KR20200037101A

KR20200037101A - 활액막 유래 중간엽 줄기세포 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20200037101A
Application number: KR1020190119759A
Authority: KR
Inventors: 이승진; 김희정; 양영일
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단; 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2019-09-27
Publication date: 2020-04-08
Anticipated expiration: 2039-09-27
Also published as: US20220112465A1; CN113454206A; JP2022513329A; EP3865571A4; WO2020067774A1; EP3865571A1; JP7230219B2; EP3865571B1; ES3014281T3; EP3865571C0; KR102223043B1

Abstract

본 발명은 활액막 조직과 하이드로젤을 이용하여 활액막 유래 중간엽줄기세포를 제조하는 방법, 상기 방법으로 제조된 활액막 유래 중간엽줄기세포, 상기 활액막 유래 중간엽줄기세포를 포함하는 골 또는 연골손상 치료용 약학 조성물, 활액막 조직 및 하이드로젤을 포함하는 중간엽 줄기세포 배양용 조성물 및 키트에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법을 사용하면, 활액막으로부터 줄기세포를 효과적으로 추출하여 수득할 수 있고, 이처럼 수득한 활액막 유래 중간엽줄기세포는 골 또는 연골손상을 효과적으로 치료할 수 있으므로, 골 또는 연골의 손상을 치료하는 방법에 크게 기여할 수 있을 것이다.

Description

활액막 유래 중간엽 줄기세포 및 그의 용도{Mesenchymal stem cells derived from synovium and uses thereof}

본 발명은 활액막 유래 중간엽 줄기세포 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 활액막 조직과 하이드로젤을 이용하여 활액막 유래 중간엽줄기세포를 제조하는 방법, 상기 방법으로 제조된 활액막 유래 중간엽줄기세포, 상기 활액막 유래 중간엽줄기세포를 포함하는 골 또는 연골손상 치료용 약학 조성물, 활액막 조직 및 하이드로젤을 포함하는 중간엽 줄기세포 배양용 조성물 및 키트에 관한 것이다.

뼈(bone)는 인체의 연조직과 체중을 지탱해주고 내부기관을 둘러싸서 내부 장기를 외부의 충격으로부터 보호한다. 또한 근육이나 장기를 구조적으로 지탱할 뿐만 아니라 체내의 칼슘이나 다른 필수 무기질 즉 인이나 마그네슘과 같은 물질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다.

인체를 구성하는 뼈 사이에는 관절이 존재한다. 관절은 두개골이나 이의 치근처럼 서로 접하는 두 개의 뼈나 연골 사이에 가동성이 거의 또는 전혀 없는 부동성관절과, 동물의 팔?다리의 뼈나 턱뼈처럼 양쪽 뼈 사이에 결합조직이 많고 가동성이 큰 가동관절, 연합관절 및 반관절로 나뉜다. 일반적으로 관절이라 하는 것은 가동관절을 말하며, 이 가동관절은 양쪽의 뼈가 인대만으로 결합되어 있는 인대결합과 활액막성 결합으로 나뉜다. 활액막성 결합은 관절이 결합조직성의 주머니(관절낭)로 쌓여 있는 것으로, 관절낭의 안쪽은 윤활유의 성격을 하는 활액을 분비하고 외부에는 많은 인대가 부착되어 있어 관절을 보강한다.

줄기세포(stem cell)란 조직을 구성하는 각 세포로 분화되기 전단계의 세포로서, 미분화 상태에서 무한 증식이 가능하고 특정 분화 자극에 의해 다양한 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재적 가능성을 가진 세포를 말한다.

줄기세포는 분화 가능성에 따라 크게 배아 줄기세포(embryonic stem cell: ES cell)와 성체줄기세포(adult stem cell (조직 특이적 줄기세포(tissue specific stem cell))로 나뉜다. 배아 줄기세포는 수정란이 형성된 후 자궁내막에 착상하기 전의 초기 단계인 포배기(blastocyst) 배아 중 태아로 발생할 세포괴(inner cell mass: ICM)로부터 분리된 줄기세포로서, 모든 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재력을 가지고 있는 세포이다.

반면, 조직 특이적 줄기세포는 배아 발생 과정이 진행되어 배아의 각 장기가 형성되는 단계에 나타나는 각 장기에 특이적인 줄기세포로서, 그 분화능이 일반적으로 그 조직을 구성하는 세포로만 한정(multipotent)된다. 대표적인 조직 특이적 줄기세포는 골수(bone-marrow)에 존재하는 조혈 줄기세포(hematopoietic stem cell)와 혈구 세포 이외의 결합조직(connective tissue) 세포로 분화되는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)가 있다. 조혈 줄기세포는 적혈구, 백혈구등 각종 혈구 세포로 분화되고, 중간엽 줄기세포는 골아세포(osteoblast), 연골아세포(chondroblast), 지방세포(adipocyte) 및 근아세포(myoblast) 등으로 분화된다.

근래에 들어 인간으로부터 배아 줄기세포 분리가 성공한 이후, 그 임상적 적용에 관심이 고조되고 있다. 줄기세포의 적용분야로서 가장 주목받고 있는 것은 세포 대체요법을 위한 세포 공급원으로서의 이용이다.

