ES2561102T3

ES2561102T3 - Agentes de unión a Notch1 y procedimientos de uso de los mismos

Info

Publication number: ES2561102T3
Application number: ES11733378.1T
Authority: ES
Inventors: Edward Thein Htun Van Der Horst
Original assignee: Oncomed Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Mereo Biopharma 5 Inc
Priority date: 2010-01-13
Filing date: 2011-01-13
Publication date: 2016-02-24
Anticipated expiration: 2031-01-13
Also published as: MX2012008085A; HK1181316A1; US20120213786A1; EP2523682B1; CN102958534B; EP2523682A4; WO2011088215A2; EP2523682A2; AU2011205316A1; AU2011205316B2; US8834875B2; CN102958534A; WO2011088215A3

Abstract

Un anticuerpo que se une específicamente a una región proximal a la membrana de no unión al ligando de un dominio extracelular de Notch1 humano para su uso en el tratamiento de un cáncer hematológico, en el que el cáncer hematológico es leucemia mielógena aguda, linfoma de Hodgkin, mieloma múltiple o leucemia linfoblástica aguda de células T; y en el que el anticuerpo comprende: una CDR1 de cadena pesada que contiene RGYWIE (SEC ID N.º 15); una CDR2 de cadena pesada que contiene QILPGTGRTNYNEKFKG (SEC ID N.º16); una CDR3 de cadena pesada que contiene FDGNYGYYAMDY (SEC ID Nº. 17); una CDR1 de cadena ligera que contiene RSSTGAVTTSNYAN (SEC ID N.º 18); una CDR2 de cadena ligera que contiene GTNNRAP (SEC ID N.º 19); y una CDR3 de cadena ligera que contiene ALWYSNHWVFGGGTKL (SEC ID N.º 20).

Description

DESCRIPCION

Agentes de union a Notchl y procedimientos de uso de los mismos 5 REFERENCIAS CRUZADAS CON SOLICITUDES RELACIONADAS

[0001] Esta solicitud reivindica el beneficio prioritario de la solicitud provisional de EE. UU. con N.° 61/294.762, presentada el 13 de enero de 2010 y la solicitud provisional de EE. UU, con N.° 61/410.651, presentada el 5 de noviembre de 2010.

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CAMPO DE LA INVENCION

[0002] El campo de esta invencion en general se refiere a anticuerpos y otros agentes que se unen a Notch1 humano, as! como a procedimientos de uso de anticuerpos y otros agentes para el tratamiento de enfermedades

15 hematologicas, especialmente enfermedades asociadas con la via Notch.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

[0003] La via de senalizacion Notch es un sistema de transduccion de senales conservado universalmente. Esta 20 implicada en la determinacion del destino celular durante el desarrollo, lo que incluye la formation del patron

embrionario y el mantenimiento del tejido posembrionario. Asimismo, la senalizacion Notch se ha identificado como un factor crltico en el mantenimiento de las celulas madre hematopoyeticas.

[0004] La familia de receptores Notch de mamlferos incluye cuatro miembros: Notch1, Notch2, Notch3 y Notch4. 25 Los receptores Notch son protelnas grandes transmembrana de tipo I con un unico dominio transmembrana y varios

motivos estructurales conservados. El dominio extracelular contiene un numero variable de repeticiones similares al factor de crecimiento epidermico (EGF) implicadas en la union del ligando y tres repeticiones LIN-12/Notch ricas en cistelna (LNR) implicadas en la heterodimerizacion de Notch. El dominio intracelular contiene un motivo RAM23 implicado en la union de protelnas de senalizacion posteriores a Notch, 7 repeticiones cdc10/anquirina implicadas 30 tambien en mediar en la senalizacion posterior y un dominio PEST implicado en la degradation de la protelna Notch.

[0005] Los ligandos de Notch en mamlferos son Delta-like 1 (DLL1), Delta-like 3 (DLL3), Delta-like 4 (DLL4), Jagged1 y Jagged2. De forma similar a los receptores Notch, los ligandos de Notch son protelnas transmembrana de tipo I con varios motivos estructurales conservados. Los motivos extracelulares comunes a todos los ligandos Notch

35 incluyen un dominio Delta/Serrate/Lag-2 (DSL) unico implicado en la union al receptor, as! como un numero variable de repeticiones similares a EGF que pueden estar implicadas en la estabilizacion de la union al receptor. El dominio extracelular de las protelnas Jagged contiene una region rica en cistelnas con homologla parcial con el dominio de tipo C del factor von Willebrand que esta probablemente implicado en la dimerization del ligando. Este motivo no esta presente en los miembros de la familia DLL (Leong y col., 2006, Blood, 107:2223-2233).

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[0006] El dominio extracelular de un receptor Notch interacciona con el dominio extracelular de un ligando de Notch, normalmente en celulas adyacentes, dando lugar a dos escisiones proteollticas del receptor Notch. Una escision extracelular esta mediada por una proteasa ADAM (desintegrina y metalopeptidasa) y una segunda escision dentro del dominio transmembrana esta mediada por el complejo gamma-secretasa gamma. Esta ultima escision

45 genera el dominio intracelular Notch (ICD), el cual se transloca al nucleo donde activa la familia CBF1/Supresor of Hairless, Lag-2 (CSL) de factores de transcription como los principales efectores posteriores en la via de senalizacion para incrementar la transcripcion de factores de transcripcion helice-bucle-helice basicos nucleares de la familia Hairy/Enhancer of Split (HES) (Artavanis y col., 1999, Science, 284:770; Brennan y Brown, 2003, Breast Cancer Res., 5:69; Iso y col., 2003, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 23:543).

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[0007] La via Notch se ha asociado a la patogenesis de tumores y canceres tanto hematologicos como solidos. Se ha demostrado que numerosas funciones celulares y senales microambientales asociadas con la oncogenesis estan moduladas por la via de senalizacion Notch, incluyendo la proliferation celular, la apoptosis, la adhesion y la angiogenesis (Leong y col., 2006, Blood, 107:2223-2233). Asimismo, se ha demostrado que los receptores Notch y/o

55 ligandos de Notch desempenan posibles funciones oncogenicas en varios canceres humanos, como la leucemia mielogena aguda, la leucemia linfocltica cronica de celulas B, el linfoma de Hodgkin, el mieloma multiple, la leucemia linfoblastica aguda de celulas T, el cancer de cerebro, el cancer de mama, el cancer de cuello uterino, el cancer de colon, el cancer de pulmon, el cancer pancreatico, el cancer de prostata y el cancer de piel (Leong y col., 2006, Blood, 107:2223-2233).

[0008] El gen Notchl en humanos fue el primero que se identified en un subgrupo de leucemias linfoblasticas agudas de celulas T como un locus translocado que daba lugar a la activacion de la via Notch (Ellisen y col., 1991, Cell, 66:649-61). Mas recientemente se ha demostrado que mas del 50% de las leucemias linfoblasticas agudas de

5 celulas T tienen mutaciones de activacion que afectan al dominio de heterodimerizacion extracelular y/o al dominio PEST c-terminal de Notchl (Weng y col., 2004, Science, 306:269-271; Pear y Aster, 2004, Curr. Opin. Hematol., 11:416-33). La activacion constitutiva de la senalizacion de Notch1 en celulas T en modelos murinos genera, de forma similar, linfomas de celulas T, lo que sugiere una funcion causal (Robey y col., 1996, Cell, 87:483-92; Pear y al., 1996, J. Exp. Med., 183:2283-91; Yan y col., 2001, Blood, 98:3793-9; Bellavia y col., 2000, EMBO J., 19:3337-48). Notch2 10 activado por retrovirus se ha asociado al linfoma tlmico inducido por el virus de la leucemia felina (Rohn y col., 1996, J. Virology, 70:8071-8080). Se ha demostrado que las muestras de leucemia linfoblastica aguda de celulas T humana expresan Notch3 y su gen diana HES-1, que no se expresaba en celulas T perifericas normales ni en leucemias no de celulas T (Bellavia y col., 2002, PNAS, 99:3788-3793). De este modo, la via Notch se ha identificado como una posible diana para la intervencion terapeutica en varios canceres hematologicos.

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[0009] Se han descrito anticuerpos anti-Notch y su posible uso como agentes terapeuticos antineoplasicos. Veanse por ejemplo las publicaciones de solicitudes de patente de EE. UU. N.° 2008/0131434 y 2009/0081238. Veanse tambien las publicaciones internacionales N.° WO 2008/057144, WO 2008/076960, WO 2008/150525, WO 2010/005566 y WO 2010/005567. El documento WO2008/057144 describe el dominio LNR-HD de Notch1 y Notch2

20 humanos y el documento WO 2008/150525 describe anticuerpos anti-Notch NRR.

RESUMEN DE LA INVENCION

[0010] La invencion se define en las reivindicaciones. Aquellos aspectos/casos de la presente descripcion que 25 constituyen la invencion se definen en las reivindicaciones.

RESUMEN DE LA DESCRIPCION

[0011] La presente descripcion proporciona agentes de union (p. ej., anticuerpos) que se unen especlficamente a 30 una region proximal a la membrana de no union al ligando del dominio extracelular de un receptor Notch1 y

composiciones, tales como composiciones farmaceuticas, que comprenden estos agentes. La descripcion ademas proporciona procedimientos de uso de los agentes de union en el tratamiento de un cancer hematologico mediante la administracion de los agentes a un sujeto que los necesita. En algunos casos, los procedimientos comprenden la inhibition del crecimiento de las celulas cancerosas. En algunos casos, el cancer es un cancer hematologico como 35 una leucemia o un linfoma. En algunos casos, el cancer hematologico es una leucemia mielogena aguda, un linfoma de Hodgkin, un mieloma multiple o una leucemia linfoblastica aguda de celulas T. En algunos casos, el cancer hematologico es leucemia linfoblastica aguda de celulas T. En algunos casos, el procedimiento para tratar canceres hematologicos comprende la inhibicion de la senalizacion de Notch1. En algunos casos, el procedimiento para tratar canceres hematologicos comprende la inhibicion de la activacion de Notch1. En algunos casos, el procedimiento para 40 tratar el cancer o inhibir el crecimiento de celulas cancerosas comprende dirigirse a las celulas madre cancerosas con los agentes de union. En algunos casos, las celulas madre cancerosas comprenden celulas iniciadoras de la leucemia. En algunos casos, los procedimientos comprenden la reduction de la frecuencia de celulas madre cancerosas en un sujeto, la reduccion del numero de celulas madre cancerosas en un sujeto, la reduccion de la oncogenicidad de un cancer y/o la reduccion de la oncogenicidad de un cancer mediante la reduccion del numero o frecuencia de celulas 45 madre cancerosas en el sujeto.

[0012] En un aspecto, la descripcion proporciona procedimientos de tratamiento de un cancer hematologico en un sujeto que comprende la administracion al sujeto de una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente de union que se une especlficamente a una region proximal a la membrana de no union al ligando de un dominio extracelular de

50 Notch1 humano. En algunos casos, el cancer hematologico es una leucemia mielogena aguda, un linfoma de Hodgkin, un mieloma multiple o una leucemia linfoblastica aguda de celulas T. En algunos casos, el cancer hematologico es leucemia linfoblastica aguda de celulas T. En algunos casos, el agente de union es un anticuerpo. En algunos casos, el agente de union es un anticuerpo que comprende (a) una CDR1 de cadena pesada que contiene RGYWIE (SEC ID N.° 15), una CDR2 de cadena pesada que contiene QILPGTGRTNYNEKFKG (Sec ID N.° 16) y/o una CDR3 de cadena 55 pesada que contiene FDGNYGYYaMdY (SEC ID N.° 17); y/o (b) una CDR1 de cadena ligera que contiene RSSTGAVTTSNYAN (SEC ID N.° 18), una CDR2 de cadena ligera que contiene GTNNRAP (SEC ID N.° 19) y/o una CDR3 de cadena ligera que contiene ALWYSNHWVFGGGTKL (SEC ID N.° 20).

[0013] En determinados casos, la descripcion proporciona procedimientos de tratamiento de un cancer hematologico

en un sujeto que comprende la administracion al sujeto de una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente de union (p. ej., un anticuerpo) que se une especlficamente a una region proximal a la membrana de no union al ligando de un dominio extracelular de Notchl humano, en el que el agente de union comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que contiene RGYWIE (SEC ID N.° 15) o una variante de la misma que contiene 1, 2, 3 o 4 sustituciones de 5 aminoacidos; (b) una CDR2 de cadena pesada que contiene QILPGTGRTNYNEKFKG (SEC ID N.° 16) o una variante de la misma que contiene 1,2, 3 o 4 sustituciones de aminoacidos; y/o (c) una CDR3 de cadena pesada que contiene FDGNYGYYAMDY (SEC ID N.° 17) o una variante de la misma que contiene 1,2, 3 o 4 sustituciones de aminoacidos. En determinados casos, el agente de union (p. ej., un anticuerpo) comprende (o ademas comprende) (a) una CDR1 de cadena ligera que contiene RSSTGAVTTSNYAN (SEC ID N.° 18) o una variante de la misma que contiene 1, 2, 3 10 o 4 sustituciones de aminoacidos; (b) una CDR2 de cadena ligera que contiene GTNNRAP (SEC ID N.° 19) o una variante de la misma que contiene 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoacidos; y/o (c) una CDR3 de cadena ligera que contiene ALWYSNHWVFGGGTKL (SEC ID N.° 20) o una variante de la misma que contiene 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoacidos. En algunos casos, las sustituciones de aminoacidos son sustituciones conservadoras de aminoacidos. En algunos casos, el cancer hematologico es una leucemia mielogena aguda, un linfoma de Hodgkin, 15 un mieloma multiple o una leucemia linfoblastica aguda de celulas T. En algunos casos, el cancer hematologico es leucemia linfoblastica aguda de celulas T.

[0014] En determinados casos, la descripcion proporciona procedimientos de tratamiento de un cancer hematologico en un sujeto que comprende la administracion al sujeto de una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente de

20 union (p. ej., un anticuerpo) que se une especlficamente a una region proximal a la membrana de no union al ligando de un dominio extracelular de Notch1 humano, en el que el agente de union comprende: (a) una region variable de cadena pesada que tiene al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 98% o el 100% de identidad de secuencia con la SEC ID N.° 14 o SEC ID N.° 24; y/o (b) una region variable de cadena ligera que tiene al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, al 25 menos aproximadamente el 98% o el 100% de identidad de secuencia con la SEC ID N.° 8, SEC ID N.° 28 o SEC ID N.° 32. En algunos casos, el agente de union (p. ej., un anticuerpo) comprende una region variable de cadena pesada que contiene la SEC ID N.° 14 y una region variable de cadena ligera que contiene la SEC ID N.° 8. En algunos casos, el agente de union (p. ej., un anticuerpo) comprende una region variable de cadena pesada que contiene la SEC ID N.° 24 y una region variable de cadena ligera que contiene la SEC ID N.° 28. En algunos casos, el agente de union (p. 30 ej., un anticuerpo) comprende una region variable de cadena pesada que contiene la SEC ID N.° 24 y una region variable de cadena ligera que contiene la SEC ID N.° 32. En algunos casos, el agente de union a Notch1 es el anticuerpo 52M51. En algunos casos, el agente de union a Notch1 es una forma humanizada del anticuerpo 52M51.

[0015] En determinados casos, el agente de union a Notch1 comprende las cadenas pesadas y las cadenas ligeras 35 del anticuerpo 52M51 (con o sin la secuencia senal/llder). En determinados casos, el agente de union a Notch1 es el

anticuerpo 52M51. En algunos casos, Notch1 es una forma humanizada del anticuerpo 52M51. La llnea celular del hibridoma que produce el anticuerpo 52M51 se deposito en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, EE. UU., segun las condiciones del Tratado de Budapest, el 7 de agosto de 2008 y se le asigno el numero de designacion PTA-9405. En algunos casos, el anticuerpo es una version humanizada del 40 anticuerpo 52M51, 52M51H4L3, tal y como codifica el polinucleotido depositado en la ATCC, segun las condiciones del Tratado de Budapest, el 15 de octubre de 2008 y se le asigno el numero de designacion PTA-9549.

[0016] En determinados casos de cada uno de los aspectos o casos mencionados anteriormente, as! como otros aspectos y/o casos descritos en otra parte de este documento, el agente de union (p. ej., un anticuerpo) se une

45 especlficamente a una region proximal a la membrana de no union al ligando del dominio extracelular de un receptor Notch1 en el que la region proximal a la membrana de no union al ligando de un receptor Notch1 contiene aproximadamente del aminoacido 1427 al aminoacido 1732 de un receptor Notch1 humano. En algunos casos, la region proximal a la membrana de un receptor Notch1 contiene al menos una parte de la SEC ID N.° 2. En algunos casos, la region proximal a la membrana de un receptor Notch1 contiene la SEC ID N.° 2. En determinados casos, el 50 agente de union (p. ej., un anticuerpo) se une especlficamente a una region proximal a la membrana de no union al ligando de un dominio extracelular de al menos un receptor Notch adicional.

[0017] En algunos casos, la descripcion proporciona un anticuerpo que se une especlficamente al mismo epitope o a un epitope de Notch1 solapante con el epitope al cual se une el anticuerpo 52M51.

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[0018] En otro aspecto, la descripcion proporciona procedimientos de tratamiento de un cancer hematologico en un sujeto que comprenden la administracion al sujeto de una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente de union (p ej., un anticuerpo) que se une especlficamente a una region proximal a la membrana de no union al ligando de un dominio extracelular de Notch1 humano, en el que el agente de union se une al mismo epitope de la region proximal

a la membrana que el epitope al cual se une el anticuerpo 52M51 producido por la llnea celular del hibridoma depositado como Deposito de Patente ATCC PTA-9405. En algunos casos, el agente de union compite con el anticuerpo 52M51 por la union especlfica a la region proximal a la membrana de Notchl. En algunos casos, el agente de union compite con el anticuerpo 52M51 por la union especlfica a la region proximal a la membrana de no union al 5 ligando de Notchl que contiene al menos una parte de la SEC ID N.° 2. En algunos casos, el agente de union compite con el anticuerpo 52M51 por la union especlfica a un epitope dentro de la region proximal a la membrana de no union al ligando de Notch1 que contiene la SEC ID N.° 2. En algunos casos, el cancer hematologico es una leucemia mielogena aguda, un linfoma de Hodgkin, un mieloma multiple o una leucemia linfoblastica aguda de celulas T. En algunos casos, el cancer hematologico es leucemia linfoblastica aguda de celulas T.

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[0019] En otro aspecto, la descripcion proporciona procedimientos de inhibicion del crecimiento de un cancer hematologico que comprenden poner en contacto las celulas cancerosas con una cantidad eficaz de un agente de union (p. ej., un anticuerpo) que se une especificamente a una region proximal a la membrana de no union al ligando de un dominio extracelular del receptor Notch1 humano y en el que el anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de cadena

15 pesada que contiene RGYWIE (SEC ID N.° 15), una CDR2 de cadena pesada que contiene QILPGTGRTNYNEKFKG (SEC ID N.° 16) y una CDR3 de cadena pesada que contiene FDGNYGYYAMDY (SEC ID N.° 17); y/o (b) una CDR1 de cadena ligera que contiene RSSTgAvTTSnYaN (SEC ID N.° 18), una CdR2 de cadena ligera que contiene GTNNRAP(SEC ID N.° 19) y una CDR3 de cadena ligera que contiene ALWYSNHWVFGGGTKL (SEC ID N.° 20). En algunos casos, el cancer hematologico es una leucemia mielogena aguda, un linfoma de Hodgkin, un mieloma multiple 20 o una leucemia linfoblastica aguda de celulas T. En algunos casos, el cancer hematologico es leucemia linfoblastica aguda de celulas T.

[0020] En determinados casos de cada uno de los aspectos o casos mencionados anteriormente, asi como otros aspectos y/o casos descritos en otra parte de este documento, el agente de union es un anticuerpo. En algunos casos,

25 el anticuerpo es un anticuerpo recombinante. En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo quimerico. En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En determinados casos, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. En determinados casos, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es monovalente, monoespecifico, bivalente, biespecifico o multiespecifico. En determinados casos, el anticuerpo se conjuga con un 30 resto citotoxico. En determinados casos, el anticuerpo esta aislado. Aun en casos adicionales, el anticuerpo esta sustancialmente puro.

[0021] Tambien se proporcionan composiciones farmaceuticas que comprenden agentes de union (p. ej., anticuerpos) que se unen especificamente a una region proximal a la membrana de no union al ligando de un dominio

35 extracelular del receptor Notch1 humano para su uso en procedimientos de tratamiento de los canceres hematologicos descritos en este documento. En determinados casos, las composiciones farmaceuticas ademas comprenden un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

[0022] En determinados casos de cada uno de los aspectos o casos mencionados anteriormente, as! como otros 40 aspectos y/o casos descritos en otra parte de este documento, el agente de union (p. ej., un anticuerpo) es un agonista

de Notch1. En algunos casos, el agente de union inhibe la senalizacion de Notch1. En algunos casos, el agente de union inhibe la activacion de Notch1. En algunos casos, el agente de union inhibe la actividad Notch1. En algunos casos, el agente de union inhibe la actividad de un Notch1 activado constitutivamente. En algunos casos, el agente de union inhibe la escision de la region proximal a la membrana. En determinados casos, el agente de union inhibe la 45 escision de Notch1 (p. ej., la escision en el sitio S2 por una metaloproteasa) y/o inhibe la activacion de Notch1 mediante la union al ligando. En algunos casos, el agente de union inhibe la liberation o formation del dominio intracelular (ICD) de Notch1. En determinados casos, el agente de union inhibe el crecimiento de las celulas del cancer hematologico. En algunos casos, el agente de union inhibe el crecimiento de las celulas de leucemia linfoblastica aguda de celulas T.

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[0023] En un aspecto adicional, la descripcion proporciona un procedimiento para inhibir la actividad de Notch1 en una celula de cancer hematologico, que comprende poner en contacto la celula cancerosa con una cantidad eficaz de cualquier de los anticuerpos o polipeptidos descritos en los aspectos y casos mencionados anteriormente, as! como otros aspectos/casos descritos en cualquier otra parte de este documento. En determinados casos, la celula de cancer

55 hematologico es una celula de leucemia linfoblastica aguda de celulas T.

[0024] En otro aspecto, la descripcion proporciona un procedimiento para inhibir el crecimiento de un cancer hematologico en un sujeto, comprendiendo el procedimiento la administration al sujeto de una cantidad terapeuticamente eficaz de cualquiera de los anticuerpos o polipeptidos descritos en los aspectos y casos

mencionados anteriormente, as! como otros aspectos/casos descritos en cualquier otra parte de este documento. En algunos casos, el cancer hematologico comprende celulas madre cancerosas. En algunos casos, el cancer hematologico comprende celulas iniciadoras de leucemia. En algunos casos, los procedimientos comprenden dirigirse a las celulas madre cancerosas con los agentes de union y los anticuerpos descritos en este documento. En 5 determinados casos, los procedimientos comprenden la reduccion de la frecuencia de celulas madre cancerosas en un cancer hematologico, la reduccion del numero de celulas iniciadoras de leucemia en un cancer hematologico, la reduccion del numero de celulas madre cancerosas en un cancer hematologico, la reduccion de la oncogenicidad de un cancer hematologico y/o la reduccion de la oncogenicidad de un cancer hematologico mediante la reduccion del numero o frecuencia de celulas madre cancerosas en el cancer hematologico. En algunos casos, los procedimientos

10 comprenden la inhibicion de la actividad de Notchl y/o la inhibicion del crecimiento de un cancer hematologico. En determinados casos, el cancer hematologico es una leucemia mielogena aguda, un linfoma de Hodgkin, un mieloma multiple o una leucemia linfoblastica aguda de celulas T. En determinados casos, la celula de cancer hematologico es una celula de leucemia linfoblastica aguda de celulas T.

15 [0025] En un aspecto adicional, la descripcion proporciona un procedimiento para inhibir el crecimiento de un cancer hematologico en un sujeto, comprendiendo el procedimiento la administracion al sujeto de una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo que se une especlficamente a una region proximal a la membrana de no union al ligando de un dominio extracelular de Notchl humano, en el que la union inhibe la actividad de Notchl. En algunos casos, los procedimientos comprenden la inhibicion de la actividad de un Notchl activado constitutivamente.

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[0026] En un aspecto mas, la descripcion proporciona un procedimiento para reducir la oncogenicidad de un cancer hematologico que comprende celulas madre cancerosas mediante la reduccion de la frecuencia o el numero de celulas madre cancerosas en el cancer, comprendiendo el procedimiento poner en contacto las celulas cancerosas con una cantidad eficaz de un agente de union o un anticuerpo, como se describe en este documento, que inhibe la actividad

25 de Notchl.

[0027] En determinados casos de cada uno de los aspectos y/o casos mencionados anteriormente, as! como otros aspectos o casos descritos en este documento, los procedimientos ademas comprenden la administracion al sujeto de al menos un agente terapeutico adicional. En determinados casos de cada uno de los aspectos o casos

30 mencionados anteriormente, as! como otros aspectos y/o casos descritos en cualquier otra parte de este documento, el anticuerpo o polipeptido se administra a un sujeto en combination con un tratamiento adicional para un cancer hematologico. En determinados casos, el tratamiento adicional para un cancer hematologico comprende radioterapia, quimioterapia y/o un anticuerpo terapeutico adicional.

35 [0028] La descripcion ademas proporciona un procedimiento para tratar un cancer hematologico en un humano, en el que el cancer hematologico que comprende celulas madre cancerosas no se caracteriza por la sobreexpresion de uno o mas receptores Notch por las celulas madre cancerosas, que comprende la administracion al humano de una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente de union o un anticuerpo que se une a una region proximal a la membrana del dominio extracelular de Notchl y bloquea la activation de Notchl por el ligando. En algunos casos, los

40 agentes de union o los anticuerpos como se describen en este documento se administran para tratar un cancer hematologico, en el que el cancer hematologico se caracteriza por un Notchl activado constitutivamente.

[0029] La descripcion ademas proporciona un procedimiento para tratar un cancer hematologico en un humano que comprende la administracion al humano de cantidades terapeuticamente eficaces de (a) un primer anticuerpo que se

45 une a Notchl e inhibe el crecimiento de celulas madre cancerosas que sobreexpresan Notchl; y (b) un segundo anticuerpo que se une a un receptor Notch y bloquea la activacion mediada por el ligando de un receptor Notch. En algunos casos, el procedimiento comprende la administracion al humano de cantidades terapeuticamente eficaces de (a) un primer anticuerpo que se une a Notchl e inhibe el crecimiento de celulas madre cancerosas que sobreexpresan Notchl; y (b) un segundo anticuerpo que se une a VEGF.

50

[0030] En casos adicionales, la descripcion proporciona artlculos de fabrication para su uso (entre otras cosas) en los procedimientos anteriores. Por ejemplo, la descripcion proporciona un artlculo de fabricacion que comprende un recipiente y una composition contenida en el, en el que la composition contiene un anticuerpo que se une a Notch y ademas contiene un prospecto indicando que la composicion se puede usar para tratar un cancer que comprende

55 celulas madre cancerosas. En algunos casos, la descripcion proporciona un artlculo de fabricacion que comprende un recipiente y una composicion contenida en el, en el que la composicion contiene un anticuerpo que se une a Notch y, ademas, contiene un prospecto indicando que la composicion se puede usar para tratar un cancer que comprende celulas madre cancerosas que expresan uno o mas receptores Notch.

[0031] En ciertos casos, la descripcion se refiere adicionalmente a un artlcuio de fabricacion que comprende un recipiente y una composicion contenida en el, en el que la composicion comprende un anticuerpo que se une a un receptor Notch y bloquea la activacion mediada por ligando de un receptor Notch y, ademas, comprende un prospecto indicando que la composicion se puede usar para tratar el cancer, en el que el cancer comprende celulas madre

5 cancerosas que no se caracterizan por la sobreexpresion del receptor Notch.

[0032] En determinados casos, se proporciona un artlculo de fabricacion que comprende (a) un primer recipiente con una composicion contenida en el, en el que la composicion comprende un primer anticuerpo que se une a un receptor Notch e inhibe el crecimiento de celulas cancerosas que comprenden celulas madre cancerosas que

10 sobreexpresan Notch; y (b) un segundo recipiente con una composicion contenida en el, en el que la composicion comprende un segundo anticuerpo que se une a Notch y bloquea la activacion mediada por ligando de un receptor Notch.

[0033] En algunos casos, se proporciona un artlculo de fabricacion adicional que comprende un recipiente y una 15 composicion contenida en el, en el que la composicion comprende un anticuerpo que se une a Notch y bloquea la

activacion mediada por ligando de un receptor Notch y, ademas, comprende un prospecto indicando que la composicion se puede usar para tratar un cancer seleccionado a partir del grupo compuesto por leucemia mielogena aguda, linfoma de Hodgkin, mieloma multiple y leucemia linfoblastica aguda de celulas T.

