ES2561045T3 - Anticuerpos anti-IGF - Google Patents

Abstract

Una molécula de anticuerpo de ser humano aislada, la cual a) se une a IGF-1 e IGF-2 de ser humano, tal que~ i) se impide la unión de IGF-1 e IGF-2 al receptor de IGF-1 y ii) se inhibe la transmisión de señales mediada por el receptor de IGF-1, b) se une a IGF-1 e IGF-2 de ratón y de rata, c) no se enlaza a insulina humana; en donde dicha molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo que tiene CDRs de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:21 (CDR1), SEQ ID NO:22 (CDR2) y SEQ ID NO:23 (CDR3) y que tiene CDRs de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:24 (CDR1), SEQ ID NO:25 (CDR2) y SEQ ID NO:26 (CDR3).

Description

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en un único polipéptido, la(s) región(es) variables sola(s) o en combinación con la totalidad o una porción de lo siguiente: dominio constante de la cadena ligera, dominios CH1, región bisagra, dominios CH2, y CH3, por ejemplo una molécula denominada “SMIP” (“Inmunofarmacéutica Modular Pequeña”), que es una molécula semejante a un anticuerpo que emplea una única cadena de polipéptido como su dominio de unión Fv, el cual está unido a una única cadena bisagra y a dominios efectores desprovistos del dominio constante CH1 (documento WO 02/056910). Las SMIPs pueden prepararse como monómeros o dímeros, pero no asumen la estructura dímera de dímeros de los anticuerpos tradicionales. También están incluidos en la invención fragmentos de unión de antígenos que comprenden cualquier combinación de una o varias regiones variables con una región de dominio constante de una cadena ligera, VH1, CH1, región bisagra, y dominios CH2 y CH3.

Los fragmentos de anticuerpos o las moléculas semejantes a anticuerpos pueden contener toda o sólo una porción de la región constante en tanto y cuanto exhiban una unión específica con la porción relevante de los antígenos IGF1/IGF-2 . La elección del tipo y longitud de la región constante depende, si no se desea ninguna función efectora como la fijación de complemento o la toxicidad celular dependiente del anticuerpo, principalmente de las propiedades farmacológicas deseadas de la proteína anticuerpo. La molécula de anticuerpo será típicamente un tetrámero que consiste en dos pares de cadena ligera/cadena pesada, pero también puede ser un dímero, es decir, que consiste en un par de cadena ligera/cadena pesada, por ejemplo un fragmento Fab o Fv, o puede ser un anticuerpo monómero de una única cadena (scFv).

Las moléculas semejantes a anticuerpos anti-IGF también pueden ser anticuerpos de un único dominio (p. ej., los denominados "nanocuerpos"), los cuales albergan un sitio de unión de antígenos en un único dominio semejante a Ig (descrito, p. ej., en el documento WO 03/050531, y por Revets et al., 2005). Otros ejemplos de moléculas semejantes a anticuerpos son los anticuerpos de la superfamilia de las inmunoglobulinas (IgSF; Srinivasan y Roeske, 2005), o moléculas que contienen CDRs o injertadas en CDRs o “Anticuerpos Dominio” (dAbs). Los dABs son unidades de unión funcionales de anticuerpos, que corresponden a las regiones variables de las cadenas pesada (VH) o ligera (VL) de anticuerpos de ser humano. Los anticuerpos dominio tienen un peso molecular de aproximadamente 13 kDa, o menos de la décima parte del tamaño de un anticuerpo completo. Se ha desarrollado una serie de genotecas grandes y altamente funcionales de VH y VL dAbs completamente de ser humano. Los dABs también están disponibles para “dianas dobles”, es decir, dAbs que se unen, además de a IGF-1/IGF-2, a otra diana en una molécula. En, por ejemplo, los documentos US 6.696.245, WO 04/058821, WO 04/003019 y WO 03/002609 se describen genotecas dAb, métodos de selección y exploración, formatos dAb para dianas dobles y para conferir una semivida extendida al suero.

En general, los fragmentos de anticuerpos y las moléculas semejantes a anticuerpos se expresan bien en sistemas bacterianos, levaduras y células de mamíferos.

Una molécula de anticuerpo de esta descripción tiene una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10 (esta secuencia puede contener, en su extremo C, una Gln adicional. Esta posición de los aminoácidos se puede considerar el extremo C-terminal de la región variable, de acuerdo con la numeración de Kabat o, alternativamente, y en línea con las secuencias en el listado de secuencias, se puede representar el primer aminoácido de la cadena ligera constante, véase la SEQ ID NO:34).

Preferiblemente, un anticuerpo con la cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10 tiene una región de cadena pesada constante de IgG1. Preferiblemente, un anticuerpo de este tipo tiene una región de cadena ligera constante de Igλ. Preferiblemente, un anticuerpo de este tipo es el anticuerpo designado 60814, que tiene una región constante de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32 y una región constante de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34. Las secuencias de aminoácidos completas del anticuerpo designado 60814 se representan en la SEQ ID NO:35 (cadena pesada) y la SEQ ID NO:36 (cadena ligera).

Una molécula de anticuerpo de esta descripción tiene una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20 (esta secuencia puede contener, en su extremo C, una Gln adicional. Esta posición de los aminoácidos se puede considerar el extremo C-terminal de la región variable, de acuerdo con la numeración de Kabat o, alternativamente, y en línea con las secuencias en el listado de secuencias, se puede representar el primer aminoácido de la cadena ligera constante, véase la SEQ ID NO:34).

Preferiblemente, un anticuerpo con la cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20 tiene una región de cadena pesada constante de IgG1. Preferiblemente, un anticuerpo de este tipo tiene una región de cadena ligera constante de Igλ. Preferiblemente, un anticuerpo de este tipo es el anticuerpo designado 60819, que tiene una región constante de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32 y una región constante de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34. Las secuencias de aminoácidos completas del anticuerpo designado 60819 se representan en la SEQ ID NO:37 (cadena pesada) y la SEQ ID NO:38 (cadena ligera).

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En otra realización, la molécula de anticuerpo anti-IGF de la invención es un anticuerpo de “afinidad madurada”.

Un anticuerpo anti-IGF de "afinidad madurada" es un anticuerpo anti-IGF derivado de un anticuerpo anti-IGF parental, p. ej. 60814, 60819 ó 60833, que tiene una o más alteraciones en una o más CDRs o en que una o más CDRs completas han sido reemplazadas, lo cual da lugar a una mejora de la afinidad por los antígenos, comparada con el respectivo anticuerpo parental. Uno de los procedimientos para generar tales anticuerpos mutantes implica la manifestación en fagos (Hawkins et al., 1992; y Lowman et al., 1991). En síntesis, se hacen mutar varios sitios de regiones hipervariables (p. ej., 6-7 sitios) para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Los mutantes de anticuerpos, así generados, se manifiestan de una manera monovalente en partículas de fagos filamentosos como fusiones al producto del gen III del fago M13 empaquetados dentro de cada partícula. Los mutantes manifestados por los fagos se exploran entonces respecto a su actividad biológica (p. ej., la afinidad de unión) como se describe en la presente memoria.