중간엽 줄기세포에서 연골발생세포(chondrogenic cell), 더 나아가 연골세포(chondrocyto)로의 분화, 즉 연골화분화(chondrogenic differentiation)에는, 사이토카인이나 성장인자들이 관여하고 있다. 정확한 메커니즘은 밝혀지지 않고 있으나, 연골세포로의 분화에 있어서 TGF-β(transforming growth factor beta), IGF(insulin-like growth factor), BMP(bone morphogenic protein), FGF(fibroblast growth factor) 등이 중요한 역할을 담당한다고 알려져 있다. 이에 따라, 줄기세포의 이러한 분화능력을 이용하여, 손상된 관절 조직을 재생 및 항염증 등의 치료에 응용하기 위하여 중간엽 줄기세포 연구에 대하여 보고되고 있다(미국특허등록번호 제6835377호). 또한, 손상된 연골 치료용으로 사용 가능한 세포로서는 환자의 자가 연골세포 이외의 대체 세포 자원으로 골수줄기세포 (Majumdar M. K. et al., J. Cell. Physiol. 185: 98-106, 2000), 제대혈(Gang E. J. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 321: 102-108, 2004), 그리고 활액막(Fickert S. et al., Osteoarthritis Cartilage 11: 790-800, 2003) 등이 연구되고 있다. 그러나, 현재 줄기세포를 이용한 골질환 또는 항염증 치료에 있어서 큰 효과를 나타내지 못하고 있으며, 특히 연골줄기세포를 이용한 골질환 또는 항염증 치료에 관하여 보고된 바 없다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 연골손상의 치료에 사용될 수 있는 새로운 줄기세포를 개발하고자 다양한 연구를 수행한 결과, 활액막 조직에서 유래된 중간엽 줄기세포가 연골손상을 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 주된 목적은 활액막 조직과 하이드로젤을 이용하여 활액막 유래 중간엽줄기세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 활액막 유래 중간엽줄기세포를 제공하는 것이다.

본 빨명의 또 다른 목적은 상기 활액막 유래 중간엽줄기세포를 포함하는 골 또는 연골손상 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 빨명의 또 다른 목적은 활액막 조직 및 하이드로젤을 포함하는 중간엽 줄기세포 배양용 조성물을 제공하는 것이다.

본 빨명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 중간엽 줄기세포 배양용 키트를 제공하는 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태는 활액막 조직과 하이드로젤을 이용하여 활액막 유래 중간엽줄기세포를 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 활액막 유래 중간엽줄기세포를 제공한다. 구체적으로, 활액막 유래 중간엽줄기세포의 제조방법은 (a) 활액막 조직을 하이드로젤 내에 함입시키고 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 배양물에서 하이드로젤을 분해하여 상기 활액막 조직으로부터 하이드로젤 내로 이동 및 증식한 중간엽줄기세포를 회수하는 단계를 포함한다.

본 발명의 용어 "활액막(synovium, synovial membrane, synovial stratum)"이란, 윤활막 또는 활막이라고도 하며, 관절강을 둘러싸고 있는 관절포의 내층을 구성하는 소성결합조직을 의미하는데, 상기 활액막에는 모세혈관이 발달되어 있어 활액의 교환을 활발하게 수행하는 것으로 알려져 있다. 상기 활막은 관절에 따라서 그의 부피가 상이하고, 경우에 따라서는 주름을 형성하여 관절강내에서 지방체를 둘러싸고, 관절의 강소를 메우는 형태를 나타내기도 한다.

본 발명에 있어서, 상기 활액막은 중간엽줄기세포를 분리하기 위한 원천조직으로 이해될 수 있다.

본 발명의 용어 "하이드로젤(hydrogel)"이란, 물을 분산매로 포함하는 젤을 의미한다. 상기 하이드로젤은 주로 냉각으로 인하여 유동성을 상실하거나 3차원 망목 구조와 미결정 구조를 갖는 친수성 고분자가 물을 함유하여 팽창함으로써 생성되는데, 전해질 고분자를 포함하는 하이드로젤은 고흡수성을 나타내기 때문에, 흡수성 고분자로서 다방면에 실용화되어 있다.

본 발명에 있어서, 상기 하이드로젤을 구성하는 친수성 고분자는 활액막 유래 중간엽줄기세포의 제조과정에 사용될 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 콘드로이틴(chondroitin), 하알루로닉산(hyaluronic acid), 알지닌(alginic acid), 메트리젤(MatrigelTM), 키토산(chitosan), 펩티드(peptide), 피브린(fibrin), PGA(polyglycolic acid), PLA(polylactic acid), PEG(polyethylene glycol), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide) 등이 될 수 있고, 이들의 혼합물이 될 수 도 있다.

본 발명에서 제공하는 활액막 유래 중간엽줄기세포를 제조하는 방법의 (a) 단계에 있어서, 활액막 조직을 하이드로젤 내에 함입시키는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 활액막 조직과 하이드로젤을 구성하는 친수성 고분자를 혼합하고, 상기 친수성 고분자를 하이드로젤로 변환시키는 방법; 하이드로젤을 형성하고, 상기 하이드로젤의 내부에 활액막 조직을 물리적으로 투입하는 방법 등에 의해 수행될 수 있다.

상기 (a) 단계에 있어서, 활액막 조직이 함입된 하이드로젤의 배양은 당업계에서 줄기세포 배양에 적합하다고 알려져 있는 통상적인 배지에 활액막 조직이 함입된 하이드로젤을 침지한 후 수행될 수 있다.

상기 배지는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium) 또는 Keratinocyte-SFM (Keratinocyte serum free medium)을 사용할 수 있고, 다른 예로서, D-media(Gibco)를 사용할 수 있다.

상기 배지는 다양한 종류의 첨가제를 추가로 포함할 수 있는데, 일 예로서, 등장액 중의 중성 완충제(예컨대 인산염 및/또는 고농도 중탄산염), 단백질 영양분(예를 들면 혈청, 예컨대 FBS, 혈청 대체물, 알부민, 또는 필수 아미노산 및 비필수 아미노산, 예컨대 글루타민), 지질(지방산, 콜레스테롤, 혈청의 HDL 또는 LDL 추출물), 기타 성분(예컨대 인슐린 또는 트랜스페린, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 피루빈산염, 임의의 이온화 형태 또는 염인 당원, 예컨대 글루코스, 셀레늄, 글루코코르티코이드, 예컨대 히드로코르티존 및/또는 환원제, 예컨대 β-메르캅토에탄올) 등을 첨가제로서 사용할 수 있다. 아울러, 세포의 유착 등을 방지하기 위하여, 항응집제 (anti-clumping agent)를 첨가제로서 사용할 수도 있다.

