ES2561851T3 - Fármacos de ácido nucleico ENA que modifican el corte y empalme en precursores de ARNm - Google Patents

Fármacos de ácido nucleico ENA que modifican el corte y empalme en precursores de ARNm Download PDF

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Abstract

Un compuesto capaz de inducir el salto del exón 51 del gen de la distrofina, que es (a) un oligonucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en una cualquiera de las SEC ID N.º 64, 66, 87 y 88 donde al menos uno de los azúcares que constituye el oligonucleótido está modificado, y donde dicho azúcar es Dribofuranosa y al menos una modificación de dicho azúcar es 2'-O,4'-C-alquilenación de la D-ribofuranosa, o (b) un compuesto representado por la fórmula general (XV"); o una sal farmacológicamente aceptable del mismo, donde dicha fórmula general se define del siguiente modo: BT"15-BM"15-BB"15 (XV") donde BT"15 es un grupo representado por uno cualquiera de los siguientes (15a") a (15j"): (15a")HO-, (15b")HO-Bt-, (15c")HO-Bc-Bt-, (15d")HO-Bt-Bc-Bt-, (15e")HO-Bt-Bt-Bc-Bt-, (15f')HO-Bt-Bt-Bt-Bc-Bt-, (15g")HO-Ba-Bt-Bt-Bt-Bc-Bt-, (15h")HO-Bc-Ba-Bt-Bt-Bt-Bc-Bt-, (15i")HO-Bg-Bc-Ba-Bt-Bt-Bt-Bc-Bt- o (15j")HO-Bg-Bg-Bc-Ba-Bt-Bt-Bt-Bc-Bt- BM"15 es un grupo representado por la siguiente fórmula (15"): -Ba-Bg-Bt-Bt-Bt-Bg-Bg-Ba-Bg- (15") BB"15 es un grupo representado por uno cualquiera de los siguientes (115a") a (115j"): (115a")-CH2CH2OH, (115b")-Ba-CH2CH2OH, (115c")-Ba-Bt-CH2CH2OH, (115d")-Ba-Bt-Bg-CH2CH2OH, (115e")-Ba-Bt-Bg-Bg-CH2CH2OH, (115f')-Ba-Bt-Bg-Bg-Bc-CH2CH2OH, (115 g")-Ba-Bt-Bg-Bg-Bc-Ba-CH2CH2OH, (115h")-Ba-Bt-Bg-Bg-Bc-Ba-Bg-CH2CH2OH, (115i")-Ba-Bt-Bg-Bg-Bc-Ba-Bg-Bt-CH2CH2OH, o (115j")-Ba-Bt-Bg-Bg-Bc-Ba-Bg-Bt-Bt-CH2CH2OH donde Bg es un grupo representado por la siguiente fórmula (G1) o (G2); Ba es un grupo representado por la siguiente fórmula (A1) o (A2); Bc es un grupo representado por la siguiente fórmula (C1) o (C2); y Bt es un grupo representado por la siguiente fórmula (U1) o (T2):**Fórmula** donde X es individual e independientemente un grupo representado por la siguiente fórmula (X1) o (X2):**Fórmula** Y es individual e independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo o un grupo alcoxi con 1-6 átomos de carbono; y Z es individual e independientemente un enlace sencillo o un grupo alquileno con 1-5 átomos de carbono; con la condición de que al menos uno de los nucleósidos que constituyen el compuesto representado por la fórmula (XV") tenga un grupo 2'-O,4'-alquileno.

Description

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[6] El compuesto de [5] anterior, que se selecciona entre los compuestos (XV"-1), (XV"-2), (XV"-3), (XV"-4), (XV"-17), 5 (XV"-18), (XV"-19) y (XV"-20).
[7] Un agente terapéutico para la distrofia muscular, que comprende el compuesto de uno cualquiera de [1] a [6] anterior o una sal farmacológicamente aceptable del mismo.
[8] El agente terapéutico de [7] anterior, cuya diana de tratamiento es aquellos pacientes en que la cantidad total de
los aminoácidos en la fase de lectura abierta del gen de la distrofina será un múltiplo de 3 cuando el exón 51 del gen 10 de la distrofina se ha saltado.
[9] Un compuesto de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [6] anterior o un agente terapéutico de acuerdo con [7] u
[8] anterior para su uso en el tratamiento de la distrofia muscular.