Los anticuerpos de afinidad madurados también pueden producirse por métodos como, por ejemplo, se describen por Marks et al., 1992, (maduración de la afinidad barajando dominios de cadena variable pesada (VH) y cadena variable ligera (VL)), o Barbas et al., 1994; Shier et al., 1995; Yelton et al., 1995; Jackson et al., 1995; y Hawkins et al., 1992, (mutagénesis aleatoria de residuos CDR y/o marco). Los anticuerpos de afinidad madurados preferidos tendrán afinidades muy elevadas, p. ej., picomolar bajo, para el antígeno diana.

La presente invención también se refiere a moléculas de ADN que codifican una molécula de anticuerpo anti-IGF de la invención. Estas secuencias incluyen, pero no se limitan a, las moléculas de ADN que codifican los anticuerpos 60833 que se muestran en los listados de secuencias: SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:29, respectivamente, que codifican, respectivamente, las cadenas variables pesada y ligera del anticuerpo 60833.

Las secuencias mostradas en las SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:19 y 29, que codifican las cadenas ligeras variables, pueden contener, en su extremo 3’, un codón adicional para Gln.

Por consiguiente, la presente invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico que se hibridan con las moléculas de ADN recogidas en el listado de secuencia en condiciones de lavado y de enlace muy rigurosas, como se define en el documento WO 2007/042309, en el que tales moléculas de ácido nucleico codifican un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales que tiene propiedades equivalentes o superiores al anticuerpo 60833. Las moléculas preferidas (desde una perspectiva del ARNm) son las que al menos tienen 75% u 80% (preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90% y mucho más preferiblemente al menos 95%) de homología o identidad de secuencias con una de las moléculas de ADN descritas en la presente memoria.

Aún otra clase de variantes de ADN que están dentro del alcance de la invención pueden definirse con referencia al polipéptido que codifican. Estas moléculas de ADN se desvían con respecto a su secuencia de las representadas en el listado de secuencias (SEQ ID NOs:27, 29, respectivamente), pero codifican, debido a la degeneración del código genético, anticuerpos con las secuencias de aminoácidos idénticas de los anticuerpos 60833, respectivamente. A modo de ejemplo, con el fin de expresar los anticuerpos 60833 en células eucariotas, los últimos nueve nucleótidos, respectivamente, que codifican los tres últimos aminoácidos de las cadenas variables ligeras, se pueden diseñar para que equivalgan al uso del codón en células eucariotas. Si se desea expresar los anticuerpos en E. coli, estas secuencias se pueden modificar para que equivalgan al uso del codón en E. coli.

Variantes de moléculas de ADN de la invención pueden construirse de varias formas diferentes, tal como se describe en el documento WO 2007/042309.

Para producir las moléculas de anticuerpos anti-IGF recombinantes de la invención, las moléculas de ADN (ADNc y/o ADN genómico) que codifican la cadena ligera de longitud completa y la cadena pesada o fragmentos de las mismas, se insertan en vectores de expresión, de modo que las secuencias están operativamente enlazadas a secuencias de control transcripcionales y de traducción.

En el caso del anticuerpo 60833, las secuencias son las de SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:33, y SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:31, respectivamente.

Para fabricar los anticuerpos de la invención, el operario experto puede elegir de una gran diversidad de sistemas de expresión bien conocidos en la técnica, por ejemplo los revisados por Kipriyanow y Le Gall, 2004.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un vector de expresión que contiene una molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada variable y/o la cadena ligera variable de una molécula de anticuerpo según se describe antes. Preferiblemente, un vector de expresión de este tipo contiene una molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:27 y/o SEQ ID NO:29. Preferiblemente, un vector de expresión de este tipo comprende adicionalmente una molécula de ADN que codifica la cadena pesada constante y/o la cadena ligera constante, respectivamente, enlazadas a la molécula de ADN que codifica la cadena pesada variable y/o la cadena ligera variable, respectivamente.

Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, cósmidos, episomas derivados de EBV, y semejantes. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se seleccionan para que sean compatibles con la

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 tumores de células redondas azules pequeñas.

En particular, las moléculas de anticuerpo anti-IGF de la invención y las composiciones farmacéuticas que las contienen son beneficiosas en el tratamiento de cánceres del sistema hematopoyético que incluyen leucemias, linfomas y mielomas, cánceres del tracto gastrointestinal que incluyen el cáncer esofágico, gástrico, colorrectal, pancreático, de hígado y de la vesícula biliar y del conducto biliar; cáncer de riñón, de próstata y de vejiga; cánceres ginecológicos que incluyen el cáncer de mama, de ovarios, cervical y de endometrio; cánceres de piel, cabeza y cuello que incluyen los melanomas malignos; cánceres pediátricos, tales como el tumor de Wilms, el neuroblastoma y el sarcoma de Ewing; cánceres de cerebro como el glioblastoma; sarcomas, tales como el osteosarcoma, el sarcoma de tejido blando, el rabdomiosarcoma, el hemangiosarcoma; el cáncer de pulmón, el mesotelioma y el cáncer de tiroides.

En un aspecto preferido de la invención, las moléculas de anticuerpos anti-IGF de la invención y composiciones farmacéuticas que contienen a las mismas son beneficiosas en el tratamiento de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), en particular NSCLC localmente avanzado o metastásico (fase IIIB/IV). En este contexto, las moléculas de anticuerpos anti-IGF de la invención se pueden combinar con quimioterapia basada en platino, en particular terapia doble con platino paclitaxel/carboplatino o gemcitabina/cisplatino.

En un aspecto adicional preferido de la invención, las moléculas de anticuerpos anti-IGF de la invención y composiciones farmacéuticas que contienen a las mismas son beneficiosas en el tratamiento de carcinoma hepatocelular, en particular carcinoma localmente avanzado o hepatocelular (fase III/IV). En este contexto, las moléculas de anticuerpos anti-IGF de la invención pueden combinarse con sorafenib (Strumberg D., 2005).

En otra realización, las moléculas de anticuerpo anti-IGF y las composiciones farmacéuticas que las contienen son útiles en los trastornos hiperproliferativos no cancerosos tales como, sin límites, la psoriasis y la restenosis después de angioplastia. Además, basado en la reciente observación (Reinberg, 2008) de que una mutación genética que disminuye la actividad de IGF-1 tiene un efecto positivo sobre la longevidad, los anticuerpos de la invención tienen el potencial de ser útiles, cuando se aplican a adultos, en terapias para ralentizar el envejecimiento y en enfermedades relacionadas con la prevención del envejecimiento.

