ES2562817T3 - Composiciones para el suministro dirigido de ARNip - Google Patents

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David L. Lewis
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Abstract

Un sistema de suministro de conjugado para suministrar polinucleótido de ARN interferente a una célula hepática in vivo, que comprende: en donde, P es una poliamina activa en la membrana anfipática; L2 es una unión lábil frente al pH M1 es un agente de enmascaramiento de carga neutra que contiene un derivado de galactosa, M2 es un agente de enmascaramiento de carga neutra que contiene un polietilenglicol, N es un polinucleótido de ARN interferente, A es un trímero de galactosa o un grupo hidrófobo que tiene al menos 20 átomos de carbono, y es un número entero mayor o igual a 1 y z es un número entero mayor o igual a 0, en donde el valor de y y z juntos es mayor que 50% del número de aminas de la poliamina P; la carga positiva de la poliamina P se neutraliza y la actividad en la membrana de la poliamina P es inhibida reversiblemente por unión de M1 y M2 por la unión lábil frente al pH L2, y la escisión de L2 en respuesta a una disminución del pH restablece la actividad en la membrana de la poliamina P; N y A no están, directa o indirectamente, covalentemente unidos a P, L2, M1 o M2.

Description

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DESCRIPCION
Composiciones para el suministro dirigido de ARNip
El suministro de polinucleotidos y otros compuestos sustancialmente impermeables a la membrana celular en una celula viva, esta muy restringido por el complejo sistema de membrana de la celula. Los farmacos usados en terapias de sentido contrario, ARNi y genicas, son polfmeros hidrofilos relativamente grandes y con frecuencia tienen carga negativa alta. Estas dos caractensticas ffsicas impiden su difusion directa a traves de la membrana celular. Por esta razon, la principal barrera para el suministro de polinucleotidos es el suministro de polinucleotidos a traves de una membrana celular al citoplasma o nucleo de la celula.
Un medio que se ha usado para suministrar acido nucleico pequeno in vivo, ha sido unir el acido nucleico a una molecula directora pequena o un lfpido o esterol. Aunque se ha observado algo de suministro y actividad con estos conjugados, la dosis de acido nucleico requerida con estos metodos ha sido prohibitivamente grande.
Se han desarrollado numerosos reactivos de transfeccion que consiguen el suministro razonablemente eficaz de polinucleotidos a las celulas in vitro. Sin embargo, el suministro de polinucleotidos in vivo usando estos mismos reactivos de transfeccion es complicado y se hace ineficaz por la toxicidad in vivo, interacciones con el suero, y poco direccionamiento. Los reactivos de transfeccion que funcionan bien in vitro, polfmeros cationicos y lfpidos, tipicamente forman partfculas electrostaticas grandes y desestabilizan las membranas celulares. La carga positiva de los reactivos de transfeccion in vitro facilita la asociacion con acido nucleico mediante interacciones de carga- carga (electrostaticas) formando asf el complejo de acido nucleico/reactivo de transfeccion. La carga positiva tambien es beneficiosa para la union no espedfica del vehfculo a la celula y para la fusion, desestabilizacion o alteracion de la membrana. La desestabilizacion de las membranas facilita el suministro de los polinucleotidos sustancialmente impermeables a la membrana celular, a traves de una membrana celular. Aunque estas propiedades facilitan la transferencia del acido nucleico in vitro, producen toxicidad y direccionamiento ineficaz in vivo. La carga cationica produce interaccion con componentes del suero, lo que produce desestabilizacion de la interaccion del polinucleotido-reactivo de transfeccion y mala biodisponibilidad y direccionamiento. La actividad en la membrana de reactivos de transfeccion que pueden ser eficaces in vitro, a menudo conduce a toxicidad in vivo.
Para el suministro in vivo, el vehfculo (acido nucleico y agente de suministro asociado) debe ser pequeno, menor de 100 nm de diametro, y preferiblemente menor de 50 nm. Incluso complejos mas pequenos, menores de 20 nm o menores de 10 nm senan todavfa mas utiles. Los vehfculos de suministro mayores de 100 nm tienen muy poco acceso a celulas que no sean celulas de los vasos sangumeos, in vivo. Los complejos formados por interacciones electrostaticas tienden a agregarse o separarse cuando son expuestos a concentraciones salinas fisiologicas o componentes del suero. Ademas, la carga cationica en vehfculos de suministro in vivo conduce a interacciones adversas en el suero y por lo tanto a mala biodisponibilidad. Es interesante que la carga negativa alta tambien puede inhibir el suministro in vivo interfiriendo con las interacciones necesarias para el direccionamiento. Por lo tanto, se desean vehfculos casi neutros para la distribucion y direccionamiento in vivo. Sin una regulacion cuidadosa, las actividades de alteracion o desestabilizacion de la membrana son toxicas cuando se usan in vivo. El equilibrio entre la toxicidad del vehfculo y el suministro del acido nucleico se logra mas facilmente in vitro que in vivo.
Rozema et al., en la publicacion de patente de EE.UU. 20040162260, demostraron un medio para regular de forma reversible la actividad de alteracion de la membrana de una poliamina activa en la membrana. La poliamina activa en la membrana proporcionaba un medio de alteracion de las membranas celulares. La regulacion reversible dependiente del pH proporcionaba un medio para limitar la actividad a los endosomas de las celulas diana, limitando asf la toxicidad. Su metodo se basa en la modificacion de aminas en una poliamina con anhfdrido 2-propionico-3- metilmaleico.
imagen1
Esta modificacion convertfa el polication en un polianion por conversion de aminas primarias en parejas de grupos carboxilo (carboxilo p y carboxilo y) e inhibfa de forma reversible la actividad en la membrana de la poliamina. Rozema et al. (Bioconjugate Chem. 2003, 14, 51-57) describieron que el carboxilo p no presentaba una carga negativa completa aparente y que por sf mismo no podfa inhibir la actividad en la membrana. Se describio que la adicion del grupo carboxilo y era necesaria para la inhibicion eficaz de la actividad en la membrana. Para permitir el cosuministro del acido nucleico con el vehfculo de suministro, el acido nucleico se unio covalentemente al polfmero de suministro. Pudieron mostrar el suministro de polinucleotidos a celulas in vitro, usando su sistema de suministro de conjugado biologicamente labil. Sin embargo, debido a que el vehfculo tema carga negativa alta, teniendo tanto el acido nucleico como el polfmero modificado una densidad de carga negativa alta, este sistema no era eficaz para el
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suministro in vivo. La carga negativa probablemente inhida el direccionamiento espedfico de celula y potenciaba la absorcion no espedfica por el sistema reticuloendotelial (RES). Usando tambien los poKmeros modificados con el anddrido 2-propionico-3-metilmaleico, Rozema et al. demostraron la formacion de complejos electrostaticos ternarios pequenos de acidos nucleicos, policationes y polfmeros modificados con anddrido 2-propionico-3- metilmaleico.
Rozema et al., en la publicacion de patente de EE.UU. 20080152661, mejoro el metodo de la publicacion de patente de EE.UU. 20040162260, eliminando la alta densidad de carga negativa del polfmero activo en la membrana modificado. Sustituyendo el carboxilo y del anddrido 2-propionico-3-metilmaleico por grupos directores hidrofilos neutros (galactosa) y estabilizantes estericos (PEG), Rozema et al. pudieron retener la solubilidad general en agua y la inhibicion reversible de la actividad en la membrana, mientras que incorporaban direccionamiento eficaz in vivo a celulas hepatocitos. Como antes, el polinucleotidos se unio covalentemente al polfmero de transfeccion. La union covalente del polinucleotido al polfmero de transfeccion se mantuvo para asegurar el cosuministro del polinucleotido con el polfmero de transfeccion a la celula diana durante la administracion in vivo, previniendo la disociacion del polinucleotido del polfmero de transfeccion. El cosuministro del polinucleotido y el polfmero de transfeccion era necesario debido a que polfmero de transfeccion proporcionaba transporte del polinucleotido a traves de la membrana celular, desde fuera de la celula o desde dentro de un compartimiento endodtico, al citoplasma de la celula. La publicacion de patente de EE.UU. 20080152661 demostraba suministro muy eficaz de polinucleotidos, espedficamente oligonucleotidos ARNi, a celulas hepaticas in vivo, usando este nuevo policonjugado fisiologicamente sensible mejorado. El documento US 2008281041 describe la inactivacion reversible de los polfmeros activos en la membrana, util para el suministro celular de compuestos. Se describen sistemas de policonjugados que incorporan actividades de direccion, antiopsonizacion, antiagregacion y transfeccion en conjugados de suministro in vivo biocompatibles pequenos, en donde el uso de multiples uniones reversibles que conectan partes componentes proporciona la modulacion de la actividad fisiologicamente sensible.
Sin embargo, la union covalente del acido nucleico a la poliamina conlleva limitaciones inherentes. La modificacion de los polfmeros de transfeccion, para unir tanto el acido nucleico como los agentes de enmascaramiento, es complicada por las interacciones de cargas. La union de un acido nucleico con carga negativa a un polfmero con carga positiva tiene tendencia a la agregacion, limitando de esta forma la concentracion de la mezcla. La agregacion se puede superar por la presencia de un exceso del polication o polianion. Sin embargo, esta solucion limita las proporciones en las que se pueden formular el acido nucleico y el polfmero. Ademas, la union del acido nucleico con carga negativa al polfmero cationico sin modificar, produce condensacion y agregacion del complejo e inhibe la modificacion del polfmero. La modificacion del polfmero, formando un polfmero negativo, impide la union del acido nucleico.
En una realizacion preferida, la invencion se caracteriza por una composicion para suministrar un polinucleotido de ARN interferente a una celula hepatica in vivo, que comprende: una poliamina activa en la membrana reversiblemente enmascarada dirigida al receptor de asialoglicoprotema (ASGPr) (polfmero de suministro) y un polinucleotido de ARN interferente conjugado con un grupo hidrofobo que contiene al menos 20 atomos de carbono (conjugado de ARN). El polfmero de suministro y el conjugado de ARNip se sintetizan por separado y se pueden suministrar en recipientes separados o en un solo recipiente. El polinucleotido de ARN interferente no esta conjugado con el polfmero.
En una realizacion preferida, la invencion se caracteriza por una composicion para suministrar un polinucleotido de ARN interferente a una celula hepatica in vivo, que comprende: una poliamina activa en la membrana reversiblemente enmascarada dirigida al ASGPr (polfmero de suministro) y un polinucleotido de ARN interferente conjugado con una galactosamina trivalente (conjugado de ARN). El polfmero de suministro y el conjugado de ARNip se sintetizan por separado y se pueden suministrar en recipientes separados o en un solo recipiente. El polinucleotido de ARN interferente no esta conjugado al polfmero.
En una realizacion, la poliamina activa en la membrana comprende: un polfmero anfipatico formado por polimerizacion aleatoria de monomeros que contienen amina y monomeros que contienen grupos hidrofobos inferiores. Los monomeros que contienen amina contienen grupos amina colgantes seleccionados del grupo que consiste en: amina primaria y amina secundaria. Los monomeros hidrofobos inferiores contienen grupos hidrofobos colgantes que tienen 1-6 atomos de carbono. La relacion de grupos amina a grupos hidrofobos se selecciona para formar un polfmero soluble en agua con actividad de alteracion de la membrana, preferiblemente >1 monomero de amina por monomero hidrofobo. En una realizacion, el polfmero tendra 60-80% de monomeros de amina. Los grupos hidrofobos se pueden seleccionar del grupo que consiste en: grupo alquilo, grupo alquenilo, grupo alquinilo, grupo arilo, grupo aralquilo, grupo aralquenilo y grupo aralquinilo, cada uno de los cuales puede ser lineal, ramificado o dclico. Los grupos hidrofobos son preferiblemente hidrocarburos, que contienen solo atomos de carbono e hidrogeno. Sin embargo, pueden estar permitidas sustituciones o heteroatomos que mantengan la hidrofobicidad, e incluyen, por ejemplo fluor. Las poliaminas activas en membrana particularmente adecuadas comprenden copolfmeros aleatorios de poli(eter vimlico) o copolfmeros aleatorios de poliacrilato.
