ES2562260T3 - Análogos del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1) que tienen una sustitución de aminoácidos en la posición 59 - Google Patents

Análogos del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1) que tienen una sustitución de aminoácidos en la posición 59 Download PDF

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Abstract

Un análogo de IGF-1 de fórmula (I), H- A-1-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-A28-A29-A30-A31-A32-A33-A34-A35-A36-A37-A38-A39-A40-A41-A42-A43-A44-A45-A46-A47-A48-A49-A50-A51-A52-A53-A54-A55-A56-A57-A58-A59-A60-A61-A62-A63-A64-A65-A66-A67-A68-A69-A70-A71-R1, (I) en donde: A59 es Asn; A-1 es Met, Ser o eliminado; A1 es Gly o eliminado; A2 es Pro, Lys o eliminado; A3 es Glu o eliminado; A4 es Thr; A5 es Leu; A6 es Cys, hCys, ß-Me-Cys, N-Me-Cys o Pen; A7 es Gly; A8 es Ala; A9 es Glu; A10 es Leu; A11 es Val; A12 es Asp; A13 es Ala; A14 es Leu; A15 es Gln; A16 es Phe; A17 es Val; A18 es Cys, hCys, ß-Me-Cys, N-Me-Cys o Pen; A19 es Gly; A20 es Asp; A21 es Arg; A22 es Gly; A23 es Phe; A24 es Tyr; A25 es Phe; A26 es Asn; A27 es Lys, Arg o Pro; A28 es Pro o Lys; A29 es Thr; A30 es Gly; A31 es Tyr; A32 es Gly; A33 es Ser; A34 es Ser; A35 es Ser; A36 es Arg; A37 es Arg; A38 es Ala; A39 es Pro; A40 es Gln; A41 es Thr; A42 es Gly; A43 es Ile; A44 es Val; A45 es Asp; A46 es Glu; A47 es Cys, hCys, ß-Me-Cys, N-Me-Cys o Pen; A48 es Cys, hCys, ß-Me-Cys, N-Me-Cys o Pen; A49 es Phe, Arg, Leu o Thr; A50 es Arg o Ser; A51 es Ser, Aib, Arg o Thr; A52 es Cys, hCys, ß-Me-Cys, N-Me-Cys o Pen; A53 es Asp, Arg o Ser; A54 es Leu o A6c; A55 es Arg o Tyr; A56 es Arg o Gln; A57 es Leu; A58 es Glu o Arg; A60 es Tyr o Phe; A61 es Cys, hCys, ß-Me-Cys, N-Me-Cys o Pen; A62 es Ala o Asn; A63 es Pro, D-Pro, Thr o eliminado; A64 es Leu, D-Leu, des-Leu o eliminado; A65 es Lys, D-Lys, des-Lys, Arg o eliminado; A66 es Pro, D-Pro o eliminado; siempre que las cadenas laterales de las parejas de residuos A6 y A48, A47 y A52, y A18 y A61, formen cada una un enlace disulfuro; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. A67 es Ala, D-Ala, Aib o eliminado; A68 es Lys, D-Lys, Arg o eliminado; A69 es Ser, D-Ser, Aib, Thr o eliminado; A70 es Ala, D-Ala, Glu o eliminado; y A71 es eliminado, Asp, Glu, Lys o Ser; y 5 R1 es OH o NH2; siempre que las cadenas laterales de las parejas de residuos A6 y A48, A47 y A52, y A18 y A61, formen cada una un enlace disulfuro; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

DESCRIPCION
Análogos del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1) que tienen una sustitución de aminoácidos en la posición 59
Campo de la invención
5 La presente invención se refiere a nuevos análogos del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1), a composiciones farmacéuticas que contienen dichos análogos y al uso de dichos análogos para el tratamiento de afecciones mediadas por el receptor de IGF-1, tales como estatura baja, terapia de la diabetes, tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y reparación del cartílago. Más particularmente, la presente invención se refiere a nuevos análogos de IGF-1 que tienen una sustitución de aminoácidos en la posición 59, p. ej., (Asn59)hlGF-1(1-70)- 10 OH, y otra(s) sustitución(es) tal y como se definen en esta memoria.
Técnica anterior
IGF-1 es una hormona polipeptídica de 70 aminoácidos que tiene actividades biológicas similares a la insulina y de crecimiento mitogénico. Esta hormona mejora el crecimiento de las células en una variedad de tejidos, incluyendo el sistema musculoesquelético, el hígado, los riñones, el intestino, los tejidos del sistema nervioso, el corazón y los 15 pulmones.
El IGF-1 de tipo silvestre tiene la siguiente secuencia de aminoácidos con tres puentes disulfuro intracatenarios en donde las cadenas laterales de las parejas de residuos A6 y A45 * * 48, A47 y A52, y A18 y A61, forman cada una un enlace disulfuro (SEQ ID NO:50):

Gly-Pro-Giu-Thr-Lcu-Cys-Gly-Ala-Glu-Leu-Val-Asp-Ala-Leú-Gln-Phe-Val-Cys- I 5 JO 15
GÍy-Asp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Phe-Asn-Lys-Pro-Thr-Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-

20 25 30 35

Arg-Aia-Pro-Gln-Thr-Gly-Jle-Val-Asp-GJu-Cys-Cys-Phc-Arg-Ser-Cys-Asp-Leu- 40 45 50