아울러, 본 발명에서 제공하는 활액막 유래 중간엽줄기세포를 제조하는 방법의 (b) 단계에 있어서, 상기 하이드로젤의 분해는 하이드로젤 내의 줄기세포에는 영향을 미치지 않으면서도, 하이드로젤을 분해할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 효소반응을 이용하는 방법에 의해 수행될 수 있고, 다른 예로서, 콜라지나아제, 젤라티나아제, 유로키나아제, 스트렙토키나아제, TPA(tissue plasminogen activator), 플라즈민(plasmin), 히알루로니다아제 등의 하이드로젤을 형성하는 친수성 고분자의 결합을 절단하는 효소를 사용하는 방법에 의해 수행될 수 있다.

한편, 본 발명에서 제공하는 활액막 유래 중간엽줄기세포를 제조하는 방법에 의해 제조된 중간엽줄기세포는 그의 세포표면에 CD29, CD44, CD73 및 CD90가 발현되는 면역학적 특성을 나타내고, 지방세포, 골세포, 연골세포 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포로 분화될 수 있는 특성을 나타낸다.

특히, 상기 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시킬 때, BMP-7을 처리하면, 연골세포로의 분화효율이 현저하게 증가될 수 있다.

또한, PLGA 스캐폴드를 사용하면 상기 중간엽 줄기세포의 증식을 촉진시킬 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태는 상기 활액막 유래 중간엽줄기세포, 그의 배양물 또는 상기 중간엽줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 골 또는 연골손상 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "치료"란, 상기 활액막 유래 중간엽줄기세포, 그의 배양물 또는 상기 중간엽줄기세포로부터 분화된 세포 등을 투여하여, 골 또는 연골손상의 증세를 호전시키거나 이롭게 하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 무릎관절의 연골 및 대퇴골을 손상시킨 부위에, 활액막 유래 중간엽줄기세포를 주입한 결과, 손상된 골 및 연골을 재생하는 치료효과를 나타내고, 이러한 치료효과는 BMP-7에 의해 향상됨을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 활액막 유래 중간엽줄기세포는 손상된 골 또는 연골부위를 치료하는 효과를 나타낼 수 있는데, 이러한 치료효과는 상기 중간엽줄기세포가 지지체과 혼합된 형태의 것을 사용할 경우에 향상될 수 있다. 구체적으로, 상기 지지체상에 활액막 유래 중간엽줄기세포가 부착된 형태로 배양된 것을 사용할 때 상기 치료효과가 증가될 수 있고, 표면에 BMP-7이 결합된 형태의 지지체를 사용할 경우, 상기 치료효과가 더욱 향상될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 지지체는 활액막 유래 중간엽줄기세포의 치료효과에 영향을 주지않는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, PLGA 스캐폴드가 될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 약학 조성물에 포함된 상기 활액막 유래 중간엽줄기세포의 수준은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 1㎖ 당 1.0×10⁵개 내지 1.0×10⁹개, 다른 예로서, 1.0×10⁶개 내지 1.0×10⁸개, 또 다른 예로서, 1.0×10⁷개의 세포를 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물은 동결되지 않은채 사용되거나 차후 사용을 위해 동결될 수 있다. 동결되어야 할 경우, 표준 냉동보존제 (예를 들어 DMSO, 글리세롤, 에피라이프 (Epilife®) 세포 동결 배지 (Cascade Biologics))가 동결 전 세포 집단에 첨가될 수 있다.

또한, 상기 약학 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 효과적인 투여량을 포함한다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입 백과 같은 주입제, 및 에어로졸 제제와 같은 분무제 등이 바람직하다. 상기 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 만니톨, 링거액 등을 사용할 수 있다. 또한, 주입 백은 염화폴리비닐 또는 폴리에틸렌 재질의 것을 사용할 수 있으며, 박스터 (Baxter), 벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson), 메드셉 (Medcep), 내셔날 호스피탈 프로덕츠 (National Hospital Products) 또는 테루모 (Terumo) 사의 주입 백을 예시할 수 있다.

상기 약학 조성물에는 상기 활액막 유래 중간엽줄기세포 이외에도 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 통상의 불활성 담체, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제 (base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명에서 제공하는 약학 조성물은 상기 활액막 유래 중간엽줄기세포 이외에도 골 또는 연골손상의 치료를 보조하거나, 상기 활액막 유래 중간엽줄기세포의 활성을 유지하거나, 상기 활액막 유래 중간엽줄기세포의 분화를 촉진하는 다양한 성분을 추가로 포함할 수 있는데, 일 예로서, 항염증제제, 줄기세포 동원인자, 성장 유도인자 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 이식 및 기타 용도에 사용되는 다른 줄기세포와 함께 혼합물의 형태로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 치료가 필요한 환자의 질환 부위에 직접 생착 또는 이식하거나 복강에 직접 이식 또는 주입하는 것이 가능하나 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 투여는 카테터를 이용한 비외과적 투여 및 질환부위 절개 후 주입 또는 이식 등 외과적 투여방법 모두 가능하나 카테터를 이용한 비외과적 투여방법이 보다 바람직하다. 또한, 통상의 방법에 따라 비경구적으로, 예를 들면 직접 병변에 투여하는 것 외에 조혈계 줄기세포 이식의 일반적 방법인 혈관 내 주입에 의한 이식도 가능하다.

상기 줄기세포의 1일 투여량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 1.0×10⁴ 내지 1.0×10¹⁰ 세포/kg 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있고, 다른 예로서, 1.0×10⁵ 내지 1.0×10⁹ 세포/kg 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 활액막 조직 및 하이드로젤을 포함하는 중간엽 줄기세포 배양용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 중간엽 줄기세포 배양용 키트를 제공한다.

상술한 바와 같이, 활액막 조직을 하이드로젤 내에 함입시켜서 배양할 경우, 상기 활액막으로부터 유래된 중간엽줄기세포를 효과적으로 제조할 수 있으므로, 상기 활액막 조직 및 하이드로젤을 포함하는 조성물은 중간엽줄기세포 배양용 조성물로서 사용될 수 있다.

아울러, 중간엽 줄기세포 배양용 키트는 상기 중간엽줄기세포 배양용 조성물과 상기 중간엽줄기세포의 배양에 필요한 용액, 장치 등의 다양한 구성요소를 포함할 수 있다.

상기 구성요소는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 테스트 튜브, 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 완충액 농도는 다양), 배양용기, 배양용 배지, 멸균수 등이 될 수 있다.