En una realizacion, la poliamina activa en la membrana comprende: un polfmero anfipatico formado por polimerizacion aleatoria de monomeros que contienen amina, monomeros hidrofobos inferiores y monomeros hidrofobos superiores. Los monomeros que contienen amina contienen grupos amina colgantes seleccionados del
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grupo que consiste en: amina primaria y amina secundaria. Los monomeros hidrofobos inferiores contienen grupos hidrofobos colgantes que tienen 1-6 atomos de carbono. Los monomeros hidrofobos superiores contienen grupos hidrofobos colgantes que tienen 12-36 o mas atomos de carbono. La relacion de grupos amina a grupos hidrofobos se selecciona para formar un polfmero soluble en agua con actividad de alteracion de la membrana, preferiblemente >1 monomero de amina por monomero hidrofobo. En una realizacion, el polfmero tendra 60-80% de monomeros de amina. Los grupos hidrofobos se pueden seleccionar del grupo que consiste en: grupo alquilo, grupo alquenilo, grupo alquinilo, grupo arilo, grupo aralquilo, grupo aralquenilo y grupo aralquinilo, cada uno de los cuales puede ser lineal, ramificado o dclico, esterol, esteroide o derivado de esteroide. Los grupos hidrofobos son preferiblemente hidrocarburos, que contienen solo atomos de carbono e hidrogeno. Sin embargo, pueden estar permitidas sustituciones o heteroatomos que mantengan la hidrofobicidad, e incluyen, por ejemplo fluor. Las poliaminas activas en membrana particularmente adecuadas comprenden terpolfmeros aleatorios de poli(eter vimlico) o terpolfmeros aleatorios de poliacrilato. En una realizacion preferida, una poliamina activa en la membrana reversiblemente enmascarada comprende una poliamina activa en la membrana de la invencion reversiblemente modificada por reaccion de aminas en el polfmero con agentes de enmascaramiento.
En una realizacion preferida, una poliamina activa en la membrana enmascarada reversiblemente comprende una poliamina de la invencion activa en la membrana modificada reversiblemente por reaccion de aminas en el polfmero con agentes enmascarantes. Una amina se modifica reversiblemente si la escision del grupo modificador restablece la amina. La modificacion reversible de la poliamina activa en la membrana inhibe reversiblemente la actividad en la membrana de la poliamina activa en la membrana. Preferiblemente, un agente de enmascaramiento tambien proporciona funcion directora y/o funcion para evitar la interaccion en el suero. La modificacion de la amina del polfmero con un agente de enmascaramiento preferiblemente tambien neutraliza la carga de la amina. Un agente de enmascaramiento preferido comprende una galactosamina o derivado de galactosamina o un polietilenglicol que tiene un grupo anhfdrido maleico disustituido reactivo con amina. La reaccion del anhfdrido con una amina modifica reversiblemente la amina para formar un maleamato o acido maleamico. En el estado enmascarado, la poliamina activa en la membrana reversiblemente enmascarada no presenta actividad de alteracion de la membrana. Puede ser necesaria la modificacion reversible de mas de 50%, mas de 55%, mas de 60%, mas de 65%, mas de 70%, mas de 75%, o mas de 80%, de las aminas en la poliamina con agentes de enmascaramiento para inhibir la actividad en la membrana y proporcionar una funcion de direccionamiento a la celula, es decir, formar un polfmero activo en la membrana reversiblemente enmascarado. La inhibicion de la actividad en la membrana y/o el direccionamiento in vivo de las poliaminas activas en la membrana descritas, requiere la modificacion de >50% de las aminas del polfmero.
Un agente de enmascaramiento descrito comprende un anhfdrido alquilmaleico sustituido hidrofilo neutro:
imagen2
en donde R1 comprende un resto director o un estabilizante esterico. Un ejemplo de un anhfdrido alquilmaleico sustituido consiste en un derivado del anhfdrido 2-propionico-3-alquilmaleico. Un derivado de anhfdrido 2-propionico- 3-alquilmaleico hidrofilo neutro se forma por union de un grupo hidrofilo neutro a un anhfdrido 2-propionico-3- alquilmaleico a traves del grupo carboxilo y del anhfdrido 2-propionico-3-alquilmaleico. En una realizacion, el grupo alquilo consiste en un grupo metilo.
Un agente de enmascaramiento preferido proporciona funcion directora a traves de la afinidad por receptores de la superficie celular, es decir, el agente de enmascaramiento contiene un ligando para un receptor de superficie celular. Los agentes de enmascaramiento preferidos contienen sacardos que tienen afinidad por el ASGPr, incluyendo, pero no limitado a: galactosa, N-Acetil-galactosamina y derivados de galactosa. Los derivados de galactosa que tienen afinidad por el ASGPr son bien conocidos en la tecnica. Una caractenstica esencial de la poliamina activa en la membrana reversiblemente enmascarada es que al menos algunos, y tantos como todos, los agentes de enmascaramiento unidos a un polfmero, proporcionan funcion de direccionamiento a la celula. Otro agente de enmascaramiento preferido proporciona biodistribucion mejorada por la inhibicion de interacciones no espedficas entre el polfmero reversiblemente modificado y los componentes del suero o celulas no diana, y reduciendo la agregacion del polfmero. Los agentes de enmascaramiento preferidos que tienen funcion estabilizantea esterica incluyen, pero no se limitan a polietilenglicoles. En una realizacion, se usa una combinacion de agentes de enmascaramiento directores y estabilizantees estericos.
El conjugado de polinucleotido de ARNi y el polfmero de suministro se administran a un mairnfero en vehfculos o diluyentes farmaceuticamente aceptables. En una realizacion, el polfmero de suministro y el conjugado de polinucleotido de ARNi se pueden combinar en una disolucion antes de la administracion al mamffero. En otra realizacion, el polfmero de suministro y el conjugado de polinucleotido de ARNi se pueden coadministrar al mamffero
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en disoluciones separadas. En otra realizacion mas, el poffmero de suministro y el conjugado de polinucleotido de ARNi se pueden administrar al mairfffero de forma secuencial. Para la administracion secuencial, el poffmero de suministro se puede administrar antes del conjugado de polinucleotido de ARNi. Alternativamente, para la administracion secuencial el conjugado de polinucleotido de ARNi se puede administrar antes de la administracion del poffmero de suministro.
Otros objetos, caractensticas y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada cuando se considere junto con los dibujos adjuntos.
FIG. 1. Esquema de reaccion para la polimerizacion de terpoffmeros aleatorios de poli(eter vinffico) anfipaticos.
FIG. 2. Grafica que ilustra el efecto de la dosis de conjugado de ARNip-colesterol en la inactivacion genica.
FIG. 3. Grafica que ilustra el efecto del tamano del grupo hidrofobo en el conjugado de ARNip-grupo hidrofobo en el direccionamiento al hffgado.
FIG. 4. Grafica que ilustra el efecto de la dosis del conjugado de ARNip-grupo hidrofobo en la inactivacion genica, para varios grupos hidrofobos.
FIG. 5. Grafica que ilustra el efecto de la dosis de poffmero de suministro en el suministro del conjugado de ARNip- grupo hidrofobo en el hffgado.
FIG. 6. Union de agrupacion de GalNAc al ARN
Se describe en la presente memoria un metodo mejorado para suministrar polinucleotidos de ARN interferente (ARNi), a celulas hepaticas en un mairfffero, in vivo. El metodo tambien proporciona metodos mejorados de produccion de vehffculos de suministro de polinucleotidos de ARNi. Anteriormente, el suministro in vivo de polinucleotidos requena la asociacion ffsica del polinucleotido con el vehffculo de suministro. El polinucleotidos se asociaba electrostaticamente con un vehffculo de suministro, como en complejos de polication/acido nucleico, se encapsulaba con el vehffculo de suministro, como en liposomas y parffculas de acido nucleico-ffpido estables (SNALP), o se uman covalentemente a un vehffculo de suministro, como en Dynamic PolyConjugates (Rozema et al. 2007). Sorprendentemente, los autores de la invencion han encontrado que usando moleculas de conjugado de polinucleotido de ARNi adecuadas y poffmeros de suministro adecuadamente dirigidos, el polinucleotido de ARNi se puede separar del poffmero de suministro y conseguir todavfa suministro eficaz del polinucleotidos a los hepatocitos.
La capacidad para separar el polinucleotido del poffmero de suministro proporciona ventajas en la formulacion, smtesis y fabricacion.
a) Al eliminar el requisito de que el polinucleotido y el poffmero esten asociados, sea por union covalente o por interaccion de carga-carga, la concentracion de los poffmeros y polinucleotidos y la relacion entre ellos, esta limitada solo por la solubilidad de los componentes en lugar de por la solubilidad del complejo asociado o la capacidad de fabricacion del complejo. Una mayor solubilidad permite mayor concentracion de polinucleotido o poffmero de suministro y por lo tanto mayor dosis de administracion.
b) El polinucleotido y el poffmero de suministro se pueden mezclar en cualquier momento antes de la administracion, o incluso administrar por separado. Por lo tanto, la separacion permite que los componentes se almacenen por separado, sea en disolucion o en seco.
c) Es posible una formulacion mas pequena, mas estable, comparado con los sistemas de suministro no covalentes, inherentemente inestables, mas grandes.
d) La fabricacion del poffmero de suministro enmascarado es mas facil en ausencia de un polinucleotido con carga negativa unido covalentemente o de la necesidad de unir covalentemente un polinucleotido con carga negativa.
e) La fabricacion se simplifica y requiere menos etapas en ausencia de la asociacion ffsica del polinucleotido con el poffmero de suministro.
f) Se observan mejoras en el direccionamiento del ARNip y el poffmero.
La invencion incluye sistemas de suministro de conjugado de estructura general:
(M1-L)x-P-(L-M2)y mas N-T,
en donde N es un polinucleotido de ARNi, T es un resto que dirige al polinucleotido (sea un grupo hidrofobo que tiene 20 o mas atomos de carbono o una agrupacion de galactosas), P es una poliamina activa en la membrana, y el agente de enmascaramiento M1 contiene un resto director, una galactosa o derivado de galactosa que tiene afinidad por el receptor de la asialoglicoprotema, covalentemente unido a P por un enlace reversible en condiciones fisiologicas L, tal como un enlace maleamato. La escision de L restablece la amina sin modificar en la poliamina P. El agente de enmascaramiento M2 es opcional. Si esta presente, M2 es un estabilizante esterico hidrofilo unido
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covalentemente a P por un enlace reversible en condiciones fisiologicas L, tal como un enlace maleamato. x e y son numeros enteros. En su estado sin modificar, P es una poliamina activa en la membrana. El poUmero de suministro (M1-L)x-P-(L-M2)y no es activo en la membrana. La modificacion reversible de las aminas P, por union de M1 y opcionalmente M2, inhibe o inactiva de forma reversible la actividad en la membrana de P y reduce la carga positiva neta de P. Se unen suficientes agentes de enmascaramiento a P para inhibir la actividad en la membrana del polfmero. x + y tiene un valor mayor que 50%, mas preferiblemente mayor que 60%, y mas preferiblemente mayor que 70% de las aminas en la poliamina P, determinado por la cantidad de aminas en P en ausencia de cualquier agente de enmascaramiento. Tras la escision de las uniones reversibles L, se restablecen las aminas sin modificar volviendo de esta manera P a su estado sin modificar, activo en la membrana. El enlace reversible de la union reversible L se elige de forma que la escision se produce en unas condiciones fisiologicas deseadas, tal como presente en un tejido, organo o situacion subcelular deseada. Una union reversible preferida en una union labil al pH. (M1-L)x-P-(L-M2)y, un polfmero activo en la membrana reversiblemente enmascarado dirigido al ASGPr (polfmero enmascarado), y T-N, un conjugado de polinucleotido, se sintetizan o fabrican por separado. Ni T ni N estan unidos covalentemente, directa o indirectamente, a P, L, M1 o M2. No es necesaria la asociacion electrostatica o hidrofoba del polinucleotido o conjugado de polinucleotido con el polfmero enmascarado o no enmascarado, para el suministro hepatico in vivo del polinucleotido. El polfmero enmascarado y el conjugado de polinucleotido se pueden suministrar en el mismo recipiente o en recipientes separados. Se pueden combinar antes de la administracion, coadministrar o administrar secuencialmente.
Polfmero
Los polfmeros de la invencion son poliaminas activas en la membrana anfipaticas. Un polfmero es una molecula construida por la union repetitiva de unidades mas pequenas llamadas monomeros. Un polfmero puede ser un homopolfmero en el que se usa un solo monomero, o un polfmero puede ser un copolfmero o heteropolfmero en el que se usan dos o mas monomeros diferentes. La cadena principal de un polfmero esta compuesta de atomos cuyos enlaces son necesarios para la propagacion de la longitud del polfmero. Una cadena lateral de un polfmero esta compuesta de atomos cuyos enlaces no son necesarios para la propagacion de la longitud del polfmero.