Arg-Arg-LeuGlu-Met-Tyr-CyS-Ala-Pro-Leu-Lys-Pro-Ala-Lys-Ser-Ala 55 60 65 70
20 Aunque IGF-1 está presente en una amplia variedad de tejidos corporales, se encuentra normalmente en una forma inactiva en la que está unido a una proteína que se une a IGF (IGFBP). Se conocen seis IGFBPs relacionadas y han sido designadas IGFBP1 - IGFBP6. Véase, p. ej., Holly y Martin, "Insulin-like Growth Factor Binding Proteins: A Review of Methodological Aspects of Their Purification, Analysis and Regulation", Growth Regul., 4 (Supl. 1):20-30
(1994) . Las IGFBPs tienen un papel importante en la regulación de IGF-1 al ejercer efectos inhibidores y/o 25 estimulantes sobre la acción de IGF-1. Por ejemplo, aproximadamente el 90% del IGF-1 circulante está presente en
un complejo trimolecular que contiene IGFBP-3 y la subunidad ácido lábil. El IGF-1 dentro de tales complejos es incapaz de unirse a los receptores de superficie, y por lo tanto es biológicamente inactivo. El IGF-1 presente dentro del complejo trimolecular también tiene una semivida sustancialmente más larga que el IGF-1 que no forma complejo.
30 La alteración de la acción de IGF-1 puede contribuir a una serie de trastornos fisiológicos que incluyen trastornos neurodegenerativos tales como la enfermedad de la motoneurona (es decir, esclerosis lateral amiotrófica (ELA)), distrofia muscular y esclerosis múltiple, trastornos del cartílago, tales como osteoartritis, enfermedades óseas tales como osteoporosis, trastornos inflamatorios tales como artritis reumatoide, lesiones isquémicas en órganos tales como el corazón, el cerebro o el hígado, y demás.
35 Como es bien conocido por los expertos en la técnica, los usos conocidos y potenciales de IGF-1 son variados y muy numerosos. Por ejemplo, una serie de estudios informan sobre el uso de IGF-1 como un agente terapéutico potencial para el tratamiento de afecciones neurodegenerativas. Véase, p. ej., Kanje et al., Brain Res., 486:396-398 (1989); Hantai et al., J. Neurol. Sci., 129:122-126 (1995); Contreras et al., Pharmac. Exp. Therap., 274:1443-1499
(1995) ; Di Giulio et al., Society for Neuroscience, 22:1960 (1996); Di Giulio et al., Society for Neuroscience, 23:894
40 (1997); Hsu et al., Biochem. Mol. Med., 60(2):142-148 (1997); Gorio et al., Neuroscience, 82:1029-1037 (1998). La
terapia con IGF-1 se ha indicado en numerosas afecciones neurológicas, incluyendo ELA, derrame cerebral, epilepsia, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, lesión traumática aguda y otros trastornos asociados con traumatismo, envejecimiento, enfermedad o lesión. Véanse, p. ej., los documentos de patente de EE.UU. n° 5.093.137; 5.652.214; 5.703.045; las Publicaciones Internacionales n°WO 90/1483 y WO 93/02695.
45 El uso de una terapia con IGF-1 para una variedad de otras afecciones se ha descrito en una serie de publicaciones.
Véanse, p. ej., Schalch et al., "Modern Concepts of Insulin-Like Growth Factors," ed. Spencer (Elsevier, New York),
págs. 705-714 (1991); Clemmons y Underwood, J. Clin. Endocrinol. Metab., 79(1):4-6 (1994); y Langford et al., Eur.
J. Clin. Invest., 23(9):503-516 (1993) (en referencia, p. ej., a estados resistentes a la insulina y diabetes); y O'Shea et
al., Am. J. Physiol., 264:F917-F922 (1993) (en referencia, p. ej., a una función renal reducida). También véanse los
5
10
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20
25
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35
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45
documentos de patente de EE.UU. n° 7.258.864 (en referencia a la estatura baja); patente de EE.UU. n° 5.110.604 y 5.427.778 (en referencia, p. ej., a la curación de heridas); patente de EE.UU. n° 5.126.324 (en referencia, p. ej., a trastornos cardiacos y a retardo del crecimiento); patente de EE.UU. n° 5.368.858 (en referencia, p. ej., a defectos o lesiones en el cartílago); patentes de EE.UU. n°. 5.543.441 y 5.550.188 (en referencia, p. ej., al aumento de tejidos); patente de EE UU. n° 5.686.425 (en referencia, p. ej., al tejido de cicatrización, la disfunción muscular localizada y la incontinencia urinaria); y patente de EE.UU. n° 5.656.598 (en referencia, p. ej., al crecimiento óseo). También véanse los documentos de Publicación Internacional n°WO 91/12018 (en referencia, p. ej., a trastornos intestinales); WO 92/09301 y WO 92/14480 (en referencia a p. ej., la curación de heridas); WO 93/08828 (en referencia, p. ej., al daño neuronal asociado con isquemia, hipoxia o la neurodegeneración); WO 94/16722 (en referencia, p. ej., a la resistencia a la insulina); WO 96/02565A1 (en referencia a, p. ej., el complejo IGF/IGFBP para favorecer la formación del hueso y para la regulación de la remodelación ósea); Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. n° 2003/0100505 (en referencia, p. ej., a la osteoporosis); y Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. n° 2005/0043240 (en referencia a la obesidad).
A pesar de que la terapia con IGF-1 ha sido utilizada para una serie de indicaciones fisiológicas, los resultados han sido a veces impredecibles. Efectos beneficiosos a corto plazo a veces no persisten (véase, p. ej., Miller et al., Kidney International, 46:201-207, (1994)) y se pueden producir efectos secundarios no deseados, en particular por la administración de dosis elevadas y/o la administración a largo plazo (véase, p. ej., Jabri et al., Diabetes, 43:369-374 (1994); Wilton, Acta Paediatr., 393:137-141 (1992)). Además, se ha descrito que niveles de IGF-1 elevados aumentan el riesgo de cáncer de próstata (Chan et al., Science, 278:563-566 (1998)).
Por consiguiente, existe una necesidad en la técnica de mejores vías para para tratar las afecciones que responden a IGF-1 y/u otras proteínas que se unen a proteínas que se unen al factor de crecimiento similar a la insulina. La presente invención satisface estas necesidades y proporciona además otras ventajas relacionadas.
Compendio de la invención
Como han descubierto los inventores de la presente invención, mediante la sustitución del residuo de metionina en la posición 59 del IGF-1 de tipo silvestre que es químicamente inestable y que se puede oxidar fácilmente con otro aminoácido según se describe en esta memoria, p. ej., (Asn59)hlGF-1(1-70)-OH, los análogos resultantes de IGF-1 son químicamente más estables y, por ello son menos susceptibles de una oxidación durante la producción, la purificación, el almacenamiento, etc.
Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona un análogo de IGF-1 de fórmula (I),
a-1-a1-a2-a3-a4-a5-a6-a7-a8-a9-a10-a11-a12-a13-a14-a15-a16-a17-a18-a19-a20-a21-a22-a23-a24-a25-a26-a27-a28-a29-a30- A31-a32-a33-a34-A35-A36-A37-A38-A39-A40-A41-A42-A43-A44-A45-A46-A47-A48-A49-A50-A51-A52-A53-A54-A55-A56-A57-A58-A59- a60-a61 -a62-a63-a64-a65-a66-a67-a68-a69-a70-a71-r1 , (I)
en donde:
A59 es Asn;
A'1 es Met, Ser o eliminado;
A1 es Gly o eliminado;
A2 es Pro, Lys o eliminado;
A3 es Glu o eliminado;
A4 es Thr;
A5 es Leu;
A6 es Cys, hCys, (3-Me-Cys, N-Me-Cys o Pen; A7 es Gly;
A8 es Ala;
A9 es Glu;
A10 es Leu;
A11 es Val;
A12 es Asp;
5
10
15
20
25
30
35
A13 es Ala;
A14 es Leu;
A15 es Gln;
A16 es Phe;
A17 es Val;
A18 es Cys, hCys, p-Me-Cys, N-Me-Cys o Pen; A19 es Gly;
A20 es Asp;
A21 es Arg;
A22 es Gly;
A23 es Phe;
A24 es Tyr;
A25 es Phe;
A26 es Asn;
A27 es Lys, Arg o Pro;
A28 es Pro o Lys;
A29 es Thr;
A30 es Gly;
A31 es Tyr;
A32 es Gly;
A33 es Ser;
A34 es Ser;
A35 es Ser;
A36 es Arg;
A37 es Arg;
A38 es Ala;
A39 es Pro;
A40 es Gin;
A41 es Thr;
A42 es Gly;
A43 es Ile;
A44 es Val;
A45 es Asp;
A46 es Glu;
A47 es Cys, hCys, p-Me-Cys, N-Me-Cys o Pen; A48 es Cys, hCys, p-Me-Cys, N-Me-Cys o Pen; A49 es Phe, Arg, Leu o Thr;
5
10
15
20
25
30
35
40
A50 es Arg o Ser;
A51 es Ser, Aib, Arg o Thr;
A52 es Cys, hCys, (3-Me-Cys, N-Me-Cys o Pen;
A53 es Asp, Arg o Ser;
A54 es Leu o A6c;
A55 es Arg o Tyr;
A56 es Arg o Gin;
A57 es Leu;
A58 es Glu o Arg;
A60 es Tyr o Phe;
A61 es Cys, hCys, (3-Me-Cys, N-Me-Cys o Pen;
A62 es Ala o Asn;
A63 es Pro, D-Pro, Thr o eliminado;
A64 es Leu, D-Leu, des-Leu o eliminado;
A65 es Lys, D-Lys, des-Lys, Arg o eliminado;
A66 es Pro, D-Pro o eliminado;
A67 es Ala, D-Ala, Aib o eliminado;
A68 es Lys, D-Lys, Arg o eliminado;
A69 es Ser, D-Ser, Aib, Thr o eliminado;
A70 es Ala, D-Ala, Glu o eliminado; y A71 es eliminado, Asp, Glu, Lys o Ser; y R1 es OH o NH2;
siempre que las cadenas laterales de las parejas de residuos A6 y A48, A47 y A52, y A18 y A61, formen cada una un enlace disulfuro;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un análogo de la invención.
También se proporciona un análogo de la invención o una composición farmacéutica de la invención para uso en el tratamiento de afecciones o enfermedades mediadas por la unión al receptor de IGF-1, comprendiendo dicho tratamiento la etapa de administrar a un sujeto que lo requiera una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho análogo o composición farmacéutica. La afección o la enfermedad se pueden seleccionar a partir del grupo que consiste en estatura baja, obesidad, pérdida de peso, caquexia, anorexia, trastornos neurodegenerativos, afecciones ligadas a la fibrosis, trastornos del cartílago, enfermedades óseas, trastornos inflamatorios, trastornos intestinales, resistencia a la insulina, diabetes, cetoacidosis diabética, síndrome de Rabson-Mendenhall, retinopatía, acromegalia, hiperplasia fibromuscular y trastornos cardíacos. El sujeto que requiere un tratamiento de la estatura baja puede ser un sujeto pediátrico humano que tiene una carencia del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGFD), en donde dicha administración es eficaz para tratar la IGFD en el sujeto pediátrico humano.
También se describen en el presente documento variantes peptídicas (es decir, análogos) de IGF-1 de la fórmula siguiente (I),
a-1-a1-a2-a3-a4-a5-a6-a7-a8-a9-a10-a11-a12-a13-a14-a15-a16-a17-a18-a19-a20-a21-a22-a23-a24-a25-a26-a27-a28-a29-a30-
A31-A32-A33-A34-A35-A36-A37-A38-A39-A40-A41-A42-A43-A44-A45-A46-A47-A48-A49-A50-A51-A52-A53-A54-A55-A56-A57-A58-A59-
^60 pQ*\ ^62 pQ4 pQ5 pQQ ^67 ^68 A^
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en donde:
A-1 es Met, Ser o eliminado;
A1 es Gly, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu o eliminado;
A2 es Pro, Ala, Arg, Asp, Gin, Glu, Lys o eliminado;
A3 es Glu, Ala, Asp, Gln o eliminado;
A4 es Thr, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Ser;
A5 es Leu, Acc, Ala, Ile o Val;
A6 es Cys, D-Cys, hCys, D-hCys, p-Me-Cys, D-p-Me-Cys, N-Me-Cys, D-N-Me-Cys, Ala, Pen o D-Pen; A7 es Gly, Ala, Asn, Asp, Gin o Glu;
A8 es Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu o Lys;
A9 es Glu, Ala, Asp o Gln;
A10 es Leu, Acc, Ala, Ile o Val;
A11 es Val, Ala, Ile o Leu;
A12 es Asp, Ala, Arg, Asn, Gin, Glu o Lys;
A13 es Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Ile, Leu o Val;
A14 es Leu, Acc, Ala, Ile o Val;
A15 es Gln, Ala, Asn, Asp o Glu;
A16 es Phe, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Trp o Tyr;
A17 es Val, Ala, Ile o Leu;
A18 es Cys, D-Cys, hCys, D-hCys, p-Me-Cys, D-p-Me-Cys, N-Me-Cys, D-N-Me-Cys, Ala, Pen o D-Pen; A19 es Gly, Ala, Asn, Asp, Gln o Glu;
A20 es Asp, Ala, Asn, Gln o Glu;
A21 es Arg, Ala, Asn, Asp, Gin, Glu o Lys;
A22 es Gly, Ala, Asn, Asp, Gln o Glu;
A23 es Phe, Ala, Trp o Tyr;
A24 es Tyr, Ala, Phe o Trp;
A25 es Phe, Ala, Trp o Tyr;
A26 es Asn, Ala, Asp, Gin, Glu, Ser o Thr;
A27 es Lys, Ala, Arg, Asn, Asp, Gin, Glu o Pro;
A28 es Pro, Ala, Arg o Lys;
A29 es Thr, Ala, Asn, Asp, Gin, Glu o Ser;
A30 es Gly, Ala, Asn, Asp, Gin o Glu;
A31 es Tyr, Ala, Phe o Trp;
A32 es Gly, Ala, Asn, Asp, Gin o Glu;
A33 es Ser, Ala, Thr o Val;
A34 es Ser, Ala, Asn, Asp, Gin, Glu o Thr;
A35 es Ser, Ala, Asn, Asp, Gin, Glu o Thr;
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A36 es Arg, Ala, Asn, Asp, Gin, Glu o Lys;
A37 es Arg, Ala, Asn, Asp, Gin, Glu o Lys;
A38 es Ala, Asn, Asp, Gin o Glu;
A39 es Pro, Ala, Arg o Glu;
A40 es Gin, Ala, Asn, Asp o Glu;
A41 es Thr, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu o Ser;
A42 es Gly, Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu o Lys;
A43 es Ile, Ala, Arg, Asn, Asp, Gin, Glu o Lys;
A44 es Val, Ala, Arg, Asn, Asp, Gin, Glu, Ile, Leu o Lys;
A45 es Asp, Ala, Arg, Asn, Gin, Glu o Lys;
A46 es Glu, Ala, Arg, Asn, Asp, Gin o Lys;
A47 es Cys, D-Cys, hCys, D-hCys, p-Me-Cys, D-p-Me-Cys, N-Me-Cys, D-N-Me-Cys, Ala, Pen o D-Pen;
A48 es Cys, D-Cys, hCys, D-hCys, p-Me-Cys, D-p-Me-Cys, N-Me-Cys, D-N-Me-Cys, Ala, Pen o D-Pen;
A49 es Phe, Ala, Arg, Ile, Leu, Lys, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val;
A50 es Arg, Ala, Lys, Ser o Thr;
A51 es Ser, Aib, Ala, Arg, Lys o Thr;
A52 es Cys, D-Cys, hCys, D-hCys, p-Me-Cys, D-p-Me-Cys, N-Me-Cys, D-N-Me-Cys, Ala, Pen o D-Pen; A53 es Asp, Ala, Arg, Asn, Gin, Glu, Lys, Ser o Thr;
A54 es Leu, Acc, Ala, Ile o Val;
A55 es Arg, Ala, Ile, Leu, Lys, Phe, Trp, Tyr o Val;
A56 es Arg, Ala, Asn, Asp, Gin, Glu o Lys;
A57 es Leu, Acc, Ala, Ile o Val;
A58 es Glu, Acc, Ala, Arg, Asn, Asp, Gin o Lys;
A59 es Acc, Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Ile, Leu, Lys, Nle, Ser, D-Ser, Thr, Trp, Tyr o Val;
A60 es Tyr, Ala, Phe o Trp;
A61 es Cys, D-Cys, hCys, D-hCys, p-Me-Cys, D-p-Me-Cys, N-Me-Cys, D-N-Me-Cys, Ala, Pen o D-Pen; A62 es Ala, Asn, Asp, Gin, Glu, Ile, Leu o Val;
A63 es Pro, D-Pro, Ala; Ser, Thr o eliminado;
A64 es Leu, D-Leu, des-Leu, Ala, Ile, Val o eliminado;
A65 es Lys, D-Lys, des-Lys, Ala, Arg, Ile, Leu, Val o eliminado;
A66 es Pro, D-Pro, Ala o eliminado;
A67 es Ala, D-Ala, Aib o eliminado;
A68 es Lys, D-Lys, Ala, Arg, Ile, Leu, Val o eliminado;
A69 es Ser, D-Ser, Aib, Ala, Thr o eliminado;
A70 es Ala, D-Ala, Asn, Asp, Gln, Glu o eliminado;
A71 es Asn, Ala, Asp, Gin, Glu, Lys, Ser, Thr o eliminado; y R1 es OH o NH2;
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siempre que las cadenas laterales de las parejas de residuos A6 y A48, A47 y A52, y A18 y A61, formen cada una un enlace disulfuro; y
con la condición adicional de que cuando A59 es o bien Leu, lie, Nle, Thr o Val, entonces el análogo contiene al menos una sustitución o una adición de aminoácidos adicional tal y como se define en esta memoria.
En un caso, en la fórmula (I) del párrafo inmediatamente anterior, las sustituciones y adiciones de aminoácidos se pueden definir del modo siguiente:
A'1 es Met, Ser o eliminado;
A1 es Gly o eliminado;
A2 es Pro, Lys o eliminado;
A3 es Glu o eliminado;
A4 es Thr;
A5 es Leu;
A6 es Cys, hCys, (3-Me-Cys, N-Me-Cys o Pen;
A7 es Gly;
A8 es Ala;
A9 es Glu;
A10 es Leu;
A11 es Val;
A12 es Asp;
A13 es Ala;
A4 es Leu;
A15 es Gln;
A16 es Phe;
A17 es Val;
A18 es Cys, hCys, (3-Me-Cys, N-Me-Cys o Pen;
A19 es Gly;
A20 es Asp;
A21 es Arg;
A22 es Gly;
A23 es Phe;
A24 es Tyr;
A25 es Phe;
A26 es Asn;
A27 es Lys, Arg o Pro;
A28 es Pro o Lys;
A29 es Thr;
A30 es Gly;
A31 es Tyr;
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A32
es Gly;
A33
es Ser;
A34
es Ser;
A35
es Ser;
A36
es Arg;
A37
es Arg;
A38
es Ala;
A39
es Pro;
A40
es Gin;
A41
es Thr;
A42
es Gly;
A43
es Ile;
A44
es Val;
A45
es Asp;
A46
es Glu;
A47
es Cys, hCys, p-Me-Cys, N-Me-Cys o Pen;
A43
es Cys, hCys, p-Me-Cys, N-Me-Cys o Pen;
A49
es Phe, Arg, Leu o Thr;
A50
es Arg o Ser;
A51
es Ser, Aib, Arg o Thr;
A52
es Cys, hCys, p-Me-Cys, N-Me-Cys o Pen;
A53
es Asp, Arg o Ser;
A54
es Leu o A6c;
A55
es Arg o Tyr;
A56
es Arg o Gln;
A57
es Leu;
A58
es Glu o Arg;
A59
es A6c, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Ile, Leu, Nle, Ser, D-Ser, Trp o Tyr;
A60
es Tyr o Phe;
A61
es Cys, hCys, p-Me-Cys, N-Me-Cys o Pen;
A62
es Ala o Asn;
A63
es Pro, D-Pro, Thr o eliminado;
A64
es Leu, D-Leu, des-Leu o eliminado;
A65
es Lys, D-Lys, des-Lys, Arg o eliminado;
A66
es Pro, D-Pro o eliminado;
A67
es Ala, D-Ala, Aib o eliminado;
A68
es Lys, D-Lys, Arg o eliminado;
A69 es Ser, D-Ser, Aib, Thr o eliminado;