본 발명의 제조방법을 사용하면, 활액막으로부터 줄기세포를 효과적으로 추출하여 수득할 수 있고, 이처럼 수득한 활액막 유래 중간엽줄기세포는 골 또는 연골손상을 효과적으로 치료할 수 있으므로, 골 또는 연골의 손상을 치료하는 방법에 크게 기여할 수 있을 것이다.

도 1a는 활액막 절편을 14일 동안 배양한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 1b는 synMSC를 계대 15세대 동안 계대배양한 결과를 나타내는 현미경 사진으로서, Passage 1은 계대 1세대(P1)를 나타내고, Passage 5는 계대 5세대(P5)를 나타내며, Passage 15는 계대 15세대(P15)를 나타낸다.
도 2a는 synMSC의 양성 에피토프에 대한 단클론 항체로 면역염색한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2b는 synMSC의 음성 에피토프에 대한 단클론 항체로 면역염색한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2c는 synMSC의 면역염색시 발색된 형광을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3a는 synMSC를 지방세포로 분화유도 한 후, Oil Red O 염색을 수행한 결과를 나타내는 형광현미경 사진이다.
도 3b는 synMSC로부터 분화된 지방세포에서 측정된 Oil Red O 염색수준을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3c는 synMSC를 골세포로 분화유도 한 후, Alizarin Red S 염색을 수행한 결과를 나타내는 형광현미경 사진이다.
도 3d는 synMSC로부터 분화된 골세포에서 측정된 Alizarin Red S 염색수준을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3e는 synMSC를 골세포로 분화유도 한 후, ALP 활성에 의한 BCIP/NBT의 발색수준을 나타내는 형광현미경 사진이다.
도 3f는 synMSC로부터 분화된 골세포에서 측정된 ALP 활성을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4a는 대조군인 BMSCs와 P3 synMSC를 대상으로 H&E 염색 및 alcian blue 염색을 수행한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 4b는 BMSCs와 P3 synMSC를 대상으로 H&E 염색수준을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 4c는 BMSCs와 P3 synMSC를 대상으로 alcian blue 염색수준을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5a는 P3 synMSC(대조군), P3 synMSC로부터 분화된 연골세포(비교군) 및 BMP-7을 사용하여 P3 synMSC로부터 분화된 연골세포(실험군)에서 측정된 sGAGs(sufated glycosaminoglycan) 수준을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5b는 P3 synMSC(대조군), P3 synMSC로부터 분화된 연골세포(비교군) 및 BMP-7을 사용하여 P3 synMSC로부터 분화된 연골세포(실험군)에서 발현된 연골 마커 단백질(SOX-9, 애그리칸(aggrecan) 및 제2형 콜라겐)의 발현수준을 측정한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 5c는 P3 synMSC(대조군), P3 synMSC로부터 분화된 연골세포(비교군) 및 BMP-7을 사용하여 P3 synMSC로부터 분화된 연골세포(실험군)에서 발현된 연골 마커 단백질(SOX-9, 애그리칸(aggrecan) 및 제2형 콜라겐)의 발현수준을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6a는 PLGA 스캐폴드를 사용하여 P3 synMSC를 배양한 후, 생존 세포수의 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6b는 PLGA 스캐폴드를 사용하여 P3 synMSC를 배양할 때, 배양기간의 경과에 따른 형태변화를 나타내는 주사 전자 현미경 사진이다.
도 7은 PLGA 스캐폴드(PLGA scaffold), PLGA 스캐폴드상에 synMSC가 배양된 배양물(PLGA/SynMSC) 및 BMP-7이 결합된 PLGA 스캐폴드상에 synMSC가 배양된 배양물(PLGA/SynMSC/BMP-7)이 이식된 토끼 관절의 대퇴골을 H&E 염색, Safranin-O 염색 및 제2형 콜라겐의 항체를 사용한 면역염색을 수행한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 활액막 유래 중간엽 줄기세포의 수득

토끼(뉴질랜드 흰 토끼, 6-48 주령, 수컷)의 양쪽 무릎관절의 상부 슬개골 주머니(suprapatellar pouch)에서 활액막을 수득하였다. 수득한 활액막을 세절하여 활액막 절편을 수득한 다음 이를 PBS로 세척하였다. 상기 세척된 활액막 절편을 100 μg/ml 아미노메틸벤조산이 포함되고, 1 unit/ml의 트롬빈이 용해된 DMEM 배지에 현탁시키고, 이를 40 mmol/L 염화칼슘이 포함되고, 0.5% 피브리노겐이 용해된 DMEM 배지와 1:1(v/v)로 혼합하여 하이드로젤을 형성하였다. 약 200mg의 활액막 절편을 포함하는 상기 하이드로젤 10 ml을 100mm 배양용기에 담고, 37℃에서 2시간 동안 가습챔버에서 배양한 다음, 이에 10 ml의 1차 성장배지(90% DMEM-Ham's F12, 10% fetal bovine serum, 10 ng/ml epidermal growth factor (EGF), 2 ng/ml basic fibroblast growth factor (bFGF), 10 ng/ml insulin-like growth factor (IGF) 및 10 μg/ml gentamycin)를 가하고, 37℃에서 14일 동안 가습챔버에서 배양하였다. 배양이 종료된 후, 배지를 제거하고, 5000 units 유로키나제와 30% 송아지 혈청을 포함하는 DMEM 배지를 가하여 하이드로젤을 형성하는 피브린을 분해한 다음, 이를 원심분리(150g, 5분)하여, 활액막 유래 중간엽 줄기세포(synMSC)를 수득하였다(도 1a).

도 1a는 활액막 절편을 14일 동안 배양한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.

상기 수득한 synMSC를 PBS로 2회 세척하고, 2차 성장배지(10% v/v FBS with 10 U/ml antibiotics, 10 ng/ml EGF, and 2 ng/ml bFGF in DMEM/Ham's F-12 (1,1) mixture)에 현탁시킨 다음, 7일 동안 계대배양하여 80 내지 90%의 포화도에 도달할 때 배양을 종료하였다. 그런 다음, 상기 배양물에 2.5%(w/v) 트립신-EDTA 용액을 처리하여 세포를 분리한 후, 원심분리하여 계대 1세대(P1)의 synMSC를 수득하였다. 이후, 동일한 방법을 반복수행하여 5개 상이한 계열의 계대 15세대(P15) synMSC를 수득하였다(도 1b).