20 [0034] La descripcion proporciona adicionalmente: un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado) que se une a Notch y bloquea la activacion mediada por ligando de un receptor Notch; una composicion que comprende el anticuerpo y un vehlculo farmaceuticamente aceptable; y un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo conjugado con un agente citotoxico.

25 [0035] En un aspecto, la descripcion proporciona un polinucleotido aislado que codifica cualquiera de los anticuerpos o polipeptidos de los aspectos o casos mencionados anteriormente, as! como otros aspectos y/o casos descritos en cualquier otra parte de este documento. En algunos casos, la descripcion proporciona un vector que comprende el polinucleotido. En algunos casos, una celula huesped contiene el polinucleotido o el vector. En otros casos, un proceso para producir el anticuerpo comprende el cultivo de una celula huesped que contiene el polinucleotido de modo que 30 se expresa el polinucleotido y, opcionalmente, comprende ademas la recuperacion del anticuerpo a partir del cultivo de la celula huesped (p. ej., a partir del medio de cultivo de la celula huesped).

[0036] Asimismo, la descripcion proporciona un polinucleotido aislado que codifica un anticuerpo humanizado o humano como se describe en los casos o aspectos mencionados anteriormente, as! como se describe en cualquier

35 otra parte de este documento; un vector que contiene el polinucleotido; una celula huesped que contiene el polinucleotido o el vector; as! como un proceso de production del anticuerpo que comprende el cultivo de una celula huesped que contiene el polinucleotido de modo que el polinucleotido se exprese y, opcionalmente, comprende ademas la recuperacion del anticuerpo a partir del cultivo de la celula huesped (p. ej., a partir del medio de cultivo de la celula huesped).

40

[0037] La descripcion ademas se refiere a un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que se une a Notch conjugado con una o mas moleculas de caliquemicina y el uso de dichos conjugados para tratar un cancer que expresa Notch, por ejemplo, un cancer en el que las celulas madre cancerosas sobreexpresan Notch.

45 [0038] Cuando los aspectos o casos de la descripcion se describen en terminos de un grupo Markush u otras agrupaciones alternativas, incluyendo, pero sin limitaciones, los grupos de alternativas separadas por «y/o» u «o», la presente descripcion abarca no solo el grupo completo indicado como un todo, sino tambien cada uno de los miembros del grupo individualmente y todos los posibles subgrupos del grupo principal y ademas el grupo principal con la ausencia de uno o mas de los miembros del grupo. La presente descripcion tambien contempla la exclusion expllcita 50 de uno o mas de los miembros del grupo en la descripcion reivindicada. Por ejemplo, expresiones como «X y/o Y» abarcan «X» individualmente, «Y» individualmente, as! como «X» e «Y» juntos.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

55 [0039]

Figura 1: Identification de anticuerpos dirigidos a la region proximal a la membrana de Notch que inhibe la serialization de Notch. (A) Esquema del receptor Notch y region del antlgeno 52M. El antlgeno 52M incluye la zona del receptor Notchl sujeto a escision por furina durante la maduracion del receptor y escision por proteasas ADAM (desintegrina y

metaloproteasa) tras la union del ligando. El procesamiento posterior con gamma-secretasa causa la liberacion del dominio intracelular (ICD) de Notch que activa la transcripcion genica en el nucleo. (B) Niveles de luciferasa (eje Y) derivados de celulas Notch1-HeLa cultivadas en presencia de un ligando soluble de Notch (hDLL4-Fc) y anticuerpos frente al receptor Notchl. Los resultados de celulas no transfectadas (NT) con y sin hDLL4-Fc se muestran en la parte 5 izquierda mas alejada del eje X. Los anticuerpos anti-52M Notchl se muestran a lo largo del eje X y se comparan con DBZ, un inhibidor de la gamma-secretasa de Notch, y 21M18, un anticuerpo anti-DLL4. Los anticuerpos anti-Notchl 52M51,52M63, 52M74 y 52M80 inhiblan todos significativamente la senalizacion de Notch como indica la disminucion de la actividad luciferasa. (C) Niveles de luciferasa (eje Y) derivados de celulas Notch1-HeLa cultivadas en presencia de un ligando soluble de Notch (hDLL4-Fc) y anticuerpos frente al receptor Notch1. Los resultados de celulas no 10 transfectadas (NT) con y sin hDLL4-Fc se muestran en la parte izquierda mas alejada del eje X. El anticuerpo derivado del hibridoma murino 52M51 y de la variante humanizada 52M51H4L3 se muestran a lo largo del eje X en diferentes concentraciones como se indica. Tanto el anticuerpo murino parental 52M51 como la variante humanizada inhiben significativamente la senalizacion de Notch como indica la disminucion en la actividad luciferasa. (D) Analisis mediante inmunotransferencia de la formacion del ICD despues de la estimulacion mediada por ligando de celulas HeLa que 15 expresan Notch1. En ausencia del ligando DLL4 (-DLL4) se produce un ICD mlnimo, pero su formacion es estimulada por la presencia de DLL4. Los anticuerpos 52M51, 52M63, 52M74 y 52M80 redujeron la formacion de ICD a niveles de fondo a pesar de la presencia de DLL4.

Figura 2: Evaluacion de los anticuerpos anti-Notch1 en un modelo de xenoinjerto de leucemia. Los ratones NOD/SCID 20 se precondicionaron con 10 x 106 celulas mononucleares de medula osea tras la irradiacion. Varios dlas despues, se inyectaron a los ratones 5 x 106 celulas de leucemia linfoblastica aguda de celulas T primarias. Cinco semanas despues se inyectaron las celulas de leucemia linfoblastica aguda de celulas T (T-ALL), se sacrificaron los ratones y se analizaron los injertos de T-ALL en las celulas aisladas de los bazos mediante citometrla de flujo. El analisis mediante citometrla de flujo se realizo usando anticuerpos monoclonales especlficos frente a CD45 y cD34 humanos. 25 La fraccion de celulas con tincion positiva para los anticuerpos se determino usando el software Tree Star FlowJo. La significacion se calculo mediante la prueba t de Student usando el software GraphPad Prism. Se indica el porcentaje de celulas CD45+ y CD34+ humanas en los bazos de los ratones. *** Representa una significacion de p < 0,001 en comparacion con el anticuerpo control LZ-1.

30 Figura 3: Evaluacion in vitro de la inhibicion de Notch1 en celulas HPB-ALL. Las celulas HPB-ALL se dispusieron en placas de 96 pocillos y se trataron con el anticuerpo 52M51 anti-Notch1 (-■-), un anticuerpo control (-▼-) o con dibenzacepina (DBZ) (-•-). Los datos se muestras como unidades relativas de luz (URL).

Figura 4: Evaluacion in vitro de la inhibicion de Notch1 sobre la proliferacion de celulas HPB-ALL. Las celulas HPB- 35 ALL se incubaron en presencia de 12 pM de DBZ, 100 pg/ml de anticuerpo 52M51 anti-Notch1 o 100 pg/ml de anticuerpo control. Se analizo en las celulas la protelna K167 mediante citometrla de flujo.

Figura 5: Evaluacion in vitro de la inhibicion de Notch1 sobre la formacion del ICD. Las celulas HPB-ALL se incubaron en presencia de 12 pM de DBZ, 100 pg/ml de anticuerpo 52M51 anti-Notch1 o 100 pg/ml de anticuerpo control. Los 40 extractos de protelna celular total se separaron mediante PAGE en presencia de SDS y se evaluaron mediante inmunotransferencia usando un anticuerpo especlfico para el ICD de Notch1.

Figura 6: Inhibicion del crecimiento tumoral de HPB-ALL in vivo por el anticuerpo anti-Notch1. Las celulas HPB-ALL se inyectaron por via subcutanea en ratones NOD/SCID. Los ratones se trataron con anticuerpo control (-■-) o con el 45 anticuerpo 52M51 anti-Notch1 (-▼-). Los datos se muestran como volumen tumoral (mm3) frente a los dlas postratamiento. Los anticuerpos se administraron a 15 mg/kg una vez a la semana.

Figura 7: Evaluacion de los anticuerpos anti-Notch1 en un modelo de xenoinjerto de leucemia diseminada. Se inyectaron las celulas HPB-ALL en la vena de la cola de ratones NOD/SCID. Un dla despues de la inyeccion, los 50 animales fueron tratados con un anticuerpo control o con el anticuerpo anti-Notch1 52M51. Aproximadamente 5 semanas despues los ratones fueron sacrificados y se analizo la presencia de celulas HPB-ALL en bazo, sangre periferica y medula osea.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA DESCRIPCION 55

[0040] La presente descripcion proporciona agentes novedosos que incluyen, pero sin limitaciones, polipeptidos tales como anticuerpos que se unen a uno o mas receptores Notch humanos, especialmente Notch1. Los agentes de union a Notch incluyen antagonistas de Notch1 humano. Tambien se proporcionan polipeptidos y polinucleotidos relacionados, composiciones que comprenden agentes de union a Notch y procedimientos para obtener los agentes

de union a Notch. Adicionalmente se proporcionan procedimientos para usar los agentes nuevos de union a Notch, tales como procedimientos de inhibicion del crecimiento de canceres hematologicos y/o de tratamiento de canceres hematologicos.

5 [0041] La presente description ademas identifica moleculas (p. ej., anticuerpos) que se unen especlficamente a una region proximal a la membrana de no union al ligando del dominio extracelular de Notchl humano y que inhiben el crecimiento tumoral in vivo. La region de union a ligando de Notch, que es necesaria y suficiente para la union del ligando, se ha identificado como las repeticiones 11 y 12 de EGF, lo que sugiere que esta region del receptor Notch es importante en la serialization y oncogenesis de Notch (Rebay y col., 1991, Cell, 67:687; Lei y col., 2003, Dev., 10 130:6411; Hambleton y col., 2004, Structure, 12:2173). Inesperadamente, se ha encontrado que los anticuerpos que se unen fuera del dominio de union al ligando del dominio extracelular del receptor Notch humano inhiben el crecimiento de celulas tumorales in vivo (vease la publication de patente de EE. UU. N.° 2008/0131434 y la publication internacional N.° WO 2010/005567). De este modo, los anticuerpos que se unen fuera del dominio de union al ligando del dominio extracelular de uno o mas receptores Notch humanos (Notch1, Notch2, Notch3 y Notch4) tienen valor 15 como posibles agentes terapeuticos contra el cancer.

[0042] Se han identificado anticuerpos monoclonales que se unen especlficamente a la region proximal a la membrana del dominio extracelular de Notch1, lo que incluye el anticuerpo monoclonal 52M51 (ejemplo 1). Se han generado anticuerpos 52M51 humanizados (ejemplo 2). Varios anticuerpos, incluidos 52M51 y la variante humanizada 20 de 52M51, inhiben la senalizacion de Notch1 inducida por ligando (ejemplo 3 y figura 1B y C), a pesar de la union a Notch1 en una region fuera de la region de union a ligando. Se ha demostrado la capacidad de varios de los anticuerpos para inhibir la formation del dominio intracelular (ICD) de Notch (ejemplos 3 y 7; figuras 1D y 5). Se ha demostrado que 52M51 inhibe el crecimiento de tumores solidos de celulas HPB-ALL (ejemplo 8 y figura 6). Se ha demostrado que 52M51 reduce la viabilidad y proliferation celular de celulas de leucemia humana in vitro (ejemplos 5 y 6; figuras 3 y 25 4). Se ha encontrado que 52M51 inhibe el injerto de celulas leucemicas in vivo en dos modelos de xenoinjerto (ejemplos 4 y 9; figuras 2 y 7).

I. Definiciones

30 [0043] Para facilitar el entendimiento de la presente descripcion, a continuation se definen varios terminos y expresiones.

[0044] El termino «antagonista» segun se usa en este documento se refiere a cualquier molecula que bloquea, inhibe o neutraliza parcial o completamente la actividad de la via de Notch. El termino «antagonista» se usa en este

35 documento para incluir a cualquier molecula que bloquea, inhibe o neutraliza parcial o completamente la expresion de un receptor Notch. Moleculas antagonistas adecuadas incluyen especlficamente anticuerpos o fragmentos de anticuerpo antagonistas.

[0045] El termino «anticuerpo» segun se usa en este documento se refiere a una molecula de inmunoglobulina que 40 reconoce y se une especlficamente a una diana, como por ejemplo una protelna, polipeptido, peptido, hidrato de

carbono, polinucleotido, llpido o combinaciones de los anteriores, a traves de al menos un sitio de reconocimiento de antlgeno dentro de la region variable de la molecula de inmunoglobulina. Segun se usa en este documento, el termino abarca anticuerpos policlonales intactos, anticuerpos monoclonales intactos, fragmentos de anticuerpos (como fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv), anticuerpos Fv de cadena sencilla (scFv), anticuerpos multiespeclficos como 45 anticuerpos biespeclficos generados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, anticuerpos monoespeclficos, anticuerpos monovalentes, anticuerpos quimericos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, protelnas de fusion que contienen una portion del determinante antigenico de un anticuerpo y cualquier otra molecula de inmunoglobulina modificada que contiene un sitio de reconocimiento de antlgeno siempre que los anticuerpos exhiban la actividad biologica deseada. Un anticuerpo puede ser de cualquiera de las cinco clases principales de 50 inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, o subclases (isotipos) de las mismas (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2), segun la identidad de los dominios constantes de su cadena pesada denominados alfa, delta, epsilon, gamma y mu, respectivamente. Las diferentes clases de inmunoglobulinas tienen estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales diferentes y bien conocidas. Los anticuerpos pueden estar tal cual o conjugados con otras moleculas, incluyendo, pero sin limitaciones, toxinas y radioisotopos.

55

[0046] El termino «fragmento de anticuerpo» se refiere a una porcion de un anticuerpo intacto y a las regiones variables determinantes antigenicas de un anticuerpo intacto. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpo se incluyen, pero sin limitaciones, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, anticuerpos lineales, anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos multiespeclficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

[0047] El termino «region variable» de un anticuerpo se refiere a la region variable de la cadena ligera del anticuerpo o a la region variable de la cadena pesada del anticuerpo, sola o en combinacion. Las regiones variables de la cadena pesada y ligera constan cada una de cuatro regiones armazon (FR, del ingles framework region) conectadas por tres

5 regiones determinantes de complementariedad (CDR), conocidas tambien como «regiones hipervariables». Las CDR de cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad gracias a las regiones armazon y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formacion del sitio de union al antlgeno de los anticuerpos. Se conocen al menos dos tecnicas para la determinacion de los CDR: (1) una estrategia basada en la variabilidad de secuencia cruzada entre especies (es decir, Kabat y col., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., National Institutes of Health, 10 Bethesda Md.) y (2) una estrategia basada en estudios cristalograficos de complejos antlgeno-anticuerpo (Al-Lazikani y col., 1997, J. Molec. Biol., 273:927-948). Ademas, a veces se utilizan en la tecnica combinaciones de estas dos estrategias para determinar las CDR.

[0048] El termino «anticuerpo monoclonal» segun se usa en este documento se refiere a una poblacion homogenea 15 de anticuerpos implicada en el reconocimiento altamente especlfico y union de un determinante antigenico o epitope

unico. Esto contrasta con los anticuerpos policlonales que normalmente incluyen una mezcla de diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes antigenicos. El termino «anticuerpo monoclonal» abarca anticuerpos monoclonales intactos y de longitud completa, as! como fragmentos antigenicos (p. ej., Fab, Fab', F(ab')2 y Fv), anticuerpos de cadena sencilla (scFv), protelnas de fusion que contienen una porcion de anticuerpo y cualquier otra 20 molecula de inmunoglobulina modificada que contenga un sitio de reconocimiento de antlgeno. Ademas, «anticuerpo monoclonal» se refiere a tales anticuerpos fabricados mediante cualquiera de las tecnicas, incluyendo, pero sin limitaciones, la produccion de hibridomas, la seleccion de fagos, la expresion de moleculas recombinantes y animales transgenicos.

25 [0049] El termino «anticuerpo humanizado» segun se usa en este documento se refiere a formas de anticuerpos no humanos (p. ej., murinos) que son cadenas de inmunoglobulinas especlficas, inmunoglobulinas quimericas o fragmentos de las mismas que contienen secuencias no humanas mlnimas.

[0050] El termino «anticuerpo humano» segun se usa en este documento se refiere a un anticuerpo producido por 30 un humano o un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoacidos que corresponde a un anticuerpo producido por

un humano hecho usando cualquiera de los metodos conocidos en la tecnica. Esta definicion de anticuerpo humano incluye anticuerpos intactos o de longitud completa, fragmentos de los mismos y/o anticuerpos que contienen al menos un polipeptido de cadena pesada y/o cadena ligera humana, por ejemplo, un anticuerpo que contiene polipeptidos de cadena ligera murina y cadena pesada humana.

35

[0051] El termino «anticuerpo quimerico» segun se usa en este documento se refiere a un anticuerpo en el que la secuencia de aminoacidos de la molecula de inmunoglobulina deriva de dos o mas especies. Normalmente, la region variable de las cadenas ligeras y pesadas se corresponde con la region variable de anticuerpos derivados de una especie de mamlfero (p. ej., raton, rata, conejo, etc.) con la especificidad, afinidad y/o capacidad deseadas, mientras

40 que las regiones constantes son homologas a las secuencias de anticuerpos derivados de otra especie (generalmente humano) para evitar activar una respuesta inmune en esa especie.

[0052] Los terminos «epitope» y «determinante antigenico» se usan indistintamente en este documento y se refieren a la porcion de un antlgeno capaz de ser reconocida por un anticuerpo en particular y unirse especificamente a este.

45 Cuando el antlgeno es un polipeptido, los epitopes pueden estar formados tanto por aminoacidos contiguos como por aminoacidos no contiguos yuxtapuestos debido al plegamiento terciario de una proteina. Los epitopes formados por aminoacidos contiguos (denominados tambien epitopes lineales) normalmente se conservan tras la desnaturalizacion de la proteina, mientras que los epitopes formados por el plegamiento terciario (denominados tambien epitopes conformacionales) normalmente se pierden tras la desnaturalizacion de la proteina. Tipicamente, un epitope incluye 50 al menos 3, y normalmente mas, al menos 5, u 8-10 aminoacidos en una conformacion espacial exclusiva.

[0053] Las expresiones «se une selectivamente» o «se une especificamente» significan que un agente de union o un anticuerpo reacciona o se asocia con mas frecuencia, mas rapidamente, con mayor duracion, con mayor afinidad o con alguna combinacion de lo anterior al epitope, proteina o molecula diana que con sustancias alternativas, incluidas

55 protelnas no relacionadas. En determinados casos, «se une especificamente» significa, por ejemplo, que un anticuerpo se une a una proteina con una Kd de aproximadamente 0,1 mM o menos, pero mas normalmente menos de aproximadamente 1 pM. En determinados casos, «se une especificamente» significa que un anticuerpo se une a una diana en ocasiones con una Kd de al menos aproximadamente 0,1 pM o menos y en otras ocasiones de al menos 0,01 pM o menos. Debido a la identidad de secuencia entre protelnas homologas de diferentes especies, la union

especlfica puede incluir un anticuerpo que reconoce una protelna (p. ej., un receptor Notch) en mas de una especie. Del mismo modo, debido a la homologla dentro de determinadas regiones de las secuencias polipeptldicas de diferentes protelnas, la union especlfica puede incluir un anticuerpo (u otro polipeptido o agente de union) que reconoce mas de una protelna (p. ej., Notchl humano y Notch2 humano). Se entiende que, en determinados casos, 5 un anticuerpo o resto de union que se une especlficamente a una primera diana puede o no unirse especlficamente a una segunda diana. As! pues, «union especlfica» no requiere necesariamente (aunque puede incluir) la union exclusiva, es decir, la union a una unica diana. De este modo, un anticuerpo puede, en determinados casos, unirse especlficamente a mas de una diana (p. ej., Notchl humano, Notch2 humano, Notch3 humano y/o Notch de raton). En determinados casos, se puede unir a multiples dianas por el mismo sitio de union a antlgeno del anticuerpo. Por 10 ejemplo, un anticuerpo puede, en determinados casos, contener dos sitios de union a antlgeno identicos, cada uno de los cuales se une especlficamente al mismo epitope en dos o mas proteinas (p. ej., Notchl y Notch2). En determinados casos alternativos, un anticuerpo puede ser biespecifico y contener al menos dos sitios de union a antlgeno con especificidades diferentes. A modo de ejemplo no limitante, un anticuerpo biespecifico puede contener un unico sitio de union a antlgeno que reconoce un epitope en una unica proteina (p. ej., Notchl humano) y ademas contiene un 15 segundo sitio de union a antlgeno diferente que reconoce un epitope diferente en una segunda proteina (p. ej., Notch2 humano). Generalmente, pero no necesariamente, la referencia a la union significa union especlfica.

[0054] Los terminos «polipeptido», «oligopeptido», «peptido» y «proteina» se utilizan indistintamente en este documento y se refieren a polimeros de aminoacidos de cualquier longitud. El polimero puede ser lineal o ramificado,

20 puede comprender aminoacidos modificados y puede estar interrumpido por restos no aminoacidicos. Los terminos tambien abarcan un polimero de aminoacidos que se ha modificado de forma natural o mediante intervencion; por ejemplo, formacion de puente disulfuro, glucosilacion, lipidacion, acetilacion, fosforilacion o cualquier otra manipulacion o modificacion, como conjugacion con un componente de marcaje. En la definicion tambien se incluyen, por ejemplo, polipeptidos que contienen uno o mas analogos de un aminoacido (incluyendo, por ejemplo, aminoacidos no 25 naturales), as! como otras modificaciones conocidas en la tecnica. Se entiende que, puesto que los polipeptidos de esta descripcion estan basados en aminoacidos, en determinados casos, los polipeptidos pueden presentarse como cadenas sencillas o cadenas asociadas.

[0055] Los terminos «polinucleotido» y «acido nucleico» se usan en este documento indistintamente y se refieren a 30 polimeros de nucleotidos de cualquier longitud e incluyen ADN y ARN. Los nucleotidos pueden ser

desoxirribonucleotidos, ribonucleotidos, nucleotidos modificados o bases y/o sus analogos o cualquier sustrato que pueda incorporarse a un polimero mediante la ADN o ARN polimerasa.

[0056] Se pueden identificar «condiciones muy rigurosas» mediante: (1) el empleo de baja fuerza ionica y alta 35 temperatura para el lavado, por ejemplo, cloruro sodico 0,015 M/citrato sodico 0,0015 M/dodecil sulfato sodico al 0,1%

a 50°C; (2) el empleo de un agente desnaturalizante durante la hibridacion, como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albumina de suero bovino al 0,1 %/Ficoll al 0,1 %/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampon fosfato sodico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sodico 750 mM, citrato sodico 75 mM a 42°C; o (3) el empleo de formamida al 50%, SSC*5 (NaCl 0,75 M, citrato sodico 0,075 M), fosfato sodico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sodico al 0,1%, solucion de 40 Denhardt *5, ADN de esperma de salmon sonicado (50 pg/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42°C, con lavados a 42°C en SSC*0,2 (cloruro sodico/citrato sodico) y formamida al 50% a 55°C, seguido de un lavado en condiciones muy rigurosas compuesto por SSC*0,1 que contiene EDTA a 55°C.

[0057] Los terminos «identico» o porcentaje de «identidad» en el contexto de dos o mas acidos nucleicos o 45 polipeptidos, se refieren a dos o mas secuencias o subsecuencias que son la misma o tienen un porcentaje

especificado de restos de nucleotidos o aminoacidos que son los mismos, cuando se comparan y alinean (introduciendo huecos, si es necesario) para una correspondencia maxima, sin considerar ninguna sustitucion conservadora de aminoacidos como parte de la identidad de secuencia. El porcentaje de identidad se puede determinar usando software o algoritmos de comparacion de secuencias o mediante inspection visual. Son bien 50 conocidos en la tecnica varios algoritmos y software que se pueden usar para obtener alineamientos de secuencias de aminoacidos o nucleotidos. Esto incluye, pero sin limitaciones, BLAST, ALIGN, Megalign, BestFit, GCG Wisconsin Package, etc. En algunos casos, dos acidos nucleicos o polipeptidos de la descripcion son sustancialmente identicos, lo que significa que tiene al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90% y, en algunos casos, al menos el 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de restos de nucleotidos o aminoacidos, 55 cuando se compara y alinea para la maxima correspondencia, determinado usando un algoritmo de comparacion de secuencias o mediante inspeccion visual. En algunos casos, existe identidad sobre una region de las secuencias que es de al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 40-60 restos de longitud o cualquier valor entero entre ellos. En algunos casos, existe identidad en una region mas larga de 60-80 restos, como al menos aproximadamente 90-100 restos y, en algunos casos, las secuencias son sustancialmente

identicas en la longitud completa de las secuencias que se estan comparando, como la region codificadora de una secuencia de nucleotidos.

[0058] Una «sustitucion de aminoacidos conservadora» es aquella en la que un resto de aminoacido se sustituye 5 por otro resto de aminoacido con una cadena lateral similar. Se han definido en la tecnica las familias de restos de

aminoacidos con cadenas laterales similares, que incluyen cadenas laterales basicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (p. ej., acido aspartico, acido glutamico), cadenas laterales polares sin carga (p. ej., glicina, asparragina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cistelna), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadenas laterales ramificadas beta (p. ej., treonina, valina, 10 isoleucina) y cadenas laterales aromaticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Por ejemplo, la sustitucion de una fenilalanina por una tirosina es una sustitucion conservadora. Preferiblemente, las sustituciones conservadoras en las secuencias de los polipeptidos y anticuerpos de la descripcion no anulan la union del polipeptido o anticuerpo que contiene la secuencia de aminoacidos, al antlgeno o antlgenos, es decir, la protelna o protelnas Notch a las cuales se une el polipeptido o el anticuerpo. Se conocen bien en la tecnica los procedimientos de identificacion de 15 sustituciones conservadoras de nucleotidos o aminoacidos que no eliminan la union a antlgeno.

[0059] El termino «vector» segun se usa en este documento significa una construccion que es capaz de administrar y, normalmente expresar, uno o mas genes o secuencias de interes en una celula huesped. Ejemplos de vectores incluyen, pero sin limitaciones, vectores virales, vectores de expresion de ADN o ARN desnudo, vectores de plasmidos,

20 cosmidos o fagos, vectores de expresion de ADN o ARN asociados con agentes de condensacion cationicos y vectores de expresion de ADN o ARN encapsulados en liposomas.

[0060] Un polipeptido, anticuerpo, polinucleotido, vector, celula o composicion que esta «aislado» es un polipeptido, anticuerpo, polinucleotido, vector, celula o composicion que esta en una forma que no se encuentra en la naturaleza.

25 Entre los polipeptidos, anticuerpos, polinucleotidos, vectores, celulas o composiciones aislados se incluyen aquellos que se han purificado hasta un grado tal que ya no es una forma en la que se encuentran en la naturaleza. En algunos casos, un anticuerpo, polinucleotido, vector, celula o composicion que esta aislado esta sustancialmente puro.

[0061] El termino «sustancialmente puro» segun se usa en este documento se refiere al material que esta al menos 30 el 50% puro (es decir, libre de contaminantes), al menos el 90% puro, al menos el 95% puro, al menos el 98% puro o

al menos el 99% puro.

[0062] Los terminos «cancer» y «canceroso» segun se usan en este documento se refieren o describen la afeccion fisiologica en mamlferos en la que una poblacion de celulas se caracteriza por el crecimiento celular no regulado. Entre

35 los ejemplos de cancer se incluyen, pero sin limitaciones, carcinoma, blastoma, sarcoma y canceres hematologicos como linfoma y leucemia.

[0063] Los terminos «tumor» y «neoplasia» segun se usan en este documento se refieren a cualquier masa de tejido que es el resultado del crecimiento o proliferacion celular excesivo, ya sea benigno (no canceroso) o maligno

40 (canceroso), incluidas lesiones precancerosas.

[0064] Los terminos «trastorno proliferativo» y «enfermedad proliferativa» se refieren a trastornos asociados con una proliferacion celular anomala como el cancer.

45 [0065] El termino «metastasis» segun se usa en este documento se refiere al proceso por el cual un cancer se disemina o transfiere desde el sitio de origen a otras regiones del organismo con el desarrollo de una lesion cancerosa similar en la nueva localizacion. Una celula «metastasica» o «metastatizante» es aquella que pierde los contactos de adherencia con las celulas vecinas y migra a traves del torrente sangulneo o la linfa desde el sitio primario de la enfermedad para invadir estructuras corporales vecinas.

50

[0066] Los terminos «celula madre cancerosa», «CMC» y «celula madre tumoral» se usan indistintamente en este documento y se refieren a celulas procedentes de un cancer que: 1) tienen capacidad proliferativa extensa; 2) son capaces de divisiones celulares asimetricas para generar una o mas clases de progenie diferenciada con reducido potencial proliferativo o de desarrollo y 3) son capaces de divisiones celulares simetricas para la autorrenovacion o 55 automantenimiento. Estas propiedades confieren a las celulas madre cancerosas la capacidad de formar o establecer un tumor o cancer tras el trasplante en serie en un huesped inmunocomprometido (p. ej., un raton) en comparacion con la mayorla de celulas tumorales que no pueden formar tumores. Las celulas madre cancerosas sufren autorrenovacion frente a diferenciacion de una forma caotica para formar tumores con tipos de celulas anomalos que pueden cambiar con el tiempo cuando se producen mutaciones. La «celula madre cancerosa» segun se usa en este

documento puede comprender celulas iniciadoras de leucemia.

