RS65187B1 - Antitela na lif i njihove primene - Google Patents

Antitela na lif i njihove primene

Info

Publication number
RS65187B1
RS65187B1 RS20240203A RSP20240203A RS65187B1 RS 65187 B1 RS65187 B1 RS 65187B1 RS 20240203 A RS20240203 A RS 20240203A RS P20240203 A RSP20240203 A RS P20240203A RS 65187 B1 RS65187 B1 RS 65187B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
seq
set forth
sequence set
Prior art date
Application number
RS20240203A
Other languages
English (en)
Inventor
Suarez Joan Seoane
Folgueira Judit Anido
Johan Fransson
Jean-Philippe Julien
Swetha Raman
Original Assignee
Medimmune Ltd
Fundacio Privada Inst Catalana De Recerca I Estudis Avancats
Fundacio Privada Inst Dinvestigacio Oncològica De Vall Hebron
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Medimmune Ltd, Fundacio Privada Inst Catalana De Recerca I Estudis Avancats, Fundacio Privada Inst Dinvestigacio Oncològica De Vall Hebron filed Critical Medimmune Ltd
Priority claimed from PCT/IB2017/001677 external-priority patent/WO2018115960A1/en
Publication of RS65187B1 publication Critical patent/RS65187B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0085—Brain, e.g. brain implants; Spinal cord
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/248—IL-6
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis
OBLAST TEHNIKE
[0001] Ovde su opisana nova anti-LIF antitela koja antagonizuju ili blokiraju aktivnost LIF. Ova antitela su korisna za lečenje raka. Ova antitela mogu da se humanizuju kako bi se razvila klinička terapija za kancere koji eksprimiraju visoke nivoe LIF, LIF receptora ili pokazuju rast zavisan od LIF. Jedno takvo antitelo koje je ovde opisano pokazuje neočekivano poboljšanje afiniteta vezivanja i biološkog efekta nakon procesa humanizacije.
OSNOV PRONALASKA
[0002] Inhibitorni faktor leukemije (LIF) je citokin tipa interleukina 6 (IL-6) koji je uključen u različite biološke aktivnosti uključujući inhibiciju diferencijacije ćelija. Humani LIF je polipeptid od 202 amino kiseline koji ispoljava biološke efekte vezivanjem za LIF receptor na površini ćelije (LIFR ili CD118) koji heterodimerizuje sa gp130. To dovodi do aktivacija signalnih puteva za pospešivanje rasta, kao što su putevi mitogen-aktivirane protein kinaze (MAPK) i Janus-aktivirane kinaze (JAK/STAT). Pokazalo se da su visoki nivoi ekspresije i visoki nivoi LIF faktora u serumu povezani sa lošom prognozom za mnoge vrste raka.
WO2011/124566 opisuje antitela usmerena humani inhibitroni faktor leukemije (LIF) i hibridoma ćelijsku liniju koja proizvodi navedena antitela.
WO1993/23556 opisuje monoklonska antitela na humani inhibitroni faktor leukemije.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0003] Sve reference u opisu, na postupke lečenja, odnose se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i medikamente prema predmetnom pronalasku za upotrebu u postupku za lečenje humanog (ili životinjskog) tela terapijom (ili za dijagnozu)
[0004] U jednom ovde opisanom aspektu je rekombinantno antitelo koje specifično vezuje inhibitorni faktor leukemije (LIF), koje sadrži: a) region 1 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VH-CDR1) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 2 (GFTFSHAW); b) region 2 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VH-CDR2) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 10 (IKAKSDDYAT); c) region 3 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VH-CDR3) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 15 (TCWEWDLDF); d) region 1 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VL-CDR1) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 22 (QSLLDSDGHTY); e) region 2 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VL-CDR2) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 26 (SVS); i f) region 3 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VL-CDR3) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 29 (MQATHAPPYT), pri čemu se rekombinantno antitelo specifično vezuje za LIF. U nekim primerima izvođenja, rekombinantno antitelo se vezuje za glikozilovani LIF. U nekim primerima izvođenja, rekombinantno antitelo je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, rekombinantno antitelo je deimunizovano. U nekim primerima izvođenja, rekombinantno antitelo sadrži dva imunoglobulinska teška lanca i dva imunoglobulinska laka lanca. U nekim primerima izvođenja, rekombinantno antitelo sadrži Fab, F(ab)2, antitelo sa jednim domenom, jednolančani varijalbilni fragment (scFv) ili nanotelo. U nekim primerima izvođenja, rekombinantno antitelo se specifično vezuje za LIF sa konstantom disocijacije (KD) manjom od oko 200 pikomola. U nekim primerima izvođenja, rekombinantno antitelo antitelo se specifično vezuje za LIF sa konstantom disocijacije (KD) manjom od oko 100 pikomola. U nekim primerima izvođenja, VH-CDR1 sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 1 (GFTFSHAWMH), pri čemu VH-CDR2 sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 9 (QYKAKSDDYATYYAESVKG), pri čemu VH-CDR3 sadrži amino kiselinsku sekvencu navedena u SEQ ID NO: 15 (TCWEWDLDF), pri čemu VL-CDR1 sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 21 (RSSQSLLDSDGHTYLN), pri čemu VL-CDR2 sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 25 (SVSNLES), i pri čemu VL-CDR3 sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 29 (MQATHAPPYT). U nekim primerima izvođenja, VH sekvenca je najmanje oko 90% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 72; a VL sekvenca je najmanje oko 90% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 76. U nekim primerima izvođenja, VH sekvenca je humanizovani varijabilni region teškog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 72; a VL sekvenca je humanizovani varijabilni region lakog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 76. U nekim primerima izvođenja, rekombinantno antitelo je za upotrebu u lečenju raka. U nekim primerima izvođenja, rak obuhvata glioblastom, rak pankreasa, rak jajnika ili rak pluća. U nekim primerima izvođenja, rekombinantno antitelo je konstituent farmaceutske kompozicije koja sadrži rekombinantno antitelo i farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija je formulisana za intravensku primenu. U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija je formulisana za intracerebralnu primenu. U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija je za upotrebu u lečenju raka. U nekim primerima izvođenja, rak obuhvata glioblastom, rak pankreasa, rak jajnika, rak debelog creva, rak prostate ili rak pluća.
[0005] Takođe je otkriveno rekombinantno antitelo koje se specifično vezuje za inhibitorni faktor leukemije (LIF), koje sadrži:
a) sekvencu varijabilnog regiona imunoglobulinskog teškog lanca (VH) sa amino kiselinskom sekvencom koja je najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom prikazanom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 71, 72 , ili 74; i
b) sekvencu varijabilnog regiona imunoglobulinskog lakog lanca (VL) sa amino kiselinskom sekvencom koja je najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom prikazanom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 75-78.
[0006] Takođe je otkriven postupak lečenja pojedinca sa rakom, koji obuhvata primenu, kod pojedinca, rekombinantnog antitela koje se specifično vezuje za inhibitorni faktor leukemije (LIF), koje sadrži: a) region 1 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VH-CDR1) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1-7 ili 33; b) region 2 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VH-CDR2) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 9-13 ili 35; c) region 3 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VH-CDR3) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 15-19 ili 37; d) region 1 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VL-CDR1) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 21-23 ili 39; e) region 2 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VL-CDR2) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 25-27 ili 41; i f) region 3 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VL-CDR3) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 29, 30 ili 43, pri čemu se rekombinantno antitelo specifično vezuje za LIF.
[0007] Takođe je otkriven postupak lečenja pojedinca sa rakom koji se sastoji od primene kod pojedinca, rekombinantnog antitela koje specifično vezuje inhibitorni faktor leukemije (LIF), koje sadrži: a) sekvencu varijabilnog regiona imunoglobulinskog teškog lanca (VH) sa amino kiselinskom sekvencom koja je najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom prikazanom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 71, 72 , ili 74; i b) sekvencu varijabilnog regiona imunoglobulinskog lakog lanca (VL) sa amino kiselinskom sekvencom koja je najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom prikazanom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 75-78.
[0008] Takođe je otkriven postupak pripreme tretmana za rak, za lečenje subjekta sa rakom, koji obuhvata mešanje farmaceutski prihvatljivog nosača i rekombinantnog antitela koje se specifično vezuje za inhibitorni faktor leukemije (LIF), koje sadrži region 1 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VH-CDR1) koji sadrži: a) region 1 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VH-CDR1) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1 -7 ili 33; b) region 2 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VH-CDR2) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 9-13 ili 35; c) region 3 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VH-CDR3) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 15-19 ili 37; d) region 1 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VL-CDR1) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 21-23 ili 39; e) region 2 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VL-CDR2) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 25-27 ili 41; i f) region 3 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VL-CDR3) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 29, 30 ili 43, pri čemu se rekombinantno antitelo specifično vezuje za LIF.
[0009] Takođe je otkriven postupak pripreme tretmana za rak, za lečenje subjekta sa rakom, koji obuhvata mešanje farmaceutski prihvatljivog nosača i rekombinantnog antitela koje se specifično vezuje za inhibitorni faktor leukemije (LIF), koje sadrži: a) sekvencu varijabilnog regiona imunoglobulinskog teškog lanca (VH) sa amino kiselinskom sekvencom koja je najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom prikazanom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 71, 72 , ili 74; i b) sekvencu varijabilnog regiona imunoglobulinskog lakog lanca (VL) sa amino kiselinskom sekvencom koja je najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom prikazanom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 75-78.
[0010] Takođe je otkriveno rekombinantno antitelo koje se specifično vezuje za inhibitorni faktor leukemije (LIF), koje sadrži najmanje jedan region za određivanje komplementarnosti (CDR) poreklom od pacova i najmanje jedan imunoglobulinski okvirni region (FR) humanog porekla, pri čemu se najmanje jedan CDR poreklom od pacova specifično vezuje za LIF.
[0011] Takođe je otkriveno rekombinantno antitelo koje se specifično vezuje za inhibitorni faktor leukemije (LIF), koje sadrži sekvencu imunoglobulinskog teškog lanca sa amino kiselinskom sekvencom koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom prikazanom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 71, 72 ili 74; i sekvencu imunoglobulinskog lakog lanca sa amino kiselinskom sekvencom koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom prikazanom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 75-78.
[0012] Takođe je otkriven postupak lečenja subjekta sa rakom koji obuhvata primenu kod pojedinca, rekombinantnog antitela koje se specifično vezuje za inhibitorni faktor leukemije (LIF), pri čemu rekombinantno antitelo koje se specifično vezuje za (LIF) sadrži najmanje jedan region za određivanje komplementarnosti (CDR) poreklom od pacova i najmanje jedan imunoglobulinski okvirni region (FR) humanog porekla, pri čemu se najmanje jedan CDR poreklom od pacova specifično vezuje za LIF.
[0013] Takođe je otkriven postupak lečenja subjekta sa rakom koji obuhvata primenu kod pojedinca, rekombinantnog antitela koje se specifično vezuje za inhibitorni faktor leukemije (LIF), pri čemu rekombinantno antitelo koje se specifično vezuje za (LIF) sadrži sekvencu teškog imunoglobulinskog lanca sa amino kiselinskom sekvencom koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom prikazanom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 71, 72 ili 74; i sekvencu imunoglobulinskog lakog lanca sa amino kiselinskom sekvencom koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom prikazanom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 75-78.
[0014] Takođe je otkriven postupak pripreme tretmana za rak, za lečenje subjekta sa rakom, koji obuhvata mešanje farmaceutski prihvatljivog nosača i rekombinantnog antitela koje se specifično vezuje za inhibitorni faktor leukemije (LIF), pri čemu rekombinantno antitelo koje se specifično vezuje za (LIF) sadrži najmanje jedan region za određivanje komplementarnosti (CDR) poreklom od pacova i najmanje jedan imunoglobulinski okvirni region (FR) humanog porekla, pri čemu se najmanje jedan CDR poreklom od pacova specifično vezuje za LIF.
[0015] Takođe je otkriven postupak pripreme tretmana za rak, za lečenje subjekta sa rakom, koji obuhvata mešanje farmaceutski prihvatljivog nosača i rekombinantnog antitela koje se specifično vezuje za inhibitorni faktor leukemije (LIF), pri čemu rekombinantno antitelo koje se specifično vezuje za (LIF) sadrži sekvencu teškog imunoglobulinskog lanca sa amino kiselinskom sekvencom koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom prikazanom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 71, 72 ili 74; i sekvencu imunoglobulinskog lakog lanca sa amino kiselinskom sekvencom koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom prikazanom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 75-78.
[0016] Takođe je otkriveno rekombinantno antitelo koje se vezuje za LIF, pri čemu antitelo sadrži: CDR1 amino kiselinsku sekvencu teškog lanca, prikazanu u SEQ ID NO: 1, CDR2 amino kiselinsku sekvencu teškog lanca, prikazanu u SEQ ID NO: 9, CDR3 amino kiselinsku sekvencu teškog lanca, prikazanu u SEQ ID NO: 15, FR1 amino kiselinsku sekvencu teškog lanca najmanje 90% identičnu amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 45, FR2 amino kiselinsku sekvencu teškog lanca najmanje 90% identičnu amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 49, FR3 amino kiselinsku sekvencu teškog lanca najmanje 90% identičnu sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 50, FR4 amino kiselinsku sekvencu teškog lanca najmanje 90% identičnu sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 54, CDR1 amino kiselinsku sekvencu lakog lanca prikazanu u SEQ ID NO: 21, CDR2 amino kiselinsku sekvencu lakog lanca prikazanu u SEQ ID NO: 25, CDR3 amino kiselinsku sekvencu lakog lanca prikazanu u SEQ ID NO: 29, FR1 amino kiselinsku sekvencu lakog lanca najmanje 90% identičnu amino kiselinskoj sekvenci izloženoj u SEQ ID NO: 57, FR2 amino kiselinsku sekvencu lakog lanca najmanje 90% identičnu amino kiselinskoj sekvenci izloženoj u SEQ ID NO: 61, FR3 amino kiselinsku sekvencu lakog lanca najmanje 90% identičnu amino kiselinskoj sekvenci izloženoj u SEQ ID NO: 65 i FR4 amino kiselinsku sekvencu lakog lanca najmanje 90% identičnu amino kiselinskoj sekvenci izloženoj u SEQ ID NO: 68.
[0017] Takođe je otkriveno rekombinantno antitelo koje se specifično vezuje za LIF, pri čemu antitelo sadrži humanizovani varijabilni region teškog lanca koji je najmanje 90%, 95%, 97%, 98% ili 99% identičan sa amino kiselinom navedenom u SEQ ID BR: 72, i humanizovani varijabilni region lakog lanca koji je najmanje 90%, 95%, 97%, 98% ili 99% identičan amino kiselini izloženoj u SEQ ID NO: 76.
[0018] Takođe je otkriveno rekombinantno antitelo koje se specifično vezuje za LIF, koje sadrži: a) CDR1 teškog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1-7 ili 33; b) CDR2 teškog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 9-13 ili 35; i c) CDR3 teškog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 15-19 ili 37, pri čemu se rekombinantno antitelo specifično vezuje za LIF.
[0019] Takođe je otkriveno rekombinantno antitelo koje se specifično vezuje za LIF, koje sadrži: a) region 1 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VL-CDR1) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 21-23 ili 39; b) region 2 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VL-CDR2) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 25-27 ili 41; i c) region 3 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VL-CDR3) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 29, 30 ili 43, pri čemu se rekombinantno antitelo specifično vezuje za LIF.
[0020] Takođe je otkriveno rekombinantno antitelo koje se vezuje za LIF, pri čemu antitelo sadrži: varijabilni domen teškog lanca koji sadrži CDR1 amino kiselinsku sekvencu teškog lanca prikazanu u SEQ ID NO: 1, CDR2 amino kiselinsku sekvencu teškog lanca prikazanu u SEQ ID NO: 9 i CDR3 amino kiselinsku sekvencu teškog lanca prikazanu u SEQ ID NO: 15 i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži CDR1 amino kiselinsku sekvencu lakog lanca prikazanu u SEQ ID NO: 21, CDR2 amino kiselinsku sekvencu lakog lanca prikazanu u SEQ ID NO: 25 i CDR3 amino kiselinsku sekvencu lakog lanca prikazanu u SEQ ID NO: 29.
[0021] Takođe je otkriveno rekombinantno antitelo koje se specifično vezuje za LIF koje sadrži: a) laki lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu koja najmanje 90%, 95%, 97%, 98% ili 99% identičnu amino kiselinskoj sekvenci koja je navedena u bilo kom SEQ ID NO: 91-94; i b) teški lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu koja najmanje 90%, 95%, 97%, 98% ili 99% identičnu amino kiselinskoj sekvenci navedenoj u bilo kojoj od SEQ ID NO: 87-90, pri čemu rekombinantno antitelo se specifično vezuje za LIF.
[0022] Takođe je otkriveno rekombinantno antitelo koje vezuje LIF, pri čemu antitelo sadrži: CDR1 teškog lanca koji ima sekvencu aminokiselina najmanje 90% identičnu SEQ ID NO: 1, teški lanac CDR2 koji ima sekvencu aminokiselina najmanje 90% identičnu do SEQ ID NO: 9, CDR3 teškog lanca koji ima sekvencu aminokiselina najmanje 90% identičnu SEQ ID NO: 15, CDR1 lakog lanca koji ima sekvencu aminokiselina najmanje 90% identičnu SEQ ID NO: 21, a CDR2 lakog lanca koji ima sekvencu aminokiselina najmanje 90% identičnu SEQ ID NO: 25, i CDR3 lakog lanca ima sekvencu aminokiselina najmanje 90% identičnu SEQ ID NO: 29.
[0023] Takođe je otkriveno rekombinantno antitelo koje vezuje LIF, pri čemu antitelo sadrži: CDR1 teškog lanca koji ima amino kiselinsku sekvencu koja ne sadrži više od 3, 2 ili 1 amino kiselinske supstitucije, delecije ili insercije u poređenju sa SEQ ID NO: 1 sa , CDR2 teškog lanca koji ima sekvencu aminokiselina koja ne sadrži više od 3,2 ili 1 amino kiselinska supstitucija, delecija ili insercija u poređenju sa SEQ ID NO: 9, CDR3 teškog lanca koji ima amino kiselinsku sekvencu koja ne sadrži više od 3, 2 ili 1 amino kiselinske supstitucije, delecije ili insercije u poređenju sa SEQ ID NO: 15, CDR1 lakog lanca koji ima amino kiselinsku sekvencu koja ne sadrži više od 3, 2 ili 1 amino kiselinske supstitucije, delecije ili insercije u poređenju sa SEQ ID NO: 21, CDR2 lakog lanca koji ima amino kiselinsku sekvencu koji ne sadrži više od 3, 2 ili 1 amino kiselinske supstitucije, delecije ili insercije u poređenju sa SEQ ID NO: 25, i CDR3 lakog lanca koji ima amino kiselinsku sekvencu koja ne sadrži više od 3, 2 ili 1 amino kiselinsku supstituciju, deleciju ili inserciju, u poređenju sa SEQ ID NO: 29.
[0024] Takođe je otkriveno rekombinantno antitelo koje vezuje LIF i u kompeticiji je sa antitelom definisanim sa: CDR1 teškog lanca koji ima sekvencu aminokiselina prikazanu u SEQ ID NO: 1, teški lanac CDR2 koji ima amino kiselinu sekvenca navedena u SEQ ID NO: 9, CDR3 teškog lanca koji ima sekvencu aminokiselina prikazanu u SEQ ID NO: 15, laki lanac CDR1 koji ima sekvencu aminokiselina prikazanu u SEQ ID NO: 21, laki lanac CDR2 ima amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 25, i laki lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 29
[0025] Takođe je otkriveno izolovano monoklonsko antitelo, pri čemu, kada je vezano za humani LIF, monoklonsko antitelo vezuje se za najmanje jedan od sledećih ostataka: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135, H138 iz SEQ ID NO:98.
[0026] Takođe je otkriveno izolovano monoklonsko antitelo, gde se, kada je vezano za humani LIF, monoklonsko antitelo vezuje za najmanje jedan od sledećih ostataka: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135, H138 iz SEQ ID NO: 98.
[0027] Takođe je otkriveno izolovano monoklonsko antitelo u kome VH-CDR1 sadrži amino kiselinsku sekvencu koja se razlikuje od one izložene u SEQ ID NO: 1 (GFTFSHAWMH) za 0, 1, 2, 3 ili 4 amino kiselinska ostatka, pri čemu VH -CDR2 sadrži amino kiselinsku sekvencu koja se razlikuje od one izložene u SEQ ID NO: 9 (QIKAKSDDYATYYAES-VKG) za 0, 1, 2, 3 ili 4 amino kiselinska ostatka, pri čemu VH-CDR3 sadrži amino kiselinsku sekvencu koja razlikuje od one izložene u SEQ ID NO: 15 (TCWEWDLDF) za 0, 1, 2, 3 ili 4 amino kiselinska ostatka, pri čemu VL-CDR1 sadrži amino kiselinsku sekvencu koja se razlikuje od one izložene u SEQ ID NO: 21 (RSSQSLLDSDGHTYLN) za 0, 1, 2, 3 ili 4 amino kiselinska ostatka, pri čemu VL-CDR2 sadrži amino kiselinsku sekvencu koja se razlikuje od one izložene u SEQ ID NO: 25 (SVSNLES) za 0, 1, 2, 3 ili 4 amino kiselinska ostatka, pri čemu VL-CDR3 sadrži amino kiselinsku sekvencu koja se razlikuje od one izložene u SEQ ID NO: 29 (MQATHAPPYT) za 0, 1, 2, 3 ili 4 amino kiselinska ostatka, i pri čemu se monoklonsko antitelo vezuje za najmanje jedan od sledećih ostataka: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135, H138 iz SEQ ID NO: 98.
[0028] Takođe je otkriveno izolovano monoklonsko antitelo u kome VH-CDR1 sadrži amino kiselinsku sekvencu koja se razlikuje od one izložene u SEQ ID NO: 1 (GFTFSHAWMH) za 0, 1, 2, 3 ili 4 amino kiselinska ostatka, pri čemu VH -CDR2 sadrži amino kiselinsku sekvencu koja se razlikuje od one izložene u SEQ ID NO: 9 (QIKAKSDDYATYYAESVKG) za 0, 1, 2, 3 ili 4 amino kiselinska ostatka, pri čemu VH-CDR3 sadrži amino kiselinsku sekvencu koja razlikuje od one izložene u SEQ ID NO: 95 (TSWEWDLDF) za 0, 1, 2, 3 ili 4 amino kiselinska ostatka, pri čemu VL-CDR1 sadrži amino kiselinsku sekvencu koja se razlikuje od one izložene u SEQ ID NO: 21 (RSSQSLLDSDGHTYLN) za 0, 1, 2, 3 ili 4 amino kiselinska ostatka, pri čemu VL-CDR2 sadrži amino kiselinsku sekvencu koja se razlikuje od one izložene u SEQ ID NO: 25 (SVSNLES) za 0, 1, 2, 3 ili 4 amino kiselinska ostatka, pri čemu VL-CDR3 sadrži amino kiselinsku sekvencu koja se razlikuje od one izložene u SEQ ID NO: 29 (MQATHAPPYT) za 0, 1, 2, 3 ili 4 amino kiselinska ostatka, i gde se monoklonsko antitelo vezuje za najmanje jedan od sledećih ostataka: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135, H138 iz SEQ ID NO: 98.
[0029] Takođe je otkriveno rekombinantno antitelo koje se specifično vezuje za inhibitorni faktor leukemije (LIF) koje sadrži: region 1 koji određuje komplementarnost teškog lanca (VH-CDR1) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 2; region 2 koji određuje komplementarnost teškog lanca (VH-CDR2) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu koja je navedena u SEQ ID NO: 10; region 3 koji određuje komplementarnost teškog lanca (VH-CDR3) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 15; region 1 koji određuje komplementarnost lakog lanca (VL-CDR1) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 22; i region 2 koji određuje komplementarnost lakog lanca (VL-CDR2) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 26; i region 3 koji određuje komplementarnost lakog lanca (VL-CDR3) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 29.
