ES2562439T3 - Procedimiento para preparar un extracto de plantas de Passiflora alata y uso de dicho extracto en composiciones cosméticas y farmacéuticas - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para preparar un extracto de planta de Passiflora alata, caracterizado porque comprende las etapas de: a) someter hojas de plantas de Passiflora alata a una extracción con agua para obtener un extracto acuoso; b) someter el extracto acuoso obtenido en (a) a al menos una elución con una solución hidroalcohólica en una columna cromatográfica rellena con una resina que consiste en polímeros de polivinilpirrolidona o poliestireno; c) concentrar y secar por pulverización el extracto obtenido en (b).

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento para preparar un extracto de plantas de Passiflora alata y uso de dicho extracto en composiciones cosmeticas y farmaceuticas

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere al uso de extractos de plantas de Passiflora alata como un ingrediente activo antiinflamatorio y analgesico en composiciones cosmeticas y farmaceuticas.

Antecedentes de la invencion

Las especies de plantas del genero Passiflora (Passifloraceae) son nativas de las zonas tropicales y sus compuestos mas importantes son los flavonoides. Estas especies de plantas son conocidas en la medicina popular debido a sus propiedades farmacologicas, tales como la accion ansiolttica e hipotensora, entre otras. Algunas especies de plantas del genero Passiflora tambien se conocen como principios activos vegetales con accion antiinflamatoria. Algunos documentos de la tecnica anterior relativos a la preparacion de extractos de Passiflora y su uso en composiciones cosmeticas y farmaceuticas se presentan a continuacion.

El documento de patente internacional WO2005/097153 da a conocer un metodo espedfico para la preparacion de extractos de la fruta de la pasion (Passiflora) y el uso de tales extractos como agentes protectores del hngado, antioxidantes e antiinflamatorios en mairnferos. Sin embargo, este documento no se refiere a especies particulares de Passiflora o a la mejora de las caractensticas de dichas especies.

El documento de patente europea EP 1 537 789 describe composiciones para la aplicacion topica que comprenden carotenoides, tocoferoles y extractos de la flor de la pasion que tienen actividad antiinflamatoria.

El documento de patente japonesa JP 200200336 describe un producto cosmetico que comprende un extracto de Cymbidium y un extracto de plantas, tal como Passiflora, que inhibe la produccion de melanina, y que tiene actividad antiinflamatoria.

El documento de patente japonesa JP 2000159657 describe una preparacion para aplicacion externa y topica a la piel, que comprende extractos de plantas del genero Passiflora que tienen actividad inhibidora de la produccion de melanina y un efecto de blanqueamiento.

El documento de patente japonesa JP 2001122731 describe una composicion cosmetica que contiene extractos de Passiflora antioquiensis y Passiflora mollissima que tiene actividad de hidratacion prolongada y una eficacia significativa contra las enfermedades inflamatorias.

El documento de patente japonesa JP 2002332224, a su vez, da a conocer una composicion cosmetica para luchar contra el envejecimiento de la piel que comprende un extracto de Passiflora incarnata L. que tiene actividad sobre los smtomas del envejecimiento y que comprende un ingrediente de hidratacion o un ingrediente activador celular.

El documento de patente japonesa JP 7233044 describe tambien un producto cosmetico para la prevencion de arrugas con la accion de activacion de las celulas, en el que la composicion segun dicho documento comprende una mezcla de extractos seleccionados de varias plantas, que incluyen Passiflora, Pineliae Tuber y Mori Fructus.

El documento de patente internacional WO 2005/077328 se refiere a un producto cosmetico antiarrugas a base de extractos de plantas. Los productos descritos en dicho documento son sistemas de agua en aceite que contiene un extracto de Passiflora y extractos de papaver, menta y mirtus con el objetivo de conseguir un efecto de humectacion de larga duracion y una mejor elasticidad.

El documento de patente japonesa JP 2001226219 describe una composicion cosmetica que contiene un extracto de planta diluido, dicho extracto de planta se selecciona del Passiflora caerulea L y Passiflora edulis Sims, mientras que el documento de patente japonesa JP 7118139 da a conocer un producto cosmetico que promueve un efecto de embellecimiento de la piel que comprende un extracto de plantas, tal como Passiflora SSP.

El documento de patente japonesa JP 2004155664 se refiere a un agente que mejora las funciones de la piel para uso interno, dichas funciones de la piel se mejoran con el uso de un polvo vegetal de las plantas del genero Passiflora, entre otras. El documento de patente internacional WO 2005/053435 describe preparaciones para la administracion oral y/o topica que contienen Passiflora incarnata, asf como caroteno y tocoferoles.

Los inventores demuestran en la presente solicitud que extractos preparados a partir de plantas del genero Passiflora tienen actividad antiinflamatoria y analgesica mejoradas, y han desarrollado un procedimiento de extraccion para obtener un extracto rico en flavonoides lo que ha originado dicha actividad analgesica y anti- inflamatoria mejoradas, dirigido a un uso topico y/o interno (oral).

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Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 contiene una breve descripcion del procedimiento de extraccion para obtener un extracto seco de las hojas de Passiflora alata enriquecido en flavonoides y, en concreto, en vitexin-2"-O-ramnosido (CAS 64820-99-1).

La Figura 2 presenta el perfil cromatografico obtenido por HPLC (cromatograffa Ifquida de alta presion) del extracto de Passiflora alata obtenido segun la presente invencion.

La Figura 3 presenta el perfil cromatografico obtenido por HPLC de una fraccion del extracto acuoso de Passiflora alata fraccionado por cromatograffa preparativa, usando sflice como la fase estacionaria. Esta fraccion (Fr13-23) tiene la flavona glicosilada vitexin-2-O-ramnosido como componente principal. El fraccionamiento se llevo a cabo con el fin de demostrar las actividades biologicas in vitro de este compuesto, que tambien esta presente en el extracto acuoso original.

Las Figuras 4 a 14 representan graficos que contienen datos relativos a las pruebas de seguridad y eficacia de muestras de extractos de Passiflora alata segun la presente invencion.

Compendio de la invencion

La presente invencion se refiere al uso de extractos de plantas de Passiflora alata como un agente antiinflamatorio en composiciones cosmeticas y farmaceuticas.

La presente invencion se refiere tambien a un procedimiento para la obtencion de un extracto de plantas de Passiflora alata, que comprende las etapas de:

a) someter hojas de plantas de Passiflora alata a una extraccion con agua para obtener un extracto acuoso;

b) someter el extracto acuoso obtenido en (a) a al menos una etapa de elucion con una solucion hidroalcoholica en una columna cromatografica rellena con una resina espedfica de polfmeros de polivinilpirrolidona o poliestireno;

c) concentrar y secar por pulverizacion el extracto obtenido en (b).

Descripcion detallada de la invencion

Los presentes inventores han encontrado que los extractos de plantas de Passiflora alata tienen actividad antiinflamatoria y analgesica mejorada y son utiles en composiciones cosmeticas, en particular composiciones antiarrugas o antienvejecimiento, asf como en composiciones farmaceuticas, en particular para la administracion topica u oral.

En una forma de realizacion de la invencion, el extracto de la planta de Passiflora alata se obtiene mediante un procedimiento que comprende las etapas de

a) someter las hojas de la planta de Passiflora alata a una extraccion con agua para obtener un extracto acuoso;

b) filtrar el extracto obtenido en (a);

c) someter el extracto acuoso obtenido en (b) a un procedimiento de purificacion por medio de una resina espedfica esta resina consiste en polfmeros de polivinilpirrolidona o poliestireno;

d) eluir el extracto con una mezcla hidroalcoholica acidificada;

e) concentrar el producto obtenido en (d);

f) volver a suspender el producto obtenido en (e) en etanol caliente y despues enfriar;

g) filtrar la solucion obtenida en (f);

h) concentrar el producto obtenido en (g);

i) secar el producto obtenido en (h) con la ayuda de un vehuculo solido.