A70 es Ala, D-Ala, Glu o eliminado; y A71 es Asp, Glu, Lys, Ser o eliminado.
Un subconjunto de los compuestos incluidos en la fórmula (I), y descritos en el presente documento, abarca 5 compuestos en los que A59 es Leu, en donde dichos compuestos contienen al menos una sustitución o una adición de aminoácidos adicional, seleccionada a partir del grupo que consiste en Arg27, Arg65, Arg68, Leu49, (3-Me-Cys47, (3- Me-Cys52, Thr51, Thr69, Asp71, Glu71, Lys71 y Ser71.
Otro subconjunto de los compuestos incluidos en la fórmula (I), y descritos en el presente documento, abarca compuestos en los que A59 es Nle, en donde dichos compuestos contienen al menos una sustitución de aminoácidos 10 adicional, seleccionada a partir del grupo que consiste en Aib51, Aib67, A1b69, A6c54, N-Me-Cys47, N-Me-Cys48, Pen52 y Pen61.
Aún otro subconjunto de los compuestos incluidos en la fórmula (I) y descritos en el presente documento, abarca compuestos en los que A59 es lie, en donde dichos compuestos contienen al menos una sustitución más de aminoácidos, seleccionada a partir del grupo que consiste en Arg58, Arg49, Arg51 y Arg53.
15 Aún otro subconjunto de los compuestos incluidos en la fórmula (I) y descritos en el presente documento, abarca compuestos en los que A59 es Arg, Asp, A6c, Gln, Glu, Ser, Trp o Tyr.
Los compuestos preferidos de la invención son:
Ejemplo 1:
(Asn39)hlGF-1(1-70)-OH;
Ejemplo 2:
(AsnbS)hlGF-1(1-62)-OH;
Ejemplo 3:
(Asn59)hlGF-1 (4-70)-OH;
Ejemplo 4:
(Pro27, Lys28, Asn59)hlGF-1(1-70)-OH;
Ejemplo 5:
(Pro27, Lys28, Asn59)hlGF-1(1-62)-OH;
Ejemplo 6:
(Ser53, Asn59)hlGF-1(1-70)-OH;
Ejemplo 7:
(Ser-Gly1, Asnb9)hlGF-1(1-70)-OH;
Ejemplo 8:
(Asn59, Thrb3, des-Leu64, des-Lysbb, G
Ejemplo 9:
(Tyr55, Asnb9)hlGF-1(1-70)-OH;
Ejemplo 10:
(Thr49, Asnb9)hlGF-1(1-70)-OH;
Ejemplo 11:
(Asn59,62)hlGF-1(1-70)-OH;
Ejemplo 12:
(Asn59, Phe60)h IGF-1 (1 -70)-OH;
Ejemplo 13:
(Ser50, Asn59)hIGF-1 (1 -70)-OH;
Ejemplo 14:
(Gln56, Asn59)hIGF-1 (1 -70)-OH;
Ejemplo 15:
(Asn59, D-Pro63)hlGE-1(1-70)-OH;
Ejemplo 16:
(Asn59, D-Leu64)h IGF-1 (1 -70)-OH;
Ejemplo 17:
(Asn59, D-Lys65)h IGF-1 (1 -70)-OH;
Ejemplo 18:
(Asn59, D-Pro66)hlGF-1(1-70)-OH;
Ejemplo 19:
(Asn59, D-Ala67)hlGF-1(1-70)-OH;
(SEQ ID NO:1) (SEQ ID NO:2) (SEQ ID NO:3) (SEQ ID NO:4) (SEQ ID NO:5) (SEQ ID NO:6) (SEQ ID NO:7)
')hlGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:8)
(SEQ ID NO:9) (SEQ ID NO:10) (SEQ ID NO: 11) (SEQ ID NO:12 (SEQ ID NO: 13 (SEQ ID NO:14)
Ejemplo 21:
(Asn59, D-Ser69)hIGF-1(1-70)-OH;
Ejemplo 22:
(Asn59, D-Ala70)hIGF-1(1-70)-OH;
Ejemplo 55:
(Met-Gly1, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH. (SEQ ID NO:47)
Ejemplos de otros compuestos descritos también en esta memoria son:
Ejemplo 23:
(Arg27,65,68, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:15)
Ejemplo 24:
(Leu59, Arg65, 68)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:16)
Ejemplo 25:
(Leu49, 59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:17)
Ejemplo 26:
(P-Me-Cys52, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:18)
Ejemplo 27:
(P-Me-Cys47, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:19)
Ejemplo 28:
(Leu59, Glu71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:20)
Ejemplo 29:
(Leu59, Asp71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:21)
Ejemplo 30:
(Leu59, Lys71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:22)
Ejemplo 31:
(Leu59, Ser71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:23)
Ejemplo 32:
(Leu59, Thr69)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:24)
Ejemplo 33:
(Thr51, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:25)
Ejemplo 34:
(N-Me-Cys47, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:26)
Ejemplo 35:
(Nle59, Aib69)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:27)
Ejemplo 36:
(N-Me-Cys48, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:28)
Ejemplo 37:
(Nle59, Aib67)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:29)
Ejemplo 38:
(Cys52, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:30)
Ejemplo 39:
(Aib51, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:31)
Ejemplo 40:
(Pen52, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:32)
Ejemplo 41:
(Nle59, Pen61)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:-33)
Ejemplo 42:
(A6c54, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:34)
Ejemplo 43:
(Arg53, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:35)
Ejemplo 44:
(Arg49, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:36)
Ejemplo 45:
(Arg51, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:37)
Ejemplo 46:
(Arg58, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:38)
Ejemplo 47:
(A6cb>IGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:39)
Ejemplo 48:
(Aspb>IGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:40)
Ejemplo 49:
(T rp59)hlGF-1 (1 -70)-OH; (SEQ ID NO:41)
Ejemplo 50:
(Ser59)h IGF-1 (1 -70)-OH; (SEQ ID NO:42)
Ejemplo 51:
(Tyr59)hlGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:43)
Ejemplo 52:
(Glu59)hlGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:44)
Ejemplo 53:
(Glnb9)hlGF-1(1-70)-OH; y (SEQ ID NO:45)
Ejemplo 54:
(Argb9)h IGF-1 (1 -70)-OH; (SEQ ID NO:46)
Descripción detallada de la invención
La solicitud emplea las siguientes abreviaturas que se entienden en general:
Acc:
ácido 1 -amino-1 -cicloalquil(C3-C9)carboxílico
Acc incluye:
A3c:
ácido 1-amino-1-ciclopropanocarboxílico
A4c:
ácido 1-amino-1-ciclobutanocarboxílico
A5c:
ácido 1-amino-1-ciclopentanocarboxílico
A6c:
ácido 1 -amino-1 -ciclohexanocarboxilico
Aib:
ácido a-aminoisobutírico
Ala o A:
alanina
Arg o R:
arginina
Asn o N:
asparagina
Asp o D:
ácido aspártico
Cys o C:
cisteína
cistina:
dímero de disulfuro de cisteína
hCys:
homocisteína
p-Me-Cys:
beta-metil-cisteína, es decir, ácido (2S, 3S)-2-amino-3-mercaptobutírico
N-Me-Cys:
N-metil-cisteína
Gin o Q:
glutamina
Glu o E:
ácido glutámico
Gly o G:
glicina
lie o I:
isoleucina
Leu o L:
leucina
des-Leu:
Leu eliminada
Lys o K:
Usina
des-Lys:
Lys eliminada
Met o M:
metionina
5
10
15
20
25
30
35
Nle: norleucina
Pen: penicilamina
Phe o F: fenilalanina
Pro o P: prolina
SeroS: serina
ThroT: treonina
TrpoW: tri ptófano
Tyr o Y: tirosina
Val o V: vallna
Todas las abreviaturas (p. ej., Ala) de los aminoácidos en esta descripción representan la estructura de -NR-CR'(R")- CO-, en donde R' y R" es cada uno, independientemente, hidrógeno o la cadena lateral de un aminoácido (por ejemplo, R' = H y R" = CH3 para alanina) y en donde R = H o CH3, excepto para la prolina,
imagen1
Un péptido descrito en este documento también se indica en este documento a través de otro formato, p. ej., (Asn59)hlGF-1(1-70)-OH (SEQ ID NO:1), con los aminoácidos sustituidos de la secuencia natural colocados entre los paréntesis (es decir, Asn para Met en la posición 59 del IGF-1 de tipo silvestre). El intervalo que se encuentra dentro de los paréntesis se refiere a aquellos aminoácidos que se encuentran en el análogo. Por ejemplo, "IGF-1(4-68)-OH" (SEQ ID NO:48) indica que el análogo se compone de los aminoácidos 4 hasta 68 que se corresponden con la secuencia peptídica del IGF-1 de tipo silvestre. "NH2" en "IGF-1(1-70)-NH2" (SEQ ID NO:49) indica que el extremo C- termlnal del péptido está amidado. "IGF-1(1-70)" o "IGF-1(1-70)-OH" indica que el extremo C-terminal del péptido es el ácido libre (SEQ ID NO:50).
Algunas otras abreviaturas utilizadas en este documento se definen del modo siguiente:
Act:
acetonitrilo
Boc:
ferc-butiloxicarbonilo
BSA:
albúmina de suero bovino
DCM:
diclorometano
DIPEA:
diisopropiletilamina
DMEM:
Medio de Eagle Modificado con Dulbecco
DMF:
dimetilformamida
DTT:
ditiotreitol
ESI:
ionización por electroespray
FCS:
suero de ternera fetal
Fmoc:
9-fluorenilmetiloxicarbonilo
HBTU:
hexafluorofosfato de 2-(1 H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
HOBt:
N-hidroxibenzotriazol
HPLC:
cromatografía líquida de alto rendimiento
LC-MS:
cromatografía liquida-espectrometría de masas
MPAA:
ácido 4-mercaptofenilacético
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
NMP: N-metilpirrolidona
OíBu: áster O-ferc-butílico
Pbf: 2,2,4,6,7-pentametild¡h¡drobenzofurano-5-sulfon¡lo
QC: control de calidad
fBu: ferc-butilo
TCA: ácido tricloroacético
TCEP tris-2-carboxietil-fosfina
TIS: triisopropilsilano
TFA: ácido trifluoroacético
Tris: 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol
Trt: tritilo
espectroscopia UV: espectroscopia ultravioleta
"Alquilo" se refiere a un grupo hidrocarburo que contiene uno o varios átomos de carbono en el que múltiples átomos de carbono, si están presentes, están unidos por enlaces sencillos. Ejemplos de los cuales incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, propilo y butilo. El grupo hidrocarburo alquilo puede ser de cadena lineal o contener una o varias ramificaciones o grupos cíclicos, ejemplos de los cuales Incluyen, pero no se limitan a, isopropilo y tere-butilo.
"Alquilo sustituido" se refiere a un alquilo en el que uno o varios átomos de hidrógeno del grupo hidrocarburo se sustituyen con uno o varios sustituyeles, seleccionados a partir del grupo que consiste en halógeno, OH, CN, SH, NH2, NHCH3, NO2, alquilo (C1.2) sustituido con 1 a 6 halógenos, CF3, OCH3, OCF3 y (CH2)o-4-COOH. En diferentes realizaciones, están presentes 1, 2, 3 o 4 sustituyentes.
"Arllo" se refiere a un grupo aromático opcionalmente sustituido con al menos un anillo que tiene un sistema de electrones p¡ conjugados, que contiene hasta tres sistemas de anillos conjugados o fusionados. Arilo incluye grupos arllo carbociclico, arilo heterocíclico y biarilo. Preferiblemente, el arilo es un anillo de 5 o 6 miembros. Los átomos preferidos para un arilo heterocíclico son uno o varios azufres, oxígenos y/o nitrógenos. Ejemplos de arilo incluyen fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, indol, quinolina, 2-imidazol y 9-antraceno. Los sustituyentes de arilo se seleccionan a partir del grupo que consiste en alquilo-Ci_2o, alcoxi-Ci.2o, halógeno, -OH, -CN, -SH, -NH2, -N02, alquilo-Ci.2o sustituido con halógenos, -CF3, -OCF3 y -(CH2)0-2o-COOH. En diferentes realizaciones, el arilo contiene 0, 1, 2, 3, o 4 sustituyentes.
"Alquil-arilo" se refiere a un "alquilo" que se une a un "arilo".
Procedimientos Sintéticos
Los análogos ejemplificados de IGF-1 descritos en este documento se prepararon mediante una primera etapa de síntesis de fragmentos peptídicos, una segunda etapa de ligación y una tercera etapa de plegamiento. Los siguientes procedimientos sintéticos ilustran como un químico experto sería capaz de preparar uno cualquiera de los análogos ejemplificados de IGF-1 descritos en esta memoria.
A) Síntesis de un fragmento peptídico de (Gln56, Asn59)hlGF-1(48-70)-OH, es decir, Cys-Phe-Arg-Ser-Cys-Asp- Leu-Arg-GIn-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Ala-Pro-Leu-Lys-Pro-Ala-Lys-Ser-Ala-OH (SEQ ID NO:51)
La síntesis de péptidos en fase sólida basada en Fmoc se utilizó para ensamblar el fragmento peptídico del título usando la ayuda de microondas en un Sintetizador de Péptidos de Liberty (CEM; Matthews, NC, EE.UU.). El primer fragmento de 14 residuos, es decir, los residuos 57-70 de hlGF-1, o el péptido ácido del extremo C-terminal, se sintetizó a una escala de 1,0 mmol usando una resina Fmoc-Ala-Wang (0,72 meq/g). El fragmento peptídico resultante se dividió después en cuatro lotes de 0,25 mmol para la elongación y la diferenciación. Una muestra de resina de 1,36 g se colocó en un tubo cónico de 50 mL junto con 15 mL de una solución 1:1 de DMF y DCM que se cargó en posición en el sintetizador. Después, la resina se transfirió al recipiente de la reacción a través de un proceso automatizado del sintetizador. Se utilizó el protocolo estándar de Liberty para una síntesis a escala de 1,0 mmol. El protocolo implicaba la eliminación del grupo protector Fmoc N-terminal mediante un tratamiento con 20 mL de piperidina al 20% que contenía HOBt 0,1 M en DMF. La etapa inicial de desprotección con un generador de microondas (45 vatios, temperatura máxima de 75°C) y nitrógeno burbujeante (3 segundos encendido, 7 segundos apagado) duró 30 segundos. El recipiente de la reacción se drenó y la resina se lavó a fondo con DMF varias veces. El siguiente aminoácido (Ciclo 1) que se iba a añadir al péptido en crecimiento, (Fmoc-Ser(tBu)-OH) preparado como una solución madre 0,2 M en DMF, se añadió entonces (15 mL, 3 equivalentes). Se añadieron 6,0 mL de HBTU 0,45 M (3 equivalentes) en DMF seguidos por 3,0 mL de DIPEA 2 M (6 equivalentes) en NMP. La etapa de acoplamiento
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se realizó usando un generador de microondas (20 vatios, temperatura máxima de 75°C) con burbujeo de nitrógeno a la misma velocidad que en la etapa de desprotección, durante un periodo de 5 minutos. El recipiente de la reacción se drenó después como desecho y la etapa de acoplamiento se repitió.
El protocolo de acoplamiento para Fmoc-Cys(Trt)-OH era una versión ligeramente modificada del protocolo convencional. Para los residuos Cys, no se aplicó un generador de microondas durante los primeros 2 minutos. A continuación siguió una sesión de 4 minutos de generador de microondas (20 vatios, temperatura máxima de 50°C). Todos los aminoácidos se introdujeron de manera similar, empleando una estrategia de acoplamiento doble a lo largo de toda la secuencia. Los ciclos de síntesis para el fragmento peptídico del título después de la primera Ser fueron del modo siguiente: Ciclo 2, Fmoc-Lys(Boc)-OH; Ciclo 3, Fmoc-Ala-OH; Ciclo 4, Fmoc-Pro-OH; Ciclo 5, Fmoc- Lys(Boc)-OH; Ciclo 6, Fmoc-Leu-OH; Ciclo 7, Fmoc-Pro-OH; Ciclo 8, Fmoc-Ala-OH; Ciclo 9, Fmoc-Cys(Trt)-OH; Ciclo 10, Fmoc-Tyr(fBu)-OH; Ciclo 11, Fmoc-Asn(Trt)-OH; Ciclo 12, Fmoc-Glu(OfBu)-OH; y Ciclo 13, Fmoc-Leu-OH.
Una vez que se completó el fragmento peptídico inicial, la resina se transfirió de vuelta al tubo cónico de 50 mL usando DMF como disolvente. La resina se dividió manualmente de manera uniforme en cuatro muestras que se pusieron en cuatro tubos cónicos de 50 mL que después se colocaron de nuevo en el sintetizador. La porción restante del péptido del título se sintetizó a una escala 0,25 mmol. El protocolo utilizado fue el mismo que el utilizado para la síntesis a mayor escala, sin embargo, se utilizaron menores cantidades de reactivos. La eliminación del grupo protector Fmoc N-terminal consistió en el tratamiento con una solución que contenía 10 mL de 20% de piperidina y HOBt 0,1 M en DMF. La etapa inicial de desprotección con un generador de microondas (45 vatios, temperatura máxima de 75°C) con nitrógeno burbujeante (3 segundos encendido, 7 segundos apagado) duró 30 segundos. El recipiente de la reacción se drenó después y la resina se lavó a fondo con DMF varias veces. El siguiente aminoácido (Ciclo 14), preparado como una solución madre 0,2 M en DMF, se introdujo a continuación (5,0 mL, 4 equivalentes) en el péptido en crecimiento (Fmoc-Gln(tBu)-OH). Después se añadieron 2,0 mL de una solución 0,45 M (4 equivalentes) de HBTU en DMF seguido por 1,0 mL de una solución 2 M (8 equivalentes) de DIPEAen NMP.
Los protocolos de acoplamiento para Fmoc-Cys(Trt)-OH y Fmoc-Arg(Pbf)-OH eran versiones del protocolo convencional ligeramente modificadas. Para el acoplamiento de los residuos Cys, el generador de microondas estaba inicialmente apagado durante los primeros 2 minutos y luego se encendió durante 4 minutos (20 vatios, temperatura máxima de 50°C). Para el acoplamiento de los residuos Arg, no se empleó un generador de microondas en el primer acoplamiento, sin embargo, fue necesaria una segunda etapa de acoplamiento convencional. Los Ciclos