[10] Uso de un compuesto de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [6] anterior en la fabricación de un medicamento para tratar la distrofia muscular.
15 [11] Uso de acuerdo con [10] anterior donde la diana de tratamiento es aquellos pacientes en que la cantidad total de los aminoácidos en la fase de lectura abierta del gen de la distrofina será un múltiplo de 3 cuando el exón 51 del gen de la distrofina se ha saltado.
[12] Un agente terapéutico de acuerdo con [7] u [8], un compuesto o agente terapéutico para su uso de acuerdo con
[9] o un uso de acuerdo con [10] u [11] donde dicha distrofia muscular es distrofia muscular de Duchenne.
20 El término "oligonucleótido" usado en la presente invención abarca no solamente oligo ADN u oligo ARN, sino también un oligonucleótido en que al menos una D-ribofuranosa que constituye el oligonucleótido está 2'-Oalquilada; un oligonucleótido en que al menos una D-ribofuranosa que constituye el oligonucleótido está 2'-O,4'-Calquilenada; un oligonucleótido en que al menos un fosfato que constituye el oligonucleótido está tioado; o una
25 combinación de los mismos. Dichos oligonucleótidos en que al menos una D-ribofuranosa que constituye el oligonucleótidos está 2'-O-alquilada o 2'-O,4'-C-alquilenada tiene elevada fuerza de unión a ARN y elevada resistencia a nucleasa. Por tanto, se espera que produzcan mayores efectos terapéuticos que los nucleótidos naturales (es decir oligo ADN u oligo ARN). Además, un oligonucleótido en que al menos un fosfato que constituye el oligonucleótido está tioado también tiene elevada resistencia a nucleasa y, por tanto, se espera que produzca mayor
30 efecto terapéutico que los nucleótidos naturales (es decir oligo ADN u oligo ARN). Un oligonucleótido que comprende tanto el azúcar modificado como el fosfato modificado como se ha descrito anteriormente aún tiene mayor resistencia a nucleasa y, por tanto, se espera que produzca aún mayor efecto terapéutico.
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(EJEMPLO DE REFERENCIA 3)
hAON8 [FAM-GCU UUU CUU UUA GUU GCU GC (SEC ID N.º: 25); todos los nucleótidos son 2'-O-metilnucleótido y se enlazan entre sí por un enlace fosforotioato] que se divulga en un documento (van Deutekom, J.C.T. et al. (2001) 5 Hum. Mol. Genet. 10, 1547-1554) y se conoce como un oligonuleótido que induce que el salto del exón 46 se sintetizó de acuerdo con el documento anterior.
(EJEMPLO DE REFERENCIA 4)
Síntesis de HO
Gmp-Ae2p-Amp-Amp-Amp-Ce2p-Gmp-Ce2p-Ce2p-Gmp-Cmp-Ce2p-Amp-Te2p-Ump-Ump-Ce2p-Te2p-CH2CH2OH (AO100)
El presente compuesto se sintetizó con un sintetizador automático de ácidos nucleicos (sintetizador de ADN/ARN PerkinElmer ABI modelo 394) en un programa de ADN de 40 nmol. Las concentraciones de disolventes, reactivos y 15 fosforoamiditas en ciclos individuales de síntesis fueron las mismas que las usadas en la síntesis de oligonucleótidos naturales. Los disolventes, reactivos y fosforoamiditas de 2'-O-metilnucleósido (forma adenosina: producto N.º 271822-41; forma guanosina: producto N.º 27-1826-41; forma citidina: producto N.º 27-1823-02; forma uridina: producto N.º 27-1825-42) fueron productos de Amersham Pharmacia. Como fosforoamiditas no naturales, se usaron aquellos compuestos divulgados en el Ejemplo 55 (5'-O-dimetoxitritil-2'-O,4'-C-etileno-6-N-benzoiladenosina-3'-O-(2cianoetil N,N-diisopropil)fosforoamidita), Ejemplo 68 (5'-O-dimetoxitritil-2'-O,4'-C-etileno-N-isobutililguanosina-3'-O-(2cianoetil N,N-diisopropil)fosforoamidita), Ejemplo 63 (5'-O-dimetoxitritil-2'-O,4'-C-etileno-4-N-benzoil-5-metilcitidina-3'O-(2-cianoetil N,N-diisopropil)fosforoamidita), y Ejemplo 50 (5'-O-dimetoxitritil-2'-O,4'-C-etileno-5-metiluridina-3'-O-(2cianoetil N,N-diisopropil)fosforoamidita) de la publicación de patente japonesa no examinada N.º 2000-297097. El presente compuesto se sintetizó en un vidrio de poro controlado modificado (CPG) (divulgado en el Ejemplo 12b de
25 la publicación de patente japonesa no examinada N.º H7-87982) como soporte sólido. Sin embargo, el periodo de tiempo para la condensación de amiditas fue de 15 min.