도 1b는 synMSC를 계대 15세대 동안 계대배양한 결과를 나타내는 현미경 사진으로서, Passage 1은 계대 1세대(P1)를 나타내고, Passage 5는 계대 5세대(P5)를 나타내며, Passage 15는 계대 15세대(P15)를 나타낸다.

도 1b에서 보듯이, 활액막 유래 중간엽 줄기세포(synMSC)는 15번 동안 계대배양 하여도 형태적 특성을 유지할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 2: synMSC의 면역 표현형 분석

실시예 1에서 수득한 다양한 계대 세대의 synMSC 중에서 계대 3세대(P3)의 synMSC를 대상으로, 세포 표면의 에피토프 프로파일을 분석하였다. 이때, 에피토프로는 CD29, CD34, CD44, CD45, CD73 및 CD90을 대상으로 하였다.

대략적으로, 96웰 플레이트에 웰당 1 x 10⁴개의 P3 synMSC를 분주하여 배양하고, 배양이 종료된 후 1% BSA를 포함하는 PBST(0.05% Tween 20을 포함하는 PBS)를 가하여 블로킹하였다. 이어, 상기 에피토프에 대한 각각의 단클론 항체(항-마우스 CD29, 항-토끼 CD44, 항-인간 CD73 PE-Cyanine7, 항-인간 CD90 PE-CyTM7, 항-CD34 PerCPCy5.5 및 항-토끼 CD45)를 가하고 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 세포를 PBS로 3회 세척하고, 1% BSA 및 2차 항체(goat anti-mouse IgG labeled with Alexa Fluor 488, 1:100)를 가한 후, 암실에서 추가로 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 세포를 다시 PBS로 3회 세척하고, DAPI (Molecular probes, OR, USA)를 가한 후, 실온의 암실에서 카운터 염색을 수행하였다. 염색이 종료된 후, Operetta174; High Content Imaging System (PerkinElmer, MA, USA)으로 스캔하고, 형광강도를 정량분석하였다(도 2a 내지 2c). 이때, 대조군으로는 에피토프에 대한 단클론 항체 대신에 Alexa Fluor 488 염소 항-마우스 IgG (H+L)를 처리한 것을 사용하였다.

도 2a는 synMSC의 양성 에피토프에 대한 단클론 항체로 면역염색한 결과를 나타내는 사진이고, 도 2b는 synMSC의 음성 에피토프에 대한 단클론 항체로 면역염색한 결과를 나타내는 사진이며, 도 2c는 synMSC의 면역염색시 발색된 형광을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 2a 내지 2c에서 보듯이, synMSC의 세포표면에는 CD29, CD44, CD73 및 CD90가 발현되고, CD34 및 CD45는 발현되지 않음을 확인하였다.

실시예 3: synMSC의 분화능 분석

실시예 3-1: 지방세포로의 분화

지방분화 유도배지(0.5mM isobutyl-methylxanthin, 1 μM dexamethasone, 10 μM insulin, 200 μM indomethacin, 1% antibiotic in DMEM)가 담겨진 48웰 플레이트의 각 웰에 웰당 1 x 10⁴개의 P3 synMSC를 분주하고 단층으로 8일 동안 배양하여 지방세포로 분화를 유도하였다. 대조군으로는 기초배지(10% FBS in DMEM)에서 배양한 것을 사용하였다. 배양이 종료된 세포에 4% 파라포름알데히드를 처리하여 고정시키고, 지방세포의 특징인 세포내 지질액포를 검출하기 위하여 Oil Red O 염색을 수행한 후, 형광 현미경으로 관찰하였다(도 3a). 이후, 염료의 함량을 정량분석하기 위하여 염색된 세포에 이소프로판올을 가하여 염료를 추출하고, 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다(도 3b).

도 3a는 synMSC를 지방세포로 분화유도 한 후, Oil Red O 염색을 수행한 결과를 나타내는 형광현미경 사진이고, 도 3b는 synMSC로부터 분화된 지방세포에서 측정된 Oil Red O 염색수준을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 3a 및 3b에서 보듯이, synMSC를 지방세포로 분화유도하면 8일 후에 세포내에서 지질액포가 검출되었고, 이는 Oil Red O 염색에 의해 검증되었다.

따라서, synMSC는 지방세포로의 분화능을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 3-2: 골세포로의 분화

골형성 유도배지(100 nM dexamethasone, 50 μg/ml ascorbate-2-phosphate, 10mM β-glycerophosphate, 1% antibiotic suspended in DMEM)가 담겨진 48웰 플레이트의 각 웰에 웰당 1 x 10⁴개의 P3 synMSC를 분주하고 14일 동안 배양하여 골세포로 분화를 유도하였다. 대조군으로는 기초배지(10% FBS in DMEM)에서 배양한 것을 사용하였다. 배양이 종료된 세포에 4% 파라포름알데히드를 처리하여 고정시키고, ALP(alkaline phosphatase)의 기질인 BCIP/NBT (Sigma Aldrich, MO, USA)를 가하여 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 골세포의 특징인 석회질을 검출하기 위하여 Alizarin Red S 염색을 수행한 후, 형광 현미경으로 관찰하고, 이의 염색수준을 정량분석하였다(도 3c 및 3d).

도 3c는 synMSC를 골세포로 분화유도 한 후, Alizarin Red S 염색을 수행한 결과를 나타내는 형광현미경 사진이고, 도 3d는 synMSC로부터 분화된 골세포에서 측정된 Alizarin Red S 염색수준을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 3c 및 3d에서 보듯이, synMSC를 골세포로 분화유도하면 14일 후에 세포내에서 석회질이 검출되었고, 이는 Alizarin Red S 염색에 의해 검증되었다.