14, 16 y 21 empleaban un procedimiento de terminación de cadena, el cual estaba inmediatamente seguido por la etapa de acoplamiento, que implicaba la adición de 7 mL de anhídrido acético 0,5 M que contenía HOBt 0,015 M y 2 mL de DIPEA 2 M ambos en NMP, mientras que se utilizaba un protocolo de microondas de etapas múltiples (50 vatios durante 30 segundos con una temperatura máxima de 65°C, después ningún generador durante 30 segundos, 50 vatios durante 30 segundos con una temperatura máxima de 65°C, después ningún generador durante 30 segundos). Los ciclos de la síntesis para el fragmento peptídico del título después de Gln fueron los siguientes: Ciclo
15, Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Ciclo 16, Leu-OH; Ciclo 17, Fmoc-Asp(OfBu)-OH; Ciclo 18, Fmoc-Cys(Trt)-OH; Ciclo 19, Fmoc-Ser(fBu)-OH; Ciclo 20, Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Ciclo 21, Fmoc-Phe-OH; y Ciclo 22, Fmoc-Cys(Trt)-OH.
Después de la terminación de la cadena principal del péptido, el grupo protector N-term¡nal Fmoc se retiró y la resina se lavó de nuevo con DMF. A continuación, la resina se transfirió de nuevo al tubo cónico de 50 mL usando DMF como disolvente de transferencia.
La resina se transfirió a un recipiente de la reacción con una frita de vidrio sinterizado. La DMF se eliminó y la resina se lavó a fondo con DCM. El fragmento peptídico se escindió y se desprotegió mediante el tratamiento con el siguiente reactivo: 5% de TIS : 5% de agua : 90% de TFA. La reacción se dejó proceder durante 3 horas a temperatura ambiente con agitación constante. Después, la solución se filtró en un tubo cónico de 50 mL. El TFA se redujo por evaporación con flujo de gas nitrógeno. El fragmento peptídico precipitó por la adición de 40 mL de éter etílico frío seguido de centrifugación a 3000 rpm durante 30 minutos a 4°C en una centrífuga refrigerada (Sorvall Legend RT; Thermo Fisher, San José, CA, EE.UU.). El sedimento resultante se disolvió en 0,1% de TFA en agua antes de la purificación mediante HPLC preparativa, equipada con una columna de fase inversa C18 (columna Luna, 10 pm, 250 x 21,2 mm) utilizando un gradiente de acetonitrilo de 0-60% (0,1% de TFA) durante 50 minutos con un caudal de 10 mL/min. El fragmento peptídico purificado se analizó por HPLC (columna Luna C18, 3 pm, 4,6 x 100 mm) con un gradiente de 5-80% de acetonitrilo (0,08% de TFA) durante 30 minutos con un caudal de 1 mL/min) y mediante espectrometría de masas (LCQ Advantage; Thermo Fisher, San José, CA, EE.UU.). El fragmento peptídico se liofilizó posteriormente y se almacenó a -50°C para un uso futuro.
B) Síntesis del fragmento peptídico de h1GF-1(1-47)-tioéster, es decir, Gly-Pro-Glu-Thr-Leu-Cys-Gly-Ala-Glu- Leu-Val-Asp-Ala-Leu-Gln-Phe-Val-Cys-Gly-Asp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Phe-Asn-Lys-Pro-Thr-Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser- Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-Thr-Gly-lle-Val-Asp-Glu-Cys-tioéster-propion¡l-Leu-NH2 (SEQ ID NO:52)
El fragmento peptídico N-terminal, es decir, los residuos 1-47 de hlGF-1, se ensambló usando una síntesis de péptidos en fase sólida basada en la química de Boc. Un sintetizador de péptidos ABI 433A (Applied Biosystems; FosterCity, CA, EE.UU.) modificado para ejecutar el protocolo FastBoc estándar, se utilizó para la síntesis a escala 0,5 mmol. El recipiente de la reacción que contenía 0,645 mg de 0,77 meq/g de resina Tampal, se colocó sobre el
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sintetizador. Para hinchar la resina, se introdujo DMF. El protocolo 0.5 de ABI FastBoc se utilizó para generar el fragmento. Cada ciclo consistía en desbloquear el grupo protector Boc N-terminal con TFA puro, seguido de un lavado a fondo con DMF. Cartuchos preenvasados 2,0 mmol (4 equivalentes) de cada aminoácido se disolvieron a continuación en FIBTU 0,40 M y DMF. Después de completar la disolución de cada aminoácido, la solución se transfirió automáticamente al recipiente de activación. Una solución de DIPEA (puro) se Introdujo en el recipiente de activación y se expuso a la resina durante un período prolongado. El recipiente de la reacción se vació y la resina se lavó con DMF. Para los cartuchos de Arg/Asn, se requiere un tiempo de activación prolongado para asegurar la solubilidad. Además, cualquier aminoácido añadido inmediatamente después del acoplamiento de un residuo de Gln, se lavó con DCM, tanto antes como después del protocolo de desbloqueo. El tiempo del acoplamiento fue de 30 minutos. Los siguientes aminoácidos se utilizaron para el fragmento peptídico del título: Boc-Arg(Tos)-OFI, Boc- Asp(cHex)-OH, Boc-Glu(cFlex)-OFI, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Cys(4Me-Bzl)-OH, Boc-Lys(CIZ)-OFI, Boc-GIn-OFI, Bod- Ser(OBzl)-OH, Boc-Thr(OBzl)-OH y Boc-Tyr(BrZ)-OH.
Después del último ciclo de acoplamiento, la resina se lavó con DCM y se secó. El fragmento de péptldo se desprotegió y se escindió de la resina usando un tratamiento con 10 mL de fluoruro de hidrógeno y anlsol. La reacción se dejó proceder durante 70 minutos, momento en el cual el fluoruro de hidrógeno fue desviado con una corriente de nitrógeno. El residuo se lavó con éter y después el péptido se disolvió en 10-15 mL de TFA. El fragmento peptídico precipitó mediante la filtración de TFA en 40 mL de éter etílico frío, seguido de centrifugación a 3000 rpm durante 30 minutos a 4°C en una centrífuga refrigerada (Sorvall Legend RT; Thermo Flsher, San José, CA, EE.UU.). El sedimento resultante se disolvió en 0,1% de TFA en agua y se purificó mediante HPLC preparativa, equipada con una columna de fase Inversa C18 (columna Luna, 10 pm, 250 x 21,2 mm) utilizando un gradiente de 20-40% de acetonltrllo (0,1% de TFA) durante 120 minutos con un caudal de 10 mL/min. El fragmento peptídico purificado se analizó por HPLC (columna Luna C18, 3 pm, 4,6 x 100 mm) con un gradiente de 5-80% de acetonitrllo (0,08% de TFA) durante 30 minutos con un caudal de 1 mL/min y mediante espectrometría de masas (LCQ Advantage; Thermo Flsher, San José, CA, EE.UU.). El fragmento peptídico se llofillzó posteriormente y se almacenó a -50°C para un uso futuro.
C) Procedimiento general de ligación
Los análogos de hlGF-1 de longitud completa se construyeron mediante el método de ligación química que se produce naturalmente entre un fragmento de tloéster N-terminal por ejemplo, hlGF-1(1-47)-S-(CH2)2C(0)-Leu-NH2 (SEQ ID NO:52), y un fragmento C-terminal, por ejemplo, (Gln , Asn59)hlGF-1(48-70)-OH (SEQ ID NO:51), que contiene un residuo de cisterna en su extremo N-termlnal.
Para iniciar el procedimiento para el péptido del título, 5,5 mg del fragmento C-terminal de hlGF-1 se disolvieron en 0,5 mL de tampón de ligación (fosfato de sodio 200 mM, pH 8,5, hidrocloruro de guanidina 6 M) en un tubo Eppendorf de 1,5 mL. A esta solución, se añadieron 100 pL de una solución de TCEP (40 mg/mL) y la mezcla se agitó en vértex. La mezcla se transfirió a un segundo tubo Eppendorf que contenía 6,5 mg del fragmento de tloéster de hlGF-1 N-terminal. Los reactivos se mezclaron a fondo. Se retiró una pequeña muestra (5 pL) y se analizó mediante LC-MS (LCQ Deca XP; Thermo Fisher, San José, CA, EE.UU.). A la mezcla de la reacción se añadieron 100 pL de una solución de MPAA (20 mg/mL) seguida de mezcla. Las muestras (5 pL) se extrajeron periódicamente con el fin de seguir el progreso de la reacción mediante LC-MS. Después de aproximadamente 3,5 horas, cuando la reacción casi se había completado, la mezcla se inactivó y se diluyó mediante la adición de 9,5 mL de 0,1% de TFA en agua. El producto de la ligación se purificó por HPLC semipreparativa (Vydac 218TP101510, C18, 10-15 pm, 10 x 250 mm) con un gradiente de 5-80% de acetonitrilo (0,1% de TFA) durante 40 minutos con un caudal de 5 mL/min. El pico del producto se liofilizó y se almacenó a -50°C. La masa del producto de ligación sin plegar se determinó mediante medición física.
D) Procedimiento general de plegado (pareja redox de glutatión) para el Ejemplo 14, es decir, (Gln56. Asn59)hlGF-1 (1 -70)-OH (SEQ ID NO:14)
La proteína, preparada mediante el procedimiento de ligación de la etapa C) como se ha descrito anteriormente, se disolvió en tampón de ligación (fosfato de sodio 200 mM, pH 8,5, hidrocloruro de guanidina 6 M) hasta una concentración de 1 mg/mL. El tampón de plegamiento (Tris 100 mM, pH 8,5, glutatión oxidado 1 mM, glutatión reducido 10 mM) se añadió entonces para llevar la concentración final de proteína a 0,25 mg/mL. Se permitió que el proceso de plegamiento se produjera durante más de 3 horas. Después, la reacción se inactivó mediante la adición gota a gota de TFA hasta que la mezcla de reacción alcanzó un pH á 3. El producto se purificó después por HPLC semipreparativa (Vydac 218TP101510, C18, 10-15 pm, columna 10 x 250 mm ) con un gradiente de 5-60% de acetonitrilo (0,1% de TFA) durante 40 minutos con un caudal de 5 mL/min. El producto se liofilizó. El contenido en proteína se determinó redisolviendo el producto en 0,1% de TFA en agua y luego midiendo la absorbancia a 280 nm (espectrofotómetro NanoDrop ND1000). A continuación, se analizó la proteína para la QC (HPLC y MS).
E) Procedimiento de oxidación para la formación de (glioxilil-Gly1, Asn59)hlGF-1 (1-70)-OH (SEQ ID NO:53) a partir del Ejemplo 7, es decir, (Ser-Gly1, Asn59)hlGF-1(1-70)-OH (SEQ ID NO:7)
La masa del análogo plegado de hlGF-1 se determinó por absorbancia a 280 nm en 0,1% de TFA en agua (espectrofotómetro NanoDrop ND 1000). La proteína, preparada por el procedimiento de plegamiento de la etapa D)
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como se ha descrito anteriormente, se volvió a disolver en tampón de imidazol 50 mM (pH 7,0) hasta una concentración final de 2 mg/ml (2,66 x 10"4M). El periodinato de sodio (Nal04)(4 equivalentes) disuelto en tampón de imidazol se añadió y la solución resultante se agitó suavemente. Se permitió que la reacción procediera a temperatura ambiente sin una agitación adicional. Después de 5 minutos, la reacción se inactivó con la adición de 10 equivalentes de etilenglicol. La mezcla se dejó en reposo durante 15 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se diluyó con 0,1% de TFA en agua hasta un volumen final de 10 mL. A continuación, el producto se purificó por HPLC semipreparativa (columna Vydac 218TP101510, C18, 10-15 pm, 10 x 250 mm) con un gradiente de 5-60% de acetonitrilo (0,1% de TFA) durante 40 minutos con un caudal de 5 mL/min. El producto se liofilizó después y se almacenó a -50°C hasta que se necesitó.
F) Procedimiento sintético para el Ejemplo 27, es decir, (P-Me-Cys47, Leu59)hlGF-1(1-70)-OH (SEQ ID NO: 19)
La proteína del título se ensambló a través de una ligación química natural, usando hlGF(1-46)-tio-propionil-Leu-NH2 (SEQ ID NO: 54) y el fragmento C-terminal, es decir, (p-Me-Cys47, Leu59)hlGF-1 (47-70) (SEQ ID NO:55). El tioéster de la proteína (7,4 mg, 1,45 pinoles) y el fragmento C-terminal (3,8 mg, 1,38 pmoles) se disolvieron en tampón de ligación (clorhidrato de guanidina 6 M en fosfato de sodio 200 mM, pH 8,5, 400 pL) y TCEP (80 pL, 40 mg/mL, pH 7). Se añadió un catalizador MPAA (80 pL, 20 mg/mL, pH 7). El progreso de la reacción se vigiló en un LCQ Deca XP LC-MS (Thermo Finnigan) con una columna Luna C18(2) (5 pm, 4,6 x 100 mm) con un gradiente de 5-80% de acetonitrilo (0,1% de TFA) durante 30 minutos. La reacción se inactivó con una dilución 1:10 con dhhO, 0,1% de TFA (v/v). La mezcla en bruto se centrifugó y se pasó a través de un filtro de vidrio de 1,0 pm para eliminar cualquier precipitado de MPAA. La proteína de longitud completa se purificó usando un gradiente lineal de B de 5-60% durante 40 minutos con un caudal de 5 mL/min en una columna Vydac C18 (10 pm, 10 x 250 mm). La proteína se cuantificó por espectroscopia de UV (Espectrofotómetro NanoDrop ND1000) y se liofilizó para uso futuro.
La proteína almacenada (1,8 mg, 235 nmoles) se disolvió en una solución de H2PO4 2OO mM, guanidinio-HCI 6 M que tenía pH 8,5 hasta una concentración de 1,0 mg/mL. El tampón de plegamiento (Tris 100 mM, glutatión 10 mM, glutatión oxidado 1 mM a pH 8,5) se añadió a la solución hasta que se consiguió una concentración final de proteína de 250 pg/mL. La mezcla se dejó incubar a temperatura ambiente mientras que se controlaba por HPLC. Una vez que se alcanzó el equilibrio (como se visualizaba por un perfil de HPLC estable), la reacción se inactivó mediante agitación, ya sea en ácido acético o TFA para llevar la solución a pH 3. La solución se purificó usando primero un filtro de vidrio de 1,0 pm y después una columna semipreparativa.
La proteína plegada se purificó usando un gradiente lineal de B de 5-60% durante 40 minutos con un caudal de 5 mL/min. La proteína se cuantificó por UV (espectrofotómetro NanoDrop ND1000) y se liofilizó. Se obtuvieron aproximadamente 92 pg de producto purificado, lo que representaba un rendimiento del 5%. La masa de la proteína se verificó en un Finnigan LCQ Advantage MAX MS.
G) Procedimiento sintético para el Ejemplo 36, es decir, (N-Me-Cys48, Nle59)hlGF-1(1-70)-OH (SEQ ID NO:28)
La proteína del título se ensambló utilizando una ligación química natural, usando hlGF-1(1-47)-tio-propionil-Leu-NH2 (SEQ ID NO:52) y el fragmento C-terminal, es decir, (N-Me-Cys48, Nle59)hlGF-1(48-70) (SEQ ID NO:56). El tioéster de proteína (4,3 mg, 824 moles) y el fragmento C-terminal (2,1 mg, 790 nmoles) se disolvieron en tampón de ligación ( 400 pL de clorhidrato de guanidina 6 M en fosfato de sodio 200 mM, pH 8,5) y TCEP (80 pL, 40 mg/mL, pH 7). Se añadió un catalizador MPAA (80 pL, 20 mg/mL, pH 7). El progreso de la reacción se vigiló empleando un Finnigan LCQ Deca XP LC-MS con una columna Luna C18(2) (5 pm, 4,6 x 100 mm) que tenía un gradiente de 5-80% de acetonitrilo (0,1% de TFA) durante 30 minutos. La reacción se inactivó con una dilución 1:10 con dH20, 0,1% de TFA (v/v). La mezcla en bruto se centrifugó y se pasó a través de un filtro de vidrio de 1,0 pm para eliminar cualquier precipitado de MPAA. La proteína de longitud completa se purificó usando una columna Vydac C18 (10 pm, 10 x 250 mm) con un gradiente lineal de B de 5-60% durante 40 minutos con un caudal de 5 mL/min. La proteína se cuantificó mediante UV (espectrofotómetro NanoDrop ND1000) y se liofilizó para uso futuro.
La proteína almacenada se disolvió utilizando una solución de H2PO4" 200 mM, guanidinio-HCI 6 M (pH 8,5) hasta que se alcanzó una concentración de 1,0 mg/mL. El tampón de plegamiento (Tris 100 mM, glutatión 10 mM, glutatión oxidado 1 mM a pH 8,5) se añadió a la solución hasta que se consiguió una concentración final de proteína de 250 pg/mL. La mezcla se dejó incubar a temperatura ambiente mientras que se controlaba por HPLC. Una vez que se alcanzó el equilibrio (como se visualizaba por un perfil de HPLC estable), la reacción se inactivó con ácido acético o TFA a pH 3. La solución se purificó usando primero un filtro de vidrio de 1,0 pm y después una columna semipreparativa.
La proteína plegada se purificó usando un gradiente lineal de B de 5-60% con un caudal de 5 mL/min durante 40 minutos. La proteína se cuantificó por UV (espectrofotómetro NanoDrop ND1000) y se liofilizó. Se obtuvieron aproximadamente 0,415 mg de producto purificado, lo que representaba un rendimiento del 10,6%. La masa de la proteína se verificó en un Finnigan LCQ Advantage MAX MS.
Otros péptidos descritos en este documento pueden ser preparados por una persona con experiencia ordinaria en la técnica, usando procedimientos sintéticos análogos a los descritos en los ejemplos anteriores. Los datos físicos para los compuestos ejemplificados en el presente documento se proporcionan en la Tabla 1.
Ejemplo Número
Peso Mol. (Esperado) Peso Mol. (ESI-MS) % de Pureza (HPLC)
1
7631,6 7631,6 99,9
2
6838,6 6839,5 95,2
3
7348,3 7347,9 93,0
4
7631,6 7632,1 97,7
5
6838,6 6839,3 95,9
6
7603,6 7602,5 99,9
7
7718,7 7718,7 99,9
8
7452,3 7454,1 99,9
9
7638,6 7639,7 99,9
10
7585,5 7586,0 99,9
11
7674,6 7675,3 99,9
12
7615,6 7616,9 99,9
13
7562,5 7563,6 99,9
14