[0067] Los terminos «celula cancerosa» y «celula tumoral» se refieren a la poblacion total de celulas derivadas de un cancer, tumor o lesion precancerosa, lo que incluye tanto celulas no oncogenas, que comprenden la masa de la 5 poblacion de celulas cancerosas, como celulas madre oncogenas (celulas madre cancerosas). Segun se usa en este documento, los terminos «celula cancerosa» o «celula tumoral» se modificaran por el termino «no oncogeno» cuando se refieran exclusivamente a aquellas celulas que carecen de la capacidad de renovarse y diferenciarse para distinguirlas de aquellas celulas tumorales procedentes de celulas madre cancerosas.

10 [0068] El termino «oncogeno» segun se usa en este documento se refiere a las caracterlsticas funcionales de una celula madre cancerosa que incluyen las propiedades de autorrenovacion (que dan lugar a celulas madre cancerosas oncogenas adicionales) y proliferacion para generar todas las demas celulas tumorales (que dan lugar a celulas tumorales diferenciadas y, por tanto, no oncogenas.

15 [0069] El termino «oncogenicidad» segun se usa en este documento de un tumor se refiere a la capacidad de una muestra aleatoria de celulas del tumor para formar tumores palpables tras el trasplante en serie en huespedes inmunocomprometidos (p. ej., ratones).

[0070] El termino «sujeto» se refiere a cualquier animal (p. ej., un mamlfero), incluyen, pero sin limitaciones, 20 humanos, primates no humanos, canidos, felinos, roedores y similares, que son receptores de un tratamiento en

particular. Normalmente, los terminos «sujeto» y «paciente» se usan indistintamente en este documento en referencia a un sujeto humano.

[0071] El termino «farmaceuticamente aceptable» significa aprobado o aprobable por una agencia reguladora del 25 gobierno Federal o Estatal o incluido en la Farmacopea de los eE. UU. o en otra farmacopea generalmente reconocida,

para su uso en animales incluido humanos.

[0072] Los terminos «excipiente, vehlculo o adyuvante farmaceuticamente aceptable» o «vehlculo farmaceuticamente aceptable» se refiere a un excipiente, vehlculo o adyuvante que puede administrarse a un sujeto,

30 junto con al menos un agente de union (p. ej., un anticuerpo) de la presente descripcion y que no destruye la actividad farmacologica del mismo ni es toxico cuando se administra en dosis suficientes para proporcionar un efecto terapeutico.

[0073] Los terminos «cantidad eficaz», «cantidad terapeuticamente eficaz» o «efecto terapeutico» se refieren a una 35 cantidad de un agente de union, un anticuerpo, un polipeptido, un polinucleotido, una molecula organica pequena u

otro farmaco eficaz para «tratar» una enfermedad o trastorno en un sujeto o mamlfero. En el caso de cancer, la cantidad terapeuticamente eficaz de un farmaco (p. ej., un anticuerpo) tiene un efecto terapeutico y como tal puede reducir el numero de celulas cancerosas; disminuir la oncogenicidad, frecuencia oncogena o capacidad oncogena; reducir el numero o frecuencia de celulas madre cancerosas; reducir el tamano del tumor; reducir la poblacion de 40 celulas cancerosas; inhibir o detener la infiltracion de celulas cancerosas dentro de organos perifericos que incluye, por ejemplo, la diseminacion del cancer dentro del tejido blando y del hueso; inhibir y detener la metastasis de celulas tumorales o cancerosas; inhibir y detener el crecimiento de celulas tumorales o cancerosas; aliviar hasta cierto grado uno o mas de los slntomas asociados con el cancer; reducir la morbilidad y mortalidad; mejorar la calidad de vida; o una combinacion de dichos efectos. Segun el grado en que el agente, por ejemplo un anticuerpo, previene el 45 crecimiento y/o mata las celulas cancerosas existentes, se puede denominar citostatico y/o citotoxico.

[0074] Los terminos «tratando», «tratamiento», «tratar», «aliviando» o «aliviar» se refieren a 1) medidas terapeuticas que curan, retardan o reducen los slntomas y/o detienen la progresion de una afeccion patologica o trastorno diagnosticado y 2) medidas profilacticas o preventivas que previenen o ralentizan el desarrollo de una afeccion

50 patologica o trastorno objetivo. Por tanto, aquellos que necesitan tratamiento son los que ya tienen el trastorno; aquellos propensos a tener el trastorno y aquellos en los que el trastorno se desea prevenir. En algunos casos, un sujeto es «tratado» con exito segun los procedimientos de la presente descripcion si el paciente muestra uno o mas de los siguientes efectos: una reduccion del numero o ausencia completa de celulas cancerosas; una reduction del tamano del tumor; una inhibition o ausencia de infiltracion de celulas cancerosas dentro de organos perifericos 55 incluyendo la diseminacion de las celulas cancerosas dentro del tejido blando o el hueso; una inhibicion o ausencia de metastasis de celulas tumorales o cancerosas; una inhibicion o ausencia de crecimiento del cancer; alivio de uno o mas slntomas asociados con el cancer especlfico; morbilidad y mortalidad reducidas; mejora de la calidad de vida; reduccion de la oncogenicidad; reduccion del numero o frecuencia de celulas madre cancerosas; o algunas combinaciones de efectos.

[0075] Segun se usa en la presente description y en las reivindicaciones, las formas singulares «un», «una» y «el», «la» incluyen las formas plurales salvo que el contexto dicte claramente lo contrario.

5 [0076] Se entiende que siempre que se describen casos en este documento con la expresion «que comprende» o «que contiene», tambien se proporcionan casos por lo demas analogos descritos en terminos de «que consta de» y/o «que consta esencialmente de».

[0077] El termino «y/o» segun se usa en un frase como «A y/o B» en este documento pretende incluir: tanto A como 10 B; A o B; A (solo) y B (solo). Del mismo modo, el termino «y/o» segun se usa en una frase como «A, B y/o C» pretende

abarcar cada uno de los siguientes casos: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo) y C (solo).

II. Agentes de union a Notchl 15

[0078] La presente descripcion proporciona agentes que se unen especlficamente a una region proximal a la membrana de no union al ligando del dominio extracelular de Notchl humano, composiciones que comprenden aquellos agentes de union y procedimientos para el uso de estos agentes de union para tratar canceres hematologicos. En particular, en determinados casos, la presente descripcion proporciona agentes, incluidos antagonistas que se

20 unen a Notchl y procedimientos para usar los agentes o antagonistas para inhibir el crecimiento del cancer y tratar el cancer u otras enfermedades en pacientes humanos. En determinados casos, los antagonistas son anticuerpos que se unen especlficamente a una region de no union al ligando del dominio extracelular de Notchl humano.

[0079] En un aspecto, la presente descripcion proporciona un agente de union que se une especlficamente a una 25 region proximal a la membrana de no union al ligando del dominio extracelular de Notchl humano. En algunos casos,

el agente de union es un anticuerpo. En algunos casos, el agente de union o anticuerpo se une a una region de Notchl humano que contiene aproximadamente del aminoacido 1427 al aminoacido 1732. En algunos casos, el agente de union o el anticuerpo se une a una region que contiene la SEC ID N.° 2. En algunos casos, el agente de union o el anticuerpo se une especlficamente a una region dentro de la SEC ID N.° 2. En algunos casos, el agente de union o el 30 anticuerpo se une especlficamente a un epitope dentro de una region que contiene la SEC ID N.° 2. En determinados casos, el agente de union o el anticuerpo que se une a Notchl tambien se une especlficamente a una region proximal a la membrana de no union al ligando del dominio extracelular de al menos un receptor Notch adicional. En algunas casos, el al menos un receptor Notch adicional es Notch2. En algunas casos, el al menos un receptor Notch adicional es Notch3. En algunas casos, el al menos un receptor Notch adicional es Notch4.

35

[0080] En determinados casos, el agente de union a Notchl es un polipeptido. En determinados casos, el polipeptido o el agente de union a Notchl es un anticuerpo. En determinados casos, el anticuerpo es un anticuerpo IgG. En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo IgG1. En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo IgG2. En determinados casos, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En determinados casos, el anticuerpo es un

40 anticuerpo humanizado. En determinados casos, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En determinados casos, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo.

[0081] En determinados casos, el agente de union a Notch1 (p. ej., un anticuerpo) se une a una region proximal a la membrana de no union al ligando del dominio extracelular de Notch1 humano con una constante de disociacion (Kd)

45 de aproximadamente 1 pM o menos, aproximadamente 100 nM o menos, aproximadamente 40 nM o meno, aproximadamente 20 nM o menos, aproximadamente 10 nM o menos o aproximadamente 1 nM o menos. En determinados casos, el agente de union a Notch1 o anticuerpo se une al Notch1 humano con una Kd de aproximadamente 40 nM o menos, aproximadamente 20 nM o menos, aproximadamente 10 nM o menos o aproximadamente 1 nM o menos. En algunos casos, la constante de disociacion del agente o anticuerpo anti-Notch1 50 es una constante de disociacion determinada usando una proteina de fusion Notch1 que contiene la region proximal del dominio extracelular de Notch1 inmovilizada en un chip Biacore.

[0082] Los agentes de union a Notch1 (p. ej., anticuerpos) de la presente descripcion se pueden usar en ensayos para la union especifica mediante cualquier procedimiento conocido en la tecnica. Los inmunoensayos que se pueden

55 usar incluyen, pero sin limitaciones, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos empleando tecnicas como el analisis con Biacore, analisis por FACS, inmunofluorescencia, inmunocitoquimica, analisis por inmunotransferencia, radioinmunoensayo, ELISA, inmunoensayo tipo «sandwich», ensayo de inmunoprecipitacion, reaction de precipitacion, reaccion de precipitina de difusion en gel, ensayo de inmunodifusion, ensayo de aglutinacion, ensayo de fijacion de complemento, ensayo inmunorradiometrico, inmunoensayo fluorescente e inmunoensayo con proteina A.

Estos ensayos son rutinarios y bien conocidos en la tecnica (vease, p. ej., Ausubel y col., Eds., 1994; Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley e Hijos, Inc., Nueva York).

[0083] En algunos casos, la union especlfica de un agente de union a Notchl (p. ej., un anticuerpo) a un Notchl 5 humano puede determinarse usando un ensayo de tipo ELISA. En algunos casos, un ensayo de tipo ELISA comprende

preparar el antlgeno Notchl, recubrir los pocillos de una placa de microvaloracion de 96 pocillos con el antlgeno, anadir a los pocillos el agente de union a Notchl o el anticuerpo conjugado con un compuesto detectable como un sustrato enzimatico (p. ej., peroxidasa de rabano picante o fosfatasa alcalina), incubar durante un periodo de tiempo y detectar la presencia del agente de union o anticuerpo. En algunos casos, el agente de union a Notchl o anticuerpo 10 no esta conjugado con un compuesto detectable, sino que en su lugar se anade al pocillo un anticuerpo secundario conjugado que reconoce el agente de union a Notchl o anticuerpo. En algunos casos, en lugar de recubrir el pocillo con el antlgeno Notchl, se puede recubrir el pocillo con el agente de union a Notchl o anticuerpo, se anade el antlgeno al pocillo recubierto y luego se anade un anticuerpo secundario conjugado con un compuesto detectable. Un experto en la materia conocera los parametros que pueden modificarse y/u optimizarse para aumentar la senal detectada, as! 15 como otras variaciones de los ELISA que se pueden usar (vease, p. ej., Ausubel y col, Eds., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol.1, John Wiley e Hijos, Inc., Nueva York en 11.2.1).

[0084] La afinidad de union de un anticuerpo u otro agente de union a Notch1 y la velocidad de asociacion- disociacion de una interaccion antlgeno-anticuerpo pueden determinarse mediante ensayos de union competitiva. En

20 algunos casos, un ensayo de union competitiva es un radioinmunensayo que comprende la incubacion de un antlgeno marcado (p. ej., antlgeno marcado con 3H o 121I), o un fragmento o variante del mismo, con el anticuerpo de interes en presencia de cantidades crecientes de antlgeno no marcado seguido por la deteccion del anticuerpo unido al antlgeno marcado. La afinidad del anticuerpo por el antlgeno y las velocidades de asociacion-disociacion pueden determinarse a partir de los datos del analisis de las graficas de Scatchard. En algunos casos se usa el analisis cinetico de Biacore 25 para determinar las afinidades de union y las velocidades de asociacion-disociacion de los anticuerpos o agentes que se unen a Notch (p. ej., Notch1 humano, Notch2 humano, Notch3 humano, Notch4 humano o Notch de raton). El analisis cinetico de Biacore comprende analizar la union y disociacion de los anticuerpos y sus antlgenos (p. ej., protelnas Notch1) que se han inmovilizado en la superficie de un chip Biacore. En algunos casos, los analisis cineticos de Biacore se pueden usar para estudiar la union de diferentes anticuerpos en ensayos cualitativos de union 30 competitiva a epitope.

[0085] En determinados casos, la descripcion proporciona un anticuerpo que se une especificamente a una region proximal a la membrana de no union al ligando del dominio extracelular de Notch1 humana, en el que el anticuerpo comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco y/o seis de los CDR del anticuerpo 52M51 (vease la tabla 1). En algunos

35 casos, el anticuerpo comprende uno o mas de las CDR de 52M51, dos o mas de las CDR de 52M51, tres o mas de las CDR de 52M51, cuatro o mas de las CDR de 52M51, cinco o mas de las CDR de 52M51, o las seis CDR de 52M51. En algunos casos, el anticuerpo comprende CDR con hasta cuatro (es decir, 0, 1, 2, 3 o 4) sustituciones de aminoacidos por CDR. En determinados casos, el o los CDR de la cadena pesada estan contenidos en la region variable de la cadena pesada. En determinados casos, el o los CDR de la cadena ligera estan contenidos en la region 40 variable de la cadena ligera.

Tabla 1

: 52M51

CDR1 de CP: RGYWIE (SEC ID N.° 15)

CDR2de CP: QILPGTGRTNYNEKFKG (SEC ID N.° 16)

CDR3de CP: FDGNYGYYAMDY (SEC ID N.° 17)

CDR1 de CL: RSSTGAVTTSNYAN (SEC ID N.° 18)

CDR2de CL: GTNNRAP (SEC ID N.° 19)

CDR3de CL

ALWYSNHWVFGGGTKL (SEC ID N.° 20)

[0086] En determinados casos, el agente de union es un anticuerpo que comprende (a) una CDR1 de cadena pesada que contiene RGYWIE (SEC ID N.° 15), una CDR2 de cadena pesada que contiene QILPGTGRTNYNEKFKG (SEC ID N.° 16) y/o una CDR3 de cadena pesada que contiene FDGNYGYyAmDY (SEC ID N.° 17) y/o (b) una CdRi de 5 cadena ligera que contiene RSSTGAVTTSNYAN (SEC ID N.° 18), una cDr2 de cadena ligera que contiene GTNNRAP(SEC ID N.° 19) y/o una CDR3 de cadena ligera que contiene ALWYSNHWVFGGGTKL (SEC ID N.° 20). En algunos casos, el anticuerpo comprende una region variable de cadena pesada que comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que contiene RGYWIE (SEC ID N.° 15) o una variante de la misma que contiene 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoacidos; (b) una CDR2 de cadena pesada que contiene QILPGTGRTNYNEKFKG (SEC ID N.° 10 16) o una variante de la misma que contiene 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoacidos; y/o (c) una CDR3 de cadena pesada que contiene FDGNYGYYAMDY (SEC ID N.° 17) o una variante de la misma que contiene 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoacidos. En otros casos, el anticuerpo comprende (o ademas comprende) una region variable de cadena ligera que comprende: (a) una CDR1 de cadena ligera que contiene RSSTGAVTTSNYAN (SEC ID N.° 18) o una variante de la misma que contiene 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoacidos; (b) una CDR2 de cadena ligera que 15 contiene GTNNRAP (SEC ID N.° 19) o una variante de la misma que contiene 1,2, 3 o 4 sustituciones de aminoacidos y/o (c) una CDR3 de cadena ligera que contiene ALWYSNHWVFGGGTKL (SEC ID N.° 20) o una variante de la misma que contiene 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoacidos. En algunos casos, las sustituciones de aminoacidos son sustituciones conservadoras de aminoacidos.

20 [0087] En algunos casos, el agente de union a Notch1 es un anticuerpo que se une especlficamente a una region proximal a la membrana de no union al ligando del dominio extracelular de Notch1 humano. En algunos casos, el anticuerpo comprende una region variable de cadena pesada que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la SEC ID N.° 14 y/o una region variable de cadena ligera que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la SEC ID N.° 8. En algunos casos, el anticuerpo comprende 25 una region variable de cadena pesada que tiene al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 97% o al menos aproximadamente el 99% de identidad de secuencia con la SEC ID N.° 14 y/o una region variable de cadena ligera que tiene al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 97% o al menos aproximadamente el 99% de identidad de secuencia con la SEC ID N.° 8. En algunos casos, el anticuerpo comprende una region variable de cadena pesada que tiene al menos aproximadamente el 95% de identidad de secuencia con la 30 SEC ID N.° 14 y/o una region variable de cadena ligera que tiene al menos aproximadamente el 95% de identidad de secuencia con la SEC ID N.° 8. En algunos casos, el anticuerpo comprende una region variable de cadena pesada que contiene la SEC ID N.° 14 y/o una region variable de cadena ligera que contiene la SEC ID N.° 8. En algunos casos, el anticuerpo comprende una region variable de cadena pesada que contiene la SEC ID N.° 14 y una region variable de cadena ligera que contiene la SEC ID N.° 8. En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal 35 o un fragmento de anticuerpo.

[0088] En algunos casos, el agente de union a Notch1 es un anticuerpo que se une especlficamente a una region proximal a la membrana de no union al ligando del dominio extracelular de Notch1 humano. En algunos casos, el anticuerpo comprende una region variable de cadena pesada que tiene al menos aproximadamente el 90% de

40 identidad de secuencia con la SEC ID N.° 24 y/o una region variable de cadena ligera que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la SEC ID N.° 28. En algunos casos, el anticuerpo comprende una region variable de cadena pesada que tiene al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 97% o al menos aproximadamente el 99% de identidad de secuencia con la SEC ID N.° 24 y/o una region variable de cadena ligera que tiene al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 97% o al menos 45 aproximadamente el 99% de identidad de secuencia con la SEC ID N.° 28. En algunos casos, el anticuerpo comprende una region variable de cadena pesada que tiene al menos aproximadamente el 95% de identidad de secuencia con la SEC ID N.° 24 y/o una region variable de cadena ligera que tiene al menos aproximadamente el 95% de identidad de secuencia con la SEC ID N.° 28. En algunos casos, el anticuerpo comprende una region variable de cadena pesada que contiene la SEC ID N.° 24 y/o una region variable de cadena ligera que contiene la SEC ID N.° 28. En algunos 50 casos, el anticuerpo comprende una region variable de cadena pesada que contiene la SEC ID N.° 24 y una region variable de cadena ligera que contiene la SEC ID N.° 28. En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo.

[0089] En algunos casos, el agente de union a Notch1 es un anticuerpo que se une especlficamente a una region 55 proximal a la membrana de no union al ligando del dominio extracelular de Notch1 humano. En algunos casos, el

anticuerpo comprende una region variable de cadena pesada que tiene al menos aproximadamente el 90% de

identidad de secuencia con la SEC ID N.° 24 y/o una region variable de cadena ligera que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la SEC ID N.° 32. En algunos casos, el anticuerpo comprende una region variable de cadena pesada que tiene al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 97% o al menos aproximadamente el 99% de identidad de secuencia con la SEC ID N.° 24 y/o una region variable de 5 cadena ligera que tiene al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 97% o al menos aproximadamente el 99% de identidad de secuencia con la SEC ID N.° 32. En algunos casos, el anticuerpo comprende una region variable de cadena pesada que tiene al menos aproximadamente el 95% de identidad de secuencia con la SEC ID N.° 24 y/o una region variable de cadena ligera que tiene al menos aproximadamente el 95% de identidad de secuencia con la SEC ID N.° 32. En algunos casos, el anticuerpo comprende una region variable de cadena pesada

10 que contiene la SEC ID N.° 24 y/o una region variable de cadena ligera que contiene la SEC ID N.° 32. En algunos casos, el anticuerpo comprende una region variable de cadena pesada que contiene la SEC ID N.° 24 y una region variable de cadena ligera que contiene la SEC ID N.° 32. En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo.

15 [0090] En algunos casos, el agente de union a Notchl es un anticuerpo, 52M51, producido por la llnea celular de hibridoma depositado en la ATCC, en las condiciones del Tratado de Budapest, el 7 de agosto de 2008 y con el numero asignado PTA-9405. En algunos casos, el anticuerpo es una version humanizada de 52M51. En algunos casos, el anticuerpo es una version humanizada de 52M51, «52M51H4L3», tal y como codifica el ADN depositado en la ATCC segun las condiciones del Tratado de Budapest el 15 de octubre de 2008 y con el numero asignado PTA-9549. En

20 algunos casos, el anticuerpo es una version humanizada de 52M51, «52M51 H4L4». En algunos casos, la descripcion proporciona un anticuerpo que se une al mismo epitope al cual se une el anticuerpo 52M51. En otros casos, la descripcion proporciona un anticuerpo que compite con cualquiera de los anticuerpos descritos en los casos y/o aspectos mencionados anteriormente, as! como otros aspectos/casos descritos en cualquier otra parte de este documento, por la union especlfica a una region proximal de membrana de no union al ligando del dominio extracelular

25 de Notch1 humano.

[0091] La descripcion proporciona una variedad de polipeptidos que incluyen, pero sin limitaciones, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos. En determinados casos, el polipeptido esta aislado. En determinados casos alternativos, el polipeptido esta sustancialmente puro.

30

[0092] En determinados casos, los polipeptidos de la presente descripcion pueden ser polipeptidos recombinantes, polipeptidos naturales o polipeptidos sinteticos que comprenden la secuencia de SEC ID N.° 8, SEC ID N.° 14, SEC Id N.° 24, SEC ID N.° 28 o Sec ID N.° 32 (con o sin las secuencias senal/llder). En algunos casos, los polipeptidos comprenden la cadena pesada y/o la cadena ligera proporcionada en la SEC ID N.° 10 y/o SEC ID N.° 4,

35 respectivamente (con o sin las secuencias senal/llder). En determinados casos, el polipeptido es un anticuerpo. En determinados casos, el polipeptido se une especlficamente a una region proximal a la membrana de no union al ligando del dominio extracelular de Notch1 humano. En determinados casos, el polipeptido comprende una secuencia variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N.° 8 y una secuencia variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N.° 14. En determinados casos, el polipeptido comprende una secuencia variable de cadena ligera que comprende

40 la SEC ID N.° 28 y una secuencia variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N.° 24. En determinados casos, el polipeptido comprende una secuencia variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N.° 32 y una secuencia variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N.° 24. En determinados casos, el polipeptido es un anticuerpo. En determinados casos, el polipeptido se une especlficamente a una region proximal a la membrana de no union al ligando del dominio extracelular de Notch1 humano.

45

[0093] Los polipeptidos de la presente descripcion incluyen los polipeptidos de SEC ID N.° 14, asi como los polipeptidos que tienen al menos el 90% de identidad de secuencia con los polipeptidos de SEC ID N.° 14 y al menos el 95% de identidad de secuencia con los polipeptidos de SEC ID N.° 14 y, aun en otros casos, el polipeptido que tiene al menos el 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con los polipeptidos de SEC ID N.° 14. Los polipeptidos

50 de la presente descripcion incluyen los polipeptidos de SEC ID N.° 8, asi como los polipeptidos que tienen al menos el 90% de identidad de secuencia con los polipeptidos de SEC ID N.° 8 y al menos el 95% de identidad de secuencia con los polipeptidos de SEC ID N.° 8 y, aun en otros casos, el polipeptido que tiene al menos el 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con los polipeptidos de SEC ID N.° 8.

55 [0094] Los polipeptidos de la presente descripcion incluyen los polipeptidos de SEC ID N.° 24, asi como los polipeptidos que tienen al menos el 90% de identidad de secuencia con los polipeptidos de SEC ID N.° 24 y al menos el 95% de identidad de secuencia con los polipeptidos de SEC ID N.° 24 y, aun en otros casos, el polipeptido que tiene al menos el 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con los polipeptidos de SEC ID N.° 24. Los polipeptidos de la presente descripcion incluyen los polipeptidos de SEC ID N.° 28, asi como los polipeptidos que tienen al menos

el 90% de identidad de secuencia con los polipeptidos de SEC ID N.° 28 y al menos el 95% de identidad de secuencia con los polipeptidos de SEC ID N.° 28 y, aun en otros casos, el polipeptido que tiene al menos el 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con los polipeptidos de SEC ID N.° 28. Los polipeptidos de la presente descripcion incluyen los polipeptidos de SEC ID N.° 32, as! como los polipeptidos que tienen al menos el 90% de identidad de 5 secuencia con los polipeptidos de SEC ID N.° 32 y al menos el 95% de identidad de secuencia con los polipeptidos de SEC ID N.° 32 y, aun en otros casos, el polipeptido que tiene al menos el 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con los polipeptidos de SEC ID N.° 32.

[0095] En determinados casos, el agente de union a Notchl (p. ej., un anticuerpo) se une a Notchl y modula su

10 actividad. En algunos casos, el agente de union a Notchl es un antagonista y modula la actividad de Notchl.

[0096] En determinados casos, el agente de union a Notchl (p. ej., un anticuerpo) es un antagonista de Notchl e inhibe la actividad de Notchl. En determinados casos, el agente de union a Notchl inhibe al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 50%,

15 al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 90% o aproximadamente el 100% de la actividad de la union de Notch1 humano. En algunos casos, el agente de union a Notch1 inhibe la actividad de un Notch1 activado constitutivamente. En algunos casos, el Notch1 activado constitutivamente se expresa en un cancer hematologico. En determinados casos, el Notch1 activado constitutivamente se expresa en una leucemia linfoblastica aguda de celulas T.

20

[0097] En determinados casos, el agente de union a Notch1 (p. ej., un anticuerpo) inhibe la senalizacion de Notch. Se entiende que un agente de union a Notch1 que inhibe la senalizacion de Notch puede, en determinados casos, inhibir la senalizacion mediada por uno o mas Notch, pero no inhibir necesariamente la senalizacion mediada por todos los Notch. En determinados casos alternativos, se puede inhibir la senalizacion mediada por todos los Notch humanos.

25 En determinados casos, se inhibe la senalizacion mediada por uno o mas Notch seleccionados a partir del grupo formado por Notch1, Notch2, Notch3 y Notch4. En determinados casos, la inhibicion de la senalizacion de Notch por un agente de union a Notch1 es una reduccion en el nivel de senalizacion de Notch1 de al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 25%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 90% o al menos aproximadamente el 95%.

30

[0098] En determinados casos, el agente de union a Notch1 (p. ej., un anticuerpo) inhibe la activacion de Notch. Se entiende que un agente de union a Notch1 que inhibe la activacion de Notch puede, en determinados casos, inhibir la activacion de uno o mas Notch, pero no inhibir necesariamente la activacion de todos los Notch. En determinados casos alternativos, se puede inhibir la activacion de todos los Notch humanos. En determinados casos, se inhibe la

35 activacion de uno o mas Notch seleccionados a partir del grupo formado por Notch1, Notch2, Notch3 y Notch4. En determinados casos, la inhibicion de la activacion de Notch por un agente de union a Notch1 es una reduccion en el nivel de activacion de Notch1 de al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 25%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 90% o al menos aproximadamente el 95%.

40

[0099] Se conocen en la tecnica ensayos in vivo e in vitro para determinar si un agente de union a Notch1 (o un posible agente de union a Notch1) inhibe la activacion de Notch. En algunos casos se puede usar un ensayo del indicador luciferasa basado en celulas que utiliza un vector TCF/indicador Luc que contiene multiples copias del dominio de union a TCF antes del extremo 5' de un gen indicador luciferasa de luciernaga para medir los niveles de

45 senalizacion de Notch in vitro. En otros casos se puede usar un ensayo del indicador luciferasa basado en celulas que utiliza un vector CBF/indicador Luc que contiene multiples copias del dominio de union a CBF antes del extremo 5' de un gen indicador luciferasa de luciernaga. El nivel de activacion de Notch inducido por un ligando de Notch en presencia de un agente de union a Notch1 se compara con el nivel de activacion de Notch inducido por un ligando de Notch en ausencia de un agente de union a Notch1. En el ejemplo 3 y en las figuras 1B y 1C se proporcionan, sin

50 limitaciones, los ejemplos especlficos del uso de dichos ensayos del indicador luciferasa para evaluar la inhibicion de la activacion de Notch.