Mas espedficamente, los polfmeros de la invencion son copolfmeros aleatorios anfipaticos activos en la membrana. Los monomeros en los copolfmeros aleatorios no tienen una disposicion definida a lo largo de la cadena principal, y se escriben, por ejemplo, como: -Ax-By- o -Ax-By-Cz-. Las composiciones generales de dichos polfmeros son reflejo de la relacion de monomeros que entran. Sin embargo, la relacion exacta de un monomero respecto a otro puede diferir entre cadenas. La distribucion de los monomeros tambien puede diferir a lo largo de la longitud de un solo polfmero. Ademas, las propiedades qmmicas de un monomero pueden afectar a su velocidad de incorporacion en un copolfmero aleatorio y su distribucion dentro del polfmero. Aunque la relacion de monomeros en un polfmero aleatorio depende de la relacion de entrada del monomero, la relacion de entrada puede no corresponderse exactamente con la relacion de los monomeros incorporados.
Anfipatico
Los polfmeros anfipaticos, o anfifflicos, son bien conocidos y reconocidos en la tecnica y tienen tanto grupos hidrofilos (polares, solubles en agua) como hidrofobos (no polares, lipofilos, insolubles en agua).
Los grupos hidrofilos indican en terminos cualitativos que el resto qmmico prefiere el agua. Tfpicamente, dichos grupos qmmicos son solubles en agua, y son donadores de enlaces de hidrogeno o aceptores con el agua. Un grupo hidrofilo puede tener carga o no tener carga. Los grupos con carga pueden tener carga positiva (anionico) o carga negativa (cationico) o ambas (de ion dbrido). Los ejemplos de grupos hidrofilos incluyen los siguientes restos qmmicos: hidratos de carbono, polioxietileno, algunos peptidos, oligonucleotidos, aminas, amidas, alcoxiamidas, acidos carboxflicos, sulfuros e hidroxilos.
Los grupos hidrofobos indican en terminos cualitativos que el resto qmmico evita el agua. Tfpicamente, dichos grupos qmmicos no son solubles en agua, y no tienden a formar enlaces de hidrogeno. Los grupos lipofilos se disuelven en grasas, aceites, lfpidos y disolventes no polares y tienen poca o no tienen capacidad para formar enlaces de hidrogeno. Los hidrocarburos que contienen dos (2) o mas atomos de carbono, algunos hidrocarburos sustituidos, colesterol y derivados de colesterol son ejemplos de grupos y compuestos hidrofobos.
Como se usa en la presente memoria, con respecto a los polfmeros anfipaticos, una parte se define como una molecula obtenida cuando un enlace covalente se rompe y se sustituye por hidrogeno. Por ejemplo, en la butilamina, la rotura entre los enlaces de carbono y nitrogeno y sustitucion por hidrogenos, da como resultado amoniaco (hidrofilo) y butano (hidrofobo). Si el 1,4-diaminobutano se escinde por los enlaces nitrogeno-carbono, y se sustituyen por hidrogenos, las moleculas resultantes son de nuevo amoniaco (2x) y butano. Sin embargo, el 1,4,- diaminobutano no se considera anfipatico porque la formacion de la parte hidrofoba requiere la rotura de dos enlaces.
Como se usa en la presente memoria, un polfmero tensioactivo disminuye la tension superficial del agua y/o la tension interfacial con otras fases, y por consiguiente es adsorbido positivamente en la interfase de lfquido/vapor. La
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propiedad de tensioactividad normalmente se debe al hecho de que las moleculas de la sustancia son anfipaticas o anfiffticas.
Activo en la membrana
Como se usa en la presente memoria, los poftmeros activos en la membrana son poftmeros anfipaticos tensioactivos, que son capaces de inducir uno o mas de los siguientes efectos sobre una membrana biologica: una alteracion o perturbacion de la membrana que permite que moleculas no permeables a la membrana entren en una celula o crucen la membrana, formacion de poro en la membrana, rotura de membranas, o alteracion o disolucion de la membrana. Como se usa en la presente memoria, una membrana o membrana celular, comprende una bicapa lipfdica. La alteracion o perturbacion de la membrana se puede definir funcionalmente por la actividad del poftmero en al menos uno de los siguientes ensayos: lisis de globulos rojos (hemolisis), fuga del liposoma, fusion de liposomas, fusion celular, lisis celular y liberacion endosomica. Los poftmeros activos en la membrana que pueden producir la lisis de membranas celulares tambien se denominan poftmeros ftticos de membranas. Los poftmeros que producen con preferencia alteracion de endosomas o lisosomas frente a la membrana plasmatica se consideran endosomolfticos. El efecto de los poftmeros activos en la membrana sobre una membrana celular puede ser transitorio. Los poftmeros activos en la membrana tienen afinidad por la membrana y producen una desnaturalizacion o deformacion de las estructuras de bicapa. Los poftmeros activos en la membrana pueden ser sinteticos o poftmeros anfipaticos no naturales.
Como se usa en la presente memoria, los poftmeros activos en la membrana son distintos de una clase de poftmeros denominados peptidos o poftmeros que penetran en las celulas representados por compuestos tales como peptido rico en arginina derivado de la protema TAT del VIH, el peptido antennapedia, peptido VP22, transportano, peptidos artificiales ricos en arginina, poftmeros artificiales ricos en guanidinio pequenos, y similares. Aunque los compuestos que penetran en las celulas parece que transportan algunas moleculas a traves de una membrana, de un lado de la bicapa lipfdica al otro lado de la bicapa lipfdica, aparentemente sin requerir endocitosis y sin alterar la integridad de la membrana, su mecanismo no se entiende.
El suministro de un polinucleotido a una celula es mediado por el poftmero activo en la membrana que altera o desestabiliza la membrana plasmatica o una membrana de vesmula interna (tal como un endosoma o lisosoma), incluyendo la formacion de un poro en la membrana, o la alteracion de vesmulas endosomales o lisosomales permitiendo de esta forma la liberacion del contenido de la vesmula en el citoplasma celular.
Endosomofttico
Los poftmeros endosomolfticos son poftmeros que, en respuesta a un cambio de pH, son capaces de producir la alteracion o lisis de un endosoma o permitir la liberacion de un compuesto normalmente impermeable a la membrana celular, tal como un polinucleotido o protema, de una vesmula encerrada por membrana interna celular, tal como un endosoma o lisosoma. Los poftmeros endosomolfticos sufren un cambio en sus propiedades fisicoqmmicas a lo largo de un intervalo de pH fisiologicamente relevante (normalmente pH 5,5 - 8). El cambio puede ser un cambio en la solubilidad del poftmero o la capacidad de interaccionar con otros compuestos o membranas como resultado de un cambio en la carga, hidrofobicidad o hidroflilicidad. Los poftmeros endosomolfticos de ejemplo tienen grupos o enlaces labiles frente al pH. Por lo tanto, un poftmero activo en la membrana enmascarado reversiblemente, en el que los agentes de enmascaramiento estan unidos al poftmero por enlaces labiles frente al pH, se puede considerar que es un poftmero endosomofttico.
Copoftmeros aleatorios activos en la membrana anfipaticas
Las poliaminas activas en la membrana anfipaticas de la invencion comprenden: poliaminas activas en la membrana anfipaticas (heteropoftmeros aleatorios).
Para los copoftmeros de la invencion, las dos o mas especies monomeras consisten como mmimo en: un monomero que contiene un grupo colgante amina primaria o secundaria y un monomero que contiene un grupo colgante hidrofobo. En una realizacion mas preferida, las dos especies monomeras consisten como mmimo en: un monomero que contiene un grupo colgante amina primaria o secundaria y un monomero que contiene un grupo colgante hidrofobo inferior. Como se usa en la presente memoria, un grupo colgante es un grupo compuesto de los atomos unidos a un poftmero pero cuyos enlaces no son necesarios para la propagacion de la longitud del poftmero, es decir, ni los atomos ni los enlaces de un grupo colgante son parte de la cadena principal o esqueleto de un poftmero al cual esta unido el grupo.
Los copoftmeros de poliaminas activas en la membrana anfipaticas de la invencion son el producto de la copolimerizacion de dos o mas especies monomeras. En una realizacion, los heterpoftmeros activos en la membrana anfipaticos de la invencion, tienen la estructura general:
-(A)a-(B)b
en donde, A contiene un grupo funcional colgante amina primaria o secundaria y B contiene un grupo colgante hidrofobo inferior (que contiene de 2 a aproximadamente 6 atomos de carbono). a y b son numeros enteros >0. Para
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ayudar en la smtesis, durante la polimerizacion se pueden usar monomeras que contienen amina protegida, tales como monomeros con amina protegida con ftalimido o protegida con BOC. Los grupos protectores de amina se eliminan despues de la polimerizacion para dar aminas. Es aceptable la incorporacion de monomeros, de hasta 10%, que contienen grupos colgantes hidrofobos medios o superiores (7 o mas atomos de carbono). Tambien es aceptable la incorporacion de especies monomeras adicionales en cantidades pequenas (<5%). Por ejemplo, los polfmeros tambien pueden tener monomeros que contienen grupos reactivos adicionales. Los monomeros que contienen grupos reactivos se pueden usar para unir componentes al polfmero despues de la smtesis del polfmero. Un monomero puede tener un grupo reactivo que no participe en la reaccion de polimerizacion. Un monomero tambien puede tener un grupo reactivo que esta protegido. El grupo protector previene la reaccion del grupo reactivo durante la polimerizacion. Despues de la polimerizacion, se elimina el grupo reactivo.
En otra realizacion, se usa un terpolfmero, un polfmero que tiene al menos tres especies monomeras diferentes, como el polfmero de suministro. Para los terpolfmeros de la invencion, las tres especies monomeras consisten como mmimo en: un monomero que contiene un grupo colgante amina primaria o secundaria, un monomero que contiene un primer grupo colgante hidrofobo, y un monomero que contiene un segundo grupo colgante hidrofobo, en donde el primer y segundo grupos colgantes hidrofobos son diferentes. En una realizacion mas preferida, las tres o mas especies monomeras consisten como mmimo en: un monomero que contiene un grupo amina primaria o secundaria, un monomero que contiene un grupo colgante hidrofobo inferior, y un monomero que contiene un grupo colgante hidrofobo medio o superior.
En una realizacion, los terpolfmeros activos en la membrana anfipaticos de la invencion, tienen la estructura general:
-(A)a-(B)b-(C)c-
en donde, A contiene un grupo funcional colgante amina primaria o secundaria, B contiene un grupo colgante hidrofobo inferior (que contiene de 2 a aproximadamente 6 atomos de carbono), y C contiene un grupo colgante hidrofobo superior (que contiene 12 o mas atomos de carbono). a, b, y c son numeros enteros >0. Para ayudar en la smtesis, durante la polimerizacion se pueden usar monomeros que contienen amina protegida, tales como monomeros con amina protegida con ftalimido o protegida con BOC. Los grupos protectores de amina se eliminan despues de la polimerizacion para dar aminas. Es posible la incorporacion de especies monomeras adicionales en cantidades pequenas (<5%). Por ejemplo, los polfmeros tambien pueden tener monomeros hidrofobos adicionales o monomeros que contienen grupos reactivos. Los monomeros que contienen grupos reactivos se pueden usar para unir componentes al polfmero despues de la smtesis del polfmero. Un monomero puede tener un grupo reactivo que no participe en la reaccion de polimerizacion. Un monomero tambien puede tener un grupo reactivo que esta protegido. El grupo protector previene la reaccion del grupo reactivo durante la polimerizacion. Despues de la polimerizacion, se elimina el grupo protector.
Los grupos hidrofobos son preferiblemente hidrocarburos, que contienen solo atomos de carbono e hidrogeno. Sin embargo, pueden estar permitidas sustituciones no polares o heteroatomos no polares que mantienen la hidrofobicidad, e incluyen, por ejemplo, fluor. El termino incluye grupo alifaticos, grupos aromaticos, grupos acilo, grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos alquinilo, grupos arilo, grupos aralquilo, grupos aralquenilo y grupos aralquinilo, cada uno de los cuales puede ser lineal, ramificado o dclico. La expresion grupo hidrofobo tambien incluye: esteroles, esteroides, colesterol y derivados de esteroides y colesterol. Como se usa en la presente memoria, los monomeros o grupos hidrofobos inferiores comprenden grupos hidrofobos que tienen de dos (2) a seis (6) atomos de carbono. Como se usa en la presente memoria, los monomeros o grupos hidrofobos medios comprenden grupos hidrofobos que tienen de siete (7) a once (11) atomos de carbono. Como se usa en la presente memoria, los monomeros o grupos hidrofobos superiores comprenden grupos hidrofobos que tienen de doce (12) a treinta y seis (36) atomos de carbono.