Así, en un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de una molécula de anticuerpo según se describe antes para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad cancerosa esbozada anteriormente.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica según se describe antes para el tratamiento de una enfermedad cancerosa esbozada anteriormente.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para tratar a un paciente que padece una enfermedad cancerosa según se ha esbozado anteriormente, que comprende administrar a dicho paciente una cantidad eficaz de una composición farmacéutica según se describe en esta memoria.

Dependiendo del trastorno a ser tratado, la molécula de anticuerpo anti-IGF de la invención puede usarse por sí misma o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales, en particular seleccionados de agentes que dañan al ADN o de compuestos terapéuticamente activos que inhiben la angiogénesis, las rutas de transducción de señales o los puntos de control mitóticos en células cancerosas.

El agente terapéutico adicional puede administrarse simultáneamente con, opcionalmente como un componente de la misma preparación farmacéutica, o antes o después de la administración de la molécula de anticuerpo anti-IGF.

En ciertas realizaciones, el agente terapéutico adicional puede ser, sin límites, uno o más agentes inhibidores seleccionados del grupo de agentes inhibidores de EGFR, VEGFR, HER2-neu, AuroraA, AuroraB, PLK y PI3 quinasa, FGFR, PDGFR, Raf, KSP o PDK1.

Ejemplos adicionales de agentes terapéuticos adicionales son los agentes inhibidores de CDK, Akt, src/bcr-abl, cKit, cMet/HGF, c-Myc, Flt3, HSP90, agentes antagonistas hedgehog, agentes inhibidores de JAK/STAT, Mek, mTor, NFkappaB, el proteasoma, Rho, un agente inhibidor de la transmisión de señales wnt o un agente inhibidor de la ruta de ubiquitinación.

Ejemplos de inhibidores de Aurora son, sin limitación, PHA-739358, AZD-1152, AT-9283, CYC-116, R-763, VX-667, MLN-8045, PF-3814735, SNS-314, VX-689, GSK-1070916, TTP-607, PHA-680626, MLN-8237 y ENMD-2076.

Un ejemplo de un agente inhibidor de PLK es GSK-461364.

Ejemplos de agentes inhibidores de raf son BAY-73-4506 (también un agente inhibidor de VEGFR), PLX-4032, RAF265 (también un agente inhibidor VEGFR), sorafenib (también un agente inhibidor de VEGFR), XL-281 y Nevavar (también un agente inhibidor de VEGFR).

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EphB4), XL-820 (también un agente inhibidor de cKit), nilotinib (también un agente inhibidor de cKit y brc-abl), CYT116, PTC-299, BMS-584622, CEP-11981, dovitinib, CY-2401401 y ENMD-2976.

El agente terapéutico adicional también puede seleccionarse de agentes inhibidores de EGFR, puede ser un agente inhibidor de EGFR de moléculas pequeñas o un anticuerpo anti-EGFR. Ejemplos de anticuerpos anti-EGFR, sin límites, son cetuximab, panitumumab, nimotuzumab, zalutumumab; ejemplos de inhibidores de EGFR de moléculas pequeñas son gefitinib, erlotinib y vandetanib (también un agente inhibidor del VEGFR). Otro ejemplo de un agente modulador de EGFR es la toxina de fusión EGF.

Agentes inhibidores de EGFR y/o Her2 adicionales, útiles para su combinación con una molécula de anticuerpo anti-IGF de la invención, son BIBW 2992 (Tovok®), lapatinib, trastuzumab, pertuzumab, XL-647, neratinib, BMS-599626 ARRY-334543, AV-412, mAB-806, BMS-690514, JNJ-26483327, AEE-788 (también un agente inhibidor de VEGFR), AZD-8931, ARRY-380 ARRY-333786, IMC-11F8, Zemab, TAK-285, AZD-4769.

Otros agentes que se pueden combinar ventajosamente en una terapia con la molécula de anticuerpo anti-IGF de la invención son tositumumab e ibritumomab tiuxetan (dos anticuerpos anti-CD20 radiomarcados); ofatumumab, rituximab, LY-2469298, ocrelizumab, TRU-015, PRO-131921, FBT-A05, veltuzumab, R-7159 (agentes inhibidores de CD20), alemtuzumab (un anticuerpo anti-CD52), denosumab, (un agente inhibidor del ligando del factor de diferenciación de osteoclastos), galiximab (un antagonista de CD80), zanolimumab (un antagonista de CD4), SGN40 (un modulador del receptor del ligando CD40), XmAb-5485, Chi Lob 7/4, lucatumumab, CP-870893 (agentes inhibidores de CD40), CAT-8015, epratuzumab, Y90-epratuzumab, inotuzumab ozogamicin (agentes inhibidores de CD22), lumiliximab (un agente inhibidor de CD23), TRU-016 (un agente inhibidor de CD37), MDX-1342, SAR-3419, MT-103 (agentes inhibidores de CD19), o mapatumumab, tigatuzumab, lexatumumab, Apomab, AMG-951 y AMG655 (moduladores del receptor TRAIL).

Otros fármacos quimioterapéuticos que pueden usarse en combinación con las moléculas de anticuerpo anti-IGF de la presente invención se seleccionan de, pero no se limitan a, hormonas, análogos hormonales y antihormonales (p. ej., tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, fulvestrant, acetato de megestrol, flutamida, nilutamida, bicalutamida, acetato de ciproterona, finasterida, acetato de buserelina, fludrocortinsona, fluoximesterona, medroxiprogesterona, octreotida, arzoxifeno, pasireotida, vapreotida), agentes inhibidores de aromatasa (p. ej., anastrozol, letrozol, liarozol, exemestano, atamestano, formestano), agentes agonistas y agentes antagonistas de LHRH (p. ej., acetato de goserelina, leuprolida, abarelix, cetrorelix, deslorelina, histrelina, triptorelina), antimetabolitos (p. ej., antifolatos tales como metotrexato, pemetrexed, análogos de la pirimidina tales como 5-fluorouracilo, capecitabina, decitabina, nelarabina y gemcitabina, análogos de purina y adenosina tales como mercaptopurina tioguanina, cladribina y pentostatina, citarabina, fludarabina); antibióticos antitumorales (p. ej., antraciclinas tales como doxorubicina, daunorubicina, epirubicina e idarubicina, mitomicina-C, bleomicina, dactinomicina, plicamicina, mitoxantrona, pixantrona, estreptozocina); derivados del platino (p. ej., cisplatino, oxaliplatino, carboplatino, lobaplatino, satraplatino); agentes alquilantes (por ejemplo, estramustina, mecloretamina, melfalano, clorambucilo, busulfano, dacarbazina, ciclofosfamida, ifosfamida, hidroxiurea, temozolomida, nitrosoureas tales como carmustina y lomustina, tiotepa); agentes antimitóticos (p. ej., alcaloides de la vinca tales como vinblastina, vindesina, vinorelbina, vinflunina y vincristina; y taxanos tales como paclitaxel, docetaxel y sus fórmulaciones, larotaxel; simotaxel, y epotilonas tales como ixabepilona, patupilona, ZK-EPO); agentes inhibidores de la topoisomerasa (p. ej., epipodofilotoxinas tales como etopósido y etopofos, teniposida, amsacrina, topotecan, irinotecan) y agentes quimioterapéuticos varios tales como amifostina, anagrelida, interferón alfa, procarbazina, mitotano, y porfimer, bexaroteno, celecoxib.