[0100] En determinados casos, los agentes de union a Notch1 (p. ej., anticuerpos) tienen uno o mas de los siguientes efectos: inhibir la proliferacion de celulas cancerosas, inhibir el crecimiento de celulas cancerosas, prevenir o reducir

55 la metastasis de celulas cancerosas, reducir la frecuencia de celulas madre cancerosas en un tumor o cancer, desencadenar la muerte celular de celulas cancerosas (p. ej., mediante apoptosis), reducir la oncogenicidad de las celulas cancerosas mediante la reduccion de la frecuencia de celulas madre cancerosas en la poblacion de celulas cancerosas, diferenciar las celulas oncogenas a un estado no oncogeno o aumentar la supervivencia de un paciente.

[0101] En determinados casos, los agentes de union a Notchl (p. ej., anticuerpos) son capaces de inhibir el crecimiento de celulas cancerosas. En determinados casos, los agentes de union a Notchl son capaces de inhibir el crecimiento de celulas cancerosas in vitro (p. ej., poniendo en contacto las celulas cancerosas con un anticuerpo in vitro). En determinados casos, los agentes de union a Notchl son capaces de inhibir el crecimiento del cancer in vivo

5 (p. ej., en un modelo de xenoinjerto en raton y/o en un humano que tiene cancer).

[0102] En determinados casos, los agentes de union a Notchl (p. ej., anticuerpos) son capaces de reducir la oncogenicidad de un cancer hematologico. En determinados casos, el agente de union a Notchl o el anticuerpo es capaz de reducir la oncogenicidad de un cancer hematologico que comprende celulas madre cancerosas en un modelo

10 animal, como un modelo de xenoinjerto en raton. En determinados casos, el agente de union a Notchl o el anticuerpo es capaz de reducir la oncogenicidad de un cancer hematologico que comprende celulas iniciadoras de leucemia en un modelo animal, como un modelo de xenoinjerto en raton. En algunos casos, el agente de union a Notchl es capaz de reducir la oncogenicidad de un cancer hematologico mediante la reduccion de la frecuencia de celulas madre cancerosas en el cancer. En determinados casos, el numero o frecuencia de celulas madre cancerosas en un cancer 15 se reduce al menos aproximadamente dos veces, aproximadamente tres veces, aproximadamente cinco veces, aproximadamente diez veces, aproximadamente 50 veces, aproximadamente 100 veces o aproximadamente 1000 veces. En determinados casos, la reduccion de la frecuencia de celulas madre cancerosas se determina mediante un ensayo de dilucion llmite usando un modelo animal. Se pueden encontrar ejemplos y gula respecto al uso de ensayos de dilucion llmite para determinar una reduccion en el numero o frecuencia de celulas madre cancerosas en un tumor, 20 por ejemplo, en la publicacion internacional N.° WO 2008/042236 y las publicaciones de patentes de EE. UU. N.° 2008/0064049 y 2008/0178305.

[0103] En determinados casos, los agentes de union de Notch1 o anticuerpos median en la muerte celular de una celula que expresa Notch1 mediante citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). La ADCC implica la lisis

25 celular por celulas efectoras que reconocen la porcion Fc de un anticuerpo. Muchos linfocitos, monocitos, macrofagos tisulares, granulocitos y eosinofilos, por ejemplo, tienen receptores Fc y pueden mediar en la citolisis (Dillman, 1994, J. Clin. Oncol., 12:1497).

[0104] En algunos casos, los agentes de union a Notch1 o anticuerpos desencadenan la muerte celulas de celulas 30 que expresan un receptor Notch1 mediante la activacion de la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). La

CDC implica la union del complemento serico a la porcion Fc de un anticuerpo y la posterior activacion de la cascada de protelnas del complemento, lo que causa danos en la membrana celular y, finalmente, la muerte celular. Se sabe que la actividad biologica de los anticuerpos viene determinada, hasta cierto grado, por los dominios constantes o la region Fc de la molecula de anticuerpo (Uananue y Benacerraf, 1984, Textbook of Immunology, 2a edicion, Williams & 35 Wilkins, p. 218). Los anticuerpos de diferentes clases y subclases difieren a este respecto, como lo hacen los anticuerpos de la misma subclase pero de diferente especie. De los anticuerpos humanos, la IgM es la clase mas eficiente de anticuerpos a la hora de unirse al complemento, seguida por IgG1, IgG3 e IgG2, mientras que IgG4 parece bastante deficiente en la activacion de la cascada del complemento (Dillman, 1994, J. Clin. Oncol. 12:1497; Jefferis y col., 1998, Immunol. Rev. 163:59-76). Segun la presente descripcion, se pueden preparar anticuerpos de aquellas 40 clases que tengan la actividad biologica deseada.

[0105] Se puede usar en ensayos la capacidad de cualquier agente de union a Notch1 o anticuerpo en particular para mediar la lisis de la celula diana mediante CDC y/o ADCC. En algunos casos, las celulas de interes se crecen y marcan in vitro (celulas diana) y el anticuerpo se anade al cultivo celular en combinacion con complemento serico o

45 celulas inmunes que puedan ser activadas por los complejos antlgeno-anticuerpo. La citolisis de las celulas diana se detecta, por ejemplo, mediante la liberacion del marcaje de las celulas lisadas. En algunos casos, los anticuerpos se pueden seleccionar usando el propio suero de un paciente como fuente de complemento y/o celulas inmunes. El anticuerpo que es capaz de activar el complemento o mediar la ADCC en la prueba in vitro se puede despues usar terapeuticamente en ese paciente en concreto.

50

[0106] En determinados casos, el agente de union a Notch1 (p. ej., un anticuerpo) tiene una semivida en circulacion en un sujeto o mamlfero (p. ej., ratones, ratas, macacos o humanos) de al menos aproximadamente 5 horas, al menos aproximadamente 10 horas, al menos aproximadamente 24 horas, al menos aproximadamente 3 dlas, al menos aproximadamente 1 semana o al menos aproximadamente 2 semanas. En determinados casos, el agente de union a

55 Notch1 es un anticuerpo IgG (p. ej., IgG1 o IgG2) que tiene una semivida en circulacion en un sujeto o mamlfero (p. ej., ratones, ratas, macacos o humanos) de al menos aproximadamente 5 horas, al menos aproximadamente 10 horas, al menos aproximadamente 24 horas, al menos aproximadamente 3 dlas, al menos aproximadamente 1 semana o al menos aproximadamente 2 semanas. Se conocen en la tecnica procedimientos para prolongar la semivida de agentes como polipeptidos y anticuerpos. En algunos casos, los procedimientos conocidos para prolongar la semivida en

circulacion de anticuerpos IgG incluyen la introduccion de mutaciones en la region Fc que incrementen la union dependiente de pH del anticuerpo al receptor Fc neonatal (FcRn) a pH 6,0 (vease, p. ej., las publicaciones de patentes de EE. UU. N.° 2005/0276799, 2007/0148164 y 2007/0122403). Entre los procedimientos conocidos para prolongar la semivida en circulacion de fragmentos de anticuerpos que carecen de la region Fc se incluyen, pero sin limitaciones, 5 tecnicas como la PEGilacion.

[0107] En determinados casos, los agentes de union a Notchl son anticuerpos policlonales. Se pueden preparar anticuerpos policlonales mediante cualquier procedimiento conocido. En algunos casos, los anticuerpos policlonales se obtienen mediante la inmunizacion de un animal (p. ej., un conejo, rata, raton, cabra, burro) mediante multiples

10 inyecciones subcutaneas o intraperitoneales del antlgeno pertinente (p. ej., un fragmento peptldico purificado, una protelna recombinante de longitud completa o una protelna de fusion). El antlgeno puede conjugarse opcionalmente con un vehlculo como hemocianina de lapa californiana (KLH) o albumina serica. El antlgeno (con o sin una protelna vehlculo) se diluye en solucion salina esteril y normalmente se combina con un adyuvante (p. ej., adyuvante completo o incompleto de Freund) para formar una emulsion estable. Tras un periodo suficiente de tiempo, los anticuerpos 15 policlonales se recuperan de la sangre, llquido ascltico y similares del animal inmunizado. Los anticuerpos policlonales se pueden purificar a partir de suero o ascitis segun procedimientos estandar en la tecnica que incluyen, pero sin limitaciones, cromatografla de afinidad, cromatografla de intercambio ionico, electroforesis en gel y dialisis.

[0108] En algunos casos, los agentes de union a Notch1 son anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos 20 monoclonales se pueden preparar usando procedimientos de hibridomas conocidos por los expertos en la materia

(vease, p. ej., Kohler y Milstein, 1975, Nature 256:495-497). En algunos casos, utilizando el procedimiento de hibridomas, un raton, hamster u otro animal huesped apropiado, se inmuniza como se describe anteriormente para desencadenar a partir de los linfocitos la production de anticuerpos que se uniran especlficamente al antlgeno inmunizante. En algunos casos, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. En algunos casos, el antlgeno inmunizante 25 puede ser una protelna humana o una parte de la misma. En algunos casos, el antlgeno inmunizante puede ser una protelna de raton o una parte de la misma.

[0109] Tras la inmunizacion, los linfocitos se alslan y fusionan usando una llnea celular de mieloma adecuada empleando, por ejemplo, polietilenglicol, para formar celulas de hibridoma que se pueden seleccionar de entre los

30 linfocitos y celulas de mieloma no fusionados. Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales dirigidos especlficamente contra un antlgeno elegido pueden identificarse mediante diversos procedimientos que incluyen, pero sin limitaciones, inmunoprecipitacion, inmunotransferencia y ensayos de union in vitro (p. ej., citometrla de flujo, ensayo de inmunoadsorcion ligado a enzima [ELISA] y radioinmunoensayo [RIA]). Los hibridomas se pueden propagar en cultivo in vitro usando procedimientos estandar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic 35 Press, 1986) o in vivo como tumores asclticos en un animal. Los anticuerpos monoclonales se pueden purificar a partir de medio de cultivo o llquido ascltico segun procedimientos estandar en la tecnica que incluyen, pero sin limitaciones, cromatografla de afinidad, cromatografla de intercambio ionico, electroforesis en gel y dialisis.

[0110] En determinados casos, los anticuerpos monoclonales se pueden obtener usando tecnicas de ADN 40 recombinante como las conocidas por los expertos en la materia (vease, p. ej., la patente de EE. UU. N.° 4.816.567).

Los polinucleotidos que codifican un anticuerpo monoclonal se alslan a partir de celulas B maduras o celulas de hibridoma, por ejemplo, mediante RT-PCR usando cebadores oligonucleotidos que amplifican especlficamente los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo, y su secuencia se determina usando tecnicas convencionales. Los polinucleotidos aislados que codifican las cadenas pesadas y ligeras se clonan a continuation en 45 vectores de expresion adecuados que producen los anticuerpos monoclonales cuando se transfectan en celulas huesped como E. coli, celulas COS de simio, celulas de ovario de hamster chino (CHO) o celulas de mieloma que de otra forma no producen la protelna inmunoglobulina. En otros casos, los anticuerpos monoclonales recombinantes, o fragmentos de los mismos, se pueden aislar a partir de bibliotecas de despliegue en fagos que expresen las CDR de la especie deseada (vease, p. ej., McCafferty y col., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson y col., 1991, Nature, 50 352:624-628 y Marks y col., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597).

[0111] Los polinucleotidos que codifican un anticuerpo monoclonal pueden ademas modificarse usando la tecnologla de aDn recombinante para generar anticuerpos alternativos. En algunos casos, los dominios constantes de las cadenas ligeras y pesadas de, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de raton se pueden sustituir 1) por aquellas

55 regiones de, por ejemplo, un anticuerpo humano para generar un anticuerpo quimerico o 2) por un polipeptido no inmunoglobulina para generar un anticuerpo de fusion. En otros casos, las regiones constantes estan truncadas o se han eliminado para generar el fragmento de anticuerpo deseado de un anticuerpo monoclonal. Se puede emplear mutagenesis dirigida a sitio o de alta densidad de la region variable para optimizar la especificidad, afinidad y/u otras caracterlsticas biologicas de un anticuerpo monoclonal. En algunos casos, se puede emplear mutagenesis dirigida a

sitio de las CDR para optimizar la especificidad, afinidad y/u otras caracterlsticas biologicas de un anticuerpo monoclonal.

[0112] En algunos casos, el agente de union a Notch1 es un anticuerpo humanizado. Normalmente, los anticuerpos 5 humanizados son inmunoglobulinas humanas en las que los restos de las CDR estan sustituidos por restos de una

CDR de una especie no humana (p. ej., raton, rata, conejo, hamster, etc.) que tiene la especificidad, afinidad y/o capacidad deseadas usando procedimientos conocidos por los expertos en la materia. En algunos casos, los restos de la region armazon de Fv de una inmunoglobulina humana estan sustituidos por los restos correspondientes de un anticuerpo de una especie no humana que tiene la especificidad, afinidad y/o capacidad deseadas. En algunos casos, 10 el anticuerpo humanizado puede estar ademas modificado por la sustitucion de restos adicionales de la region armazon de Fv y/o dentro de los restos no humanos sustituidos para refinar y optimizar la especificidad, afinidad y/o capacidad del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todo de al menos uno, y tlpicamente dos o tres, dominios variables que contienen todas, o sustancialmente todas, las regiones CDR que corresponden a las de la inmunoglobulina no humana, o todas o sustancialmente todas las regiones armazon son las 15 de una secuencia consenso de la inmunoglobulina humana. En algunos casos, el anticuerpo humanizado puede tambien comprender al menos una porcion de una region o dominio constante de la inmunoglobulina (Fc), que tlpicamente es el de una inmunoglobulina humana. En ciertos casos, dichos anticuerpos humanizados se usan terapeuticamente porque pueden reducir la antigenicidad y las respuestas HAMA (anticuerpo humano anti-raton) cuando se administran a un sujeto humano. Un experto en la materia sera capaz de obtener un anticuerpo humanizado 20 funcional con inmunogenicidad reducida siguiendo tecnicas conocidas (vease, p. ej., las patentes de EE. UU. N.° 5.225.539, 5.585.089, 5.693.761 y 5.693.762).

[0113] En algunos casos, el agente de union a Notch1 es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos pueden prepararse directamente usando diversas tecnicas conocidas en la tecnica. En algunos casos, se pueden generar

25 linfocitos B humanos inmortalizados inmunizados in vitro o aislados a partir de un individuo inmunizado que produce un anticuerpo dirigido contra un antlgeno diana (vease, p. ej., Cole y col., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer y col., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95 y las patentes de EE. UU. N.° 5.750.373, 5.567.610 y 5.229.275). En algunos casos, el anticuerpo humano se puede seleccionar a partir de una biblioteca de fagos, en la que la biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos (Vaughan y col., 1996, Nature Biotechnology, 30 14:309-314;Sheets y col., 1998, PNAS, 95:6157-6162; Hoogenboom y Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks y col., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Alternativamente, la tecnologla de despliegue en fagos puede usarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro, a partir de los repertorios de genes del dominio variable (V) de las inmunoglobulinas de donantes no inmunizados. Tambien se describen tecnicas para la generacion y uso de bibliotecas de despliegue en fagos en las patentes de EE. UU. N.° 5.969.108, 6.172.197, 5.885.793, 6.521.404, 35 6.544.731, 6.555.313, 6.582.915, 6.593.081, 6.300.064, 6.653.068, 6.706.484 y 7.264.963, y Rothe y col., 2008, J. Mol. Biol., 376:1182-1200. Se conocen en la tecnica estrategias de maduracion de afinidad, como intercambio de cadenas (Marks y col., 1992, Bio/Technology, 10:779-783) que se pueden emplear para generar anticuerpos humanos de alta afinidad.

40 [0114] En algunos casos, los anticuerpos humanos se pueden obtener en ratones transgenicos que contienen loci de inmunoglobulina humana que son capaces, tras la inmunizacion, de producir el repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de produccion de inmunoglobulinas endogenas. Esta estrategia se describe en las patentes de EE. UU. N.° 5.545.807, 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425 y 5.661.016.

45 [0115] En algunos casos, el agente de union a Notch1 es un anticuerpo biespeclfico. Los anticuerpos biespeclficos son capaces de reconocer especlficamente y unirse a al menos dos epitopes diferentes. Los diferentes epitopes pueden estar dentro de la misma molecula o de moleculas diferentes. En algunos casos, los anticuerpos biespeclficos son anticuerpos monoclonales humanos o humanizados. En algunos casos, los anticuerpos pueden reconocer y unirse especlficamente a un primer antigeno diana (p. ej., Notch1), asi como a un segundo antigeno diana, como una 50 molecula efectora o un leucocito (p. ej., CD2, CD3, CD28 o b7) o un receptor de Fc (p. ej., CD64, CD32 o CD16) con el fin de centrar los mecanismos de defensa celular en la celula que expresa el primer antigeno diana. En algunos casos, los anticuerpos se pueden usar para dirigir agentes citotoxicos a celulas que expresan un antigeno diana en particular, como Notch1. Estos anticuerpos poseen un brazo de union a antigeno y un brazo que une un agente citotoxico o un quelante radionucleido, como EOTUBE, DPTA, DOTA o TETA. En determinados casos, el anticuerpo 55 biespeclfico se une especlficamente a Notch1, as! como a al menos un receptor Notch adicional seleccionado a partir del grupo compuesto por Notch2, Notch3 y Notch4 o un ligando de Notch seleccionado a partir del grupo compuesto por Jagged1, Jagged2, DLL1, DLL3 y DLL4.

[0116] Los expertos en la materia conocen tecnicas para producir anticuerpos biespeclficos, vease por ejemplo,

Millstein y col., 1983, Nature, 305:537-539; Brennan y col., 1985, Science, 229:81; Suresh y col., 1986, Methods in Enzymol., 121:120; Traunecker y col., 1991, EMBO J., 10:3655-3659; Shalaby y col., 1992, J. Exp. Med., 175:217225; Kostelny y col., 1992, J. Immunol., 148:1547-1553; Gruber y col., 1994, J. Immunol., 152:5368 y la patente de EE. UU. N.° 5.731.168). Los anticuerpos biespeclficos pueden ser anticuerpos intactos o fragmentos de anticuerpo. 5 Tambien se contemplan anticuerpos con mas de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespeclficos (Tutt y col., 1991, J. Immunol., 147:60). De este modo, en determinados casos, los anticuerpos anti- Notch1 son multiespeclficos.

[0117] En determinados casos, el agente de union a Notch1 o anticuerpo descrito en este documento puede ser 10 monoespeclfico. Por ejemplo, en determinados casos, cada uno de los uno o mas sitios de union a antlgeno que

contiene un anticuerpo es capaz de unirse (o se une) a un epitope homologo en Notch1. En determinados casos, un sitio de union a antlgeno de un anticuerpo monoespeclfico descrito en este documento es capaz de unirse (o se une) a Notch1 y un segundo Notch, como Notch2, Notch3 o Notch4 (es decir, el mismo epitope se encuentra en Notch1 y, por ejemplo, en Notch2).

15

[0118] En determinados casos, el agente de union a Notch1 es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo pueden tener funciones o capacidades diferentes a las de los anticuerpos intactos; por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden tener mayor penetracion en el tumor. Se conocen varias tecnicas para la production de fragmentos de anticuerpo que incluyen, pero sin limitaciones, la digestion proteolitica de anticuerpos intactos. En

20 algunos casos, los fragmentos de anticuerpo incluyen un fragmento F(ab')2 producido por la digestion con pepsina de una molecula de anticuerpo. En algunos casos, los fragmentos de anticuerpo incluyen un fragmento Fab generado mediante la reduction de puentes disulfuro de un fragmento F(ab')2. En otros casos, los fragmentos de anticuerpo incluyen un fragmento Fab generado por el tratamiento de la molecula de anticuerpo con papaina y un agente reductor. En determinados casos, los fragmentos de anticuerpo se producen de forma recombinante. En algunos casos, los 25 fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fv o Fv de cadena sencilla (scFv). Los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y scFv se pueden expresar y secretar en E. coli u otra celula huesped, permitiendo la produccion de grandes cantidades de estos fragmentos. En algunos casos, los fragmentos de anticuerpo se aislan a partir de bibliotecas de despliegue en fagos como se discute en este documento. Por ejemplo, pueden utilizarse procedimientos para la construction de bibliotecas de expresion de Fab (Huse y col., 1989, Science 246:1275-1281) para permitir una 30 identification rapida y eficaz de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada para una proteina Notch1 o derivados, fragmentos, analogos u homologos de la misma. En algunos casos, los fragmentos de anticuerpo son fragmentos de anticuerpo lineales como se describe en la patente de EE. UU. N.° 5.641.870. En determinados casos, los fragmentos de anticuerpo son monoespecificos o biespeclficos. En determinados casos, el agente de union a Notch1 es un scFv. Se pueden usar varias tecnicas para la produccion de anticuerpos de cadena sencilla especificos 35 de Notch1 (vease, p. ej., la patente de EE. UU. N.° 4.946.778).

[0119] Puede ser deseable ademas, especialmente en el caso de fragmentos de anticuerpos, modificar un anticuerpo con el fin de aumentar su semivida en suero. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante la incorporation de un receptor natural que se una al epitope dentro del fragmento de anticuerpo mediante la mutation de la region

40 correspondiente en el fragmento de anticuerpo o mediante la incorporacion del epitope dentro de una etiqueta peptidica que, a continuation, se fusiona con el fragmento de anticuerpo, ya sea en un extremo o en el centro (p. ej., mediante la sintesis de ADN o peptido).

[0120] Para los fines de la presente description, debe apreciarse que los anticuerpos modificados, o los fragmentos 45 de los mismos, pueden comprender cualquier tipo de region variable que proporcione la asociacion del anticuerpo con

una region proximal a la membrana del dominio extracelular de Notch1. A este respecto, la region variable puede proceder de cualquier tipo de mamifero al que se le pueda inducir a desencadenar una respuesta humoral y generar inmunoglobulinas frente a un antlgeno deseado (p. ej., Notch1). As! pues, la region variable de los anticuerpos modificados pueden ser, por ejemplo, de humano, murinos, de primate no humano (p. ej., monos macacos, etc.) o de 50 origen salvaje. En algunos casos, tanto las regiones variables como constantes de las inmunoglobulinas modificadas son humanas. En otros casos, las regiones variables de anticuerpos compatibles (normalmente derivados de un origen no humano) pueden modificarse geneticamente o adaptarse especlficamente para mejorar las propiedades de union o reducir la inmunogenicidad de la molecula. A este respecto, las regiones variables utiles en la presente descripcion se pueden humanizar o alterar de alguna otra forma mediante la inclusion de secuencias de aminoacidos importadas. 55

[0121] En algunos casos, los dominios variables tanto de las cadenas pesadas como ligeras se alteran mediante la sustitucion al menos parcial de una o mas CDR y, si es necesario, mediante la sustitucion parcial de la region armazon y la modification de la secuencia. Aunque las CDR pueden proceder de un anticuerpo de la misma clase o incluso subclase que el anticuerpo del cual proceden las regiones armazon, se preve que las CDR procedan de un anticuerpo

de diferente clase y, preferiblemente, de un anticuerpo de una especie diferente. Puede ser necesario sustituir todas las CDR con todas las CDR de la region variable del donante para transferir la capacidad de union a antlgeno de un dominio variable a otro. Preferiblemente, puede ser necesario transferir solo aquellos restos que son necesarios para mantener la actividad del sitio de union a antlgeno.

5

[0122] A pesar de las alteraciones en la region variable, los expertos en la materia apreciaran que los anticuerpos modificados de esta descripcion pueden comprender anticuerpos (es decir, anticuerpos de longitud completa o fragmentos de union a antlgeno de los mismos) en los que al menos una fraccion de uno o mas de los dominios de la region constante se ha delecionado o alterado de alguna otra forma, de modo que proporcione las caracterlsticas

10 bioqulmicas deseadas, como la mayor localizacion de celulas cancerosas, mayor penetracion en el tumor, semivida reducida en suero o mayor semivida en suero, cuando se compara con un anticuerpo de aproximadamente la misma inmunogenicidad que comprende una region constante nativa o sin alterar. En algunos casos, la region constante de los anticuerpos modificados comprende una region constante humana. Las modificaciones en la region constante incluyen adiciones, deleciones o sustituciones de uno o mas aminoacidos en uno o mas dominios. Los anticuerpos 15 modificados descritos en este documento pueden comprender alteraciones o modificaciones de uno o mas de los dominios constantes de la cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) y/o del dominio constante de la cadena ligera (CL). En algunos casos, uno o mas dominios se delecionan parcial o completamente de las regiones constantes de los anticuerpos modificados. En otros casos, el dominio CH2 completo se ha eliminado (construcciones ACH2). En algunos casos, el dominio de la region constante omitido se sustituye por un espaciador de aminoacidos corto (p. ej., 20 10 restos de aminoacidos) que proporciona algo de la flexibilidad molecular impartida normalmente por la region constante ausente.

[0123] En algunos casos, los anticuerpos modificados estan geneticamente modificados para fusionar el dominio CH3 directamente a la region bisagra del anticuerpo. En otros casos, se inserta un espaciador peptldico entre la region

25 bisagra y los dominios CH2 y/o CH3 modificados. Por ejemplo, pueden expresarse construcciones en las que el dominio CH2 se haya delecionado y el dominio CH3 que queda (modificado o sin modificar) se une a la region bisagra con un espaciador de 5 a 20 aminoacidos. Dicho espaciador puede anadirse para garantizar que los elementos reguladores del dominio constante permanecen libres y accesibles o que la region bisagra sigue siendo flexible. No obstante, debe apreciarse que los espaciadores de aminoacidos pueden, en algunos casos, mostrar inmunogenicidad 30 y desencadenar una respuesta inmune no deseada contra la construction. En consecuencia, en determinados casos, cualquier espaciador anadido a la construccion sera relativamente no inmunogenico de modo que mantenga las cualidades biologicas deseadas de los anticuerpos modificados.

[0124] En algunos casos, los anticuerpos modificados pueden tener solo una deletion parcial de un dominio 35 constante o una sustitucion de unos pocos o incluso un unico aminoacido. Por ejemplo, la mutation de un unico

aminoacido en areas seleccionadas del dominio CH2 puede ser suficiente para reducir sustancialmente la union a Fc y aumentar de este modo la localizacion de celulas tumorales y/o la penetracion en el tumor. De forma similar, puede ser deseable simplemente delecionar la parte de uno o mas dominios de la region constante que controla una funcion efectora especlfica (p. ej., de union al complemento C1q) que se va a modular. Estas deleciones parciales de las 40 regiones constantes pueden mejorar caracterlsticas seleccionadas del anticuerpo (semivida en suero) mientras que conservan otras funciones deseadas asociadas con el dominio intacto de la region constante del sujeto. Ademas, como se ha senalado antes, las regiones constantes de los anticuerpos descritos pueden ser modificados a traves de la mutacion o sustitucion de uno o mas aminoacidos que potencian el perfil de la construccion resultante. A este respecto, puede ser posible alterar la actividad proporcionada por un sitio de union conservado (p. ej., union a Fc) 45 mientras que se mantienen sustancialmente la configuration y el perfil inmunogenico del anticuerpo modificado. En determinados casos, los anticuerpos modificados comprenden la adicion de uno o mas aminoacidos a la region constante para potenciar caracterlsticas deseadas como el aumento o disminucion de la funcion efectora o proporcionar mas union de citotoxinas o de hidratos de carbono.

50 [0125] Se conoce en la tecnica que la region constante media en varias funciones efectoras. Por ejemplo, la union del componente C1 del complemento a la region Fc de anticuerpos IgG o IgM (unidos a antlgeno) activa el sistema de complemento. La activation del complemento es importante en la opsonization y lisis de patogenos celulares. La activation del complemento tambien estimula la respuesta inflamatoria y ademas puede estar implicada en la hipersensibilidad autoinmune. Asimismo, la region Fc de un anticuerpo puede unirse a una celula que exprese un 55 receptor de Fc (FcR). Existen varios receptores de Fc que son especlficos para diferentes clases de anticuerpos, que incluyen IgG (receptores gamma), IgE (receptores epsilon), IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu). La union del anticuerpo a los receptores Fc de las superficies celulares desencadena varias respuestas biologicas diversas e importantes que incluyen la captation y destruction de parflculas recubiertas de anticuerpo, el aclaramiento de complejos inmunes, la lisis de celulas diana recubiertas de anticuerpo por celulas citotoxicas (ADCC), liberation de

mediadores inflamatorios, transferencia placentaria y control de la produccion de inmunoglobulinas.