Las propiedades bioffsicas de los polfmeros anfipaticos se determinan por las clases de especies monomeras polimerizadas, la relacion con la que se incorporan en el polfmero, y el tamano del polfmero. Se pueden hacer diferentes polfmeros alterando la relacion de alimentacion de monomeros en la reaccion de polimerizacion, o alterando los grupos usados para modificar la cadena principal del polfmero. Aunque la relacion de los monomeros incorporados en un polfmero puede ser la misma que la relacion de alimentacion de monomeros, las relaciones pueden ser diferentes. Se incorporen los monomeros a la relacion de alimentacion o en una relacion diferente, se puede alterar la relacion de alimentacion de los monomeros para conseguir una relacion de incorporacion de monomeros deseada.
La relacion de grupos amina a grupos hidrofobos se selecciona para formar un polfmero soluble en agua con actividad alteradora de la membrana. Los polfmeros activos en la membrana preferidos de la invencion son solubles en agua en >1 mg/ml, >5 mg/ml, >10 mg/ml, >15 mg/ml, >20 mg/ml, >25 mg/ml, y >30 mg/ml. Los polfmeros activos en la membrana preferidos de la invencion son tensioactivos. Los polfmeros activos en la membrana de la invencion preferiblemente tienen un tamano en el intervalo de aproximadamente 3 kDa a aproximadamente 300 kDa. Debido a que los polfmeros son anfipaticos, se autoasocian en disolucion acuosa, con una concentracion de asociacion cntica <1 mg/ml.
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En una realizacion, la relacion de incorporacion de monomeros para los copoKmeros de poliamina activos en la membrana es de 4-8 monomeros amina:3-5 monomeros hidrofobos inferiores. En otra realizacion, la relacion de incorporacion de monomeros para las poliaminas activas en la membrana es 5,4-7,5 monomeros amina:3-3,5 monomeros hidrofobos inferiores. En otra realizacion, la relacion de incorporacion de monomeros para las poliaminas activas en la membrana es de aproximadamente 2 monomeros de amina a aproximadamente 1 monomero hidrofobo inferior. En una realizacion, los grupos de los monomeros hidrofobos consisten en grupos alquilo.
En una realizacion, la relacion de incorporacion de monomeros para los terpolfmeros de poliamina activos en la membrana es de 4-8 monomeros amina:3-5 monomeros hidrofobos inferiores:1 monomero hidrofobo superior. En otra realizacion, la relacion de incorporacion de monomeros para las poliaminas activas en la membrana es 5,4-7,5 monomeros amina: 3-3,5 monomeros hidrofobos inferiores: 1 monomero hidrofobo superior. En otra realizacion, la relacion de incorporacion de monomeros para las poliaminas activas en la membrana es de aproximadamente 6 monomeros amina a aproximadamente 3 monomeros hidrofobos inferiores a aproximadamente 1 monomero hidrofobo superior. En una realizacion, los grupos hidrofobos de los monomeros hidrofobos consisten en grupos alquilo.
En una realizacion, los copolfmeros con amina/grupo hidrofobo inferior se sintetizan usando monomeros en una relacion de alimentacion de aproximadamente 4-8 monomeros amina:aproximadamente 3-5 monomeros alquilo inferior. En otra realizacion, los copolfmeros con amina/grupo hidrofobo inferior se pueden sintetizar usando monomeros en una relacion de alimentacion de aproximadamente 15 monomeros amina: 4 monomeros con grupo hidrofobo inferior.
En una realizacion, los terpolfmeros con amina/grupo hidrofobo inferior/grupo hidrofobo superior se sintetizan usando monomeros en una relacion de alimentacion de aproximadamente 4-8 monomeros amina:aproximadamente 3-5 monomeros alquilo inferior:1 monomero alquilo superior. En otra realizacion, los terpolfmeros con amina/grupo hidrofobo inferior/grupo hidrofobo superior se pueden sintetizar usando monomeros en una relacion de alimentacion de aproximadamente 15 monomeros amina: 4 monomeros con grupo hidrofobo inferior: 1 monomero con grupo hidrofobo superior.
En una realizacion, las poliaminas activas en la membrana particularmente adecuadas comprenden copolfmeros que tienen monomeros que contienen amina, monomeros que contienen butilo y monomeros que contienen grupo hidrofobo superior, en donde el grupo hidrofobo superior contiene 12-18 atomos de carbono. Las poliaminas activas en membrana particularmente adecuadas comprenden terpolfmeros aleatorios de poli(eter vimlico) o terpolfmeros aleatorios de poliacrilato.
En otra realizacion, las poliaminas activas en la membrana particularmente adecuadas comprenden copolfmeros que tienen monomeros que contienen amina, monomeros que contienen grupo hidrofobo inferior. Las poliaminas activas en membrana particularmente adecuadas comprenden copolfmeros aleatorios de poli(eter vimlico) o copolfmeros aleatorios de poliacrilato.
Las poliaminas activas en la membrana particularmente adecuadas comprenden copolfmeros que tienen monomeros que contienen amina y monomeros que contienen butilo. Las poliaminas activas en membrana particularmente adecuadas comprenden copolfmeros aleatorios de poli(eter vimlico) o copolfmeros aleatorios de poliacrilato.
Polfmeros biodegradables
Un polfmero puede tener uno o mas enlaces escindibles. Si los enlaces escindibles se escinden de forma natural en condiciones fisiologicas o condiciones fisiologicas celulares, el polfmero es biodegradable. El enlace biodegradable puede estar en la cadena principal o en una cadena lateral. Si el enlace escindible esta en la cadena principal, la escision del enlace produce una disminucion de la longitud del polfmero y la formacion de dos moleculas. Si el enlace escindible esta en la cadena lateral, entonces la escision del enlace produce la perdida de atomos de la cadena lateral del polfmero. Para polfmeros activos en la membrana, la biodegradacion del polfmero producira una disminucion de la actividad del polfmero en la membrana. Como se usa en la presente memoria, el termino biodegradable significa que el polfmero se degradara a lo largo del tiempo por accion de enzimas, por accion hidrolftica y/o por otros mecanismos similares en el cuerpo. Los enlaces biodegradables son aquellos enlaces que se escinden por procesos biologicos e incluyen, pero no se limitan a: esteres, fosfodiesteres, algunos enlaces peptfdicos, y combinaciones de los mismos. Los esteres sufren hidrolisis y tambien son escindidos catalfticamente por esterasas. Los fosfodiesteres son escindidos por nucleasas. Los enlaces peptfdicos son escindidos por peptidasas. En particular, se degrada o escinde la cadena principal del polfmero, o se degradan o escinden las cadenas laterales (grupos colgantes), del polfmero. Los enlaces biodegradables en los polfmeros biodegradables se pueden escindir, en condiciones fisiologicas, con una semivida menor de 45 min, mayor de 45 min, mayor de 2 horas, mayor de 8 horas, mayor de 24 horas o mayor de 48 horas. Aunque los polfmeros biodegradables son utiles para el suministro in vivo, el polfmero debe ser suficientemente estable para formar un polfmero de tamano suficiente en disolucion acuosa. Ademas, la velocidad de escision de un enlace biodegradable debe ser mas lenta que el enlace labil usado para unir un agente de enmascaramiento al polfmero. En una realizacion preferida, la
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degradacion de un poKmero biodegradable ocurre a una velocidad mas lenta que la escision de los agentes de enmascaramiento.
Enmascaramiento
Los poKmeros de suministro de la invencion comprenden poliaminas activas en la membrana anfipaticas modificadas reversiblemente, en donde la modificacion reversible inhibe la actividad en la membrana, neutraliza la poliamina para reducir carga positiva y formar un polfmero de carga casi neutra, proporciona direccionamiento espedfico del tipo de celula e inhibe las interacciones no espedficas del polfmero. La poliamina se modifica reversiblemente por modificacion reversible de las aminas en la poliamina.
Las poliaminas activas en la membrana de la invencion son capaces de alterar las membranas plasmaticas o membranas lisosomicas/endodticas.Esta actividad en la membrana es una caractenstica esencial para el suministro celular del polinucleotido. Sin embargo, la actividad en la membrana conduce a toxicidad cuando el polfmero se administra in vivo. Las poliaminas tambien interaccionan facilmente con muchos componentes anionicos in vivo, conduciendo a biodistribucion indeseada. Por lo tanto, el enmascaramiento reversible de la actividad en la membrana de la poliamina es necesaria para usar in vivo. Este enmascaramiento se consigue por la union reversible de agentes de enmascaramiento a la poliamina activa en la membrana, para formar un polfmero activo en la membrana enmascarado reversiblemente, es decir, un polfmero de suministro. Ademas de inhibir la actividad en la membrana, los agentes de enmascaramiento protegen al polfmero de interacciones no espedficas, reducen interacciones en el suero, aumentan el tiempo de circulacion y proporcionan interacciones espedficas de celula, es decir, direccionamiento.
Es una caractenstica esencial de los agentes de enmascaramiento el que, en agregados, inhiben la actividad en la membrana del polfmero, protegen al polfmero de interacciones no espedficas (reducen las interacciones en el suero, aumentan el tiempo de circulacion), y proporcionan direccionamiento a hepatocitos in vivo. La poliamina activa en la membrana es activa en la membrana en el estado no modificado (no enmascarada) y no es activa en la membrana (inactivada) en el estado modificado (enmascarada). Se une un numero suficiente de agentes de enmascaramiento al polfmero para conseguir el nivel deseado de inactivacion. El nivel deseado de modificacion de un polfmero por union del o de los agentes de enmascaramiento se determina facilmente usando ensayos de actividad del polfmero adecuados. Por ejemplo, si el polfmero tiene actividad en la membrana en un ensayo dado, se une al polfmero un nivel suficiente de agentes de enmascaramiento para conseguir el nivel deseado de inhibicion de la actividad en la membrana en ese ensayo. El enmascaramiento requiere la modificacion de >50%, >60%, >70%, o >80% de los grupos amina en el polfmero, determinado por la cantidad de aminas en el polfmero en ausencia de cualquier agente de enmascaramiento. Tambien es una caractenstica preferida de los agentes de enmascaramiento que su union al polfmero reduce la carga positiva del polfmero, formando asf un polfmero de suministro mas neutro. Es deseable que el polfmero enmascarado retenga la solubilidad acuosa.
Como se usa en la presente memoria, una poliamina activa en la membrana esta enmascarada si el polfmero modificado no presenta actividad en la membrana y presenta direccionamiento espedfico de celula (es decir, de hepatocitos) in vivo. Una poliamina activa en la membrana esta enmascarada reversiblemente si la escision de los enlaces que unen los agentes de enmascaramiento al polfmero produce el restablecimiento de las aminas en el polfmero, restableciendo asf la actividad en la membrana.
Otra caractenstica esencial es que los agentes de enmascaramiento estan covalentemente unidos a la poliamina activa en la membrana por enlaces reversibles en condiciones fisiologicas. Al usar uniones o enlaces reversibles en condiciones fisiologicas, los agentes de enmascaramiento se pueden escindir del polfmero in vivo, desenmascarando de esta forma al polfmero y restableciendo la actividad del polfmero no enmascarado. Seleccionando una union reversible adecuada, se puede formar un conjugado que restablece la actividad del polfmero activo en la membrana despues de haber sido suministrado o dirigido a un tipo de celula deseado o sitio celular. La reversibilidad de las uniones proporciona la activacion selectiva del polfmero activo en la membrana. Las uniones covalentes reversibles contienen enlaces reversibles o labiles que se pueden seleccionar del grupo que comprende: enlaces labiles en condiciones fisiologicas, enlaces labiles en condiciones fisiologicas celulares, enlaces labiles frente al pH, enlaces muy labiles frente al pH y enlaces extremadamente labiles frente al pH.
Como se usa en la presente memoria, un agente de enmascaramiento comprende un compuesto que tiene un resto que se dirige al ASGPr o un estabilizante esterico y un grupo reactivo con amina, en donde la reaccion del grupo reactivo con amina con una amina en un polfmero da como resultado la union del resto que dirige al ASGPr o estabilizante esterico al polfmero por un enlace covalente labil en condiciones fisiologicas. Un grupo que dirige al ASGPr es un grupo, tfpicamente un sacarido, que tiene afinidad por el receptor de asialoglicoprotema. Un estabilizante esterico preferido es un polietilenglicol (PEG). Los agentes de enmascaramiento preferidos de la invencion son capaces de modificar el polfmero (forman un enlace reversible con el polfmero) en disolucion acuosa. Un grupo reactivo con amina preferido comprende un anhfdrido maleico disustituido. Un agente de enmascaramiento preferido se representa por la estructura:
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q
o |
y* 2
O
en donde, en el que R1 es un grupo alquilo tal como un grupo metilo (-CH3), grupo etilo (-CH2CH3) o grupo propilo (- CH2CH2CH3) para formar un anlddrido alquilmaleico sustituido) y R2 comprende un resto que se dirige al receptor de asialoglicoprotema (ASGPr) o un estabilizante esterico.