El análogo oligonucleotídico protegido que tiene la secuencia de interés se trató con amoniaco acuoso concentrado para cortar de este modo el oligómero del soporte y, al mismo tiempo, retirar los grupos cianoetilo protectores en átomos de fósforo y los grupos protectores en bases de ácido nucleico. El disolvente se retiró por destilación a presión reducida, y el residuo resultante se purificó por HPLC de fase inversa [Shimadzu modelo LC-10VP; columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A: acetonitrilo al 5 %, acetato de trietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución B: acetonitrilo B%: 10 %  45 % (8 min, gradiente lineal); 60 ºC; 2 ml/min; 254 nm]. Se recogió la fracción eluida a 6,55 min. Después de retirar por destilación el disolvente a presión reducida,
35 se añadió solución acuosa de ácido acético al 80 % al residuo, que después se dejó durante 20 min para retirar el grupo DMTr. Después de retirar por destilación el disolvente, el residuo resultante se disolvió en 0,5 ml de agua y se filtró con Ultrafree-MC (Millipore: producto N.º UFC4 OHV 25). El disolvente se retiró por destilación para obtener de este modo el compuesto de interés (1,40 unidades A260) (λmax (H2O) = 264 nm). Cuando se analizó por HPLC de fase inversa [columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A: acetonitrilo al 5 %, acetato de trietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución B: acetonitrilo al 25 %, TEAA 0,1 M B%: 20 %  100 % (10 min, gradiente lineal); 60 ºC; 2 ml/min; 254 nm], el presente compuesto se eluyó a 5,40 min. El compuesto se identificó por análisis espectrométrico de masas ESI de iones negativos (valor calculado: 6245,68).
La secuencia de nucleótidos del presente compuesto es complementaria a los nucleótidos N.º. 6133-6155 del ADNc 45 de la distrofina (N.º de acceso a Gene Bank NM_004006.1).
(EXÓN 51)
(EJEMPLO 1)
Te2p-Ge2p-Te2p-Ge2p-Te2p-Cmp-Amp-Cmp-Cmp-Amp-Gmp-Amp-Gmp-Ump-Amp-Ae2p-Ce2p-Ae2p-Ge2p-Te2p-CH2CH2OH (AO3)
El compuesto del Ejemplo 1 que tiene una secuencia de interés se sintetizó de la misma manera que en el Ejemplo de referencia 4, excepto que la N,N-diisopropilfosforamidita de fenil2-cianoetilo (Hotoda, H. et al. Nucleosides & 55 Nucleotides 15, 531-538, (1996)) se usó en la condensación final para introducir fenilfosfato en el extremo terminal 5’. Después de la desprotección, el producto resultante se purificó por HPLC de fase inversa [Shimadzu modelo LC10VP; columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A: acetonitrilo al 5 %, acetato de trietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución B: % de acetonitrilo B: 5 %  15 % (10 min, gradiente lineal); 60 ºC; 2 ml/min; 254 nm]. Se recogió la fracción eluida a 5,24 min. Después de retirar por destilación el disolvente, el residuo resultante se disolvió en 0,5 ml de agua y se filtró con Ultrafree-MC (Millipore: producto N.º UFC4 OHV 25). El disolvente se retiró por destilación para obtener de este modo el compuesto de interés (1,21 unidades A260) (λmax (H2O) = 259 nm). Cuando se analizó por HPLC de fase inversa [columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A: acetonitrilo al 5 %, acetato de trietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución B: % de acetonitrilo B: 5 %  15 % (10 min, gradiente lineal); 60 ºC; 2 ml/min; 254 nm], el presente compuesto se eluyó a
65 5,79 min. El compuesto se identificó por análisis espectrométrico de masas ESI de iones negativos (valor calculado: 6240,22; valor medido: 6239,82).
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acetonitrilo B: 5 % → 15 % (10 min, gradiente lineal); 60 ºC; 2 ml/min; 254 nm], el presente compuesto se eluyó a 6,46 min. El compuesto se identificó por análisis espectrométrico de masas ESI de iones negativos (valor calculado: 7037,82; valor medido: 7036,73).