En un aspecto, las moléculas de anticuerpos anti-IGF de la invención se utilizan en combinación con quimioterapia basada en platino, por ejemplo en combinación con terapia doble con platino paclitaxel/carboplatino o gemcitabina/cisplatino. En una realización, esta terapia de combinación puede repetirse varias veces, por ejemplo 6 ciclos (cada 3 semanas). Este tratamiento puede ser seguido por tratamiento repetido adicional (p. ej. 6 ciclos cada 3 semanas) con una molécula de anticuerpo anti-IGF sola. Este régimen se puede utilizar, p. ej., en el tratamiento de NSCLC. En otro aspecto, las moléculas de anticuerpo anti-IGF de la invención se utilizan en combinación con sorafenib. En una realización, la molécula de anticuerpo anti-IGF se puede administrar repetidamente a intervalos de 1-3 semanas, p. ej. durante 12 ciclos, en combinación con la administración continua de sorafenib. Este régimen se puede utilizar, p. ej., en el tratamiento de carcinoma hepatocelular.

Las moléculas de anticuerpo anti-IGF de la invención, p. ej., cuando se utilizan a concentraciones bajas, también se pueden combinar con agentes que tienen como diana el IGF-1R. Tales agentes incluyen anticuerpos que se unen a IGF-1R (p. ej., CP-751871, AMG-479, IMC-A12, MK-0646, AVE-1642, R-1507, BIIB-022, SCH-717454, rhu Mab IGFR y nuevas entidades químicas que tienen como diana el dominio quinasa del IGF1-R (p. ej., OSI-906 o BMS554417, XL-228, BMS-754807).

Las moléculas de anticuerpo anti-IGF de la invención también se pueden utilizar en combinación con otras terapias, incluidas la cirugía, radioterapia, terapia endocrina, modificadores de la respuesta biológica, hipertermia y crioterapia y agentes para atenuar cualquier efecto adverso, p. ej.. antieméticos y, en una realización preferida, antidiabéticos,

p. ej., metformina.

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Las moléculas de anticuerpo anti-IGF de la invención también son útiles en el diagnóstico de cánceres en los que los elevados niveles de IGF-1 y/o IGF-2 en el suero se correlacionan con el desarrollo o la progresión de la enfermedad,

p. ej., para determinar elevados niveles de IGF-2 debido a la pérdida de sellado (LOI), una alteración epigenética que afecta al gen del factor de crecimiento insulínico II (IGF2). En ciertas realizaciones, un anticuerpo para aplicaciones de diagnóstico, p. ej., para la detección de IGF-1 en secciones de tejidos de ser humano por tinción inmunohistológica, es un anticuerpo quimera que se deriva de un anticuerpo de ser humano. En un anticuerpo de este tipo, las regiones constantes, o sus partes, han sido reemplazadas por las respectivas secuencias de un anticuerpo de otra especie, por ejemplo ratón. Usando un anticuerpo quimera de este tipo como un anticuerpo principal, el anticuerpo secundario, por ejemplo un anticuerpo de cabra que reacciona específicamente con la porción Fc murina, reconocerá específicamente las secuencias murinas del anticuerpo quimera principal y no se unirá a las porciones Fc de las otras moléculas de inmunoglobulinas de ser humano que están presentes en la muestra de tejido de ser humano. Así, se evita la tinción no deseada del fondo.

Los anticuerpos de la invención, al bloquear la transducción de señales mediada por IGF-1 e IGF-2, también pueden ser útiles para el control del peso corporal y la formación de tejido adiposo. Para este fin, los anticuerpos de la invención se administran solos o en combinación con otros fármacos anti-obesidad.

Materiales y métodos

Selección de anticuerpos completamente humanos, de alta afinidad, que se unen a IGF-1

La selección de clones de fragmentos Fab específicos a partir de la genoteca de anticuerpos combinatorios humanos (HuCAL Gold) (Knappik et al., 2000) que se unen a IGF-1 humano con afinidad baja nanomolar se realiza esencialmente como se describe por Rauchenberger et al., 2003, en tres ciclos de adsorción. Con el fin de identificar fragmentos Fab con afinidad mejorada por IGF-1 humano, varios de estos clones Fab ‘parentales’ se someten a una ‘maduración de la afinidad in vitro’, esencialmente según se describe por Nagy et al., 2002. Las secuencias L-CDR3 (CDR3 de cadena ligera) y H-CDR2 (CDR2 de cadena pesada) de cada clon se diversifican por separado, sustituyendo la secuencia parental por aproximadamente 108 casetes L-CDR3 y H-CDR2 de HuCAL (Knappik et al., 2000). Se preparan fagos a partir de las ‘genotecas de maduración’ resultantes, y cada genoteca se somete a adsorciones en solución en IGF-1 humano. Con el fin de seleccionar los ligantes de IGF-1 humano de más alta afinidad, las adsorciones en solución se realizan en condiciones de lavado normales y de rigurosidad incrementada de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, con reducción de antígeno, y con y sin el bloqueo de la insulina humana. Los resultados de la adsorción, tras tres rondas de adsorción del fago, se subclonan en un vector de expresión de Fab, y la afinidad de cada Fab por el IGF-1 humano se determina mediante una tecnología de titulación en equilibrio basada en electroquimioluminiscencia, desarrollada por BioVeris (Witney, Oxfordshire, GB), esencialmente como se describe por Haenel et al., 2005. Los clones Fab con las mejores afinidades por IGF-1 se secuencian, y luego se convierten en anticuerpos IgG1 humanos según se describe por Krebs et al., 2001, con una afinidad subnanomolar por IGF-1 humano, sin ningún cambio en la especificidad, en comparación con los anticuerpos parentales.