La poliamina activa en la membrana se puede conjugar con agentes de enmascaramiento en presencia de un exceso de agentes de enmascaramiento. El exceso de agente de enmascaramiento se puede eliminar del polfmero de suministro conjugado antes de la administracion del polfmero de suministro.
Estabilizante esterico
Como se usa en la presente memoria, un estabilizante esterico es un polfmero hidrofilo no ionico (sea natural, sintetico o no natural) que previene o inhibe las interacciones intramoleculares o intermoleculares de un polfmero al cual esta unido, en relacion al polfmero que no contiene estabilizante esterico. Un estabilizante esterico impide a un polfmero al que esta unido que participe en interacciones electrostaticas. La interaccion electrostatica es la asociacion no covalente de dos o mas sustancias debido a fuerzas atractoras entre cargas positivas y negativas. Los estabilizantes estericos pueden inhibir la interaccion de componentes de la sangre y por lo tanto la opsonizacion, fagocitosis y absorcion por el sistema reticuloendotelial. Por lo tanto, los estabilizantes estericos aumentan el tiempo de circulacion de moleculas a las que estan unidas. Los estabilizantes estericos tambien pueden inhibir la agregacion de un polfmero. Un estabilizante esterico preferido es un polietilenglicol (PEG) o derivado de PEG. Como se usa en la presente memoria, un PEG preferido puede tener aproximadamente 1-500 monomeros de etilenglicol, 2-20 monomeros de etilenglicol, 5-15 monomeros de etilenglicol, o aproximadamente 10 monomeros de etilenglicol. Como se usa en la presente memoria un PEG preferido tambien puede tener un peso molecular medio de aproximadamente 85-20.000 Daltons (Da), aproximadamente 200-1000 Da, aproximadamente 200-750 Da, o aproximadamente 550 Da. Como se usa en la presente memoria, los estabilizantes estericos previenen o inhiben interacciones intramoleculares o intermoleculares de un polfmero al que estan unidos, en relacion con el polfmero que no contiene estabilizante esterico en disolucion acuosa.
Resto que dirige al ASGPr
Los restos o grupos directores potencian las propiedades farmacocineticas o de biodistribucion de un conjugado al que estan unidos, para mejorar la distribucion espedfica de celula y absorcion espedfica de celula del conjugado. La galactosa y derivados de galactosa se han usado para dirigir moleculas a hepatocitos in vivo a traves de su union al receptor de asialoglicoprotema expresado en la superficie de hepatocitos (ASGPr). Como se usa en la presente memoria, un resto que dirige al ASGPr comprende una galactosa o derivado de galactosa que tiene afinidad por el ASGPr igual o mayor que el de la galactosa. La union de los restos directores galactosa al o a los ASGPr facilita el direccionamiento espedfico de celula del polfmero suministrado a hepatocitos y la endocitosis del polfmero de suministro en los hepatocitos.
Los restos que dirigen al ASGPr se pueden seleccionar del grupo que comprende: lactosa, galactosa, N- acetilgalactosamina (GalNAc), galactosamina, N-formilgalactosamina, N-acetil-galactosamina, N- propionilgalactosamina, N-n-butanoilgalactosamina, y N-iso-butanoilgalactosamina (lobst, S.T. y Drickamer, K. J.B.C. 1996, 271, 6686). Los restos que dirigen al ASGPr pueden ser monomeros (p. ej., tienen una sola galactosamina) o multimericos (p. ej., tienen multiples galactosaminas).
En algunas realizaciones, el resto director galactosamina esta unido al grupo reactivo con amina por un conector PEG como se ilustra mediante la estructura:
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en donde n es un numero entero entre 1 y 19.
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En una realizacion, la poliamina activa en la membrana se enmascara de forma reversible por union de agentes de enmascaramiento con resto que dirige al ASGPr, a >50%, >60%, >70% o >80% de las aminas en la poliamina. En otra realizacion, la poliamina activa en la membrana se enmascara de forma reversible por union de agentes de enmascaramiento con resto que dirige al ASGPr, a >50%, >60%, >70% o >80% de aminas en la poliamina. En otra realizacion, los agentes de enmascaramiento con resto que dirige al ASGPr comprenden un resto que dirige al ASGPr unido a un grupo reactivo con amina por un conector PEG. Para el enmascaramiento de la poliamina activa en la membrana tanto con agentes de enmascaramiento con resto que dirige al ASGPr como con agentes de enmascaramiento PEG, una relacion preferida de PEG a resto que dirige al ASGPr es aproximadamente 0-4:1, mas preferiblemente aproximadamente 0,5-2:1. En otra realizacion, hay aproximadamente 1,3-2 agentes de enmascaramiento PEG por aproximadamente 1 agente de enmascaramiento derivado de galactosa.
Carga superficial
El potencial Z es una propiedad ffsica que presenta una partfcula en suspension y esta estrechamente relacionada con la carga superficial. En medio acuoso, el pH de la muestra es uno de los factores mas importantes que afectan al potencial zeta. Cuando la carga se basa en la protonacion/desprotonacion de bases/acidos, la carga depende del pH. Por lo tanto, un valor de potencial zeta debe incluir las condiciones en disolucion, en especial el pH, para ser importante. Para partfculas tfpicas, la magnitud del potencial zeta da una indicacion de la estabilidad del potencial del sistema coloidal. Si todas las partfculas en suspension tienen un potencial zeta grande negativo o positivo, tendran tendencia a repelerse entre sf, y las partfculas no tendran tendencia a juntarse. Sin embargo, si las partfculas tienen valores de potencial zeta bajos, no habra fuerza para impedir que las partfculas se junten y floculen. La lmea divisoria general entre suspensiones estables e inestables para partfculas tfpicas en general se toma a +30 o -30 mV. Las partfculas con potenciales zeta mas positivos que +30 mV o mas negativas que -30 mV normalmente se consideran estables. Los polfmeros de suministro de la invencion descrita presentan un potencial zeta de 20 mV a -20 mV en disolucion salina fisiologica y pH 8, pero son estables coloidalmente en solucion acuosa y no floculan.
La carga positiva, o potencial zeta, de una poliamina activa en la membrana, se reduce por modificacion con los agentes de enmascaramiento. La carga del polfmero, en especial la carga positiva, puede dar lugar a interacciones no deseadas con componentes del suero o celulas no diana. La carga superficial positiva tambien tiene una funcion en la actividad en la membrana potenciando la interaccion del polfmero con membranas celulares con carga negativa. Por lo tanto, son preferidos los polfmeros de suministro con carga neta o potencial zeta casi neutro para el suministro in vivo de polinucleotidos. Los polfmeros de suministro de la invencion, poliaminas activas en la membrana, enmascaradas por union reversible de agentes de enmascaramiento con resto que dirige al ASGPr y agentes de enmascaramiento estabilizantes estericos, tienen una carga superficial aparente casi neutra y son estables en el suero. Mas espedficamente, los polfmeros de suministro de la invencion tienen un potencial zeta, medido a pH 8, entre +30 y -30 mV, entre +20 y -20 mV, entre +10 y -10 mV, o entre +5 y -5 mV. A pH 7, se espera que la carga neta del conjugado sea mas positiva que a pH 8. La carga neta, o carga superficial es un factor importante para las aplicaciones in vivo.
Union labil
Una union o conector es una conexion entre dos atomos que une un grupo o segmento qmmico de interes a otro grupo o segmento qmmico de interes por uno o mas enlaces covalentes. Por ejemplo, una union puede conectar un agente de enmascaramiento a un polfmero. La formacion de una union puede conectar dos moleculas separadas en una sola molecula o puede conectar dos atomos en la misma molecula. La union puede ser de carga neutra o puede llevar una carga positiva o negativa. Una union reversible o labil contiene un enlace reversible o labil. Una union puede incluir opcionalmente un espaciador que aumenta la distancia entre los dos atomos unidos. Un espaciador puede anadir ademas flexibilidad y/o longitud a la union. Los espaciadores pueden incluir, pero no se limitan a grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos alquinilo, grupos arilo, grupos aralquilo, grupos aralquenilo, grupos aralquinilo; cada uno de los cuales puede contener uno o mas heteroatomos, heterociclos, aminoacidos, nucleotidos y sacaridos. Los grupos espaciadores son bien conocidos en la tecnica y no se pretende que la lista previa limite el alcance de la invencion.
Un enlace reversible o labil es un enlace covalente distinto de un enlace covalente con un atomo de hidrogeno, que se puede romper o escindir selectivamente en condiciones que no romperan o escindiran otros enlaces covalentes en la misma molecula. Mas espedficamente, un enlace reversible o labil es un enlace covalente que es menos estable (termodinamicamente) o se rompe mas rapidamente (cineticamente) en condiciones adecuadas que otros enlaces covalentes no labiles en la misma molecula. La escision de un enlace labil en una molecula puede dar lugar a la formacion de dos moleculas. Para los expertos en la tecnica, la escision o la labilidad de un enlace en general se describe en terminos de semivida (ty2) de escision del enlace (tiempo necesario para que se escindan la mitad de los enlaces). Por lo tanto, los enlaces reversibles o labiles abarcan enlaces que se pueden escindir selectivamente mas rapidamente que otros enlaces en la molecula.
Las condiciones adecuadas se determinan por el tipo de enlace labil y son bien conocidas en qmmica organica. Un enlace labil puede ser sensible al pH, a condiciones o agentes oxidantes o reductores, temperatura, concentracion salina, la presencia de una enzima (tal como esterasas, incluyendo nucleasas y proteasas), o la presencia de un
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agente anadido. Por ejemplo, el aumento o disminucion de pH son las condiciones adecuadas para un enlace labil frente al pH.
La velocidad a la que un grupo labil sufrira transformacion se puede controlar alterando los constituyentes qmmicos de la molecula que contiene el grupo labil. Por ejemplo, la adicion de restos qmmicos particulares (p. ej., aceptores o donadores de electrones) cerca del grupo labil puede afectar a las condiciones particulares (p. ej., pH) a las que se producira la transformacion qmmica.
Como se usa en la presente memoria, un enlace labil en condiciones fisiologicas es un enlace labil que se puede escindir en condiciones que se encuentran normalmente o analogas a las encontradas en el cuerpo de un mairnfero. Los grupos de uniones labiles en condiciones fisiologicas se seleccionan de modo que sufren una transformacion qmmica (p. ej., escision) cuando estan presentes en determinadas condiciones fisiologicas.
Como se usa en la presente memoria, un enlace labil en condiciones fisiologicas celulares es un enlace labil que se puede escindir en condiciones intracelulares de marnffero. Las condiciones intracelulares de mamffero incluyen condiciones qmmicas tales como pH, temperatura, condiciones o agentes oxidantes o reductores, y concentracion salina que se encuentran o analogas a las que se encuentran en celulas de mamffero. Las condiciones intracelulares de mamffero tambien incluyen la presencia de actividad enzimatica normalmente presente en una celula de mamffero, tal como de enzimas proteolfticas o tiidroltticas. Un enlace labil en condiciones fisiologicas celulares tambien se puede escindir en respuesta a la administracion de un agente exogeno farmaceuticamente aceptable. Los enlaces labiles en condiciones fisiologicas que se escinden en condiciones adecuadas con una semivida de menos de 45 min se consideran muy labiles. Los enlaces labiles en condiciones fisiologicas que se escinden en condiciones adecuadas con una semivida de menos de 15 min se consideran extremadamente labiles.
La transformacion qmmica (escision del enlace labil) se puede iniciar por la adicion de un agente farmaceuticamente aceptable a la celula o puede ocurrir espontaneamente cuando una molecula que contiene el enlace labil llega a un entorno intra y/o extracelular adecuado. Por ejemplo, un enlace labil frente al pH se puede escindir cuando la molecula entra en un endosoma acidificado. Por lo tanto, un enlace labil frente al pH se puede considerar que es un enlace escindible en endosomas. Los enlaces escindibles por enzimas se pueden escindir cuando son expuestos a enzimas tales como las presentes en un endosoma o lisosoma o en el citoplasma. Un enlace disulfuro se puede escindir cuando la molecula entra en el entorno mas reductor del citoplasma celular. Por lo tanto, se puede considerar que un disulfuro es un enlace escindible en el citoplasma.
Como se usa en la presente memoria, un enlace labil frente al pH es un enlace labil que se rompe selectivamente en condiciones acidas (pH<7). Dichos enlaces tambien se pueden denominar enlaces labiles en endosomas, puesto que los endosomas y lisosomas de las celulas tienen un pH menor que 7. La expresion labil frente al pH incluye enlaces que son labiles frente al pH, muy labiles frente al pH y extremadamente labiles frente al pH.