또한, 도 3e는 synMSC를 골세포로 분화유도 한 후, ALP 활성에 의한 BCIP/NBT의 발색수준을 나타내는 형광현미경 사진이고, 도 3f는 synMSC로부터 분화된 골세포에서 측정된 ALP 활성을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 3e 및 3f에서 보듯이, synMSC를 골세포로 분화유도하면 14일 후에 골분화 마커로 알려진 ALP의 활성이 약 3배 증가됨을 확인하였다.

따라서, synMSC는 골세포로의 분화능을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 3-3: 연골세포로의 분화

연골 유도배지(1% calf serum, 1× ITS, 0.1mM dexamethasone, 50 μg/ml ascorbate-2-phosphate suspended in DMEM)가 담겨진 폴리-D-리신이 코팅된 6웰 배양용 플레이트의 각 웰에 웰당 1 x 10⁶개의 P3 synMSC를 분주하고 2주 동안 배양하여 연골세포로 분화를 유도하였다. 배양 2일째에 P3 synMSC로부터 스페로이드가 형성되었고, 2일 마다 배지를 교체하였다. 배양이 종료된 후, 배양산물인 스페로이드를 수득하고, 이에 4% 파라포름알데히드를 2시간 동안 처리하여 고정시켰다. 이어, 원심분리(300g, 5 분)하여 스페로이드를 수득하고, 수득한 스페로이드를 PBS로 3회 세척한 후, 50 내지 100%로 증가된 함량의 에탄올 용액을 순차적으로 처리하여 스페로이드를 탈수시켰다. 그런 다음, 상기 스페로이드를 파라핀에 포매시키고, 4 ㎛ 두께의 박편을 수득한 다음, H&E 염색 및 alcian blue 염색을 수행하였다. 핵 부위는 nuclear fast red로 대조염색하였다(도 4a 내지 4c). 이때, 대조군으로는 BMSCs(bone marrow derived stem cells)를 동일 조건으로 분화유도한 결과물을 사용하였다.

도 4a는 대조군인 BMSCs와 P3 synMSC를 대상으로 H&E 염색 및 alcian blue 염색을 수행한 결과를 나타내는 현미경 사진이고, 도 4b는 BMSCs와 P3 synMSC를 대상으로 H&E 염색수준을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 4c는 BMSCs와 P3 synMSC를 대상으로 alcian blue 염색수준을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 4a 내지 4c에서 보듯이, 동일한 조건에서 연골분화를 수행할 경우, 대조군인 BMSCs로 부터 분화된 연골세포 보다도 P3 synMSC로부터 분화된 연골세포의 수준이 현저하게 높은 수준을 나타냄을 확인하였다. 특히, H&E 염색을 수행한 결과, BMSCs로 부터 분화된 연골세포 보다 P3 synMSC로부터 분화된 연골세포가 약 9배 높은 수준을 나타내었고, alcian blue 염색을 수행한 결과, BMSCs로 부터 분화된 연골세포 보다 P3 synMSC로부터 분화된 연골세포가 약 13배 높은 수준을 나타냄을 확인하였다.

따라서, synMSC는 연골세포로의 분화능을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 3-4: 연골세포로의 분화에 미치는 BMP-7의 효과

실시예 3-4-1: BMP-7을 사용한 synMSC의 연골세포 분화유도

BMP-7(50 ng/ml)이 첨가된 연골 유도배지를 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 3-3과 동일하게 P3 synMSC로부터 연골세포의 분화를 유도하였다. 이때, 대조군으로는 연골 유도배지가 아닌 기초 배지(10% FBS in DMEM)를 사용한 배양물을 사용하고, 비교군으로는 상기 실시예 3-3과 동일하게 P3 synMSC로부터 연골세포의 분화를 유도한 것을 사용하였다.

실시예 3-4-2: sGAGs(sulfated glycosaminoglycan) 함량 분석

상기 실시예 3-4-1에서 수득한 대조군, 비교군 및 실험군을 대상으로 sGAGs(sufated glycosaminoglycan)를 정량분석하였다.

대략적으로, 각 시료의 세포 추출물에 Blyscan 염료를 가하고, 진탕조건에서 30분 동안 반응시킨 후, 원심분리(12,000 rpm, 10분)하여 침전물을 수득하였다. 수득한 침전물에 해리시약(dissociation reagent)을 가하여 현탁액을 수득하고, 656 nm에서 흡광도를 측정하였다(도 5a).

도 5a는 P3 synMSC(대조군), P3 synMSC로부터 분화된 연골세포(비교군) 및 BMP-7을 사용하여 P3 synMSC로부터 분화된 연골세포(실험군)에서 측정된 sGAGs(sufated glycosaminoglycan) 수준을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 5a에서 보듯이, P3 synMSC로부터 분화된 연골세포(비교군)에 비하여 BMP-7을 사용하여 P3 synMSC로부터 분화된 연골세포(실험군)에서 현저히 높은 수준의 sGAGs가 검출됨을 확인하였다.

실시예 3-4-3: 연골 마커의 발현수준 분석

상기 실시예 3-4-1에서 수득한 대조군, 비교군 및 실험군을 대상으로 연골 마커 단백질(SOX-9, 애그리칸(aggrecan) 및 제2형 콜라겐)의 발현수준을 RT-PCR을 사용하여 분석하였다.

대략적으로, 각 시료의 세포를 파쇄하고, Trizol 시약 (Invitrogen, CA)을 사용하여 각각의 총 RNA를 추출하였다. 추출된 각각의 총 RNA를 TOPscript™ One-step RT PCR kit (Enzynomics, Daejeon, Korea)에 적용하여 각각의 cDNA를 합성하였다. 합성된 각각의 cDNA를 주형으로 하고 하기 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여 각각의 증폭산물을 수득하고, 이들의 수준을 정량분석하였다(도 5b 및 5c). 이때, 내부대조군으로는 GAPDH를 사용하였다.