5 La secuencia de nucleótidos del presente compuesto es complementaria a los nucleótidos N.º 7738-7757 de ADNc de la distrofina (N.º de acceso a Gene Bank NM_004006,1).
(EJEMPLO 8)
Síntesis de HO-Te2p-Ae2p-Ae2p-Ce2p-Ae2p-Gmp-Ump-Cmp-Ump-Gmp-Amp-Gmp-Ump-Ae2p-Ge2p-Ge2p-Ae2p-Ge2p-CH2CH2 OH (AO37)
El compuesto del Ejemplo 8 que tiene una secuencia de interés se sintetizó de la misma manera que se sintetizó el compuesto del Ejemplo de referencia 4. Después de la desprotección, el producto resultante se purificó por HPLC de
15 fase inversa [Shimadzu modelo LC-10VP; columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A: 5 % acetonitrilo, acetato de trietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución B: % de acetonitrilo B: 10 % →45 % (10 min, gradiente lineal); 60 ºC; 2 ml/min; 254 nm]. Se recogió la fracción eluida a 7,64 min. Después de retirar el disolvente por destilación a presión reducida, se añadió una solución acuosa al 80 % de ácido acético al residuo, que después se dejó durante 20 min para retirar el grupo DMTr.. Después de retirar por destilación el disolvente, el residuo resultante se disolvió en 0,5 ml de agua y se filtró con Ultrafree-MC (Millipore: producto N.º UFC4 OHV 25). El disolvente se retiró por destilación para obtener de este modo el compuesto de interés (17,9 unidades A260) (λmax (H2O) = 257 nm). Cuando se analizó por HPLC de fase inversa [columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A: acetonitrilo al 5 %, acetato de trietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución B: acetonitrilo al 25 %, TEAA 0,1 M B%: 20 %  60 % (10 min, gradiente lineal); 60 ºC; 2 ml/min;
25 254 nm], el presente compuesto se eluyó a 9,03 min. El compuesto se identificó por análisis espectrométrico de masas ESI de iones negativos (valor calculado: 6344,26; valor medido: 6343,66).
La secuencia de nucleótidos del presente compuesto es complementaria a los nucleótidos N.º 7554-7571 del ADNc de la distrofina (N.º de acceso a Gene Bank NM_004006.1).
(EJEMPLO 9)
Síntesis de HO-
Ge2p-Ge2p-Ce2p-Ae2p-Te2p-Ump-Ump-Cmp-Ump-Amp-Gmp-Ump-Ump-Te2p-Ge2p-Ge2p-Ae2p-Ge2p-CH2CH2OH (AO39)
35 El compuesto del Ejemplo 9 que tiene una secuencia de interés se sintetizó del mismo modo que se sintetizó el compuesto del Ejemplo de referencia 4. Después de la desprotección, el producto resultante se purificó por HPLC de fase inversa [Shimadzu modelo LC-10VP; columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A: acetonitrilo al 5 %, acetato de trietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución B: acetonitrilo B%: 10 %  45 % (10 min, gradiente lineal); 60 ºC; 2 ml/min; 254 nm]. Se recogió la fracción eluida a 6,82 min. Después de retirar el disolvente por destilación a presión reducida, se añadió solución acuosa de ácido acético al 80 % al residuo, que después se dejó durante 20 min para retirar el grupo DMTr. Después de retirar por destilación el disolvente, el residuo resultante se disolvió en 0,5 ml de agua y se filtró con Ultrafree-MC (Millipore: producto N.º UFC4 OHV 25). El disolvente se retiró por destilación para obtener de este modo el compuesto de interés (17,5
45 unidades A260) (λmax (H2O) = 250 nm). Cuando se analizó por HPLC de fase inversa [columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A: acetonitrilo al 5 %, acetato de trietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución B: acetonitrilo al 25 %, TEAA 0,1 M B%: 20 %  60 % (10 min, gradiente lineal); 60 ºC; 2 ml/min; 254 nm], el presente compuesto se eluyó a 6,27 min. El compuesto se identificó por análisis espectrométrico de masas ESI de iones negativos (valor calculado: 6289,17; valor medido: 6289,10).
La secuencia de nucleótidos del presente compuesto es complementaria a los nucleótidos N.º 7612-7629 del ADNc de la distrofina (N.º de acceso a Gene Bank NM_004006.1).