La reaccion de un antndrido con una amina forma una amida y un acido. Para muchos antndridos, la reaccion inversa (formacion de un antndrido y amina) es muy lenta y energeticamente desfavorable. Sin embargo, si el antndrido es un antndrido cfclico, la reaccion con una amina da una amida-acido, una molecula en la que la amida y el acido estan en la misma molecula. La presencia de ambos grupos reactivos (la amida y el acido carboxflico) en la misma molecula acelera la reaccion inversa. En particular, el producto de aminas primarias con antndrido maleico y derivados de antndrido maleico, acidos maleamicos, devuelve a la amina y antndrido de 1*109 a 1*1013 veces mas rapido que sus analogos no dclicos (Kirby 1980).
Reaccion de una amina con un antndrido para formar una amida y un acido.
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Reaccion de una amina con un antndrido cfclico para formar una amida-acido.
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La escision de la amida-acido para formar una amina y un antndrido depende del pH y se acelera muctio a pH acido. Esta reactividad dependiente del pH se puede explotar para formar enlaces y conectores labiles frente al pH reversibles. El acido cis-acomtico se tia usado como dicta molecula conectora sensible al pH. El carboxilato y se acopla primero a una molecula. En una segunda etapa, el carboxilato a o p se acopla a una segunda molecula para
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formar un acoplamiento de las dos moleculas sensible al pH. La semivida para la escision de este conector a pH 5 es entre 8 y 24 h.
Estructuras del antndrido cis-aconftico y antndrido maleico.
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El pH al que se produce la escision se controla por la adicion de constituyentes qmmicos al resto labil. La velocidad de conversion de los acidos maleamico en aminas y anhndridos maleicos depende mucho de la sustitucion (R2 y R3) del sistema de antndrido maleico. Cuando R2 es metilo, la velocidad de conversion es 50 veces mayor que cuando R2 y R3 son hidrogeno. Cuando hay sustituciones alquilo tanto en R2 como en R3 (p. ej., antndrido 2,3- dimetilmaleico) al aumento de velocidad es espectacular: 10.000 mas rapido que en el antndrido maleico no sustituido. El enlace de maleamato formado por la modificacion de una amina con antndrido 2,3-dimetilmaleico se escinde para restablecer el antndrido y la amina con una semivida de entre 4 y 10 min a pH 5. Se preve que si R2 y R3 son grupos mayores que el hidrogeno, la velocidad de conversion del amida-acido en amina y antndrido sera mas rapida que si R2 y/o R3 son hidrogeno.
Enlace muy labil frente al pH: Un enlace muy labil frente al pH tiene una semivida para ls escision a pH 5 menor que 45 min. La construccion de enlaces muy labiles frente al pH es bien conocida en la tecnica qrnmica.
Enlaces extremadamente labiles frente al pH: Un enlace extremadamente labil frente al pH tiene una semivida para la escision a pH 5 menor que 15 min. La construccion de enlaces extremadamente labiles frente al pH es bien conocida en la tecnica qrnmica.
Los antndridos dclicos disustituidos son particularmente utiles para la union de agentes de enmascaramiento a poliaminas activas en la membrana de la invencion. Proporcionan uniones labiles frente al pH en condiciones fisiologicas, modifican aminas facilmente y restablecen esas aminas por escision en el pH reducido que se encuentra en los endosomas y lisosomas celulares. Segundo, el grupo acido carboxflico a o p creado tras la reaccion con una amina, parece que contribuye solo aproximadamente 1/20a parte de la carga negativa esperada al polfmero (Rozema et al. Bioconjugate Chemistry 2003). Por lo tanto, la modificacion de la poliamina con los antndridos maleicos disustituidos neutraliza eficazmente la carga positiva de la poliamina en lugar de crear un polfmero con carga negativa alta. Los polfmeros casi neutros son preferidos para el suministro in vivo.
Polimerizacion por etapas
En la etapa de polimerizacion, la polimerizacion se produce en un modo por etapas. El crecimiento del polfmero se produce por reaccion entre monomeros, oligomeros y polfmeros. No se necesita iniciador puesto que ocurre la misma reaccion en todo el proceso, y no hay etapa de terminacion de modo que los grupos terminales todavfa estan reactivos. La velocidad de polimerizacion disminuye al consumirse los grupos funcionales.
Se puede crear un polfmero usando la polimerizacion por etapas usando monomeros que tienen dos grupos reactivos (A y B) en el mismo monomero (heterobufuncional), en donde A comprende un grupo reactivo y B comprende un grupo reactivo con A (un grupo reactivo que forma un enlace covalente con A). La polimerizacion de A-B da -[A-B]n-. Los grupos reactivos A y B se pueden unir por un enlace covalente o una pluralidad de enlaces covalentes, formando asf el monomero del polfmero. Tambien se puede crear un polfmero usando la polimerizacion por etapas, usando monomeros homobifuncionales, de modo que A-A + B-B da -[A-A-B-B]n-. En general, estas reacciones pueden implicar acilacion o alquilacion. Los dos grupos reactivos de un monomero se pueden unir mediante un solo enlace covalente o una pluralidad de enlaces covalentes.
Si el grupo reactivo A es una amina entonces B es un grupo reactivo con amina, que se puede seleccionar del grupo que comprende: isotiocianato, isocianato, acilazida, N-hidroxi-succinimida, cloruro de sulfonilo, aldetndo (incluyendo formaldetndo y glutaraldetndo), cetona, epoxido, carbonato, imidoester, carboxilato activado con una carbodiimida, alquilfosfato, haluros de arilo (difluoro-dinitrobenceno), antndrido, haluro de acido, ester de p-nitrofenilo, ester de o- nitrofenilo, ester de pentaclorofenilo, ester de pentafluorofenilo, carbonil-imidazol, carbonil-piridinio, y carbonil- dimetilaminopiridinio. En otras palabras, cuando el grupo reactivo A es una amina entonces B puede ser un agente acilante o alquilante o agente de aminacion.
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Si el grupo reactivo A es un sulfhidrilo (tiol) entonces B es un grupo reactivo con tiol, que se puede seleccionar del grupo que comprende: derivado de yodoacetilo, maleimida, derivado de aziridina, derivado de acriloilo, derivado de fluorobenceno y derivado de disulfuro (tal como disulfuro de piridilo o derivado de acido 5-tio-2-nitrobenzoico (TNB)).
Si el grupo reactivo A es carboxilato, entonces el grupo reactivo B es un grupo reactivo con carboxilato, que se puede seleccionar del grupo que comprende: diazoacetato y una amina en la que se usa una carbodiimida. Se pueden usar otros aditivos tales como carbonildiimidazol, dimetilaminopiridina (DMAP), N-hidroxisuccinimida o alcohol usando carbodiimida, y DMAP.
Si el grupo reactivo A es un hidroxilo, entonces el grupo reactivo B es un grupo reactivo con hidroxilo, que se puede seleccionar del grupo que comprende: epoxido, oxirano, carbamato activado, ester activado, y haluro de alquilo.
Si el grupo reactivo A es un aldehndo o cetona, entonces el grupo reactivo B es un grupo reactivo con aldehndo o cetona, que se puede seleccionar del grupo que comprende: hhidrazina, derivado de hidrazida, amina (para formar una base de Schiff que se puede reducir o no mediante agentes reductores tales como NaCNBHa), y compuesto de hidroxilo.
Se puede crear un polfmero usando la polimerizacion por etapas, usando monomeros bifuncionales y otro agente, de modo que A-A mas otro agente da -[A-A]n-.
Si el grupo reactivo A es un grupo sulfhidrilo (tiol) entonces se puede convertir en enlaces disulfuro mediante agentes oxidantes tales como yodo (I2), peryodato sodico (NaIO4), u oxfgeno (O2). Si el grupo reactivo A es una amina, se puede convertir en un tiol por reaccion con 2-iminotiolato (reactivo de Traut) que despues sufre oxidacion y formacion de disulfuro. Los derivados de disulfuro (tal como un disulfuro de piridilo o derivado de TNB) tambien se pueden usar para catalizar la formacion de enlaces disulfuro.
Los grupos reactivos A o B en cualquiera de los ejemplos anteriores tambien pueden ser un grupo fotorreactivo tal como arilazida (incluyendo arilazida halogenada), diazo, benzofenona, alquino o derivado de diazirina.
Las reacciones de los grupos amina, hidroxilo, sulfhidrilo o carboxilato dan enlaces qrnmicos que se describen como amidas, amidinas, disulfuros, eteres, esteres, enaminas, iminas, ureas, isotioureas, isoureas, sulfonamidas, carbamatos, enlaces alquilamina (aminas secundarias), y enlaces sencillos carbono-nitrogeno en los que el carbono esta unido a un grupo hidroxilo, tioeter, diol, hidrazona, diazo o sulfona.
Polimerizacion en cadena
En la polimerizacion por reaccion en cadena, el crecimiento del polfmero se produce por la adicion sucesiva de unidades de monomero a un numero limitado de cadenas en crecimiento. Los mecanismos de inicio y propagacion son diferentes, y normalmente hay una etapa de terminacion de la cadena. Las reacciones de polimerizacion en cadena pueden ser radicalicas, anionicas o cationicas. Los monomeros para la polimerizacion en cadena se pueden seleccionar de los grupos que comprenden: grupos vinilo, eter vimlico, metacrilato, acrilamida y metacrilamida. La polimerizacion en cadena tambien se puede llevar a cabo por polimerizacion por apertura de ciclo o anillo. Se pueden usar diferentes tipos de iniciadores de radicales libres incluyendo, pero no limitado a peroxidos, hidroxiperoxidos, y compuestos azo, tales como dihidrocloruro de 2,2'-azobis(-amidinopropano) (AAP).
Un polfmero natural es un polfmero que se puede encontrar en la naturaleza. Los ejemplos incluyen polinucleotidos, protemas, colageno y polisacaridos (almidones, celulosa, glucosaminoglucanos, quitina, agar, agarosa). Un polfmero natural se puede aislar de una fuente biologica o puede ser sintetico. Un polfmero sintetico se formula o fabrica por un procedimiento qrnmico "por el hombre" y no es creado por un proceso biologico que ocurre naturalmente. Un polfmero no natural es un polfmero sintetico que no se hace a partir de materiales o monomeros naturales (animales o vegetales) (tales como aminoacidos, nucleotidos y sacaridos). Un polfmero puede ser completa o parcialmente natural, sintetico o no natural.
Conjugado de polinucleotido de ARNi
Los autores de la invencion han encontrado que la conjugacion de un polinucleotido de ARNi con un resto director del polinucleotido, sea un grupo hidrofobo o a una agrupacion de galactosas, y la coadministracion del conjugado del polinucleotido de ARNi con el polfmero de suministro descrito antes, proporciona el suministro funcional, eficaz, del polinucleotido de ARNi a celulas hepaticas, en particular a hepatocitos, in vivo. Por suministro funcional se entiende que el polinucleotido de ARNi se suministra a la celula y tiene la actividad biologica esperada, la inhibicion espedfica de secuencia de la expresion genica. Muchas moleculas, incluyendo polinucleotidos, administradas a la vasculatura de un mairnfero son normalmente depuradas del cuerpo por el hngado. La depuracion de un polinucleotido por el hngado en donde el polinucleotido es degradado o procesado de otra forma para la eliminacion del cuerpo, y en donde el polinucleotido no produce inhibicion espedfica de secuencia de la expresion genica, no se considera suministro funcional.
El conjugado del polinucleotido de ARNi se forma por union covalente del polinucleotido de ARNi con el resto director del polinucleotido. El polinucleotido se sintetiza o modifica de modo que contiene un grupo reactivo A. El
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resto director tambien se sintetiza o modifica de modo que contiene un grupo reactivo B. Los grupos reactivos A y B se seleccionan de modo que se puedan unir por una union covalente usando metodos conocidos en la tecnica.
El resto director se puede unir al extremo 3' o al 5' del polinucleotido de ARNi. Para los polinucleotidos de ARNip, el resto director se puede unir en la cadena codificante o en la cadena de sentido contrario, aunque se prefiere en la cadena codificante.