Segun otro aspecto de la invencion, el extracto de Passiflora alata se obtiene mediante un procedimiento que comprende las etapas de:

a) someter las hojas de la planta de Passiflora alata a una extraccion con agua en la proporcion de 1 parte de la planta a 20 partes de agua caliente, entre 60° C y 80° C, preferiblemente a 80° C, durante 2 horas;

b) filtrar el extracto obtenido en (a);

c) someter el extracto acuoso obtenido en (b) a un procedimiento de purificacion por medio de una resina espedfica, esta resina consiste en polfmeros de polivinilpirrolidona o de poliestireno, preferiblemente poliestireno;

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d) eluir el extracto resultante con una mezcla hidroalcoholica, preferiblemente con etanol al 30% en agua, acidular con acido acetico a pH 5,0;

e) concentrar el producto obtenido en (d) a 30% del material solido total;

f) volver a suspender el producto obtenido en (e) en etanol caliente 96° GL a 60° C y posteriormente enfriar a 2° C;

g) filtrar la solucion obtenida en (f);

h) concentrar el producto obtenido en (g) a 20% de material solido total;

i) secar el producto obtenido en (h) usando un metodo de secado por pulverizacion con una temperatura de entrada de 180° C y una temperatura de salida de 85° C con la ayuda del vehiculo "E 1450" (succinato de octenilo de almidon sodico) a la concentracion de 1 a 8%, preferiblemente 8%.

El extracto seco resultante del procedimiento anterior contiene flavonoides C-glicosilados, principalmente orientina, homoorientina, vitexina, isovitexina y vitexin-2"-O-ramnosido; y flavonas, principalmente luteolina. Sus formulas estructurales se describen a continuation:

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Homoorientina

imagen3

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imagen5

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Se encontro que el flavonoide presente en mayor cantidad en el extracto de Passiflora alata obtenido segun la presente invention es vitexin-2"-O-ramnosido (CAS 64820-99-1), este flavonoide solamente se encuentra en las especies de Passiflora alata cuando se compara con otras especies de Passiflora que se utilizan mas comunmente como agentes fitoterapeuticos, tambien se recomienda como un marcador quimico para evitar adulteraciones del principio activo vegetal con otras especies de Passiflora (PEREIRA, 2004).

El contenido de flavonoides totales obtenidos en la presente invencion esta dentro del intervalo de aproximadamente 11,40% a aproximadamente 16,55%, segun la metodologia de dosificacion de flavonoides totales, tales como vitexina, segun lo determinado por la Farmacopea Portuguesa, 2000.

El contenido de vitexin-2"-O-ramnosido obtenido por la presente invencion es de aproximadamente 9,70% a aproximadamente 11,90%, segun la metodologia de dosificacion de esta sustancia por HPLC. Las condiciones de este analisis fueron:

- Cromatografia liquida de alta eficiencia Alliance con detector PDA 2996, fabricante Waters.

- Columna X-Terra RP 18,5 pm, 4,6 x 150 mm

- Fase movil: sistema de gradiente compuesto de acetonitrilo y acido formico al 0,2% v/v.

- Caudal: 0,6 ml/min

- Temperatura: 25°C

- Volumen inyectado: 20 pl

- Longitud de onda: 340,7 nm

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La presente invencion se refiere ademas a composiciones cosmeticas y farmaceuticas que contienen un extracto de la planta de Passiflora alata como un agente antiinflamatorio activo. En las composiciones segun la presente invencion, la cantidad de extracto de Passiflora alata utilizado depende del objetivo final previsto, pero preferiblemente esta entre 0,25 a 1,00% en peso, basado en el peso total de la composicion. Las composiciones de la presente invencion pueden contener otros ingredientes utilizados tradicionalmente en estos tipos de composiciones, tales como agentes quelantes, antioxidantes, agentes espesantes, agentes de ajuste del pH, conservantes, agentes humectantes, agentes acondicionadores, otros emolientes, agentes filmogenos, agentes de oleosidad, y agentes adsorbentes, entre otros. La presente invencion se ilustrara con los ejemplos siguientes.

Ejemplo 1 - Obtencion de un extracto de Passiflora alata

Se colocaron 50 g de hojas de Passiflora alata en 1.000 l de agua destilada y la mezcla se calento a 80° C durante 3 horas. A continuacion, la mezcla se paso a traves de una columna de poliestireno y despues se eluyo con una solucion de etanol al 30% acidificada a pH 5,0 con acido acetico. El extracto resultante se filtro y se seco.

Ejemplo 2 - Obtencion de un extracto de Passiflora alata purificado por el contacto con PVPP

Fueron sometidas 100 g de hojas secas de Passiflora alata a extraccion con agua destilada en una proporcion de 1:10 (p/v) a 80° C durante 2 horas. Despues de filtracion con un buchner, se tomaron 4 alfcuotas de 50 ml y se mezclaron con 2,5 g de PVPP (Divergan F BASF) a 8°C.

Despues de 90 minutos bajo agitacion, las muestras se eluyeron en el buchner y se sometio PVPP a los siguientes eluyentes para la eliminacion de los flavonoides contenidos en la mezcla resultante:

a) 50 ml de H2O + NH4OH 1%, 60° C, 30 minutos

b) 50 ml de H2O + HCl 1%, 60° C, 30 minutos

c) 50 ml de EtOH + NH4OH 1%, 60° C, 30 minutos

d) 50 ml de EtOH + HCl 1%, 60° C, 30 minutos

Las alfcuotas se diluyeron 8,33 veces y luego se analizaron por HPLC en las siguientes condiciones de analisis:

Fase movil (A): acido formico 0,2% en agua Fase movil (B): ACN

Deteccion: 337 nm (para los flavonoides)

Flujo: 0,8 ml/min

Testigos: disueltos en metanol: orientina, isoorientina, vitexina, isovitexina, luteolina, apigenina. Concentracion de 105 ppm

Columna: Phenomenex Synergil 4 micras Fusion RP-80 150 x 4,6 mm Gradiente:

Tiempo

% (A) % (B)

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El valor del area de vitexina fue considerado para propositos de comparacion, ya que es el flavonoide principal.

La Figura 1 contiene un grafico comparativo de los resultados obtenidos para las varias muestras, y en la Figura 2 se enumeran los cromatogramas de varias carreras realizadas en este analisis en el que se observo que PVP es capaz de absorber los flavonoides glicosilados a baja temperatura.

Ejemplo 3 - Obtencion e identificacion de flavonoides de diferentes extractos de Passiflora alata

Los flavonoides presentes en diferentes tipos de extractos de Passiflora alata se obtuvieron a traves de 2 metodologfas diferentes.

a) Ruta 1

Se suspendieron 100g de hojas secas de Passiflora alata en 1000 ml de agua desionizada. Seguidamente, los flavonoides fueron extrafdos durante 2 horas en un matraz de reaccion bajo agitacion constante a 3 temperatures diferentes: 60, 70 y 80° C.

5 El extracto fue filtrado en un embudo de Buchner al vado descartando el resto de las hojas retenidas y completando el volumen del filtrado nuevamente a 1000 ml (para cada una de las diferentes temperatures de extraccion). A partir de este volumen, se dejo 500 ml de extracto a reposar durante la noche en una camara fna a 5° C. Despues de 24 horas, el extracto se centrifugo a 5° C y 4100 rpm durante 21 minutos, obteniendose asf dos fracciones: precipitado y sobrenadante. El precipitado se suspendio en etanol, se filtro en un papel de filtro comun y el volumen de etanol se 10 completo a 80 ml.

b) Ruta 2

El volumen de los otros 500 ml de extracto separados en la ruta (1) anterior se precipito con etanol dos veces, despues del enfriamiento a la temperatura ambiente anterior. A continuacion, el extracto se centrifugo a 20° C y 4100 rpm durante 21 minutos, obteniendose dos fracciones: precipitado y sobrenadante. El precipitado se suspendio en 15 etanol, se filtro con un papel de filtro comun y el volumen de etanol se completo a 80 ml.

