ES2633604T3 - Métodos para usar células regenerativas derivadas de adiposo en el tratamiento de una enfermedad vascular periférica - Google Patents
Métodos para usar células regenerativas derivadas de adiposo en el tratamiento de una enfermedad vascular periférica Download PDFInfo
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Abstract
Una composición que comprende una población concentrada de células derivadas del tejido adiposo para su uso en el tratamiento de la enfermedad vascular periférica (PVD) fuera del corazón y del sistema nervioso central en un sujeto que lo necesite, en la que dicha población concentrada de células derivadas de adiposo se administrará a un paciente que lo necesite sin cultivar las células derivadas del tejido adiposo antes de administrarlas al sujeto, en la que las células derivadas de adiposo se obtienen mediante el procesamiento de tejido adiposo para separar las células derivadas de adiposo de adipocitos maduros y tejido conectivo, y lavando, separando y concentrando dichas células derivadas de adiposo, en la que dicha población concentrada de células derivadas del tejido adiposo comprende una concentración celular mínima de aproximadamente 1 x 105 a aproximadamente 1 x 107 células/ml, y en la que al menos el 0,1 % del componente celular de la población concentrada de células derivadas de adiposo son células madre.
Description
Como se usa en el presente documento, "composición de células regenerativas" se refiere a la composición de células típicamente presentes en un volumen de líquido después de lavar y, al menos parcialmente, desagregar un tejido, por ejemplo, tejido adiposo. Por ejemplo, una composición celular regenerativa de la invención comprende 5 múltiples tipos diferentes de células regenerativas, incluyendo ASC, células endoteliales, células precursoras endoteliales, células progenitoras endoteliales, macrófagos, fibroblastos, pericitos, células de músculo liso, preadipocitos, adipocitos diferenciados desdiferenciados, queratinocitos, células progenitoras y precursoras unipotentes y multipotentes (y su progenie), y linfocitos. La composición de células regenerativas también puede contener uno o más contaminantes, tales como colágeno, que pueden estar presentes en los fragmentos de tejido, o
10 colagenasa residual u otra enzima o agente empleado en o resultante del proceso de desagregación tisular descrito en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, "medicina regenerativa" se refiere a cualquier beneficio terapéutico, estructural o cosmético que se derive de poner, directa o indirecta, células regenerativas en un sujeto. Como se usa 15 en el presente documento, "enfermedad vascular periférica (PVD)" se refiere a enfermedades y trastornos de la circulación de los vasos sanguíneos fuera del corazón y del cerebro e incluye, pero no se limita a, PVD funcional, PVD orgánico, enfermedad arterial periférica (PAD), enfermedad artrosclerótica oclusiva, arteriosclerosis, lesión traumática de vasos y arteritis inflamatorias. Específicamente, la PVD está caracterizada a menudo por un estrechamiento de los vasos que llevan la sangre a la pierna y los músculos del brazo. Por ejemplo, en la PAD, que
20 es una afección similar a la arteriopatía coronaria y la arteriopatía carotídea, los depósitos grasos se acumulan a lo largo de las paredes arteriales y afectan la circulación sanguínea, principalmente en las arterias que conducen a las piernas y los pies. Las personas con PAD tienen un mayor riesgo de muerte por accidente cerebrovascular y ataque al corazón, debido al riesgo de coágulos sanguíneos.
25 Como se usa en el presente documento, el término "angiogénesis" se refiere al proceso mediante el cual se generan nuevos vasos sanguíneos a partir de la vasculatura y el tejido existentes (Folkman, 1995). La expresión "reparación
o remodelación" se refiere a la reforma de la vasculatura existente. El alivio de la isquemia tisular es críticamente dependiente de la angiogénesis. El crecimiento espontáneo de nuevos vasos sanguíneos proporciona circulación colateral en y alrededor de un área isquémica, mejora el flujo sanguíneo y alivia los síntomas causados por la 30 isquemia. Las enfermedades y trastornos mediados por la angiogénesis incluyen infarto agudo de miocardio, cardiomiopatía isquémica, enfermedad vascular periférica, accidente cerebrovascular isquémico, necrosis tubular aguda, heridas isquémicas, incluyendo AFT, sepsis, enfermedad isquémica intestinal, retinopatía diabética, neuropatía y nefropatía, vasculitis, encefalopatía isquémica, disfunción eréctil, lesiones fisiológicas, isquémicas o traumáticas de la médula espinal, insuficiencia multiorgánica, enfermedad isquémica de las encías e isquemia
35 relacionada con el trasplante.