[0030] Takođe je otkriveno rekombinantno antitelo koje se specifično vezuje za inhibitorni faktor leukemije (LIF) koje sadrži: region 1 koji određuje komplementarnost teškog lanca (VH-CDR1) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 3; region 2 koji određuje komplementarnost teškog lanca (VH-CDR2) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 9; region 3 koji određuje komplementarnost teškog lanca (VH-CDR3) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 16; region 1 koji određuje komplementarnost lakog lanca (VL-CDR1) koji sadrži amino kiselinu sekvenca navedena u SEQ ID NO: 21; i region 2 koji određuje komplementarnost lakog lanca (VL-CDR2) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 25; i region 3 koji određuje komplementarnost lakog lanca (VL-CDR3) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 29.
[0031] Takođe je otkriveno rekombinantno antitelo koje specifično vezuje inhibitorni faktor leukemije (LIF) koje sadrži: region 1 koji određuje komplementarnost teškog lanca (VH-CDR1) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 3; region 2 koji određuje komplementarnost teškog lanca (VH-CDR2) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 10; region 3 koji određuje komplementarnost teškog lanca (VH-CDR3) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 16; region 1 koji određuje komplementarnost lakog lanca (VL-CDR1) koji sadrži amino kiselinu sekvenca navedena u SEQ ID NO: 22; i region 2 koji određuje komplementarnost lakog lanca (VL-
1
CDR2) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 26; i region 3 koji određuje komplementarnost lakog lanca (VL-CDR3) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 29.
[0032] Takođe je otkriveno rekombinantno antitelo koje specifično vezuje inhibitorni faktor leukemije (LIF) koje sadrži: a) region 1 koji određuje komplementarnost teškog lanca (VH-CDR1) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 3; b) region 2 koji određuje komplementarnost teškog lanca (VH-CDR2) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 10; c) region 3 koji određuje komplementarnost teškog lanca (VH-CDR3) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 16; d) region 1 koji određuje komplementarnost lakog lanca (VL-CDR1) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 22; e) region 2 koji određuje komplementarnost lakog lanca (VL-CDR2) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 26; i f) region koji određuje komplementarnost lakog lanca 3 (VL-CDR3) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 29, pri čemu se rekombinantno antitelo specifično vezuje za LIF.
[0033] Takođe je otkriveno rekombinantno antitelo koje specifično vezuje inhibitorni faktor leukemije (LIF) koje sadrži: a) region 1 koji određuje komplementarnost teškog lanca (VH-CDR1) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu datu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 4-7 ili 33; b) region 2 koji određuje komplementarnost teškog lanca (VH-CDR2) koji sadrži amino kiselinska sekvenca navedena u bilo kojoj od SEQ ID NO: 11-13 ili 35; c) region 3 koji određuje komplementarnost teškog lanca (VH-CDR3) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu datu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 17-19 ili 37; d) region 1 koji određuje komplementarnost lakog lanca (VL-CDR1) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu datu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 21-23 ili 39; e) region 2 koji određuje komplementarnost lakog lanca (VL-CDR2) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu datu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 25-27 ili 41; i f) region 3 koji određuje komplementarnost lakog lanca (VL-CDR3) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu datu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 29, 30 ili 43; pri čemu se rekombinantno antitelo specifično vezuje za LIF.
[0034] Takođe je otkriveno rekombinantno antitelo koje specifično vezuje inhibitorni faktor leukemije (LIF) koje sadrži: VH-CDR1 koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 1 (GFTFSHAWMH); b) a VH-CDR2 koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 9 (QIKAKSDDYATYYAESVKG); c) VH-CDR3 koji sadrži amino kiselinska sekvenca navedena u SEQ ID NO: 15 (TCWEWDLDF), d) VL-CDR1 koja sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 21 (RSSQSLLDSDGHTYLN), e) VL-CDR2 koja sadrži amino kiselinsku sekvencu navedeno u SEQ ID NO: 25 (SVSNLES); i f) VL-CDR3 koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 29 (MQATHAPPYT); pri čemu je cisteinski ostatak SEQ ID NO: 15 bilo koja amino kiselina osim tirozina, triptofana, histidina, lizina ili arginina. U nekim primerima izvođenja, rekombinantno antitelo se vezuje za glikozilovani LIF.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0035]
Sl. 1 prikazuje Vestern blot koji pokazuje inhibiciju LIF-indukovane STAT3 fosforilacije različitih anti-LIF humanizovanih antitela.
Sl. 2A i 2B prikazuju Vestern blot koji pokazuje inhibiciju LIF-indukovane STAT3 fosforilacije humanizovanog i parentalnog 5D8 antitela.
Sl. 3A pokazuje IC50za LIF inhibiciju u U-251 ćelijama pomoću antitela h5D8. Sl. 3B prikazuje reprezentativne IC50krive odgovora na dozu za r5D8 i h5D8-1 inhibiciju pSTAT3 u uslovima endogene stimulacije LIF. Prikazane su reprezentativne krive (n=1 h5D8, n=2 r5D8). Pogledajti dodatak sa slikama 2, 3, 4 za sve IC50dozne krive i kontrole.
Sl. 4 prikazuje Vestern blot koji pokazuje inhibiciju LIF-indukovane STAT3 fosforilacije različitih monoklonskih antitela opisanih u ovom pronalasku.
Sl. 5 prikazuje imunohistohemijsko bojenje i kvantifikaciju LIF ekspresije kod multiformnog glioblastoma (GBM), NSCLC (ne-sitnoćelijskog karcinoma pluća), raka jajnika i tumora kolorektalnog kancera kod pacijenata koji su ljudi. Crte predstavljaju srednju vrednost /- SEM.
Sl. 6 je grafik koji prikazuje eksperiment sproveden u mišjem modelu nesitnoćelijskog raka pluća pomoću humanizovanog 5D8 antitela.
Sl. 7A pokazuje efekat r5D8 na inhibiciju U251 ćelija u ortotopskom mišjem modelu GBM kvantitacije, prikazan za 26. dan.
Sl. 7B prikazuje podatke za miševe inokulisane humanim U251 GBM ćelijama koje eksprimiraju luciferazu i zatim tretirane sa 100, 200 ili 300 µg h5D8 ili vehikuluma, dva puta nedeljno. Veličina tumora je određena bioluminiscencijom (Xenogen IVIS Spectrum), 7. dana. Grafik prikazuje merenja individualnih tumora gde horizontalne crte prikazuju srednju vrednost ± SEM. Statistička značajnost je izračunata korišćenjem neuparenog neparametarskog Mann-Whitney U-testa.
Sl. 8A pokazuje efekat r5D8 na inhibiciju rasta ćelija raka jajnika u singenom modelu miša.
Sl. 8B pokazuje pojedinačna merenja tumora, 25. dana.
Sl. 8C ilustruje da h5D8 pokazuje značajno smanjenje rasta tumora kada se primenjuje u dozi od 200 µg/mišu dva puta nedeljno (p<0,05). Simboli su srednja vrednost SEM, statistička značajnost u poređenju sa vehikulumom (sa neuparenim neparametarskim Mann-whitney U-testom).
Slika 9A pokazuje efekat r5D8 na inhibiciju rasta ćelija kolorektalnog karcinoma u modelu singenog miša.
Slika 9B prikazuje pojedinačna merenja tumora 17. dana.
Sl. 10A pokazuje smanjenje infiltracije makrofaga na mesta tumora u ortotopskom mišjem modelu GBM sa reprezentativnom slikom i kvantifikacijom CCL22+ ćelija.
Sl. 10B pokazuje smanjenje infiltracije makrofaga u modelu kulture humanog organotipskog tkiva.
Sl. 10C pokazuje smanjenje infiltracije makrofaga na mesta tumora u singenom mišjem modelu raka jajnika sa reprezentativnom slikom i kvantifikacijom CCL22+ ćelija.
Sl. 10D pokazuje smanjenje infiltracije makrofaga na tumorska mesta u singenom mišjem modelu kolorektalnog karcinoma sa reprezentativnom slikom i kvantifikacijom CCL22+ ćelija.
Sl. 11A pokazuje povećanje ne-mijeloidnih efektorskih ćelija u singenom mišjem modelu raka jajnika nakon tretmana sa r5D8.
Sl. 11B pokazuje povećanje ne-mijeloidnih efektorskih ćelija u singenom mišjem modelu kolorektalnog kancera nakon tretmana sa r5D8.
Sl. 11C pokazuje smanjenje procenta CD4+ TREGćelija u mišjem modelu NSCLC raka nakon tretmana sa r5D8.
Sl. 12 prikazuje podatke za miševe sa CT26 tumorima, tretirane dva puta nedeljno sa PBS (kontrola) ili r5D8 primenjenim intraperitonealno u prisustvu ili odsustvu anti-CD4 i anti-CD8 deplecionih antitela. Grafik pokazuje pojedinačna merenja tumora na d13 izražena kao srednja zapremina tumora SEM. Statističke razlike između grupa je određena neuparenim neparametarskim Mann-Whitney U-testom. R5D8 je inhibirao rast CT26 tumora (*p<0,05). Inhibicija rasta tumora pomoću r5D8 je značajno smanjena u prisustvu anti-CD4 i anti-CD8 deplecionih antitela (*p<0,0001).
Sl. 13A ilustruje pregled ko-kristalne strukture h5D8 Fab u kompleksu sa LIF. Mesto interakcije sa gp 130 je mapirano na površini LIF (tamno osenčeno)
Sl. 13B ilustruje detaljne interakcije između LIF-a i h5D8, pokazujući ostatke koji formiraju sone mostove i ostatke h5D8 sa zakopanim površinama većim od 100 Å<2>.
1
Sl. 14A ilustruje superpoziciju pet h5D8 Fab kristalnih struktura i ukazuje na visok stepen sličnosti uprkos tome što su kristalizovane u različitim hemijskim uslovima.
Sl. 14B ilustruje široku mrežu van der Valsovih interakcija posredovanih nesparenim Cys100. Ovaj ostatak je dobro uređen, učestvuje u oblikovanju konformacija HCDR1 i HCDR3 i ne učestvuje u neželjenom rearanžmanu disulfida. Rastojanja između ostataka su prikazana isprekidanim linijama i naznačena.
Sl. 15A ilustruje vezivanje h5D8 C100 mutanata za humani LIF pomoću ELISA. Sl. 15B ilustruje vezivanje h5D8 C100 mutanata za mišji LIF pomoću ELISA.
Sl. 16A ilustruje da h5D8 ne blokira vezivanje između LIF i LIFRa, određeno Octet analizom. Sekvencijalno vezivanje h5D8 za LIF praćeno LIFR.
Sl. 16B i 16C ilustruju ELISA analizu LIF/mAb kompleksa koji se vezuju za imobilizovani LIFR ili gp130. Signali anti-IgG antitela konjugovanih sa peroksidazom specifičnom za vrstu (anti-humana za (-) i h5D8, anti-pacovska za r5d8 i B09) koja detektuju deo antitela u mAb/LIF kompleksima koji se vezuju za ploče obložene imobilisanim LIFR (sl. 16B) ili gp130 ( sl.16C).
Sl. 17A i 17B ilustruju ekspresiju LIF iRNK (sl. 16A) ili LIFR (sl. 16B) u 72 različita ljudska tkiva.
DETALJAN OPIS
Neke definicije
[0036] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički termini koji se ovde koriste imaju isto ono značenje koje obično podrazumeva stručnjak u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada. Na način na koji se koriste u ovoj specifikaciji i priloženim zahtevima, neodređeni i određeni oblici imenica u jednini uključuju reference u množini osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Predviđeno je da svaka referenca na „ili“ ovde obuhvati i „i/ili“, osim ako nije drugačije navedeno.
[0037] Kako se ovde koristi, osim ako nije drugačije naznačeno, termin „oko“ odnosi se na količinu koja je blizu navedene količine, na primer, u okviru 10%, 5% ili 1%.
[0038] Kako se ovde koristi, termini „pojedinac“, „subjekt“ i „pacijent“ se koriste naizmenično i uključuju ljude kod kojih je dijagnostifikovan, ili se sumnja da imaju tumor, rak ili drugu neoplaziju.
[0039] Kako se ovde koristi, osim ako nije drugačije naznačeno, termin „antitelo“ uključuje fragmente antitela koji se vezuju za antigen, tj. fragmente antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vezuju za antigen vezan za antitelo potpune dužine, npr. fragmente koji zadržavaju jedan ili više CDR regiona. Primeri fragmenata antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, Fab, Fab', F(ab')2 i Fv fragmente; dijatela; linearna antitela; antitela teškog lanca, jednolančane molekule antitela, npr. jednolančane fragmente varijabilnog regiona (scFv), nanotela i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela sa odvojenim specifičnostima, kao što je bispecifično antitelo. U nekim primerima izvođenja, antitela su humanizovana na takav način da se smanjuje imuni odgovor pojedinca na antitelo. Na primer, antitela mogu da budu himerna, npr. ne-humani varijabilni region sa humanim konstantnim regionom, ili CDR kalemljeni, npr. ne-humani CDR regioni sa humanim sekvencama konstantnog regiona i okvirnim sekvencama varijabilnog regiona. U nekim primerima izvođenja, antitela su deimunizovana nakon humanizacije. Deimunizacija uključuje uklanjanje ili mutiranje jednog ili više epitopa T-ćelija u konstantnom regionu antitela. Kako se ovde koristi, „rekombinantno antitelo“ je antitelo koje sadrži amino kiselinsku sekvencu izvedenu iz dve različite vrste ili, iz dva različita izvora, i uključuje sintetičke molekule, na primer, antitelo koje sadrži ne-humani CDR i humani okvirni ili konstantni region.
[0040] Termini „rak“ i „tumor“ odnose se na fiziološko stanje kod sisara koje karakteriše deregulisani rast ćelija. Rak je klasa bolesti kod koje grupa ćelija pokazuje nekontrolisani rast ili neželjeni rast. Ćelije raka mogu da se šire i na druge lokacije, što može da dovede do stvaranja metastaza. Širenje ćelija raka u telu može, na primer, da se odvija putem limfe ili krvi. Nekontrolisani rast, intruzija i formiranje metastaza se takođe označavaju kao maligna svojstva raka. Po ovim malignim svojstvima se rak razlikuje od benignih tumora, koji tipično ne vrše invaziju i ne metastaziraju.
[0041] Procenat (%) identičnosti sekvence u odnosu na referentnu sekvencu polipeptida ili antitela je procenat amino kiselinskih ostataka u sekvenci-kandidatu koji su identični sa amino kiselinskim ostacima u referentnoj sekvenci polipeptida ili antitela, nakon poravnanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, kako bi se postigao maksimalan procenat identičnosti sekvence, i ne uzimajući u obzir bilo kakve konzervativne supstitucije kao deo identičnosti sekvence. Poravnanje u cilju određivanja procenta identičnosti amino kiselinske sekvence mogu se postići na različite načine koji su poznati, na primer, korišćenjem javno dostupnog kompjuterskog softvera kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Odgovarajući parametri za poravnanje sekvenci se mogu odrediti, uključujući algoritme potrebne da se postigne maksimalno poravnanje preko cele dužine sekvenci koje se porede. Za potrebe u ovom tekstu se, međutim, % vrednosti identičnosti amino kiselinske sekvence generišu korišćenjem kompjuterskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Autor kompjuterskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2 je Genentech, Inc., a izvorni kod je podnet uz korisničku dokumentaciju kod biroa U.S. Copyright Office,
1
Washington D.C,, 20559, gde je registrovan pod brojem U.S. Copiright Registration No. TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan od kompanije Genentech, Inc., Južni San Francisko, Kalifornija, ili se može kompajlirati iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba kompajlirati za upotrebu na UNIX operativnom sistemu, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Svi parametri poređenja sekvenci su zadati programom ALIGN-2 i ne variraju.
[0042] U situacijama kada se ALIGN-2 koristi za poređenje amino kiselinskih sekvenci, % identičnosti amino kiselinske sekvence date amino kiselinske sekvence A prema, sa ili protiv date amino kiselinske sekvence B (koja se alternativno može izraziti kao data amino kiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti amino kiselinske sekvence prema, sa ili protiv date amino kiselinske sekvence B) izračunava se na sledeći način: 100 puta razlomak X/Y, gde je X broj amino kiselinskih ostataka sa skorom identičnog poklapanja prema programu za poravnanje sekvence ALIGN-2 za poravnanje A i B u tom programu, i gde je Y ukupan broj amino kiselinskih ostataka u B. Smatraće se da, ako dužina amino kiselinske sekvence A nije jednaka dužini amino kiselinske sekvence B, % identičnosti amino kiselinske sekvence A sa B nije jednak % identičnosti amino kiselinske sekvence B sa A. Osim ako nije sepecifično navedeno drugačije, svi % vrednosti identičnosti amino kiselinske sekvence koje se ovde koriste dobijaju se kao što je opisano u neposredno prethodnom paragrafu korišćenjem ALIGN-2 kompjuterskog programa.
[0043] Termin „epitop“ uključuje bilo koju determinantu za koju može da se veže protein koji vezuje antigen, kao što je antitelo. Epitop je region antigena koji je vezan sa proteinom koji vezuje antigen, čije je taj antigen ciljna kategorija, a kada je antigen protein, uključuje specifične amino kiseline koje su direktno u kontaktu sa proteinom koji vezuje antigen. Najčešće, epitopi se nalaze na proteinima, ali u nekim slučajevima mogu da budu na drugim vrstama molekula, kao što su saharidi ili lipidi. Epitop determinante mogu da uključuju hemijski aktivne površinske grupacije molekula kao što su amino kiseline, bočni lanci šećera, fosforilne ili sulfonilne grupe, i mogu da imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike i/ili specifične karakteristike naelektrisanja. U principu, antitela specifična za određeni ciljni antigen će preferencijalno prepoznati epitop na ciljnom antigenu u kompleksnoj mešavini proteina i/ili makromolekula.
Strukturni atributi ovde opisanih antitela
[0044] Region za određivanje komplementarnosti („CDR“) je deo varijabilnog regiona imunoglobulina (antitela) koji je prvenstveno odgovoran za specifičnost vezivanja antitela za antigena. CDR regioni su veoma varijabilni od jednog do drugog antitela čak i kada se antitelo specifično vezuje za isti cilj ili epitop. Varijabilni region teškog lanca sadrži tri CDR
1
regiona, skraćeno VH-CDR1, VH-CDR2 i VH-CDR3; i varijabilni region lakog lanca sadrži tri CDR regiona, skraćeno VL-CDR1, VL-CDR2 i VL-CDR3. Ovi CDR regioni su poređani jedan za drugim u varijabilnom regionu, pri čemu je CDR1 najbliži N-terminusu, a CDR3 je najbliži C-terminusu. Između CDR regiona su raspoređeni okvirni regioni koji doprinose strukturi i prikazuju mnogo manje varijabilnosti od CDR regiona. Varijabilni region teškog lanca sadrži četiri okvirna regiona, skraćeno VH-FR1, VH-FR2, VH-FR3 i VH-FR4; i varijabilni region lakog lanca sadrži četiri okvirna regiona, skraćeno VL-FR1, VL-FR2, VL-FR3 i VL-FR4. Kompletna bivalentna antitela pune veličine koja sadrže dva teška i laka lanca će sadržati: 12 CDR regiona, sa tri jedinstvena CDR regiona teškog lanca i tri jedinstvena CDR regiona lakog lanca; 16 FR regiona, sa četiri jedinstvena FR regiona teškog lanca i četiri jedinstvena FR regiona lakog lanca. U nekim primerima izvođenja, ovde opisana antitela minimalno sadrže tri CDR regiona teškog lanca. U nekim primerima izvođenja, ovde opisana antitela minimalno sadrže tri CDR regiona lakog lanca. U nekim primerima izvođenja, ovde opisana antitela minimalno sadrže tri CDR teškog lanca i tri CDR lakog lanca. Precizne granice amino kiselinske sekvence datog CDR ili FR mogu lako da se odrede korišćenjem bilo koje od brojnih dobro poznatih šema, uključujući one koje su opisali Kabat et al. (1991), , "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (šema numeracije „po Kabatu“); Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 (šema numeracije „po Hotiji“); MacCallum et al., J. Mol. Biol.
262:732-745 (1996), "Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography," (“kontaktna” šema numeracije); Lefranc MP et al., "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains," Dev Comp Immunol, 2003 Jan;27(1):55-77 ("IMGT" šema numeracije); i Honegger A and Plückthun A, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool," J Mol Biol, 2001 Jun 8;309(3):657-70, ("Aho" šema numeracije). CDR regioni su ovde identifikovani iz varijabilnih sekvenci obezbeđenih korišćenjem različitih sistema numeracije, ovde sa Kabat, IMGT, Hotia sistemom numeracije ili bilo kojom kombinacijom ova tri sistema. Granice datog CDR ili FR mogu da variraju u zavisnosti od šeme koja se koristi za identifikaciju. Na primer, Kabat šema je zasnovana na strukturnim poravnanjima, dok je Hotia šema zasnovana na strukturnim informacijama. Numeracija, i za Kabat i za Hotia šemu je zasnovano na najčešćim dužinama sekvenci regiona antitela, gde su insercije omogućene insercijom slova, na primer, „30a“ i delecijama koji se javljaju u nekim antitelima. Dve šeme postavljaju neke insercije i delecije („indeli“) na različite pozicije, što rezultira diferencijalnom numeracijom. Kontaktna šema je zasnovana na analizi složenih kristalnih struktura i po mnogo čemu je slična Hotia šemi numeracije.
1
[0045] Termin „varijabilni region“ ili „varijabilni domen“ odnosi se na domen teškog ili lakog lanca antitela koji je uključen u vezivanje antitela za antigen. Varijabilni domeni teškog i lakog lanca (VH i VL, redom) nativnog antitela generalno imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri očuvana okvirna regiona (FR) i tri CDR regiona (Videti npr. Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91(2007)). Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan da dodeli specifičnost vezivanja antigena. Štaviše, antitela koji vezuju određeni antigen mogu biti izolovani korišćenjem VH ili VL domena iz antitela koje vezuje antigen za skrining biblioteke komplementarnih VL ili VH domena, redom (Videti npr. Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)). U nekim primerima izvođenja, ovde opisana antitela obuhvataju varijabilne regione poreklom od pacova. U nekim primerima izvođenja, ovde opisana antitela sadrže CDR regione pacovskog porekla. U nekim primerima izvođenja, ovde opisana antitela obuhvataju varijabilne regione mišjeg porekla. U nekim primerima izvođenja, ovde opisana antitela sadrže CDR regione mišjeg porekla.
[0046] Promene (npr. supstitucije) se mogu izvršiti u CDR regionima, npr., da bi se poboljšao afinitet antitela. Takve izmene se mogu napraviti u kodonima koji kodiraju CDR sa visokom stopom mutacije tokom somatskog sazrevanja (Videti npr. Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), a rezultujuća varijanta se može testirati na afinitet vezivanja. Sazrevanje afiniteta (npr. korišćenje PCR podložnog greškama, mešanje lanaca, randomizacija CDR ili mutageneza usmerena na oligonukleotide) može se koristiti za poboljšanje afiniteta antitela (Videti npr. Hoogenboom et al. u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (2001)). CDR ostaci uključeni u vezivanje antigena mogu se specifično identifikovati, npr. korišćenjem alanin skenirajuće mutageneze ili modeliranja (Videti npr. Cunningham and Wells Science, 244:1081-1085 (1989)). Često su ciljani CDR-H3 i CDR-L3. Alternativno, ili dodatno, analizira se kristalna struktura kompleksa antigen-antitelo da bi se identifikovale kontaktne tačke između antitela i antigena. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci mogu biti ciljani ili eliminisani kao kandidati za zamenu. Varijante se mogu pregledati da bi se utvrdilo da li sadrže željena svojstva.