Dosificacion de la concentracion de flavonoides

La concentracion de los flavonoides contenidos en los extractos obtenidos por las rutas 1 y 2 se determino segun Rolim et al, 2005, y el flavonoide rutina se utilizo como estandar. La concentracion se puede ver en la Figura 3, donde se expresa en pg/ml.

20 La Figura 3 muestra (de izquierda a derecha) el precipitado de la Ruta 1 en suspension en etanol a 60° C (R1-60), el precipitado de la Ruta 1 a 70° C (R1-70), el precipitado de la Ruta 1 a 80° C (R1-80), el precipitado de la Ruta 2 a 60° C (R2-60), el precipitado de la Ruta 2 a 70° C (R2-70) y el precipitado de la Ruta 2 a 80° C (R2-80). Para seguir las concentraciones exactas de los extractos, los resultados de la Figura 3 tambien se presentan en la tabla a continuacion: Tabla 1 - Absorbancias y concentraciones respectivas de flavonoides de los diferentes extractos de P. 25 alata

Muestra

Absorcion (391nm) □pg/ml

R1-60

0,1908 10,10

R1-70

0,5093 26,78

R1-80

0,8166 42,87

R2-60

0,3397 17,90

R2-70

0,2791 14,73

R2-80

0,6023 31,65

A traves de los datos presentados en la Figura 3, es posible seguir el perfil de concentracion de los flavonoides de todos los precipitados suspendidos en etanol obtenidos a traves de las rutas 1 y 2 a las tres temperaturas adoptadas en los procedimientos (60, 70 y 80° C) y se concluye que la temperatura de extraccion de 80° C fue la mas eficaz.

Comparando la Ruta 1 (acuosa) y 2 (con precipitacion etanolica), se concluye que la Ruta 1 es mas eficaz, lo que 30 demuestra que el procedimiento se optimiza en la extraccion acuosa con posterior suspension en etanol. El precipitado suspendido de la Ruta 1 a 80° C logra una concentracion superior a 40 pg/ml.

Ejemplo 4 - Evaluacion de la fototoxicidad y la citotoxicidad in vitro

El objetivo de este experimento fue determinar el efecto citotoxico y fototoxico de las muestras de extractos de Passiflora alata segun la presente invencion utilizando metodologfas establecidas por el Instituto Nacional de Salud 35 (NIH) de los Estados Unidos de America, que son internacionalmente validas.

Definiciones:

Citotoxicidad: el ensayo permite determinar la concentracion citotoxica de un componente activo, cuando las celulas 3T3 se incuban con el durante 24 horas. La toxicidad se determina en funcion de la viabilidad celular, monitorizada por la incubacion de las celulas 3T3 con rojo neutro, un colorante vital que es incorporado por las celulas vivas 40 despues de 24 horas de contacto con el componente activo (Guidance Document on using In Vitro Data to Estimate In Vivo Starting Doses for Acute Toxicity. Publicacion del NIH 01 a 4.500 (2.001)).

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Fototoxicidad: La base de la prueba es comparar la toxicidad de un componente activo en presencia y ausencia de una dosis no citotoxica de radiacion UVA. La fototoxicidad es medida por la captacion de rojo neutro por las celulas que sobreviven a la incubacion con el componente activo, segun el protocolo de Borenfreund y Puerner(1985), que ya ha sido establecido y estandarizado por el NIH ("ZEBET/ECVAM/COLIPA Standar Operating Procedure. In vitro 3T3 Phototoxicity Test. 26 Ap, 1998 "). La fototoxicidad/fotoirritacion se define como una respuesta toxica causada despues de la primera exposicion de la piel a ciertos productos/componentes activos con una posterior exposicion a la luz solar o que es inducida por irradiacion de la piel despues de la administracion sistemica de un componente/producto activo ("Spielmann H, Liebsch M, Doring B, Moldenhauer F. First results of an EC/COLIPA validation project of in vitro phototoxicity testing methods. ALTEX. 1994; 11 (1):22-31").

Materiales:

Celulas 3T3 (lmea celular de fibroblastos de ratones Balb/C de la piel del raton).

Reactivos:

Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), suero bovino fetal (FBS), rojo neutro (Sigma-Aldrich), dimetilsulfoxido (DMSO), etanol, acido acetico y PBS (solucion salina de tampon de fosfato).

Metodos:

Analisis de solubilidad y definicion de las concentraciones del experimento: la solubilidad de las muestras se evalua segun ensayos internacionalmente estandarizados por el NIH. Con el fin de proporcionar una mejor solubilizacion de las muestras en soluciones acuosas, tales como DMEM (en el ensayo de citotoxicidad) o PBS (en el ensayo de fototoxicidad), se permite el uso de una concentracion maxima de 1% de DMSO o etanol. Las concentraciones utilizadas en los ensayos de citotoxicidad y fototoxicidad vanan segun los resultados de los ensayos de solubilidad de la muestra. La concentracion maxima ensayada no debena ser mayor de 3 mg/ml.

Citotoxicidad: las celulas 3T3 se siembran en una placa esteril de 96 pocillos, a una densidad de 1x104 celulas/pocillo. Despues de 24 horas, las celulas se incuban durante 24 horas con las muestras diluidas en un medio de cultivo con 5% SFB. Despues, se incuban con rojo neutro durante 3 horas. El exceso de colorante se lava con PBS y los cristales formados se disuelven con etanol: acido acetico: agua (50: 1: 49). La lectura de la absorbancia se realiza a 540 nm y, a partir de los resultados obtenidos, se calcula la concentracion a la que 50% de las celulas son viables (CI50). Por lo tanto, cuanto mayor sea el valor de CI50, mas bajo es el potencial citotoxico de la muestra, y viceversa.

Fototoxicidad: las celulas 3T3 se siembran en una placa esteril de 96 pocillos, a una densidad de 1x104 celulas/pocillo. Se preparan dos placas identicas pero una de ellas se irradia con rayos UVA y la otra se mantiene en la oscuridad, como control. Despues de 24 horas de la siembra, las celulas se incuban durante 1 hora en la oscuridad con las muestras diluidas con PBS. Despues de eso, una de ellas es irradiada con 5 Joules/cm2 de luz UVA durante 50 minutos. Las placas se lavan con PBS y reciben un medio de cultivo con suero bovino fetal al 10% para el penodo de recuperacion que dura aproximadamente 12 horas. En el segundo dfa del experimento, las celulas se incuban con una solucion de rojo neutro durante 3 horas. El exceso de colorante se lava con PBS y los cristales formados se disuelven con etanol: acido acetico: agua (50: 1: 49). La lectura de la absorbancia se realiza a 540 nm y, a partir de los resultados obtenidos, se calcula en cada placa la concentracion a la que 50% de las celulas son viables (Cl50). La relacion entre los dos valores es el Factor de Fotoirritacion (PIF), que clasifica la muestra como fototoxica o no.

Calculo del PIF:

PIF = ICfin (-U)

CI50 (+UV)

Cuando el PIF es mayor que o igual a 5, la muestra es fototoxica.

Si no es posible obtener el valor de Cl50 hasta la concentracion maxima ensayada en ausencia de UV, mientras que en la presencia de UV habfa sido posible observar la accion fototoxica y calcular Cl50, >PIF se calcula dividiendo la concentracion maxima ensayada por el IC50 de la curva de fototoxicidad con UV:

>PIF = Cmax (-UV)

Clso (+UV)

Cuando >PIF es mayor que 1, la muestra es fototoxica.