7603,6 7605,1 98,5
15
7631,6 7634,1 96,8
16
7631,6 7633,2 97,2
17
7631,6 7632,9 95,1
18
7631,6 7631,6 96,7
19
7631,6 7631,9 97,9
20
7631,6 7631,8 98,5
21
7631,6 7631,7 97,6
22
7631,6 7631,8 98,1
23
7714,7 7713,9 99,9
24
7686,7 7686,7 99,9
25
7596,6 7596,7 99,9
Ejemplo Número
Peso Mol. (Esperado) Peso Mol. (ESI-MS) % de Pureza (HPLC)
26
7644,7 7645,5 99,9
27
7644,7 7644,9 99,9
28
7759,8 7760,4 100
29
7745,8 7746,5 100
30
7758,8 7758,4 100
31
7717,7 7718,5 100
32
7644,7 7645,5 100
33
7644,7 7645,4 95,5
34
7644,7 7643,9 100
35
7628,7 7628,1 94,0
36
7644,7 7644,8 99,9
37
7644,7 7644,6 99,9
38
7644,7 7645,3 99,9
39
7628,7 7628,4 99,9
40
7658,7 7658,8 99,9
41
7658,7 7658,8 99,9
42
7642,7 7641,7 99,9
43
7671,8 7672,4 99,9
44
7641,7 7641,8 99,9
45
7699,8 7701,0 97,7
46
7657,7 7658,7 96,1
47
7642,7 7640,9 99,9
48
7632,6 7632,5 99,9
49
7703,7 7704,0 99,9
50
7604,6 7604,7 99,9
51
7680,7 7680,5 100
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Ejemplo Número
Peso Mol. (Esperado) Peso Mol. (ESI-MS) % de Pureza (HPLC)
52
7646,6 7646,2 100
53
7645,6 7644,9 100
54
7673,7 7674,7 99,9
Ensayos Funcionales
A) Ensayo de unión al receptor de IGF-1 in vitro
Se prepararon membranas para estudios de unión de radioligandos mediante homogeneización de células humanas MCF-7 que expresaban el receptor natural de IGF-1 en 20 ml_ de Tris-HCI 50 mM helado con Brinkman Polytron (Westbury, NY, EE.UU.) (ajustando a 6, 15 s). Los homogeneizados se lavaron dos veces mediante centrifugación (39.000 g/10 minutos) y los sedimentos finales se resuspendieron en Tris-HCI 50 mM que contenía MgCI2 2,5 mM y 0,1% de BSA.
Para el ensayo, se incubaron partes alícuotas con [125I]IGF-1 0,05 nM. Péptidos del ensayo de competencia sin marcar se incluyeron a veces. El volumen del ensayo final era de 0,25 mi. Después de un periodo de incubación de 120 minutos (20°C), el [125I]IGF-1 unido (-2000 Ci/mmol, Perkin Elmer Ufe Sciences, Boston, MA, EE.UU.) se separó de las partículas radiactivas libres mediante centrifugación a 3000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se decantó y se contaron las partículas radiactivas atrapadas en el sedimento, mediante espectrometría gamma (Wallac LKB, Galthersburg, MD, EE.UU.). La unión específica se definió como el [125I]IGF-1 total unido menos el unido en presencia de IGF-1 100 nM.
Los datos de la unión in vitro al receptor de IGF-1 (es decir, los valores de CI50) para los compuestos ejemplificados en este documento, se proporcionan en la Tabla 2.
B) Ensayo de la bioactividad de IGF-1 in vitro
Células de ratón 3T3/R (obtenidas a partir del Dr. E. Rozengurt en UCLA en Los Angeles, CA, EE.UU.) se cultivaron en una placa de 24 pocilios (DMEM + 10% de FCS) y el cultivo se mantuvo durante 2 días.
Para el ensayo, se retiró el medio y se lavó una vez con DMEM exento de suero. A continuación, se privó de suero durante 24 horas. Después de la privación, se añadió [3H]timidina y péptidos de IGF-1. Las células se incubaron después durante 24 horas a 37°C.
Al final de la incubación, se aspiró el medio. Las células se lavaron entonces con una solución enfriada con hielo de 0,9% de NaCI. A continuación, se añadió una solución de TCA al 5% enfriada con hielo para una incubación durante 30 minutos a 4°C. El TCA se aspiró y los pocilios se incubaron con etanol al 95% durante 4 horas. A continuación, el medio se transfirió a un vial de centelleo líquido para el recuento de la radiactividad.
Los datos de la bioactividad de IGF-1 in vitro (es decir, los valores de CE50) para los compuestos ejemplificados en este documento también se proporcionan en la Tabla 2.
C) Escrutinio in vitro de péptidos de IGF-1 para estudiar la reactividad cruzada con el receptor de la insulina en células U20S
Las células U20S (n° de catálogo 93-0466C3, DiscoveRX Corporation, Fremont, CA, EE.UU.) se extendieron en placas a 6 x 105 células/mL en una placa de poli-D-lisina de 96 pocilios, 16 horas antes del ensayo en medio del ensayo exento de suero. La insulina de tipo silvestre (n° de catálogo 10908, Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.), el IGF-1 de tipo silvestre (Increlex®, Tercica, Inc., Brisbane, CA, EE.UU.) o un péptido de IGF-1 del ensayo descrito en la presente solicitud, se añadió con un intervalo de dosis de 10 pM (micromolar) a 0,15 nm (nanomolar), y se incubó durante 3 horas a 37°C con 5% de CO2. El reactivo PathHunter® (n° de catálogo 93-001, DiscoveRX) se preparó de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se añadió a cada pocilio. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. La luminiscencia se leyó en un lector de placas Envision 2104 con multietiquetas (PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, EE.UU.). Se analizó la actividad de cada péptido de la prueba y se expresó como valores máximo/mínimo (máx/mín). Los datos de la reactividad cruzada del receptor de insulina in vitro (es decir, máx/mín) para los compuestos ejemplificados en este documento, también se proporcionan en la Tabla 2.
Muchos de los compuestos ejemplificados en el presente documento resultaron ser significativamente más potentes que el IGF-1 de tipo silvestre que tiene un valor de CI50 de 4,59 nM, un valor de CE50 de 3,75 nM y el valor máx/mín de 2,1.
Ejemplo Número
CI50 (nM) CE50 (nM) máx/mín
1
0,57 0,51 2,1
2
0,50 2,31 N/A
3
2,41 7,17 N/A
4
0,88 1,90 N/A
5
1,14 1,89 N/A
6
0,66 0,98 N/A
7
4,11 7,41 N/A
8
19,02 32,00 N/A
9
3,62 8,31 N/A
10
2,90 1,09 N/A
11
1,85 3,34 N/A
12
1,47 5,11 N/A
13
1,25 7,02 N/A
14
5,94 3,56 N/A
15
0,81 3,70 N/A
16
2,61 7,59 N/A
17
2,77 4,59 N/A
18
0,72 3,33 N/A
19
2,77 7,69 N/A
20
1,60 3,13 N/A
21
1,57 3,95 N/A
22
0,91 4,22 N/A
23
2,69 3,86 N/A
24
2,89 2,60 N/A
25
2,40 6,72 N/A
Ejemplo Número
CI50 (nM) CE50 (nM) máx/mín
26
3,60 1,28 N/A
27
0,58 1,13 N/A
28
3,25 2,12 N/A
29
13,25 4,86 N/A
30
1,95 1,87 N/A
31
2,03 1,18 N/A
32
2,66 5,45 N/A
33
2,25 2,30 N/A
34
N/A N/A N/A
35
3,64 3,15 N/A
36
N/A N/A N/A
37
23,25 3,42 N/A
38
23,13 4,21 N/A
39
28,10 0,93 N/A
40
N/A N/A N/A
41
N/A N/A N/A
42
1,49 2,01 N/A
43
1,27 5,08 N/A
44
6,31 3,69 N/A
45
9,27 6,24 N/A
46
N/A N/A N/A
47
1,46 1,31 N/A
48
18,49 1,81 N/A
49
4,54 2,69 N/A
50
30,63 2,63 N/A
51
2,18 1,29 N/A
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Ejemplo Número
Clso (nM) CEso (nM) máx/mín
52
1,29 2,44 N/A
53
N/A N/A N/A
54
3,49 2,34 N/A
Administración
Los análogos de IGF-1 descritos en este documento se pueden proporcionar en forma de sales farmacéuticamente aceptables. Ejemplos de tales sales incluyen, pero no se limitan a las formadas con ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido acético, láctico, maleico, cítrico, mélico, ascórbico, succínico, benzoico, metanosulfónico, toluenosulfónico o pamoico), ácidos inorgánicos (por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico) y ácidos poliméricos (por ejemplo, ácido tánico, carboximetilcelulosa, poliláctico, poliglicólico o copolímeros de ácidos poli(ácido láctico- ácido glicólico).
Un método típico de preparar una sal de un péptido descrito en este documento es bien conocido en la técnica y se puede llevar a cabo por métodos convencionales de intercambio de sales. Por ejemplo, la sal de TFA de un péptido (la sal de TFA es el resultado de la purificación del péptido mediante el uso de HPLC preparativa, eluyendo con soluciones tampón que contienen TFA) se convirtió en otra sal, tal como una sal de acetato, disolviendo el péptido en una pequeña cantidad de solución acuosa de ácido acético 0,25 N. La solución resultante se aplica a una columna de HPLC semipreparativa (Zorbax, 300 SB, C-8). La columna se eluye con (1) solución acuosa de acetato de amonio 0,1 N durante 0,5 horas, (2) solución acuosa de ácido acético 0,25 N durante 0,5 horas y (3) un gradiente lineal (20% a 100% de solución B durante 30 min) con un caudal de 4 mL/min (la solución A es una solución acuosa de ácido acético 0,25 N, y la solución B es un ácido acético 0,25 N en acetonitrilo/agua, con una relación de 80:20). Las fracciones que contienen el péptido se recogen y se liofilizan hasta sequedad.
La dosificación del ingrediente activo en las composiciones descritas en el presente documento se puede variar; sin embargo, es necesario que la cantidad de ingrediente activo sea de modo que se obtenga una forma de dosificación adecuada. La dosificación seleccionada depende del efecto terapéutico deseado, de la vía de administración y de la duración del tratamiento. La dosificación se determina fácilmente por el médico facultativo competente, cualificado.
Los compuestos descritos en el presente documento se pueden administrar por vías de administración oral, parenteral (por ejemplo, inyección intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutánea, o un implante), nasal, vaginal, rectal, sublingual o tópica y se pueden formular con vehículos farmacéuticamente aceptables para proporcionar formas de dosificación apropiadas para cada vía de administración.
Las formas de dosificación sólidas para la administración oral incluyen cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos y gránulos. En tales formas de dosificación sólidas, el compuesto activo se mezcla por adición con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable inerte tal como sacarosa, lactosa o almidón. Tales formas de dosificación también pueden comprender, como es una práctica normal, sustancias adicionales distintas de las de diluyentes inertes de este tipo, p. ej., agentes lubricantes tales como estearato de magnesio. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, las formas de dosificación también pueden comprender agentes tamponadores. Los comprimidos y las píldoras se pueden preparar adicionalmente con recubrimientos entéricos.
Las formas de dosificación líquidas para administración oral incluyen, sin limitación, emulsiones farmacéuticamente aceptables, soluciones, suspensiones, jarabes, elixires y similares que contienen diluyentes inertes usados comúnmente en la técnica, tales como agua. Además de tales diluyentes inertes, las composiciones también pueden incluir adyuvantes, tales como agentes humectantes, emulsionantes y agentes de suspensión, y agentes edulcorantes, aromatizantes y agentes perfumantes.
Las preparaciones descritas en este documento para la administración parenteral, incluyen, sin limitación, soluciones acuosas o no acuosas estériles, suspensiones, emulsiones y similares. Ejemplos de disolventes no acuosos o vehículos incluyen propilenglicol, polletilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y aceite de maíz, gelatina y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Tales formas de dosificación también pueden contener adyuvantes tales como agentes conservantes, humectantes, emulsionantes y dispersantes. Las preparaciones se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias, incorporando agentes esterilizantes en las composiciones, radiando las composiciones y/o calentando las composiciones. Las composiciones farmacéuticas que contienen los nuevos análogos de IGF-1 descritos en este documento también se pueden preparar en forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver en agua estéril o algún otro medio inyectable estéril inmediatamente antes del uso.
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Las composiciones para administración rectal o vaginal son preferiblemente supositorios que pueden contener, además de la sustancia activa, excipientes tales como manteca de cacao o una cera de supositorio.
Las composiciones para administración nasal o sublingual también se preparan con excipientes convencionales bien conocidos en la técnica.
Además, un compuesto descrito en el presente documento se puede administrar en una composición de liberación sostenida tal como las descritas en los siguientes documentos de patentes y solicitudes de patentes. El documento de patente de EE.UU. n° 5.672.659 describe composiciones de liberación sostenida que comprenden un agente bioactivo y un poliéster. El documento de patente de EE.UU. n° 5.595.760 describe composiciones de liberación sostenida que comprenden un agente bioactivo en una forma gelificable. El documento de patente de EE.UU. n° 5.821.221 describe composiciones de liberación sostenida pollmérlcas que comprenden un agente bioactivo y quitosano. El documento de patente de EE.UU. n° 5.916.883 describe composiciones de liberación sostenida que comprenden un agente bioactivo y ciclodextrina. El documento de publicación PCT W099/38536 describe composiciones de liberación sostenida absorbióles de un agente bioactivo. El documento de publicación PCT WO00/04916 describe un procedimiento para la preparación de micropartículas que comprenden un agente terapéutico tal como un péptido en un procedimiento de acelte-en-agua. El documento de publicación PCT WO00/09166 describe complejos que comprenden un agente terapéutico tal como un péptido y un polímero fosforllado. El documento de publicación PCT WOOO/25826 describe complejos que comprenden un agente terapéutico tal como un péptido y un polímero que es portador de una lactona no polimerlzable.
Además, la Invención descrita en el documento de patente de EE.UU. n° 7.258.864 presenta un método para el tratamiento de un sujeto que tiene una carencia del factor de crecimiento similar a la Insulina 1 (IGFD) que comprende administrar a un sujeto pediátrico humano una cantidad eficaz del IGF-1 no modificado, en donde el sujeto se caracteriza por lo siguiente: a) en el momento del tratamiento o antes del tratamiento Inicial con IGF-1, tiene o tenia una estatura de al menos aproximadamente 2 desviaciones estándar (SD) por debajo de una media normal para la edad y el sexo correspondiente, y b) en el momento del tratamiento o antes del tratamiento inicial con IGF-1, tiene o tenía un nivel en sangre de IGF-1 de al menos aproximadamente -1 SD por debajo de los niveles medios normales, en donde el sujeto no tiene síndrome de Laron o síndrome de insensibilidad parcial a la hormona de crecimiento, y en donde dicha administración es eficaz para tratar la IGFD en el sujeto.
Del mismo modo, la invención descrita en el documento WO 2006/130769 presenta un método para el tratamiento de un sujeto que tiene baja estatura idiopática (ISS) que comprende administrar a un sujeto pediátrico humano que padece ISS caracterizada por una actividad o señalización endógena parcial de la hormona de crecimiento, una cantidad de IGF-1 eficaz para favorecer el crecimiento en el sujeto, en donde el sujeto se caracteriza además por lo siguiente: a) en el momento del tratamiento o antes del tratamiento inicial con IGF-1, tiene o tenía una estatura de al menos aproximadamente 2,0 desviaciones estándar (SD) por debajo de la estatura media normal para un sujeto de la misma edad y sexo, y b) tiene niveles sanguíneos de GH e IGF-1 que son al menos normales para un sujeto de la misma edad y sexo.
Además, los nuevos análogos descritos en este documento se pueden administrar solos o en combinación con otro agente terapéutico según lo determinado por un médico facultativo especializado.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos empleados en este documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto ordinario en la técnica a la que pertenece esta invención.
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Listado de Secuencias
<110> IPSEN Pharma S.A.S. Dong, Zheng Xin Prairie, Nicholas C Ufret, Maria L Zhang, Jundong Rothman, Deborah Comstock, Jeanne M
<120> Análogos del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1) que tienen una sustitución de aminoácidos en la posición 59
<130> 207P/PCT2
<150>61/271549 <151 >2009-07-22
<160> 56
<170> Patentln versión 3.5
<210 1 <211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220
<223> análogo de IGF-1 <400> 1
Gly Pro Gtu Thr Leu cys Gly Ala Glu Leu val Asp Ala Leu Gln Phe