[0126] En algunos casos, los agentes de union a Notch1 o anticuerpos proporcionan funciones efectoras alteradas que, a su vez, afectan al perfil biologico del anticuerpo administrado. Por ejemplo, en algunos casos, la delecion o

5 inactivacion (a traves de mutaciones puntuales u otros medios) de un dominio de la region constante puede reducir la union al receptor de Fc del anticuerpo modificado en circulacion (p. ej., anticuerpo anti-Notchl) aumentando de este modo la localizacion de celulas cancerosas y/o penetracion en el tumor. En otros casos, las modificaciones de la region constante aumentan o reducen la semivida en suero del anticuerpo. En algunos casos, la region constante se modifica para eliminar los enlaces disulfuro o restos oligosacaridos, lo que permite mejorar la localizacion de las celulas 10 cancerosas.

[0127] En determinados casos, el agente de union a Notchl o anticuerpo no tiene una o mas funciones efectoras. En algunos casos, el anticuerpo no tiene actividad ADCC y/o actividad CDC. En determinados casos, el anticuerpo no se une al receptor de Fc y/o a factores de complemento. En determinados casos, el anticuerpo no tiene funcion

15 efectora.

[0128] La presente descripcion ademas abarca variantes y equivalentes que son sustancialmente homologas a los anticuerpos quimericos, humanizados y/o humanos, o fragmentos de anticuerpo de los mismos, establecidos en este documento. Estos pueden contener, por ejemplo, mutaciones de sustitucion conservadoras, es decir, la sustitucion de

20 uno o mas aminoacidos por aminoacidos similares.

[0129] Asl, la presente descripcion proporciona procedimientos para generar un anticuerpo que se une a Notchl. En algunos casos, el procedimiento para generar un anticuerpo que se une a Notchl comprende el uso de tecnicas de hibridomas. En algunos casos, el procedimiento comprende el uso de un dominio extracelular de Notchl humano

25 o de raton como antlgeno de inmunizacion. En algunos casos, el procedimiento para generar un anticuerpo que se une a Notchl comprende el cribado de una biblioteca en fagos humana. La presente descripcion ademas proporciona procedimientos de identificacion de un anticuerpo que se une a Notchl. En algunos casos, el anticuerpo se identifica seleccionando la union a Notchl con citometrla de flujo (FACS). En algunos casos, el anticuerpo se identifica seleccionando la inhibicion o bloqueo de la activacion de Notchl. En algunos casos, el anticuerpo se identifica 30 analizando la inhibicion o bloqueo de la senalizacion de Notchl.

[0130] En determinados casos, los anticuerpos como se describen en este documento estan aislados. En determinados casos, los anticuerpos como se describen en este documento estan sustancialmente puros.

35 [0131] En algunos casos de la presente descripcion, los agentes de union a Notchl son polipeptidos. Los polipeptidos pueden ser polipeptidos recombinantes, polipeptidos naturales o polipeptidos sinteticos que se unen a una region proximal a la membrana de no union al ligando del dominio extracelular de Notch1 humano. En algunos casos, los polipeptidos comprenden un anticuerpo o fragmento del mismo que se une especlficamente a una region proximal a la membrana de no union al ligando del dominio extracelular de Notchl humano. Los expertos en la materia 40 reconoceran que algunas secuencias de aminoacidos de un polipeptido pueden variarse sin efecto significativo para la estructura o funcion de la protelna. De este modo, los polipeptidos de union a Notchl ademas incluyen variaciones de los polipeptidos que muestran una importante actividad de union a una region proximal a la membrana del dominio extracelular de Notchl humano. En algunos casos, las variaciones en la secuencia de aminoacidos de los polipeptidos de union a Notchl incluyen deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones y/o sustituciones de tipo.

45

[0132] Los polipeptidos y sus variaciones pueden modificarse ademas para contener restos qulmicos adicionales que no son parte normalmente del polipeptido. Los restos derivatizados pueden mejorar la solubilidad, la semivida biologica y/o la absorcion del polipeptido. Los restos ademas pueden reducir o eliminar cualquier efecto secundario no deseado de los polipeptidos y sus variantes. Se puede encontrar una descripcion general de los restos qulmicos en

50 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edicion, University of the Sciences Philadelphia 2005.

[0133] Los polipeptidos descritos en este documento pueden producirse mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en la tecnica. Dichos procedimientos oscilan desde procedimientos de slntesis de protelnas directos hasta la construction de una secuencia de ADN que codifica una secuencia polipeptldica y que expresa estas

55 secuencias en un huesped adecuado. En algunos casos, se construye una secuencia de ADN usando tecnologla recombinante mediante el aislamiento o slntesis de una secuencia de ADN que codifica una protelna natural de interes. Opcionalmente, la secuencia puede mutarse mediante mutagenesis dirigida a sitio para obtener analogos funcionales de la misma (vease, p. ej., Zoeller y col., 1984, PNAS, 81:5662-5066 y la patente de EE. UU. N.° 4.588.585).

[0134] En algunos casos, se puede construir una secuencia de ADN que codifica un polipeptido de interes mediante slntesis qulmica usando un sintetizador de oligonucleotidos. Los oligonucleotidos pueden disenarse en funcion de la secuencia de aminoacidos del polipeptido deseado y seleccionando los codones favorecidos en la celula huesped en la que se producira el polipeptido recombinante de interes. Pueden aplicarse procedimientos convencionales para

5 sintetizar una secuencia polinucleotldica que codifique un polipeptido de interes. Por ejemplo, puede usarse una secuencia de aminoacidos completa para construir un gen traducido de forma inversa. Ademas, puede sintetizarse un oligomero de ADN que contenga una secuencia de nucleotidos que codifique el polipeptido aislado en particular. Por ejemplo, pueden sintetizarse, y despues ligarse, varios oligonucleotidos pequenos que codifiquen porciones del polipeptido deseado. Los oligonucleotidos individuales tlpicamente contienen salientes 5' o 3' para el ensamblaje 10 complementario.

[0135] Una vez ensamblados (mediante slntesis, tecnicas de ADN recombinante, mutagenesis dirigida a sitio u otro procedimiento), las secuencias polinucleotldicas que codifican un polipeptido de interes en particular se pueden insertar en un vector de expresion y se uniran de forma operativa a una secuencia de control de expresion apropiada

15 para la expresion del polipeptido en un huesped deseado. El ensamblaje apropiado puede confirmarse mediante secuenciacion de nucleotidos, mapeo de restriccion y/o expresion de un polipeptido biologicamente activo en un huesped adecuado. Como es bien conocido en la tecnica, para obtener niveles elevados de expresion de un gen transfectado en un huesped, el gen debe unirse de forma operativa a secuencias de control de la expresion transcripcional y traduccional que sean funcionales en los huespedes de expresion elegidos.

20

[0136] En determinados casos, los vectores de expresion recombinantes se utilizan para amplificar y expresar ADN que codifica agentes de union a Notchl como polipeptidos, anticuerpos o fragmentos de los mismos. Por ejemplo, los vectores de expresion recombinantes pueden ser construcciones de ADN replicables que tengan fragmentos de ADN sinteticos o derivados de ADNc que codifiquen una cadena polipeptldica de un agente de union a Notchl, anticuerpo

25 o fragmento del mismo, unido de forma operativa a elementos reguladores transcripcionales o traduccionales adecuados derivados de genes mamlferos, microbianos, vlricos o de insecto. Una unidad transcripcional generalmente comprende el ensamblaje de (1) un elemento o elementos genicos que tienen una funcion reguladora en la expresion genica, por ejemplo, promotores o potenciadores de la transcripcion, (2) una secuencia estructural o codificadora que se transcribe a ARNm y se traduce a protelna y (3) secuencias apropiadas de inicio y terminacion de la transcripcion 30 y traduccion. Los elementos reguladores pueden incluir una secuencia operadora para controlar la transcripcion. Adicionalmente, puede incorporarse la capacidad para replicarse en un huesped, que normalmente viene conferida por un origen de replicacion, y un gen de seleccion para facilitar el reconocimiento de los transformantes. Las regiones de ADN estan «unidas de forma operativa» cuando estan relacionadas funcionalmente entre si. Por ejemplo, el ADN de un peptido senal (secuencia llder de la secrecion) esta unido de forma operativa al ADN de un polipeptido si este 35 se expresa como precursor que participa en la secrecion del polipeptido; un promotor esta unido de forma operativa a una secuencia codificadora si controla la transcripcion de la secuencia; o un sitio de union al ribosoma esta unido de forma operativa a una secuencia codificadora si se coloca de modo que permita la traduccion. En algunos casos, los elementos estructurales destinados a su uso en sistemas de expresion en levaduras incluyen preferiblemente una secuencia llder que permite la secrecion extracelular de la protelna traducida por una celula huesped. En otros casos, 40 cuando la protelna recombinante se expresa sin una secuencia llder o de transporte, puede incluir un resto de metionina N-terminal. De forma opcional, este resto puede escindirse posteriormente de la protelna recombinante expresada para proporcionar un producto final.

[0137] La eleccion de la secuencia de control de expresion y del vector de expresion dependera de la eleccion del 45 huesped. Puede emplearse una amplia variedad de combinaciones de huespedes/vectores de expresion. Los vectores

de expresion utiles para huespedes eucariotas incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden secuencias de control de expresion de SV40, virus del papiloma bovino, adenovirus y citomegalovirus. Vectores de expresion utiles para huespedes bacterianos incluyen plasmidos bacterianos conocidos, tales como plasmidos de E. coli, como pCR1, pBR322, pMB9 y sus derivados, y plasmidos de gama mas amplia, tales como M13 y otros fagos filamentosos de ADN 50 de cadena sencilla.

[0138] Las celulas huesped adecuadas para la expresion de un agente de union a Notch1 o anticuerpo (o un polipeptido de Notch1 para su uso como antlgeno) incluyen celulas procariotas, de levadura, de insecto o eucariotas superiores bajo el control de promotores adecuados. Entre los procariotas se incluyen organismos gram negativos o

55 gram positivos, por ejemplo, E. colio Bacillus. Las celulas eucariotas superiores incluyen llneas celulares establecidas de origen mamlfero, como se describe mas adelante. Tambien se pueden emplear sistemas de traduccion sin celulas.

[0139] Se usan diversos sistemas de cultivo de celulas de mamlfero o insecto para expresar los polipeptidos recombinantes. Puede ser preferible la expresion de protelnas recombinantes en celulas de mamlfero ya que,

generalmente, dichas protelnas se pliegan correctamente, se modifican adecuadamente y son completamente funcionales. Entre los ejemplos de llneas celulares huesped de mamlfero adecuadas se incluyen las llneas celulares COS-7 (derivadas de rinon de mono), L-929 (derivada de fibroblastos murinos), C127 (derivada de tumor mamario murino), 3T3 (derivada de fibroblasto murino), CHO (derivada de ovario de hamster chino), HeLa (derivada de cancer 5 de cuello uterino humano) y BHK (derivada de fibroblastos de rinon de hamster). Los vectores de expresion de mamlferos pueden comprender elementos no transcritos, tales como un origen de replicacion, un promotor y potenciador adecuados unidos al gen que se desea expresar y otras secuencias no transcritas que flaquean los extremos 5' o 3' y secuencias no traducidas 5' o 3', tales como los sitios de union a ribosomas necesarios, un sitio de poliadenilacion, sitios donador y aceptor de ayuste y las secuencias de terminacion de la transcripcion. Los sistemas

10 de baculovirus para la production de protelnas heterologas en celulas de insecto son bien conocidas por los expertos en la materia (vease, p. ej., Luckow y Summers, 1988, Bio/Technology, 6:47).

[0140] Las protelnas producidas por un hospedador transformado pueden purificarse segun cualquier procedimiento adecuado. Dichos procedimientos convencionales incluyen cromatografla (p. ej., cromatografla de intercambio ionico,

15 de afinidad y de exclusion molecular), centrifugation, solubilidad diferencial o mediante cualquier otra tecnica convencional para purification de protelnas. Pueden unirse a la protelna etiquetas de afinidad, como hexahistidina, dominio de union a maltosa, secuencia de la cubierta del virus de la gripe y la glutation-S-transferasa, que permiten una facil purificacion pasandola a traves de una columna de afinidad apropiada. Las protelnas aisladas tambien pueden caracterizarse flsicamente usando tecnicas como proteolisis, cromatografla llquida de alta resolution (HPLC),

20 resonancia magnetica nuclear y cristalografla de rayos X.

[0141] En algunos casos, los sobrenadantes de los sistemas de expresion que secretan protelnas recombinantes al medio de cultivo pueden concentrarse primero usando un filtro de concentration de protelnas disponible en el mercado, por ejemplo, una unidad de ultrafiltracion Amicon o Millipore Pellicon. Tras la etapa de concentracion, puede

25 aplicarse el concentrado a una matriz de purificacion adecuada. En otros casos, puede emplearse una resina de intercambio anionico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tenga grupos dietilaminoetilo (DEAE) colgantes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa y otros tipos empleados frecuentemente en la purificacion de protelnas. En algunos casos, puede emplearse una etapa de intercambio cationico. Entre los intercambiadores cationicos adecuados se incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo.

30 En algunos casos, se puede emplear un medio de hidroxiapatita (CHT), que incluye pero sin limitaciones, hidroxiapatita ceramica. En algunos casos, pueden emplearse para una purificacion adicional de una protelna recombinante una o mas etapas de HPLC en fase inversa, empleando medios de HPLC-RP hidrofobos, por ejemplo, gel de sllice que tenga grupos metilo u otros grupos alifaticos colgantes. Algunas o todas las etapas de purificacion anteriores, en diversas combinaciones, tambien pueden emplearse para proporcionar una protelna recombinante homogenea.

35

[0142] En algunos casos, la protelna recombinante producida en cultivo bacteriano se puede aislar, por ejemplo, mediante la extraction inicial a partir de sedimentos de celulas, seguido de una o mas etapas de concentracion, precipitation con sales, cromatografla de intercambio ionico acuoso o de exclusion molecular. Puede emplearse HPLC para las etapas finales de purificacion. Las celulas microbianas empleadas en la expresion de una protelna

40 recombinante pueden lisarse por cualquier procedimiento conveniente, incluyendo ciclos de congelacion- descongelacion, sonicacion, disrupcion mecanica o el uso de agentes de lisis celular.

[0143] Entre los procedimientos conocidos en la tecnica para la purificacion de anticuerpos y otras protelnas tambien se incluyen, por ejemplo, los descritos en las publicaciones de patente de EE. UU. N.° 2008/0312425, 2008/0177048

45 y 2009/0187005.

[0144] En determinados casos, el agente de union a Notch1 es un polipeptido que no es un anticuerpo. Se conocen en la tecnica diversos procedimientos para identificar y producir polipeptidos que no son anticuerpos que se unen con alta afinidad a una protelna diana. Vease, por ejemplo, Skerra, 2007, Curr. Opin. Biotechnol., 18:295-304; Hosse y

50 col., 2006, Protein Science, 15:14-27; Gill y col., 2006, Curr. Opin. Biotechnol., 17:653-658; Nygren, 2008, FEBS J., 275:2668-76 y Skerra, 2008, FEBS J., 275:2677-83. En determinados casos, la tecnologla de despliegue en fagos puede utilizarse para producir y/o identificar un polipeptido de union a Notch1. En determinados casos, el polipeptido de union a Notch1 comprende una estructura proteica de un tipo seleccionado a partir del grupo compuesto por protelna A, protelna G, una lipocalina, un dominio fibronectina, un dominio de repeticiones consenso de anquirina y

55 tioredoxina.

[0145] En determinados casos, los agentes de union a Notch1 o anticuerpos se pueden usar en cualquiera de las formas conjugadas (es decir, un inmunoconjugado o radioconjugado) o no conjugadas. En determinados casos, los anticuerpos se pueden usar en forma no conjugada para estimular los mecanismos de defensa natural del sujeto,

como la citotoxicidad dependiente de complemento y la toxicidad celular dependiente de anticuerpo, para eliminar las celulas malignas o cancerosas.

[0146] En algunos casos, el agente de union a Notchl (p. ej., un anticuerpo o polipeptido) se conjuga con un agente 5 citotoxico. En algunos casos, el agente citotoxico es un agente quimioterapeutico que incluye, pero sin limitaciones, metotrexato, adriamicina, doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucilo, daunorubicina u otros agentes intercalantes. En algunos casos, el agente citotoxico es una toxina enzimaticamente activa de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma, que incluye, pero sin limitaciones, la cadena A de la toxina difterica, fragmentos activos no de union de la toxina difterica, cadena A de la exotoxina, cadena A de la ricina, cadena

10 A de la abrina, cadena A de la modecina, alfa-sarcina, protelnas de Aleurites fordii, protelnas de diantina, protelnas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. En algunos casos, el agente citotoxico es un radioisotopo para producir un radioconjugado o un anticuerpo radioconjugado. Se dispone de diversos radionuclidos para la production de anticuerpos radioconjugados que incluyen, pero sin limitaciones 90Y,

15 125I, 131I, 123I, 111In, 131In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re y 212Bi. Tambien se pueden usar conjugados de un anticuerpo y una o mas toxinas de molecula de bajo peso molecular, como caliqueamicina, maitansinoides, un tricoteno y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad como toxina. Se obtienen conjugados de un anticuerpo y un agente citotoxico usando diversos agentes bifuncionales de conjugation de protelnas como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)-propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de

20 imidoesteres (como dimetiladipimidato HCl), esteres activos (como suberato de disuccinimidilo), aldehldos (como glutaraldehldo), compuestos bis-azido (como bis (p-azidobezoil)hexanodiamina), derivados bis-diazonio (como bis-(p- diazoniumbenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (como tolueno 2,6-diisocianato) y compuestos de fluor biactivos (como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno).

25 [0147] Los anticuerpos heteroconjugados tambien se incluyen dentro del alcance de la presente description. Los anticuerpos heteroconjugados estan compuestos de dos anticuerpos unidos covalentemente. Estos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir las celulas inmunes frente a celulas no deseados (patente de EE. UU. N° 4.676.980). Se contempla que los anticuerpos pueden prepararse in vitro usando procedimientos conocidos en qulmica de slntesis de protelnas, incluyendo los que implican agentes de entrecruzamiento.

30

[0148] En determinados casos, la descripcion abarca polinucleotidos que comprenden polinucleotidos que codifican un polipeptido que se une especlficamente a Notch1 o un fragmento de dicho polipeptido. La expresion «polinucleotido que codifica un polipeptido» abarca un polinucleotido que incluye solo secuencias codificadoras para el polipeptido, as! como un polinucleotido que incluye secuencias codificadoras y/o no codificadoras adicionales. Por ejemplo, la

35 descripcion proporciona un polinucleotido que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica un anticuerpo frente a un Notch1 humano o que codifica un fragmento de dicho anticuerpo. Los polinucleotidos de la descripcion pueden estar en forma de ARN o en forma de ADN. El ADN incluye ADNc, ADN genomico y ADN sintetico y puede ser de cadena doble o de cadena sencilla, y si es de cadena sencilla, puede ser la hebra codificadora o la hebra no codificadora (complementaria).

40

[0149] En determinados casos, se proporciona un polinucleotido que comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido que comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo compuesto por las SEC ID N.° 8, SEC ID N.° 14, SeC ID N.° 24, SEC ID N.° 28 y SEC ID N.° 32. En algunos casos, se proporciona una secuencia polinucleotldica que codifica un polipeptido (con o sin la secuencia senal) que comprende una secuencia seleccionada

45 a partir del grupo compuesto por las SEC ID N.° 4, SEC ID N.° 10, SEC ID N.° 22, SEC ID N.° 26 y SEC ID N.° 30.

[0150] En algunos casos, se proporciona un polinucleotido que comprende una secuencia nucleotldica (con o sin la secuencia senal) seleccionada a partir del grupo compuesto por las SEC ID N.° 3, SEC ID N.° 5, SEC ID N.° 7, SEC ID N.° 9, SEC ID N.° 11, SEC ID N.° 13, SEC ID N.° 21, SEC ID N.° 25 y SEC ID N.° 29.

50

[0151] En determinados casos, se proporciona un polinucleotido que comprende un polinucleotido (con o sin la secuencia senal) que tiene una secuencia nucleotldica al menos el 80% identica, al menos el 85% identica, al menos el 90% identica, al menos el 95% identica y, en algunos casos, al menos el 96%, 97%, 98% o 99% identica a un polinucleotido que comprende una secuencia seleccionada a partir de grupo compuesto por las SEC ID N.° 7, SEC ID

55 N.° 13, SEC ID N.° 21, SEC ID N.° 25 y SEC ID N.° 29. En algunos casos, los polinucleotidos tienen una secuencia nucleotldica al menos el 90% identica a la SEC ID N.° 7 o SEC ID N.° 13.

[0152] Tambien se proporciona un polinucleotido que comprende un polinucleotido que hibrida con la SEC ID N.° 3, SEC ID N.° 5, SEC ID N.° 7, SEC ID N.9, SEC ID N.° 11, SEC ID N.° 13, SEC ID N.° 21, SEC ID N.° 25 o SEC ID N.°

29 y/o con un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene la secuencia de la SEC ID N.° 4, SEC ID N.° 6, SEC ID N.° 8, SEC ID N.° 10, SEC ID N.° 12, SEC ID N.° 14, SEC ID N.° 22, SEC ID N.° 23, SEC ID N.° 24, SEC ID N.° 26, SEC ID N.° 27, SEC ID N.° 28, SEC ID N.° 30, SEC ID N.° 31 o SEC ID N.° 32. En determinados casos, la hibridacion se hace en condiciones muy rigurosas.

5

[0153] En determinados casos, los polinucleotidos comprenden la secuencia codificadora del polipeptido maduro fusionado en el mismo marco de lectura que un polinucleotido que ayuda, por ejemplo, a la expresion y secrecion de un polipeptido a partir de una celula huesped (p. ej., una secuencia llder que funciona como secuencia secretora para controlar el transporte de un polipeptido desde la celula). El polipeptido con una secuencia llder es una preprotelna y 10 puede tener la secuencia llder escindida por la celula huesped para producir la forma madura del polipeptido. Los polinucleotidos tambien pueden codificar una proprotelna que es la protelna madura mas restos de aminoacidos 5' adicionales. Una protelna madura que tiene una prosecuencia es una proprotelna y es una forma inactiva de la protelna. Una vez escindida la prosecuencia, queda la protelna madura activa.

15 [0154] En determinados casos, los polinucleotidos comprenden la secuencia codificadora del polipeptido maduro fusionada en el mismo marco de lectura que una secuencia marcadora que permite, por ejemplo, la purificacion y/o identificacion del polipeptido codificado. Por ejemplo, la secuencia marcadora puede ser una etiqueta hexahistidina suministrada por un vector pQE-9 para facilitar la purificacion del polipeptido maduro fusionado al marcador en el caso de un huesped bacteriano, o la secuencia marcadora puede ser una etiqueta hemaglutinina (HA) derivada de la 20 protelna hemaglutinina del virus de la gripe cuando se usa un huesped mamlfero (p. ej., celulas COS-7). En algunos casos, la secuencia marcadora es una etiqueta FLAG, un peptido de secuencia DYKDDDK (SEC ID N.° 33) que puede usarse junto con otras etiquetas de afinidad.

[0155] La presente descripcion ademas se refiere a variantes de los polinucleotidos descritos anteriormente en este 25 documento que codifican, por ejemplo, fragmentos, analogos y/o derivados.

[0156] En determinados casos, la presente descripcion proporciona polinucleotidos que comprenden polinucleotidos que tienen una secuencia nucleotldica al menos el 80% identica, al menos el 85% identica, al menos el 90% identica, al menos el 95% identica y, en algunos casos, al menos el 96%, 97%, 98% o 99% identica a un polinucleotido que

30 codifica un polipeptido que comprende un anticuerpo, o fragmento del mismo, frente a Notch1 humano descrito en este documento.

[0157] Segun se usa en este documento, la frase un polinucleotido que tiene una secuencia nucleotldica al menos, por ejemplo, el 95% «identica» a una secuencia nucleotldica de referencia pretende significar que la secuencia

35 nucleotldica del polinucleotido es identica a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia polinucleotldica puede incluir hasta cinco puntos de mutacion por cada 100 nucleotidos de la secuencia nucleotldica de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleotido que tiene una secuencia nucleotldica al menos el 95% identica a una secuencia nucleotldica de referencia, se pueden delecionar o sustituir hasta el 5% de los nucleotidos de la secuencia de referencia con otro nucleotido, o se pueden insertar en la secuencia de referencia varios nucleotidos hasta el 5% 40 de los nucleotidos totales de la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden producirse en posiciones de los extremos 5' o 3' terminales de la secuencia nucleotldica de referencia o en cualquier lugar entre estas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los nucleotidos en la secuencia de referencia o en uno o mas grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

45 [0158] Las variantes polinucleotldicas pueden contener alteraciones en las regiones codificadoras, en las regiones no codificadoras o en ambas. En algunos casos, las variantes polinucleotldicas contienen alteraciones que producen sustituciones, adiciones o deleciones silenciosas que no alteran las propiedades o actividades del polipeptido codificado. En algunos casos, las variantes polinucleotldicas contienen sustituciones «silenciosas» debido a la degeneracion del codigo genetico. Las variantes polinucleotldicas pueden producirse por diversas razones, por 50 ejemplo, para optimizar la expresion de codones en un huesped en particular (p. ej., cambiar codones en el ARNm humano por los preferidos por un huesped bacteriano como E. coli).

[0159] En algunos casos, los polinucleotidos pueden comprender nucleotidos modificados, tales como nucleotidos metilados y sus analogos. Si se presenta, la modificacion de la estructura nucleotldica puede realizarse antes o 55 despues del ensamblaje del pollmero. La secuencia de nucleotidos puede interrumpirse mediante componentes no nucleotldicos. Un polinucleotido puede ademas modificarse tras la polimerizacion, por ejemplo mediante conjugation con un componente marcado. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, «grupos protectores»; sustitucion de uno o mas de los nucleotidos naturales por un analogo; modificaciones internucleotldicas, tales como enlaces no cargados (p. ej., metilfosfonatos, fosfotriesteres, fosfoamidatos y carbamatos) y con enlaces cargados (p. ej.,

fosforotioatos y fosforoditioatos); restos colgantes, tales como protelnas (p. ej., nucleasas, toxinas, anticuerpos, peptidos senal y poli L-lisina); intercaladores (p. ej., acridina y psoraleno); quelantes (p. ej., metales, metales radiactivos, boro y metales oxidantes); agentes alquilantes; enlaces modificados (p. ej., acidos nucleicos alfa anomericos); as! como formas no modificadas de los polinucleotidos. Ademas, cualquiera de los grupos hidroxilo 5 presentes de forma habitual en los azucares puede sustituirse, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protectores convencionales o activados para preparar enlaces adicionales con nucleotidos adicionales o pueden conjugarse con soportes solidos. Los grupos OH de los extremos 5' y 3' terminales pueden estar fosforilados o sustituidos con aminas o restos de grupos protectores organicos de 1 a 20 atomos de carbono. Otros hidroxilos pueden derivatizarse tambien a grupos protectores convencionales. Los polinucleotidos tambien pueden 10 contener formas analogas de azucares ribosa o desoxirribosa que generalmente son conocidos en la tecnica, incluyendo, por ejemplo, 2'-O-metil-, 2'-O-alil-, 2'-fluoro- o 2'-azido-ribosa, analogos de azucar carboclclicos, azucares alfa-anomericos, azucares epimericos, tales como arabinosa, xilosas y lixosas, azucares piranosa, azucares furanosa, heptulosas, analogos aclclicos y analogos de nucleosidos no basicos, como metil ribosido. Uno o mas enlaces fosfodiester pueden sustituirse por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, pero 15 sin limitaciones, casos en los que el fosfato se sustituye por P(O)S («tioato»), P(S)S («ditioato»), (O)NR2 («amidato»), P(O)R, P(O)OR', CO o CH2 («formacetal»), en el que cada R o R' es independientemente H o un alquilo sustituido o no sustituido (1-20 C) que contiene opcionalmente un enlace eter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todos los enlaces de un polinucleotido tienen que ser identicos.

20 [0160] En determinados casos, los polinucleotidos como se describen en este documento estan aislados. En determinados casos, los polinucleotidos como se describen en este documento estan sustancialmente puros.

[0161] Tambien se proporcionan vectores y celulas que comprenden los polinucleotidos descritos en este documento. En algunos casos, un vector de expresion comprende una molecula de polinucleotido. En algunos casos, 25 una celula huesped comprende un vector de expresion que comprende la molecula de polinucleotido. En algunos casos, una celula huesped comprende una molecula de polinucleotido.