[0047] U nekim primerima izvođenja, ovde opisana antitela sadrže konstantni region pored varijabilnog regiona. Konstantni region teškog lanca (CH) obuhvata četiri domena skraćeno CH1, CH2, CH3 i CH4, koji se nalaze na C-terminalnom kraju potpunog polipeptida teškog lanca, C-terminalno u odnosu na varijabilni region. Konstantni region lakog lanca (CL) je mnogo manji od CHi nalazi se na C-terminalnom kraju potpunog polipeptida lakog lanca, C-terminalno u odnosu na varijabilni region. Konstantni region je visoko očuvan i obuhvata
1
različite izotipove koji su povezani sa malo drugačijim funkcijama i svojstvima. U nekim primerima izvođenja, konstantni region je neophodan za vezivanje antitela za ciljni antigen. U nekim primerima izvođenja, konstantni regioni antitela, i teški i laki lanci su neophodni za vezivanje antitela. U nekim primerima izvođenja, ovde opisanim antitelima nedostaje jedna ili više svetlosti konstantni region lanca, konstantni region teškog lanca ili oba. Većina monoklonskih antitela je izotip IgG; koja je dalje podeljen u četiri podklase IgG1, IgG2, IgG3i IgG4. U nekim primerima izvođenja, ovde opisana antitela obuhvataju bilo koju IgG podklasu. U nekim primerima izvođenja, podklasa IgG obuhvata IgG1. U nekim primerima izvođenja, podklasa IgG obuhvata IgG2. U nekim primerima izvođenja, podklasa IgG obuhvata IgG3. U nekim primerima izvođenja, IgG podklasa obuhvata IgG4.
[0048] Antitela sadrže region koji može da kristališe fragmente (Fc region) koji je odgovoran za vezivanje za komplement i Fc receptore. Fc region obuhvata CH2, CH3 i CH4 regione molekula antitela. Fc region antitela je odgovoran za aktiviranje komplementa i ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC). Region Fc takođe doprinosi poluživotu antitela u serumu. U nekim primerima izvođenja, Fc region ovde opisanih antitela sadrže jednu ili više supstitucija amino kiselina koje promovišu komplementom posredovanu ćelijsku lizu. U nekim primerima izvođenja, Fc region antitela ovde opisanih sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje promovišu ADCC. U nekim primerima izvođenja, Fc region antitela koji je ovde opisan sadrži jednu ili više supstitucija amino kiselina koje smanjuju ćelijsku lizu posredovanu komplementom. U nekim primerima izvođenja, Fc region antitela opisan ovde sadrži jednu ili više supstitucija amino kiselina koje povećavaju vezivanje antitela za Fc receptor. U nekim primerima izvođenja, Fc receptor obuhvata FcyRI (CD64), FcyRIIA (CD32), FcγRIIIA (CD16a), FcyRIIIB (CD16b) ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim primerima izvođenja, Fc region ovde opisanih antitela sadrži jednu ili više amino kiselinskih supstitucija koje povećavaju poluživot antitela u serumu. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više amino kiselinskih supstitucija koje povećavaju poluživot antitela u serumu povećavaju afinitet antitela za neonatalni Fc receptor (FcRn).
[0049] U nekim primerima izvođenja, antitela prema predmetnom pronalasku su varijante koje poseduju neke, ali ne sve efektorske funkcije, što ga čini poželjnim kandidatom za primene u kojima je poluživot antitela in vivo važan, ali određene efektorske funkcije (kao što su komplement i ADCC) su nepotrebni ili štetni. In vitro i/ili in vivo testovi citotoksičnosti mogu se sprovesti da bi se potvrdilo smanjenje/smanjenje aktivnosti CDC i/ili ADCC. Na primer, testovi vezivanja Fc receptora (FcR) se mogu sprovesti kako bi se osiguralo da antitelu nedostaje FcγR vezivanje (dakle verovatno nedostaje ADCC aktivnost), ali zadržava sposobnost vezivanja FcRn. Neograničavajući primeri in vitro
1
testova za procenu ADCC aktivnosti molekula od interesa su opisani u SAD pat. br.
5,500,362 i 5,821,337. Alternativno, mogu se koristiti metode neradioaktivnih testova (npr. ACTI<™>i CytoTox 96<®>neradioaktivni testovi citotoksičnosti). Korisne efektorske ćelije za ove testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), monocite, makrofage i ćelije prirodne ubice (NK).
[0050] Antitela mogu imati produženi poluživot i poboljšano vezivanje za neonatalni Fc receptor (FcRn) (Videti npr. US 2005/0014934). Takva antitela mogu da sadrže Fc region sa jednom ili više supstitucija koje poboljšavaju vezivanje Fc regiona za FcRn, i uključuju ona sa supstitucijama na jednom ili više ostataka Fc regiona: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ili 434, prema EU sistemu numerisanja (Videti npr. SAD patent br. 7,371,826). Drugi primeri varijanti Fc regiona su takođe razmatrani (Videti npr. Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); SAD patente br. 5,648,260 i 5,624,821; i WO94/29351).
[0051] Antitela korisna u kliničkom lečenju se često „humanizuju“ da bi se smanjila imunogenost kod ljudi. Humanizovana antitela poboljšavaju bezbednost i efikasnost terapije monoklonskim antitelima. Jedan uobičajeni metod humanizacije je da se proizvede monoklonsko antitelo u bilo kojoj pogodnoj životinji (npr. miš, pacov, hrčak) i zameni konstantni region humanim konstantnim regionom, antitela napravljena na ovaj način se nazivaju „himerna“. Još jedna uobičajena metoda je „CDR kalemljenje“ koja zamenjuje nehumane V-FR sa humanim V-FR. U metodi CDR kalemljenja svi ostaci osim za CDR region su humanog porekla. U nekim primerima izvođenja, ovde opisana antitela su humanizovana. U nekim primerima izvođenja, ovde opisana antitela su himerna. U nekim primerima izvođenja, ovde opisana antitela su CDR kalemljena.
[0052] Humanizacija generalno smanjuje ili ima mali uticaj na ukupan afinitet antitela. Ovde su opisana antitela koja neočekivano poseduju veći afinitet za svoju ciljnu kategoriju nakon humanizacije. U nekim primerima izvođenja, humanizacija povećava afinitet za antitelo za 10%. U nekim primerima izvođenja, humanizacija povećava afinitet za antitelo za 25%. U nekim primerima izvođenja, humanizacija povećava afinitet za antitelo za 35%. U nekim primerima izvođenja, humanizacija povećava afinitet za antitelo za 50%. U nekim primerima izvođenja, humanizacija povećava afinitet za antitelo za 60%. U nekim primerima izvođenja, humanizacija povećava afinitet za antitelo za 75%. U nekim primerima izvođenja, humanizacija povećava afinitet za antitelo za 100%. Afinitet se pogodno meri korišćenjem rezonance površinskog plazmona (SPR). U nekim primerima izvođenja, afinitet se meri korišćenjem glikozilovanog humanog LIF. U nekim primerima izvođenja, glikozilovani humani LIF je imobilisan na površini SPR čipa. U nekim
2
primerima izvođenja, antitelo se vezuje sa KDmanjom od oko 300 nanomola, 200 nanomola, 150 nanomola, 125 nanomola, 100 nanomola, 90 nanomola, 80 nanomola, 70 nanomola, 60 nanomola, 50 nanomola, 40 nanomola, ili manje.
Nova antitela prema predmetnom pronalasku
[0053] Ovde opisana antitela su dobijena od pacova i miševa imunizovanih sa DNK koja kodira humani LIF.
[0054] U nekim , ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF koje sadrži VH-CDR1 izložen u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1-7 ili 33, VH-CDR2 izložen u bilo kojoj od SEQ ID NO: 9 -13 ili 35, i VH-CDR3 izložen u bilo kojoj od SEQ ID NO: 15-19 ili 37. U nekim , ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF, koje sadrži VL-CDR1 izložen u bilo kojoj od SEQ ID NO: 21-23 ili 39 , VL-CDR2 izložen u SEQ ID NO: 25-27 ili 41, i VL-CDR3 izložen u bilo kojoj od SEQ ID NO: 29, 30, 43. U nekim , ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF koji sadrži VH-CDR1 izložen u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1-7 ili 33, VH-CDR2 izložen u bilo kojoj od SEQ ID NO: 9-13 ili 35, i VH-CDR3 izložen u bilo kojoj od SEQ ID NO: 15-19 ili 37, VL-CDR1 izložen u bilo kojoj od SEQ ID NO: 21-23 ili 39, VL-CDR2 izložen u bilo kojoj od SEQ ID NO: 25-27 ili 41, i VL-CDR3 izložen u bilo kojoj od SEQ ID NO: 29, 30, 43. U nekim primerima izvođenja, antitelo se specifično vezuje za humani LIF.
[0055] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje se specifično vezuje za LIF sadrži jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca koji sadrže: VH-FR1 amino kiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 44-47, VH-FR2 amino kiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 48 -49, VH- FR3 amino kiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 50-52, ili amino kiselinsku sekvencu VH-FR4 regiona koja je najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 53-55. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca sadrže VH-FR1 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 45, VH-FR2 amino kiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 49, VH-FR3 amino kiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 50, i VH-FR4 amino kiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 54. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje se specifično vezuje za LIF sadrži jedan ili više okvirnih regiona humanog lakog lanca koji sadrži: VL-FR1 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 56-59, VL-FR2 amino kiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 60-63, VL-FR3 amino kiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 64-67, ili VL-FR4 amino kiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 68-70. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više okvirnih regiona humanog lakog lanca sadrže VL-FR1 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identičnu amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 57, a VL-FR2 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 61, amino kiselinska sekvenca VL-FR3 najmanje oko 80%, oko 90 %, ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 65, i VL-FR4 amino kiselinskoj sekvenci najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 68. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca i jedan ili više regiona humanog lakog lanca sadrže VH-FR1 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje 90% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 45, VH-FR2 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 49, VH-FR3 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinska sekvenca navedena u SEQ ID NO: 50, VH-FR4 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 54, VL-FR1 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, 90% ili 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 57, VL-FR2 amino kiselinska sekvenca najmanje 80%, 90% ili 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 61, VL-FR3 amino kiselinska sekvenca najmanje 80%, 90% ili 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 65, i VL-FR4 amino kiselinska sekvenca najmanje 80%, oko 90%, ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 68. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje se specifično vezuje za LIF sadrži jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca koji sadrže: VH-FR1 aminokiselinu sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom prikazanom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 44-47, VH-FR2 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 48-49, VH-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 50-52, ili VH-FR4 regionu amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 53-55. U određenimvarijanti, jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca sadrže VH-FR1 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselinskoj sekvenci izloženoj u SEQ ID NO: 45, VH-FR2 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselinskoj sekvenci datoj u SEQ ID NO: 49, VH-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 50, i VH-FR4 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 54 . U nekim primerima izvođenja, antitelo koje se specifično vezuje za LIF obuhvata jedan ili više okvirnih regiona humanog lakog lanca koji sadrži: VL-FR1 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselinskoj sekvenci navedenoj u bilo kojoj od SEQ ID NO: 56-59, VL-FR2 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 60-63, VL-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom koja je navedena u bilo kojoj od SEQ ID NO: 64-67, ili VL-FR4 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 68-70. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više regiona okvira humanog lakog lanca sadrže VL-FR1 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselinskoj sekvenci izloženoj u SEQ ID NO: 57, VL-FR2 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselinska sekvenca navedena u SEQ ID NO: 61, VL-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom navedeno u SEQ ID NO: 65, i VL-FR4 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 68. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca i jedan ili više regioni humanog lakog lanca obuhvataju VH-FR1 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselinskoj sekvenci izloženoj u SEQ ID NO: 45, VH-FR2 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselinskoj sekvenci izloženoj u SEQ ID NO: 49, a VH-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 50, amino kiselinska sekvenca VH-FR4 identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 54, VL-FR1 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 57, VL-FR2 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 61, VL-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID
2
NO: 65, i VL-FR4 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 68. U nekim primerima izvođenja, antitelo se specifično vezuje za humani LIF. 5D8
[0056] Ovde opisana antitela su generisana iz pacova i miševa imunizovanih sa DNK koja kodira humani LIF. Jedno takvo antitelo (5D8) je klonirano i sekvencirano i sadrži CDR regione (koristeći kombinaciju Kabat i IMGT CDR metoda numeracije) sa sledećim amino kiselinskim sekvencama: VH-CDR1 koji odgovara SEQ ID NO: 1 (GFTFSHAWMH), VH-CDR2 koji odgovara SEQ ID NO: 9 (QIKAKSDDYATYYAESVKG), VH-CDR3 koji odgovara SEQ ID NO: 15 (TCWEWDLDF), VL-CDR1 koji odgovara SEQ ID NO: 21 (RSSQSLLDSDGHTYLN), VL-CDR2 koji odgovara SEQ ID NO: 25 (SVSNLES), i VL-CDR3 koji odgovara SEQ ID NO: 29 (MQATHAPPYT).
[0057] U nekim, ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF, koje sadrži VH-CDR1 najmanje 80% ili 90% identičan sa onim koji je izložen u SEQ ID NO: 1 (GFTFSHAWMH), VH-CDR2 najmanje 80%, 90 %, ili 95% identičan sa onim koji je izložen SEQ ID NO: 9 (QIKAKSDDYATYYAESVKG), i VH-CDR3 najmanje 80% ili 90% identičan sa onim koji je izložen SEQ ID NO: 15 (TCWEWDLDF). U nekim, ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF, koje sadrži VL-CDR1 najmanje 80% ili 90% identičan sa onim koji je izložen u SEQ ID NO: 21 (RSSQSLLDSDGHTYLN), VL-CDR2 najmanje 80 % identičan sa onim koji je izložen u SEQ ID NO: 25 (SVSNLES), i VL-CDR3 najmanje 80% ili 90% identičan sa onim koji je izložen u SEQ ID NO: 29 (MQATHAPPYT). U nekim, ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF, koje sadrži VH-CDR1 izložen u SEQ ID NO: 1 (GFTFSHAWMH), VH-CDR2 izložen u SEQ ID NO: 9 (QIKAKSDDYATYYAESVKG), VH-CDR3 izložen u SEQ ID NO: 15 (TCWEWDLDF), VL-CDR1 izložen u SEQ ID NO: 21 (RSSQSLLDSDGHTYLN), VL- CDR2 izložen u SEQ ID NO: 25 (SVSNLES), i VL-CDR3 prikazan u SEQ ID NO: 29 (MQATHAPPYT). Određene konzervativne amino kiselinske supstitucije su predviđene u amino kiselinskim sekvencama CDR regiona prema predmetnom prikazu. U nekim primerima izvođenja, antitelo sadrži CDR regione koji se razlikuju od amino kiselinske sekvence izložene u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1, 9, 15, 21, 25 i 29 za 1, 2, 3 ili 4 amino kiseline. U nekim primerima izvođenja, antitelo sadrži CDR regione koji se razlikuju od amino kiselinske sekvence izložene u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1, 9, 15, 21, 25 i 29 za 1, 2, 3 ili 4 amino kiseline i ne utiču na afinitet vezivanja za više od 10%, 20% ili 30%. U nekim primerima izvođenja, antitela koja se specifično vezuju za LIF sadrže jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca koji sadrže: VH-FR1 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 44-47, VH-FR2 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 48-49, VH-FR3 amino kiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 50-52, ili amino kiselinsku sekvencu VH-FR4 regiona koja je najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 53-55. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca sadrži VH-FR1 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90%, ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 45, VH-FR2 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 49, VH-FR3 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 50, i VH-FR4 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 54. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje se specifično vezuje za LIF sadrži jedan ili više okvirnih regiona humanog lakog lanca koji sadrži: VL-FR1 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 56-59, VL-FR2 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 60-63, VL-FR3 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom koja je navedena u bilo kojoj od SEQ ID NO: 64-67, ili VL-FR4 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom koja je navedena u bilo kojoj od SEQ ID NO: 68-70. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više regiona okvira humanog lakog lanca sadrže VL-FR1 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identičnu amino kiselinskoj sekvenci izloženoj u SEQ ID NO: 57, VL-FR2 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom koja je navedena u SEQ ID NO: 61, VL-FR3 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 65, i VL-FR4 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje 90% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 68. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca i jedan ili više regiona humanog lakog lanca sadrže sve VH-FR1 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90%, ili oko 95% identična sa amino kiselinskom
2
sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 45, VH-FR2 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom navedeno u SEQ ID NO: 49, VH-FR3 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 50, VH-FR4 amino kiselinska sekvenca najmanje 90% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 54, VL-FR1 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom kiselinska sekvenca navedena u SEQ ID NO: 57, VL-FR2 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 61, VL- FR3 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom koja je navedena u SEQ ID NO: 65, i VL-FR4 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 68. U nekim primerima izvođenja, antitelo se specifično vezuje za humani LIF. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje se specifično vezuje za LIF obuhvata jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca koji sadrže: VH-FR1 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselinskoj sekvenci navedenoj u bilo kojoj od SEQ ID NO: 44-47, VH-FR2 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselinska sekvenca navedena u bilo kojoj od SEQ ID NO: 48-49, VH-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 50-52, ili VH-FR4 amino kiselinska sekvenca regiona identična sa amino kiselinskom sekvencom prikazanom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 53-55. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca sadrže VH-FR1 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselinskoj sekvenci izloženoj u SEQ ID NO: 45, VH-FR2 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselinskoj sekvenci datoj u SEQ ID NO: 49, VH-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 50, i VH-FR4 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 54. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje se specifično vezuje za LIF obuhvata jedan ili više okvirnih regiona humanog lakog lanca koji sadrži: VL-FR1 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselinskoj sekvenci navedenoj u bilo kojoj od SEQ ID NO: 56-59, VL-FR2 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselinskoj sekvenci navedenoj u bilo kojoj od SEQ ID NO: 60-63, VL-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 64-67, ili VL-FR4 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom prikazanom u bilo koji od SEQ ID NO: 68-70. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više okvirnih regiona humanog lakog lanca sadrže VL-FR1 amino kiselinsku sekvencu identičnu
2
amino kiselinskoj sekvenci izloženoj u SEQ ID NO: 57, VL-FR2 amino kiselinskoj sekvenci identičnoj amino kiselinskoj sekvenci izloženoj u SEQ ID NO: 61, VL-FR3 amino kiselinskoj sekvenci identičnoj amino kiselinskoj sekvenci dalje u SEQ ID NO: 65, i VL-FR4 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 68. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca i jedan ili više regiona humanog lakog lanca sadrže VH-FR1 amino kiselinsku sekvencu identičnu sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 45, a VH-FR2 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 49, VH-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 50, VH-FR4 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 54, VL-FR1 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 57, VL-FR2 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom navedeno u SEQ ID NO: 61, VL-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 65, i VL-FR4 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 68. U nekim primerima izvođenja, antitelo se specifično vezuje za humani LIF.
[0058] U nekim , ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF, koje sadrži VH-CDR1 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje 80% ili 90% identična sa onom izloženom u SEQ ID NO: 1 (GFTFSHAWMH), VH-CDR2 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje 80%, 90% ili 95% identična onoj izloženoj u SEQ ID NO: 9 (QIKAKSDDYATYYAESVKG), i VH-CDR3 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje 80% ili 90% identična onoj izloženoj u SEQ ID NO: 95 (TSWEWDLDF). U nekim, ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF, koje sadrži VL-CDR1 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje 80% ili 90% identična sa onom izloženom u SEQ ID NO: 21 (RSSQSLLDSDGHTYLN), VL-CDR2 amino kiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% identična sa onom izloženom u SEQ ID NO: 25 (SVSNLES), i VL-CDR3 amino kiselinska sekvenca najmanje 80% ili 90% identična sa onom izloženom u SEQ ID NO: 29 (MQATHAPPYT) . U nekim primerima izvođenja, ovde je opisano antitelo koje se specifično vezuje za LIF, koje sadrži VH-CDR1 amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 1 (GFTFSHAWMH), VH-CDR2 amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 9 (QIKAKSDDYATYYAESVKG), VH - CDR3 amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 95 (TSWEWDLDF), VL-CDR1 amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 21 (RSSQSLLDSDGHTYLN), VL-CDR2 amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 25 (SVSNLES), i VL-CDR3 amino
2
kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 29 (MQATHAPPYT). Neke konzervativne amino kiselinske supstitucije su predviđene u amino kiselinskim sekvencama CDR regiona prema predmetnom pronalasku. U nekim primerima izvođenja, antitelo sadrži CDR regione koji se razlikuju od amino kiselinske sekvence izložene u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1, 9, 95, 21, 25 i 29 za 1, 2, 3 ili 4 amino kiseline. U nekim primerima izvođenja, antitelo sadrži CDR regione koji se razlikuju od amino kiselinske sekvence izložene u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1, 9, 95, 21, 25 i 29 za 1, 2, 3 ili 4 amino kiseline i ne utiču na afinitet vezivanja za više od 10%, 20% ili 30%. U nekim primerima izvođenja, antitela koja se specifično vezuju za LIF sadrže jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca koji sadrže: VH-FR1 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična amino kiselinskoj sekvenci koja je navedena u bilo koji od SEQ ID NO: 44-47, VH-FR2 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična skupu aminokiselinskih sekvenci dalje u bilo kojoj od SEQ ID NO: 48-49, VH-FR3 amino kiselinska sekvenca je najmanje 90% identična sa amino kiselinskom sekvencom koja je navedena u bilo kojoj od SEQ ID NO: 50-52, ili VH-FR4 regionu amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom koja je navedena u bilo kojoj od SEQ ID NO: 53-55. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca sadrži VH-FR1 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identičnu amino kiselinskoj sekvenci izloženoj u SEQ ID NO: 45, VH-FR2 aminokiselina sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 49, VH-FR3 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95 % identične amino kiselinskoj sekvenci izloženoj u SEQ ID NO: 50, i VH-FR4 amino kiselinskoj sekvenci najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identične amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO : 54. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje se specifično vezuje za LIF obuhvata jedan ili više okvirnih regiona humanog lakog lanca koji sadrže: VL-FR1 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom koja je navedena u bilo kojoj od SEQ ID NO: 56-59, VL-FR2 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 60-63, VL-FR3 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična skupu aminokiselinskih sekvenci dalje u bilo kojoj od SEQ ID NO: 64-67, ili VL-FR4 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom koja je navedena u bilo kojoj od SEQ ID NO : 68-70. In u nekim primerima izvođenja, jedan ili više humanih okvirnih regiona lakog lanca sadrže VL-FR1
2
amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identičnu amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 57, a VL-FR2 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 61, amino kiselinska sekvenca VL-FR3 najmanje oko 80%, oko 90 %, ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 65, i VL-FR4 amino kiselinska sekvenca najmanje 90% identična amino kiselini sekvenca navedena u SEQ ID NO: 68. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više regiona okvira humanog teškog lanca i jedan ili više regiona humanog lakog lanca obuhvataju celu VH-FR1 amino kiselinsku sekvencu najmanje oko 80%, oko 90 %, ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 45, VH-FR2 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom koja je navedena u SEQ ID NO: 49, VH-FR3 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom navedeno u SEQ ID NO: 50, VH-FR4 amino kiselinska sekvenca najmanje 90% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 54, VL-FR1 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90 %, ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 57, VL-FR2 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom koja je navedena u SEQ ID NO: 61, VL-FR3 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 65, i VL-FR4 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 68. U nekim primerima izvođenja, antitelo se specifično vezuje za humani LIF. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje se specifično vezuje za LIF obuhvata jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca koji sadrže: VH-FR1 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselinskoj sekvenci navedenoj u bilo kojoj od SEQ ID NO: 44-47, VH -FR2 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 48-49, VH-FR3 aminokiselina sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom prikazanom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 50-52, ili amino kiselinska sekvenca VH-FR4 regiona identična sa amino kiselinskom sekvencom prikazanom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 53-55. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca sadrži VH-FR1 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselinskoj sekvenci izloženoj u SEQ ID NO: 45, VH-FR2 amino kiselinsku sekvencu identičnu skupu aminokiselinskih sekvenci dalje u SEQ ID NO: 49, VH-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 50, i VH-FR4 amino kiselinska sekvenca identična sa amino
2
kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 54. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje se specifično vezuje za LIF obuhvata jedan ili više okvirnih regiona humanog lakog lanca koji sadrže: VL-FR1 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom prikazanom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 56-59, VL-FR2 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 60-63, VL-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 64-67, ili VL-FR4 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom prikazanom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 68-70. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više regiona okvira humanog lakog lanca sadrže VL-FR1 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselinskoj sekvenci izloženoj u SEQ ID NO: 57, VL-FR2 amino kiselinsku sekvencu identičnu skupu aminokiselinskih sekvenci dalje u SEQ ID NO: 61, VL-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 65, i VL-FR4 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: : 68. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca i jedan ili više regiona humanog lakog lanca sadrže VH-FR1 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselinskoj sekvenci izloženoj u SEQ ID NO: 45, VH-FR2 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 49, VH-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 50, VH-FR4 amino kiselinska sekvenca je identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 54, VL-FR1 amino kiselinskoj sekvenci identičnoj amino kiselinskoj sekvenci izloženoj u SEQ ID NO: 57, VL-FR2 amino kiselinskoj sekvenci identičnoj amino kiselinskoj sekvenci dalje u SEQ ID NO: 61, VL-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 65, iVL-FR4 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 68. U nekim primerima izvođenja, antitelo specifično vezuje humani LIF.