En una realizacion, el resto director del polinucleotido consiste en un grupo hidrofobo. Mas espedficamente, el resto director del polinucleotido consiste en un grupo hidrofobo que tiene al menos 20 atomos de carbono. Los grupos hidrofobos usados como restos directores del polinucleotido se denominan en la presente memoria restos directores hidrofobos. Los grupos hidrofobos adecuados de ejemplo se pueden seleccionar del grupo que comprende: colesterol, dicolesterol, tocoferol, ditocoferol, didecilo, didodecilo, dioctadecilo, didodecilo, dioctadecilo, isoprenoido y coleamida. Los grupos hidrofobos que tienen 6 o menos atomos de carbono no son eficaces como restos directores de polinucleotido, mientras que los grupos hidrofobos que tienen de 8 a 18 atomos de carbono proporcionan suministro de polinucleotido creciente con el aumento del tamano del grupo hidrofobo (es decir, aumento del numero de atomos de carbono). La union de un resto director hidrofobo a un polinucleotido de ARNi no proporciona suministro funcional eficaz in vivo del polinucleotido de ARNi en ausencia de la coadministracion del polfmero de suministro. Aunque otros han descrito que los conjugados de ARNip-colesterol suministran ARNip (ARNip-colesterol) a las celulas hepaticas in vivo, en ausencia de cualquier vehmulo de suministro adicional, son necesarias concentraciones altas de ARNip y la eficacia del suministro es mala. Cuando se combinan con los polfmeros de suministro descritos en la presente memoria, el suministro del polinucleotido mejora mucho. Al proporcionar el ARNip-colesterol junto con un polfmero de suministro de la invencion, la eficacia del ARNip-colesterol aumenta aproximadamente 100 veces.
Los grupos hidrofobos utiles como restos directores de polinucleotidos se pueden seleccionar del grupo que consiste en: grupo alquilo, grupo alquenilo, grupo alquinilo, grupo arilo, grupo aralquilo, grupo aralquenilo y grupo aralquinilo, cada uno de los cuales puede ser lineal, ramificado o dclico, colesterol, derivado de colesterol, esterol, esteroide o derivado de esteroide. Los restos directores hidrofobos son preferiblemente hidrocarburos que contienen solo atomos de carbono e hidrogeno. Sin embargo, pueden estar permitidas sustituciones o heteroatomos que mantengan la hidrofobicidad, por ejemplo fluor. El resto director hidrofobo se puede unir al extremo 3' o 5' del polinucleotido de ARNi usando metodos conocidos en la tecnica. Para los polinucleotidos de ARNi que tienen 2 cadenas, tales como los ARNip, el grupo hidrofobo se puede unir a cualquiera de las cadenas.
En otra realizacion, el resto director del polinucleotido comprende una agrupacion de galactosas (resto director de agrupacion de galactosas). Como se usa en la presente memoria, una agrupacion de galactosas comprende una molecula que tiene de dos a cuatro derivados de galactosa terminales. Como se usa en la presente memoria, la expresion derivado de galactosa incluye tanto galactosa como derivados de galactosa que tienen una afinidad por el receptor de asialoglicoprotema igual o mayor que la de la galactosa. Un derivado de galactosa terminal esta unido a una molecula por su carbono C-1. El receptor de asialoglicoprotema (ASGPr) es unico de hepatocitos y se une a glicoprotemas con galactosa termina ramificadas. Una agrupacion de galactosas preferida tiene tres galactosaminas o derivados de galactosamina terminales, teniendo cada una afinidad por el receptor de asialoglicoprotema. Una agrupacion de galactosas mas preferida tiene tres N-acetil-galactosaminas terminales. Otras expresiones comunes en la tecnica incluye galactosa triantenaria, galactosa trivalente y tnmero de galactosa. Se sabe que las agrupaciones de derivados de galactosa triantenaria se unen al ASGPr con mayor afinidad que las estructuras derivadas de galactosa biantenarias o monoantenarias (Baenziger y Fiete, 1980, Cell, 22, 611-620; Connolly et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 939-945). La multivalencia es necesaria para lograr afinidad nM. La union de un solo derivado de galactosa que tiene afinidad por el receptor de asialoglicoprotema no permite el suministro funcional del polinucleotido de ARNi a los hepatocitos in vivo cuando se coadministra con el polfmero de suministro.
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Una agrupacion de galactosas contiene tres derivados de galactosa cada uno unido a un punto de ramificacion central. Los derivados de galactosa estan unidos al punto de ramificacion central por los carbonos C-1 de los sacaridos. El derivado de galactosa preferiblemente esta unido al punto de ramificacion por conectores o espaciadores. Un espaciador preferido es un espaciador hidrofilo flexible (patente de EE.UU. 5885968; Biessen et al. J. Med. Chem. 1995 Vol. 39 pag. 1538-1546). Un espaciador hidrofilo flexible preferido es un espaciador de PEG. Un espaciador de PEG preferido es un espaciador PEG3. El punto de ramificacion puede ser cualquier molecula pequena que permita la union de los tres derivados de galactosa y que permita ademas la union del punto de
ramificacion al polinucleotido de ARNi. Un punto de ramificacion de ejemplo es una di-lisina. Una molecula de di- lisina contiene tres grupos amina por los cuales se pueden unir tres derivados de galactosa y un grupo reactivo con carboxilo a traves del cual la di-lisina se puede unir al polinucleotido de ARNi. La union del punto de ramificacion al polinucleotido de ARNi puede ocurrir a traves de un conector o espaciador. Un espaciador preferido es un 5 espaciador hidrofilo flexible. Un espaciador hidrofilo flexible preferido es un espaciador de PEG. Un espaciador de PEG preferido es un espaciador PEG3 (tres unidades de etileno). La agrupacion de galactosas se puede unir al extremo 3' o 5' del polinucleotido de ARNi usando metodos conocidos en la tecnica. Para los polinucleotidos de ARNi que tienen 2 cadenas, tales como los ARNip, la agrupacion de galactosas se puede unir a cualquiera de las cadenas.
10 Un derivado de galactosa preferido es una N-acetil-galactosamina (GalNAc). Otros sacaridos que tienen afinidad por el receptor de la asialoglicoprotema se pueden seleccionar de la lista que comprende: galactosa, galactosamina, N- formilgalactosamina, N-acetilgalactosamina, N-propionil-galactosamina, N-n-butanoilgalactosamina, y N-iso- butanoilgalactosamina. Se han estudiado las afinidades de numerosos derivados de galactosa por el receptor de asialoglicoprotema (vease, por ejemplo: lobst, S.T. y Drickamer, K. J.B.C. 1996, 271, 6686) o se determinan 15 facilmente usando metodos tfpicos en la tecnica.
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El termino polinucleotido, o acido nucleico o poli(acido nucleico), es un termino de la tecnica que se refiere a un polfmero que contiene al menos dos nucleotidos. Los nucleotidos son las unidades monomeras de los polfmeros 20 polinucleotidos. Los polinucleotidos con menos de 120 unidades de monomeros a menudo se llaman oligonucleotidos. Los acidos nucleicos naturales tienen una cadena principal de desoxirribosa- o ribosa-fosfato. Un polinucleotido no natural o sintetico es un polinucleotido que se polimeriza in vitro o en un sistema sin celulas y contiene las mismas bases o similares, pero puede contener una cadena principal de un tipo distinto de la cadena principal de ribosa- o desoxirribosa-fosfato natural. Los polinucleotidos se pueden sintetizar usando cualquier tecnica
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conocida en la materia. Las cadenas principales de polinucleotidos conocidas en la tecnica incluyen: PNA (acidos peptidonucleicos), fosforotioatos, fosforodiamidatos, morfolinos, y otras variantes de la cadena principal de fosfato de acidos nucleicos no modificados. Las bases incluyen purinas y pirimidinas, que ademas incluyen los compuestos naturales adenina, timina, guanina, citosina, uracilo, inosina y analogos naturales. Los derivados sinteticos de purinas y pirimidinas incluyen, pero no se limitan a modificaciones que ponen nuevos grupos reactivos en el nucleotido, tales como, pero no limitado a aminas, alcoholes, tioles, carboxilatos y haluros de alquilo. El termino base abarca cualquiera de los analogos de bases conocidos de ADN y ARN. Un polinucleotido puede contener ribonucleotidos, desoxirribonucleotidos, nucleotidos sinteticos, o cualquier combinacion adecuada. Los polinucleotidos se pueden polimerizar in vitro, pueden ser recombinantes, contener secuencias quimericas o derivados de esos grupos. Un polinucleotido puede incluir un resto terminal en el extremo 5', el extremo 3', o tanto en el extremo 5' como el 3'. El resto terminal puede ser, pero no limitado a un resto desoxi-basico invertido, un resto desoxi-timidina invertido, un resto timidina, o modificacion 3' con glicerilo.
Un polinucleotido de ARN interferente (ARNi) es una molecula capaz de inducir el ARN interferente por interaccion con la maquinaria de la ruta del ARN interferente de celulas de mairnfero, para degradar o inhibir la traduccion de transcritos de ARN mensajero (ARNm) de un transgen de una forma espedfica de la secuencia. Dos polinucleotidos de ARNi principales son los ARN interferentes pequenos (o cortos) (ARNip) y los micro ARN (miARN). Los polinucleotidos de ARNi se pueden seleccionar del grupo que comprende: ARNip, microARN, ARN bicatenario (ARNbc), ARN horquillado corto (ARNhc), y casetes de expresion que codifican ARN capaz de inducir ARN interferente. El ARNip comprende una estructura bicatenaria que contiene tfpicamente 15-50 pares de bases y preferiblemente 21-25 pares de bases y que tiene una secuencia de nucleotidos identica (perfectamente complementaria) o casi identica (parcialmente complementaria) a una secuencia codificante en un gen diana expresado o ARN dentro de la celula. Un ARNip puede tener extremos protuberantes de dinucleotidos 3'. Un ARNip puede estar compuesto de dos polinucleotidos asociados o un solo polinucleotido que forma una estructura horquillada. Una molecula de ARNip de la invencion contiene una region codificante y una region de sentido contrario. En una realizacion, el ARNip del conjugado se ensambla a partir de dos fragmentos de oligonucleotidos en donde un fragmento comprende la secuencia de nucleotidos de la cadena de sentido contrario de la molecula de ARNip y un segundo fragmento comprende la secuencia de nucleotidos de la region codificante de la molecula de ARNip. En otra realizacion, la cadena codificante esta conectada a la cadena de sentido contrario por una molecula conectora, tal como un conector polinucleotido o un conector no nucleotido. Los microARN (miARN) son productos genicos de ARN no codificante pequeno de aproximadamente 22 nucleotidos de longitud que dirigen la destruccion o represion de la traduccion de sus dianas ARNm. Si la complementariedad entre el miARN y el ARNm diana es parcial, se reprime la traduccion del ARNm diana. Si la complementariedad es extensa, el ARNm diana se escinde. Para los miARN, el complejo se une a los sitios diana normalmente situados en las UTR 3' de los ARNm que tfpicamente comparten solo homologfa parcial con el miARN. Una "region semilla", un tramo de aproximadamente siete (7) nucleotidos consecutivos en el extremo 5' del miARN que forma emparejamiento de bases perfecto con su diana, tiene una funcion principal en la especificidad del miARN. La union del complejo RISC/miARN al ARNm puede conducir a la represion de la traduccion de protema o a la escision y degradacion del ARNm. Datos recientes indican que la escision del ARNm se produce con preferencia si hay una homologfa perfecta a lo largo de toda la longitud del miARN y su diana, en lugar de mostrar solo emparejamiento de bases perfecto en la region semilla (Pillai et al. 2007).
Los casetes de expresion del polinucleotido de ARNi se pueden transcribir en la celula para producir ARN horquillados pequenos que funcionan como ARNip, ARNip lineales de cadena codificante y de sentido contrario separados, o miARN. Los ADN transcritos por la aRn polimerasa III contienen promotores seleccionados de la lista que comprende: promotores U6, promotores H1, y promotores ARNt. Los promotores de la ARN polimerasa II incluyen promotores U1, U2, U4 y U5, promotores de ARNnp, promotores de microARN, y promotores de ARNm.
Se pueden encontrar listas de secuencias de miARN en bases de datos mantenidas por organizaciones de investigacion tales como Wellcome Trust Sanger Institute, Penn Center for Bioinformatics, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, y European Molecule Biology Laboratory, entre otras. Las secuencias de ARNip eficaces conocidas y los sitios de union cognados tambien estan bien representados en la bibliograffa relevante. Las moleculas de ARNi son disenadas y producidas facilmente por tecnologfas conocidas en la tecnica. Ademas, hay herramientas computacionales que aumentan la posibilidad de encontrar motivos de secuencias eficaces y espedficos (Pei et al. 2006, Reynolds et al. 2004, Khvorova et al. 2003, Schwarz et al. 2003, Ui-Tei et al. 2004, Heale et al. 2005, Chalk et al. 2004, Amarzguioui et al. 2004).