1 S 10 15
val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly

20 25 30

sér ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly lie val Asp Glu cys cys 35 40 45

Phe Arg ser cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Asn Tyr cys Alá Pro Leu So 55 60
Lys Pro Ala Lys Ser Ala

65 70
<210> 2 <211> 62 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220
<223> análogo de IGF-1 <400>2
Gly Pro Glu Thr Leu cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
1 S 10 15
val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
20 25 30
ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly He Val Asp Glu Cys cys jj 40 4*
<210> 3
5
10
15
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30
<211> 67 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> análogo de IGF-1 <400>3

Thr Leu cys Gly Ala Glu Leu val Asp Ala Leu Gln Phe val cys Gly 1 5 10 15
Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly ser ser ser
^____ 20. ...____________ 25 - 30----------
Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly lie val Asp Glu Cys Cys Phe Arg ser

35 40 45

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Lys ser Ala 65
<210> 4 <211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1 <400>4
Gly Pro Glu Thr Leu cys Gly Ala Glu Leu val Asp Ala Leu Gln Phé
1 5 10 15
val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn pro Lys Thr Gly Tyr Gly
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Lys Pro Ala Lys Ser Ala
<210> 5 <211> 62 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1 <400>5
Gly Pro Clu Thr Leu Cys Gly 1 5
val Cys Gly Asp Arg Gly Phe 20
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Phe Arg.Ser cys Asp Leu Arg
<210> 6 <211> 70 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> análogo de IGF-1
10
<400>6
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly 1 5
val Cys Gly Asp Arg Gly Phe 20
Ser Ser ser Arg Afg Alá Pro
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15 <210> 7
<211> 71 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> análogo de IGF-1
<400> 7
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Gly ser ser ser Arg Arg Ala
Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu 50 55
<210> 8
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10
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25
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10
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25
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40
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Arg
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5
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<211> 68 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1 <400>8