[0059] U nekim , ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF koje sadrži humanizovani varijabilni region teškog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 97%, oko 98% ili oko 99% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 71, 72 i 74. U nekim , ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF koje sadrži humanizovani teški lanac varijabilni region koji sadrži amino kiselinsku sekvencu datu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 71, 72 i 74. U nekim , ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF koje sadrži humanizovani varijabilni region lakog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 97%, oko 98% ili oko 99% identična sa amino kiselinskom sekvencom koja je navedena u bilo kojoj od SEQ ID NO: 75-78. U nekim , ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF koje sadrži humanizovani varijabilni region lakog lanca koji sadrži amino kiselinska sekvenca navedena u bilo kojoj od SEQ ID NO: 75-78. U nekim primerima izvođenja, antitelo se specifično vezuje za humani LIF.
[0060] U nekim , ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF koje sadrži humanizovani varijabilni region teškog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 97%, oko 98% ili oko 99% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO:72; i humanizovan laki lanac varijabilni region koji sadrži amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 97%, oko 98%,ili oko 99% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 76. U nekim , ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF koji sadrži humanizovani varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina prikazanu u SEQ ID NO: 72; i humanizovani varijabilni region lakog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 76.
[0061] U nekim , ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF koje sadrži humanizovani varijabilni region teškog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 97%, oko 98% ili oko 99% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 96; i humanizovani varijabilni region lakog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 97%, oko 98%,ili oko 99% identična sa amino kiselinskom sekvencom datoj u SEQ ID NO: 76. U nekim , ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF koje sadrži humanizovani varijabilni region teškog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 96; i humanizovani varijabilni region lakog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 76.
[0062] U nekim , ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF koje sadrži humanizovani teški lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 97%, oko 98%, ili oko 99% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 79-82; i humanizovani laki lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 97%, oko 98% ili oko 99% identičnu amino kiselinskoj sekvenci koja je navedena u bilo kojoj od SEQ ID NO: 83-86. U nekim primerima izvođenja, opisanoovde je antitelo koje se specifično vezuje za LIF koje sadrži humanizovani teški lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu datu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 79-82; i humanizovani laki lanac koji sadrži
1
prikazanu sekvencu aminokiselina u bilo kojoj od SEQ ID NO: 83-86. U nekim , ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF koji sadrži humanizovani teški lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 97%, oko 98% ili oko 99% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 87-90; i humanizovani laki lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 97%, oko 98% ili oko 99% identičnu amino kiselinskoj sekvenci koja je navedena u bilo kojoj od SEQ ID NO: 91-94. In određene realizacije, koje su ovde opisane, je antitelo koje se specifično vezuje za LIF koje sadrži humanizovani teški lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu datu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 87-90; i humanizovani laki lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu datu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 91-94.
[0063] U nekim , ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF koje sadrži humanizovani teški lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 97%, oko 98%, ili oko 99% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO:80; i humanizovani laki lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 97%, oko 98% ili oko 99% identičnu amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 84 U nekim , ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF koje sadrži humanizovani teški lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO:80; i humanizovani laki lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 84. U nekim primerima izvođenja, ovde opisano, je antitelo koje se specifično vezuje za LIF koje sadrži humanizovani teški lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 97%, oko 98% ili oko 99% identičnu amino kiselinska sekvenca navedena u SEQ ID NO:88; i humanizovani laki lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 97%, oko 98% ili oko 99% identičnu amino kiselinskoj sekvenci koja je navedena u SEQ ID NO: 92. U nekim primerima izvođenja, koje su ovde opisane, je antitelo koje se specifično vezuje za LIF koje sadrži humanizovani teški lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 88; i humanizovan laki lanackoji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 92. U nekim , ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF koje sadrži humanizovani teški lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 97%, oko 98% ili oko 99% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO:88; i humanizovani laki lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 97%, oko 98% ili oko 99% identičnu amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 97 . U
2
nekim, ovde opisanim primerima izvođenja, je antitelo koje se specifično vezuje za LIF koje sadrži humanizovani teški lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 88; i humanizovani laki lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu navedeno u SEQ ID NO: 97.
[0064] U nekim, ovde opisanim, primerima izvođenja je rekombinantno antitelo koje se specifično vezuje za inhibitorni faktor leukemije (LIF) koje sadrži: region 1 koji određuje komplementarnost teškog lanca (VH-CDR1) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 2; region 2 koji određuje komplementarnost teškog lanca (VH-CDR2) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 10; region 3 koji određuje komplementarnost teškog lanca (VH-CDR3) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 15; region 1 koji određuje komplementarnost lakog lanca (VL-CDR1) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 22; i region 2 koji određuje komplementarnost lakog lanca (VL-CDR2) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 26; i region 3 koji određuje komplementarnost lakog lanca (VL-CDR3) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 29.
[0065] U nekim, ovde opisanim, primerima izvođenja je rekombinantno antitelo koje se specifično vezuje za inhibiciju leukemije. Faktor (LIF) koji sadrži: region 1 koji određuje komplementarnost teškog lanca (VH-CDR1) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 3; region 2 koji određuje komplementarnost teškog lanca (VH-CDR2) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 9; region 3 koji određuje komplementarnost teškog lanca (VH-CDR3) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 16; region 1 koji određuje komplementarnost lakog lanca (VL-CDR1) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 21; i određivanje komplementarnosti lakog lanca region 2 (VL-CDR2) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 25; i region 3 koji određuje komplementarnost lakog lanca (VL-CDR3) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 29.
[0066] U nekim, ovde opisanim, primerima izvođenja je rekombinantno antitelo koje se specifično vezuje za inhibitorni faktor leukemije (LIF) koje sadrži: region 1 koji određuje komplementarnost teškog lanca (VH-CDR1) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 3; region 2 koji određuje komplementarnost teškog lanca (VH-CDR2) koji sadrži an amino kiselinska sekvenca navedena u SEQ ID NO: 10; region 3 koji određuje komplementarnost teškog lanca (VH-CDR3) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 16; region 1 koji određuje komplementarnost lakog lanca (VL-CDR1) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 22; i region 2 koji određuje komplementarnost lakog lanca (VL-CDR2) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 26; i region 3 koji određuje komplementarnost lakog lanca (VL-CDR3) koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 29.10G7
[0067] Drugo antitelo klonirano i sekvencirano iz imunizacije pacova (10G7) sadrži CDR (koristeći kombinaciju Kabat i IMGT CDR metoda numerisanja) sa sledećim amino kiselinskim sekvencama: VH-CDR1 koji odgovara SEQ ID NO: 4 (GFTFSNAWMH), VH-CDR2 koji odgovara SEQ ID NO: 11 (QIKDKSDNYATYYAESVKG), VH-CDR3 koji odgovara SEQ ID NO: 17 (TCWEWYLDF), VL-CDR1 koji odgovara SEQ ID NO: 21 (RSSQSLLDGHTYLN), VL-CDR2 koji odgovara SEQ ID NO: 25 (SVSNLES) i VL-CDR3 koji odgovara SEQ ID NO: 29 (MQATHAPPYT).
[0068] U nekim , ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF koje sadrži VH-CDR1 koja sadrži amino kiselinsku sekvencu koja najmanje 80% ili 90% identičnu sa onom izloženom u SEQ ID NO: 4 (GFTFSNAWMH), VH-CDR2 koji sadrži amino kiselinsku sekvencu najmanje 80%, 90% ili 95% identičnu sa onom izloženom u SEQ ID NO: 11 (QIKDKSDNYATYYAESVKG), i VH-CDR3 koji sadrži amino kiselinsku sekvencu najmanje 80% ili 90% identičnu sa onom izloženom u SEQ ID NO: 17 (TCWEWYLDF). U nekim, ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF, koje sadrži VL-CDR1 koja sadrži amino kiselinsku sekvencu najmanje 80% ili 90% identičnu sa onom izloženom u SEQ ID NO: 21 (RSSQSLLDSDGHTYLN), VL-CDR2 koji sadrži amino kiselinsku sekvencu koja najmanje 80% identičnu sa onom izloženom u SEQ ID NO: 25 (SVSNLES), i VL-CDR3 koja sadrži amino kiselinsku sekvencu najmanje 80% ili 90% identičnu sa onom izloženom u SEQ ID NO: 29 (MQATHAPPYT). U nekim , ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koji specifično vezuje LIF koji sadrži VH-CDR1 koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 4 (GFTFSNAWMH), a VH-CDR2 koji sadrži sekvencu aminokiselina prikazanu u SEQ ID NO: 11 (QIKDKSDNYATYYAESVKG), a VH-CDR3 koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 17 (TCWEWYLDF), VL-CDR1 koja sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 21 (RSSQSLLDSDGHTYLN), a VL-CDR2 koja sadrži sekvencu aminokiselina navedeno u SEQ ID NO: 25 (SVSNLES), i VL-CDR3 koji sadrži set amino kiselinskoj sekvenci dalje u SEQ ID NO: 29 (MQATHAPPYT). Određene konzervativne amino kiselinske supstitucije su predviđene u amino kiselinskim sekvencama CDR regiona prema predmetnom pronalasku. U nekim primerima izvođenja, antitelo sadrži CDR amino kiselinske sekvence koje se razlikuju od amino kiselinske sekvence izložene u bilo kojoj od SEQ ID NO: 4, 11, 17, 21, 25 i 29 za 1, 2, 3 ili 4 amino kiseline. U nekim primerima izvođenja, antitelo sadrži CDR amino kiselinske sekvence koje se razlikuju od amino kiselinska sekvenca navedena u bilo kojoj od
4
SEQ ID NO: 4, 11, 17, 21, 25 i 29 sa 1, 2, 3 ili 4 amino kiseline i ne utiče na afinitet vezivanja za više od 10%, 20 % ili 30%. U nekim primerima izvođenja, antitela koja se specifično vezuju za LIF obuhvataju jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca koji sadrže: VH-FR1 amino kiselinsku sekvencu najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identičnu amino kiselinskoj sekvenci koja je navedena u bilo kojoj od SEQ ID NO: 44-47, VH-FR2 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom koja je navedena u bilo kojoj od SEQ ID NO: 48-49, a VH-FR3 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom koja je navedena u bilo kojoj od SEQ ID NO: 50-52, ili amino kiselinskoj sekvenci VH-FR4 regiona na najmanje oko 80%, oko 90%, ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom koja je navedena u bilo kojoj od SEQ ID NO: 53-55. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca sadrže VH-FR1 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identičnu amino kiselinskoj sekvenci koja je navedena u SEQ ID NO: 45, VH-FR2 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90%, ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 49, VH-FR3 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom navedeno u SEQ ID NO: 50, i VH-FR4 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 54. U nekim primerima izvođenja, antitela koja specifično vezuju LIF sadrže jedan ili više okvirnih regiona humanog lakog lanca koji sadrže: VL-FR1 amino kiselinsku sekvencu najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identičnu amino kiselinskoj sekvenci navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 56-59, VL-FR2 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom koja je navedena u bilo kojoj od SEQ ID NO : 60-63, VL-FR3 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom koja je navedena u bilo kojoj SEQ ID NO: 64-67, ili VL-FR4 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom koja je navedena u bilo kojoj od SEQ ID NO: 68-70 . U nekim primerima izvođenja, jedna ili više humanih svetlostiregioni okvira lanca sadrže VL-FR1 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identičnu amino kiselinskoj sekvenci koja je navedena u SEQ ID NO: 57, VL-FR2 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 61, VL-FR3 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 65, i VL-FR4 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična na amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 68. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca i jedan ili više regiona humanog lakog lanca obuhvataju sve VH-FR1 amino kiselinske sekvence najmanje oko 80 %, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 45, VH-FR2 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90%, ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 49, VH-FR3 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom navedeno u SEQ ID NO: 50, VH-FR4 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 54, VL-FR1 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 57, VL-FR2 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90%, ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 61, VL-FR3 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ-u ID BR: 65, i VL-FR4 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom koja je navedena u SEQ ID NO: 68. U nekim primerima izvođenja, antitelo se specifično vezuje za humani LIF. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje se specifično vezuje za LIF obuhvata jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca koji sadrže: VH-FR1 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom prikazanom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 44-47, VH-FR2 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 48-49, a VH-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 50-52, ili amino kiselinska sekvenca VH-FR4 regiona identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO. : 53-55. U nekim primerima izvođenja,jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca sadrže VH-FR1 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselinska sekvenca navedena u SEQ ID NO: 45, VH-FR2 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 49, VH-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ-u ID BR: 50, i VH-FR4 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 54. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje se specifično vezuje za LIF sadrži jedan ili više okvirnih regiona humanog lakog lanca koji sadrže: a VL-FR1 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom koja je navedena u bilo kojoj od SEQ ID NO: 56-59, VL-FR2 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 60-63, VL-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom prikazanom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 64-67, ili VL-FR4 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom prikazanom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 68-70. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više humanih okvirnih regiona lakog lanca sadrže VL-FR1 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselinskoj sekvenci izloženoj u SEQ ID NO: 57, VL-FR2 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselini sekvenca navedena u SEQ ID NO: 61, VL-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 65, i VL-FR4 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ-u ID BR: 68. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca i jedan ili više humanih regiona lakog lanca sadrže VH-FR1 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselinskoj sekvenci izloženoj u SEQ ID NO: 45, a VH-FR2 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 49, VH-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 50, VH-FR4 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 54, VL-FR1 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 57, VL-FR2 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izneti u SEQ ID NO: 61, VL-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 65, iVL-FR4 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 68. U nekim primerima izvođenja, antitelo se specifično vezuje za humani LIF.
6B5
[0069] Drugo antitelo klonirano i sekvencionirano iz imunizacije pacova (6B5) sadrži CDR (koristeći Kabat metod numerisanja) sa sledećim amino kiselinskim sekvencama: VH-CDR1 koji odgovara SEQ ID NO: 7 (SKFMY), VH-CDR2 koji odgovara SEQ ID NO: 13 (WIYPGDGDTEYNQKFSE), VH-CDR3 koji odgovara SEQ ID NO: 19 (RDYHSSHFAY), VL-CDR1 koji odgovara SEQ ID NO: 23 (RSSQSLLHNNGNTYLS), VL-CDR2 koji odgovara SEQ ID NO: 27 (QVSNRFS), i VL-CDR3 koji odgovara SEQ ID NO: 30 (GQGTQYPYT).
[0070] U nekim , ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF koje sadrži VH-CDR1 amino kiselinska sekvenca najmanje 80% identična onoj izloženoj u SEQ ID NO: 7 (SKFMY), amino kiselinska sekvenca VH-CDR2 najmanje 80% ili 90% identična onoj izloženoj u SEQ ID NO: 13 (WIYPGDGDTEYNQKFSE) i VH-CDR3 amino kiselinska sekvenca najmanje 80% ili 90% identična onoj izloženoj u SEQ ID NO: 19 (RDYHSSHFAY). U nekim , ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF koje sadrži VL-CDR1 amino kiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% ili 90% identičnu sa onom izloženom u SEQ ID NO: 23 (RSSQSLLHNNGNTYLS), VL-CDR2 amino kiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% identična onoj izloženoj u SEQ ID NO: 27 (QVSNRFS), i VL-CDR3 amino kiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% identična onoj izloženoj u SEQ ID NO: 30 (GQGTQYPYT). U nekim , ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF, koje sadrži VH-CDR1 amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 7 (SKFMY), VH-CDR2 amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 13 (WIYPGDGDTEYNQKFSE), VH-CDR3 amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 19 (RDYHSSHFAY), VL-CDR1 amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 23 (RSSQSLLHNNGNTYLS), VL-CDR2 amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 27 (QVSNRFS) i VL-CDR3 amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 30 (GQGTQYPYT). Neke konzervativne amino kiselinske supstitucije su predviđene u amino kiselinskim sekvencama CDR regiona prema predmetnom pronalasku. U nekim primerima izvođenja, antitelo sadrži CDR amino kiselinske sekvence koje se razlikuju od amino kiselinske sekvence izložene u bilo kojoj od SEQ ID NO: 7, 13, 19, 23, 27 i 30 za 1, 2, 3 ili 4 amino kiseline. U nekim primerima izvođenja, antitelo sadrži CDR amino kiselinske sekvence koje se razlikuju od amino kiselinske sekvence izložene u bilo kojoj od SEQ ID NO: 7, 13, 19, 23, 27 i 30 za 1, 2, 3 ili 4 amino kiseline i ne utiče na afinitet vezivanja za više od 10%, 20% ili 30%. U nekim primerima izvođenja, antitela koja se specifično vezuju za LIF sadrže jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca koji sadrže: VH-FR1 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 44-47, VH-FR2 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 48-49, VH-FR3 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO : 50-52, ili amino kiselinska sekvenca VH-FR4 regiona koja je najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 53-55. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca sadrži VH-FR1 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 45, VH-FR2 amino kiselinska sekvencu koja je najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 49, VH-FR3 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90%, ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 50, i VH-FR4 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95 % identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 54. U nekim primerima izvođenja, antitela koja se specifično vezuju za LIF sadrže jedan ili više okvirnih regiona humanog lakog lanca koji sadrže: VL-FR1 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 56-59, VL-FR2 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 60-63, VL-FR3 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90%, ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 64-67, ili VL-FR4 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 68-70. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više regiona okvira humanog lakog lanca sadrže VL-FR1 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identičnu amino kiselinskoj sekvenci izloženoj u SEQ ID NO: 57, VL-FR2 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 61, VL-FR3 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90%, ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 65, i VL-FR4 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 68. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca i jedan ili više humanihregioni lakih lanaca obuhvataju sve VH-FR1 amino kiselinske sekvence najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identične amino kiselinskoj sekvenci izloženoj u SEQ ID NO: 45, VH-FR2 amino kiselinska sekvenca na najmanje oko 80%, oko 90%, ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 49, VH-FR3 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ-u ID BR: 50, VH-FR4 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom koja je navedena u SEQ ID NO: 54, VL-FR1 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identično sa amino kiselinom sekvenca prikazana u SEQ ID NO: 57, VL-FR2 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 61, VL-FR3 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom koja je navedena u SEQ ID NO: 65, i VL-FR4 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90%, ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 68. U nekim primerima izvođenja, antitelo se specifično vezuje za humani LIF. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje se specifično vezuje za LIF obuhvata jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca koji sadrže: VH-FR1 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselinskoj sekvenci navedenoj u bilo kojoj od SEQ ID NO: 44-47, VH-FR2 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselinska sekvenca navedena u bilo kojoj od SEQ ID NO: 48-49, VH-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 50-52, ili VH-FR4 amino kiselinska sekvenca regiona identična sa amino kiselinskom sekvencom prikazanom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 53-55. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca sadrže VH-FR1 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselinskoj sekvenci izloženoj u SEQ ID NO: 45, VH-FR2 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselinskoj sekvenci datoj u SEQ ID NO: 49, VH-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 50, i VH-FR4 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 54. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje se specifično vezuje za LIF obuhvata jedan ili više okvirnih regiona humanog lakog lanca koji sadrži: VL-FR1 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselinskoj sekvenci navedenoj u bilo kojoj od SEQ ID NO: 56-59, VL-FR2 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselinskoj sekvenci navedenoj u bilo kojoj od SEQ ID NO: 60-63, VL-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 64-67, ili VL-FR4 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom prikazanom u bilo koji od SEQ ID NO: 68-70. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više humanih okvirnih regiona lakog lanca sadrže VL-FR1 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselinskoj sekvenci izloženoj u SEQ ID NO: 57, VL-FR2 amino kiselinskoj sekvenci identičnoj amino kiselinskoj sekvenci izloženoj u SEQ ID NO: 61, VL-FR3 amino kiselinskoj sekvenci identičnoj amino kiselinskoj sekvenci dalje u SEQ ID NO: 65, i VL-FR4 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 68. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca i jedan ili više humanih regioni lakog lanca sadrže VH-FR1 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselinskoj sekvenci izloženoj u SEQ ID NO: 45, a VH-FR2 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 49, VH-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 50, VH-FR4 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 54, VL-FR1 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 57, VL-FR2 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom navedeno u SEQ ID NO: 61, VL-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 65, i VL-FR4 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 68. U nekim primerima izvođenja, antitelo se specifično vezuje za humani LIF.
9G7
[0071] Drugo antitelo klonirano i sekvencionirano imunizacijom miša (9G7) sadrži CDR regione (koristeći Kabat metod numerisanja) sa sledećim amino kiselinskim sekvencama:
4
VH-CDR1 koji odgovara SEQ ID NO: 33 (TAGMQ),VH-CDR2 koji odgovara SEQ ID NO: 35 (WINTQSGEPQYVDDFRG), VH-CDR3 koji odgovara SEQ ID NO: 37 (WALYSEYDVMDY), VL-CDR1 koji odgovara SEQ ID NO: 39 (KASENVDSYVS), VL-CDR2 koji odgovara SEQ ID NO: 41 (GASNRYT), i VL-CDR3 koji odgovara SEQ ID NO: 43 (GQSYRYPPT).