(EJEMPLO 10)
55 Síntesis de HO-Ae2p-Ge2p-Ce2p-Ce2p-Ae2p-Gmp-Ump-Cmp-Gmp-Gmp-Ump-Amp-Amp-Ge2p-Te2p-Te2p-Ce2p-Te2p-CH2CH2OH (AO43)
El compuesto del Ejemplo 10 que tiene una secuencia de interés se sintetizó del mismo modo que se sintetizó el compuesto del Ejemplo 1. Después de la desprotección, el producto resultante se purificó por HPLC de fase inversa [Shimadzu modelo LC-10VP; columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A: acetonitrilo al 5 %, acetato de trietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución B: acetonitrilo B%: 10 %  45 % (10 min, gradiente lineal); 60 ºC; 2 ml/min; 254 nm]. Se recogió la fracción eluida a 6,76 min. Después de retirar el disolvente por destilación a presión reducida, se añadió solución acuosa de ácido acético al 80 % al residuo, que
65 después se dejó durante 20 min para retirar el grupo DMTr. Después de retirar por destilación el disolvente, el residuo resultante se disolvió en 0,5 ml de agua y se filtró con Ultrafree-MC (Millipore: producto N.º UFC4 OHV 25).
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El disolvente se retiró por destilación para obtener de este modo el compuesto de interés (6,57 unidades A260) (λmax (H2O) = 258 nm). Cuando se analizó por HPLC de fase inversa [columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A: acetonitrilo al 5 %, acetato de trietilamina acuosa 0,1 M (TEAA), pH 7.0; solución B: acetonitrilo al 25 %, TEAA 0,1 M B%: 20 % → 60 % (10 min, gradiente lineal); 60°C; 2 ml/min; 254 nm], el presente
5 compuesto se eluyó a 8,90 min. El compuesto se identificó por análisis espectrométrico de masas ESI de iones negativos (valor calculado: 6313,28; valor medido: 6313,15).
La secuencia de nucleótidos del presente compuesto es complementaria a los nucleótidos N.º 7684-7701 de ADNc de la distrofina (N.º de acceso a Gene Bank NM _004006.1).
(EJEMPLO 11)
Síntesis de HO-Ae2p-Ge2p-Te2p-Te2p-Te2p-Gmp-Gmp-Amp-Gmp-Amp-Ump-Gmp-Gmp-Ce2p-Ae2p-Ge2p-Te2p-Te2p-CH2CH2OH (AO58)
15 EL compuesto del Ejemplo 11 que tiene una secuencia de interés se sintetizó del mismo modo que se sintetizó el compuesto del Ejemplo de referencia 4. Después de la desprotección, el producto resultante se purificó por HPLC de fase inversa [Shimadzu modelo LC-10VP; columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A: acetonitrilo al 5 %, acetato de trietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución B: acetonitrilo B%: 10 % → 38 % (8 min, gradiente lineal); 60°C; 2 ml/min; 254 nm]. Se recogió la fracción eluida a 6,62 min. Después de retirar el disolvente por destilación a presión reducida, se añadió solución acuosa de ácido acético al 80 % al residuo, que después se dejó durante 20 min para retirar el grupo DMTr. Después de retirar por destilación el disolvente, el residuo resultante se disolvió en 0,5 ml de agua y se filtró con Ultrafree-MC (Millipore: producto N.º UFC4 OHV 25). El disolvente se retiró por destilación para obtener de este modo el compuesto de interés (10,7
25 unidades A260) (λmax (H2O) = 258 nm). Cuando se analizó por HPLC de fase inversa [columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A: acetonitrilo al 5 %, acetato de trietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución B: acetonitrilo al 25 %, TEAA 0,1 M B%: 20 %  80 % (10 min, gradiente lineal); 60 ºC; 2 ml/min; 254 nm], el presente compuesto se eluyó a 4,80 min. El compuesto se identificó por análisis espectrométrico de masas ESI de iones negativos (valor calculado: 6313,28; valor medido: 6313,15).
La secuencia de nucleótidos del presente compuesto es complementaria a los nucleótidos N.º 7603-7620 del ADNc de la distrofina (N.º de acceso a Gene Bank NM_004006.1).