III. Procedimientos de uso y composiciones farmaceuticas

30 [0162] Los agentes de union a Notch1 (p. ej., polipeptidos y/o anticuerpos) de la descripcion son utiles en diversas aplicaciones que incluyen, pero sin limitaciones, procedimientos de tratamiento terapeutico, como el tratamiento de un cancer hematologico. En determinados casos, los agentes son utiles para la modulacion de la actividad Notch1, la inhibicion de la actividad Notch1, la inhibicion o bloqueo de las interacciones Notch1/ligando de Notch, la inhibicion de la senalizacion de Notch1 y/o la inhibicion de la activacion de Notch1. En algunos casos, los agentes de union a Notch1 35 son utiles para bloquear la escision de Notch1, para la inhibicion de la escision con la region proximal a la membrana, para la inhibicion de la escision en el sitio S2 dentro de la region proximal a la membrana y para la inhibicion de la liberacion del dominio intracelular de Notch1. En algunos casos, los agentes de union a Notch1 son utiles en la inhibicion del crecimiento de celulas cancerosas, la reduction del volumen de celulas cancerosas, la reduction de la poblacion de celulas cancerosas, la reduccion de la oncogenicidad de un cancer hematologico, la reduccion de la 40 frecuencia de celulas madre cancerosas en un cancer hematologico, la reduccion de la frecuencia de celulas iniciadoras de leucemia en un cancer hematologico, la induction de la muerte de las celulas cancerosas y/o la induction de diferenciacion. Los procedimientos de uso pueden ser procedimientos in vitro, ex vivo o in vivo. En determinados casos, el agente de union a Notch1 (p. ej., un polipeptido y/o anticuerpo) es un antagonista de Notch1. En determinados casos, el agente de union a Notch1 es un antagonista de la via de senalizacion de Notch. En algunos 45 casos, el agente de union a Notch1 es un antagonista de la activacion de Notch1.

[0163] En determinados casos, los agentes de union a Notch1 como se describen en este documento se usan en el tratamiento de una enfermedad asociada a la senalizacion y activacion de Notch. En casos particulares, la enfermedad es una enfermedad asociada a una via de senalizacion de Notch. En casos particulares, la enfermedad es una

50 enfermedad asociada a un Notch1 activado constitutivamente. En algunos casos, el crecimiento de las celulas cancerosas se asocia con una via de senalizacion de Notch. En algunos casos, el crecimiento de las celulas cancerosas se asocia con la activacion de Notch1. En algunos casos, la enfermedad es un cancer hematologico. En determinados casos, el cancer hematologico es una leucemia mielogena aguda, un linfoma de Hodgkin, un mieloma multiple o una leucemia linfoblastica aguda de celulas T. En algunos casos, la enfermedad es leucemia linfoblastica 55 aguda de celulas T.

[0164] La presente descripcion ademas proporciona procedimientos para inhibir el crecimiento de un cancer hematologico usando los agentes de union a Notch1 descritos en este documento. En determinados casos, el procedimiento de inhibicion del crecimiento de un cancer hematologico comprende poner en contacto las celulas

tumorales con un agente de union a Notchl (p. ej., un anticuerpo) in vitro. Por ejemplo, se cultiva una ilnea celular inmortalizada o una llnea celular de cancer que exprese Notchl en la superficie celular en un medio al cual se anade el anticuerpo u otro agente que inhibe el crecimiento de las celulas cancerosas. En algunos casos, las celulas cancerosas se alslan a partir de la muestra de un paciente, como por ejemplo, una biopsia de tejido, derrame pleural 5 o muestra de sangre, y se cultivan en medio al cual se le anade un agente de union a Notchl para inhibir el crecimiento de dichas celulas cancerosas.

[0165] En algunos casos, el procedimiento de inhibicion del crecimiento de un cancer hematologico comprende poner en contacto las celulas cancerosas con un agente de union a Notchl (p. ej., un anticuerpo) in vivo. En

10 determinados casos, el contacto de las celulas cancerosas con un agente de union a Notchl se lleva a cabo en un modelo animal. Por ejemplo, en un modelo animal de leucemia, se irradian subletalmente ratones inmunocomprometidos (p. ej., ratones NOD/SCID) y, posteriormente, en el plazo de 24 horas se les inyecta por via intravenosa celulas de leucemia humana primaria. Se ha demostrado que las celulas de leucemia humana pueden injertarse en los tejidos hematopoyeticos de los ratones. En un modelo alternativo, a los ratones inmunocomprometidos 15 (p. ej., ratones nOd/SCID) se les inyecta por via intravenosa celulas de leucemia humana primaria sin irradiacion previa. En un modelo animal diferente para leucemia, se irradian subletalmente ratones inmunocomprometidos (p. ej., ratones NOD/SCID) y, posteriormente, se «precondicionan» con celulas mononucleares de medula osea o de sangre de cordon umbilical humanas. Tras un periodo de tiempo (p. ej., 5-7 dlas), a estos ratones se les inyectan celulas procedentes de un paciente que sufre un cancer hematologico como una leucemia linfoblastica aguda de celulas T. 20 Se ha demostrado que las celulas de leucemia se injertan en estos ratones precondicionados (vease, p. ej., Dialynas y col., 2001, Stem Cells 19:443-452, Dialynas y col, 2001, Blood 97:3218-3225 y las patentes de EE. UU. N.° 6.930.222 y 7.186.880).

[0166] En algunos casos, los agentes de union a Notch1 (p. ej., anticuerpos) se administran inmediatamente 25 despues de la inyeccion de las celulas de cancer hematologico para estudiar el efecto de dichos agentes de union a

Notch1 tras el injerto de las celulas cancerosas. En algunos casos, los agentes de union a Notch1 se administran antes de la inyeccion de las celulas de cancer hematologico (p. ej., celulas de leucemia). En algunos casos, los agentes de union a Notch1 administrados despues de las celulas de cancer hematologico se han injertado en los ratones para estudiar el efecto de los agentes de union a Notch1 despues de un cancer hematologico establecido. En algunos 30 casos, los agentes de union a Notch1 administrados despues de las celulas de cancer hematologico se han injertado en ratones precondicionados para estudiar el efecto de los agentes de union a Notch1 despues de un cancer hematologico establecido. En algunos casos, los agentes de union a Notch1 se administran a los ratones 1 dla, 2 dlas, 3 dlas, 4 dlas, 5 dlas, etc. antes de inyectar las celulas de cancer hematologico (p. ej., celulas de leucemia) a los ratones. En algunos casos, los agentes de union a Notch1 se administran a los ratones 1 semana, 2 semanas, 35 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, etc. despues del injerto de las celulas de cancer hematologico. Despues de la administration de agentes de union a Notch1, se observa en los ratones la inhibicion del injerto de las celulas cancerosas y/o la inhibicion del crecimiento de las celulas cancerosas. En algunos casos, las celulas madre cancerosas se alslan a partir de la muestra de un paciente, como por ejemplo, una biopsia de tejido, derrame pleural o muestra de sangre, y se inyectan a ratones inmunocomprometidos a los que se administra a continuation un agente 40 de union a Notch1 para inhibir el crecimiento de las celulas cancerosas. En algunos casos, las celulas madre cancerosas se alslan a partir de la muestra de un paciente, como por ejemplo, una biopsia de tejido, derrame pleural o muestra de sangre, y se inyectan a ratones inmunocomprometidos precondicionados irradiados a los que se administra a continuacion un agente de union a Notch1 para inhibir el crecimiento de las celulas cancerosas. En algunos casos, el agente de union a Notch1 se administra al mismo tiempo o inmediatamente despues de la 45 introduccion de las celulas cancerosas en el animal para prevenir el crecimiento de las celulas cancerosas. En algunos casos, el agente de union a Notch1 se administra como agente terapeutico despues de que las celulas cancerosas se hayan injertado y se haya establecido un cancer hematologico. En algunos casos, las celulas del cancer hematologico comprenden celulas madre cancerosas. En algunos casos, las celulas del cancer hematologico comprenden celulas iniciadoras de leucemia.

50

[0167] La description proporciona procedimientos para inhibir el crecimiento de un cancer hematologico en un sujeto, comprendiendo el procedimiento la administracion al sujeto de una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo que se une especlficamente a una region proximal a la membrana de no union al ligando de un dominio extracelular de Notch1 humano. En algunos casos, el cancer hematologico comprende celulas madre cancerosas. En

55 algunos casos, el cancer hematologico comprende celulas iniciadoras de leucemia. En algunos casos, el procedimiento comprende dirigirse a las celulas madre cancerosas o a las celulas iniciadoras de leucemia con los anticuerpos anti-Notch1 descritos en este documento. En determinados casos, el procedimiento de inhibicion del crecimiento de un cancer hematologico comprende la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de los anticuerpos anti-Notch1 descritos en este documento.

[0168] En determinados casos, el procedimiento de inhibicion del crecimiento de un cancer hematologico comprende la reduccion de la frecuencia de celulas madre cancerosas en el cancer, la reduccion del numero de celulas madre cancerosas en el cancer, la reduccion de la oncogenicidad del cancer y/o la reduccion de la oncogenicidad del cancer

5 mediante la reduccion del numero o frecuencia de celulas madre cancerosas en el cancer. En algunos casos, el procedimiento de inhibicion del crecimiento de un cancer hematologico comprende la inhibicion de la actividad de un receptor Notchl. En determinados casos, el cancer hematologico incluye, pero sin limitaciones, leucemia mielogena aguda, linfoma de Hodgkin, mieloma multiple o leucemia linfoblastica aguda de celulas T. En algunos casos, el cancer hematologico es leucemia linfoblastica aguda de celulas T.

10

[0169] En determinados casos, el procedimiento de tratamiento de un cancer hematologico comprende la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo conjugado con un resto citotoxico que se une especlficamente a una region proximal a la membrana de no union al ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano e inhibe el crecimiento del cancer. En determinados casos, el procedimiento de tratamiento

15 de un cancer hematologico comprende la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo de cualquiera de los aspectos y/o casos, as! como otros aspectos y/o casos descritos en este documento, en combinacion con radioterapia. En determinados casos, el procedimiento de tratamiento de un cancer hematologico comprende la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo de cualquiera de los aspectos y/o casos, as! como otros aspectos y/o casos descritos en este documento, en combinacion con quimioterapia. En

20 determinados casos, el procedimiento de tratamiento de un cancer hematologico comprende la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo que se une especlficamente a una region proximal a la membrana de no union al ligando del dominio extracelular de un receptor Notchl humano y que inhibe el crecimiento del cancer, en el que el cancer hematologico incluye, pero sin limitaciones, leucemia mielogena aguda, linfoma de Hodgkin, mieloma multiple o leucemia linfoblastica aguda de celulas T.

25

[0170] En otro aspecto, la presente descripcion proporciona un procedimiento para tratar un cancer hematologico en un sujeto que lo necesita que comprende la administracion a un sujeto de una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo que se une especlficamente a una region proximal a la membrana de no union al ligando del dominio extracelular de una protelna receptora Notchl humana y que inhibe el crecimiento del cancer en el sujeto. En

30 determinados casos, el procedimiento para tratar un cancer hematologico comprende la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo monoclonal. En determinados casos, el procedimiento para tratar un cancer hematologico comprende la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo quimerico. En determinados casos, el procedimiento para tratar un cancer hematologico comprende la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo humanizado. En determinados casos, el procedimiento para

35 tratar un cancer hematologico comprende la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo humano.

[0171] En determinados casos, el procedimiento de inhibicion del crecimiento de un cancer hematologico comprende la administracion a un sujeto de una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente de union a Notchl. En

40 determinados casos, el sujeto es un humano. En determinados casos, el sujeto tiene un cancer hematologico. En determinados casos, al sujeto se le han extraldo las celulas cancerosas. En algunos casos, el agente de union a Notchl es un anticuerpo. En algunos casos, el agente de union a Notchl es el anticuerpo 52M51. En algunos casos, el agente de union a Notchl es una version humanizada de 52M51.

45 [0172] En determinados casos, la celula de cancer hematologico expresa Notch1 al cual se une el agente de union a Notch1 o el anticuerpo. En algunos casos, el tumor sobreexpresa un Notch1 humano. En algunos casos, el agente de union a Notch1 se une a Notch1 e inhibe o reduce el crecimiento del cancer hematologico. En algunos casos, el agente de union a Notch1 se une a Notch1, interfiere con las interacciones Notch1/ligando de Notch e inhibe o reduce el crecimiento del cancer hematologico. En algunos casos, el agente de union a Notch1 se une a Notch1, inhibe la

50 activacion de Notch e inhibe o reduce el crecimiento del cancer hematologico. En algunos casos, el agente de union a Notch1 se une a Notch1 y reduce la frecuencia de las celulas madre cancerosas en el cancer hematologico. En algunos casos, el agente de union a Notch1 se une a un Notch1 activado constitutivamente e inhibe la actividad de Notch1.

55 [0173] En determinados casos, el cancer hematologico es una leucemia mielogena aguda, un linfoma de Hodgkin, un mieloma multiple o una leucemia linfoblastica aguda de celulas T. En determinados casos, el cancer hematologico es leucemia mielogena aguda. En algunos casos, el cancer hematologico es linfoma de Hodgkin. En determinados casos, el cancer hematologico es mieloma multiple. En determinados casos, el cancer hematologico es leucemia linfoblastica aguda de celulas T. En determinados casos, el sujeto es un humano.

[0174] La presente descripcion ademas proporciona procedimientos para tratar un cancer hematologico usando los agentes de union a Notchl descritos en este documento. En determinados casos, el cancer hematologico se caracteriza por celulas que expresan Notchl al cual se une el agente de union a Notchl (p. ej., anticuerpo). En

5 determinados casos, el cancer hematologico sobreexpresa Notchl humano. En determinados casos, el cancer hematologico se caracteriza por celulas que expresan Notchl, en el que el agente de union a Notchl (p. ej., un anticuerpo) interfiere con la senalizacion y/o activacion de Notch inducida por el ligando de Notch. En algunos casos, el agente de union a Notchl se une a Notchl e inhibe o reduce el crecimiento del cancer hematologico. En algunos casos, el agente de union a Notchl se une a Notchl, interfiere con las interacciones Notchl/ligando de Notch e inhibe

10 o reduce el crecimiento del cancer hematologico. En algunos casos, el agente de union a Notchl se une a Notchl, inhibe la activacion de Notchl e inhibe o reduce el crecimiento del cancer hematologico. En algunos casos, el agente de union a Notch se une a Notch y reduce la frecuencia de las celulas madre cancerosas en el cancer hematologico.

[0175] La presente descripcion proporciona procedimientos para tratar un cancer hematologico que comprenden la

15 administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente de union a Notchl a un sujeto (p. ej., un sujeto

que necesita el tratamiento). En determinados casos, el sujeto es un humano. En determinados casos, el sujeto tiene un cancer hematologico. En determinados casos, al sujeto se le han extraldo las celulas cancerosas. En algunos casos, el agente de union a Notchl es un anticuerpo. En algunos casos, el agente de union a Notchl es el anticuerpo 52M51. En algunos casos, el agente de union a Notchl es una version humanizada de 52M51.

20

[0176] En determinados casos, el cancer hematologico es un cancer seleccionado a parti r del grupo compuesto por leucemia mielogena aguda, linfoma de Hodgkin, mieloma multiple y leucemia linfoblastica aguda de celulas T. En determinados casos, el cancer hematologico es leucemia mielogena aguda. En algunos casos, el cancer hematologico es linfoma de Hodgkin. En determinados casos, el cancer hematologico es mieloma multiple. En determinados casos,

25 el cancer hematologico es leucemia linfoblastica aguda de celulas T. En determinados casos, el sujeto es un humano.

[0177] La descripcion tambien proporciona un procedimiento de inhibicion de la senalizacion de Notch o de la activacion de Notch en una celula que comprende poner en contacto la celula con una cantidad eficaz de un agente de union a Notch1. En determinados casos, la celula es una celula de cancer hematologico. En determinados casos,

30 el procedimiento es un procedimiento in vivo en el que la etapa de poner en contacto la celula cancerosa con el agente de union a Notch1 que comprende la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz del agente de union a Notch1 al sujeto. En algunos casos, el procedimiento es un procedimiento in vitro o ex vivo. En determinados casos, el agente de union a Notch1 inhibe la senalizacion de Notch. En algunos casos, el agente de union a Notch1 inhibe la activacion de Notch. En determinados casos, el agente de union a Notch1 interfiere con la interaccion Notch1/ligando

35 de Notch. En determinados casos, el agente de union a Notch1 inhibe la activacion de Notch de al menos un receptor Notch adicional seleccionado a parti r del grupo compuesto por Notch2, Notch3 y Notch4. En algunos casos, el agente de union a Notch1 es un anticuerpo. En algunos casos, el agente de union a Notch1 es el anticuerpo 52M51. En algunos casos, el agente de union a Notch1 es una version humanizada de 52M51.

40 [0178] Ademas, la descripcion proporciona un procedimiento de reduction de la oncogenicidad de un cancer hematologico en un sujeto, que comprende la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente de union a Notch1 al sujeto. En determinados casos, el cancer hematologico comprende celulas madre cancerosas. En determinados casos, el cancer hematologico comprende celulas iniciadoras de leucemia. En determinados casos, la frecuencia de celulas madre cancerosas en el cancer hematologico se reduce mediante la administracion del agente

45 de union a Notch1. La descripcion tambien proporciona un procedimiento de reduccion de la frecuencia de celulas madre cancerosas en un cancer hematologico que comprende poner en contacto las celulas cancerosas con una cantidad eficaz de un agente de union a Notch1. En algunos casos, el agente de union a Notch1 es el anticuerpo 52M51. En algunos casos, el agente de union a Notch1 es una version humanizada de 52M51.

50 [0179] La descripcion tambien proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto, en el que la enfermedad o trastorno se caracteriza por un nivel mayor de celulas madre cancerosas, celulas iniciadoras de leucemia y/o celulas progenitoras. En algunos casos, los procedimientos de tratamiento comprenden la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz del agente de union a Notch1, polipeptido o anticuerpo al sujeto.

55

[0180] La presente descripcion ademas proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden agentes de union a Notch1, anticuerpos o polipeptidos como se describe en este documento. Estas composiciones farmaceuticas encuentran uso en la inhibicion del crecimiento de celulas cancerosas, la inhibicion del crecimiento de un cancer hematologico y el tratamiento de un cancer hematologico en pacientes humanos.

[0181] Las formulaciones se preparan para su almacenamiento y uso combinando un antagonista purificado (p. ej., anticuerpo) de la presente descripcion con un vehlculo farmaceuticamente aceptable (p. ej., transportador, excipiente, etc.) (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edicion, University of the Sciences Philadelphia, 2005).

5 Los vehlculos farmaceuticamente aceptables incluyen, pero sin limitaciones, tampones no toxicos, como fosfato, citrato y otros acidos organicos; sales como cloruro sodico; antioxidantes que incluyen acido ascorbico y metionina; conservantes como cloruro de amonio de octadecildimetilbencilo; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butllico o bencllico; alquilparabenos como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol y m-cresol; polipeptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10

10 restos de aminoacidos); protelnas como albumina serica, gelatina o inmunoglobulinas; pollmeros hidrofilos como polivinilpirrolidona; aminoacidos como glicina, glutamina, asparragina, histidina, arginina o lisina; hidratos de carbono como monosacaridos, disacaridos, glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; azucares como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales como sodio; complejos metalicos como complejos Zn-protelna y/o tensioactivos no ionicos como TWEEN o polietilenglicol (PEG).

15

[0182] La composicion farmaceutica de la presente descripcion se puede administrar en variedad de formas para el tratamiento local o sistemico. La administracion puede ser topica (como en las membranas mucosas que incluyen la administracion vaginal y rectal) tales como parches transdermicos, podamas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, llquidos y polvos; pulmonar tales como inhalacion o insuflacion de polvos o aerosoles (que

20 incluyen nebulizadores), intratecal, intranasal, epidermal y transdermica; oral; parenteral que incluye inyeccion o infusion intravenosa, intraarterial, intratumoral, subcutanea, intraperitoneal o intramuscular; o intracraneal como intratecal o intraventricular.

[0183] La formulacion terapeutica puede estar en forma farmaceutica de monodosis. Dichas formulaciones incluyen

25 comprimidos, pastillas, capsulas, polvos, granulos, soluciones o suspensiones en agua o medio no acuoso, o

supositorios para administracion oral, parenteral o rectal o para administracion mediante inhalacion. En composiciones solidas como comprimidos, el principio activo principal esta mezclado con un vehlculo farmaceutico. Los componentes convencionales para comprimidos incluyen almidon de malz, lactosa, sacarosa, sorbitol, talco, acido estearico, estearato de magnesio, fosfato dicalcico o gomas y otros diluyentes (p. ej., agua) para formar una composicion

30 preformulacion solida que contiene una mezcla homogenea de un compuesto de la presente descripcion o una sal no toxica farmaceuticamente aceptable del mismo. La composicion preformulacion solida se divide a continuacion en formas farmaceuticas de monodosis del tipo descrito en este documento. Los comprimidos, pastillas, etc. de la composicion nueva pueden recubrirse o combinarse de alguna otra forma para proporcionar una forma farmaceutica que ofrece la ventaja de una accion prolongada. Por ejemplo, el comprimido o pastilla puede comprender una

35 composicion interna recubierta por un componente externo. Asimismo, los dos componentes pueden estar separados por una capa enterica que sirve como resistencia a la desintegracion y permite que el componente interno pase intacto por el estomago o que se retrase su liberacion. Se pueden usar diversos materiales para estas capas o revestimientos entericos, entre estos materiales se incluyen varios acidos polimericos y mezclas de acidos polimericos con materiales como goma laca shellac, alcohol cetllico y acetato de celulosa.

40

[0184] Las formulaciones farmaceuticas incluyen anticuerpos de la presente descripcion formando complejos con liposomas (Epstein, y col., 1985, PNAS, 82:3688; Hwang, y col., 1980, PNAS, 77:4030 y las patentes de Ee. UU. 4.485.045 y 4.544.545). Se describen liposomas con mayor tiempo de circulacion en la patente de EE. UU. N.° 5.013.556. Algunos liposomas se pueden generar mediante evaporacion en fase inversa con una composicion lipldica

45 que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a traves de filtros de un tamano de poro definido para obtener liposomas con el diametro deseado.

[0185] Los anticuerpos tambien se pueden atrapar en microcapsulas. Dichas microcapsulas se preparan, por ejemplo, mediante tecnicas de coacervacion o mediante polimerizacion interfacial, por ejemplo, microcapsulas de

50 hidroximetilcelulosa o gelatina y microcapsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de suministro de farmacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albumina, microemulsiones, nanopartlculas y nanocapsulas) o en macroemulsiones como se describe en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edicion, University of the Sciences Philadelphia 2005.

55 [0186] Ademas, se pueden hacer preparados de liberacion mantenida. Entre los ejemplos adecuados de preparados de liberacion mantenida se incluyen matrices semipermeables de pollmeros hidrofobos solidos que contienen el anticuerpo, estando dichas matrices en forma de artlculos conformados (p. ej., en pellculas o microcapsulas). Entre los ejemplos de matrices de liberacion mantenida se incluyen poliesteres, hidrogeles como poli(2-hidroxietilmetacrilato) o poli(vinilalcohol), polilactidas (patente de EE. UU. N° 3.773.919), copollmeros de acido L-glutamico y 7-etil-L-

glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copollmeros de acido lactico-acido glucolico degradables como el LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copollmero de acido lactico-acido glucolico y acetato de leuprolide), acetato isobutirato de sacarosa y acido poli-D-(-)-3-hidroxibutlrico. En algunos casos, los anticuerpos se pueden usar para tratar diversas afecciones caracterizadas por la expresion y/o mayor sensibilidad de las celulas 5 a un marcador de celulas madre cancerosas. En particular, se preve que los anticuerpos contra un marcador de celula madre cancerosa, por ejemplo Notchl, se usaran para tratar trastornos proliferativos que incluyen, pero sin limitaciones, tumores benignos y malignos del rinon, hlgado, vejiga, mama, estomago, ovario, colon, recto, prostata, pulmon, vulva, tiroides, cabeza y cuello, cerebro (p. ej., glioblastoma, astrocitoma, meduloblastoma) y canceres hematologicos como leucemias y linfomas.

10

[0187] En determinados casos, ademas de la administracion de un agente de union a Notchl, el procedimiento o tratamiento ademas comprende la administracion de al menos un agente terapeutico adicional. Se puede administrar un agente terapeutico adicional antes de, concomitantemente con, y/o despues de la administracion de un agente de union a Notchl. Tambien se proporcionan composiciones farmaceuticas que comprenden el agente de union a Notchl

15 y el o los agentes terapeuticos. En algunos casos, el al menos un agente terapeutico adicional comprende 1, 2, 3 o mas agentes terapeuticos adicionales.

[0188] En la terapia de combination con al menos dos agentes terapeuticos a menudo se usan agentes que funcionan a traves de mecanismos de action diferentes, aunque esto no es necesario. La terapia de combinacion

20 usando agentes con diferentes mecanismos de accion pueden dar lugar a efectos aditivos o sinergicos. La terapia de combinacion puede permitir una dosis mas baja de cada agente que se usa en monoterapia, reduciendo as! los efectos toxicos secundarios. La terapia de combinacion puede reducir la probabilidad de que las celulas cancerosas desarrollen resistencia. La terapia de combinacion puede permitir dirigir un agente a las celulas madre cancerosas oncogenas y un segundo agente a las celulas cancerosas no oncogenas.

25

[0189] Se apreciara que la combinacion de un agente de union a Notchl y un agente terapeutico adicional puede administrarse en cualquier orden o concomitantemente. En algunos casos, el agente de union a Notchl se administrara a los pacientes que hayan recibido previamente tratamiento con un segundo agente terapeutico. En otros casos determinados, el agente de union a Notchl y un segundo agente terapeutico se administrara de forma sustancial

30 simultanea o concomitantemente. Por ejemplo, se puede administrar a un sujeto el agente de union a Notchl (p. ej., un anticuerpo) mientras se esta sometiendo a un ciclo de tratamiento con un segundo agente terapeutico (p. ej., quimioterapia). En determinados casos, el agente de union a Notchl se administrara en el plazo de 1 ano desde el tratamiento con el segundo agente terapeutico. En determinados casos alternativos, el agente de union a Notch1 se administrara en el plazo de 10, 8, 6, 4 o 2 meses desde cualquier tratamiento con el segundo agente terapeutico. En

35 otros casos determinados, el agente de union a Notch1 se administrara en el plazo de 4, 3, 2 o 1 semana desde cualquier tratamiento con un segundo agente terapeutico. En algunos casos, el agente de union a Notch1 se administrara en el plazo de 5, 4, 3, 2 o 1 dla desde cualquier tratamiento con un segundo agente terapeutico. Se apreciara ademas que los dos (o mas) agentes o tratamientos se pueden administrar al sujeto en pocas horas o minutos (es decir, sustancialmente de forma simultanea).

40

[0190] Los agentes terapeuticos usados para el tratamiento de canceres hematologicos incluyen, pero sin limitaciones, daunorubicina, doxorubicina, mitoxantrona e idarubicina; inhibidores de la topoisomerasa como etoposido, teniposido y topotecan; inhibidores de la slntesis de ADN como carboplatino; agentes que danan el ADN como ciclofosfamida e ifosfamida; enzimas citotoxicas como asparraginasa y pegaspargasa; inhibidores de tirosina

45 quinasas como mesilato de imatinib, dasatinib y nilotinib; antimetabolitos como azacitidina, clofarabina, citarabina, cladribina, fludarabina, hidroxiurea, mercaptopurina, metotrexato, tioguanina y nelarabina; hormonas sinteticas como prednisona, prednisolona y dexametasona, agentes antimitoticos como vincristina e inhibidores del proteasoma como bortezomib.

50 [0191] Los agentes terapeuticos que pueden administrarse en combinacion con los agentes de union a Notch1 incluyen los agentes terapeuticos nombrados anteriormente, as! como otros agentes quimioterapeuticos. De este modo, en algunos casos, el procedimiento o el tratamiento supone la administracion combinada de un agente de union a Notch1 o anticuerpo y un agente quimioterapeutico o mezcla de multiples agentes quimioterapeuticos diferentes. El tratamiento con un agente de union a Notch1 o anticuerpo puede realizarse antes de, concomitantemente con, o

55 despues de la administracion de quimioterapias. La administracion combinada puede incluir la coadministracion, bien en una formulation farmaceutica unica o bien usando formulaciones separadas, o la administracion consecutiva en cualquier orden pero generalmente dentro de un periodo de tiempo de modo que todos los agentes activos puedan ejercer sus actividades biologicas simultaneamente. El preparado y las pautas posologicas para estos agentes quimioterapeuticos pueden usarse segun las instrucciones del fabricante o como determine emplricamente el medico

experto. El preparado y las pautas posologicas para esta quimioterapia tambien se describen en Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md. (1992).