[0072] U nekim , ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF, koje sadrži VH-CDR1 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje 80% identična onoj izloženoj u SEQ ID NO: 33 (TAGMQ), VH-CDR2 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje 80% ili 90% identična onoj izloženoj u SEQ ID NO: 35 (WINTQSGEPQYVDDFRG), i VH-CDR3 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje 80% ili 90% identična onoj izloženoj u SEQ ID NO: 37 (WALYSEYDVMDY). U nekim , ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF koje sadrži VL-CDR1 amino kiselinsku sekvencu najmanje 80% ili 90% identičnu sa onom izloženom u SEQ ID NO: 39 (KASENVDSYVS), VL-CDR2 amino kiselinsku sekvencu najmanje 80% identičnu sa onom izloženom u SEQ ID NO: 41 (GASNRYT), i VL-CDR3 amino kiselinsku sekvencu najmanje 80% ili 90% identičnu sa onom izloženom u SEQ ID NO: 43 (GQSYRYPPT). U nekim, ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF, koje sadrži VH-CDR1 amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 33 (TAGMQ), VH-CDR2 amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 35 ( WINTQSGEPQYVDDFRG), VH-CDR3 amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 37 (WALYSEYDVMDY), VL-CDR1 amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 39 (KASENVDSYVS), VL-CDR2 amino kiselinska sekvenca navedena u SEQ ID NO: 41 (GASNRYT), i VL-CDR3 amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 43 (GQSYRYPPT). Neke konzervativne amino kiselinske supstitucije su predviđene u amino kiselinskim sekvencama CDR regiona prema predmetnom pronalasku. U nekim primerima izvođenja, antitelo sadrži CDR amino kiselinske sekvence koje se razlikuju od amino kiselinske sekvence izložene u bilo kojoj od SEQ ID NO: 39, 41, 43, 33, 35 i 37 za 1, 2, 3 ili 4 amino kiseline. U nekim primerima izvođenja, antitelo sadrži CDR amino kiselinske sekvence koje se razlikuju od amino kiselinske sekvence izložene u bilo kojoj od SEQ ID NO: 39, 41, 43, 33, 35 i 37 za 1, 2, 3 ili 4 amino kiseline i ne utiče na afinitet vezivanja za više od 10% , 20% ili 30%. U nekim primerima izvođenja, antitela koja se specifično vezuju za LIF sadrže jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca koji sadrže: VH-FR1 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom koja je navedena u bilo kojoj od SEQ ID NO: 44-47, VH-FR2 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom navedenom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 48-49, VH-FR3 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 50-52, ili amino kiselinska sekvenca VH-FR4 regiona koja je najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom navedenom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 53-55. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca sadrže VH-FR1 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identičnu amino kiselinskoj sekvenci koja je navedena u SEQ ID NO: 45, VH-FR2 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90%, ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 49, VH-FR3 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom navedeno u SEQ ID NO: 50, i VH-FR4 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 54. U nekim primerima izvođenja, antitela koja specifično vezuju LIF obuhvataju jedan ili više okvirnih regiona humanog lakog lanca koji sadrže: VL-FR1 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identičnu skupu sekvenci amino kiselina dalje u bilo kojoj od SEQ ID NO: 56-59, VL-FR2 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom navedenom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 60-63, VL-FR3 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom navedenom u bilo kojoj SEQ ID NO: 64-67, ili VL-FR4 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom navedenom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 68-70 . U nekim primerima izvođenja, jedna ili više humanih svetlostiregioni okvira lanca sadrže VL-FR1 amino kiselinsku sekvencu koja najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identičnu amino kiselinskoj sekvenci koja je navedena u SEQ ID NO: 57, VL-FR2 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 61, VL-FR3 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 65, i VL-FR4 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična na amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 68. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca i jedan ili više regiona humanog lakog lanca obuhvataju sve VH-FR1 amino kiselinske sekvence najmanje oko 80 %, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 45, VH-FR2 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90%, ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 49, VH-FR3 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom navedeno u SEQ ID NO: 50, VH-FR4 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 54, VL-FR1 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 57, VL-FR2 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90%, ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 61, VL-FR3 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ-u ID BR: 65, i VL-FR4 amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90% ili oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 68. U nekim primerima izvođenja, antitelo se specifično vezuje za humani LIF. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje se specifično vezuje za LIF obuhvata jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca koji sadrže: VH-FR1 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom prikazanom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 44-47, VH-FR2 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 48-49, a VH-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 50-52, ili amino kiselinska sekvenca VH-FR4 regiona identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO. : 53-55. U nekim primerima izvođenja,jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca sadrže VH-FR1 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselinska sekvenca navedena u SEQ ID NO: 45, VH-FR2 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 49, VH-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ-u ID BR: 50, i VH-FR4 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 54. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje se specifično vezuje za LIF sadrži jedan ili više okvirnih regiona humanog lakog lanca koji sadrže: a VL-FR1 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom navedenom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 56-59, VL-FR2 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 60-63, VL-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom prikazanom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 64-67, ili VL-FR4 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom prikazanom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 68-70. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više humanih okvirnih regiona lakog lanca sadrže VL-FR1 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselinskoj sekvenci izloženoj u SEQ ID NO: 57, VL-FR2 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselini sekvenca navedena u SEQ ID NO: 61, VL-FR3 amino kiselinska
4
sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 65, i VL-FR4 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ-u ID BR: 68. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više okvirnih regiona humanog teškog lanca i jedan ili više humanih regiona lakog lanca sadrže VH-FR1 amino kiselinsku sekvencu identičnu amino kiselinskoj sekvenci izloženoj u SEQ ID NO: 45, a VH-FR2 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 49, VH-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 50, VH-FR4 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 54, VL-FR1 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 57, VL-FR2 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izneti u
SEQ ID NO: 61, VL-FR3 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 65, iVL-FR4 amino kiselinska sekvenca identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 68. U nekim primerima izvođenja, antitelo se specifično vezuje za humani LIF.
[0073] Ovde opisana antitela direktno vezuju humani LIF. Kanonska amino kiselinska sekvenca humanog LIF data je SEQ ID NO: 98. Stručnjaci će ceniti da su prirodne varijante SEQ ID NO: 98 moguće među ljudskom populacijom što može dovesti do razlika od 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina između SEQ ID NO: 98 i LIF koje eksprimira bilo koja ljudska individua. Ne očekuje se da će male promene koje nastaju usled prirodnih varijacija dovesti do različite kinetike vezivanja ili efikasnosti u lečenju bilo kog od ovde opisanih antitela.
Epitopi vezani terapeutski korisnim LIF antitelima
[0074] Ovde je opisan jedinstveni epitop humanog LIF koji kada se veže inhibira biološku aktivnost LIF faktora (npr. STAT3 fosforilaciju) i inhibira rast tumora in vivo. Epitop opisan ovde se sastoji od dva diskontinuirana dela aminokiselina (od ostatka 13 do ostatka 32 i od ostatka 120 do 138 humanog LIF), koji su prisutni u dva različita topološka domena (alfa helikse A i C) humanog LIF proteina . Ovo vezivanje je kombinacija slabog (Van der Vaalsovo privlačenje), srednje (vezivanje vodonika) i jake (slani most) interakcije. U nekim primerima izvođenja, kontaktni ostatak je ostatak na LIF koji formira vodoničnu vezu sa ostatkom na anti-LIF antitelu. U nekim primerima izvođenja,kontaktni ostatak je ostatak na LIF koji formira most soli sa ostatkom na anti-LIF antitelu. U nekim primerima izvođenja, kontaktni ostatak je ostatak na LIF koji dovodi do Van der Valsove privlačnosti sa i nalazi se unutar najmanje 5, 4 ili 3 angstrema od ostatka na anti-LIF antitelu.
[0075] U nekim primerima izvođenja, ovde opisano je izolovano antitelo koje vezuje bilo koje, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest, osamnaest, devetnaest , ili dvadeset od sledećih ostataka: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, K25, K29, K32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135 ili H138 SEQ ID NO:98. U nekim primerima izvođenja, ovde opisano je izolovano antitelo koje vezuje sve sledeće ostatke: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, K25, K29, K32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135 i H138 SEQ ID NO:98. U nekim primerima izvođenja, ovde opisano je izolovano antitelo koje vezuje sve sledeće ostatke: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, K25, K29, K32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135 i H138 SEQ ID NO:98. U nekim primerima izvođenja, antitelo vezuje samo ostatke koji učestvuju sa antitelom u jakim ili srednjim interakcijama. U nekim primerima izvođenja, antitelo vezuje samo ostatke koji učestvuju sa antitelom u jakim interakcijama. U određenom izvođenju, antitelo je u interakciji sa spiralom A i C u LIF. U određenom aspektu, antitelo blokira LIF interakciju sa gp130.
[0076]U nekim primerima izvođenja, ovde je opisano antitelo koje sadrži CDR regione sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1, 9, 15, 21, 25 i 29 koje vezuje bilo koju, dva, tri, četiri, pet , šest, sedam, osam, devet,deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest, osamnaest, devetnaest ili dvadeset od sledećih ostataka: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135 ili H138 iz SEQ ID NO:98. U nekim primerima izvođenja, ovde je opisano antitelo koje sadrži CDR sa sekvencom aminokiselina koja je navedena u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1, 9, 15, 21, 25 i 29 koje se vezuje za sve sledeće ostatke: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135 i H138 iz SEQ ID NO:98. U nekim primerima izvođenja, antitelo se vezuje samo za ostatke koji učestvuju sa antitelom u jakim ili srednjim interakcijama. U nekim primerima izvođenja, antitelo se vezuje samo za ostatke koji učestvuju sa antitelom u jakim interakcijama.
[0077] U nekim primerima izvođenja, ovde je opisano antitelo koje sadrži CDR sa sekvencom aminokiselina koja je navedena u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1, 9, 95, 21, 25 i 29 koja vezuje bilo koju, dva, tri, četiri, pet , šest, sedam, osam, devet,deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest, osamnaest, devetnaest ili dvadeset od sledećih ostataka: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135 ili H138 iz SEQ ID NO:98. U nekim primerima izvođenja, ovde je opisano antitelo koje sadrži CDR sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1, 9, 95, 21, 25 i 29 koje se vezuje za sve sledeće ostatke: A13, I14,
4
R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135, or H138 iz SEQ ID NO:98. U nekim primerima izvođenja, antitelo vezuje samo ostatke koji učestvuju sa antitelom u jakim ili srednjim interakcijama. U nekim primerima izvođenja, antitelo vezuje samo ostatke koji učestvuju sa antitelom u snažnom među- radnje.
[0078] U nekim primerima izvođenja, ovde je opisano antitelo koje sadrži CDR regione koji se razlikuju od amino kiselinske sekvence izložene u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1, 9, 15, 21, 25 i 29 za 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina i vezuje bilo koju, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest, osamnaest, devetnaest ili dvadeset od sledećih ostataka: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135, or H138 iz SEQ ID NO:98. U nekim primerima izvođenja, ovde je opisano antitelo koje sadrži CDR regione koji se razlikuju od amino kiselinske sekvence izložene u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1, 9, 15, 21, 25 i 29 za 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina i vezuje se za sve sledeće ostatke: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135 i H138 iz SEQ ID NO:98. U nekim primerima izvođenja, antitelo vezuje samo ostatke koji učestvuju sa antitelom u jakim ili srednjim interakcijama. U nekim primerima izvođenja, antitelo vezuje samo ostatke koji učestvuju sa antitelom u jakim interakcijama.
[0079] U nekim primerima izvođenja, ovde je opisano antitelo koje sadrži CDR regione koji se razlikuju od amino kiselinske sekvence izložene u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1, 9, 95, 21, 25 i 29 za 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina i vezuje bilo koju, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest, osamnaest, devetnaest ili dvadeset od sledećih ostataka: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135, or H138 iz SEQ ID NO:98. U nekim primerima izvođenja, ovde je opisano antitelo koje sadrži CDR regione koji se razlikuju od amino kiselinske sekvence izložene u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1, 9, 95, 21, 25 i 29 za 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina i vezuju se za sve sledeće ostatke: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, Q25, Q29, Q32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135, or H138 iz SEQ ID NO:98. U nekim primerima izvođenja, antitelo se vezuje samo za ostatke koji učestvuju sa antitelom u jakim ili srednjim interakcijama. U nekim primerima izvođenja, antitelo se vezuje samo za ostatke koji učestvuju sa antitelom u jakim interakcijama.
[0080] U nekim , ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF koje sadrži sekvencu aminokiselina humanizovanog varijabilnog regiona teškog
4
lanca najmanje oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 97%, oko 98%, ili oko 99% identična sa amino kiselinskom sekvencom datoj u SEQ ID NO:72; i humanizovani varijabilni region lakog lanca amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 97%, oko 98% ili oko 99% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 76 i vezuje bilo koje, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet,deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest, osamnaest, devetnaest ili dvadeset od sledećih ostataka: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, K25, K20 , R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135 ili H138 SEQ ID NO:98. U nekim , ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF koje sadrži sekvencu aminokiselina humanizovanog varijabilnog regiona teškog lanca najmanje oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 97%, oko 98% ili oko 99% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO:72; i humanizovani varijabilni region lakog lanca amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 97%, oko 98% ili oko 99% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 76 i vezuje sve sledeće ostatke: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, K25, K29, K32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135 i H138 SEQ ID-a NO:98. U nekim primerima izvođenja, antitelo vezuje samo ostatke koji učestvuju sa antitelom u jakim ili srednjim interakcijama. U nekim primerima izvođenja, antitelo vezuje samo ostatke koji učestvuju sa antitelom u jakim interakcijama.
[0081] U nekim , ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF koje sadrži humanizovani
amino kiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca najmanje oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 97%, oko 98% ili oko 99% identična sa amino kiselinskom sekvencom datoj u SEQ ID NO: 96; i humanizovani varijabilni region lakog lanca amino kiselinska sekvenca najmanje oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 97%, oko 98% ili oko 99% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 76 i vezuje bilo koje, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet,deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest, osamnaest, devetnaest ili dvadeset od sledećih ostataka: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, K25, K29, K32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135 ili H138SEK ID NO:98. U nekim , ovde opisanim, primerima izvođenja je antitelo koje se specifično vezuje za LIF koje sadrži sekvencu aminokiselina humanizovanog varijabilnog regiona teškog lanca najmanje oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 97%, oko 98% ili oko 99% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 96; i amino kiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca najmanje oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 97%, oko 98% ili oko 99% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom
4
u SEQ ID NO: 76 i vezuje sve sledeće ostatke: A13, I14, R15, H16, P17, C18, H19, N20, K25, K29, K32, D120, R123, S127, N128, L130, C131, C134, S135 i H138 SEQ ID-a NO:98. U nekim primerima izvođenja, antitelo vezuje samo ostatke koji učestvuju sa antitelom u jakim ili srednjim interakcijama. U nekim primerima izvođenja, antitelo vezuje samo ostatke koji učestvuju sa antitelom u jakim interakcijama.
Terapeutske indikacije
[0082] U nekim primerima izvođenja, ovde otkrivena antitela inhibiraju LIF signalizaciju u ćelijama. U nekim primerima izvođenja, IC50 za biološku inhibiciju antitela u uslovima gladovanja u serumu u U-251 ćelijama je manji ili jednak oko 100, 75, 50, 40, 30, 20, 10, 5 ili 1 nanomolar. U nekim primerima izvođenja, IC50 za biološku inhibiciju antitelo u uslovima gladovanja u serumu u U-251 ćelijama je manje ili jednako oko 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 ili 100 nanomolarnih.
[0083] Sve reference na metode lečenja odnose se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove ovog pronalaska za upotrebu u postupku za lečenje humanog (ili životinjskog) tela terapijom (ili za dijagnozu). U nekim primerima izvođenja, ovde otkrivena antitela su korisna za lečenje tumora i karcinoma koji eksprimiraju LIF. U nekim primerima izvođenja, pojedinac tretiran antitelima iz ovog otkrića je izabran za lečenje kao osoba koja ima LIF pozitivan tumor/karcinom. U nekim primerima izvođenja, tumor je pozitivan na LIF ili proizvodi povišene nivoe LIF. U nekim primerima izvođenja, LIF pozitivnost se određuje u poređenju sa referentnom vrednošću ili postavljenim patološkim kriterijumima. U nekim primerima izvođenja, tumor pozitivan na LIF eksprimira više od 2 puta, 3 puta, 5 puta, 10 puta, 100 puta ili više LIF od netransformisane ćelije iz koje je tumor izveden. U nekim primerima izvođenja, tumor je dobio ektopičnu ekspresiju LIF. LIF pozitivan tumor može se odrediti histološki korišćenjem, na primer, imunohistohemije sa anti-LIF antitelom; uobičajeno korišćenim metodama molekularne biologije kao što je, na primer, kvantitacija mRNK realnim vremenski PCR ili RNA-sek; ili kvantitaciju proteina, na primer, Vestern blot-om, protočnom citometrijom, ELISA-om ili homogenim testovima kvantitacije proteina (npr. alfaLISA). U nekim primerima izvođenja, antitela se mogu koristiti za lečenje pacijenata kojima je dijagnostikovan rak. U nekim primerima izvođenja, rak obuhvata jednu ili više matičnih ćelija raka ili je jedna ili više matičnih ćelija raka.
[0084] U nekim primerima izvođenja, ovde otkrivena antitela su korisna za lečenje tumora kod kancera koji eksprimiraju LIF receptor (CD118). Tumor pozitivan na LIF receptor može se odrediti histopatologijom ili protočnom citometrijom, i, u nekim primerima izvođenja, sadrži ćeliju koja vezuje antitelo LIF receptora veće od 2k, 3k, 3k, 4k, 5k, 10k ili više od
4
kontrole izotipa. U nekim primerima izvođenja, tumor je dobio ektopičnu ekspresiju LIF receptora. U određenom aspektu, rak je matična ćelija raka. U određenom aspektu, LIF pozitivan tumor ili kancer može se odrediti imunohistohemijom korišćenjem anti-LIF anti-LIF antitela. U određenom aspektu, tumor pozitivan na LIF se određuje IHC analizom sa nivoom LIF u prvih 10%, 20%, 30%, 40% ili gornjih 50% tumora.
[0085] Ovde opisana antitela utiču na brojne ishode. U određenom izvođenju, ovde opisana antitela mogu da smanje prisustvo M2 makrofaga u tumorima za najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili više u modelu tumora u poređenju sa kontrolnim antitelom (npr. kontrola izotipa). M2 makrofagi se mogu identifikovati bojenjem za CCL22 i CD206 u IHC sekcijama ili protočnom citometrijom tumora koji se infiltrira imunim ili mijeloidne ćelije. U određenom izvođenju, ovde opisana antitela mogu da smanje vezivanje LIF za gp130 tumore za najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili više kada u poređenju sa kontrolnim antitelom (npr. kontrola izotipa). U određenom izvođenju, ovde opisana antitela mogu da smanje LIF signalizaciju za najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili više u ćelijskoj liniji koja reaguje na LIF u poređenju sa kontrolnim antitelom (npr.kontrola izotipa). LIF signalizacija se može meriti, na primer, Vestern blot za fosforilisani STAT3 (nizvodno cilj LIF signalizacije). Ovde su antitela takođe veoma specifična za LIF u poređenju sa drugim citokinima iz porodice IL-6. U nekim primerima izvođenja, antitela vezuju humani LIF sa afinitetom oko 10k, oko 50k ili oko 100k većim od afiniteta bilo kog drugog citokina iz porodice IL-6. U nekim primerima izvođenja, LIF antitela se ne vezuju za druge citokine iz porodice IL-6 koji se proizvode u sistemu sisara. U nekim primerima izvođenja, antitela se ne vezuju za onkostatin M koji je proizveden u sistemu sisara.
[0086] U nekim primerima izvođenja, ovde otkrivenim, su antitela korisna za lečenje kancera ili tumora. U nekim primerima izvođenja, rak obuhvata dojku, srce, pluća, tanko crevo, debelo crevo, slezinu, bubreg, bešiku, glavu, vrat, jajnik, prostatu, mozak, pankreas, kožu, kost, koštanu srž, krv, timus, matericu, testise i tumori jetre. U nekim primerima izvođenja, tumori koji se mogu lečiti antitelima prema pronalasku obuhvataju adenom, adenokarcinom, angiosarkom, astrocitom, epitelni karcinom, germinom, glioblastom, gliom, hemangioendoteliom, hemangiosarkom, hematom, hepatoblastom, leukemija, limfom, meduloblastom, melanom, neuroblastom, osteosarkom, retinoblastom, rabdomiosarkom, sarkom i/ili teratom. U nekim primerima izvođenja, tumor/kancer je izabran iz grupe akralnog lentiginoznog melanoma, aktinične keratoze, adenokarcinoma, adenoidnog cističnog karcinoma, adenoma, adenosarkoma, adenoskvamoznog karcinoma, astrocitnih tumora, karcinoma Bartolinove žlezde, kapilarnog karcinoida, karcinoma, karcinosarkoma,
4
holangiokarcinoma, hondrosarkoma, cistadenoma, tumora endodermalnog sinusa, hiperplazija endometrijuma, stromalnog sarkoma endometrijuma, endometrioidnog adenokarcinoma, ependimalnog sarkoma, Svingov sarkoma, fokalne nodularne hiperplazije, gastronoma, tumori zametne linije, hemani gliagoblastoma, hema gluliman gliagoblastoma, hema adenom jetre, hepatična ad- enomatoza, hepatocelularni karcinom, insulinit, intraepitelna neoplazija, intraepitelna neoplazija skvamoznih ćelija, invazivni karcinom skvamoznih ćelija, karcinoma velikih ćelija, liposarkoma, karcinoma pluća, limfoblastna leukemija, limfoblastna leukemija focitna leukemija, lejomiosarkoma, melanoma, malignog melanoma, malignog mezotelnog tumora, tumora nervnog omotača, meduloblastoma, meduloepitelioma, mezotelioma, mukoepidermoidnog karcinoma, mijeloidne leukemije, neuroblastoma neuroblastoma, jajne ćelije i karcinom bez neuroblastoma, papilarni serozni adenokarcinoma, tumora hipofize, plazmacitoma, pseudosarkoma, karcinoma prostate, plućnog blastoma, karcinom bubrežnih ćelija, retinoblastom, rabdomiosarkom, sarkom, serozni karcinom, karcinom skvamoznih ćelija, karcinom malih ćelija, karcinoma mekog tkiva, tumora koji luči somatostatin, skvamoznog karcinoma, karcinoma skvamoznih ćelija, nediferenciranog karcinoma, uvealnog melanoma, verukoznog karcinoma, karcinoma vagine/vulve, VIPpoma i Vilmovog tumora. U nekim primerima izvođenja, tumor/rak koji se leči sa jednim ili više antitela prema pronalasku obuhvata rak mozga,i karcinom vrata, kolorektalni karcinom, akutnu mijeloidnu leukemiju, pre-B-ćelijska akutna limfoblastna leukemija, rak mokraćne bešike, astrocitoma, poželjno astrocitoma II, III ili IV stepena, glioblastoma, multiformnog glioblastoma, karcinoma malih ćelija i karcinoma ne-malih ćelija, poželjno karcinoma pluća nemaloh ćelija, adenokarcinoma pluća, metastatskog melanoma, androgenog nezavisnog metastatskog karcinoma prostate, androgena zavisni metastatski karcinom prostate, adenokarcinom prostate i rak dojke, poželjno rak duktala dojke, i/ili karcinom dojke. U nekim primerima izvođenja, rak koji se leči sa antitelima prema predmetnom pronalasku obuhvata glioblastom. U nekim primerima izvođenja, kancer lečen jednim ili više antitela iz ovog otkrića obuhvata rak pankreasa. U nekim primerima izvođenja, kancer tretiran sa jednim ili više antitela iz ovog otkrića obuhvata rak jajnika. U nekim primerima izvođenja, kancer tretiran sa jednim ili više antitela iz ovog otkrića obuhvata rak pluća. U nekim primerima izvođenja, kancer tretiran sa jednim ili više antitela iz ovog otkrića obuhvata rak prostate. U nekim primerima izvođenja, kancer lečen jednim ili više antitela ovog otkrića obuhvataju rak debelog creva. U nekim primerima izvođenja, lečeni rak obuhvata glioblastom, rak pankreasa, rak jajnika, rak debelog creva, rak prostate ili rak pluća. U nekom primeru izvođenja, rak je otporan na druge tretmane. U nekom primeru izvođenja, lečeni kancer je relaps. U nekom primeru izvođenja, rak je relapsni/refraktorni glioblastom, rak pankreasa, rak jajnika, rak debelog creva, rak prostate ili rak pluća.
Terapeutske metode
[0087] U nekim primerima izvođenja, antitela se mogu davati bilo kojim putem pogodnim za primenu farmaceutskih kompozicija koje sadrže antitela, kao što su, na primer, subkutano, intraperitonealno, intravenozno, intramuskularno, intratumoralno ili intracerebralno, itd. U nekim primerima izvođenja, antitela se primenjuju intravenozno. U nekim primerima izvođenja, antitela se primenjuju prema odgovarajućem rasporedu doziranja, na primer, nedeljno, dva puta nedeljno, mesečno, dva puta mesečno, itd. U određenim rešenjima, antitela se primenjuju jednom u tri nedelje. Antitela se mogu primeniti u bilo kojoj terapeutski efikasnoj količini. U nekim primerima izvođenja, terapeutski prihvatljiva količina je između oko 0,1 mg/kg i oko 50 mg/kg. U nekim primerima izvođenja, terapeutski ak-prihvatljiva količina je između oko 1 mg/kg i oko 40 mg/kg. U nekim primerima izvođenja, terapeutski prihvatljiva količina je između oko 5 mg/kg i oko 30 mg/kg.