(EJEMPLO 12)
35 Síntesis de HO-Gmp-Gmp-Ce2p-Amp-Te2p-Te2p-Ump-Ce2p-Te2p-Amp-Gmp-Ump-Te2p-Te2p-Gmp-Gmp-Ae2p-Gmp-CH2CH2OH (AO131)
El compuesto del Ejemplo 12 que tiene una secuencia de interés se sintetizó de la misma manera que el compuesto del Ejemplo de referencia 4. Después de la desprotección, el producto resultante se purificó por HPLC de fase inversa [Shimadzu modelo LC-10VP; columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A: acetonitrilo al 5 %, acetato de trietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución B: acetonitrilo B%: 10 % →45 % (8 min, gradiente lineal); 60°C; 2 ml/min; 254 nm]. Se recogió la fracción eluida a 6,27 min. Después de retirar el disolvente por destilación a presión reducida, se añadió solución acuosa de ácido acético al 80 % al residuo, que
45 después se dejó durante 20 min para retirar el grupo DMTr. Después de retirar por destilación el disolvente, el residuo resultante se disolvió en 0,5 ml de agua y se filtró con Ultrafree-MC (Millipore: producto N.º UFC4 OHV 25). El disolvente se retiró por destilación para obtener de este modo el compuesto de interés (1,80 unidades A260). Cuando se analizó por HPLC de intercambio iónico [columna: Tosoh TSK-gel DEAE-5PW (7,5 x 75 mm); solución A: acetonitrilo al 20 %; solución B: acetonitrilo al 20 %, tampón fosfato 67 mM (pH 6,8), KBr 1,5 M, gradiente: solución B 15→ 60 % (10 min, gradiente lineal); 40°C; 2 ml/min], el presente compuesto se eluyó a 4,89 min.
La secuencia de nucleótidos del presente compuesto es complementaria a los nucleótidos N.º 7612-7629 del ADNc de la distrofina (N.º de acceso a Gene Bank NM_004006.1).
55 (EJEMPLO 13)
Síntesis de HO-Gms-Gms-Ce2s-Ams-Te2s-Te2s-Ums-Ce2s-Te2s-Ams-Gms-Ums-Te2s-Te2s-Gms-Gms-Ae2s-Gms-CH2CH2OH
(AO132)
El compuesto del Ejemplo 13 que tiene una secuencia de interés se sintetizó del mismo modo que se sintetizó el compuesto del Ejemplo de referencia 4. Sin embargo, la parte con un enlace fosforotioato se sulfuró tratando con una solución mixta de hidruro de xantano 0,02 M/acetonitrilo-piridina (mezcla 9:1) durante 15 min, en lugar de la etapa de oxidación con yodo-H2O. Después de la desprotección, el producto resultante se purificó por HPLC de fase inversa [Shimadzu modelo LC-10VP; columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A:
65 acetonitrilo al 5 %, acetato de trietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución B: acetonitrilo B%: 10 %  45 % (8 min, gradiente lineal); 60 ºC; 2 ml/min; 254 nm]. Se recogió la fracción eluida a 6,47 min. Después de retirar el
20
disolvente por destilación a presión reducida, se añadió solución acuosa de ácido acético al 80 % al residuo, que después se dejó durante 20 min para retirar el grupo DMTr. Después de retirar por destilación el disolvente, el residuo resultante se disolvió en 0,5 ml de agua y se filtró con Ultrafree-MC (Millipore: producto N.º UFC4 OHV 25). El disolvente se retiró por destilación para obtener de este modo el compuesto de interés (15.1 unidades A260).
5 Cuando se analizó por intercambio iónico [columna: Tosoh TSK-gel DEAE-5PW (7,5 x 75 mm); solución A: acetonitrilo al 20 %; solución B: acetonitrilo al 20 %, tampón fosfato 67 mM (pH 6,8), KBr 1,5 M; gradiente: solución B 20  80 % (10 min, gradiente lineal); 40 ºC; 2 ml/min], el presente compuesto se eluyó a 8,46 min.
La secuencia de nucleótidos del presente compuesto es complementaria a los nucleótidos N.º 7612-7629 del ADNc de la distrofina (N.º de acceso a Gene Bank NM_004006.1).