Ejemplo 4.1

Las siguientes muestras de extracto de Passiflora alata segun la presente invencion han sido analizadas en cuanto a la citotoxicidad:

Passiflora A = 16,54% de flavonoides; 11,02% de vitexin-2-o-r

5 Passiflora B = 11,49% de flavonoides; 0,39% de vitexin-2-o-r

En primer lugar, se preparo una solucion madre de la muestra en PBS a 30 mg/ml que contema 10% de DMSO. En el caso de la citotoxicidad, la solucion madre se diluyo 10 veces en DMEM que contema 5% de SFB, obteniendose la concentracion maxima utilizada de 3 mg/ml que contema 1% de DMSO. Las otras diluciones ensayadas para la citotoxicidad tambien se habfan preparado con DMEM que contema 5% de SFB.

10 Los datos relacionados con el ensayo de citotoxicidad para las muestras descritas en la presente solicitud se han utilizado para la construccion de los graficos de las Figuras 4 y 5.

Las muestras ensayadas y sus respectivos potenciales citotoxicos in vitro se indican en la Tabla 2. La muestra 550 fue considerada citotoxica in vitro por encima de 0,2 mg/ml.

Tabla 2: Datos obtenidos en el ensayo de citotoxicidad

Muestras

Record CI50 (mg/ml)

Extracto de Passiflora

A NA

Extracto de Passiflora

B 2,0

15 Ejemplo 4.2

Las siguientes muestras de extracto de Passiflora alata segun la presente invencion han sido analizadas en cuanto a la fototoxicidad:

Passiflora A = 16,54% de flavonoides; 11,02% vitexin-2-o-r Passiflora B = 11,49% de flavonoides; 0,39% vitexin-2-o-r

20 En primer lugar, se preparo una solucion madre de la muestra en PBS a 30 mg/ml que contema 10% de DMSO. En el caso de la fototoxicidad, la solucion madre se diluyo 10 veces en PBS para obtener la concentracion maxima utilizada de 3 mg/ml que contema 1% de DMSO. Las otras diluciones ensayadas para la fototoxicidad tambien se habfan preparado con PBS. Las muestras se filtraron en membranas de 0,22 pm.

Los datos relacionados con el ensayo de fototoxicidad para las muestras descritas en la presente solicitud se han 25 utilizado para la construccion de los graficos de las Figuras 6 y 7.

Las muestras ensayadas y sus respectivos potenciales fototoxicos in vitro se indican en la Tabla 3. Las muestras A y B se consideraron no fototoxicas in vitro.

Tabla 3: Datos obtenidos en el ensayo de fototoxicidad

Muestras

Record PIF

Extracto de Passiflora

A NA

Extracto de Passiflora

B NA

Ejemplo 5 - Evaluacion del potencial mutagenico mediante el ensayo de mutacion inversa en Salmonella 30 typhimurium (prueba de Ames)

La prueba de AMES (Maron y Ames, 1983; Directrices de la OCDE, 1997) tiene como objetivo evaluar el potencial de ciertos productos qmmicos para inducir mutaciones en el genoma de cepas de Salmonella typhimurium a traves de la mutacion inversa de his- a his+, con y sin un sistema de activacion metabolica. En este estudio, se observo que los extractos de Passiflora alata no tienen potencial de actividad mutagenica en cepas de Salmonella typhimurium.

35 Ejemplo 5.1

Se han utilizado las siguientes muestras de extracto de Passiflora alata segun la presente invencion:

Muestra C (contenido de flavonoides totales 16,46% y contenido de vitexin-2-o-r 11,87%)

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Muestra F (contenido de flavonoides totales 16,10% y contenido de vitexin-2-o-r 9,67%)

Materiales: Cepas TA97a, TA98, TA100, TA102 y TA1535 y TA1537

Reactivos: azida de sodio, 2-nitrofluoreno; 9-aminoacridina, hidroperoxido de cumeno, 2-aminoantraceno, medio mmimamente glicosilado, agar superior, fraccion S9 (Molecular Toxicology Incorporated, Estados Unidos de America), agua desionizada, 4 nitroquinolema-1-6xido, mitomicina C

Realizacion de la prueba

Se anadieron 0,1 ml de cultivo de bacterias cultivado durante la noche y 0,1 ml de las muestras analizadas a cada tubo que contema 3 ml de agar superior previamente acondicionado en caldo seco a 45° C. En las pruebas con activacion metabolica, se anadio 0,5 ml/placa de la fraccion S9 que tiene una concentracion de protemas de 39,7 mg/ml.

Antes de la prueba, se evaluaron los genotipos de las cepas con el objetivo de garantizar las caractensticas geneticas originales de las bacterias. Por medio de medio de crecimiento selectivo, se analizo la dependencia de las cepas de histidina y biotina. Se detecto la presencia de la delecion uvrB por la sensibilidad a la luz ultravioleta irradiada a las placas. Se detecto la mutacion rfa, que aumenta la permeabilidad de la pared bacteriana a la entrada de las sustancias a ensayar, por medio de la sensibilidad al violeta cristal. En la prueba de la resistencia a la ampicilina, se observo la presencia de plasmido pKM101, actuando a nivel de la reparacion del ADN, aumentando la mutagenicidad qmmica y espontanea. Se verifico la presencia del plasmido pAQ1 porque imparte resistencia a la tetraciclina. Se comparo el numero de colonias revertidas espontaneas por placa en cada cepa a la tasa aceptable descrita en la bibliograffa por Maron y Ames (1983).

Controles positivos y negativos se han incluido en todos los ensayos. Como control negativo, se utilizo el disolvente seleccionado para la solubilizacion de las muestras (100 pl/placa de agua desionizada) con el fin de obtener el numero de colonias revertidas espontaneas por placa para posterior comparacion con el numero de revertidas observado en presencia de las muestras. Como controles positivos, se utilizaron sustancias mutagenicas conocidas a fin de garantizar la capacidad de respuesta de cada cepa al mutageno y la eficacia del sistema de activacion metabolica (azida de sodio, 4-nitroquinolina-1-oxido, 9-amidoacridina, mitomicina C, 2-aminoantraceno, 2- nitrofluoreno, hidroperoxido de cumeno).

Se realizo un ensayo preliminar con la cepa TA100 para determinar el intervalo mas adecuado de concentracion de la muestra para la prueba definitiva utilizando concentraciones de 8; 40; 200; 1000 y 5000 pg/placa. Las concentraciones utilizadas en esta prueba no han presentado toxicidad para el crecimiento de Salmonella typhimurion. Por lo tanto, las concentraciones de la prueba definitiva han variado de 0,001 a 5 mg/placa. Todas las concentraciones se analizaron por triplicado en ausencia y presencia de activacion metabolica. Los controles negativos y positivos se realizaron por triplicado.

Los resultados se expresaron como el numero de colonias revertidas por placa y por la relacion de mutagenicidad (MR), correspondiente a la relacion entre el numero de colonias revertidas en las placas de ensayo y el numero de colonias revertidas en las placas de control negativo. El numero de colonias revertidas espontaneas en cada cepa se comparo con la tasa normal aceptable que se describe en la bibliograffa (Maron y Ames, 1983).

Un resultado se considera positivo cuando el promedio de colonias revertidas en las placas de prueba es mayor o igual al doble del observado en las placas de control negativo (MR>2) para las cepas TA97a, TA98, TA 100 y TA 102. Para las cepas TA1535 y TA1537, MR debe ser mayor que o igual al triple.

Los controles positivos han presentado una relacion de mutagenicidad de entre 5 y 152, mostrando que son adecuados y validando el experimento. No se observo ningun aumento significativo en el numero de colonias revertidas en las cepas probadas despues del tratamiento con las muestras C y F en cualquiera de las concentraciones probadas en presencia y ausencia de activacion metabolica. Las muestras C y F mostraron una relacion de mutagenicidad de menos de 2.

Ejemplo 6 - Evaluacion del potencial de irritacion y sensibilizacion de la piel in vivo

El extracto de Passiflora alata fue sometido a una prueba in vivo de seguridad, segun Fisher, 1995:

Muestra C - (contenido de flavonoides totales 16,46% y contenido de vitexin-2-o-r 11,87%) a 25% y 50% de una solucion acuosa.