Dodatni terapeutski agensi
[0088] U nekim primerima izvođenja, antitela se mogu davati sa ili tokom tretmana sa dodatnim terapeutskim agensom. U nekim primerima izvođenja, terapeutski agens sadrži rekombinantni protein ili monoklonsko antitelo. U nekim primerima izvođenja, rekombinantni protein ili monoklonsko antitelo obuhvata Etaracizumab (Abegrin), Tacatuzumab tetraketan, Bevacizumab (Avastin), Labetuzumab, Cetukimab (Erbituk), Obinutuzumab (Gaziva), Trastuzumab (Hertuzumab Traketin), , Ramucirumab, Ritukimab (MabThera, Ritukan), Gemtu- zumab ozogamicin (Milotarg), Pertuzumab (Omnitarg), Girentuksimab (Rencarek) ili Nimotuzumab (Theracim, Theraloc). U nekim primerima izvođenja, monoklonsko antitelo sadrži imunomodulator koji cilja kontrolnu tačkuinhibitora, na primer PD-1 ili CTLA-4. U nekim primerima izvođenja, imunomodulator sadrži Nivolumab, Ipilimumab, Atezolizumab ili Pembrolizumab. U nekim primerima izvođenja, dodatni terapeutski agens je hemoterapeutski agens. U nekim primerima izvođenja, hemoterapeutski agens je agens za alkilovanje (npr. ciklofosfamid, ifosfamid, hlo-rambucil, busulfan, melfalan, mehloretamin, uramustin, tiotepa, nitrozouree ili temozolomid), antraciklin (npr. doksorubicin, adriamicin, daunorubicin, epirubicin ili mitoksantron), citoskeletni disruptor (paclitakeg) ilidocetaksel), inhibitor histon deacetilaze (npr. vorinostat ili romidepsin), inhibitor topoizomeraze (npr. irinotekan, topotekan, amsakrin, etopozid ili tenipozid), inhibitor kinaze (npr. bortezomib, erlotinib, gefitinib, gefitinib). rafenib, ili vismodegib), analog nukleozida ili
1
analoga prekursora (npr. azacitidin, azatioprin, kapecitabin, citarabin, fluorouracil, gemcitabin, hidroksiurea, merkaptopurin, metotreksat ili tioguanin), peptidni antibiotik (npr. aktinomicin ili bleomicin), agens na bazi platine (npr. cisplatin, oksaloplatin ili biljni alkaloid) ili vinkristin, vinblastin, vinorelbin, vindezin, podofilotoksin, paklitaksel ili docetaksel). U nekim primerima izvođenja, hemoterapeutski agens je analog nukleozida. U nekim primerima izvođenja, hemoterapeutski agens je gemcitabin. U nekim primerima izvođenja, dodatni terapeutski agens je terapija zračenjem.
Farmaceutski prihvatljivi nosači
[0089] U nekim primerima izvođenja, antitela prema predmetnom pronalasku se primenjuju suspendovana u sterilnom rastvoru. U nekim primerima izvođenja, rastvor sadrži fiziološki odgovarajuću koncentraciju soli (npr. NaCl). U određenim varijanti, rastvor sadrži između oko 0,6% i 1,2% NaCl. U nekim primerima izvođenja, rastvor sadrži između oko 0,7% i 1,1% NaCl. U nekim primerima izvođenja, rastvor sadrži između oko 0,8% i 1,0% NaCl. U nekim primerima izvođenja, visoko koncentrovani osnovni rastvor antitela može biti razblažen u oko 0,9% NaCl. U nekim primerima izvođenja, rastvor sadrži oko 0,9% NaCl. U nekim primerima izvođenja, rastvor dalje sadrži jedan ili više od: pufera, na primer, acetat, citrat, histidin, sukcinat, fosfat, bikarbonat i hidroksimetil-aminometan (Tris); surfaktante, na primer, polisorbat 80 (Tween 80), polisorbat 20 (Tween 20), polisorbat i poloksamer 188; poliol/disaharid/polisaharidi, na primer, glukoza, dekstroza, manoza, manitol, sorbitol, saharoza, trehaloza i dekstran 40; amino kiseline, na primer, histidin, glicin ili arginin; antioksidanse, npr. askorbinska kiselina, metionin; i helatna sredstva, na primer, EGTA ili EGTA. U nekim primerima izvođenja, antitela prema predmetnom pronalasku se otpremaju/čuvaju liofilizovana i rekonstituišu pre primene. U nekim primerima izvođenja, formulacije liofilizovanih antitela sadrže agens za povećanje zapremine kao što su manitol, sorbitol, saharoza, trehaloza i dekstran 40. U nekom primeru izvođenja, anti-LIF antitela prema predmetnom pronalasku mogu da se transportuju i čuvaju kao koncentrovani osnovni rastvor koji se razblažuje na mestu upotrebe gde se sprovodi lečenje. U nekim primerima izvođenja, osnovni rastvor sadrži oko 25 mM histidina, oko 6% saharoze, oko 0,01% polisorbata i oko 20 mg/mL anti-LIF antitela.
PRIMERI
[0090] Sledeći ilustrativni primeri su reprezentativni za primere izvođenja softverskih aplikacija, sistema i postupaka koji su ovde opisani i nije predviđeno da na bilo koji način budu ograničavajući.
2
Primer 1 - Generisanje pacovskih antitela specifičnih za LIF
[0091] cDNK koja kodira amino kiseline 23-202 humanog LIF je klonirana u ekspresione plazmide (Aldevron GmbH, Freiburg, Nemačka). Grupe laboratorijskih pacova (Wistar) su imunizovane intradermalnom primenom zlatnih čestica obloženih sa DNK korišćenjem ručnog uređaja za bombardovanje česticama („genski pištolj“). Ekspresija na površini ćelija privremeno transfektovanih HEK ćelija je potvrđena anti-tag antitelima koja prepoznaju tag koja je dodata na N-terminus LIF proteina. Uzorci seruma su sakupljeni nakon serije imunizacija i testirani protočnom citometrijom na HEK ćelijama privremeno transfektovanim sa gore pomenutim ekspresionim plazmidima. Ćelije koje proizvode antitela su izolovane i fuzionisane sa mišjim ćelijama mijeloma (Ag8) prema standardnim procedurama. Hibridomi koji proizvode antitela specifična za LIF identifikovani su skriningom u testu protočne citometrije kao što je gore opisano. Ćelijski talog pozitivnih hibridomskih ćelija je pripremljen korišćenjem agensa za zaštitu RNK (RNAlater, kat. br. AM7020 firme ThermoFisher Scientific) i dalje obrađen za sekvenciranje varijabilnih domena antitela.
Primer 2 - Generisanje mišjih antitela specifičnih za LIF
[0092] cDNK koja kodira amino kiseline 23-202 humanog LIF je klonirana u ekspresione plazmide (Aldevron GmbH, Frajburg, Nemačka). Grupe laboratorijskih miševa (NMRI) su imunizovane intradermalnom primenom zlatnih čestica obloženih sa DNK korišćenjem ručnog uređaja za bombardovanje česticama („genski pištolj“). Ekspresija na površini ćelije na prolaznom transfektovanim HEK ćelijama su potvrđene anti-tag antitelima koja prepoznaju oznaku dodatu na N-terminus LIF proteina. Uzorci seruma su sakupljeni nakon serije imunizacija i testirani u protočnoj citometriji na HEK ćelijama koje su prolazno transfektovane sa gore pomenutim ekspresionim plazmidima. Ćelije koje proizvode antitela su izolovane i fuzionisane sa mišjim ćelijama mijeloma (Ag8) prema standardnim procedurama. Hibridomi koji proizvode antitela specifična za LIF identifikovani su skriningom u testu protočne citometrije kao što je gore opisano. Ćelijski talog pozitivnih hibridomskih ćelija je pripremljen korišćenjem agensa za zaštitu RNK (RNAlater, kat. br. AM7020 firme ThermoFisher Scientific) i dalje obrađen za sekvenciranje varijabilnih domena antitela.
Primer 3-Humanizacija pacovskih antitela specifičnih za LIF
[0093] Jedan klon iz imunizacije pacova (5D8) je izabran za kasniju humanizaciju. Humanizacija je sprovedena korišćenjem standardnih metoda CDR kalemljenja. Regioni teškog i lakog lanca su klonirani iz 5D8 hibridoma korišćenjem standardnih tehnika molekularnog kloniranja i sekvencionirani Sangerovom metodom. Zatim je sprovedena BLAST pretraga varijabilnih sekvenci humanog teškog lanca i lakog lanca i 4 sekvence iz svake grupe su izabrane kao akceptorski okviri za humanizaciju. Ovi akceptorski okviri su deimunizovani da bi se uklonili epitopi za odgovor T ćelija. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca iz 5D8 su klonirani u 4 različita akceptorska okvira teškog lanca (H1 do H4) i 4 različita okvira lakog lanca (L1 do L4). Zatim je svih 16 različitih antitela testirano na: ekspresiju u CHO-S ćelijama (Selexis); inhibicija LIF-indukovane STAT3 fosforilacije; i afinitet vezivanja rezonancijom površinskog plazmona (SPR). Ovi eksperimenti su sažeti u Tabeli 1
[0094] Poređene su performanse ekspresije transfektovanih ćelija u erlenmajerima (zasejavanje 3×10<5>ćelija/mL, zapremina kulture od 200 mL) u okviru gajenja sa dohranom u seriji, nakon 10 dana ćelijske kulture. U ovom trenutku ćelije su sakupljene i izlučeno antitelo je prečišćeno pomoću Protein A kolone, a zatim kvantifikovano. Sva humanizovana antitela su
4
bila eksprimirane, osim onih koja koriste teški lanac H3.
[0095] Inhibicija LIF-indukovane STAT3 fosforilacije na tirozinu 705 određena je Vestern blot analizom. Ćelije glioma U251 su postavljene u ploče sa 6 bunarčića pri gustini od 100.000 ćelija/bunariću. Ćelije su gajene u kompletnom medijumu 24 sata pre bilo kakvog tretmana, a nakon toga, ćelije su izgladnjivane u serumu 8 sati. Nakon toga ćelije sa naznačenim antitelima preko noći u koncentraciji od 10 µg/ml. Nakon tretmana, proteini su dobijeni u puferu za liziranje radio-imunoprecipitacionog testa (RIPA) koji sadrži inhibitore fosfataze i proteaze, kvantifikovani (BCA-proteinski test, Thermo Fisher Scientific) i korišćeni u Vestern blotu. Za Vestern blot, membrane su blokirane tokom 1 sata u 5% nemasnom dehidriranom mleku - TBST i inkubirane sa primarnim antitelom preko noći (p-STAT3, kataloški br. 9145, Cell Signaling ili STAT3, kataloški br. 9132,Cell Signaling) ili 30 minuta (β-aktin-peroksidaza, kataloški br. A3854, Sigma-Aldrich). Membrane su zatim isprane sa TBST, inkubirane sa sekundarnim antitelom i ponovo isprane. Proteini su detektovani hemiluminiscencijom (SuperSignal Substrate, kataloški br. 34076, Thermo Fisher Scientific). Ovi rezultati su prikazani na sl. 1. Što je pSTAT3 traka tamnija, manje inhibicije je prisutno. Inhibicija je bila visoka u kolonama označenim sa 5D8 (nehumanizovani pacov), A (H0L0), C (H1L2), D (H1L3) i G (H2L2); inhibicija je bila umerena u H (H2L3), O (H4L2) i P (H4L3); inhibicija je izostala u B (H1L1), E (H1L4), F (H2L1), I (H2L4), N (H4L1) i K (H4L4).
[0096] Antitela koja su pokazala inhibiciju LIF-indukovane STAT3 fosforilacije su zatim analizirana pomoću SPR-a da bi se odredio afinitet vezivanja. Ukratko, vezivanje humanizovanih antitela A(H0L0), C (H1L2), D (H1L3) i G (H2L2), H (H2L3) i O (H4L2) sa hLIF kuplovanim sa aminom, uočeno je korišćenjem Biacore™ 2002 instrumenta. Kinetičke konstante i afiniteti su određeni matematičkim fitovanjem senzograma (Langmuirov model interakcije [A B = AB]) svih senzograma generisanih na svim površinama senzorskog čipa pri šest koncentracija liganda. Najbolje fitovane krive (minimalni Chi2) za svaku koncentraciju su korišćene za izračunavanje kinetičkih konstanti i afiniteta. Videti tabelu 1.
[0097] Pošto je eksperimentalna postavka koristila bivalentna antitela kao analite, najbolje fitovani senzogrami su takođe analizirani na osnovu modela fitovanja bivalentnog analita [A+B = AB; AB+B = AB2] kako bi se dobio detaljniji uvid u mehanizam vezivanja humanizovanih antitela za ciljnu kategoriju. Kinetička analiza senzograma korišćenjem modela bivalentnog fitovanja [A+B = AB; AB+B = AB2] potvrdila je relativni afinitet uzoraka mAb.
[0098] Humanizovani 5D8 koji sadrži H2 i L2 je odabran za detaljniju analizu zbog svog visokog afiniteta vezivanja i visokog prinosa iz pojedinačnih kultura.
Primer 4-Humanizacija klona 5D8 poboljšava vezivanje za LIF
[0099] Za dalju analizu smo izabrali klon H2L2 (h5D8) i pomoću SPR uporedili vezivanje za parentalni pacovski 5D8(r5D8) i mišji klon 1B2. Antitelo 1B2 je prethodno otkriveno mišje anti-LIF antitelo koje je prethodno deponovano u zbirci Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM ACC3054) i uključeno je u cilju poređenja. Rekombinantni humani LIF, prečišćeni iz ćelija E.coli i HEK-293, korišćeni su kao ligandi. LIF iz humanih ili E. coli izvora je kovalentno kuplovan sa površinom Biacore optičkih senzorskih čipova korišćenjem hemije aminskog kuplovanja, a afiniteti vezivanja su izračunati iz kinetičkih konstanti.
Materijali i metode
[0100] Humani LIF iz E.coli je dobijen od firme Millipore, referenca LIF 1010; humani LIF iz ćelija HEK-293 je dobijen od ACRO Biosystems, referenca LIF-H521b. LIF je kuplovan sa senzorskim čipovima pomoću kompleta Biacore Amine Coupling Kit (BR-1000-50; GE-Healthcare, Uppsala). Uzorci su analizirani na Biacore<™>2002 instrumentu koristeći CM5 optičke senzorske čipove (BR-1000-12; GE-Healthcare, Uppsala). Biacore HBS-EP pufer je korišćen tokom radnih ciklusa mašine (BR-1001-88; GE-Healthcare, Uppsala). Kinetička analiza senzograma vezivanja je izvedena korišćenjem BIAevaluation 4.1 softvera. Kinetičke konstante i afiniteti su određeni matematičkim fitovanjem senzograma (Langmuir interakcijski model [A B = AB]) svih senzograma generisanih na svim površinama senzorskog čipa pri rastućim koncentracijama analita. Senzogrami su takođe analizirani na osnovu modela fitovanja senzograma bivalentnog analita [A+B = AB; AB+B = AB2], uključujući analizu komponenti, kako bi se generisala procena doprinosa bivalenata utvrđenim antitelo-cilj afinitetima prema Langmuiru (npr. doprinos aviditeta). Za izračunavanje kinetičkih konstanti i afiniteta korišćene su najbolje prilagođene krive (minimalni Chi<2>) svake koncentracije. Pregled ovih eksperimenata sa afinitetima prikazani su u tabeli 2 (humani LIF napravljen u E.coli) i tabeli 3 (humani LIF napravljen u HEK 293 ćelijama).
[0101] Langmuirov 1:1 model fitovanja senzograma iz ovog skupa eksperimenata pokazuje da se humanizovano 5D8 (h5D8) antitelo vezalo sa ~10 - 25 puta većim afinitetom za humani LIF nego za mišji 1B2 i r5D8.
[0102] Zatim, h5D8 antitelo je testirano sa LIF više vrsta pomoću SPR. h5D8 SPR kinetika vezivanja je izvedena za rekombinantne LIF analite dobijene iz različitih vrsta i ekspresionih sistema: humani LIF (E.coli, HEK293 ćelije); mišji LIF (E.coli, CHO ćelije); pacovski LIF (E.coli); LIF cinomolgus majmuna (kvasac, HEK293 ćelije).
Materijali i metode
[0103] Antitelo h5D8 je imobilisano na površini senzorskog čipa nekovalentnim, Fc specifičnim hvatanjem. Rekombinantni, protein A/G iz S. aureus specifičan za Ig(Fc) je korišćen kao agens za hvatanje, omogućavajući sterno uniformno i fleksibilno prezentovanje anti-LIF antitela LIF analitima. Izvori LIF analita su sledeći: humani LIF (iz E.coli; Millipore referentni LIF 1050); humani LIF (iz HEK ćelija ACRO Biosystems LIF-H521); mišji LIF (E. coli; Millipore kat. br. NF-LIF2010); mišji LIF (iz CHO ćelija; Reprokine kataloški br. RCP09056); LIF majmuna (kvasac Kingfisher Biotech kataloški br. RP1074Y); LIF majmuna proizveden u HEK-293 ćeliji. Sveukupno, h5D8 je prikazao vezivanje za LIF iz nekoliko vrsta. Pregled ovog afinitetnog eksperimenta je prikazan u tabeli 4.
Primer 5-Humanizovani klon 5D8 inhibira LIF-indukovanu fosforilaciju STAT3 in vitro
[0104] Da bi se utvrdila biološka aktivnost h5D8, humanizovana i parentalna verzija su testirane na modelu LIF aktivacije u ćelijskoj kulturi. sl.2A pokazuje da je humanizovani klon pokazao povećanu inhibiciju STAT3 fosforilacije (Tyr 705) kada je ćelijska linija glioma inkubirana sa humanim LIF. sl.2B prikazuje eksperiment sa istom postavkom kao na sl.2A, ponovljen sa različitim razblaženjima h5D8 antitela.
Metode
[0105] Ćelije glioma U251 su zasejane u ploče sa 6 bunarčića pri gustini od 150.000 ćelija/bunariću. Ćelije su gajene u kompletnom medijumu tokom 24 sata, pre bilo kakvog tretmana. Nakon toga, ćelije su tretirane preko noći ili nisu tretirane (kontrolne ćelije) sa r5D8 anti-LIF antitelom ili h5D8 anti-LIF antitelom u koncentraciji od 10 µg/ml.
[0106] Posle tretmana, proteini su dobijeni u radio-imunoprecipitacionom testu (RIPA) puferu za lizu radio-imunoprecipitacionog testa (RIPA) koji sadrži fosfatazu i inhibitore proteaze, kvantifikovani (BCA-proteinski test, Thermo Fisher Scientific) i korišćeni u Vestern blotu. Za Vestern blot, membrane su blokirane 1 sat u 5% nemasnog mleka - TBST i inkubirane sa primarnim antitelom preko noći (p-STAT3, kataloški br. 9145, Cell Signaling ili STAT3, kataloški br. 9132, Cell Signaling) ili 30 minuta (β-aktin-peroksidaza, kataloški br. A3854, Sigma-Aldrich). Membrane su zatim isprane sa TBST, inkubirane sa sekundarnim antitelom, ukoliko je potrebno, i ponovo isprane. Proteini su detektovani hemiluminiscencijom (SuperSignal Substrate, kataloški br.34076, Thermo Fisher Scientific).
Primer 6-IC50vrednost tretmana h5D8 antitelom na endogene nivoe LIF u U-251 ćelijama.
[0107] Takođe smo odredili vrlo nisku IC50od samo 490 pikomola (sl. 3A), za biološku inhibiciju h5D8 u uslovima gladovanja u serumu u U-251 ćelijama. Videti reprezentativne rezultate, sl. 3A i 3B i tabela 5.
Metode
[0108] Ćelije U-251 su zasejane sa 600.000 ćelija po ploči od 6 cm (po stanju). Ćelije su tretirane sa h5D8 in odgovarajuća koncentracija (titracija) preko noći na 37°C, uz gladovanje u serumu (0,1% FBS). Kao pozitivna kontrola za pSTAT3, korišćen je rekombinantni LIF (R&D br. 7734-LF/CF) za stimulaciju ćelija pri 1,79 nM tokom 10 minuta na 37°C. Kao negativna kontrola za pSTAT3, korišćen je JAK I inhibitor (Calbiochem #420099) pri 1 uM tokom 30 minuta na 37 °C. Ćelije su zatim sakupljene na ledu za lizate prema protokolima za komplete Meso Scale Discovery Multi-Spot Assay System Total STAT3 (kat. br. K150SND-2) i Phospho-STAT3 (Tyr705) (kat. br. K150SVD-2), za merenje nivoa proteina koji mogu da se detektuju pomoću MSD Meso Sector S600 kamere.
Primer 7 - Dodatna antitela koja se specifično vezuju za humani LIF
[0109] Identifikovani su drugi klonovi antitela pacova (10G7 i 6B5) koji se specifično vezuju za humani LIF i pregled njihovih karakteristika vezivanja je prikazan u nastavku teksta u tabeli 6, klon 1B2 je služio kao poređenje.
Metode
[0110] Kinetička analiza vezivanja u realnom vremenu je izvedena za anti-LIF mAb 1B2, 10G7 i 6B5, imobilisana na površini CM5 optičkih senzorskih čipova, primenom rekombinantnih LIF ciljnih proteina [humani LIF (E.coli); Millipore kat. br. LIF 1010 i humani LIF (HEK293 ćelije); ACRO Biosystems kat. br. LIF-H521b] kao analita.
[0111] Kinetičke konstante i afiniteti su dobijeni matematičkim fitovanjem senzograma korišćenjem Langmuir 1:1 modela vezivanja koji primenjuje globalni (simultano fitovanje skupova senzograma) kao i algoritme za fitovanje pojedinačne krive. Verovatnoća globalnog fitovanja je procenjena kobsanalizom.
Primer 8-Dodatna anti LIF antitela inhibiraju LIF-indukovanu fosforilaciju STAT3 in vitro
[0112] Dodatni klonovi su testirani na njihovu sposobnost da inhibiraju LIF-indukovanu fosforilaciju STAT3 u ćelijskoj kulturi. Kao što je prikazano na slici 4, klonovi 10G7 i prethodno detaljno opisani r5D8 pokazali su visoku inhibiciju LIF-indukovane STAT3 fosforilacije, u poređenju sa klonom 1B2. Anti-LIF poliklonski anti-serumi (poz.) uključeni su kao pozitivna kontrola dok je 6B5 nije pokazala inhibiciju, ovo se može objasniti mogućim nedostatkom vezivanja 6B5 za neglikozilovani LIF koji je korišćen u ovom eksperimentu.
Metode
[0113] Ćelije glioma dobijene od pacijenata su postavljene u ploče sa 6 bunarčića u gustini od 150.000 ćelija/bunariću. Ćelije su gajene u GBM medijumu koji se sastojao od Neurobasal medijuma (Life Technologies) sa dodatkom B27 (Life Technologies), penicilina/streptomicina i faktora rasta (20 ng/ml EGF i 20 ng/ml FGF-2 [PeproTech]) tokom 24 sata. pre bilo kakvog tretmana. Sledećeg dana, ćelije su tretirane ili ne rekombinantnim LIF proizvedenim u E. coli ili mešavinom rekombinantnog LIF plus naznačenim antitelima tokom 15 minuta (konačna koncentracija od 10 mg/ml za antitela i 20 µg/ml rekombinantni LIF). Nakon tretmana, proteini su dobijeni radioimunoprecipitacionim testom (RIPA) puferom za lizu koji sadrži inhibitore fosfataze i proteaze, kvantifikovani (BCA-protein test, Thermo Fisher Scientific) i korišćeni u Vestern blot-u. Za Vestern blot, membrane su blokirane 1 sat u 5% nemasnog mleka - TBST i inkubirane saprimarno antitelo preko noći (p-STAT3, kataloški br. 9145, ćelijska signalizacija) ili 30 minuta (β-aktin-peroksidaza, kataloški br. A3854, Sigma-Aldrich). Membrane su zatim isprane sa TBST, inkubirane sa sekundarnim antitelom ako je potrebno, i isprane opet. Proteini su detektovani hemiluminiscencijom (SuperSignal Substrate, kataloški br. 34076, Thermo Fisher Scientific).