Como se usa en el presente documento, "célula madre" se refiere a una célula regenerativa multipotente con el potencial de diferenciarse en una diversidad de otros tipos celulares, que realizan una o más funciones específicas y tienen la capacidad de auto-renovarse. Algunas de las células madre desveladas en el presente documento pueden
40 ser multipotentes.
Como se usa en el presente documento, "célula progenitora" se refiere a una célula regenerativa multipotente con el potencial de diferenciarse en más de un tipo de célula y tiene limitada o ninguna capacidad de auto-renovación. "Célula progenitora", como se usa en el presente documento, también se refiere a una célula unipotente con el
45 potencial de diferenciarse en un único tipo de célula, que realiza una o más funciones específicas y tiene limitada o ninguna capacidad de auto-renovación. En particular, como se usa en el presente documento, "célula progenitora endotelial" se refiere a una célula multipotente o unipotente con el potencial de diferenciarse en células endoteliales vasculares.
50 Como se usa en el presente documento, "célula precursora" se refiere a una célula regenerativa unipotente con el potencial de diferenciarse en un tipo de célula. Las células precursoras y su progenie pueden conservar una amplia capacidad proliferativa, por ejemplo, linfocitos y células endoteliales, que pueden proliferar en las condiciones apropiadas.
55 Como se usa en el presente documento, la expresión "factor angiogénico" o "proteína angiogénica" se refiere a cualquier proteína, péptido u otro agente conocido capaz de promover el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de la vasculatura existente (angiogénesis). Los factores angiogénicos adecuados para uso en la invención incluyen, pero no se limitan a, factor de crecimiento placentario (Luttun et al., 2002), factor estimulante de colonias de macrófagos (Aharinejad et al., 1995), factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (Buschmann et
7
cual se extrae el tejido. Por ejemplo, el porcentaje de células regenerativas de 100 ml de tejido adiposo extraído de un individuo delgado es mayor que el extraído de un donante obeso (Tabla 1). Esto probablemente refleja un efecto dilutivo del aumento del contenido de grasa en el individuo obeso. Por lo tanto, puede ser deseable, de acuerdo con un aspecto de la invención, obtener cantidades mayores de tejido de los donantes con sobrepeso en comparación
5 con las cantidades que se extraerán de los pacientes más delgados. Esta observación también indica que la utilidad de esta invención no se limita a individuos con grandes cantidades de tejido adiposo.
Tabla 1: Efecto del índice de masa corporal sobre el tejido y el rendimiento celular
- Estado del índice de masa corporal
- Cantidad de tejido obtenido (g) Rendimiento total de células regenerativas (x 107)
- Normal
- 641 ± 142 2,1 ± 0,4
- Obeso
- 1.225 ± 173 2,4 ± 0,5
- valor de p
- 0,03 0,6
10 Después de que el tejido adiposo se procesa, las células regenerativas resultantes están sustancialmente libres de adipocitos maduros y tejido conectivo. Por consiguiente, el sistema de la presente invención genera una pluralidad heterogénea de células regenerativas derivadas de adiposo que pueden usarse con fines de investigación y/o terapéuticos. En una realización preferida, las células son adecuadas para su colocación o re-infusión dentro del cuerpo de un receptor. En otras realizaciones, las células pueden usarse para investigación, por ejemplo, las células
15 pueden usarse para establecer líneas de células madre o progenitoras que pueden sobrevivir durante largos períodos de tiempo y usarse para un estudio adicional.
A continuación se hará referencia en detalle a las realizaciones actualmente preferidas de la invención, cuyos ejemplos se ilustran en los dibujos adjuntos. Siempre que sea posible, se utilizan los mismos números de referencia 20 o similares en los dibujos y la descripción para referirse a las mismas o partes similares. Debe observarse que los dibujos están en forma simplificada y no son de escala precisa. En referencia a la divulgación del presente documento, sólo para fines de conveniencia y claridad, los términos direccionales, tales como, parte superior, fondo, izquierda, derecha, arriba, abajo, sobre, por encima, por debajo, abajo, posterior, frontal, distal y proximal se usan con respecto a los dibujos adjuntos. Dichos términos direccionales no deben interpretarse para limitar el alcance de
25 la invención de ninguna manera.