El extracto se sometio a una evaluacion de la irritacion primaria e irritacion acumulada y sensibilizacion a un parche. La prueba de irritacion primaria se evalua con la eliminacion del parche de prueba despues de 48 horas de aplicacion, realizando las lecturas 30 minutos y 24 horas despues de su retirada. La prueba de irritacion acumulada y la prueba de sensibilizacion, por otro lado, requieren la aplicacion de un parche de prueba en una base diaria durante un penodo de 14 dfas, seguido por un penodo de descanso de 14 dfas y la reaplicacion posterior del parche

5

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15

20

25

30

35

40

de prueba durante 48 horas, en una zona que no se habfa utilizado previamente para la evaluacion de la irritacion primaria.

El estudio fue un ensayo clmico aleatorizado, mono ciego, controlado. Cincuenta y seis voluntarios completaron el estudio y no se detectaron reacciones adversas (eritema, edema, papulas o vesfculas) en las areas de la aplicacion de la muestra.

Ejemplo 7 - Evaluacion del potencial antiinflamatorio en fibroblastos humanos in vitro

El objetivo de este ensayo fue evaluar el potencial antiinflamatorio de los extractos in vitro, utilizando cultivos de fibroblastos dermicos humanos. La significacion estadfstica (p < 0,05) de los datos se verifico mediante el analisis de varianza (ANOVA de un factor) seguido de una comparacion multiple de Tukey utilizando el software SYSTAT 10.

Ejemplo 7.1

Se han utilizado las siguientes muestras de extracto de Passiflora alata segun la presente invencion:

Muestra A (contenido de flavonoides totales 16,54% y contenido de vitexin-2-o-r 11,02%)

Muestra B (contenido de flavonoides totales 11,49% y contenido de vitexin-2-o-r 0,39%)

Los fibroblastos humanos derivados de la dermis se incubaron con lipopolisacarido (LPS) de Escherichia coli para inducir la secrecion de citoquinas proinflamatorias IL-6 e IL-8 (interleuquina 6 y 8). El potencial antiinflamatorio de la muestra fue identificado por la reduccion en la secrecion de los marcadores pro-inflamatorios.

Materiales utilizados: dermis derivada de fibroblastos humanos, mantenida en cultivo hasta el decimo paso como maximo. Placas esteriles de cultivo con 96 pocillos, placas no esteriles con 96 pocillos, tubos conicos de 15 ml y 50 ml.

Reactivos: medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), suero bovino fetal (FBS), rojo neutro, dimetilsulfoxido (DMSO), tampon de desarrollo (etanol: acido acetico: agua, 50: 1: 49), PBS (tampon de fosfato en solucion salina), tampon de Lavado (PBS que contiene 0,05% de Tween-20), tampon de sensibilizacion (carbonato de sodio 0,1 M), tampon de bloqueo (PBS que contiene 5% de albumina de suero bovino), lipopolisacarido bacteriano (LPS), dexametasona, hidrocortisona, kits para la dosificacion de IL-6 e IL-8 por ELISA (R & D Systems), kit de desarrollo de sustrato TMB (BD Pharmingen®) y solucion de parada (acido sulfurico 2 N).

Preparacion del cultivo celular

Se prepararon placas de 96 pocillos con 2x104 celulas/pocillo en 100 pl de DMEM que contema 10% SFB. Las celulas se incubaron durante la noche en un horno de CO2. El medio de cultivo se desecho y los pocillos se lavaron con 200 |jl de PBS.

Estimulacion celular con LPS

Se anadieron 100 pl de DMEM que contema 1% SFB y los estfmulos adecuados. La incubacion se realizo en un horno de CO2 durante la noche. Los tratamientos fueron:

- Control (solo DMEM que contema 1% SFB);

-LPS 10 ng/ml;

- Dexametasona 5 pM;

- LPS 10 ng/ml + dexametasona 5 pM;

- Extracto A 0,1 mg/ml;

- LPS 10 ng/ml + extracto A 0,1 mg/ml;

- Extracto A 1 mg/ml;

- LPS 10 ng/ml + extracto A 1 mg/ml;

- Extracto B 0,1 mg/ml;

- LPS 10 ng/ml + Extracto B 0,1 mg/ml;

- Extracto B 1 mg/ml;

- LPS 10 ng/ml + Extracto B 1 mg/ml;

5

10

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25

30

35

Recogida de sobrenadante y analisis de la viabilidad celular

Despues de la estimulacion, se recogieron los sobrenadantes, se almacenaron a -20° C y se analizaron por ELISA (descrito a continuacion). A fin de mantener la viabilidad celular despues de la estimulacion, las celulas se incubaron con una solucion de rojo neutro durante 3 horas y despues de lavar con 200 pl de PBS, se anadieron 200 pl de solucion de desarrollo, y la lectura se realizo a 540 nm. En todos los tratamientos, la viabilidad celular minima debena ser mayor que o igual a 80% de la viabilidad de control. Los datos de viabilidad celular tambien se utilizaron mas tarde para la normalizacion de los datos obtenidos por ELISA.

ELISA (ensayo por inmunoadsorcion ligado a enzimas)

Para el ensayo ELISA, se usaron placas de 96 pocillos. La cuantificacion de marcadores proinflamatorios se determino a partir de la comparacion con las curvas estandar construidas espedficamente para IL-6 o IL-8. Se utilizaron sobrenadantes de cultivo segun los siguientes pasos:

- Adicion del anticuerpo de captura diluido en PBS (1: 180, 100 pl/pocillo);

- Incubacion durante la noche a temperatura ambiente;

- Lavado de placas 3 veces con tampon de lavado (200 pl/pocillo);

- Bloqueo de los sitios libres en la placa con un tampon de bloqueo (200 pl/pocillo);

- Incubacion durante 1 hora a temperatura ambiente;

- Lavado de placas 3 veces con tampon de lavado (200 pl/pocillo);

- Preparacion de las diluciones del patron y muestras con el tampon de bloqueo (1:200);

- Adicion de las diluciones del patron, las muestras y el control (100 pl/pocillo);

- Incubacion durante 2 horas a temperatura ambiente;

- Lavado de placas 3 veces con tampon de lavado (200 pl/pocillo);

- Adicion de anticuerpo de deteccion diluido en un tampon de bloqueo (1: 180 cada uno, 100 pl/pocillo);

- Incubacion durante 2 horas a temperatura ambiente;

- Lavado de placas 3 veces con tampon de lavado (200 pl/pocillo);

-Adicion del conjugado de estreptoavidina-peroxidasa diluido en un tampon de bloqueo (1: 200, 100 pl/pocillo);

- Incubacion durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad;

- Lavado de placas 3 veces con tampon de lavado (200 pl/pocillo);

- Adicion de la solucion de sustrato (100 pl/pocillo);

- Incubacion de la placa durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad;

- Adicion de la solucion de parada (50 pl/pocillo);

- Lectura de la absorbancia a 450 nm.

Con los resultados obtenidos, se prepararon las Tablas 2 y 3 con los valores de inhibicion de la secrecion de IL-6 e IL-8, respectivamente. La columna de referencia indica la muestra cuyos datos se utilizaron como base para el calculo de los porcentajes de inhibicion de las otras muestras. Los datos tambien se representan en los graficos de las Figuras 8 y 9, respectivamente.

Tabla 2. Tasa de inhibicion de la secrecion de IL-6.

Tratamiento

% de inhibicion Referencia

Dexametasona

71

Extracto A 0,1 mg/ml

15

Extracto A 1 mg/ml

73 Control

Extracto B 0,1 mg/ml

19

Extracto B 1 mg/ml

44

5

10

15

20

25

Tratamiento

% de inhibicion Referencia

Dexametasona + LPS

96

Extracto A 0,1 mg/ml + LPS

68

Extracto B 1 mg/ml + LPS

96 LPS

Extracto B 0,1 mg/ml + LPS

69

Extracto B 1 mg/ml + LPS

85

Tabla 3. Tasa de inhibicion de la secrecion de IL-8.