Clonación y expresión recombinante de anticuerpos de IgG1

Regiones de cadena pesada variables (VH) y regiones de cadena ligera variables (VL) se escinden de los vectores de expresión de Fab mediante digestión con enzimas de restricción y se ligan en sitios de enzimas de restricción compatibles de plásmidos basados en pcDNA3.1 que contienen las regiones constantes de la cadena pesada de IgG1 humana y de la cadena ligera de Igλ humana, respectivamente. Se preparan preparaciones de plásmidos EndoFree (Qiagen) y los plásmidos de las cadenas pesada y ligera se co-transfectan en células freestyle HEK293 (Invitrogen) a una concentración de cada plásmido de 1 mg/L según el protocolo del proveedor. Después de 72 horas se cosecha el sobrenadante y la concentración de IgG se determina mediante ensayo ELISA. El anticuerpo se purifica en una columna modificada con proteína A (GE Healthcare), se eluye en tampón citrato y, a continuación, se dializa hasta una concentración de 2,5 mg/ml en PBS. Alternativamente, se genera una línea de células CHO establemente integrada con los plásmidos de expresión de anticuerpos y se utilizan para producir los anticuerpos.

Análisis de la resonancia por plasmón de superficie para determinar constantes de afinidad

a) Método de captura del anticuerpo

El chip sensor se reviste con aproximadamente 1000 UR del anticuerpo de referencia en células de flujo 1 y con aproximadamente 1000 UR de un anticuerpo específico para Fc-gamma, anti-humano de conejo en células de flujo 2 utilizando los reactivos de acoplamiento de un kit de acoplamiento de aminas. Se establece una diana de 1000 UR en el kit wizard de la preparación en superficie del software Biacore 3000 a un caudal de 5 µl/min. El tampón de ejecución utilizado es HBS-EP. Las mediciones de afinidad se realizan utilizando los siguientes parámetros: caudal de 20 µl/min (tampón de ejecución HCB:); temperatura de detección, 25°C; vías de flujo Fc1, Fc2; detección de Fc1, Fc2; captura de MAbhu anti-IGF: 3 min de una solución de 1 µg/ml; asociación de IGF-Ag durante 5 min; disociación de IGF-Ag durante 5 min; regeneración: pulso durante 30 s con HCl 50 mM. Los antígenos de IGF se diluyen hasta 500, 250, 125, 62,5 y 31,3 nM en tampón de ejecución (HCB) y las diferentes diluciones de antígeno se realizan de forma única sobre Fc1 y Fc2 con un orden aleatorio. Tandas en blanco utilizando tampón de ejecución sólo se

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realizan entremedias. Una curva de tanda en blanco se sustrae de cada curva de unión antes del análisis de afinidad. La evaluación de los datos se realiza utilizando el software BIAevaluation (versión 4.1, Biacore, Freiburg, Alemania). Las fases de disociación y de asociación de las cinéticas se ajustan por separado. Para el ajuste separado de los valores kdiss se utiliza un marco de tiempo de los 200 -300 segundos iniciales en la fase de disociación (intervalo de disminución estacionaria de la señal). Para el ajuste separado de los valores kass se utilizan marcos de tiempo de aproximadamente 100 segundos (intervalo de aumento estacionario de la señal), y para el cálculo de los valores kdiss individuales con el modelo de asociación 1:1 de Langmuir. Se calculan los valores medios con las desviaciones estándares de los datos cinéticos junto con las correspondientes constantes de disociación (KD) y de asociación (KA).

b) Método de revestimiento con IGF

La determinación de las constantes de unión de anticuerpos IGF a ligandos de IGF, cuando el chip del sensor está revestido con ligandos de IGF, se realiza según se describe antes, excepto que el chip del sensor está revestido con 35,1 pg/mm2 y 38,5 pg/mm2 de IGF-1 e IGF-2, respectivamente. Los anticuerpos se hacen fluir luego sobre el chip a las concentraciones siguientes: 50, 25, 12,5, 6,25, 3,12 nM.

Medición de la unión a IGFs humanos, murinos y de rata y a insulina humana en ensayos de inmunosorbente

Anticuerpos IgG1 completamente humanos que se unen con una elevada afinidad a IGF-1 se testan también en cuanto a la unión a IGF-1 humano en ensayos de inmunosorbente directos (ELISA). Los ensayos de realizan revistiendo IGF-1 humano (R&D Systems, Nº 291-G1) a placas Maxisorb de 96 pocillos a una concentración de 0,5 µg/ml durante una noche a 4oC (100 µl/pocillo). Tampón de revestimiento solo se utiliza como un control para la unión no específica. Los pocillos se lavan entonces una vez con tampón de lavado (1 x TBS-T) y los sitios de unión residuales se bloquean con 200 µl de tampón de bloqueo durante 1 hora a la temperatura ambiente en un sacudidor orbital, seguido de un ciclo de lavado adicional. Sobre las placas revestidas se preparan directamente diluciones triples en serie de cada anticuerpo de ensayo. Concentraciones típicas utilizadas son 50, 16,6, 5,6, 1,8, 0,6, 0,2 y 0,07 ng/ml. Tampón de bloqueo solo se utiliza como un control positivo. Las placas se incuban entonces durante 2 horas a la temperatura ambiente con agitación. Después de tres ciclos de lavado de 100 µl/pocillo de reactivo secundario de IgG anti-humana conjugada con HRPO, se añade a todos los pocillos de reactivo secundario (Jackson ImmunoResearch Inc.) diluido en tampón de bloqueo. Después de 2 horas de incubación a la temperatura ambiente con agitación, las placas se lavan tres veces y en todos los pocillos se pipetean 100 µl/pocillo de solución de sustrato TMB (cantidades iguales de solución A y B). Las placas se incuban durante 10-20 min a TA con agitación y, luego, la reacción se detiene mediante la adición de 100 µl/pocillo de ácido fosfórico 1 M. La absorbancia se mide a una longitud de onda de 450 nm (referencia 650 nm).

La unión de los anticuerpos IgG1 de unión a IGF-1 completamente humano a IGF-1 de ratón (R&D Systems, Nº 791-MG), IGF-1 de rata (IBT, Nº RU100), IGF-2 humano (GroPep, Nº FM001), IGF-2 de ratón (R&D Systems, Nº 792-MG), IGF-2 de rata IGF-2 (IBT, Nº AAU100) e insulina humana (Roche) también se testa según se describe antes para IGF-1 humano (excepto que la concentración de insulina humana utilizada para el revestimiento es 3 µg/ml).

Ensayos de proliferación celular in vitro para determinar la potencia de neutralización

La línea de células de cáncer de mama MCF-7 (ATCC, HTB-22) y la línea de células derivada de cáncer de colon COLO 205 (ATCC nº CCL-222) se extienden en placas de 96 pocillos a una densidad de células de 1000 células por pocillo en medio RPMI exento de suero. Se añaden 10 ng/ml de IGF-1 o IGF-2 en presencia o ausencia de un anticuerpo control de isótopo humanizado que no se une a IGF-1 o IGF-2, o de anticuerpos 60814, 60819 y 60833, a concentraciones de 12, 37, 111, 333, 1000 y 3000 ng/ml. Las células se cultivan durante 5 días y a continuación se determina el número relativo de células en cada pocillo usando el ensayo luminiscente CellTiter-Glo de viabilidad celular (Promega). La luminiscencia (UL = unidades de luminiscencia) se registra utilizando un XFluor GENios Pro 4.