(EJEMPLO 14)
Síntesis de HO-Ae2s-Gms-Te2s-Ums-Te2s-Gms-Gms-Ae2s-Gms-Ams-Te2s-Gms-Gms-Ce2s-Ae2s-Gms-Te2s-Te2s-CH2CH2OH 15 (AO139)
El compuesto del Ejemplo 14 que tiene una secuencia de interés se sintetizó de la misma manera que el Ejemplo de referencia 4. Sin embargo, la porción con un enlace fosforotioato se sulfurizó por tratamiento con una solución mezcla de hidruro de xantano 0,02 M/acetonitrilo-piridina (mezcla 9:1) durante 15 min, en lugar de la etapa de oxidación con yodo-H2O. Después de la desprotección, el producto resultante se purificó por HPLC de fase inversa [Shimadzu modelo LC-10VP; columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A: acetonitrilo al 5 %, acetato de trietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución B: acetonitrilo B%: 10 %  45 % (8 min, gradiente lineal); 60 ºC; 2 ml/min; 254 nm]. Se recogió la fracción eluida a 7,08 min. Después de retirar el disolvente por destilación a presión reducida, se añadió solución acuosa de ácido acético al 80 % al residuo, que
25 después se dejó durante 20 min para retirar el grupo DMTr. Después de retirar por destilación el disolvente, el residuo resultante se disolvió en 0,5 ml de agua y se filtró con Ultrafree-MC (Millipore: producto N.º UFC4 OHV 25). El disolvente se retiró por destilación para obtener de este modo el compuesto de interés (12,9 unidades A260). Cuando se analizó por HPLC de intercambio iónico [columna: Tosoh TSK-gel DEAE-5PW (7,5 x 75 mm); solución A: acetonitrilo al 20 %; solución B: acetonitrilo al 20 %, tampón fosfato 67 mM (pH 6,8), KBr 1,5 M; gradiente: solución B 20  80 % (10 min, gradiente lineal); 40 ºC; 2 ml/min], el presente compuesto se eluyó a 6,92 min.
La secuencia de nucleótidos del presente compuesto es complementaria a los nucleótidos N.º 7603-7620 del ADNc de la distrofina (N.º de acceso a Gene Bank NM_004006.1).
35 (EJEMPLO 15)
Síntesis de HO-Ae2p-Gmp-Te2p-Ump-Te2p-Gmp-Gmp-Ae2p-Gmp-Amp-Te2p-Gmp-Gmp-Ce2p-Ae2p-Gmp-Te2p-Te2p-CH2CH2O H (AO140)
El compuesto del Ejemplo 15 que tiene una secuencia de interés se sintetizó de la misma manera que el Ejemplo de referencia 4. Después de la desprotección, el producto resultante se purificó por HPLC de fase inversa [Shimadzu modelo LC-10VP; columna: Merck, Chromolith Performance RP-18e (4,6 x 100 mm); solución A: acetonitrilo al 5 %, acetato de trietilamina acuoso 0,1 M (TEAA), pH 7,0; solución B: acetonitrilo B%: 10 %  45 % (8 min, gradiente lineal); 60 ºC; 2 ml/min; 254 nm]. Se recogió la fracción eluida a 6,47 min. Después de retirar el disolvente por
45 destilación a presión reducida, se añadió solución acuosa de ácido acético al 80 % al residuo, que después se dejó durante 20 min para retirar el grupo DMTr. Después de retirar por destilación el disolvente, el residuo resultante se disolvió en 0,5 ml de agua y se filtró con Ultrafree-MC (Millipore: producto N.º UFC4 OHV 25). El disolvente se retiró por destilación para obtener de este modo el compuesto de (3,54 unidades A260). Cuando se analizó por HPLC de intercambio iónico [columna: Tosoh TSK-gel DEAE-5PW (7,5 x 75 mm); solución A: acetonitrilo al 20 %; solución B: acetonitrilo al 20 %, tampón fosfato 67 mM (pH 6,8), KBr 1,5 M; gradiente: solución B 20  80 % (10 min, gradiente lineal); 40 ºC; 2 ml/min], el presente compuesto se eluyó 5,54 min.
La secuencia de nucleótidos del presente compuesto es complementaria a los nucleótidos N.º7603-7620 del ADNc de la distrofina (N.º de acceso a Gene Bank. NM_004006.1).
55 (EJEMPLO DE ENSAYO) Método para el análisis de la capacidad de inducción del salto de exón por ENA antisentido
Preparación de cultivo primario de células mioblásticas
Se estableció un cultivo primario de células mioblásticas como se describe a continuación.
1. Se cortaron muestras de tejido muscular tomadas del músculo recto del muslo de pacientes con distrofia muscular de Duchenne en trozos finos y se lavaron con PBS dos veces.