Primer 9 - LIF je visoko eksprimiran kod više tipova tumora
[0114] Imunohistohemija je sprovedena na više tipova humanih tumora da bi se odredio stepen ekspresije LIF. Kao što je prikazano na sl. 5, LIF je visoko eksprimiran u multiformnom glioblastomu (GBM), nesitnoćelijskom karcinomu pluća (NSCLC), raku jajnika i kolorektalnom karcinom (CRC).
Primer 10-Humanizovani klon h5D8 inhibira rast tumora u mišjem modelu nesitnoćelijskog karcinoma pluća
[0115] Da bi se utvrdila sposobnost humanizovanog klona 5D8 da inhibira LIF pozitivan kancer in vivo, ovo antitelo je testirano na mišjem modelu nesitnoćelijskog karcinoma pluća (NSCLC). Sl. 6 pokazuje smanjeni rast tumora kod miševa tretiranih ovim antitelom u poređenju sa negativnom kontrolom vehikuluma.
Metode
[0116] Mišja ćelijska linija ne-sitnoćelijskog karcinoma pluća (NSCLC), KLN205, sa visokim nivoima LIF, stabilno je inficirana lentivirusom koji eksprimira gen luciferaze svica za praćenje bioluminiscencije in vivo. Da bi se razvio mišji model, 5×10<5>KLN205 ćelija nesitnoćelijskog karcinoma pluća (NSCLC) je ortotopski implantirano u levo plućno krilo imunokompetentnih singenih DBA/2 miševa starih 8 nedelja, interkostalnom punkcijom. Miševi su tretirani kontrolnim vehikulumom ili sa 15 mg/kg ili 30 mg/kg antitela h5D8 intraperitonealno dva puta nedeljno, a rast tumora je praćen bioluminecencijom. Za bioluminiscentno snimanje, miševi su primili intraperitonealnu injekciju od 0,2 mL 15 mg/mL D-luciferina pod 1-2% inhalacione anestezije izofluranom. Signali bioluminiscencije su praćeni korišćenjem instrumenta IVIS system 2000 series (Xenogen Corp., Alameda, Kalifornija, SAD) koji se sastoji od visoko senzitivne hlađene CCD kamere. Softver Living Image software (Xenogen Corp.) je korišćen za mrežu podataka o slikama i integraciju ukupnih signala bioluminiscencije u svakom upakovanom regionu. Podaci su analizirani korišćenjem
1
ukupne emisije fotonskog fluksa (fotona/sekundi) u regionima od interesa (ROI). Rezultati pokazuju da tretman sa antitelom h5D8 promoviše regresiju tumora. Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM.
Primer 11- h5D8 inhibira rast tumora u mišjem modelu multiformnog glioblastoma
[0117] U ortotopskom GBM modelu tumora koji koristi humanu ćelijsku liniju U251 koja eksprimira luciferazu, r5D8 značajno smanjuje zapremine tumora kod miševa kod kojih je primenjeno 300 µg r5D8 i h5D8 intraperitonealnom (IP) injekcijom dva puta nedeljno. Rezultati ove studije su prikazani na sl. 7A (kvantifikacija 26. dana nakon tretmana). Ovaj eksperiment je takođe sproveden korišćenjem humanizovanih h5D8 miševa tretiranih sa 200 µg ili 300 µg, i pokazao je statistički značajno smanjenje tumora posle 7 dana lečenja.
Metode
[0118] Ćelije U251 koje stabilno eksprimiraju luciferazu su sakupljene, isprane u PBS, centrifugirane na 400 g tokom 5 minuta, resuspendovane u PBS i izbrojane pomoću automatizovanog brojača ćelija (Countess, Invitrogen). Ćelije su držane na ledu da bi se održala optimalna vijabilnost. Miševi su anestezirani intraperitonealnom primenom ketamina (Ketolar50<®>) / ksilacina (Rompun<®>) (75 mg/kg i 10 mg/kg, redom). Svaki miš je pažljivo stavljen u stereotaktički uređaj i imobilisan. Dlake sa glave su uklonjene kremom za depilaciju, a koža glave je isečena skalpelom da bi se otkrila lobanja. Mali rez je pažljivo napravljen bušilicom u koordinatama 1,8 mm bočno i 1 mm ispred lambde. 5 µL ćelija je inokulisano pomoću Hamilton 30G šprica u desni corpus striatum, na 2,5 mm dubine. Rez na glavi je zatvoren Hystoacryl adhezivom za tkivo (Braun) i miševima je potkožno ubrizgan analgetik Meloxicam (Metacam<®>) (1 mg/kg). Finalni broj ćelije implantiran u svakog miša bio je 3×10<5>.
[0119] Miševi su tretirani dva puta nedeljno sa h5D8 primenjenim intraperitonealno. Tretman je započet 0. dana, odmah nakon inokulacije tumorskih ćelija. Miševi su primili ukupno 2 doze h5D8 ili kontrole vehikuluma.
[0120] Telesna težina i zapremina tumora: Telesna težina je merena 2 puta nedeljno i rast tumora je kvantifikovan bioluminiscencijom 7. dana (Xenogen IVIS Spectrum). Da bi se kvantifikovala bioluminiscentna aktivnost in vivo, miševi su anestezirani korišćenjem izofluorana i intraperitonealno im je ubrizgan supstrat za luciferin (PerkinElmer) (167 µg/kg).
[0121] Veličina tumora određena bioluminiscencijom (Xenogen IVIS Spectrum) je procenjena 7. dana. Izračunata su individualna merenja tumora i srednja vrednost ± SEM za
2
svaku tretiranu grupu. Statistička značajnost je određena neparenim neparametarskim Mann-Whitney U-testom.
Primer 12 - h5D8 inhibira rast tumora u mišjem modelu raka jajnika
[0122] Efikasnost r5D8 je procenjena na dva druga singena modela tumora. U ortotopskom modelu tumora jajnika ID8, IP primena 300 µg r5D8 dva puta nedeljno značajno je inhibirala rast tumora mereno abdominalnom zapreminom (sl. 8A i 8B). Rezultati na sl. 8C pokazuju da h5D8 takođe smanjuje zapreminu tumora pri dozi od 200 µg i više.
Metode
[0123] ID8 ćelije su gajene u medijumu Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco, Invitrogen), suplemetniranom sa 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) (Gibco, Invitrogen), 40 U/mL penicilina i 40 μg/mL streptomicina (PenStrep) (Gibco), Invitrogen) i sa 0,25 μg/mL plazmocina (Invivogen).
[0124] ID8 ćelije su sakupljene, isprane u PBS, centrifugirane na 400 g tokom 5 minuta i resuspendovane u PBS. Ćelije su držane na ledu da bi se održala optimalna vijabilnost i 200 μL ćelijske suspenzije je ubrizgano intraperitonealno 27G iglom. Finalni broj ćelija implantiranih u miševe bio je 5×10<6>.
[0125] Miševi su tretirani dva puta nedeljno sa h5D8 primenjenim ip u različitim dozama kako je naznačeno. Telesna težina je merena 2 puta/nedeljno, a progresija tumora je praćena tako što je meren obim abdomena pomoću kalipera (Fisher Scientific).
Primer 13-r5D8 inhibira rast tumora u mišjem modelu kolorektalnog kancera
[0126] Kod miševa sa potkožnim tumorima kolona CT26, r5D8 (primenjeno 300 μg IP dva puta nedeljno) značajno je inhibirao rast tumora (sl. 9A i 9B).
Metode
[0127] CT26 ćelije su gajene u medijumu Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI [Gibco, Invitrogen]), suplementiranom sa 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS), 40 U/mL penicilina i 40 μg/mL streptomicina (PenStrep) i 0,25 μg/mL plazmocina.
[0128] CT26 ćelije (8 × 10<5>) su tripsinizovane, isprane sa PBS, centrifugirane na 400 g tokom 5 minuta i resuspendovane u 100 μL PBS. Ćelije su držane na ledu da bi se izbegla ćelijska smrt. CT26 ćelije su primenjene kod miševa putem potkožne injekcije pomoću 27G igle.
[0129] 300 μg r5D8, ili kontrole za vehikulum, primenjeno je kod miševa putem intraperitonealne injekcije (IP) dva puta nedeljno od 3. dana nakon implantacije CT26 ćelija.
[0130] Telesna težina i zapremine tumora merene su tri puta nedeljno. Zapremina tumora je merena pomoću kalipera (Fisher Scientific).
Primer 14- r5D8 smanjuje inflamatornu infiltraciju u tumorskim modelima
[0131] U ortotopskom modelu U251 GBM, ekspresija CCL22, markera M2 polarizovanih makrofaga, bila je značajno smanjena kod tumora tretiranih sa r5D8 kao što je prikazano na slici 10A. Ovaj nalaz je takođe potvrđen u fiziološki relevantnom modelu kulture organotipskih preseka tkiva korišćenjem h5D8 u kome su tri uzorka pacijenata pokazala značajno smanjenje ekspresije CCL22 i CD206 (MRC1) (takođe marker M2 makrofaga) nakon tretmana sa kao što je prikazano na sl. 10B. (uporedi gornji levi, kontrolni, donji desni, tretiran, i za MRC1 i za CCL22). Štaviše, r5D8 je takođe smanjio CCL22<+>M2 makrofage u singenim ID8 (sl. 10C) i CT26 (sl. 10D) tumorima kod imunokompetentnih miševa.
Primer 15- r5D8 povećava nemijeloidne efektorske ćelije
[0132] Da bi se istražili dodatni imunski mehanizmi, procenjen je efekat r5D8 na T ćelije i druge ne-mijeloidne imunske efektorske ćelije u mikrookruženju tumora. U ortotopskom ID8 singenom modelu jajnika, tretman sa r5D8 je rezultirao povećanjem intratumorskih NK ćelija i povećanjem ukupnih i aktiviranih CD4+ i CD8+T ćelija kao što je prikazano na sl.
11A. Slično, u singenom modelu tumora CT26 debelog creva, r5D8 je povećao intratumorske NK ćelije, povećao je CD4+ i CD8+T ćelije i imao trend smanjenja CD4<+>CD25<+>FoxP3<+>T-reg ćelija kao što je prikazano na sl. 11B. Trend smanjenja CD4<+>CD25<+>FoxP3<+>T-reg ćelija takođe je primećen u singenom ortotopskom KLN205 tumorskom modelu nakon tretmana r5D8 kao što je prikazano na sl. 11C. U skladu sa zahtevom da T ćelije posreduju u efikasnosti, deplecija CD4+ i CD8+T ćelija u modelu CT26 inhibira antitumorsku efikasnost r5D8 kao što je prikazano na sl.12.
Metode za depleciju T ćelija
[0133] CT26 ćelije su gajene u medijumu za gajenje RPMI (Gibco, Invitrogen), suplementiranom sa 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS [Gibco, Invitrogen]), 40 U/mL penicilina i 40 μg/mL streptomicina (PenStrep [Gibco, Invitrogen]) i 0,25 μg/mL plazmocina (Invivogen). CT26 ćelije (5 × 10<5>) su sakupljene, isprane sa PBS, centrifugirane
4
na 400 g tokom 5 minuta i resuspendovane u 100 µL PBS. Ćelije su držane na ledu da bi se izbegla ćelijska smrt. CT26 ćelije su primenjene u oba boka kod miševa putem potkožne injekcije pomoću šprica od 27G. Miševi su tretirani dva puta nedeljno sa r5D8 primenjenim intraperitonealno kao što je naznačeno u dizajnu studije. Vehikulum kontrola (PBS), r5D8 pacova i/ili anti-CD4 i anti-CD8 su primenjeni kod miševa putem intraperitonealne injekcije (IP) dva puta nedeljno, kao što je navedeno u dizajnu studije. Svi tretmani antitelima su primenjivani istovremeno.
Primer 16-Kristalna struktura h5D8 u kompleksu sa humanim LIF
[0134] Kristalna struktura h5D8 je razrešena do rezolucije od 3,1 angstrema kako bi se odredio epitop na LIF za koji je h5D8 vezan i da bi se odredili ostaci h5D8 koji učestvuju u vezivanju. Kokristalna struktura otkrila je da je N-terminalna petlja LIF centralno pozicionirana između varijabilnih regiona lakog i teškog lanca h5D8 (sl. 13A). Pored toga, h5D8 interaguje sa ostacima na heliksu A i C LIF molekula, formirajući tako diskontinuirani i konformacioni epitop. Vezivanje je vođeno nekoliko sonih mostova, H-veza i Van der Valsovih interakcija (tabela 7, sl. 13B). Epitop h5D8 LIF molekila obuhvata region interakcije sa gp130. Videti Boulanger, MJ, Bankovich, AJ, Kortemme, T., Baker, D. & Garcia, KC Convergent mechanisms for recognition of divergent cytokines by the shared signaling receptor gp130. Molecular cell 12, 577-589 (2003). Rezultati su sumirani u nastavku teksta u tabeli 7 i prikazani na slici 13.
Metode
[0135] LIF je privremeno eksprimiran u HEK 293S (Gnt I-/-) ćelijama i prečišćen korišćenjem Ni-NTA afinitetne hromatografije, praćeno gel-filtracionom hromatografijom u 20 mM Tris pH 8,0 i 150 mM NaCl. Rekombinantni h5D8 Fab je prolazno eksprimiran u HEK 293F ćelijama i prečišćen korišćenjem KappaSelect afinitetne hromatografije, nakon čega je usledila hromatografija izmene katjona. Prečišćeni h5D8 Fab i LIF su pomešani u molarnom odnosu 1:2,5 i inkubirani na sobnoj temperaturi. peratura 30 min pre deglikozilacije korišćenjem EndoH. Za prečišćavanje kompleksa je zatim korišćena gelfiltraciona hromatografija. Kompleks je koncentrovan do 20 mg/mL i podešen za ispitivanje kristalizacije korišćenjem sita sa retkim matriksom. Kristali formirani na 4°C u uslovima koji sadrže 19% (zap./zap.) izopropanola, 19% (tež./zap.) PEG 4000, 5% (zap./zap.) glicerola, 0,095 M natrijum citrata pH 5,6. Kristal je difraktovao do rezolucije od 3,1 Å na liniji snopa 08ID-1 u uređaju Canadian Light Source (CLS). Podaci su prikupljeni, obrađeni i skalirani korišćenjem XDS prema Kabsch et al. Xds. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography 66, 125-132 (2010). Strukture su određene molekularnom zamenom korišćenjem Phaser programa prema McCoy et al. Phaser crystallographic software. J Appl Crystallogr 40, 658-674 (2007). Nekoliko iteracija Izgradnja modela i prečišćavanje izvedeni su korišćenjem softvera Coot i phenix.refine dok se strukture nisu konvergirale do prihvatljive Rradnoi Rslobodno. Videti Emsley et al. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography 66, 486-501 (2010); i Adams, et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography 66, 213-221 (2010) redom. Brojke su generisane u PyMOL programu (PyMOL Molecular Graphics System, verzija 2.0 Schrödinger, LLC).
Primer 17- h5D8 ima visoku specifičnost za LIF
[0136] Cilj nam je bio da testiramo vezivanje h5D8 za druge članove porodice LIF kako bismo utvrdili specifičnost vezivanja. Kada se koristi Octet96 analiza, vezivanje h5D8 za humani LIF je približno 100 puta veće od vezivanja za člana porodice IL-6 sa najviše homologije sa LIF, onkostatin M (OSM), ako se oba proteina proizvode u E. coli. Ako se oba proteina proizvode u sisarskom sistemu, h5D8 ne pokazuje vezivanje za OSM. Podaci su sažeti u tabeli 8.
Metode
[0137] Eksperimenti vezivanja okteta: Reagensi su korišćeni i pripremljeni prema uputstvu proizvođača. Osnovni kinetički eksperiment je izveden korišćenjem softvera Octet Data Acquisition ver. 9.0.0.26 na sledeći način: Podešavanje senzora/programa: i) Ekvilibracija (60 sekundi); ii) Učitavanje (15 sekundi); iii) Osnovna linija (60 sekundi); iv) Asocijacija (180 sekundi); i v) Disocijacija (600 sekundi)
[0138] Oktetski afinitet h5D8 za citokine: Osnovni kinetički eksperiment je izveden korišćenjem softvera Octet Data Acquisition ver. 9.0.0.26, na sledeći način: biosenzori Amine Reactive 2ndGeneration Biosensors (AR2G) su hidrirani najmanje 15 minuta u vodi. Konjugacija amina h5D8 sa biosenzorima izvedena je prema ForteBio tehničkoj napomeni 26 (pogledajte Reference) korišćenjem kompleta Amine Coupling Second Generation Kit. Koraci uranjanja su izvedeni na 30°C, 1000 o/min na sledeći način: i) 60 sekundi ekvilibracija u vodi; ii) 300 sekundi aktivacija u 20 mM ECD, 10 mM sulfo-NHS u vodi; iii) 600 sekundi imobilizacija 10 µg/ml h5D8 u 10 mM natrijum acetata, pH 6,0; iv) 300 sekundi prigušivanje u 1M etanolaminu, pH 8,5; v) 120 sekundi osnovna linija u vodi. Kinetički eksperimenti su zatim izvedeni sa sledećim koracima potapanja i očitavanja na 30°C, 1000 o/min: vi) 60 sekundi osnovna linija u 1X kinetičkom puferu; vii) 180 sekundi asocijacija odgovarajućih serijskih razblaženja citokina u 1X kinetičkom puferu; viii) 300 sekundi disocijacija u 1X kinetičkom puferu; ix) tri ciklusa regeneracije/neutralizacije naizmenično u 10 mM glicinu pH 2,0 i 1X kinetičkom puferu, redom (po 5 sekundi u svakom, 3 ciklusa). Nakon regeneracije, biosenzori su ponovo korišćeni za naredne analize vezivanja.
[0139] Humani rekombinantni LIF proizveden iz ćelija sisara je iz ACROBiosystems (LIFH521b); humani rekombinantni OSM proizveden u ćelijama sisara je iz istraživanja i razvoja (8475-OM/CF); i proizvedeni humani rekombinantni OSM u ćelijama E. coli je iz istraživanja i razvoja (295-OM-050/CF).
Primer 18- Kristalna struktura h5D8 fab
[0140] Određeno je pet kristalnih struktura h5D8 Fab u širokom spektru hemijskih uslova. Visoke rezolucije ovih struktura ukazuju na to da su konformacije CDR ostataka povezane sa malom fleksibilnošću i da su veoma slične u različitim hemijskim okruženjima. Jedinstvena karakteristika ovog antitela je prisustvo nekanonskog cisteina na poziciji 100 varijabilnog teškog regiona. Analiza strukture pokazuje da je cistein nesparen i u velikoj meri nepristupačan za rastvarač.
[0141] H5D8 Fab je dobijen digestijom pomoću papaina svog IgG, nakon čega je usledilo prečišćavanje korišćenjem standardnih tehnika afiniteta, jonske izmene i hromatografskog razdvajanja po veličini. Kristali su dobijeni metodama difuzije pare i omogućili su da se odredi pet kristalnih struktura u opsegu rezolucije od 1,65 Å do 2,0 Å. Sve strukture su razrešene u istoj kristalografskoj prostornoj grupi i sa sličnim dimenzijama jedinične ćelije (P212121, a~53,8 Å, b~66,5 Å, c~143,3 Å), uprkos uslovima kristalizacije u opsegu od pet različitih nivoa pH: 5,6, 6,0, 6,5, 7,5 i 8,5. Same po sebi, ove kristalne strukture omogućavaju poređenje trodimenzionalne dispozicije h5D8 Fab neometane artefaktima pakovanja kristala i u širokom spektru hemijskih uslova.
[0142] Elektronska gustina je posmatrana za sve ostatke regiona za određivanje komplementarnosti (CDR), koji su naknadno modelovani. Primetno je da su LCDR1 i HCDR2 usvojili izdužene konformacije koje su zajedno sa plitkim LCDR3 i HCDR3 regionima formirale žleb za vezivanje u centru paratopa (sl. 14A). Pet struktura je bilo veoma slično za sve ostatke, sa srednjim kvadratnim devijacijama svih atoma u opsegu između 0,197 Å i 0,327 Å (sl. 14A). Ovi rezultati su pokazali da se konformacije CDR ostataka održavaju u različitim hemijskim okruženjima, uključujući pH nivoe u opsegu između 5,6 i 8,5 i jonske jačine između 150 mM i 1 M. Analiza elektrostatičke površine h5D8 paratopa otkrila je da su pozitivno i negativno naelektrisani regioni su podjednako doprineli hidrofilnim svojstvima, bez preovlađujućih hidrofobnih oblasti. h5D8 ima neuobičajeno javljanje nekanonskog cisteina u bazi HCDR3 (Cys100). U svih pet struktura, ovaj slobodni cistein je uređen i ne formira nijedan rearanžman disulfida. Pored toga, nije modifikovan dodavanjem Cys (cisteinilacija) ili glutationa (glutatiolacija) i stvara van der Valsove interakcije (3,5-4,3 Å rastojanja) sa atomima glavnog i bočnog lanca Leu4, Phe27, Trp33, Met34, Glu102 i Leu105 teškog lanca (sl. 14B). Na kraju, Cys100 je pretežno zaklonjen strukturni ostatak koji izgleda da je uključen u posredovanje konformacija CDR1 i HCDR3. Prema tome, malo je verovatno da će imati reaktivnost sa drugim cisteinima, kao što je uočeno homogenom dispozicijom ovog regiona u naših pet kristalnih struktura.
Metode
[0143] H5D8-1 IgG je dobijen od firme Catalent Biologics i formulisan je u 25 mM histidina, 6% saharoze, 0,01% polisorbata 80, na pH 6,0. Formulisani IgG je podvrgnut intenzivnoj izmeni pufera u PBS korišćenjem 10K MWCO koncentratora (Millipore) pre digestije sa 1:100 mikrograma papaina (Sigma) tokom 1 sata na 37°C u PBS, 1,25 mM EDTA, 10 mM cisteina. IgG koji je digeriran papainom je propušten kroz kolonu proteina A (GE Healthcare) korišćenjem AKTA Start sistema za hromatografiju (GE Healthcare). Sadržaj propušten kroz protein A, koji je sadržao h5D8 Fab, je izdvojen i podvrgnut izmeni pufera u 20 mM natrijum acetat, pH 5,6 korišćenjem 10K MWCO koncentratora (Millipore). Dobijeni uzorak je apliciran na Mono S katjonsku jonoizmenjivačku kolonu (GE Healthcare) korišćenjem AKTA Pure sistema za hromatografiju (GE Healthcare). Eluacija sa gradijentom od 1 M kalijum hlorida je rezultirala preovlađujućim h5D8 Fab pikom koji je izdvojen, koncentrovan i prečišćen do homogenosti po veličini korišćenjem Superdex 200 Increase kolone za gel filtraciju (GE Healthcare) u 20 mM Tris-HCl, 150 mM natrijum hlorida, na pH 8,0. Visoka čistoća h5D8 Fab je potvrđena pomoću SDS-PAGE pod redukujućim i neredukujućim uslovima.