Haciendo referencia ahora a las figuras, un sistema 10 de la presente invención está compuesto generalmente por una o más de una cámara de recogida de tejido 20, una cámara de procesamiento 30, una cámara de desecho 40, una cámara de salida 50 y una cámara de muestra 60. Las diversas cámaras están acopladas entre sí a través de 30 uno o más conductos 12 de tal forma que los fluidos que contienen material biológico pueden pasar de una cámara a otra mientras se mantiene una trayectoria de fluido/tejido estéril cerrada. Los conductos pueden comprender cuerpos rígidos o flexibles denominados en el presente documento de manera intercambiable como lúmenes y tubos, respectivamente. En ciertas versiones, los conductos están en forma de tubos flexibles, tales como tubos de polietileno usados convencionalmente en entornos clínicos, silicona o cualquier otro material conocido en la técnica. 35 Los conductos 12 pueden variar en tamaño dependiendo de si se desea el paso de fluido o tejido. Los conductos 12 también pueden variar en tamaño dependiendo de la cantidad de tejido o fluido que se hace circular a través del sistema. Por ejemplo, para el paso de fluido, los conductos pueden tener un diámetro que varía de aproximadamente 0,060 a aproximadamente 0,750 pulgadas y para el paso de tejido, los conductos pueden tener un diámetro que varía de 0,312 a 0,750 pulgadas. Generalmente, el tamaño de los conductos se selecciona para equilibrar el 40 volumen que los conductos pueden alojar y el tiempo requerido para transportar el tejido o fluidos a través de dichos conductos. En versiones automatizadas del sistema, los parámetros anteriores, es decir, el volumen y el tiempo de transporte, deben identificarse de tal manera que las señales apropiadas puedan ser transmitidas al dispositivo de procesamiento del sistema. Esto permite que el dispositivo mueva volúmenes precisos de líquido y tejido de una cámara a otra. El tubo flexible utilizado debe ser capaz de soportar la presión negativa para reducir la probabilidad
45 de colapso. El tubo flexible utilizado debe ser también capaz de soportar una presión positiva que se genera, por ejemplo; una bomba de desplazamiento positivo, que puede utilizarse en el sistema.
Todas las cámaras del sistema pueden estar compuestas por uno o más puertos, por ejemplo, puertos de salida 22
o de entrada 21, que aceptan conexiones de tubos de jeringa estándar IV y succión. Los puertos pueden ser un
50 puerto sellado, tal como un puerto de acceso de aguja de jeringa cerrada por un tapón de caucho 51. Los puertos de entrada pueden acoplarse a una o más cánulas (no mostradas) a través de conductos. Por ejemplo, un puerto de entrada de tejido 21 puede acoplarse a una cánula integrada de liposucción de uso único y el conducto puede ser un tubo flexible. Los conductos están colocados generalmente para proporcionar pasos de fluido desde una cámara del sistema a otra. Con este fin, los conductos y puertos pueden acoplarse, por ejemplo, a un dispositivo de succión (no
10
sola mediante el uso de válvulas que dirigen la fuerza de vacío a los diferentes conductos que lo necesitan en puntos específicos en la proceso. Además, la bomba de vacío 26 puede estar acoplada al recipiente de residuos 40 a través de un conducto, tal como el conducto 12f.
5 Con referencia a las figuras 10 y 11, la presión generada por la bomba de vacío 26 puede utilizarse para dirigir el flujo de fluidos, incluyendo las células regenerativas, a través de los conductos 12. Esta presión puede suministrarse en múltiples direcciones, por ejemplo, controlando automática o manualmente la posición de una o más válvulas 14 en el sistema 10. El sistema 10 puede hacerse funcionar correctamente con el uso de presión positiva o mediante el uso de presión negativa, o combinaciones de las mismas. Por ejemplo, las células regenerativas pueden ser
10 arrastradas a través del primer y segundo filtros descritos anteriormente en un recipiente de lados blandos que está conectado al tercer filtro. El recipiente de lados blandos puede estar en línea (serie) conectado antes del tercer filtro. La cámara de salida final puede ser un recipiente de lados blandos que está en el otro lado (por ejemplo, el lado de aguas abajo) del tercer filtro. En esta versión, se utiliza presión para mover las células regenerativas de un recipiente de lados blandos a un segundo recipiente de lados blandos a través del filtro.
15 En otra versión del sistema 10, la filtración de las células madre y/o células progenitoras derivadas de adiposo se puede llevar a cabo usando una combinación de filtración por percolación y sedimentación. Por ejemplo, dicho sistema usa una solución salina que se pasa a través de una composición de células regenerativas tisulares (por ejemplo, la composición que contiene las células madre y/o células progenitoras derivadas de adiposo) y a
20 continuación a través de un filtro. Algunas de las variables que están asociadas con la filtración por percolación de células de una composición de células regenerativas incluyen, pero no se limitan a, tamaño de poro del medio filtrante, geometría o forma de poro, área superficial del filtro, dirección de flujo de la composición de células regenerativas que se están filtrando, velocidad de flujo de la solución salina infundida, presión transmembrana, dilución de la población celular, tamaño y viabilidad celular.