[0192] Entre los agentes quimioterapeuticos utiles en la presente descripcion se incluyen, pero sin limitaciones, 5 agentes alquilantes como tiotepa y ciclofosfamida; sulfonatos de alquilo como busulfan, improsulfan y piposulfan;

aziridinas como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluye altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; mostazas nitrogenadas como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de oxido de mecloretamina, melfalan, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; 10 nitrosoureas como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibioticos como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, acido micofenolico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, 15 tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); analogos de acido folico como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; analogos de purina como fludarabina, 6- mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; analogos de pirimidina como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, arabinosido de citosina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; androgenos como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenales such as aminoglutetimida, 20 mitotano, trilostano; restablecedores de acido folico como acido follnico; aceglatona; glucosido de aldofosfamida; acido aminolevullnico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamino; demecolcino; diazicuona; elformitina; acetato de eliptinio; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; acido podofillnico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK; razoxano; sizofurano; espirogermanio; acido tenuazonico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; 25 dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosido (Ara-C); taxoides, por ejemplo, paclitaxel y docetaxel; clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; analogos de platino como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etoposido; ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; teniposido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT11; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina; acido retinoico; esperamicinas; capecitabina; y las sales, acidos o 30 derivados farmaceuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. Entre los agentes quimioterapeuticos tambien se incluyen agentes antihormonales que actuan regulando o inhibiendo la accion de hormonas, como antiestrogenos, sobre los tumores como por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles que inhiben la aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (Fareston) y antiandrogenos como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolido y goserelina, y sales, acidos o derivados farmaceuticamente aceptables 35 de cualquier de los anteriores.

[0193] En determinados casos, el agente quimioterapeutico es un inhibidor de la topoisomerasa. Los inhibidores de la topoisomerasa son agentes quimioterapeuticos que interfieren con la accion de una enzima topoisomerasa (p. ej., topoisomerasa I o II). Entre los inhibidores de la topoisomerasa se incluyen, pero sin limitaciones, doxorubicina HCl,

40 citrato de daunorubicina, mitoxantrona HCl, actinomicina D, etoposido, topotecan HCl, teniposido e irinotecan, as! como sales, acidos o derivados farmaceuticamente aceptables de cualquiera de estos.

[0194] En determinados casos, el agente quimioterapeutico es un antimetabolito. Un antimetabolito es un compuesto qulmico con una estructura que es similar a un metabolito necesario para reacciones bioqulmicas normales, pero

45 suficientemente diferente como para interferir con una o mas funciones normales de las celulas, como la division celular. Entre los antimetabolitos se incluyen, pero sin limitaciones, gemcitabina, fluorouracilo, capecitabina, metotrexato sodico, ralitrexed, pemetrexed, tegafur, arabinosido de citosina, tioguanino, 5-azacitidina, 6- mercaptopurina, azatioprina, 6-tioguanina, pentostatina, fosfato de fludarabina y cladribina, as! como sales, acidos o derivados farmaceuticamente aceptables de cualquiera de estos.

50

[0195] En determinados casos, el agente quimioterapeutico es un agente antimitotico, que incluye, pero sin limitaciones, agentes que unen tubulina. En algunos casos, el agente es un taxano. En determinados casos, el agente es paclitaxel o docetaxel, o una sal, acido o derivado farmaceuticamente aceptable de paclitaxel o docetaxel. En determinados casos alternativos, el agente antimitotico comprende un alcaloide de la vinca, como vincristina,

55 vinblastina, vinorelbina o vindesina, o sales, acidos o derivados farmaceuticamente aceptables de estos.

[0196] En algunos casos, el tratamiento supone un agente de union a Notch1 (p. ej., un anticuerpo) como se describe en este documento en combinacion con un agente quimioterapeutico seleccionado a partir del grupo compuesto por prednisona, vincristina, daunorubicina, L-asparraginasa, metotrexato y ciclofosfamida. En algunos casos, el agente

terapeutico adicional es imatinib, nelarabina o dastinib. En algunos casos, el agente terapeutico adicional es idarubicina, arabinosido de citosina, metoxantrona o gemtuzumab ozogamicina.

[0197] En determinados casos, el tratamiento supone la administration combinada de un agente de union a Notchl 5 (p. ej., un anticuerpo) de la presente description y radioterapia. El tratamiento con un agente de union a Notchl puede

realizarse antes de, concomitantemente con, o despues de la administracion de radioterapia. Las pautas posologicas para dicha radioterapia pueden ser determinadas por el medico experto. En algunos casos, el agente de union o anticuerpo se administra despues de la radioterapia. En algunos casos, el agente de union o anticuerpo se administra con la radioterapia.

10

[0198] En algunos casos, un segundo agente terapeutico comprende un anticuerpo. De este modo, el tratamiento puede suponer la administracion combinada de un agente de union a Notchl (p. ej., un anticuerpo) de la presente descripcion con otros anticuerpos adicionales frente a antlgenos asociados a tumor que incluyen, pero sin limitaciones, anticuerpos que se unen a EGFR, ErbB2, DLL4, Notch o NF-kB. A modo de ejemplo, se describen por ejemplo

15 anticuerpos anti-DLL4 en la patente de EE. UU. N.° 7.750.124. Se describen anticuerpos anti-DLL4 adicionales, por ejemplo, en las publicaciones de patentes internacionales N.° WO 2008/091222 y WO 2008/0793326, y las publicaciones de solicitudes de patente de EE. UU. N.° 2008/0014196, 2008/0175847, 2008/0181899 y 2008/0107648. A modo de ejemplo, se describen por ejemplo anticuerpos anti-Notch en la publication de patente de EE. UU. N.° 2008/0131434. La administracion combinada puede incluir la coadministracion, bien en una formulation farmaceutica 20 unica o bien usando formulaciones separadas, o la administracion consecutiva en cualquier orden pero generalmente dentro de un periodo de tiempo de modo que todos los agentes activos puedan ejercer sus actividades biologicas simultaneamente.

[0199] Ademas, el tratamiento con los agentes de union a Notch1 descritos en este documento pueden incluir el 25 tratamiento de combination con uno o mas citoquinas (p. ej., linfoquinas, interleuquinas, factores de necrosis tumoral

y/o factores de crecimiento) o puede ir acompanado de la extirpation quirurgica de tumores, celulas cancerosas o cualquier otra terapia que se estime necesaria por el medico responsable del tratamiento. Para el tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada de un anticuerpo u otro agente de la presente descripcion depende del tipo de enfermedad que se va a tratar, la gravedad y la evolution de la enfermedad, la capacidad de respuesta de la 30 enfermedad, si el anticuerpo se administra para fines terapeuticos o preventivos, el tratamiento previo, los antecedentes cllnicos del paciente, etc., todo a discretion del medico responsable del tratamiento. El anticuerpo o agente se puede administrar una vez o durante una serie de tratamientos que duran desde varios dlas a varios meses, o hasta que se logre una cura o se consiga una disminucion del estado de la enfermedad (p. ej., reduction del tamano del tumor). Las pautas posologicas optimas se pueden calcular a partir de mediciones de la acumulacion de farmaco 35 en el organismo del paciente y variaran dependiendo de la potencia relativa de un antagonista individual. El medico que realiza la administracion puede determinar facilmente las dosis optimas, las metodologlas de administracion y las frecuencias de repetition. En general, la dosis es de 0,01 pg a 100 mg por kg de peso corporal y se puede administrar una o mas veces al dla, a la semana, al mes o al ano. El medico responsable del tratamiento puede estimar las frecuencias de repeticion de la administracion en funcion de los tiempos de permanencia medidos y de las 40 concentraciones del anticuerpo o agente en los llquidos o tejidos del organismo.

[0200] La presente descripcion proporciona kits que comprenden los anticuerpos descritos en este documento y que se pueden usar para realizar los procedimientos descritos en este documento. En algunos casos, un kit comprende al menos un anticuerpo purificado frente a Notch1 humano, en uno o mas recipientes. En algunos casos, un kit

45 comprende al menos uno anticuerpo purificado frente a una region proximal a la membrana de no union al ligando del dominio extracelular de Notch1 humano, en uno o mas recipientes. En algunos casos, un kit comprende el anticuerpo 52M51 o una variante humanizada de 52M51.

EJEMPLOS

50

Ejemplo 1

[0201] Se generaron anticuerpos frente a una region de no union al ligando de Notch1, especlficamente la region proximal a la membrana de no union al ligando del dominio extracelular. En determinadas realizaciones, se generaron

55 fragmentos polipeptldicos recombinantes del dominio extracelular de Notch1 humano como antlgenos para la production de anticuerpos. Se utilizo la tecnologla convencional de ADN recombinante para aislar los polinucleotidos que codificaban la region proximal a la membrana del dominio extracelular de los aminoacidos 1427-1732 de Notch1 humano (SEC ID N.° 1). Estos polinucleotidos se ligaron por separado en el extremo N-terminal en marco a un Fc humano y a una etiqueta de histidina y se clonaron en un vector plasmldico de transferencia para la expresion mediada

por baculovirus en celulas de insecto. Se utilizaron protocolos convencionales de transfeccion, infeccion y cultivo celular para producir celulas de insecto recombinantes que expresan el correspondiente polipeptido de Notch1 que corresponde a la region proximal a la membrana que comprende los aminoacidos 1427-1732 (SEC ID N.° 2) (O'Reilly y col., 1994, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press).

5

[0202] El polipeptido de la region proximal a la membrana de Notchl (aminoacidos 1472-1732 de Notchl) se purifico a partir de lisados de las celulas de insecto usando cromatografla de afinidad con Ni++-quelato y protelna A como conocen los expertos en la materia. El polipeptido de la region proximal a la membrana de Notch1 purificado se dializo frente a PBS (pH = 7), se concentro hasta aproximadamente 1 mg/ml y se filtro a esterilidad en una preparacion para

10 inmunizacion.

[0203] Se inmunizaron ratones (n = 3) con protelna antigenica Notch1 purificada (Antibody Solutions; Mountain View, CA) usando tecnicas convencionales. Aproximadamente 70 dlas despues de la inmunizacion inicial se analizo en la sangre de cada raton individual el reconocimiento del antlgeno mediante ELISA y FACS (como se describe en este

15 documento). Se seleccionaron los dos animales con los tltulos de anticuerpo mas altos para el refuerzo de antlgeno final tras lo cual se aislaron las celulas del bazo para la produccion de hibridomas. Las celulas de hibridoma se dispusieron a 1 celula por pocillo en placas de 96 pocillos y se analizo en el sobrenadante de cada pocillo mediante ELISA y FACS la actividad frente al polipeptido de la region proximal a la membrana de Notch1. Se seleccionaron varios hibridomas con un tltulo alto de anticuerpo y se llevaron a cultivo en matraz estatico. Los anticuerpos se 20 purificaron a partir del sobrenadante de los hibridomas mediante cromatografla en agarosa de protelna A o protelna G. Los anticuerpos monoclonales purificados se analizaron de nuevo mediante FACS como se describe en este documento. Se aislaron varios anticuerpos que reconoclan la region proximal a la membrana del dominio extracelular del Notch1 humano. Una llnea celular de hibridoma que expresaba el anticuerpo 52M51 se deposito en la ATCC, en las condiciones del Tratado de Budapest, el 7 de agosto de 2008 y se le asigno la Designacion de Deposito de Patente 25 ATTC PTA-9405. Se determinaron las secuencias de nucleotidos y protelnas predichas de la cadena pesada (SEC ID N.° 9 y 10) y de la cadena ligera (SEC ID N.° 3 y 4) del anticuerpo 52M51.

Anticuerpos humanos

30 [0204] En realizaciones alternativas, los anticuerpos humanos que reconocen especlficamente la region proximal a la membrana de no union al antlgeno del dominio extracelular de un receptor Notch1 se alslan usando la tecnologla de despliegue en fagos. En determinadas realizaciones, en una biblioteca de anticuerpos sinteticos que contiene los dominios variables de anticuerpos humanos se analiza el reconocimiento especlfico y de alta afinidad de un antlgeno del receptor Notch descrito en este documento. En determinadas realizaciones, se hace un cribado de una biblioteca 35 de despliegue en fagos de Fab humanos usando una serie de protelnas recombinantes que comprenden la region proximal a la membrana de no union al ligando del dominio extracelular de un receptor Notch1. Brevemente, en la ronda uno se incuban partlculas de fago que despliegan 2 * 1013 Fab con protelna recombinante (inmovilizada pasivamente), los fagos no especlficos se eliminan mediante lavado y, a continuacion, los fagos especlficos se eluyen con pH bajo (celulas) o DTT (protelna recombinante). El resultado del eluido se usa para infectar bacterias TG1 F+, 40 se recupera con un fago auxiliar y, posteriormente, se induce el despliegue de Fab con IPTG (0,25 nM). Este procedo se repite durante dos rondas mas y despues, en la ronda tres se hace un cribado en ELISA frente al antlgeno inmovilizado pasivamente (5 pg/ml).

[0205] Los casetes de CDR de la biblioteca se intercambian especlficamente por medio de sitios de restriccion 45 flanqueantes unicos para la optimizacion de anticuerpos. A continuacion, se clonan las regiones variables humanas

optimizadas en un vector de expresion de Ig que contiene la cadena pesada y la cadena ligera kappa de la IgG1 humana para la expresion de anticuerpos humanos en celulas CHO.

Mapeo de epitopes 50

[0206] Para identificar anticuerpos que reconocen una region proximal a la membrana de no union al ligando especifica de los dominios extracelulares del receptor Notch1, se realiza un mapeo de epitopes. En determinadas realizaciones, se generan vectores plasmidicos de expresion en mamiferos que comprenden un promotor de CMV antes del extremo 5' de los polinucleotidos que codifican fragmentos del dominio Notch1 extracelular como proteinas

55 de fusion Fc, usando tecnologia de ADN recombinante convencional. En determinadas realizaciones, se realiza el mapeo de epitopes de la serie 52M de anticuerpos frente a la region de no union al ligando usando una serie de proteinas de fusion y deleciones de la region proximal a la membrana del dominio extracelular de un Notch1 humano desde aproximadamente el aminoacido 1427 a aproximadamente el aminoacido 1732. Estas proteinas de fusion recombinantes se expresan en celulas HEK 293 transfectadas transitoriamente de las cuales se recoge el medio

condicionado 24 a 48 horas despues de la transfeccion para su analisis mediante ELISA.

[0207] En determinadas realizaciones, los fragmentos de proteina de fusion Notch1 se separan en geles de SDS- PAGE y se analizan con ambos anticuerpos anti-Fc para detectar la presencia de todas las proteinas de fusion frente

5 a anticuerpos anti-Notchl para detectar los dominios reconocidos por cada anticuerpo anti-Notch.

Ejemplo 2

[0208] Se generaron anticuerpos humanizados frente a la region proximal a la membrana del dominio extracelular 10 de Notchl humano. Los dominios variables del anticuerpo monoclonal murino 52M51 se aislaron y secuenciaron a

partir de la linea de hibridoma usando PCR degenerada esencialmente como se describe en Larrick, J.M., y col., 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 160:1250 y en Jones, S.T. & Bendig, M.M., 1991, Bio/Technology 9:88. Las regiones armazon variables de las cadenas pesada y ligera humanas probablemente similares en estructura a las secuencias de aminoacidos del anticuerpo 52M51 parental, se consideran entonces como regiones armazon humanas de 15 referencia para ayudar en el diseno de nuevas regiones armazon sinteticas. Para identificar las regiones armazon humanas que portan similaridad con las regiones armazon murinas de 52M51, se comparan las secuencias proteicas predichas codificadas por los dominios variables murinos Vh y Vl de 52M51 con las secuencias del anticuerpo humano codificadas por el ADNc humano expresado empleando busquedas en BLAST de secuencias humanas depositadas en GenBank. Usando este procedimiento, se seleccionaron secuencias de ADNc humanas expresadas (p. ej., 20 GenBank DA975021, DB242412) y dominios Vh de linea germinal (p. ej., IGHV1-24) para su posterior analisis en el diseno de regiones armazon de la cadena pesada. De forma similar, se consideraron las secuencias de ADNc humanas expresadas (p. ej., GenBank CD709370, CD707373) y Vl de linea germinal (p. ej., IGLV7-46, IGLV8-61) en el diseno de las regiones armazon de la cadena ligera.

25 [0209] Las diferencias en aminoacidos entre las regiones armazon humanizadas candidatas de las cadenas pesadas y los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo monoclonal murino 52M51 parental se evaluaron para determinar su probable importancia y hacer un juicio sobre si cada diferencia en la posicion contribuye al adecuado plegamiento y funcion del dominio variable. Este analisis se baso en el examen de estructuras cristalinas resueltas de otros fragmentos de anticuerpo (p. ej., la estructura de Fab 2E8 como se describe en Trakhanov y col., 30 1999, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 55:122-28, asi como estructuras cristalinas de otras proteinas [p. ej., estructuras del banco de datos de proteinas 1ADQ y 1 GIG]). Las estructuras se modelaron usando software informaticos como Jmol, quick PDB y Pymol. Se tuvo en cuenta el posible impacto de un aminoacido en una posicion determinada sobre el empaquetamiento de la region armazon en lamina-p, la interaccion entre los dominios variables de las cadenas pesada y ligera, el grado de exposicion al solvente de la cadena lateral del aminoacido y la probabilidad 35 de que un aminoacido afectara a la posicion de los lazos de CDR. A partir de este analisis, se concibieron y sintetizaron quimicamente nueve cadenas Vh candidatas fusionadas en marco con la region constante de la IgG2 humana y ocho cadenas Vl candidatas fusionadas en marco con la region constante IgLC1 humana. Las cadenas pesadas candidatas comprenden: i) una region armazon sintetica disenada para asemejarse a las regiones armazon humanas naturales y ii) los CDR del anticuerpo murino 52M51 parental.

40

[0210] La funcionalidad de cada cadena pesada y ligera humanizada variante candidata se analizo mediante cotransfeccion en celulas de mamifero. Cada una de las nueve cadenas pesadas de 52M51 humanizadas candidatas descritas anteriormente se cotransfectaron en celulas HEK 293 con el ADNc de la cadena ligera de 52M51 murino y se analizo mediante ELISA la actividad de union a Notch1 del medio condicionado. Se selecciono la variante de la

45 cadena pesada de 52M51 que mostro la union mas fuerte. Esta variante «52M51-H4» (SEC ID N.° 22) contiene, ademas de las CDR murinas, variaciones en tres posiciones armazon dentro de la region armazon Vh, las posiciones Kabat 20, 48 y 71, en comparacion con una region armazon humana de ejemplo (p. ej., IGHV1-24). La cadena pesada humanizada 52M51-H4 se cotransfecto despues en celulas HEK 293 con cada una de las ocho cadenas ligeras humanizadas candidatas y se analizo de nuevo en el medio condicionado la union a antigeno mediante un ELISA. Se 50 encontro que dos variantes de la cadena ligera, «52M51 L3» (SEC ID N.° 26) y «52M51 L4» (SEC ID N.° 30), mostraban mejor union que las demas candidatas, por lo que se eligieron para posteriores estudios. La variante 52M51 L3 contiene, ademas de los CDR murinos, variacion en una posicion armazon en la posicion Kabat 49 en comparacion con una region armazon humana de ejemplo (p. ej., IGLV7-46). Se desarrollaron dos anticuerpos variantes humanizados, 52M51H4L3 y 52M51H4L4. El polinucleotido que codifica 52M51H4L3 se deposito en la ATCC en las 55 condiciones del Tratado de Budapest el 15 de octubre de 2008 y se le asigno el numero de designacion PTA-9549.

[0211] Las afinidades para Notch1 humano y de raton se determinaron usando un instrumento Biacore 2000. Brevemente, las proteinas Notch1 humana y de raton recombinantes se inmovilizaron en un chip CM5 usando quimica basada en aminas convencional (NHS/eDc). Se inyectaron diferentes concentraciones de anticuerpo sobre las

superficies de protelna y se recopilaron los datos cineticos a lo largo del tiempo. Los datos se ajustaron usando la ecuacion de ajuste global simultaneo para obtener las constantes de disociacion (Kd, nM) para cada Notchl (tabla 2).

Tabla 2

Constantes de disociacion de IgG (Kd)

Anticuerpo: Notch1 humano (nM) Notch1 de raton (nM)

52M51: 2,86 No unido

52M51H4L3: 4,33 No unido

52M51H4L4: 7,35 No unido

Ejemplo 3

Senalizacion del receptor Notch

10

[0212] Se determino la capacidad de los anticuerpos anti-Notchl para bloquear la senalizacion de Notch mediada por ligando. Celulas HeLa modificadas geneticamente para sobreexpresar Notchl (Notch1-HeLa) cultivadas en DMEM complementado con antibioticos y STF al 10% se cotransfectaron con 1) el vector pGL4 8X CBF luciferasa de luciernaga que contenla un promotor sensible a Notch antes del extremo 5' de un gen indicador de luciferasa de

15 luciernaga para medir los niveles de senalizacion de Notch en respuesta al ligando DLL4 y 2) un indicador luciferasa Renilla (Promega, Madison, WI) como control interno de la eficiencia de la transfeccion. Las celulas transfectadas se anadieron a placas de cultivo recubiertas durante toda la noche con 200 ng/pocillo de protelna hDLL4-Fc y despues se anadieron los anticuerpos anti-Notch1 al medio de cultivo. Cuarenta y ocho horas despues de la transfeccion, se midieron los niveles de luciferasa usando un kit de ensayo de luciferasa doble (Promega, Madison WI) con actividad 20 luciferasa de luciernaga normalizada para la actividad luciferasa Renilla. De este modo, se determino la capacidad de los anticuerpos para inhibir la activacion de la via Notch1. Los anticuerpos 52M51,52M63, 52M74 y 52M80, generados contra una region proximal a la membrana del dominio extracelular de Notch1 humano (fig. 1A), reduclan significativamente la actividad luciferasa, lo que era indicativo de una reduccion de la senalizacion de Notch1 en comparacion con otros anticuerpos Notch1 (fig. 1B). Ademas, una variante humanizada del anticuerpo 52M51, la 25 variante 52M51H4L3 mostraba una potencia similar a la hora de reducir la actividad luciferasa (fig. 1C).

[0213] La escision de receptores Notch por furina, ADAM y gamma-secretasa da lugar a la formacion del dominio intracelular (ICD) de Notch, lo que desencadena la posterior senalizacion de Notch en el nucleo. La capacidad de los anticuerpos anti-Notch1 para bloquear la activacion del receptor mediada por ligando se determino mediante analisis

30 por inmunotransferencia. Se crecieron la celulas Notch1-HeLa en un cultivo en suspension en medio 293-SMII (Invitrogen, Carlsbad CA). Las celulas cultivadas se transfirieron a placas de 96 pocillos en las que pocillos seleccionados se hablan recubierto previamente con protelna de fusion DLL4-Fc humana (2 pg/ml) en DMEM mas SBF al 2 % y MG132 1 pM (Calbiochem, San Diego CA). Los anticuerpos generados contra una region proximal a la membrana del dominio extracelular de Notch1 humano se anadieron al medio de cultivo celular y las celulas se 35 incubaron a 37°C durante 5 horas. A continuacion se aspiraron los pocillos y las celulas se resuspendieron en tampon de desarrollo SDS 2X. Las muestras se sonicaron a temperatura ambiente y se sometieron a PAGE en presencia de SDS y a analisis por inmunotransferencia usando un anticuerpo especlfico del ICD de Notch1 escindido segun las recomendaciones del fabricante (Cell Signaling Technology, Danvers MA). El anticuerpo 52M51, as! como los anticuerpos 52M63, 52M74 y 52M80 inhiblan significativamente la generacion del ICD despues de la estimulacion por 40 ligando (fig. 1D).

Ejemplo 4

Evaluacion de los anticuerpos anti-Notch1 en un modelo de xenoinjerto de leucemia 45

[0214] Ratones NOD/SCID de seis a ocho semanas de edad recibieron 350 rads de radiacion corporal total en un equipo de rayos X Pantak HF320 con un tubo de rayos X MXR. Inmediatamente despues, se inyectaron 1 x 107 celulas mononucleares de medula osea humana (Lonza, Walkersville MD) en 0,2 ml de solucion salina tamponada con fosfato (PBS) a traves de la vena de la cola. Siete dlas despues, se resuspendieron 5 x 106 celulas de leucemia humana

50 primaria viables en 0,2 ml de PBS y se inyectaron a traves de la vena de la cola. Comenzando un dla despues, los animales fueron tratados con anticuerpo control (LZ1) o anticuerpo que se une a la region proximal a la membrana del dominio extracelular de Notch1 humano (52M51). Los anticuerpos se administraron a una dosis de 15 mg/kg i.p. una

vez a la semana.

[0215] Cinco semanas despues de la inyeccion de las celulas de leucemia y del tratamiento con anticuerpo, se evaluo el nivel de injerto de las celulas de leucemia en los ratones mediante citometria de flujo. Se uso

5 inmunofluorescencia de dos colores para identificar las celulas de leucemia humana. Se analizo la presencia de celulas humanas en los bazos de los ratones usando un anticuerpo frente al marcador CD45 humano. Las suspensiones celulares de los bazos de ratones se lisaron en Pharmlyse (BD Biosciences, San Jose CA) y, posteriormente, se lavaron y resuspendieron en HBSS mas SBF al 2%. En cada caso, las celulas se tineron con un anticuerpo frente a CD34 (BD Biosciences, San Jose CA) ademas del anticuerpo frente a CD45. Un anticuerpo de raton generado frente 10 a la lisozima humana (LZ-1) sirvio como anticuerpo control de isotipo. Las celulas tambien se tineron con DAPI como marcador de la viabilidad celular.

[0216] Despues de la tincion, las celulas se lavaron, se resuspendieron en HBSS mas SBF al 2% y se mantuvieron en hielo antes del analisis. Las celulas se analizaron usando un citometro de flujo Canto II (Beckman Coulter, Brea

15 CA). Las celulas no viables se excluyeron en funcion de la captation de DAPI, los controles de isotipo correspondientes se procesaron para cada muestra de tejido y se usaron para definir los parametros de selection, los cuales excluian al menos el 99,9% de las celulas del isotipo control. Los bazos de los ratones NOD/SCID no injertados se usaron como controles adicionales para verificar los parametros de seleccion. El injerto de las celulas de leucemia humana se definio como la expresion de al menos el 0,1% de celulas CD45 positivas en una muestra.

20

[0217] Como se muestra en la figura 2, los ratones inyectados con celulas de leucemia humana y tratados con anticuerpo anti-Notch1 52M51 tenian un nivel significativamente menor de injerto (39,7%, p < 0,001) en comparacion con ratones tratados con un anticuerpo control (61,8%).

25 Ejemplo 5

Evaluation in vitro de la inhibition de Notch1 en celulas HPB-ALL

[0218] Las celulas HPB-ALL se adquirieron de DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen). 30 La linea celular HPB-ALL se establecio a partir de la sangre periferica de un paciente con leucemia linfoblastica aguda

y timoma, y se clasifico como una leucemia de celulas T humana. Se anadieron 5000 celulas HPB-ALL a cada uno de los pocillos de las placas de 96 pocillos en medio de cultivo (RPMI con SBF al 15%) y se trataron con anticuerpo anti- Notch1 52M51 (- ■ -), un anticuerpo control (- ▼ -) o dibenzacepina, un inhibidor de gamma-secretasa (- • -). Los anticuerpos se usaron a una concentration de 100 pg/ml con diluciones seriadas 1/3 hasta 1,7 ng/ml. La 35 dibenzacepina se uso a una concentracion de 12 pM con diluciones seriadas 1/3 hasta 0,2 nM y sirvio como control positivo. Las muestras se analizaron por triplicado y el experimento se repitio al menos 4 veces. Despues de 8 dias se analizo la viabilidad celular usando el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® segun las instrucciones del fabricante (Promega, Madison WI). Como se muestra en la figura 3, el anticuerpo anti-Notch1 52M51 era capaz de reducir la viabilidad de las celulas HBP-ALL, lo que demuestra que la inhibicion de Notch1 podria tener efecto sobre 40 la leucemia de celulas T humana in vitro.

Ejemplo 6

Evaluacion in vitro de la inhibicion de Notch1 sobre la proliferation de celulas HPB-ALL 45

[0219] Ki67 es un antigeno nuclear presente en celulas humanas en proliferacion y se puede usar para cuantificar el porcentaje de celulas en proliferacion en un cultivo celular. Las celulas HBP-ALL se cultivaron en presencia de DBZ 12 pM, 100 pg/ml de 52M51 o 100 pg/ml de anticuerpo control. Despues de 5 dias se renovo el medio y el dia 9 se analizo en las celulas la presencia de proteina Ki67. Brevemente, las celulas se lavaron con PBS y se fijaron con una

50 solution de formaldehido al 4% con PBS durante 5 minutos. Las celulas se lavaron en PBS y se permeabilizaron usando tampon PBS con 0,5% de saponina y 2,5% de BSA. La proteina Ki67 se detecto con un anticuerpo anti-Ki67 conjugado con FITC (BD Biosciences, San Jose CA). Como se muestra en la figura 4, el anticuerpo anti-Notch1 52M51 reducia el porcentaje de celulas HPB-ALL en proliferacion aproximadamente un 40% en comparacion con las celulas tratadas con anticuerpo control (60% de celulas Ki67 positivas en comparacion con el 98% de celulas Ki67 positivas). 55

Ejemplo 7

Evaluacion in vitro de la inhibicion de Notch1 sobre la formation del ICD

[0220] Las celulas HBP-ALL se cultivaron en presencia de DBZ 12 pM, 100 pg/ml de 52M51, 100 pg/ml de A2G1 o 100 pg/ml de anticuerpo control. Despues de 5 dlas se renovo el medio y las celulas se recogieron el dla 9. Se prepararon extractos de protelnas de celulas completas con tampon de ensayo de radioinmunoprecipitacion que contenla una mezcla de inhibidores de proteasas (Roche Molecular, Pleasanton CA). Las protelnas se separaron 5 mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) en presencia de SDS y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron en TBS-T (solucion salina tamponada con tris mas 0,1% de Tween 20) que contenla un 5% de leche desnatada para bloquear la union inespeclfica. Las membranas se incubaron a continuacion con un anticuerpo monoclonal de conejo que detectaba el dominio intracelular (ICD) de Notch1 (clon D3B8, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) durante 1 hora a temperatura ambiente en PBS-T con 0,5% de leche. 10 Las membranas se incubaron tambien con anticuerpo de raton anti-actina (clon AC-15, Sigma, St. Louis MO). El anticuerpo primario unido se detecto con anticuerpos anti-conejo/raton conjugados con HRP (Jackson ImmunoResearch Labs, West Grove PA) y se visualizaron con reactivo para inmunotransferencia ECL Plus™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Como se muestra en la figura 5, el anticuerpo anti-Notch 52M51 reducla la cantidad de formacion de ICD en las celulas HPB-ALL tratadas en comparacion con las celulas tratadas con anticuerpo control.