Ensayo de crecimiento de línea de células derivada de sarcoma de Ewing

Las líneas de células TC-71 (ATCC nº ACC516) y SK-ES-1 (ATCC nº HTB86) derivados de sarcoma de Ewing se distribuyen en placas de 96-pocillos con una densidad de 1000 células por pocillo en medio DMEM que contiene 1 x NEAA, 1 x piruvato de sodio, 1x glutamax y suero de ternero fetal (FCS) al 10% y se incuban durante toda la noche a 37ºC y en atmósfera humidificada con 5% de CO2. Al día siguiente se añadió a las células una dilución en serie de anticuerpo de ensayo, anticuerpo control de isotipo humanizado (un anticuerpo IgG1 humanizado que tiene como diana CD44-v6) el cual no se une a IGF-1 o IGF-2, rapamicina, o una combinación de rapamicina y anticuerpo de ensayo. Las concentraciones típicas utilizadas son 30, 10, 3,3, 1,1, 0,37 y 0,12 µg/ml (ó 100, 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 nM de rapamicina y anticuerpo de ensayo para estudios de combinación) y cada dilución se realiza en pocillos por triplicado. Las células más el anticuerpo se incuban a continuación durante 120 horas, tiempo después del cual se determina el número relativo de células en cada pocillo usando el ensayo luminiscente CellTiter-Glo de viabilidad celular (Promega). La luminiscencia (UL = unidades de luminiscencia) se registra usando un programa informático XFluor GENios Pro 4 y para el análisis de datos se toma el valor medio de tres pocillos triplicados y se ajusta mediante cálculos iterativos usando un programa de análisis de curvas sigmoidales (Graph Pad Prism) con pendiente variable de Hill.

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se lavan dos veces con tampón de lavado como antes y una vez con 300 µL de PBS. A los pocillos se añaden100 µL/pocillo de disolución de sustrato TMB (Bender MedSystems, Nº BMS406.1000) y se incuban durante 10 min con agitación, tras lo cual la reacción se detiene añadiendo 100 µL/pocillo de ácido fosfórico 1 M y se lee la absorbancia utilizando un fotómetro (DO 450 nm, DO 650 nm como referencia). Los valores CI50 de la inhibición de IGF-1R o de la fosforilación de IR-A se determinan mediante análisis gráfico.

Co-cristalización de Fab-IGF-1 y determinación de la estructura

Anticuerpos monoclonales se preparan en un tampón fosfato de Na 100 mM (pH 7,0) antes de la digestión con papaína. Papaína (Sigma Aldrich, P nº 3125) es activada en tampon de digestión (tampón fosfato que contiene hidrocloruro de cisteína 10 mM, EDTA 4 mM, pH 7,0) siguiendo las instrucciones del fabricante. El anticuerpo IgG se mezcla con la papaína activada (relación enzima:IgG = 1:100) y la reacción se incuba a 37°C en un sacudidor rotatorio durante una noche. La digestión se detiene añadiendo yodoacetamida hasta una concentración final de 30 mM. Con el fin de separar el fragmento Fab del fragmento Fc, los productos de escisión de Fc y el Mab intacto, la mezcla de digestión se carga en una columna con medio de proteína A MabSelect equilibrada con tampón fosfato. La columna se lava con 5 volúmenes de columna de PBS, y el fragmento Fab se recoge en las fracciones de flujo y de lavado. El fragmento Fc y el Amb intacto se eluyen de la columna con tampón citrato 100 mM (pH 3,0) y se efectúa una subsiguiente cromatografía de exclusión de tamaño del fragmento Fab utilizando una columna HiLoad Superdex 75. La columna se hace funcionar a razón de 0,5 mL por min con trietanolamina 20 mM, NaCl 130 mM, pH 8,0. La concentración en proteína de fragmentos Fab se determina midiendo la absorbancia a 280 nm. La calidad de los fragmentos Fab se analiza mediante transferencia Western y ELISA.

El complejo Fab-IGF-1 se genera añadiendo un exceso 2 veces molar del IGF-1 recombinante (Gropep; Calidad de Receptor) al Fab purificado que después se incuba durante una noche en un sacudidor con rotor a 4 °C. La concentración del complejo hasta (15 mg/mL) y la separación de IGF-1 no unido se efectúa utilizando un dispositivo Amicon-Ultra. La cristalización del complejo Fab:IGF-1 se lleva a cabo utilizando diversas técnicas tales como la gota colgante, la gota sentada y siembra. En una realización, el cristal se precipita poniendo en contacto la disolución con un depósito que reduce la solubilidad de las proteínas debido a la presencia de precipitantes, es decir, reactivos que inducen precipitación. El rastreo de diversas condiciones conduce a un sistema tampón adecuado manipulado mediante la adición de un precipitante y aditivos. La concentración de los precipitantes oscila preferiblemente entre 5-50 % p/v. El pH del tampón oscila preferiblemente entre aproximadamente 3 y aproximadamente 6. La concentración de la proteína en la disolución es preferiblemente la de sobresaturación con el fin de permitir la precipitación. La temperatura durante la cristalización oscila preferiblemente entre 4 y 25°C.

La estructura tridimensional del complejo Fab:IGF-1, según se define por las coordenadas atómicas, se obtiene del modelo de difracción de rayos X del cristal y el mapa de la densidad de electrones derivado del mismo. La difracción de los cristales es mejor que una resolución de 2Å. Los cristales tienen preferiblemente el grupo espacial P3221 (número 154) y dimensiones de la celda unidad de aproximadamente = 70Å, b = 70Å, c = 195Å; y γ = 120°. El método para determinar la estructura tridimensional es el reemplazo molecular, que implica el uso de la estructura de una molécula estrechamente relacionada o un complejo de receptor-ligando. La formación del modelo y el refinado se realizan en varias etapas iterativas hasta factores R (R y Rfree) finales de 21 y 23%, respectivamente.

Determinación de parámetros farmacocinéticos en ratas

A ratas Wistar se las administran cinco administraciones por bolo intravenosas de 18, 52 y 248 mg/kg de anticuerpo cada 72 horas. A diversos instantes se toma una muestra de sangre y la concentración de anticuerpos humanos en el plasma se determina mediante ELISA sándwich. Esto permite calcular los parámetros farmacocinéticos medios del anticuerpo el primer día de dosificación, y la semivida se calcula después del último día de dosificación (con t(n) = 1008 horas).