[0144] Prečišćeni h5D8 Fab je koncentrovan do 25 mg/mL korišćenjem 10K MWCO koncentratora (Millipore). Oryx 4 dozator (Douglas Instruments) je korišćen za postavljanje eksperimenata kristalizacije difuzijom pare sa komercijalnim ekranima JCSG TOP96 (Rigaku Reagents) MCSG-1 (Anatrace) za stanje u formatu 96 i oskudnog matriksa, na 20°C. Kristali su dobijeni i sakupljeni nakon četiri dana u sledećih pet uslova kristalizacije: 1) 0,085 M natrijum citrat, 25,5% (tež./zap.) PEG 4000, 0,17 M amonijum acetat, 15% (zap./zap.) glicerol, pH 5,6; 2) 0,1 M MES, 20% (tež./zap.) PEG 6000, 1 M litijum hlorid, pH 6,0; 3) 0,1 M MES, 20% (tež./zap.) PEG 4000, 0,6 M natrijum hlorid, pH 6,5; 4) 0,085 M natrijum HEPES, 17% (tež./zap.) PEG 4000, 8,5% (zap./zap.) 2-propanol, 15% (zap./zap.) glicerol, pH 7,5; i 5) 0,08 M Tris, 24% (tež./zap.) PEG 4000, 0,16 M magnezijum hlorid, 20% (zap./zap.) glicerol, pH 8,5. Pre brzog zamrzavanja u tečnom azotu, matične tečnosti koje sadrže kristale su suplementirane sa 5-15% (zap./zap.) glicerola ili 10% (zap./zap.) etilen glikola, po potrebi. Kristali su podvrgnuti rendgenskom sinhrotronskom zračenju na sinhrotronnu Advanced Photon Source, linija snopa 23-ID-D (Chicago, IL) i obrasci difrakcije su snimljeni na Pilatus3 6M detektoru. Podaci su obrađeni korišćenjem XDS i strukture su određene molekularnom zamenom koristeći Phaser. Refinacija je izvršena u PHENIX programu sa iterativnom izgradnjom modela u Coot programu. Slike su generisane u PyMOL programu. Svim softverima se pristupalo preko SBGrid platforme.
Primer 19 - Mutacije na cisteinu 100 u h5D8 zadržavaju vezivanje
[0145] Analiza h5D8 otkrila je slobodni cisteinski ostatak na poziciji 100 (C100) u varijabilnom regionu teškog lanca. H5D8 varijante su generisane supstitucijom C100 sa svakom prirodnom amino kiselinom, kako bi se okarakterisalo vezivanje i afinitet za humanii mišji LIF. Vezivanje je okarakterisano korišćenjem ELISA i Octet testa. Rezultati su sumirani u tabeli 9. ELISA EC50 krive su prikazane na sl. 15 (sl. 15A humani LIF i sl.
15B mišji LIF).
1
Metode
[0146] ELISA: Vezivanje varijanti h5D8 C100 za humani i mišji LIF je određeno ELISA testom. Rekombinantnim humanim ili mišjim LIF proteinom su obložene Maxisorp ploče sa 384 bunarčića pri 1 ug/mL, preko noći na 4°C. Ploče su blokirane sa 1x puferom za blokiranje tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Dodati su titri svake varijante h5D8 C100 i omogućeno je vezivanje tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane tri puta sa PBS+0,05% Tween-20. Dodat je HRP-konjugovani anti-humani IgG i omogućeno je vezivanje tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane tri puta sa PBS+0,05% Tween-20 i razvijene korišćenjem 1x TMB supstrata. Reakcija je zaustavljena sa 1M HCl i izmerena je apsorbancija na 450 nm. Generisanje slika i nelinearna regresiona analiza je izvršena pomoću programa Graphpad Prism.
[0147] Octet RED96: Afinitet varijanti h5D8 C100 za humani i mišji LIF je određen pomoću BLI, upotrebom Octet RED96 sistema. Varijante h5D8 C100 su aplicirane na biosenzore sa anti-humanim Fc pri 7,5 ug/mL, što je praćeno sa 30 sekundi za osnovnu liniju u 1× kinetičkom puferu. Titri humanog ili mišjeg LIF proteina su povezani sa pripremljenim biosenzorima tokom 90 sekundi i ostavljeni da disociraju u 1x kinetičkom puferu tokom 300 sekundi. KDsu izračunate pomoću softvera za analizu podataka, upotrebom model globalnog fitovanja 1:1.
Primer 20 - h5D8 blokira vezivanje LIF faktora za gp130 in vitro
[0148] Da bi se utvrdilo da li je h5D8 sprečio LIF da se veže za LIFR, izveden je test vezivanja molekula pomoću platforme Octet RED 96. H5D8 je apliciran na ARC biosenzore putem hvatanja anti-humanim Fc. Zatim su biosenzori umočeni u LIF i, kao što je očekivano, uočeno je povezivanje (sl. 16A, srednja trećina). Nakon toga, biosenzori su umočeni u različite koncentracije LIFR. Primećeno je povezivanje zavisno od doze (sl. 16A, desna trećina). Kontrolni eksperiment je pokazao da je ovo povezivanje bilo LIF-specifično (nije prikazano), i da nije bilo uslovljeno nespecifičnom interakcijom LIFR sa h5D8 ili sa biosenzorima.
[0149] Da bi se dalje okarakterisalo vezivanje h5D8 i LIF, sprovedena je serija ELISA eksperimenata vezivanja. H5D8 i LIF su preinkubirani i zatim uvedeni u ploče obložene, ili rekombinantnim humanim LIFR (hLIFR) ili sa gp130. Izostanak vezivanja između kompleksa h5D8/LIF i supstrata kojim je ploča obložena bi ukazivao na to da je h5D8 na neki način poremetio vezivanje LIF faktora za receptor. Osim toga, kontrolna antitela koja se, ili nisu vezala za LIF (kontrola izotipa, označena sa (-)) ili koja se vezuju za LIF na
2
poznatim mestima vezivanja (B09 nije u kompeticiji ni sa gp130 ni sa LIFR pri vezivanju za LIF; r5D8 je pacovska parentalna verzija h5D8). ELISA rezultati su pokazali da je h5D8/LIF kompleks bio u stanju da se veže za hLIFR (kao i r5D8/LIF kompleks), što ukazuje da ova antitela nisu sprečila LIF/LIFR povezivanje (sl. 16A). Nasuprot tome, h5D8/LIF kompleks (i r5D8/LIF kompleks) nije bio u stanju da se veže za rekombinantni humani gp130 (sl. 16B). Ovo ukazuje da je mesto za vezivanje gp130 na LIF pogođeno kada je LIF bio vezan za h5D8.
Primer 21 - Ekspresija LIF i LIFR u humanim tkivima
[0150] Kvantitativni PCR u realnom vremenu je izveden na mnogo različitih tipova humanog tkiva da bi se odredili nivoi ekspresije LIF i LIFR. Srednji nivoi ekspresije prikazani na sl. 17A i 17B su dati kao kopije na 100 ng ukupne RNK. Najveći broj tkiva je eksprimirao najmanje 100 kopija na 100ng ukupne RNK. Ekspresija LIF iRNK bila je najviša u humanom masnom tkivu (mezenterično-ileum [1]), tkivu krvnih sudova (horoidni pleksus [6] i mezenterično [8]) i tkivu pupčane vrpce [68], a najniža u tkivu mozga (korteks [20] i supstancija nigra [28]). Ekspresija LIFR iRNK bila je najviša u humanom masnom tkivu (mezenterično-ileum [1]), tkivu krvnih sudova (plućno [9]), tkivu mozga [11-28] i tkivu štitne žlezde [66], a najniža je bila u PBMC ćelijama [31]. Nivoi ekspresije LIF i LIFR iRNK u tkivima cinomolgus majmuna su bili slični nivoima uočenim u humanim tkivima, gde je ekspresija LIF bila visoka u masnom tkivu, a ekspresija LIFR je bila visoka u masnom tkivu, a niska u PBMC ćelijama (podaci nisu prikazani). Numeracija tkiva za sl.
17A i sl. 17B je: 1 - adipozno (mezenterično-ileum); 2 - nadbubrežna žlezda; 3 - bešika; 4 -bešika (dno); 5 - krvni sud (moždani: srednja cerebralna arterija); 6 - krvni sud (horoidni pleksus); 7 - krvni sud (koronarna arterija); 8 - krvni sud (mezenterični (debelo crevo)); 9 -krvni sud (plućni); 10 - krvni sud (bubrežni); 11 - mozak (amigdala); 12 - mozak (kaudalni region); 13 - mozak (cerebelum); 14 mozak - (korteks: cingulatni-prednji); 15 - mozak (korteks: cingulatni-zadnji); 16 - mozak (korteks: frontalno-lateralni); 17 - mozak (korteks: frontalno-medijalni); 18 - mozak (korteks: okcipitalni); 19 - mozak (korteks: parijetalni); 20 - mozak (korteks: temporalni); 21 - mozak (dorzalni nukleus rafe); 22 - mozak (hipokampus); 23 - mozak (hipotalamus: prednji); 24 - mozak (hipotalamus: zadnji); 25 -mozak (lokus ceruleus); 26 - mozak (produžena moždina); 27 - mozak (nukleus akumbens); 28 - mozak (supstancija nigra); 29 - dojka; 30 – slepo crevo; 31-mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC ćelije); 32 - debelo crevo; 33 - ganlija dorzalnog korena (DRG); 34 -duodenum; 35 - jajovod; 36 - žučna kesa; 37 - srce (leva pretkomora); 38 - srce (leva komora); 39 - ileum; 40 - jejunum;41 - bubreg (korteks); 42 - bubreg (medula);43 - bubreg (karlica); 44 - jetra (parenhim);45 - jetra (bronhus: primarni); 46 - jetra (bronhus: tercijarni); 47 - pluća (parenhim); 48 - limfna žlezda (krajnik); 49 - mišić (skeletni); 50 - jednjak; 51 - jajnik; 52 - pankreas; 53 - epifiza; 54 - hipofiza; 55 - placenta; 56 - prostata; 57 - rektum; 58 - koža (prepucijum); 69 - kičmena moždina; 60 - slezina (parenhim); 61 – želudac (antrum); 62 -želudac (telo); 63 - želudac (fundus); 64 - želudac (pilorusni kanal); 65 - testis; 66 - štitna žlezda; 67 - traheja; 68 - pupčana vrpca; 69 - ureter; 70 - materica (grlić); 71 - materica (miometrijum); i 72 - vas deferens.
[0151] Premda su ovde prikazani i opisani poželjni primeri izvođenja prema predmetnom pronalasku, stručnjacima će biti očigledno da su ovi primeri izvođenja obezbeđeni samo kao primer.
4
SEKVENCE
[0152]

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Rekombinantno antitelo koje se specifično vezuje za inhibitorni faktor leukemije (LIF), koje sadrži:
a) region 1 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VH-CDR1), koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 2 (GFTFSHAW);
b) region 2 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VH-CDR2), koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 10 (IKAKSDDYAT);
c) region 3 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VH-CDR3), koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 15 (TCWEWDLDF);
d) region 1 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VL-CDR1), koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 22 (QSLLDSDGHTY);
e) region 2 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VL-CDR2), koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 26 (SVS); i
f) region 3 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VL-CDR3), koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 29 (MQATHAPPYT),
naznačeno time što se rekombinantno antitelo specifično vezuje za LIF.
2. Rekombinantno antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što se rekombinantno antitelo vezuje za glikozilovani LIF.
3. Rekombinantno antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, naznačeno time što je rekombinantno antitelo humanizovano.
4. Rekombinantno antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačeno time što je rekombinantno antitelo deimunizovano.
5. Rekombinantno antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačeno time što rekombinantno antitelo sadrži dva imunoglobulinska teška lanca i dva imunoglobulinska laka lanca.
6. Rekombinantno antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačeno time što rekombinantno antitelo sadrži Fab, F(ab)2, antitelo sa jednim domenom ili jednolančani varijabilni fragment (scFv).
7. Rekombinantno antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, naznačeno time što se rekombinantno antitelo specifično vezuje za LIF sa konstantom disocijacije (KD) manjom od oko 200 pikomola.
8. Rekombinantno antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, naznačeno time što se rekombinantno antitelo specifično vezuje za LIF sa konstantom disocijacije (KD) manjom od oko 100 pikomola.
9. Rekombinantno antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, naznačeno time što VH-CDR1 sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 1 (GFTFSHAWMH), pri čemu VH-CDR2 sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 9 (QIKAKSDDYATYYAESVKG), pri čemu VH-CDR3 sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 15 (TCWEWDLDF), pri čemu VL-CDR1 sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 21 (RSSQSLLDSDGHTYLN), pri čemu VL-CDR2 sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 25 (SVSNLES), i pri čemu VL-CDR3 sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 29 (MQATHAPPYT).
10. Rekombinantno antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, naznačeno time što je VH sekvenca najmanje oko 90% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 72; i VL sekvenca je najmanje oko 90% identična sa amino kiselinskom sekvencom izloženom u SEQ ID NO: 76.
11. Rekombinantno antitelo prema patentnom zahtevu 10, naznačeno time što je VH sekvenca humanizovani varijabilni region teškog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 72; a VL sekvenca je humanizovani varijabilni region lakog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 76.
12. Rekombinantno antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11, za primenu u lečenju raka.
13. Rekombinantno antitelo za primenu prema patentnom zahtevu 12, naznačenu time što rak obuhvata glioblastom, rak pankreasa, rak jajnika, rak debelog creva, rak prostate ili rak pluća.
14. Farmaceutska kompozicija koja sadrži rekombinantno antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
15. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 14, formulisana za intravensku primenu.
RS20240203A 2016-12-19 2017-12-18 Antitela na lif i njihove primene RS65187B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16382617 2016-12-19
US201762467017P 2017-03-03 2017-03-03
EP17382683 2017-10-13
PCT/IB2017/001677 WO2018115960A1 (en) 2016-12-19 2017-12-18 Antibodies against lif and uses thereof
EP17840489.3A EP3555132B1 (en) 2016-12-19 2017-12-18 Antibodies against lif and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65187B1 true RS65187B1 (sr) 2024-03-29

Family

ID=67138942

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240203A RS65187B1 (sr) 2016-12-19 2017-12-18 Antitela na lif i njihove primene

Country Status (23)

Country Link
US (2) US11390670B2 (sr)
EP (2) EP4321219A3 (sr)
JP (3) JP7100056B2 (sr)
KR (3) KR102784394B1 (sr)
CN (2) CN111868086B (sr)
AU (1) AU2017381585B2 (sr)
BR (1) BR112019012691A2 (sr)
CA (1) CA3047528A1 (sr)
CL (2) CL2019001717A1 (sr)
DK (1) DK3555132T3 (sr)
ES (1) ES2971126T3 (sr)
FI (1) FI3555132T3 (sr)
HR (1) HRP20240195T8 (sr)
HU (1) HUE065241T2 (sr)
IL (2) IL267450B (sr)
LT (1) LT3555132T (sr)
MX (2) MX2019007376A (sr)
PL (1) PL3555132T3 (sr)
RS (1) RS65187B1 (sr)
SA (1) SA519402119B1 (sr)
SI (1) SI3555132T1 (sr)
SM (1) SMT202400065T1 (sr)
ZA (1) ZA201904533B (sr)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SI3555132T1 (sl) * 2016-12-19 2024-04-30 Medimmune Limited Protitelesa proti LIF in njihove uporabe
CN112585164A (zh) * 2018-04-12 2021-03-30 免疫医疗有限公司 用于治疗癌症的、lif抑制剂和pd-1轴抑制剂的组合
CN114929741A (zh) * 2019-12-04 2022-08-19 免疫医疗有限公司 针对lif的抗体及其用途
TWI841810B (zh) 2020-01-24 2024-05-11 日商西斯美股份有限公司 提升抗體對抗原之親和性的方法及其用途
CA3203886A1 (en) 2020-12-31 2022-07-07 Yanni CONG Human lifr antigen binding protein, preparation method therefor, and application thereof
JP2024518545A (ja) * 2021-05-14 2024-05-01 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｔｒｅｍ２のアゴニスト

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
EP0940468A1 (en) 1991-06-14 1999-09-08 Genentech, Inc. Humanized antibody variable domain
AU4231393A (en) 1992-05-08 1993-12-13 Genentech Inc. Antibodies to leukemia inhibitory factor
AU4241693A (en) 1992-05-15 1993-12-13 Re/Map Incorporated Electromagnetic shielding for a liquid conditioning device
WO1994029351A2 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Celltech Limited Antibodies
DK1287832T3 (da) 1995-04-24 2006-05-01 Genentech Inc Anvendelse af antagonist af leukæmiinhiberende faktor
KR101077001B1 (ko) 1999-01-15 2011-10-26 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
US6399857B1 (en) * 1999-09-22 2002-06-04 Paradigm Genetics, Inc. Modified nucleotide sequence encoding a LexA DNA binding domain optimized for arabidopsis species
US7084257B2 (en) 2001-10-05 2006-08-01 Amgen Inc. Fully human antibody Fab fragments with human interferon-gamma neutralizing activity
AU2003218456A1 (en) 2002-04-01 2003-10-20 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that specifically bind to gmad
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
EP1612558A1 (en) 2004-06-30 2006-01-04 Academisch Ziekenhuis Leiden Method for detecting gluten
BRPI0610248A2 (pt) 2005-04-25 2010-06-08 Pfizer anticorpos contra miostatina, composição farmacêutica compreendendo os mesmos, linhas celulares que os produzem , moléculas de ácido nucleico codificantes dos mesmos bem como seus usos
US8768629B2 (en) 2009-02-11 2014-07-01 Caris Mpi, Inc. Molecular profiling of tumors
WO2008043052A2 (en) 2006-10-04 2008-04-10 The Scripps Research Institute Human antibodies neutralizing human metapneumovirus
CN101440128A (zh) 2007-11-21 2009-05-27 中国人民解放军第二军医大学 人脑胶质瘤中差异表达的蛋白及其用途
DK2356270T3 (da) * 2008-11-07 2016-12-12 Fabrus Llc Kombinatoriske antistofbiblioteker og anvendelser deraf
ES2363358B1 (es) 2009-04-03 2012-06-21 FUNDACIÓ INSTITUT DE RECERCA HOSPITAL UNIVERSITARI VALL D'HEBRON (Titular al Agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades asociadas con una proliferación celular indeseable.
US8221753B2 (en) * 2009-09-30 2012-07-17 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Endoglin antibodies
CN102869775A (zh) 2009-09-30 2013-01-09 哈佛大学校长及研究员协会 通过调节自噬抑制基因产物调节自噬的方法
WO2011057144A2 (en) 2009-11-06 2011-05-12 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Methods for modulating lif activity, treating immune disorders and diseases, and stimulatings immune responses
CN102167742B (zh) 2010-02-25 2014-05-14 上海百迈博制药有限公司 一种全人源抗her2单克隆抗体、其制备方法及用途
EP2371860A1 (en) 2010-04-05 2011-10-05 Fundació Privada Institut d'Investigació Oncològica de Vall d'Hebron Antibody recognising human leukemia inhibitory factor (LIF) and use of anti-LIF antibodies in the treatment of diseases associated with unwanted cell proliferation
US9790268B2 (en) 2012-09-12 2017-10-17 Genzyme Corporation Fc containing polypeptides with altered glycosylation and reduced effector function
IL289918B2 (en) 2013-03-11 2025-07-01 Genzyme Corp Site-specific antibody-drug conjugation through glycoengineering
US20140314741A1 (en) 2013-04-18 2014-10-23 Developmen Center For Biotechnology Human Antibody against Interleukin-20 and Treatment for Inflammatory Diseases
WO2015025786A1 (ja) 2013-08-20 2015-02-26 独立行政法人科学技術振興機構 ヒト抗体κ型軽鎖複合体含有組成物及びその製造方法
US20150056195A1 (en) 2013-08-23 2015-02-26 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Compositions and methods for inihibiting tumorigenicity of senescent cancer cells induced by chemotherapy
US20160237158A1 (en) 2013-09-23 2016-08-18 Institut National De La Santé Et Da La Recherche Médicale (Inserm) Methods and Compositions for Targeting Tumor Microenvironment and for preventing Metastasis
CA2926428C (en) 2013-10-09 2023-08-29 Research Development Foundation Monoclonal olfml-3 antibodies and uses thereof
TWI486172B (zh) 2013-11-08 2015-06-01 長庚大學 鼻咽癌治療的醫藥
EP3092253B1 (en) 2014-01-10 2021-03-17 AnaptysBio, Inc. Antibodies directed against interleukin-33 (il-33)
US10995148B2 (en) 2014-03-19 2021-05-04 Genzyme Corporation Site-specific glycoengineering of targeting moieties
EP3191129A4 (en) 2014-09-10 2018-03-14 The Regents of The University of California TARGETING K-RAS-MEDIATED SIGNALING PATHWAYS AND MALIGNANCY BY ANTI-hLIF ANTIBODIES
EP3173483A1 (en) 2015-11-27 2017-05-31 Fundació Privada Institut d'Investigació Oncològica de Vall-Hebron Agents for the treatment of diseases associated with undesired cell proliferation
SI3555132T1 (sl) * 2016-12-19 2024-04-30 Medimmune Limited Protitelesa proti LIF in njihove uporabe
US10583191B2 (en) * 2016-12-19 2020-03-10 Mosaic Biomedicals Slu Antibodies against LIF and uses thereof
CN112585164A (zh) * 2018-04-12 2021-03-30 免疫医疗有限公司 用于治疗癌症的、lif抑制剂和pd-1轴抑制剂的组合
AU2019291305B2 (en) * 2018-06-18 2024-03-21 Fundacio Privada Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats Methods for improving response to anti-LIF antibody treatment in individuals with cancer

Also Published As

Publication number Publication date
ZA201904533B (en) 2024-08-28
KR20240149987A (ko) 2024-10-15
JP7459173B2 (ja) 2024-04-01
NZ755004A (en) 2025-08-29
IL267450B (en) 2022-07-01
ES2971126T3 (es) 2024-06-03
CN111868086B (zh) 2024-07-16
JP2022130632A (ja) 2022-09-06
PL3555132T3 (pl) 2024-04-22
CA3047528A1 (en) 2018-06-28
HRP20240195T8 (hr) 2024-05-24
AU2017381585A1 (en) 2019-07-18
US20230042095A1 (en) 2023-02-09
SMT202400065T1 (it) 2024-03-13
US11390670B2 (en) 2022-07-19
BR112019012691A2 (pt) 2019-11-19
CN111868086A (zh) 2020-10-30
LT3555132T (lt) 2024-02-26
SA519402119B1 (ar) 2023-02-19
KR20190122652A (ko) 2019-10-30
HRP20240195T1 (hr) 2024-04-26
FI3555132T3 (fi) 2024-02-08
EP4321219A2 (en) 2024-02-14
KR102716931B1 (ko) 2024-10-15
EP4321219A3 (en) 2024-05-15
JP2024075682A (ja) 2024-06-04
EP3555132B1 (en) 2023-11-15
IL294088B2 (en) 2023-10-01
KR102784394B1 (ko) 2025-03-19
MX2024003178A (es) 2024-03-25
US20190352389A1 (en) 2019-11-21
CL2021000950A1 (es) 2021-11-26
JP7100056B2 (ja) 2022-07-12
JP2020512388A (ja) 2020-04-23
AU2017381585B2 (en) 2025-02-13
SI3555132T1 (sl) 2024-04-30
IL267450A (en) 2019-08-29
EP3555132A1 (en) 2019-10-23
HUE065241T2 (hu) 2024-05-28
IL294088A (en) 2022-08-01
IL294088B1 (en) 2023-06-01
CN118652335A (zh) 2024-09-17
DK3555132T3 (da) 2024-02-05
CL2019001717A1 (es) 2020-02-28
KR102599557B1 (ko) 2023-11-07
KR20230125099A (ko) 2023-08-28
MX2019007376A (es) 2020-02-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10583191B2 (en) Antibodies against LIF and uses thereof
JP7459173B2 (ja) Ｌｉｆに対する抗体及びその使用
JP7570929B2 (ja) Ｌｉｆを定量化する方法及びその使用
JP7603772B2 (ja) 癌の治療に使用するためのｌｉｆ阻害剤と白金系抗悪性腫瘍剤の組み合わせ
HK40107591A (en) Antibodies against lif and uses thereof
HK40016422A (en) Antibodies against lif and uses thereof
HK40016422B (en) Antibodies against lif and uses thereof
EA045781B1 (ru) Антитела к lif и их применения
HK40040276B (zh) 抗lif抗体及其用途
BR122024020696A2 (pt) Anticorpo recombinante que se liga ao fator inibidor de leucemia e composição farmacêutica compreendendo o referido anticorpo
HK40040276A (en) Antibodies against lif and uses thereof