15

Ejemplo 8

Inhibicion del crecimiento tumoral de HPB-ALL in vivo por el anticuerpo anti-Notch1 52M51

20 [0221] Las celulas HPB-ALL (7 x 106 celulas) se inyectaron por via subcutanea en ratones NOD/SCID de 68 semanas de edad. Se dejaron crecer los tumores hasta un tamano promedio de tumor de aproximadamente 111 mm3. El dla 13 los animales se asignaron aleatoriamente en grupos (n = 10 por grupo) y fueron tratados con un anticuerpo control (anticuerpo anti-lisozima LZ-1, -■-) o el anticuerpo anti-Notch1 52M51 (-▼-). Los anticuerpos se administraron a una dosis de 15 mg/kg dos veces a la semana mediante inyeccion intraperitoneal. El crecimiento 25 tumoral se midio los dlas indicados despues del tratamiento con calibres electronicos. Como se muestra en la figura 6, el tratamiento con anticuerpo anti-Notch1 52M51 dio lugar a una reduction significativa del crecimiento de los tumores HPB-ALL en comparacion con el anticuerpo control (p < 0,0001).

Ejemplo 9

30

Evaluation de los anticuerpos anti-Notch1 en un modelo de xenoinjerto de leucemia diseminada

[0222] Se usaron celulas HPB-ALL para establecer xenoinjertos de leucemia diseminada en un modelo de raton. Las celulas HPB-ALL (5 x 106 celulas) se inyectaron en la vena lateral de la cola de ratones NOD/SCID de 635 8 semanas de edad. Un dla despues de la inyeccion de las celulas de leucemia, los animales se asignaron

aleatoriamente en grupos (n = 11-13 por grupo) y fueron tratados con un anticuerpo control, el anticuerpo anti-lisozima LZ-1 (-■-) o el anticuerpo anti-Notch1 52M51 (-▼-). Los anticuerpos se administraron en una unica dosis a 15 mg/kg. Se controlo a los ratones al menos dos veces a la semana en busca de signos de enfermedad, como perdida de peso del 15 al 20%, postura encorvada y desalino, hinchazon craneal y paralisis de las extremidades posteriores. El dla 38, 40 una parte de los ratones del grupo de tratamiento con el anticuerpo control mostraban una perdida de peso corporal del 15% y se sacrificaron todos los animales de ambos grupos. Se determino la presencia de celulas de leucemia humanas en el bazo, sangre periferica y medula osea.

[0223] Cinco semanas despues de la inyeccion de las celulas de leucemia y del tratamiento con anticuerpos, se 45 evaluo el nivel de injerto de las celulas de leucemia en los ratones mediante citometrla de flujo. Se uso

inmunofluorescencia de dos colores para identificar las celulas de leucemia humana. Se recogieron muestras de medula osea, sangre periferica y los bazos de los ratones y se analizo la presencia de celulas humanas usando un anticuerpo frente al marcador cD3 humano. Las suspensiones celulares se lisaron en Pharmlyse (BD Biosciences) y, posteriormente, se lavaron y resuspendieron en HBSS mas SBF al 2%. Las celulas se tineron con anticuerpo anti- 50 CD45 de raton-FITC y anticuerpo anti-H-2Kd de raton-FITC (clones 30F11 y SF1-1.1.1, respectivamente, eBioscience, San Diego CA) para el recuento de celulas murinas, y con anticuerpo anti-CD3 humano-PE (clon OKT3, eBioscience, San Diego CA) para el recuento de celulas de leucemia humanas. Las celulas tambien se tineron con DAPI como marcador de la viabilidad celular.

55 [0224] Despues de la tincion, las celulas se lavaron, se resuspendieron en HBSS mas SBF al 2% y se mantuvieron en hielo antes del analisis. Las celulas se analizaron usando un citometro de flujo Canto II (Beckman Coulter, Brea CA). Las celulas no viables se excluyeron en funcion de la captation de DAPI, los controles de isotipo correspondientes se procesaron para cada muestra de tejido y se usaron para definir los parametros de selection, los cuales exclulan al menos el 99,9% de las celulas del isotipo control. Se usaron celulas de ratones NOD/SCID no injertados y celulas

HPB-ALL cultivadas in vitro como controles adicionales para verificar los parametros de seleccion.

[0225] Como se muestra en la figura 7, el tratamiento con anticuerpo anti-Notch1 52M51 dio lugar a una reduccion significativa del porcentaje de celulas HPB-ALL en medula osea en comparacion con el tratamiento con el anticuerpo

5 control. Los animales tratados con anticuerpo control tenlan una media del 88% de celulas CD3+ humanas en medula osea en comparacion con una media del 16% de celulas CD3+ humanas en los animales tratados con 52M51 (p < 0,0001). Asimismo, el anticuerpo anti-Notchl 52M51 reducla el porcentaje de celulas HPB-ALL en el bazo y sangre periferica de los animales tratados en comparacion con los animales tratados con el anticuerpo control. Los animales tratados con anticuerpo control tenlan una media del 18% de celulas CD3+ humanas en bazo en 10 comparacion con un nivel indetectable en los animales tratados con 52M51. De forma similar, los animales tratados con anticuerpo control tenlan una media del 13% de celulas CD3+ humanas en sangre periferica en comparacion con un nivel indetectable en los animales tratados con 52M51.

[0226] Se entiende que los ejemplos y casos descritos en este documento son solo para fines ilustrativos y que los 15 expertos en la materia podran sugerir diversas modificaciones o cambios.

SECUENCIAS

[0227]

20

SEC ID N.° 1 Polinucleotido que codifica los aminoacidos 1427-1732 de Notch1.

CACATCCTGGACTACAGCTTCGGGGGTGGGGCCGGGCGCGACATCCCCCCGCCGCTGATC GAGGAGGCGTGCGAGCTGCCCGAGTGCCAGGAGGACGCGGGCAACAAGGTCTGCAGCCTG CAGTGCAACAACCACGCGTGCGGCTGGGACGGCGGTGACTGCTCCCTCAACTTCAATGAC CCCTGGAAGAACTGCACGCAGTCTCTGCAGTGCTGGAAGTACTTCAGTGACGGCCACTGT GACAGCCAGTGCAACTCAGCCGGCTGCCTCTTCGACGGCTTTGACTGCCAGCGTGCGGAA GGCCAGTGCAACCCCCTGTACGACCAGTACTGCAAGGACCACTTCAGCGACGGGCACTGC GACCAGGGCTGCAACAGCGCGGAGTGCGAGTGGGACGGGCTGGACTGTGCGGAGCATGTA CCCGAGAGGCTGGCGGCCGGCACGCTGGTGGTGGTGGTGCTGATGCCGCCGGAGCAGCTG CGCAACAGCTCCTTCCACTTCCTGCGGGAGCTCAGCCGCGTGCTGCACACCAACGTGGTC TTCAAGCGTGACGCACACGGCCAGCAGATGATCTTCCCCTACTACGGCCGCGAGGAGGAG CTGCGCAAGCACCCCATCAAGCGTGCCGCCGAGGGCTGGGCCGCACCTGACGCCCTGCTG GGCCAGGTGAAGGCCTCGCTGCTCCCTGGTGGCAGCGAGGGTGGGCGGCGGCGGAGGGAG CTGGACCCCATGGACGTCCGCGGCTCCATCGTCTACCTGGAGATTGACAACCGGCAGTGT GTGCAGGCCTCCTCGCAGTGCTTCCAGAGTGCCACCGACGTGGCCGCATTCCTGGGAGCG CTCGCCTCGCTGGGCAGCCTCAACATCCCCTACAAGATCGAGGCCGTGCAGAGTGAGACC GTGGAGCCGCCCCCGCCG 25 SEC ID N.° 2 Aminoacidos 1427-1732 de Notch1

HILDYSFGGGAGRDIPPPLIEEACELPECQEDAGNKVCSLQCNNHACGWDGGDCSLNFND

PWKNCTQSLQCWKYFSDGHCDSQCNSAGCLFDGFDCQRAEGQCNPLYDQYCKDHFSDGHC

DQGCNSAECEWDGLDCAEHVPERLAAGTLWWLMPPEQLRNSSFHFLRELSRVLHTNW

FKRDAHGQQMIFPYYGREEELRKHPIKRAAEGWAAPDALLGQVKASLLPGGSEGGRRRRE

LDPMDVRGSIVYLEIDNRQCVQASSQCFQSATDVAAFLGALASLGSLNIPYKIEAVQSET

VEPPPP

Secuencias del anticuerpo de raton 52M51:

5 SEC ID N.° 3 Secuencia polinucleotidica de la cadena ligera de 52M51 (la supuesta secuencia senal aparece subrayada)

ATGGCCTGGATTTCACTTATACTCTCTCTCCTGGCTCTCAGCTCAGGGGCCATTTCCCAG

GCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACT

TGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTACGCCAACTGGGTCCAAGAAAAA

CCTGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCTCCAGGTGTTCCT

GCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAG

ACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCACTGGGTGTTCGGT

GGAGGAACCAAACTGACTGTCCTAGGCCAGCCCAAGTCTTCGCCATCAGTCACCCTGTTT

CCACCTTCCTCTGAAGAGCTCGAGACTAACAAGGCCACACTGGTGTGTACGATCACTGAT

TTCTACCCAGGTGTGGTGACAGTGGACTGGAAGGTAGATGGTACCCCTGTCACTCAGGGT

ATGGAGACAACCCAGCCTTCCAAACAGAGCAACAACAAGTACATGGCTAGCAGCTACCTG

ACCCTGACAGCAAGAGCATGGGAAAGGCATAGCAGTTACAGCTGCCAGGTCACTCATGAA

GGTCACACTGTGGAGAAGAGTTTGTCCCGTGCTGACTGTTCCTAG

10 SEC ID N.° 4 Secuencia de aminoacidos de la cadena ligera de 52M51 (la supuesta secuencia senal aparece subrayada)

MAWISLILSLLALSSGAISQAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEK PDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFG GGTKLTVLGQPKSSPSVTLFPPSSEELETNKATLVCTITDFYPGWTVDWKVDGTPVTQG METTQPSKQSNNKYMASSYLTLTARAWERHSSYSCQVTHEGHTVEKSLSRADCS 15 SEC ID N.° 5

Secuencia polinucleotidica de la region variable de la cadena ligera de 52M51 (la supuesta secuencia senal aparece subrayada)

ATGGCCTGGATTTCACTTATACTCTCTCTCCTGGCTCTCAGCTCAGGGGCCATTTCCCAG GCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACT TGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTACGCCAACTGGGTCCAAGAAAAA CCTGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCTCCAGGTGTTCCT GCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAG ACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCACTGGGTGTTCGGT GG AGG AAC C AAACTG ACT GTCCT AGGC

SEC ID N.° 6 Secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera de 52M51 (la supuesta secuencia senal aparece subrayada)

5

MAWISLILSLLALSSGAISQAWTQE SALTTS PGETVTLT CRSSTGAVT T SNY ANWVQEK PDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFG GGTKLTVLGQPKSSPSVTLFPPSSEELETNKATLVCTITDFYPGWTVDWKVDGTPVTQG

SEC ID N.° 7 Secuencia polinucleotldica de la region variable de la cadena ligera de 52M51 sin la supuesta secuencia senal

10

CAGGC TGTT GTGACT CAGGAAT CTGCACTCACCACATCACCT GGTGAAACAGTCACACTC ACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTACGCCAACTGGGTCCAAGAA AAACCTGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCTCCAGGTGTT CCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCA CAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCACTGGGTGTTC

GGTGGAGGAACCAAACTGACTGTCCTAGGC

SEC ID N.° 8 Secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera de 52M51 sin la supuesta secuencia senal 15

QAWTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGV

PARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLG

SEC ID N.° 9 Secuencia polinucleotldica de la cadena pesada de 51M51 (la supuesta secuencia senal aparece subrayada)

ATGGAATGGACCTGGGTCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTAACTGCAGGTGTCCACTCCCAG GTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCC TGCAAGGCTGCTGGCTACACAATGAGAGGCTACTGGATAGAGTGGATAAAGCAGAGGCCT GGACATGGCCTTGAGTGGATTGGACAGATTTTACCTGGAACTGGGAGAACTAACTACAAT GAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTCACTGCAGATACATCCTCCAACACAGCCAACATG CAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCAAGATTTGATGGT AACTACGGTTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGATCCTCAGTCACCGTCTCCTCA GCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAAC TCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACC TGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGAC CTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCCCTCGGCCCAGCGAGACCGTC ACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGG GATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTC CCCCCAAAGCCCAAGGATGTCCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTG GTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAG GTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTC AGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTC AACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATATCCAAAACCAAAGGCAGACCG AAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCT CC CAAGGAGCAGAT GGCCAAGGATAAAGT C AGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATAACAGTGGAGTGGCAGTGG AATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGAACACGAATGGCTCT TACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTC ACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCAC TCTCCTGGTAAATGA

SEC ID N.° 10 Secuencia de aminoacidos de la cadena pesada de 51M51 (la supuesta secuencia senal aparece

subrayada)

5

MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLQQSGAELMKPGASVKISCKAAGYTMRGYWIEWIKQRP

GHGLEWIGQILPGTGRTNYNEKFKGKATFTADTSSNTANMQLSSLTSEDSAVYYCARFDG

NYGYYAMDYWGQGSSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVT

WNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPR DCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVWDISKDDPEVQFSWFVDDVE VHTAQTQ PREEQ FNS T FRSVS ELPIMHQ DWLNGKE FKCRVNSAAFPAPIE KTISKTKGRP KAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGS YFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK

SEC ID N.° 11 Secuencia polinucleotidica de la region variable de la cadena pesada de 52M51 (la supuesta secuencia senal aparece subrayada)

5

ATGGAATGGACCTGGGTCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTAACTGCAGGTGTCCACTCCCAG GTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCC TGCAAGGCTGCTGGCTACACAATGAGAGGCTACTGGATAGAGTGGATAAAGCAGAGGCCT GGACATGGCCTTGAGTGGATTGGACAGATTTTACCTGGAACTGGGAGAACTAACTACAAT GAGAAGTT CAAGGGCAAGGCCACATTCACTGCAGATACATCCTC CAACACAGCCAACATG CAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCAAGATTTGATGGT AACTACGGTTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGATCCTCAGTCACCGTCTCCTCA

SEC ID N.° 12 Secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada de 52M51 (la supuesta secuencia senal aparece subrayada)

10

MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLQQSGAELMKPGASVKISCKAAGYTMRGYWIEWIKQRP

GHGLEWIGQILPGTGRTNYNEKFKGKATFTADTSSNTANMQLSSLTSEDSAVYYCARFDG

NYGYYAMDYWGQGSSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVT

SEC ID N.° 13 Secuencia polinucleotidica de la region variable de la cadena pesada de 52M51 sin la supuesta secuencia senal 15

CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATA

TCCTGCAAGGCTGCTGGCTACACAATGAGAGGCTACTGGATAGAGTGGATAAAGCAGAGG

CCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGACAGATTTTACCTGGAACTGGGAGAACTAACTAC

AATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTCACTGCAGATACATCCTCCAACACAGCCAAC

ATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCAAGATTTGAT

GGTAACTACGGTTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGATCCTCAGTCACCGTCTCC

TCA

SEC ID N.° 14 Secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada de 52M51 sin la supuesta secuencia senal

QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKAAGYTMRGYWIEWIKQRPGHGLEWIGQILPGTGRTNY

NEKFKGKATFTADTSSNTANMQLSSLTSEDSAVYYCARFDGNYGYYAMDYWGQGSSVTVS

SA

SEC ID N.° 15 CDR1 de la cadena pesada de 52M51 5

RGYWIE

SEC ID N.° 16 CDR2 de la cadena pesada de 52M51

10 QILPGTGRTNYNEKFKG

SEC ID N.° 17 CDR3 de la cadena pesada de 52M51

FDGNYGYYAMDY

15

SEC ID N.° 18 CDR1 de la cadena ligera de 52M51 RSSTGAVTTSNYAN

20 SEC ID N.° 19 CDR2 de la cadena ligera de 52M51 GTNNRAP

SEC ID N.° 20 CDR3 de la cadena ligera de 52M51 25

ALWYSNHWVFGGGTKL Secuencias de 52M51 humanizado:

30 f02281

SEC ID N.° 21 Secuencia polinucleotldica de la cadena pesada de 52M51-H4 (la supuesta secuencia senal aparece subrayada)

ATGGATTGGACATGGAGGGTGTTCTGCCTCCTCGCTGTGGCTCCTGGAGTCCTGAGCCAG GTCCAGCTCGTCCAGAGCGGGGCTGAAGTCAAGAAGCCTGGCGCTAGCGTCAAAATCAGC TGTAAGGTCAGCGGATACACACTGAGGGGATACTGGATCGAGTGGGTGAGGCAGGCTCCA GGAAAGGGCCTGGAATGGATCGGCCAGATCCTGCCTGGAACCGGAAGGACAAATTACAAT GAGAAGT TTAAGGGAAGGGT CACAAT GACAGCAGACACAAGCACAGACACAGCTTATAT G GAACTCAGCTCCCTCAGATCCGAGGACACCGCTGTCTACTATTGTGCCAGGTTCGATGGA AATTACGGATACTATGCCATGGATTACTGGGGACAGGGGACAACGGTCACCGTGAGCTCA GCCAGCACAAAGGGCCCTAGCGTCTTCCCTCTGGCTCCCTGCAGCAGGAGCACCAGCGAG AGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCG TGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCA GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACC TACAC CTGCAACGTAGATCACAAGCC CAGCAACACCAAGGT GGACAAGACAGTTGAGCGC AAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTC CTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGC GTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGC GTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGT

GTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGC AAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGG CAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAAC CAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGG GAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGAC GGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAAC GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

SEC ID N.° 22 Secuencia de aminoacidos de la cadena pesada de 52M51-H4 (la supuesta secuencia senal aparece subrayada)

MDWTWRVFCLLAVAPGVLSQVQLVQSGAEVKKPGASVKIS CKVS GYT LRGYWIEWVRQAP GKGLEWIGQILPGTGRTNYNEKFKGRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFDG NYGYYAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRST SE STAALGCLVKDY FPE PVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVER KCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEC ID N.° 23 Secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada de 52M51-H4 (la supuesta secuencia senal aparece subrayada)

5

MDWTWRVFCLLAVAPGVLSQVQLVQSGAEVKKPGASVKIS CKVS GYT LRGYWIEWVRQAP GKGLEWIGQILPGTGRTNYNEKFKGRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFDG NYGYYAMDYWGQGTTVTVSSA

SEC ID N.° 24 Secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada de 52M51-H4 sin la supuesta secuencia senal

10

QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKVSGYTLRGYWIEWVRQAPGKGLEWIGQILPGTGRTNY

NEKFKGRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFDGNYGYYAMDYWGQGTTVTVS

SA

SEC ID N.° 25 Secuencia polinucleotldica de la cadena ligera de 51M51-L3 (la supuesta secuencia senal aparece subrayada)

15

ATGAGCGTCCCTACAATGGCTTGGATGATGCTCCTGCTGGGACTCCTGGCTTATGGAAGC GGAGTGGATAGCCAGGCCGTCGTCACACAGGAACCTAGCCTCACCGTTAGCCCTGGAGGA ACAGTCACACTGACCTGTAGGAGCTCCACAGGAGCTGTGACAACAAGCAATTACGCTAAC TGGTTCCAGCAGAAGCCCGGTCAAGCCCCTAGAACCCTCATCGGCGGCACCAATAACAGA

GCTCCCGGAGTCCCCGCCAGGTTCTCCGGCTCCCTCCTGGGTGGCAAGGCTGCTCTGACA

CTCAGCGGTGCCCAGCCAGAGGATGAAGCGGAGTACTACTGTGCACTGTGGTACAGCAAC

CATTGGGTTTTCGGAGGCGGAACAAAGTTAACCGTCCTCGGGCAGCCTAAGGCTGCTCCT

AGCGTCACACTGTTCCCCCCATCTAGCGAGGAGCTGCAGGCTAACAAGGCAACCCTCGTC

TGCCTGGTTAGCGACTTCTACCCTGGCGCTGTCACAGTGGCCTGGAAAGCTGACGGCTCC

CCTGTGAAAGTTGGCGTCGAAACCACAAAGCCTTCTAAGCAGAGCAATAATAAATATGCC

GCAAGCTCCTACCTCTCCCTGACTCCTGAGCAGTGGAAAAGCCATAGGAGCTACTCCTGC

CGGGTCACACACGAAGGAAGCACAGTGGAAAAGACAGTCGCCCCTGCTGAGTGTAGCTGA

SEC ID N.° 26 Secuencia de aminoacidos de la cadena ligera de 51M51-L3 (la supuesta secuencia senal aparece subrayada)

MSVPTMAWMMLLLGLLAYGSGVDSQAWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYAN

WFQQK PGQAPRTLIGGTNNRAPGVPARFSG S LLGGKAALTLS GAQ PE DEAEYY CALWY SN

HWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGS

PVKVGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAECS

5

SEC ID N.° 27 Secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera de 52M51-L3 (la supuesta secuencia senal aparece subrayada)

MSVPTMAWMMLLLGLLAYGSGVDSQAWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYAN

WFQQKPGQAPRTLIGGTNNRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSN

HWVFGGGTKLTVLG

10

SEC ID N.° 28 Secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera de 52M51-L3 sin la supuesta secuencia senal

SGVDSQAWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWFQQKPGQAPRTLIGGTNN

RAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNHWVFGGGTKLTVLG

15

SEC ID N.° 29 Secuencia polinucleotldica de la cadena ligera de 52M51-L4 (la supuesta secuencia senal aparece subrayada)

ATGAGCGTCCCTACAATGGCTTGGATGATGCTCCTGCTGGGACTCCTGGCTTATGGAAGC

GGAGTGGATAGCCAGACCGTCGTCACACAGGAACCTAGCTTTTCCGTTAGCCCTGGAGGA

ACAGTCACACTGACCTGTAGGAGCTCCACAGGAGCTGTGACAACAAGCAATTACGCTAAC

TGGTATCAGCAGACTCCCGGTCAAGCCCCTAGAACCCTCATCGGCGGCACCAATAACAGA

GCTCCCGGAGTCCCCGACAGGTTCTCCGGCTCCATCCTGGGAAATAAAGCTGCTCTGACA

ATCACAGGTGCCCAGGCTGACGATGAAAGCGACTACTACTGTGCACTGTGGTACAGCAAC

CATTGGGTTTTCGGAGGCGGAACAAAGTTAACCGTCCTCGGGCAGCCTAAGGCTGCTCCT

AGCGTCACACTGTTCCCCCCATCTAGCGAGGAGCTGCAGGCTAACAAGGCAACCCTCGTC

TGCCTGGTTAGCGACTTCTACCCTGGCGCTGTCACAGTGGCCTGGAAAGCTGACGGCTCC

CCTGTGAAAGTTGGCGTCGAAACCACAAAGCCTTCTAAGCAGAGCAATAATAAATATGCC

GCAAGCTCCTACCTCTCCCTGACTCCTGAGCAGTGGAAAAGCCATAGGAGCTACTCCTGC

CGGGTCACACACGAAGGAAGCACAGTGGAAAAGACAGTCGCCCCTGCTGAGTGTAGCTGA

SEC ID N.° 30 Secuencia de aminoacidos de la cadena ligera de 51M51-L4 (la supuesta secuencia senal aparece subrayada)

MSVPTMAWMMLLLGLLAYGSGVDSQTWTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYAN

WYQQTPGQAPRTLIGGTNNRAPGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSN

HWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGS

PVKVGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAECS

SEC ID N.° 31 Secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera de 51M51-L4 (la supuesta secuencia senal aparece subrayada)

5

MSVPTMAWMMLLLGLLAYGSGVDSQTWTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYAN

WYQQTPGQAPRTLIGGTNNRAPGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSN

HWVFGGGTKLTVLG

SEC ID N.° 32 Secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera de 52M51-L4 sin la supuesta secuencia senal

10

SGVDSQTWTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWYQQTPGQAPRTLIGGTNN RAPGVPDRFSGSILGNKAALTIT GAQADDES DYYCALWYSNHWVFGGGTKLTVLG

SEC ID N.° 33 Etiqueta FLAG 15 DYKDDDK

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que se une especlficamente a una region proximal a la membrana de no union al ligando

de un dominio extracelular de Notch1 humano para su uso en el tratamiento de un cancer hematologico, en el que el 5 cancer hematologico es leucemia mielogena aguda, linfoma de Hodgkin, mieloma multiple o leucemia linfoblastica aguda de celulas T; y en el que el anticuerpo comprende:

una CDR1 de cadena pesada que contiene RGYWIE (SEC ID N.° 15);

10 una CDR2 de cadena pesada que contiene QILPGTGRTNYNEKFKG (SEC ID N.°16);

una CDR3 de cadena pesada que contiene FDGNYGYYAMDY (SEC ID N°. 17);

una CDR1 de cadena ligera que contiene RSSTGAVTTSNYAN (SEC ID N.° 18);

15

una CDR2 de cadena ligera que contiene GTNNRAP (SEC ID N.° 19); y

una CDR3 de cadena ligera que contiene ALWYSNHWVFGGGTKL (SEC ID N.° 20).

20 2. El anticuerpo para su uso segun la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo comprende:

i) una region variable de cadena pesada que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con la SEC ID N.° 24 o la SEC ID N.° 14; y/o

25 ii) una region variable de cadena ligera que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con la SEC ID N.° 28, la SEC ID N.° 32 o la SEC ID N.° 8.
3. El anticuerpo para su uso segun la reivindicacion 2, en el que el anticuerpo comprende:

30 i) una region variable de cadena pesada que contiene la SEC ID N.° 24 y una region variable de cadena ligera que contiene la SEC ID N.° 28; o

ii) una region variable de cadena pesada que contiene la SEC ID N.° 24 y una region variable de cadena ligera que contiene la SEC ID N.° 32; o iii) una region variable de cadena pesada que contiene la SEC ID N.° 14 y una region

35 variable de cadena ligera que contiene la SEC ID N.° 8.
4. El anticuerpo para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo es un anticuerpo recombinante, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano o un fragmento de anticuerpo.

40
5. El anticuerpo para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoespeclfico o un anticuerpo biespeclfico.
6. El anticuerpo para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1a 5, en el que el anticuerpo es un 45 anticuerpo monovalente.
7. El anticuerpo para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el anticuerpo es un anticuerpo IgA, IgD, IgE, IgM o IgG; preferiblemente en el que el anticuerpo es un anticuerpo IgG1 o un anticuerpo IgG2.

50
8. El anticuerpo para su uso segun la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo:

i) es el anticuerpo producido por la llnea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Deposito de Patente PTA- 9405 («52M51») o una version humanizada del mismo;

55

ii) esta codificado por el polinucleotido depositado en la ATCC como Deposito de Patente PTA-9549 («52M51 H4L3»).
9. El anticuerpo para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que ademas comprende la administracion de al menos un agente terapeutico adicional, en el que:

i) preferiblemente, el agente terapeutico adicional es un agente quimioterapeutico; o

ii) preferiblemente, el agente terapeutico adicional es un anticuerpo terapeutico adicional, como un anticuerpo que se 5 une especlficamente a un segundo receptor Notch, o a un ligando del receptor Notch.
10. El anticuerpo para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el anticuerpo esta

conjugado con un agente citotoxico.

10 11. El anticuerpo para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el anticuerpo se

administra:

i) despues de radioterapia; o 15 ii) con radioterapia.
12. El uso del anticuerpo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de la leucemia mielogena aguda, el linfoma de Hodgkin, el mieloma multiple o la leucemia linfoblastica aguda de celulas T.

20
13. Una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y un vehlculo farmaceuticamente aceptable.