25 En una versión del sistema 10, la cámara de procesamiento 30 utiliza un conjunto de filtro 36 que implementa filtración percolativa y sedimentación para separar y concentrar las células regenerativas. A modo de ejemplo, y no a modo de limitación, la cámara de procesamiento 30 se define como un cuerpo generalmente cilíndrico que tiene una pared lateral 30a, una superficie superior 30b, y una superficie inferior 30c, como se muestra en la figura 6. Se
30 proporciona un respiradero estéril 32 en la superficie superior 30b.
En la versión de la figura 6, se ilustra la cámara de procesamiento 30 que incluye un conjunto de filtro 36, que incluye dos filtros, tales como un filtro de poro grande 36a y un filtro de poro pequeño 36b. Los tamaños de poro de los filtros 36a y 36b típicamente están en un intervalo entre aproximadamente 0,05 micrómetros y aproximadamente 35 10 micrómetros. El filtro de poro grande 36a puede comprender poros con un diámetro de aproximadamente 5 μm, y el filtro de poro pequeño 36b puede comprender poros con un diámetro de aproximadamente 1-3 μm. En una versión, los filtros tienen un área superficial de aproximadamente 785 mm2. Los filtros 36a y 36b dividen un interior de la cámara de procesamiento 30 para incluir una primera cámara 37a, una segunda cámara 37b y una tercera cámara 37c. Como se muestra en la figura 6, la primera cámara 37a está situada entre la segunda cámara 37b y la 40 tercera cámara 37c. Además, la primera cámara 37a se muestra como la región de la cámara de procesamiento 30 que tiene un puerto de entrada 31a y un puerto de salida 31b. La cámara de procesamiento ilustrada 30 incluye una pluralidad de puertos que proporcionan trayectos de comunicación desde un exterior de la cámara de procesamiento 30 al interior de la cámara de procesamiento 30, tales como los puertos 31a, 31b y 31c. Los puertos 31a, 31b y 31c están ilustrados dispuestos en la pared lateral 30a de un cuerpo de la cámara de procesamiento 30. Sin embargo, 45 los puertos 31a, 31b y 31c también podrían estar situados en otras regiones. El puerto 31a se ilustra como un puerto de entrada de muestra, que está construido para acoplarse a un conducto de manera que una composición que contiene células regenerativas pueda pasar al interior de la cámara de procesamiento 30. El puerto 31b se ilustra como un puerto de salida construido para acoplarse a un conducto de manera que las células separadas y concentradas puedan retirarse del interior de la cámara de procesamiento 30. El puerto 31c se ilustra como un
50 puerto de entrada construido para acoplarse a un conducto para el suministro de una solución de lavado fresca, tal como una solución salina en el interior de la cámara de procesamiento 30.
Durante el uso, las células regenerativas pueden introducirse en la cámara central 37a a través del puerto de entrada 31a. Se introduce una solución salina u otro tampón en la cámara inferior 37b a través del puerto de entrada 55 31c. La solución salina puede dirigirse a través de la composición de células regenerativas en la cámara 37a a una velocidad de aproximadamente 10 ml/min. El caudal de la solución salina es tal que contrarresta la fuerza de la gravedad. El flujo de solución salina da a las células de la cámara la capacidad de separarse basándose en la densidad de las células. Típicamente, a medida que la solución salina se hace subir a través de la composición, las células más grandes de la composición se depositarán en el fondo de la cámara central 37a, y las células y
20
En otra versión más de la invención, la cámara de procesamiento puede estar compuesta por un concentrador de células en forma de un filtro de membrana giratoria. En otra versión del proceso de centrifugación, también se puede aplicar elutriación centrífuga. En esta versión, las células pueden separarse basándose en la velocidad de 5 sedimentación celular individual de tal forma que la fuerza direccional (por ejemplo, hacia fuera) aplicada por centrifugación hace que las células y solutos sedimenten a velocidades diferentes. En la elutriación, la velocidad de sedimentación de la población de células diana se opone a un caudal opuesto (por ejemplo, hacia adentro) aplicado por la solución de bombeo en la dirección opuesta a la fuerza centrífuga. El contraflujo se ajusta de manera que las células y partículas dentro de la solución se separen. La elutriación se ha aplicado en muchos casos de separación
10 celular (Inoue, Carsten et al., 1981; Hayner, Braun et al. 1984, Noga 1999) y los principios y prácticas utilizados para optimizar el flujo y los parámetros centrífugos pueden aplicarse en el presente documento a la luz de la presente divulgación por un experto en la técnica.