Tratamiento

% de inhibicion Referencia

Dexametasona

68 Control

Extracto A 0,1 mg/ml

34

Extracto A 1 mg/ml

85

Extracto B 0,1 mg/ml

55

Extracto B 1 mg/ml

67

Dexametasona + LPS

53 LPS

Extracto A 0,1 mg/ml + LPS

24

Extracto B 1 mg/ml + LPS

78

Extracto B 0,1 mg/ml + LPS

32

Extracto B 1 mg/ml + LPS

51

Segun los datos analizados, las muestras A y B indican una actividad antiinflamatoria potencial, con una reduccion en la secrecion de IL-6 e IL-8 en fibroblastos humanos in vitro (p <0,05). Ambos extractos tienen un efecto similar a la dexametasona utilizada en el modelo. En general, los extractos utilizados en la concentracion de 1 mg/ml mostraron una tasa de inhibicion muy similar o mayor que la encontrada para la dexametasona a 5 pM. Ademas, este efecto antiinflamatorio tambien se observo en la presencia de LPS, un agente conocido para inducir la respuesta inflamatoria (p < 0,05).

Ejemplo 7.2

Se han utilizado las siguientes muestras de extracto de Passiflora alata segun la presente invencion:

Muestra A (contenido de flavonoides totales 16,54% y contenido de vitexin-2-o-r 11,02%)

Fraccion purificada de vitexin-2-O-ramnosido (Fr13-23)

Fibroblastos humanos derivados de la dermis se incubaron con lipopolisacarido (LPS) o UV para inducir la secrecion de marcadores proinflamatorios IL-6 e IL-8. El potencial antiinflamatorio de la muestra fue identificado por la reduccion en la secrecion de los marcadores proinflamatorios.

Materiales utilizados: fibroblastos humanos derivados de la dermis, mantenidos en cultivo hasta el decimo paso como maximo. Placas esteriles de cultivo con 96 pocillos, placas no esteriles con 96 pocillos, tubos conicos de 15 ml y 50 ml, camara de irradiacion con luz UVB.

Reactivos: se utilizaron los mismos reactivos indicados para el Ejemplo 7.1.

Preparacion del cultivo celular

Se prepararon placas de 96 pocillos con 2x104 celulas/pocillo en 100 pl de DMEM que contema 10% de SFB. Las celulas se incubaron durante la noche en un horno de CO2. El medio de cultivo se desecho y los pocillos se lavaron con 200 |jl de PBS.

Estimulacion celular con LPS

Se anadieron 100 pl de DMEM que contema 1% SFB y los estfmulos adecuados. La incubacion se llevo a cabo en un horno de CO2 durante la noche. Los tratamientos fueron:

- Control (solo DMEM que contema 1% SFB);

5

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40

- LPS 10 ng/ml;

- LPS 10 ng/ml + dexametasona 5 pM;

- LPS 10 ng/ml + Muestra A 1 mg/ml;

- LPS 10 ng/ml + Muestra A 0,5 mg/ml;

- LPS 10 ng/ml + Muestra A 0,25 mg/ml;

- LPS 10 ng/ml + Muestra A 0,125 mg/ml;

- LPS 10 ng/ml + muestra Fr13-23 1 mg/ml;

- LPS 10 ng/ml + muestra Fr13-23 0,5 mg/ml;

- LPS 10 ng/ml + muestra Fr13-23 0,25 mg/ml;

- LPS 10 ng/ml + muestra Fr13-23 0,125 mg/ml.

Estimulacion celular con UVB

Se anadieron 100 pl de PBS y los estfmulos adecuados. La incubacion se llevo a cabo en un horno de CO2 durante 50 minutos. Los tratamientos fueron:

- Control (solo PBS en celulas que no fueron irradiadas);

- UVB 0,23 J/cm2 (solo PBS con irradiacion despues de la incubacion);

- UVB 0,23 J/cm2 + hidrocortisona 5 pM;

- UVB 0,23 J/cm2 + Muestra A 1 mg/ml;

- UVB 0,23 J/cm2 + Muestra A 0,5 mg/ml;

- UVB 0,23 J/cm2 + Muestra A 0,25 mg/ml;

- UVB 0,23 J/cm2 + Muestra A 0,125 mg/ml;

- UVB 0,23 J/cm2 + muestra Fr13-23 1 mg/ml;

- UVB 0,23 J/cm2 + muestra Fr13-23 0,5 mg/ml;

- UVB 0,23 J/cm2 + muestra Fr13-23 0,25 mg/ml;

- UVB 0,23 J/cm2 + muestra Fr13-23 0,125 mg/ml.

Despues del penodo de irradiacion celular (a excepcion de control), los volumenes de los pocillos fueron desechados y reemplazados con el mismo tratamiento preparado en 100 pl de DMEM que contema 1% de SFB y los estfmulos adecuados. Despues, se produjo la incubacion con CO2 durante la noche.

Recogida del sobrenadante y analisis de la viabilidad celular

Despues de la estimulacion, se recogieron los sobrenadantes, se almacenaron a -20° C y se evaluaron por ELISA (descrito a continuacion). A fin de mantener la viabilidad celular despues de la estimulacion, las celulas se incubaron con una solucion de rojo neutro durante 3 horas y, despues de lavar con 200 pl de PBS, se anadieron 200 pl de solucion de desarrollo, y la lectura se realizo a 540 nm. En todos los tratamientos, la viabilidad celular minima debena ser mayor que o igual al 80% de la viabilidad del control. Los datos de viabilidad celular tambien se utilizaron mas tarde para la normalizacion de los datos obtenidos por ELISA.

ELISA (ensayo por inmunoadsorcion ligado a enzimas)

Para el ensayo de ELISA, se usaron placas de 96 pocillos. La cuantificacion de los marcadores proinflamatorios se determino a partir de la comparacion con las curvas estandar construidas espedficamente para IL-6 o IL-8. Se utilizaron sobrenadantes de cultivo segun los siguientes pasos:

- Adicion del anticuerpo de captura diluido en un tampon de sensibilizacion (1: 250, 100 pl/pocillo);

- Durante la noche incubacion a 4° C;

- Lavado de placas 3 veces con tampon de lavado (200 pl/pocillo);

- Bloqueo de los sitios libres en la placa con un tampon de bloqueo (200 |jl/pocillo);

- Incubacion durante 1 hora a temperatura ambiente;

- Lavado de placas 3 veces con tampon de lavado (200 jl/pocillo);

- Preparacion de las diluciones del patron y muestras con el tampon de bloqueo (1:200);

5 - Adicion de las diluciones del patron, las muestras y el control (100 jl/pocillo);

- Incubacion durante 2 horas a temperatura ambiente;

- Lavado de placas 5 veces con tampon de lavado (200 jl/pocillo);

- Adicion de anticuerpo de deteccion y del conjugado de estreptoavidina-peroxidasa diluido en un tampon de bloqueo (1: 250 cada uno, 100 jl/pocillo);

10 - Incubacion durante 1 hora a temperatura ambiente;

- Lavado de placas 7 veces con tampon de lavado (200 jl/pocillo);

- Adicion de la solucion de sustrato (100 jl/pocillo);

- Incubacion de la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad;

- Adicion de la solucion de parada (50 jl/pocillo);

15 - Lectura de la absorbancia a 450 nm.

De los resultados obtenidos, se prepararon las Tablas 4 y 5 con los valores de inhibicion de la secrecion de IL-6 e IL- 8, respectivamente, asf como los graficos de las Figuras 10 y 11 para el estimulo con LPS, y 12 y 13 para el estfmulo con UVB. La columna de referencia indica la muestra cuyos datos se utilizaron como base para el calculo de los porcentajes de inhibicion para las otras muestras.