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val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly

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<210> 9 <211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1 <400>9

Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu val Asp Ala Leu Gln Phe 15 10 15
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<210> 10 <211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1 <400> 10

Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu val Asp Ala Leu Gln Phe 1 5 .10 15

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10
<210> 11 <211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1 <400> 11
15
20
20
50
Lys Pro Ala Lys Ser Ala 65' 70
<210> 12 <211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1
Gly
Aia Glu Leu val Asp Ala Leu Gln Phe
10 15
Phe
Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
2 5 30
Pro
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40 45
Arg
Arg
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25
<400> 12
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5
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<210> 13 <211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1 <400> 13
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu val Asp Ala teu Gln Phe

1 S 10 15
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<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1 <400> 14
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu val Asp Ala Leu Gln Phe

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<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1 <400> 15
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu val Asp Ala Leu Gln Phe
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<213> Secuencia artificial
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<223> análogo de IGF-1
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<210> 17 <211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
20
<220>
<223> análogo de IGF-1
<400> 17 25
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<210> 18 <211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1 <220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC <222> (52)..(52)
<223> Xaa = beta-metil-cisteína (B-Me-Cys)
<400> 18
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Sin Phe val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ásn Lys Pro Thr GTy Ty Gly
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......S0_. ____ ' 55 ___ 60 ......
Lys Pro Ala Lys Ser Ala 65 70
<210> 19 <211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1 <220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC <222> (47)..(47)
<223> Xaa = beta-metil-cisteína (B-Me-Cys)
<400> 19

Gly Pro Glu Thr Leu cys Gly a!» Glu Leu Val Asp Ala teM Gln X 5 10
val cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe aso Lys Pro Thr Gly Tyr Gly

Ser Ser ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly lie val Asp Glu Xaa y 35 40 45
Phe Ahg ser cys Asp Leu Arg *rg Leu Glu Leu Tyr Cys Al® pr0 Leu

Lys Pro Ala Lys Ser Ala 65 70
<210> 20
<211> 71 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
5
10
15
20
25
30
<220>
<223> análogo de IGF-1 <400> 20

Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe X 5 10 X5

val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly 20 25 30

ser Ser ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly ile val Asp Glu cys cys 35 40 45

Phe Arg ser cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Leu Tyr Cys Ala Pro Leu 50 55 G0

Lys Pro Ála Lys Ser ATa Glu 65 70
<210> 21 <211> 71 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1 <400> 21

Gly pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu val Asp Ala Leu Gln Phe 1 5 ' 10 15

val Cys Gly Asp Arg Gly phe Tyr Phe Asn Lys pro Thr Gly Tyr Gly 20 25 30

ser ser ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly lie val Asp Glu Cys cys 35 40 45
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Leu Tyr cys Ala 50 " fin
rrg i_tsu
55
60
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Asp 65 70
<210> 22 <211> 71 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1 <400> 22
5
10
15
20
25
Gly Pro Glu Thr leu cys Gly Ala 1 5
Val Cys Gly Asp Aró Gly Phe Tyr 20
Ser ser ser Arg Arg Ala Pro Gln 35 40
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg 50 55
Lys Pro Ala Lys ser Ala Lys 65 70
<210> 23 <211> 71 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1 <400> 23
Gly Pro Glu Thr Leu cys Gly Ala l S
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr 20
Ser ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln 35 40
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg 50 55
Lys Pro Ala Lys ser AÍa ser
65 70
<210> 24 <211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1 <400> 24
Gly Pro Glu Thr Leu cys Gly Ala
val cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr 20
Ser ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln 35 40
Phe Arg ser cys Asp Leu Arg Arg 50 55
Glu Leu val Asp Ala Leu Gln Phe 10 15
Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly 25 30
Thr Gly lie Val Asp Glu Cys cys
Leu Glu Leu Tyr cys Ala Pro Leu 60
Glu Leu val Asp Ala Leu Gln Phe 10 15
phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly 25 30
Thr Gly lie val Asp Glu Cys cys
45
Leu Glu Leu Tyr Cys Ala Pro Leu 60
Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe 10 15
Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly 25 30
Thr Gly lie Val Asp Glu Cys Cys
Leu Glu Leu Tyr cys Ala Pro Leu
5
10
15
20
25
30
35
<210> 25 <211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> análogo de IGF-1 <400> 25
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
1 5 10 15 ..........
Val cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly lie val Asp Glu Cys Cys 35 40 45
Phe Arg Thr Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Leu Tyr Cys Ala Pro Leu 50 55 60
Lys Pro Ala Lys Ser Ala ____
—5$ ---------------- 70 •------- -------------
<210> 26 <211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> análogo de IGF-1 <220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC <222> (47)..(47)
<223> Xaa = N-metil-cisteína (N-Me-Cys) <220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC <222> (59)..(59)
<223> Xaa = norleucina (Nle)
<400> 26
Gly
Pro Glu Thr Leu 5 cys Gly Ala
val
cys Gly ASp 20 Arg Gly Phe Tyr
Ser
ser ser Arg Arg Ala Pro Gln
35 40
Phe
Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg
50 55
Lys
Pro Ala cys Ser Ala
65
70
<210> 27 <211> 70 <212> PRT
Glu Leu val Asp Ala Leu Gln Phe
10 15
phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly 25 30
Thr Gly lie val Asp Glu Xaa Cys
Leu Glu xaa Tyr Cys Ala Pro Leu 60
5
10
15
20
25
30
35
40
<220>
<223> análogo de IGF-1 <220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC <222> (59)..(59)
<223> Xaa = norleucina (Nle)
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC <222> (69)..(69)
<223> Xaa = ácido alfa-aminoisobutírico (Aib)
<400> 27
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu val asp Ala Leu Gln Phe

1 5 10 15
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly

20 25 30

ser ser sér Arg Arg Ala pro Gln Thr Gly lie val Asp Glú cys cys 35 40 45

Phe Arg Ser cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Xaa Tyr Cys Ala Pro Leu 50 55 60

Lys Pro Ala Lys xaa Ala 65 70
<210> 28 <211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1 <220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC <222> (48)..(48)
<223> Xaa = N-metil-cisteína (N-Me-Cys)
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC <222> (59)..(59)
<223> Xaa = norleucina (Nle)
<400> 28
Gly Pro Glu Thr Leu cys Gly Ala Glu Leu val Asp Ala Leu Gln Phe
1 5 10 15
val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr <¡|y
5
10
15
20
25
30
35
40
Ser
ser ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly ríe val Asp Glu Cys Xaa
35 40 45
Phé
Arg 50 Ser cys Asp Leu Arg 55 Arg Leu Glu xaa Tyr cys Ala pro Leii
Lys
Pro Ala Lys Ser Ala ....... . ——..
65
70
<210> 29 <211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1 <220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC <222> (59)..(59)
<223> Xaa = norleucina (Nle)
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC <222> (67)..(67)
<223> Xaa = ácido alfa-aminoisobutmco (Aib)
<400> 29

Gly Pro Glu Thr Leu cys Gly Ala Glu Leu val Asp Ala Leu Gln phe 1 5 10 is

Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Glv in oe an 7 ’

Ser Ser ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly ile val Asp Glu cvs rv? 35 40 45 r
imagen2

Lys Pro Xaa Lys Ser Ala 65 70
<210> 30 <211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1 <220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC <222> (52)..(52)
<223> Xaa = homo-cisteína (hcys) <220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC <222> (59)..(59)
<223> Xaa = norleucina (Nle)
5
10
15
20
25
30
35
Gly pro Glu Thr Leu cys Gly Ala Glu Leu val asp Ala Leu Gln Phe

1 . 5 " 10 IS '
val cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly

20 25 30

Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly ríe Vál Asp Glu cys Cys 35 40 45

Phe Arg ser Xaa Asp Leu Arg Arg Leu Glu xaa Tyr cys Ala Pro Leu 50 55 60

Lys Pro Ala Lys ser Ala 65 70
<210> 31 <211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1 <220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC <222> (51)..(51)
<223> Xaa = ácido alfa-aminoisobutirico (Aib)
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC <222> (59)..(59)
<223> Xaa = norleucina (Nle)
<400> 31
Gly Pro Glu Thr Leu cys Gly Ala Glu Leu val Asp Ala Léu Gln Phe

1 5 10 ^5
val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly

20 25 30

Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln thr Gly lie Val Asp Glu Cys Cys 35 40 45

Phe Arg xaa Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Xaa Tyr Cys Al* Pr0 Leu 50 55 60
Lys Pro Ala Lys ser Ala

65 70
<210> 32 <211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> análogo de IGF-1 <220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC <222> (52)..(52)
5
10
15
20
25
30
35
40
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC <222> (59)..(59)
<223> Xaa = norleucina (Nle)
<400> 32
Gly Pro Glu Thr Léu cys Gly Ala Glu Leu val Asp Ala Leu Gln Phe

T 5 10 1S .
Val cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr l»he Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly

20 15 30 •

Ser Ser ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly lie Val Asp.Glü cys Cys 3S 40 45

Phe Arg Ser xaa Asp Leu Arg Arg Leu Glu xaa Tyr cys Ala pro Leu 50 55 60

Lys Pro Ala Lys ser Ala 65 70
<210> 33 <211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1 <220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC <222> (59)..(59)
<223> Xaa = norleucina (Nle)
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC <222> (61)..(61)
<223> xaa = penicilamina (Pen)
<400> 33

Oly Pro Glu Thr Leu cys Gly Ala Glu Leu val Asp Ala Leu Gln Phe 1 5 10 15

val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ásn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly 20 25 30

ser ser ser Árg Arg Alá Pro Gln Thr Gly lie val Asp Glu cys cys 35 40 45

Phe Arg ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Xaa Tyr xaa Ala Pro Leu 50 55 60

Lys Pro Ala Lys ser Ala 65 70
<210> 34 <211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
<223> análogo de IGF-1
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC <222> (54)..(54)
<223> Xaa = ácido 1-am¡no-1-c¡clohexanocarboxflico (A6c)
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC <222> (59)..(59)
<223> Xaa = norleucina (Nle)
<400> 34
Gly Pro Glu Thr Leu cys Gly Ala Glu.Leu val Asp Ala Leu Gln -phe 1 5 10 15
val cys Gly Asp 20
Ser Ser Ser Arg 35
Phe Arg ser cys Asp xáa Arg Arg Leu Glu xaa Tyr Cys Ála Pro Leu 50 55 60
Lys Pro Ala Lys Ser Ala 65 70
<210> 35 <211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1 <400> 35

Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala leu Gln Phe l ' S i© 15
val cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly

ser Ser ser Arg Arg Ala pro Gln Thr Gly He Val Asp Glu cys Cys 35 40 45

Phe Arg Ser Cys Arg Leu Arg Arg Leu Glu lie Tyr Cys Ala Pro Leu sn 55 ou

Lys Pro Ala Lys ser Ala 65 70
<210> 36 <211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1 <400> 36
Arg Gly Phe Tyr Phe aso Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
Aro Ala Pro Gln Thr Gly lie Val Asp Glu Cys Cys s 40 45

Gly Pro Glu Thr Leu cys Gly 1 S
val cys Gly Asp Arg Gly Phe 20
ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro

Arg Arg ser cys Asp Leu Arg 50 55

Lys pro Ala Lys ser Ala 65 70
<210> 37 <211> 70 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> análogo de IGF-1
10
<400> 37
Gly Pro Glu Thr Leu cys Gly
val Cys Gly Asp Arg Gly Phe 20
Ser ser ser Arg Arg Ala Pro 35
Phe Arg Arg cys Asp Leu Ara 50 55
Lys Pro Ala Lys' Ser Ala 65 70
15
<210> 38 <211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
20
<220>
<223> análogo de IGF-1
<400> 38 25
Glu
Leu 10 val Asp Ala Leu Gln 15 Phe
Phe
Asn Lys pro Thr Gly Tyr Gly
25
30
Thr
Gly He val Asp GlU cys cys
45
Leu
Glu lie Tyr cys Ala Pro
Leu
60
Glu
Leu 10 val ASp Ala Leu Gln 15 phe
Phe 25
Asn Lys pro Thr Gly 30 Tyr ciy
Thr
Gly lie val ASP Glu Cys Cys
45
Leu
Glu lie Tyr cys Ala Pro
Leu
60
Ala
Tyr
Gln
40
Arg
Ala
Tyr
Gln
40
Arg
5
10
15
20
25
30
6ly Pro Glu Thr Leu cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe

1 s 10 15

Vál Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr 61 y Tyr clv
20 25 y
30

ser ser ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly ile val aso Glu Cys cys 3S 40 ■ ■ 7
45
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Arg lie Tyr Cys Ala Pro Leu
50
55
€0
Lys Pro Ala Lys Sén Ala 70
%
<210> 39 <211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> análogo de IGF-1
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC <222> (59)..(59)
<223> Xaa = ácido 1-amino-1-ciclohexanocarboxN¡co (A6c)
<400> 39
Gly Pro Glu Thr Leu cys Gly Ala Glu Leu val asp Ala Leu Gln Phe

1 S 10 15
val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly

20 25 30

Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly íle val Asp Glu Cys Cys 35 40 45

Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Xaa Tyr cys Ala pro Léü 50 55 60

Lys Piro Ala Lys Ser Ala 65 70
<210> 40 <211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1 <400> 40
val cys Gly ASP Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
5
10
15
20
ser ser ser Arg Arg Ala Pro Gln,jhr Gly lie Val Asp Glu Cys Cys 35
phe Arg ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Asp Tyr cys Ala pro Leu SO S5 60
Lys pro Ala Lys ser Ala 65 70
<210> 41 <211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1 <400> 41
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu val Asp Ala Leu Gln Phe

I 5 10 15
val cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr qly Tyr Gly

20 25 30

Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly lie Val Asp Glu Cys Cys 35 40 45
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg l¿u Glu Trp T^r cys Ala Pro Leu

Lys Pro Ala Lys Ser Ala 65 70
<210> 42 <211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1 <400> 42

val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Ty<" Gly 20 25 3°

ser ser ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly lie val Asp Glu Cys cys 35 40 45
phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu ser Tyr cys Ala Pro Leu SO 55 60 ____

Lys Pro Ala Lys Ser Ala 65 70
<210> 43 <211> 70 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> análogo de IGF-1
0
<400> 43
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu val Asp Ala Leu Glh Phe 1 5 10
val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly TV|Í'

20 25 .