SOX-9 F: 5'-CCCGATCTGAAGAAGGAGAGC-3'(서열번호 1)

SOX-9 R: 5'-GTTCTTCACCGACTTCCTCCG-3'(서열번호 2)

aggrecan F: 5'-TGAGGAGGGCTGGAACAAGTACC-3'(서열번호 3)

aggrecan R: 5'-GGAGGTGGTAATTGCAGGGAACA-3'(서열번호 4)

T2 collagen F: 5'-TTCAGCTATGGAGATGACAATC-3'(서열번호 5)

T2 collagen R: 5'-AGAGTCCTAGAGTGACTGAG-3'(서열번호 6)

GAPDH F: 5'-ATTGTTGCCATCAATGACCC-3'(서열번호 7)

GAPDH R: 5'-AGTAGAGGCAGGGATGATGTT-3'(서열번호 8)

도 5b는 P3 synMSC(대조군), P3 synMSC로부터 분화된 연골세포(비교군) 및 BMP-7을 사용하여 P3 synMSC로부터 분화된 연골세포(실험군)에서 발현된 연골 마커 단백질(SOX-9, 애그리칸(aggrecan) 및 제2형 콜라겐)의 발현수준을 측정한 결과를 나타내는 전기영동사진이고, 도 5c는 P3 synMSC(대조군), P3 synMSC로부터 분화된 연골세포(비교군) 및 BMP-7을 사용하여 P3 synMSC로부터 분화된 연골세포(실험군)에서 발현된 연골 마커 단백질(SOX-9, 애그리칸(aggrecan) 및 제2형 콜라겐)의 발현수준을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 5b 및 5c에서 보듯이, P3 synMSC로부터 분화된 연골세포(비교군)에 비하여 BMP-7을 사용하여 P3 synMSC로부터 분화된 연골세포(실험군)에서 연골 마커 단백질(SOX-9, 애그리칸(aggrecan) 및 제2형 콜라겐)이 현저히 높은 수준으로 발현됨을 확인하였다.

실시예 4: 세포증식에 미치는 PLGA 스캐폴드의 효과

실시예 4-1: PLGA 스캐폴드의 제작

PLGA를 디클로로메탄(DCM)에 용해시켜 수득한 20%(w/v) 중합체 용액을 17-gauge 바늘이 구비된 10 ml 주사기에 담고 습식방사 한 후, 롤러를 사용하여 PLGA 섬유를 수득하였다. 수득한 PLGA 섬유를 48시간 동안 건조시킨 후, -70℃에서 3 일 동안 진공건조시켜서 잔류 용매를 제거하였다.

상기 수득한 PLGA 섬유를 사용하여 3차원 형태의 PLGA 스캐폴드를 형성하고, 이를 1.0M PBS (pH 7.4)에 침지하고, 37 °C에서 60 rpm으로 교반하여 PLGA가 분해된 산성부산물을 제거하였다. 산성부산물이 제거된 PLGA 스캐폴드를 PBS로 3회 세척하고, 48시간 동안 진공건조하여, P3 synMSC 배양용 3차원 스캐폴드를 제작하였다.

실시예 4-2: PLGA 스캐폴드의 효과

상기 실시예 4-1에서 제작한 PLGA 스캐폴드에 에탄올을 처리하여 습윤시킨 후, 개당 1 x 10⁶개의 P3 synMSC를 접종하고, PBS로 2회 세척한 다음, 2차 성장배지에서 7일 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, colorimetric CCK-8 assay (Dojindo Molecular Technologies Inc., MD, USA)를 사용하여 생존세포수를 분석하고, 주사 전자 현미경 (SEM)으로 형태를 분석하였다(도 6a 및 6b). 이때, 대조군으로는 동일한 조건으로 P3 synMSC를 24-웰 플레이트에서 배양한 것을 사용하였다.

도 6a는 PLGA 스캐폴드를 사용하여 P3 synMSC를 배양한 후, 생존 세포수의 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 6b는 PLGA 스캐폴드를 사용하여 P3 synMSC를 배양할 때, 배양기간의 경과에 따른 형태변화를 나타내는 주사 전자 현미경 사진이다.

도 6a 및 6b에서 보듯이, 24-웰 플레이트 보다는 PLGA 스캐폴드를 사용할 경우, P3 synMSC의 배양효율이 증가됨을 확인하였는데, 이는 시간의 경과에 따라 PLGA 스캐폴드에 대한 P3 synMSC의 부착율이 증가하고, 이에 의해 증식율이 증가되기 때문인 것으로 분석되었다.

실시예 4-3: BMP-7이 결합된 PLGA 스캐폴드의 제작

재조합 인간 BMP-7 단백질 (3 μg)을 10 μL의 PBS에 용해시킨 후, 아세톤/에탄올(9:1) 용매에서 0.2%(w/v) PLGA와 함께 유화시켜서, BMP-7의 유중수(water-in-oil) 현탁액(1:100 w/o ratio)을 수득하고, 이를 17-gauge 바늘이 구비된 10 ml 주사기에 담고 전기 분무법(10 kV voltage, 0.033 ml/min flow rate)으로 PLGA 섬유에 방사하여, PLGA 섬유상에 캡슐화된 BMP-7이 결합된 형태의 PLGA 스캐폴드를 제작하였다.

실시예 5: synMSC를 이용한 연골손상의 치료

상기 실시예 4-1에서 제작한 PLGA 스캐폴드(PLGA scaffold), 실시예 4-2에서 제작한 PLGA 스캐폴드상에 synMSC가 배양된 배양물(PLGA/SynMSC) 및 실시예 4-3에서 제작한 BMP-7이 결합된 PLGA 스캐폴드상에 synMSC가 배양된 배양물(PLGA/SynMSC/BMP-7)을 각각 준비하고, 이들을 사용하여 각각 1mm 두께와 10mm 길이의 임플란트를 제작하였다.

한편, 평균 체중 3.2kg인 4월령 수컷 뉴질랜드 흰토끼에 자일라진(5 mg / kg)을 근육내 주사하여 전신마취하고, 무릎관절을 절개하여 슬개골을 노출시켰다. 노출된 슬개골로부터 약 1mm 두께의 연골을 제거하고, 치과용 드릴로 대퇴골의 홈에 3 개의 골 연골 결함 (직경 2mm 및 깊이 3mm)을 생성 하였다. 상기 생성된 결함 부위에 앞서 제작한 각각의 임플란트를 이식하여 수술을 종료하고, 트라마돌(5mg/kg) 및 옥시테트라사이클린(20mg/kg)을 주사한 다음, 일반적인 조건에서 사육하였다.

