexametasona. Este medio de diferenciación se sustituye cada 2-3 días, y esto durante un periodo de 15 a 20 días, que corresponde a una diferenciación adipocitaria óptima.
ii) Condiciones de diferenciación en osteoblastos
35 Las células que confluyen desde hace 24h se incuban con el medio de diferenciación osteoblástico compuesto de DMEM, 100 U/ml de penicilina, 100 µg / ml de estreptomicina, 10% de suero fetal de ternera descomplementado, 0,1 µM de dexametasona (SIGMA), 10 mM de β-glicerofosfato (SIGMA) y de 50 µM de ácido ascórbico (SIGMA).
El medio se sustituye cada 2-3 días, durante un periodo comprendido entre 15 y 20 días. 40 iii) Condiciones de diferenciación en miocitos
Las células que confluyen desde hace 24h, se incuban o bien en un medio DMEM, o bien en el medio PromoCell, en presencia del 2% de suero fetal de ternera descomplementado y de antibióticos (100 U/ml de penicilina, 100 µg / ml 45 de estreptomicina). El medio se sustituye cada 2-3 días durante 3 a 6 semanas, particularmente cada tres días, durante 21 días.
iv) Condiciones de diferenciación en células endoteliales
50 Las células son inoculadas a 20 000 /cm2 en un medio DMEM que contiene 10 ng/ml de VEGF121 humano (SIGMA). El medio de diferenciación se sustituye cada 2-3 días, durante 21 días.
4.1.2 Coloraciones
55 i) Coloración Oil Red O (adipocitos: coloración de los lípidos intracelulares)
Después de la fijación en una solución PBS/0.25% glutaraldehído, las células se incuban durante 5 minutos a temperatura ambiente en una solución de Oil Red O 2% (peso/volumen). Después, las células se lavan y se conservan en glicerol al 70%.
60 ii) Coloración Alizarin Red (osteoblastos: Calcificación de la matriz extracelular)
Después de la fijación en una solución PBS/0,25% glutaraldehído, las células se incuban durante 5 minutos a temperatura ambiente con la solución Alizarin Red 1% (peso/volumen). Las células se lavan después con agua y se 65 conservan en seco.
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4.1.3. Análisis de transcripción
i) Extracción de ARN
5 Los ARN celulares son extraídos utilizando el Tri Reagent(Euromedex, Ref TR-118)
ii) Transferencia Northern
Se depositan 20 µg de ARN / pocillo sobre un gel de agarosa (1,2%)/MOPS (1X)/ formaldehído (1,1M). Después de
10 la electroforesis en tampón de migración MOPS (1X), los ARN son transferidos en una membrana de nylon Hybond N+ (Amersham Pharmacia).
La membrana se hibrida después en presencia de una sonda específica, marcada con 32P [dCTP] con la ayuda del kit Rediprime TM II Random Prime Labelling system (Amersham Pharmacia).
15 iii) RT-PCR
La reacción de transcripción inversa PCR se ha realizado utilizando el kit OneStep RT-PCR de Qiagen.
20 4.1.4. Análisis de la expresión de marcadores intracelulares:
Esta técnica se ha utilizado para cuantificar el número de células de primo2 CA capaces de diferenciarse in vitro en miocitos. El marcador analizado es la miosina de las fibras musculares rápidas (fast twitch myosin o FT myosin), marcador tardío de la miogénesis.
25 Después del despegue de las células, estas se fijan en presencia de PBS/1% formaldehído durante 15 min a temperatura ambiente, después se permeabilizan con una solución de digitonina (10 µg/ml de PBS) durante 7 a 8 min a temperatura ambiente.
30 Se procede después al marcado con anticuerpo, siguiendo el protocolo descrito para la detección de los marcadores de superficie (véanse los Ejemplos 7 y 11 a continuación). El anticuerpo utilizado es un anticuerpo de ratón conjugado directamente con ficoeritrina y que reconoce la FT miosina humana.
4.1.5. Inmunohistoquímica
35 Las células se fijan con un 4% de paraformaldehído durante 10 min a temperatura ambiente. Cuando la proteína buscada es nuclear (como por ejemplo la miogenina), las células son permeabilizadas en presencia de PBS/0,1% Tritón X100 durante 10 min. Se procede después al bloqueo de la actividad peroxidasa endógena, incubando las células con un 3% de H2O2 durante 5min.
40 Las células son después incubadas con el anticuerpo primario entre 30 min y 1h a temperatura ambiente, después con el anticuerpo secundario (anti-espuma IgG acoplado con la peroxidasa (Vector Laboratories) o anti-goat IgG acoplado con la peroxidasa (Santa Cruz Biotechnology).
45 Los anticuerpos primarios utilizados en nuestros experimentos, von Willebrand factor (vWF) (goat IgG, que reconocen al mismo tiempo el vWF humano, de rata y de ratón) (Santa Cruz Biotechnology) y miogenina (mouse anti human IgG) (Santa Cruz Biotechnology), se utilizaron al 1:100.
4.2 Resultados del análisis de la plasticidad celular 50
4.2.1. Plasticidad de las dos subpoblaciones celulares CA y CS con fases precoces
En fases precoces (por ejemplo T1, T5, T7, que corresponde a 3, 15 y 21 duplicaciones de la población, respectivamente), las poblaciones CA y CS presentan las mismas características en términos de plasticidad,
55 morfología y proliferación.
i) Diferenciación en adipocitos
Los resultados para los experimentos que implican una coloración Oil Red O se ilustran en la Figura 5 (para Primo
60 2CA y Primo 2CS) y la Figura 14 para Primo 1CA (40 duplicaciones de la población), Primo 3CA (25 duplicaciones de la población) y Primo 6CA (25 duplicaciones de la población). Además, en la Figura 13 se ilustran unos adipocitos procedentes de Primo 1CA, Primo 3CA y Primo 6CA después de 50, 40 y 40 duplicaciones de la población, respectivamente. Una comparación de las Figuras 13 y 14 demuestra claramente que, cuanto más sea elevado el número de duplicaciones de la población, más homogénea es la diferenciación.
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