20 Tabla 4. Tasa de inhibicion de la secrecion de IL-6.

Tratamiento

% de inhibicion Referencia

LPS + Dexametasona

94 LPS

LPS + Muestra A 1 mg/ml

91

LPS + Muestra A 0,5 mg/ml

75

LPS + Muestra A 0,25 mg/ml

62

LPS + Muestra A 0,125 mg/ml

38

LPS + Muestra Fr13-23 0,125 mg/ml

84

UVB + Hidrocortisona

71 UVB

UVB + Muestra A 1 mg/ml

85

UVB + Muestra A 0,5 mg/ml

90

UVB + Muestra A 0,25 mg/ml

91

UVB + Muestra A 0,125 mg/ml

84

UVB + Muestra Fr13-23 0,125 mg/ml

80

Tabla 5. Tasa de inhibicion de la secrecion de IL-8.

Tratamiento

% de inhibicion Referencia

LPS + Dexametasona

82 LPS

LPS + Muestra A 1 mg/ml

90

LPS + Muestra A 0,5 mg/ml

71

LPS + Muestra A 0,25 mg/ml

57

LPS + Muestra A 0,125 mg/ml

28

LPS + Muestra Fr13-23 0,125 mg/ml

65

5

10

15

20

25

30

35

40

Tratamiento

% de inhibicion Referencia

UVB + Hidrocortisona

79 UVB

UVB + Muestra A 1 mg/ml

86

UVB + Muestra A 0,5 mg/ml

88

UVB + Muestra A 0,25 mg/ml

86

UVB + Muestra A 0,125 mg/ml

74

UVB + Muestra Fr13-23 0,125 mg/ml

57

Segun los datos analizados, las muestras A y Fr13-23 indican una actividad antiinflamatoria potencial, con una reduccion en la secrecion de IL-6 e IL-8 en fibroblastos humanos in vitro (p <0,05).

La muestra A mostro actividad antiinflamatoria en los 2 modelos (estimulacion con LPS y UVB), en todas las concentraciones ensayadas (p <0,05).

La muestra Fr13-23 no fue citotoxica en fibroblastos humanos a la concentracion de 0,125 mg/ml. Esto es probablemente debido al hecho de que esta muestra tiene una alta concentracion de vitexin-2-O-ramnosido. A esta concentracion y en los 2 modelos (estimulacion con LPS y UVB), la muestra mostro actividad antiinflamatoria considerable.

Ejemplo 8 - Evaluacion de la expresion de moleculas de adhesion ICAM-1 in vitro.

Se sabe que durante el procedimiento inflamatorio, la liberacion de TNF-a por los macrofagos y fibroblastos tiene un papel importante en la senalizacion entre leucocitos y celulas endoteliales. La respuesta celular a la lesion comprende la adhesion de los leucocitos al endotelio de las venulas post-capilares, seguido por la migracion de las celulas adherentes a la parte exterior del vaso, su desplazamiento al lugar extravascular y la acumulacion subsiguiente sobre la lesion, mecanismos que se han descrito como una secuencia de complejas interacciones y senalizaciones entre leucocitos y celulas endoteliales. El aumento en la expresion de moleculas de adhesion, tales como ICAM-1, V-CAM y E-selectina es un prerrequisito para una adhesion leucocito-endotelio estable y necesariamente precede a la extravasacion de leucocitos (Quinlan et al., 1999; Fuchs et al., 2001). Por lo tanto, su evaluacion puede utilizarse como un modelo experimental in vitro para la evaluacion pro- o anti-inflamatoria de nuevas moleculas.

Ejemplo 8.1

Se utilizo la siguiente muestra de extracto de Passiflora alata segun la presente invencion:

Muestra A (contenido de flavonoides totales 16,54% y contenido de vitexin-2-o-r 11,02%)

Celulas endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) se incubaron con TNF-a para inducir la expresion de ICAM-1, responsable de la infiltracion de celulas en el proceso antiinflamatorio. El potencial antiinflamatorio de la muestra se identifico por la reduccion en la expresion de esta molecula.

Materiales: celulas endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) con un numero total de pasajes de 6

Reactivos: medio de cultivo M199; suero bovino fetal; tripsina (Gibco). TNF-a humano (Peprotech Mexico, SA), anticuerpos anti-ICAM-1 humanos (BD Biosciences Pharmingen); solucion salina tamponada con fosfato, (PBS), albumina de suero bovino.

Preparacion del cultivo celular

Placas de 24 pocillos se prepararon con 5x104 celulas/pocillo en un medio de cultivo M199 y suero bovino fetal al 10%. Las celulas se incubaron en un horno de CO2 durante 24 horas. Despues de este penodo, las celulas se trataron con diferentes concentraciones de la muestra A con 12 horas de incubacion. A continuacion, las celulas se expusieron a 10 ng/ml de TNF-a durante un penodo de 6 horas para estimular la expresion de ICAM-1, este tiempo representa el pico de la expresion de moleculas en las celulas endoteliales mantenidas en cultivo, como se describe por Perfetto et al. (2003) y Jiang et al. (2004). Ademas, la concentracion de 10 ng/ml de TNF-a habfa sido determinada como capaz de inducir la expresion de moleculas de adhesion, sin interferir en la viabilidad celular (Piela-Smith et al., 1992).

Despues de la incubacion con TNF-a, las celulas fueron desplazadas de la placa con tripsina, se lavaron en medio de cultivo con SFB para eliminar la tripsina contenida en el medio, se centrifugaron durante 8 minutos a 300 g y se volvieron a suspender en 1 ml de paraformaldehndo al 1% durante 15 minutos para su fijacion. Mas tarde, las celulas se centrifugaron de nuevo para eliminar el paraformaldetndo, se volvieron a suspender en 100 pl de PBS con 1% de albumina de suero bovino (BSA) y se incubaron con 5 pl de anticuerpo anti-ICAM (FITC), durante una hora a la temperatura de 4° C y protegidas de la luz. Despues, las celulas se centrifugaron durante 8 minutos a 300 g y se

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15

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30

volvieron a suspender en PBS para la lectura de las muestras en el citometro de flujo FACS CALIBUR (BD), conectado a un ordenador Apple (Mackintosh) utilizando el software Cell QuestPro®. Se adquirieron diez mil (10,000) eventos. El marcado del anticuerpo isotfpico se utilizo como control negativo para el anticuerpo. Los datos generados por el citometro se analizaron con la ayuda del software, los valores se expresan como un porcentaje de las celulas marcadas por el anticuerpo, lo que indica el porcentaje de celulas que tienen expresion de ICAM-1 en la superficie, y tambien el promedio de la intensidad de fluorescencia de cada muestra, lo que indica cuantitativamente la expresion de moleculas de adhesion antes y despues de los tratamientos con TNF-a y la muestra a las diferentes concentraciones.

Los resultados obtenidos con el tratamiento se expresan en los graficos de las Figuras 14 y 15.

Solo las celulas que se incubaron con la mayor concentracion de muestra (316 g/ml) presentaron un incremento en la expresion de moleculas de adhesion ICAM-1 en relacion con las celulas mantenidas solo en un medio de cultivo; sin embargo, este aumento no mostro una diferencia significativa (p> 0,05). La incubacion con TNF-a causo un aumento significativo (p <0,001) en la expresion de estas moleculas de adhesion. La incubacion de las celulas con una menor concentracion de la muestra (100 pg/ml) fue capaz de inhibir el efecto de TNF-a en la expresion de moleculas de adhesion ICAM-1 en HUVECs parcialmente (aunque significativamente, p <0,001).

Ejemplo 9 - Evaluacion de la accion preventiva y curativa de la irritacion de la piel in vivo

Este estudio tuvo como objetivo evaluar el extracto de Passiflora alata incorporado en una formulacion cosmetica a diferentes concentraciones, en el tratamiento preventivo y curativo de la irritacion de la piel causada por la aplicacion de un insulto qmmico realizado en la region del pliegue nasolabial, utilizando la escala de dolor para la evaluacion subjetiva. Se sabe que la irritacion por insulto qmmico es transitoria, pero se caracteriza por un procedimiento micro inflamatorio con el inicio de las cascadas de senalizacion para el dolor y la irritacion (eritema, enrojecimiento).