6주 후, 각각의 토끼를 희생시키고, 이들의 무릎부위로부터 대퇴골을 적출한 다음, 10 % 중성 완충 포르말린 (pH 7.4, BBC Biochemical, Mount Vernon, USA, WA) 용액을 사용하여 5일 동안 고정하였다. 고정된 대퇴골에 0.5% EDTA 용액을 처리하여 석회질을 제거한 다음, 파라핀에 포매하였다. 포매된 대퇴골을 세절하여 4 μm 두께의 조직박편을 수득하고, 수득한 조직박편을 대상으로 H&E 염색 및 Safranin-O 염색을 수행하였다(도 7).

또한, 상기 조직박편을 3% 과산화수소 메탄올 용액에 30분 동안 침지하여 내인성 페록시다제의 활성을 억제한 다음, 이에 proteinase K (Sigma-Aldrich, MO, USA)를 가하고 37 ℃에서 10 분 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 상기 조직절편을 제2형 콜라겐의 항체(Calbiochem, CA, USA, dilution 1:100)로 염색하고, Vectastain Elite ABC-Peroxidase kit (Vector Laboratories Inc., CA, USA)를 사용한 면역염색을 수행하였다. 항체반응은 Vector SG (Vector Laboratories Inc., CA, USA)를 사용하여 발색시키고, nuclear fast solutions (Vector Laboratories Inc., CA, USA)를 사용하여 대조염색하였다(도 7).

도 7은 PLGA 스캐폴드(PLGA scaffold), PLGA 스캐폴드상에 synMSC가 배양된 배양물(PLGA/SynMSC) 및 BMP-7이 결합된 PLGA 스캐폴드상에 synMSC가 배양된 배양물(PLGA/SynMSC/BMP-7)이 이식된 토끼 관절의 대퇴골을 H&E 염색, Safranin-O 염색 및 제2형 콜라겐의 항체를 사용한 면역염색을 수행한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.

도 7에서 보듯이, 손상된 부위를 치료하지 않은 대조군의 경우에는 연골층이 재생되지 않았고, 단순히 섬유조직으로만 덮여 있으며, Safranin-O 염색이 수행되지 않았다. 그러나, PLGA 스캐폴드 임플란트가 이식된 부위는 연골층이 형성되었으나, 연골세포가 적게 포함되어 얇은 연골층이 형성되었으며, 프로테오글리칸 역시 소량으로 형성되었다. 또한, PLGA 스캐폴드상에 synMSC가 배양된 배양물 임플란트가 이식된 부위는 세포수준이 증가하였고, 표면에 연골이 재생됨을 확인하였다. 끝으로, BMP-7이 결합된 PLGA 스캐폴드상에 synMSC가 배양된 배양물 임플란트가 이식된 부위는 두터운 연골층이 재생되었고, 제2형 콜라겐 역시 다량으로 존재함을 확인하였다.

따라서, 상기 synMSC는 손상된 골 및 연골을 재생하는 치료효과를 나타내고, 이러한 치료효과는 BMP-7에 의해 향상됨을 알 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation inje university industry-academic cooperation foundation <120> Mesenchymal stem cells derived from synovium and uses thereof <130> KPA191099-KR-P1 <150> KR 10-2018-0116496 <151> 2018-09-28 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cccgatctga agaaggagag c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gttcttcacc gacttcctcc g 21 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tgaggagggc tggaacaagt acc 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggaggtggta attgcaggga aca 23 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ttcagctatg gagatgacaa tc 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 agagtcctag agtgactgag 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 attgttgcca tcaatgaccc 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 agtagaggca gggatgatgt t 21

Claims

(a) 활액막 조직을 하이드로젤 내에 함입시키고 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및
(b) 상기 수득한 배양물에서 하이드로젤을 분해하여 상기 활액막 조직으로부터 하이드로젤 내로 이동 및 증식한 중간엽줄기세포를 회수하는 단계를 포함하는, 활액막 유래 중간엽줄기세포의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 하이드로젤은 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 콘드로이틴(chondroitin), 하알루로닉산(hyaluronic acid), 알지닌(alginic acid), 메트리젤(MatrigelTM), 키토산(chitosan), 펩티드(peptide), 피브린(fibrin), PGA(polyglycolic acid), PLA(polylactic acid), PEG(polyethylene glycol), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 물질로 구성되는 것인, 활액막 유래 중간엽줄기세포의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 하이드로젤의 분해는 콜라지나아제, 젤라티나아제, 유로키나아제, 스트렙토키나아제, TPA(tissue plasminogen activator), 플라즈민(plasmin), 히알루로니다아제 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 효소의 처리에 의해 수행되는 것인, 활액막 유래 중간엽줄기세포의 제조방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되고; 세포 표면에 CD29, CD44, CD73 및 CD90가 발현되는 면역학적 특성을 가지는, 활액막 유래 중간엽줄기세포.
제4항에 있어서,
상기 중간엽줄기세포는 지방세포, 골세포, 연골세포 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포로 분화될 수 있는 것인, 활액막 유래 중간엽줄기세포.
제4항의 활액막 유래 중간엽줄기세포, 그의 배양물 또는 상기 중간엽줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는, 골 또는 연골손상 치료용 약학 조성물.
제6항에 있어서,
상기 중간엽줄기세포는 지지체과 혼합된 형태인 것인, 골 또는 연골손상 치료용 약학 조성물.
제7항에 있어서,
상기 지지체는 PLGA 스캐폴드인 것인, 골 또는 연골손상 치료용 약학 조성물.
제6항에 있어서,
상기 약학 조성물은 BMP-7을 추가로 포함하는 것인, 골 또는 연골손상 치료용 약학 조성물.
활액막 조직 및 하이드로젤을 포함하는 중간엽 줄기세포 배양용 조성물.
제10항의 중간엽 줄기세포 배양용 조성물을 포함하는 중간엽 줄기세포 배양용 키트.