• ser Ser ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly lie val Asp c^s c^s 35 40 45

Phe Arg ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Tyr cys Ala Pro Lé íft 55 60

Lys Pro Ala Lys Ser Ala 65 70
15 <210> 44
<211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> análogo de IGF-1
<400> 44
Gly
Pro Glu Thr Leu S Cys Gly Ala Glu Leu 10 Val Asp Ala Leu Gln 15 Phe
val
Cys Gly Asp 20 Arg Gly Phe Tyr Phe 25 Asn Lys Pro Thr Gly 30 Tyr Gly
ser
Ser ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly He val Asp Glu Cys cys
35 40 45
Phe
Arg 50 Ser Cys Asp Leu Arg 55 Arg Leu Glu Glu Kr cys Ala Pro Leu
Lys Pro Ala Lys ser Ala 65 70
<210> 45 <211> 70 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> análogo de IGF-1
10
<400> 45

Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu val Asp Ala Leu Gln Phe 1 . . 5 10 15
val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly

ser ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly lie Val Asp Glu Gys Cys 35 40 45

Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Gln Tyr cys Ala Pro Leu SO 55 60

Lys pro Ala Lys ser Ala 65 70
15 <210> 46
<211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> análogo de IGF-1
<400> 46
Gly Pro Glu Thr Leu cys Gly Ala Glu Leu val Asp Ala Leu Gln Phe 1 5 10 15
25 Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
20
25
30
10

Ser ser ser Aro Arg Ala Pro Gln Thr Gly lie Val Asp Glu Cys Cys 35 40

Phe Aria Ser cys Ásp Leu Arg Arg Leu Glu Arg Tyr Cys Ála Pro Leu 50 55 w

Lys Pro Ala Lys ser Ala 65 70
<210> 47 <211> 71 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1 <400> 47
Met Gly Pro Glu Thrxeü Cys Gly Alá Glu Leu val Asp Ala Leu Gln
1 S 10 15
Phe val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr
20 25 30
Gly ser Ser Ser Arg Arg Ala pro Gln Thr Gly lie Vál :Asp Glu Cys -* Afi 45
35
40
cys Phe Arg ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Asn Tyr Cys Ala Pro 50 55 60
Leu Lys Pro Ala Lys Ser Ala 65 - 70
15 <210> 48
<211> 65 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> análogo de IGF-1
<400> 48

Thr Leu cys Gly Ala Glu Leu val Asp Ala Leu Gln phe val cys Gly 1.5 10 15

Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly Ser ser ser 20 25 30

Ara Arg Ala Pro Gln Thr Gly lie val Asp Glu Cys cys Phe Arg 35 40 45
Ser

Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr cys Ala Pro Leu Lys Pro Ala 50 55 60
r
<210> 49 <211> 70
5
10
15
20
25
30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221 > MOD_RES <222> (70)..(70)
<223> AMIDACION
<400> 49
Gly Pro Glu Thr Leu cys Gly Ala Glu Leu val Asp Ala'Leu Gln Phe

1 5 10 15
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly

20 25 30

Ser Ser ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly lie val Asp Glu cys Cys .35 40 45

Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met tyr Cys Ala Pro Leu 50 55 60

Lys pro Ala Lys ser Ala 65 70
<210> 50
<211> 70
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu val Asp Ala Leu Gln Phe

1 5 10 15
val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly

20 25 30

Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly lie Val Asp Glu Cys Cys

35 ' 40 45
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr cys Ala Pro Leu

50 55 60

Lys Pro Ala Lys Ser Ala 65 70
<210> 51 <211> 23 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1 <400> 51
Cys Phe Arg ser Cys Asp Leu Arg Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Ala Pro
Leu Lys Pro Ala Lys ser Ala 20
5
10
15
20
25
30
35
40
45
<210> 52 <211> 48 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1 <220>
<221 > MOD_RES <222> (48)..(48)
<223> modificado con un grupo tioéster-propionilo <220>
<221 > MOD_RES <222> (48)..(48)
<223> AMIDACION
<400> 52
Gly Pro Glu Thr Leu cys Gly Ala Glu Leu val Asp Ala Leu Gln Phe

1 5 10 15
val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly

20 25 30

ser ser ser Arg Arg Ala pro Gln Thr Gly lie val Asp Glu Cys Leu 35 40 45
<210> 53 <211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1 <220>
<221 > MOD_RES <222> (1)..(1)
<223> glioxilado
<400> 53
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu val asp Ala Leu Gln Phe

1 5 10 15
val cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly

20 25 30

Ser ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly ile val asp Glu Cys Cys 35 40 4$
Phe Arg ser cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Asn Tyr Cys Ala Pro Leu

Lys Pro Ala Lys Ser Ala 65 70
<210> 54 <211> 47 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
<220>
<221> MOD_RES <222> (46)..(47)
<223> enlazador de tioéster-propionilo <220>
<221> MOD_RES <222> (47)..(47)
<223> AMIDACION
<400> 54

Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe 1 5 10 15

val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly 20 25 30
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly lie Val Asp Glu Leu

35 40 4S
<210> 55 <211> 24 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1 <220>
<221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (1)..(1)
<223> Xaa = beta-metil-cisteína (B-Me-Cys)
<400> 55
xaa cys Phe Arg ser cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Leu Tyr Cys Ala 1 5 10 15
Pro Leu Lys Pro Ala Lys ser Ala 20
<210> 56 <211> 23 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> análogo de IGF-1 <220>
<221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (1)..(1)
<223> Xaa = N-metil-cisteína (N-Me-Cys) <220>
<221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (12)..(12)
<223> Xaa = norleucina (Nle)
<400> 56

Claims (6)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    1. Un análogo de IGF-1 de fórmula (I),
    H-
    A-1 -A1 -a2-a3-a4-a5-a6-a7-a8-a9-a10-a11 -a12-a13-a14-a15-a16-a17-a18-a19-a20-a21 -a22-a23-a24-a25-a26-a27-a28-a29-a
    ^31 ^32 ^33 ^34 ^35 ^36 ^37 ^38 ^39 ^40 ^41 ^42 ^43 ^44 ^45 ^46 ^47 ^48 ^49 ^50 ^51 ^52 ^53 ^54 ^55 ^56 ^57 ^58 ^
    59
    60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 1
    (I)
    en donde:
    A59 es Asn;
    A-1 es Met, Ser o eliminado;
    A1 es Gly o eliminado;
    A2 es Pro, Lys o eliminado;
    A3 es Glu o eliminado;
    A4 es Thr;
    A5 es Leu;
    A6 es Cys, hCys, p-Me-Cys, N-Me-Cys o Pen; A7 es Gly;
    A8 es Ala;
    A9 es Glu;
    A10 es Leu;
    A11 es Val;
    A12 es Asp;
    A13 es Ala;
    A14 es Leu;
    A15 es Gln;
    A16 es Phe;
    A17 es Val;
    A18 es Cys, hCys, p-Me-Cys, N-Me-Cys o Pen; A19 es Gly;
    A20 es Asp;
    A21 es Arg;
    A22 es Gly;
    A23 es Phe;
    A24 es Tyr;
    A25 es Phe;
    A26 es Asn;
    A27 es Lys, Arg o Pro;
    A28 es Pro o Lys;
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    A29 es Thr;
    A30 es Gly;
    A31 es Tyr;
    A32 es Gly;
    A33 es Ser;
    A34 es Ser;
    A35 es Ser;
    A36 es Arg;
    A37 es Arg;
    A38 es Ala;
    A39 es Pro;
    A40 es Gln;
    A41 es Thr;
    A42 es Gly;
    A43 es Ile;
    A44 es Val;
    A45 es Asp;
    A46 es Glu;
    A47 es Cys, hCys, p-Me-Cys, N-Me-Cys o Pen; A48 es Cys, hCys, p-Me-Cys, N-Me-Cys o Pen; A49 es Phe, Arg, Leu o Thr;
    A50 es Arg o Ser;
    A51 es Ser, Aib, Arg o Thr;
    A52 es Cys, hCys, p-Me-Cys, N-Me-Cys o Pen; A53 es Asp, Arg o Ser;
    A54 es Leu o A6c;
    A55 es Arg o Tyr;
    A56 es Arg o Gln;
    A57 es Leu;
    A58 es Glu o Arg;
    A60 es Tyr o Phe;
    A61 es Cys, hCys, p-Me-Cys, N-Me-Cys o Pen; A62 es Ala o Asn;
    A63 es Pro, D-Pro, Thr o eliminado;
    A64 es Leu, D-Leu, des-Leu o eliminado;
    A65 es Lys, D-Lys, des-Lys, Arg o eliminado; A66 es Pro, D-Pro o eliminado;
    A67 es Ala, D-Ala, Aib o eliminado;
    A68 es Lys, D-Lys, Arg o eliminado;
    A69 es Ser, D-Ser, Aib, Thr o eliminado;
    A70 es Ala, D-Ala, Glu o eliminado; y 5 A71 es eliminado, Asp, Glu, Lys o Ser; y
    R1 es OH o NH2;
    siempre que las cadenas laterales de las parejas de residuos A6 y A48, A47 y A52, y A18 y A61, formen cada una un enlace disulfuro; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  2. 2. Un análogo de IGF-1 según la reivindicación 1, en donde dicho análogo es:
    (Asn59)hIGF-1(1-70)-OH;
    (SEQ ID NO:1)
    (Asn59)hIGF-1(1-62)-OH;
    (SEQ ID NO:2)
    (Asn59)hIGF-1(4-70)-OH;
    (SEQ ID NO:3)
    (Pro27, Lys28, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH;
    (SEQ ID NO:4)
    (Pro27, Lys28, Asn59)hIGF-1(1-62)-OH;
    (SEQ ID NO:5)
    (Ser53, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH;
    (SEQ ID NO:6)
    (Ser-Gly1, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH;
    (SEQ ID NO:7)
    (Asn59, Thr63, des-Leu64, des-Lys65, Glu70)hIGF-1(1-70)-OH;
    (SEQ ID NO:8)
    (Tyr55, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH;
    (SEQ ID NO:9)
    (Thr49, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH;
    (SEQ ID NO:10)
    (Asn59,62)hIGF-1(1-70)-OH;
    (SEQ ID NO:11)
    (Asn59, Phe60)hIGF-1(1-70)-OH;
    (SEQ ID NO:12)
    (Ser50, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH;
    (SEQ ID NO:13)
    (Gln56, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH;
    (SEQ ID NO:14)
    (Asn59, D-Pro63)hIGF-1(1-70)-OH; (Asn59, D-Leu64)hIGF-1(1-70)-OH; (Asn59, D-Lys65)hIGF-1(1-70)-OH; (Asn59, D-Pro66)hIGF-1(1-70)-OH; (Asn59, D-Ala67)hIGF-1(1-70)-OH; (Asn59, D-Lys68)hIGF-1(1-70)-OH; (Asn59, D-Ser69)hIGF-1(1-70)-OH; (Asn59, D-Ala70)hIGF-1(1-70)-OH;
    (Met-Gly1, Asnba)hlGF-1(1-70)-OH; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
    (SEQ ID NO:47)
  3. 3. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un análogo según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.
  4. 4. Un análogo según la reivindicación 1 o 2 o una composición farmacéutica según la reivindicación 3, para uso en el 5 tratamiento de afecciones o enfermedades mediadas por la unión al receptor de IGF-1, comprendiendo dicho
    tratamiento la etapa de administrar a un sujeto que lo requiere una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho análogo o composición farmacéutica.
  5. 5. Un análogo o una composición farmacéutica para uso según la reivindicación 4, en donde dicha afección o enfermedad se selecciona a partir del grupo que consiste en estatura baja, obesidad, pérdida de peso, caquexia,
    10 anorexia, trastornos neurodegenerativos, afecciones ligadas a la fibrosis, trastornos del cartílago, enfermedades óseas, trastornos inflamatorios, trastornos intestinales, resistencia a la insulina, diabetes, cetoacidosis diabética, síndrome de Rabson-Mendenhall, retinopatía, acromegalia, hiperplasia fibromuscular y trastornos cardíacos.
  6. 6. Un análogo o una composición farmacéutica para uso según la reivindicación 5, en donde dicho sujeto que requiere un tratamiento de la estatura baja es un sujeto pediátrico humano que tiene una carencia de factor de
    15 crecimiento similar a la insulina 1 (IGFD), en donde dicha administración es eficaz para tratar la IGFD en el sujeto pediátrico humano.
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