Ejemplo 1

Selección de anticuerpos de alta afinidad, que se unen a IGF-1

Con el fin de identificar fragmentos Fab con una afinidad mejorada por IGF-1 humano, varios clones Fab ‘parentales’, que están identificados como que se unen a IGF-1 con una afinidad nanomolar baja, se someten a ‘maduración de afinidad in vitro’, en que las secuencias L-CDR3 y H-CDR2 de cada uno de los clones se diversifican por separado, sustituyendo la secuencia parental por una genoteca de nuevas secuencias de L-CDR3 y H-CDR2. Las ‘genotecas de maduración’ resultantes se someten a adsorciones en solución en IGF-1 humana y se seleccionan los clones con la mejor afinidad en cuanto a la conversión en anticuerpos IgG1 y se someten a ensayo adicionalmente. Los tres anticuerpos con las mejores afinidades por IGF-1 humano son 60814, 60819 y 60833, que tenían afinidades (KD) de 180, 190 y 130 pM, respectivamente (mostradas en la Tabla 1) según se determinan por el método de titulación en equilibrio basado en electroquimioluminiscencia.

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(100 nM)) de 60833 en neutralizar la bioactividad de IGF en suero humano. Tal como se muestra en la Tabla 3 y la Figura 3B de ejemplo, 60833 inhibe de forma potente y efectiva la bioactividad de IGF en suero humano. Tabla 3. Efecto de 60833 sobre la fosforilación de IGF-1R

Estímulo de fosforilación de IGF-1R

Inhibidor CI50 (µg/mL) % de fosforilación remanente a 15 µg/mL (100 nM) de inhibidor

IGF-1

60833 0,09 0

(20 ng/mL)

IR3 1,16 35

IgG Control

>15 108

IGF-2

60833 1,12 7

(100 ng/mL)

IR3 >15 76

IgG Control

>15 108

Suero humano agrupado de donantes sanos (20%)

60833 0,25 5

IR3

>15 120

IgG Control

>15 110

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Tabla 4.

Efecto de 60833 sobre la fosforilación de IR-A

Estímulo de fosforilación de IR-A

Inhibidor CI50 (µg/mL) % de fosforilación remanente a 15 µg/mL (100 nM) de inhibidor

IGF-2

60833 0,82 6

(100 ng/mL)

IR3 >15 115

IgG Control

>15 109

Ejemplo 3

10 Efectos sobre la proliferación celular inducida por IGF-1 e IGF-2

Se determinan los efectos de los anticuerpos 60814, 60819 y 60833 sobre la proliferación de la línea de células MCF-7 (derivada de cáncer de mama) y COLO 205 (derivada de cáncer de colon) inducida por IGF-1 e IGF-2. En las figuras 4A-D se muestran los efectos de los anticuerpos 60814 y 60819. Los tres anticuerpos muestran una inhibición, dependiente de la dosis, de la proliferación de células MCF-7 (Figs. 4A y 4B) y COLO 205 (Figs. 4C y 4D)

15 inducida por IGF-1 (Figuras 4A y 4C) e IGF-2 (Figuras 4B y 4D). En la Tabla 5 se muestra la concentración de cada uno de los anticuerpos, requerida para inhibir el 50% de la proliferación de cada una de las líneas de células, inducida por IGF-1 o IGF-2.

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Tabla 5. Inhibición de la proliferación de las líneas de células cancerosas MCF-7 y COLO 205, inducida por IGF-1 E IGF-2

Línea de células

Estimulación CI50 (ng/ml)

60814

60819 60833

MCF7

IGF-1 24,1 54,0 38,6

MCF7

IGF-2 78., 40,8 81,2

COLO-205

IGF-1 135,0 216,9 165,1

COLO205

IGF-2 576,1 100,8 632,3

Ejemplo 4

Efectos sobre la proliferación de líneas de células derivadas de sarcoma de Ewing

El efecto de los anticuerpos 60819 y 60833 sobre la proliferación de la línea de células TC-71 derivada de sarcoma de Ewing hechos crecer en medio que contiene FCS al 10% se muestra en la Figura 5. Con relación a un anticuerpo control de isotipo IgG1 humanizado, que no se une a IGF-1 o IGF-2, tanto 60819 como 60833 muestran una inhibición de la proliferación de células TC-71 dependiente de la dosis.

Ejemplo 5

Efecto sobre los niveles totales de IGF-1 murina y de rata

Puede esperarse que la neutralización de IGF-1 activo con un anticuerpo diana de IGF dé lugar a una retroalimentación endocrina a través de la vía de GH, lo cual da lugar a elevados niveles totales de IGF-1 en suero. Los anticuerpos 60814, 60819 y 60833 tienen reactividad cruzada con IGF-1 de ratón y de rata, lo cual permite que se mida en estas especies cualquier efecto farmacodinámico sobre los niveles totales de IGF-1 en suero. Tal como se muestra en las Figuras 6 y 7, la administración de anticuerpo 60819 a ratones (Figura 6) y ratas (Figura 7) da como resultado un aumento, dependiente de la dosis, de niveles totales de IGF-1 murina y de rata, 24 horas postadministración. Esto representa un marcador farmacodinámico útil de la actividad de estos anticuerpos que puede ensayarse durante el desarrollo clínico en seres humanos.

Ejemplo 6

Efecto de la combinación de anticuerpos que tienen como diana el ligando de IGF y rapamicina sobre la proliferación de la línea de células derivada del sarcoma de Ewing y la señalización intracelular

En la Figura 8 se muestra el efecto de anticuerpos 60819 y el inhibidor mTOR rapamicina, solos o en combinación, sobre la proliferación de la línea de células SK-ES-1 derivada de sarcoma de Ewing. Existe una inhibición, dependiente de la dosis, tanto con los anticuerpos 60819 como con rapamicina sola, consiguiendo los dos agentes individuales una inhibición de la proliferación de alrededor del 60% a 100 nM. La combinación de dosis equivalentes tanto de los anticuerpos 60819 como de rapamicina demostró un efecto aditivo sobre la inhibición de la proliferación de células, con aproximadamente un 95% de inhibición cuando se combinan dosis de 100 nM.

La proliferación de células inducida por IGF es mediada a través de una cadena de sucesos de fosforilación de proteínas intracelulares. Una proteína, cuya fosforilación se incrementa por medio de la estimulación de IGF, es AKT. La Figura 9 demuestra el efecto del anticuerpo 60819 y rapamicina, solos o en combinación, sobre la fosforilación de AKT en células SK-ES-1 24 horas después del tratamiento, utilizando dosis de 100 nM. Comparado con células no tratadas proliferantes, que muestran una fosforilación de AKT, 100 nM de anticuerpo 60819 inhibían la fosforilación de AKT. A la inversa, el tratamiento con 100 nM de rapamicina dio como resultado niveles mayores de AKT fosforilado que el control, lo cual se piensa que es debido a un mecanismo de retroalimentación compensatorio, tras la inhibición de mTOR. Sin embargo, cuando se combinan 100 nM de rapamicina y 100 nM de anticuerpo 60819, se inhibe la fosforilación de AKT. Esto sugiere que la retroalimentación compensatoria que conduce a AKT fosforilado tras tratamiento con rapamicina es debida a la elevación de los ligandos de IGF y éstos son inhibidos por el anticuerpo 60819. La Figura 9 demuestra también que tanto el anticuerpo 60819 como rapamicina, solos o en combinación, no afectan a los niveles totales de PTEN.