65 2. El tejido muscular de 1 anterior se trató con Difco Bacto™ triptona 250 (solución al 5 % en PBS) a 37 ºC
21
durante 30 min para obtener de este modo células libres enzimáticamente.
3.
Las células libres de 2 anterior se lavaron con DMEM (que contenía FBS al 20 %) dos veces.
4.
Las células de 3 anterior se suspendieron en DMEM (que contenía FBS al 20 % y ultroser G al 4 %).
5. Las células en suspensión de 4 se pasaron a través de una malla (Becton Dickinson: filtro celular 35-2360) 5 para recuperar solamente células libres.
6.
Las células recuperadas de 5 anterior se sembraron en placas recubiertas con gelatina.
7.
Las células se cultivaron a 37 ºC en una atmósfera de CO2 al 5 % en aire.
Inducción de diferenciación
La diferenciación de las células musculares se indujo como se describe a continuación.
1. Las células cultivadas obtenidas anteriormente se sembraron en placas de 6 pocillos (recubiertas con
gelatina). Cuando las células se hicieron confluyentes, se intercambió el medio con DMEM (que contenía suero 15 de caballo al 2 % (HS)).
2. Después de un cultivo de 4 días, las células se transfectaron con los compuestos preparados en los Ejemplos (ENA) como se describe a continuación.
Transfección de ENA
Las células mioblásticas se transfectaron con los compuestos preparados en los Ejemplos (ENA) como se describe a continuación.
1.
Se disolvieron 200 pmol de cada uno de los compuestos preparados en los Ejemplos (10 µg/20 µl de milliQ) en 25 100 µl de Opti-MEM (GIBCO-BRL).
2.
Se añadieron 6 µl de reactivo Plus (GIBCO-BRL) a la solución de 1 anterior, que después se dejó a temperatura ambiente durante 15 min.
3.
En otro tubo, se disolvieron 8 µl de Lipofectamina (GIBCO-BRL) en 100 µl de Opti-MEM.
4.
Después de completar el tratamiento de 2 anterior, la solución de 3 anterior se añadió a la solución de 2 anterior. La solución resultante se dejó a temperatura ambiente durante otros 15 min.
5.
Las células mioblásticas 4 días después del inicio de la inducción de diferenciación se lavaron con PBS una vez. Después, se añadieron 800 µl de Opti-MEM a las mismas.
6.
Después de completar el tratamiento de 4 anterior, la solución tratada se añadió a las células de 5 anterior.
7.
Las células de 6 anterior se cultivaron a 37 ºC en una atmósfera de CO2 al 5 % en aire durante 3 h. Después, 35 se añadieron 500 µl de DMEM (que contenía HS al 6 %) a cada pocillo.
8. Las células se cultivaron adicionalmente.
Extracción de ARN
Se extrajo el ARN como se describe a continuación.
1. Las células transfectadas con ENA se cultivaron durante 2 días y después se calentaron con PBS una vez. A estas células, se añadieron 500 µl de ISOGEN (Nippon Gene).
2. Las células se dejaron a temperatura ambiente durante 5 min, seguido de recuperación de ISOGEN en cada 45 pocillo en tubos.
3.
Se extrajo el ARN de acuerdo con el protocolo de ISOGEN (Nippon Gene).
4.
Finalmente, se disolvió el ARN en 20 µl de DEPW.
Trascripción inversa
La transcripción inversa se realizó como se describe a continuación.
1. A 2 µg de ARN, se añadió DEPW (agua esterilizada tratada con dietilpirocarbonato) para hacer una solución de 6 µl.
55 2. A la solución de 1 anterior, se añadieron 2 µl de hexámero aleatorio (Invitrogen: 3 µg/µl de producto se diluyó a factor 20 antes de su uso).
3.
La solución resultante se calentó a 65º durante 10 min.
4.
Después, la solución se enfrió en hielo durante 2 min.
5.
A la solución de reacción anterior, se añadió lo siguiente:
transcriptasa inversa MMLV (Invitrogen: 200 U/µl) 1 µl inhibidor de ribonucleasa placentaria humana (Takara: 40 U/µl) 1 µl DTT (adjuntado a transcriptasa inversa MMLV) 1 µl tampón (adjuntado a transcriptasa inversa MMLV) 4 µl
65 dNTP (adjuntado a Takara Ex Taq) 5 µl
22
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