La figura 9 ilustra principios asociados con una implementación de elutriación de acuerdo con la presente invención.
15 La versión de elutriación puede ser similar a una implementación de centrifugación en la medida en que se aplica una fuerza a la solución usando un rotor giratorio. Algunas de las variables que están asociadas con la separación de elutriación incorporada en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, el tamaño y la forma de la cámara giratoria, el diámetro del rotor, la velocidad del rotor, el diámetro del tubo de contraflujo, el caudal del contraflujo, así como el tamaño y la densidad de las partículas y las células que se van a retirar de la solución. Como
20 en la centrifugación, las células regenerativas se pueden separar basándose en las densidades de células individuales.
En una versión, la composición de células regenerativas, por ejemplo, la solución que contiene las células regenerativas y la colagenasa, se introduce en una cámara de un rotor giratorio, como se muestra en la figura 9.1. 25 Después de añadir la solución salina a la cámara, se añade una solución salina adicional a la cámara a un caudal predeterminado. El caudal de la solución salina puede predeterminarse en función de la velocidad del rotor, el diámetro de la celda y la constante de la cámara que se ha establecido empíricamente. El caudal se controlará, por ejemplo, con un dispositivo similar a una bomba IV. Un propósito de la solución salina adicional es proporcionar una condición dentro de la cámara del rotor donde las partículas más grandes se moverán a un lado de la cámara y las 30 partículas más pequeñas se moverán a la otra, como se ilustra en la figura 9.2. El flujo se ajusta de manera que, en esta aplicación, las partículas más pequeñas salgan de la cámara y se muevan a un recipiente de residuos, como se muestra en la figura 9.3. Este movimiento da como resultado que la solución en la cámara del rotor tenga una población sustancialmente homogénea de células, tales como células madre. Después de que se ha determinado que las células madre se han separado del resto de los artículos en la solución (con proteínas no deseadas y lípidos
35 libres que se han extraído de la cámara), el contraflujo se detiene. Las células dentro de la cámara formarán entonces un sedimento concentrado en la pared exterior de la cámara. El contraflujo se invierte y el sedimento celular se transfiere a la bolsa de salida.
Como se ha expuesto anteriormente en el presente documento, la cámara de procesamiento 30 o la cámara de
40 salida 50 puede incluir uno o más puertos, por ejemplo, los puertos 51 o 52. Uno o más de estos puertos pueden estar diseñados para transportar las células regenerativas obtenidas usando cualquier combinación de los métodos descritos anteriormente, o una porción de los mismos, a través de conductos a otros dispositivos quirúrgicos, dispositivos de cultivo celular, dispositivos de maceración celular, dispositivos de terapia génica o dispositivos de purificación. Estos puertos también pueden estar diseñados para transportar las células regenerativas a través de
45 conductos a cámaras o recipientes adicionales dentro del sistema o como parte de otro sistema para los mismos fines descritos anteriormente. Los puertos y conductos también se pueden usar para añadir uno o más aditivos, por ejemplo, factores de crecimiento, fluidos de resuspensión, reactivos de expansión celular, reactivos de conservación de células o reactivos de modificación celular, incluyendo agentes que transfieren genes a las células. Los puertos y conductos también pueden usarse para transportar las células regenerativas a otras dianas tales como materiales de
50 implante (por ejemplo, estructuras o fragmentos de hueso), así como otros implantes y dispositivos quirúrgicos.
El procesamiento adicional de las células puede iniciarse también reconfigurando las interconexiones de los conjuntos desechables del sistema existente, reprogramando el dispositivo de procesamiento del sistema existente, proporcionando recipientes y/o cámaras diferentes o adicionales para el sistema existente, transportando las células 55 a uno o más sistemas o dispositivos adicionales y/o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, el sistema puede reconfigurarse por cualquiera de los medios descritos anteriormente de tal modo que las células regenerativas obtenidas utilizando el sistema pueden someterse a uno o más de los siguientes: expansión celular (de uno o más tipos de células regenerativas) y mantenimiento celular (incluyendo lavado de la lámina celular y cambio de los medios); subcultivo; siembra celular; transfección transitoria (incluyendo siembra de células transfectadas del
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