Ejemplo 7

Efecto de la combinación de un anticuerpo que tiene como diana a un ligando de IGF y un inhibidor de EGFR sobre la proliferación de la línea de células derivada de NSCLC

En la Figura 10 se muestra el efecto de anticuerpos 60819 y al agente inhibidor de EGFR erlotinib/tarceva, solos o

5 en combinación, sobre la proliferación de la línea de células A-549 derivada de NSCLC. En este modelo sólo existe un pequeño efecto de anticuerpo 60819 solo sobre la proliferación de células, mientras que tarceva muestra un efecto dependiente de la dosis con una inhibición de alrededor de 60% de la proliferación celular a la dosis más elevada sometida a ensayo (20 µM). Sin embargo, cuando se combina el anticuerpo 60819 y tarceva, existe una inhibición más potente y eficaz de la proliferación celular, indicativa de un efecto sinérgico.

10 Ejemplo 8

Propiedades farmacocinéticas en ratas Wistar

En la Tabla 6 se muestran los parámetros farmacocinéticos medios del anticuerpo 60833 en ratas Wistar el primer día de dosificación con 18, 52 y 248 mg/kg. La semivida terminal se calculó después del último día de dosificación (con t(n) = 1008 horas), la semivida terminal media para los tres niveles de dosis es 221 h (9,2 días).

15 Tabla 6.

Parámetros farmacocinéticos medios de anticuerpo 60833 en ratas Wistar el primer día de dosificación

Dosis de 60833 (mg/kg)

18

52 248

C(max) [mg/mL]

0,531 1,70 5,56

AUC(0-72h) [mg·h/mL]

15,5 40,2 120

CL [(mL/día)/kg]

22,9 28,7 37,3

V(ss) [mL/kg]

68,1 76,3 65,4

t1/2φ [h]

210 197 255

φ = después del último día de dosificación con t(n) = 1008 h

Ejemplo 9

Co-cristalización de Fab-IGF-1 y determinación de la estructura para identificar los sitios de unión del anticuerpo en 20 IGF-1

Para determinar definitivamente los residuos en IGF-1 humano que interactúa con los anticuerpos de IGF, el Fab eIGF-1 se co-cristalizaron y se determinó la estructura de la interacción con una resolución mejor que 2Å. En la Tabla 7 se muestran los residuos en IGF-1 que son contactados por el anticuerpo (Fab) 60833. En total, 19 residuos en IGF-1 hacen contacto con 15 residuos de CDR en 60833. De estos 19 residuos en IGF-1, 17 son idénticos en IGF-2

25 humano cuando se alinean las secuencias de aminoácidos de IGF-1 e IGF-2 humanos (listadas en la Tabla 7). La figura 11 muestra la estructura 3D de IGF-1 con los aminoácidos que están unidos por 60833 resaltados, también se muestra la secuencia lineal de aminoácidos de IGF-1 humano con los aminoácidos interactuantes subrayados.

Tabla 7

Residuos en IGF-1 humano que hacen contacto con residuos de FAB de 60833

Residuos de IGF-1 en contacto con 60833

Residuos de contacto en 60833 (CDR) Residuo homólogo en IGF-2

Leu (L) 5

Tyr (Y) 54; (HCDR 2) Leu (L) 8

Cys (C) 6

Ser (S) 56; (HCDR 2) Cys (C) 9

Glu (E) 9

Thr (T) 52; (HCDR 2) Ser (S) 53; (HCDR 2) Glu (E) 12

Tyr (Y) 54; (HCDR 2) Gly (G) 55; (HCDR 2) Ser (S) 56; (HCDR 2)

Leu (L) 10

Phe (F) 57; (HCDR 2) Leu (L) 13

Asp (D) 12

Trp (W) 33; (HCDR 1) Asp (D) 15

Ala (A) 13

Trp (W) 33; (HCDR 1) -

Phe (F) 16

Trp (W) 33; (HCDR 1) Arg (R) 92; (LCDR 3) Tyr (Y) 98; (LCDR 3) Trp (W) 99; (LCDR 3) Tyr (Y) 101; (HCDR 3) Phe (F) 19

Val (V)17

Arg (R) 92; (LCDR 3) Tyr (Y) 98; (LCDR 3) Val (V) 20

Arg (R) 21

Tyr (Y) 95; (LCDR 3) Arg (R) 24

Cys (C) 47

Ser (S) 56; (HCDR 2) Phe (F) 57; (HCDR 2) Cys (C) 46

Cys (C) 48

Ser (S) 56; (HCDR 2) Cys (C) 47

Phe (F) 49

Tyr (Y) 54; (HCDR 2) Gly (G) 55; (HCDR 2) Ser (S) 56; (HCDR 2) Phe (F) 48

Ser (S) 51

Gly (G) 55; (HCDR 2) Ser (S) 56; (HCDR 2) Thr (T) 58; (HCDR 2) Ser (S) 50

Cys (C) 52

Ser (S) 56; (HCDR 2) Phe (F) 57; (HCDR 2) Thr (T) 58; (HCDR 2) Cys (C) 51

Asp (D) 53

Phe (F) 57; (HCDR 2) Thr (T) 58; (HCDR 2) Asp (D) 52

Leu (L) 54

Trp (W) 33; (HCDR 1) Phe (F) 57; (HCDR 2) Thr (T) 58; (HCDR 2) Tyr (Y) 98; (LCDR 3) Leu (L) 53

Arg (R) 55

Lys (K) 65; (HCDR 2) Gly (G) 96; (LCDR 3) Tyr (Y) 98; (LCDR 3) -

Leu (L) 57

Phe (F) 57; (HCDR 2) Leu (L) 56

Glu (E) 58

Tyr (Y) 95; (LCDR 3) Gly (G) 96; (LCDR 3) Tyr (Y) 98; (LCDR 3) Glu (E) 57

19 residuos en IGF-1 implicados en el contacto con 60833

15 residuos en 60833 implicados en contactos con IGF-1: HCDR 1: 1 residuo HCDR 2: 8 residuos HCDR 3: 1 residuo LCDR 1: -LCDR 2: -LCDR 3: 5 residuos

Referencias

Barbas, et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813. Burtrum et al., Cancer Res. 63: 8912-21, 2003).

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Claims (1)

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