Ejemplo 9.1

Se utilizo la siguiente muestra de extracto de Passiflora alata segun la presente invencion:

Muestra C (contenido de flavonoides totales 16,46% y contenido de vitexin-2-o-r 11,87%)

Este extracto se incorporo en una formulacion cosmetica a las concentraciones de 0,25%; 0,4%; 0,75% y 1%. Las formulaciones que conteman el extracto se compararon entre sf, asf como con el placebo (formulacion cosmetica sin el principio activo) y un control positivo (cortisona de uso dermatologico). La formulacion se encuentra en la Tabla 6.

Tabla 6 - formulacion cosmetica

Componente

Concentracion (%)

Agua desmineralizada

88,25

Acrilato de alquilo TR-1

0,20

Eter dicapnlico

2,00

Ciclometicona D5/D6 VS 7158

4,00

EDTA disodica

0,10

Lactato de cetilo

1,00

Estearato de glicerilo

0,20

Stearet-2

2,10

Stearet-21

0,70

Trietanolamina

0,10

Butilcarbamato de yodopropinilo

0,20

BHT

0,05

Fenoxietanol F

0,90

Goma de xantano

0,20

Se marcaron dos rectangulos de 1,0 x 2,0 cm, los llamados sitios, con una pluma quirurgica en las regiones del pliegue nasolabial izquierdo y derecho de los voluntarios de entre 20 y 50 anos de edad (promedio 35 anos) que teman una prueba de pinchazo positivo en la region del pliegue nasolabial. El estudio fue planeado y llevado a cabo

5

10

15

20

25

30

de acuerdo con las determinaciones de la Resolucion 196/96 del Consejo Nacional de Salud, bajo las directrices y normas que regula la investigacion con seres humanos. El protocolo de estudio fue aprobado el 25 de julio de 2006 por el Comite de Etica en Investigacion de la Facultad de Ciencias Medicas de la Universidad Estatal de Campinas, en opinion escrita N° 372/2006. La significacion estadfstica (p <0,05) se comprobo mediante el analisis de varianza (ANOVA de un factor) seguido de una comparacion multiple de Tukey.

Usando un gotero, se aplico una gota de solucion de acido lactico al 10% en cada sitio. Se evaluo la irritacion inmediatamente despues de la aplicacion del acido lactico. A continuacion, se aplicaron los productos al azar. Despues de 5 y 10 minutos de la aplicacion, se evaluo la irritacion producida. Este protocolo fue dirigido a evaluar el efecto curativo.

Para el efecto preventivo, se realizo la aplicacion durante 3 dfas consecutivos dos veces al dfa. En el cuarto dfa, se aplico el producto y despues de 30 minutos se llevo a cabo el insulto qmmico usando una gota de solucion al 10% de acido lactico en cada sitio. Se evaluo la irritacion inmediatamente despues de la aplicacion de acido lactico, despues de 5 minutos y despues de 10 minutos.

Se utilizo una escala de cuantificacion numerica para evaluar la irritacion en funcion de la intensidad del dolor y la gravedad en una escala de 0 (ausencia de dolor e irritacion) a 10 (intenso dolor e irritacion).

Los resultados de los efectos curativo y preventivo del tratamiento se expresan en los graficos de las figuras 16 y 17, respectivamente.

En el efecto curativo, todas las formulaciones cosmeticas que conteman la muestra C mostraron el mismo rendimiento que el corticoide comercial de uso topico (p> 0,05). La formulacion de placebo fue significativamente mas baja que el corticoide y todas las formulaciones que conteman el extracto de prueba (p <0,05). Estos datos muestran que las formulaciones cosmeticas que contienen extractos de Passiflora alata en cualquiera de las concentraciones ensayadas son eficaces para reducir la sensacion de incomodidad (dolor, irritacion y picor). Su accion no difiere significativamente de la presentada por el corticoide de uso topico y es superior a la de la formulacion placebo. Por lo tanto, los principios activos presentes en el extracto de Passiflora alata son responsables de la realizacion observada en estas formulaciones cosmeticas con respecto a la reduccion de la irritacion y el dolor.

En el efecto preventivo, todas las formulaciones cosmeticas que conteman la muestra C mostraron una reduccion en la intensidad del dolor y la irritacion. Estos efectos fueron esencialmente identicos a los observados con el corticoide de uso topico utilizado en el estudio. La formulacion de placebo es significativamente diferente de la de corticoide (p <0,05), lo que confirma que la eficacia en la prevencion del dolor e irritacion de las formulaciones cosmeticas que contienen el extracto de Passiflora alata es debida a la presencia de la muestra C en la misma.

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para preparar un extracto de planta de Passiflora alata, caracterizado porque comprende las etapas de:

   a) someter hojas de plantas de Passiflora alata a una extraccion con agua para obtener un extracto acuoso;

   b) someter el extracto acuoso obtenido en (a) a al menos una elucion con una solucion hidroalcoholica en una columna cromatografica rellena con una resina que consiste en polfmeros de polivinilpirrolidona o poliestireno;

   c) concentrar y secar por pulverizacion el extracto obtenido en (b).
2. 2. El procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado por que entre las etapas b) y c) comprende ademas la etapa de:

   - resuspender el producto obtenido en (b) en etanol caliente y despues enfriar.
3. 3. Una composicion cosmetica que comprende, como un ingrediente activo antiinflamatorio, un extracto de plantas de la especie Passiflora alata, dicho extracto de plantas de Passiflora alata es un extracto obtenido a traves de un procedimiento como se define en la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2.
4. 4. Una composicion cosmetica segun la reivindicacion 3, caracterizada por que es una composicion antienvejecimiento o antiarrugas.
5. 5. Una composicion cosmetica segun la reivindicacion 3 o 4, caracterizada por que el extracto de plantas de Passiflora alata esta presente en una cantidad de 0,25% a 1,0%, en peso, basado en el peso total de la composicion.
6. 6. Una composicion farmaceutica caracterizada por que comprende un extracto de plantas de la especie Passiflora alata, dicho extracto de plantas de Passiflora alata es un extracto obtenido a traves de un procedimiento tal como se define en la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, para uso como un antiinflamatorio.
7. 7. Una composicion farmaceutica para uso como un antiinflamatorio segun la reivindicacion 6, caracterizada por que el extracto de plantas de Passiflora alata esta presente en una cantidad de 0,25% a 1,0%, en peso, basado en el peso total de la composicion.
8. 8. Una composicion farmaceutica para uso como un antiinflamatorio segun la reivindicacion 6 o 7, caracterizada por que es una composicion para uso por administracion topica.
9. 9. Una composicion farmaceutica para uso como un antiinflamatorio segun la reivindicacion 6 o 7, caracterizada por que es una composicion para uso por administracion oral.
10. 10. Un extracto de la planta de Passiflora alata para uso como un agente antiinflamatorio en composiciones cosmeticas o farmaceuticas caracterizado por que dicho extracto de plantas de Passiflora alata se obtiene segun el procedimiento definido en la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2.
11. 11. Un metodo para reducir la aparicion de envejecimiento o reducir las arrugas, que comprende el uso de una composicion cosmetica segun una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.
12. 12. Un extracto de Passiflora alata, que se prepara segun el procedimiento definido en la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2.
13. 13. Un extracto de Passiflora alata segun la reivindicacion 12, para uso como un antiinflamatorio y analgesico.
14. 14. Un extracto de Passiflora alata segun la reivindicacion 12, o para uso como un antiinflamatorio y analgesico segun la reivindicacion 13, para administracion topica u oral.
15. 15. Un extracto de Passiflora alata para uso como un antiinflamatorio y analgesico, para administracion topica u oral.