Los polinucleotidos de la invencion se pueden modificar qmmicamente. Los ejemplos no limitantes de modificaciones qmmicas incluyen: uniones internucleotidos fosforotioato, 2'-O-metil-ribonucleotidos, 2'-desoxi-2'-fluoro- ribonucleotidos, 2'-desoxi-ribonucleotidos, nucleotidos "bases universales", 5-C-metil-nucleotidos, e incorporacion de restos desoxibasicos invertidos. Estas modificaciones qmmicas, cuando se usan en diferentes construcciones de polinucleotidos, han mostrado conservar la actividad del polinucleotido en celulas, mientras que al mismo tiempo aumentan la estabilidad en el suero de estos compuestos. Qmmicamente el ARNip modificado tambien puede minimizar la posibilidad de activar la actividad de interferones en seres humanos.
En una realizacion, un polinucleotido de ARNi qmmicamente modificado de la invencion, comprende un duplex que tiene dos cadenas, una de las cuales o ambas pueden estar qmmicamente modificadas, en donde cada cadena es
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de aproximadamente 19 a aproximadamente 29 nucleotidos. En una realizacion, un polinucleotido de ARNi de la invencion comprende uno o mas nucleotidos modificados, a la vez que mantiene la capacidad de mediar el ARNi dentro de una celula o sistema in vitro reconstituido. Se puede modificar un polinucleotido de ARNi en donde la modificacion qmmica comprende uno o mas (p. ej., aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o mas) de los nucleotidos. El polinucleotido de ARNi de la invencion puede comprender nucleotidos modificados como un porcentaje del numero total de nucleotidos presente en el polinucleotido de ARNi. Como tal, un polinucleotido de ARNi de la invencion en general puede comprender los nucleotidos modificados de aproximadamente 5 a aproximadamente 100% de las posiciones de nucleotidos (p. ej., 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 3o%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de las posiciones de nucleotidos). El porcentaje real de nucleotidos modificados presentes en un polinucleotido de ARNi dado depende del numero total de nucleotidos presentes en el polinucleotido de ARNi. Si el polinucleotido de ARNi es monocatenario, el porcentaje de modificacion se puede basar en el numero total de nucleotidos presentes en el polinucleotido de ARNi monocatenario. Igualmente, si el polinucleotido de ARNi es bicatenario, el porcentaje de modificacion se puede basar en el numero total de nucleotidos presentes en la cadena codificante, cadena de sentido contrario o tanto la cadena codificante como la de sentido contrario. Ademas, el porcentaje real de nucleotidos modificados presentes en un polinucleotido de ARNi dado puede depender tambien del numero total de nucleotidos de purina y pirmidina presente en el polinucleotido de ARNi. Por ejemplo, en donde estan modificados todos los nucleotidos de pirimidina y/o todos los nucleotidos de purina presentes en el polinucleotido de ARNi.
Un polinucleotido de ARNi modula la expresion del ARN codificado por un gen. Debido a que multiples genes pueden compartir el mismo grado de homologfa de secuencia entre ellos, se puede disenar un polinucleotido de ARNi para dirigirse a una clase de genes con suficiente homologfa de la secuencia. Por lo tanto, un polinucleotido de ARNi puede contener una secuencia que tiene complementariedad con secuencias que son compartidas entre diferentes genes diana o que son unicas para un gen diana espedfico. Por lo tanto, el polinucleotido de ARNi se puede disenar para que se dirija a regiones conservadas diana de una secuencia de ARN que tiene homologfa entre varios genes, dirigiendose asf a varios genes en una familia de genes (p. ej., diferentes isoformas de genes, variantes de corte y empalme, genes mutantes, etc.). En otra realizacion, el polinucleotido de ARNi se puede disenar para que se dirija a una secuencia que es unica de una secuencia de ARN espedfica de un solo gen.
El termino complementariedad se refiere a la capacidad de un polinucleotido para formar enlace(s) de hidrogeno con otra secuencia de polinucleotido por tipos tradicionales de Watson-Crick u otros no tradicionales. En relacion con las moleculas de polinucleotidos de la presente invencion, la energfa libre de la union para una molecula de polinucleotido con su diana (sitio de union del efector) o secuencia complementaria, es suficiente para permitir que proceda la funcion relevante del polinucleotido, p. ej., escision enzimatica de ARNm o inhibicion de la traduccion. La determinacion de las energfas libres de union para moleculas de acido nucleico son bien conocidas en la tecnica (Frier et al. 1986, Turner et al. 1987). Un porcentaje de complementariedad indica el porcentaje de bases, en una cadena contigua, en una primera molecula de polinucleotido que pueden formar enlaces de hidrogeno (p. ej., emparejamiento de bases de Watson-Crick) con una segunda secuencia de polinucleotidos (p. ej., 5, 6, 7, 8, 9, 10 de 10 siendo 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, y 100% complementaria). Perfectamente complementaria significa que todas las bases en una cadena contigua de una secuencia de polinucleotido formaran enlace de hidrogeno con el mismo numero de bases contiguas en una segunda secuencia de polinucleotido.
Por inhibicion, regulacion por disminucion o inactivacion de la expresion genica, se entiende que la expresion del gen, medida por el nivel de ARN transcrito del gen o el nivel de polipeptido, protema o subunidad de protema traducida del ARN, se reduce por debajo de la observada en ausencia de los conjugados de polinucleotidos bloqueantes de la invencion. La inhibicion, regulacion por disminucion o inactivacion de la expresion genica, con un polinucleotido suministrado por las composiciones de la invencion, es preferiblemente inferior al nivel observado en presencia de un acido nucleico inactivo de control, un acido nucleico con secuencia desordenada o con apareamientos erroneos inactivantes, o en ausencia de conjugacion del polinucleotido al polfmero enmascarado.
Administracion in vivo
En farmacologfa y toxicologfa, una via de administracion es la ruta por la que un farmaco, fluido, veneno u otra sustancia se pone en contacto con el cuerpo. En general, los metodos de administracion de farmacos y acidos nucleicos para el tratamiento de un mamffero son bien conocidos en la tecnica, y se pueden aplicar a la administracion de las composiciones de la invencion. Los compuestos de la presente invencion se pueden administrar por cualquier via adecuada, lo mas preferiblemente via parenteral, en una preparacion hecha adecuadamente para esta via. Por lo tanto, los compuestos de la presente invencion se pueden administrar por inyeccion, por ejemplo, intravenosa, intramuscular, intracutanea, subcutanea, o intraperitoneal. Por consiguiente, la presente invencion tambien proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden un vehmulo o excipiente farmaceuticamente aceptable.
Las vfas de administracion parenteral incluyen las inyecciones intravascular (intravenosa, intraarterial), intramuscular, intraparenquima, intradermica, subdermica, subcutanea, intratumoral, intraperitoneal, intratecal, subdural, epidural, e intralinfatica, que usan una jeringa y una aguja o cateter. Intravascular en la presente memoria significa dentro de una estructura tubular llamada un vaso que esta conectado a un tejido u organo dentro del cuerpo. Dentro de la cavidad de la estructura tubular, un fluido corporal fluye hacia o desde una parte del cuerpo.
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Los ejemplos de fluidos corporales incluyen sangre, Kquido cefalorraqmdeo (LCR), Kquido linfatico o bilis. Los ejemplos de vasos incluyen arterias, arteriolas, capilares, venulas, sinusoides, venas, vasos linfaticos, conductos biliares y conductos de las glandulas salivares u otras glandulas exocrinas. La ruta intravascular incluye el suministro a traves de los vasos sangumeos tales como una arteria o una vena. El sistema circulatorio de la sangre proporciona la extension sistemica del producto farmaceutico.
Las composiciones descritas se inyectan en disoluciones vehmulo farmaceuticamente aceptables. Farmaceuticamente aceptable se refiere a aquellas propiedades y/o sustancias que son aceptables para el mairnfero desde el punto de vista farmacologico/toxicologico. La frase farmaceuticamente aceptable se refiere a entidades moleculares, composiciones y propiedades que son fisiologicamente tolerables y tfpicamente no producen una reaccion alergica u otra reaccion adversa o toxica cuando se administran a un mamffero. Preferiblemente, como se usa en la presente memoria, la expresion farmaceuticamente aceptable significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o nacional o citada en la Farmacopea de EE.UU. u otra farmacopea generalmente reconocida, para usar en animales y mas en particular en seres humanos.
El conjugado del polinucleotido de ARNi-resto director se coadministra con el polfmero de suministro. Por coadministracion se entiende que el polinucleotido de ARNi y el polfmero de suministro se administran al mamffero de modo que estan presentes ambos en el mamffero al mismo tiempo. El conjugado de polinucleotido de ARNi-resto director y el polfmero de suministro se pueden administrar simultaneamente o se pueden suministrar de forma secuencial. Para la administracion simultanea, se pueden mezclar antes de la administracion. Para la administracion secuencial, se puede administrar primero el conjugado de polinucleotido de ARNi-resto director o el polfmero de suministro.
Para los conjugados de polinucleotido de ARNi-resto director hidrofobo, el conjugado de ARNi se puede administrar hasta 30 min antes de la administracion del polfmero de suministro. Tambien para los conjugados de polinucleotido de ARNi-resto director hidrofobo, el polfmero de suministro se puede administrar hasta dos horas antes de la administracion del conjugado de ARNi.
Para los conjugados de polinucleotido de ARNi-resto director de agrupacion de galactosas, el conjugado de ARNi se puede administrar hasta 15 min antes de la administracion del polfmero de suministro. Tambien para los conjugados de polinucleotido de ARNi-resto director de agrupacion de galactosas, el polfmero de suministro se puede administrar hasta 15 min antes de la administracion del conjugado de ARNi.
Efecto terapeutico
Los polinucleotidos de ARNi se pueden suministrar con fines de investigacion o para producir un cambio en una celula, es decir terapeutico. El suministro in vivo de polinucleotidos de ARNi es util para reactivos de investigacion y para una variedad de aplicaciones terapeuticas, de diagnostico, validacion de objetivos, descubrimiento genomico, ingeniena genetica y farmacogenomica. Los autores de la invencion han descrito el suministro de polinucleotido de ARNi que produce la inhibicion de la expresion de genes endogenos en hepatocitos. Los niveles de expresion de un gen indicador (marcador) medidos despues del suministro de un polinucleotido, indican una expectativa razonable de niveles similares de expresion genica despues de suministro de otros polinucleotidos. Los niveles de tratamiento considerados beneficiosos por un experto en la tecnica, difieren de una enfermedad a otra. Por ejemplo, la hemofilia A y B son causadas por deficiencias en los factores de coagulacion VIII y IX ligadas al cromosoma X, respectivamente. En su evolucion clmica influye mucho el porcentaje de los niveles normales en el suero del factor VIII o IX: < 2%, grave; 2-5%, moderada; y 5-30% leve. Por lo tanto, un aumento de 1% a 2% del nivel normal del factor de coagulacion en pacientes graves, se puede considerar beneficiosa. Niveles mayores que 6% previenen las hemorragias espontaneas pero no las secundarias a cirugfa o lesion. Igualmente, la inhibicion de un gen no es necesario que sea 100% para proporcionar un beneficio terapeutico. Un experto en la tecnica de la terapia genica prevena razonablemente los niveles beneficiosos de la expresion de un gen espedfico para una enfermedad, basandose en los niveles suficientes de los resultados del gen marcador. En la hemofilia de ejemplo, si los genes marcadores eran expresados para dar una protema en un nivel comparable en volumen a 2% del nivel normal del factor VIII, se podna esperar razonablemente que el gen que codifica el factor VIII fuera expresado tambien en niveles similares. Por lo tanto, los genes indicadores o marcadores sirven como referencias utiles para la expresion de protemas intracelulares en general.
El tugado es uno de los tejidos diana mas importantes para la terapia genica, dada su funcion central en el metabolismo (p. ej., metabolismo de lipoprotemas en diferentes hipercolesterolemias) y la secrecion de protemas circulantes (p. ej., factores de coagulacion en la hemofilia). Ademas, los trastornos adquiridos tales como la hepatitis cronica y la cirrosis son comunes y tambien son potencialmente tratadas mediante terapias en el tugado basadas en polinucleotidos. Una serie de enfermedades o afecciones que afectan o estan afectadas por el tugado son tratadas potencialmente por inactivacion (inhibicion) de la expresion genica en el tugado. Dichas enfermedades y afecciones hepaticas se pueden seleccionar de la lista que comprende: cancer de tugado (incluyendo carcinoma hepatocelular, HCC), infecciones vmcas (incluyendo hepatitis), trastornos metabolicos, (incluyendo hiperlipidemia y diabetes), fibrosis, y lesion hepatica aguda.
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La cantidad (dosis) del poffmero de suministro y el conjugado de polinucleotido de ARNi que se va a administer se puede determinar empmcamente. Se ha mostrado inactivacion eficaz de la expresion genica usando 0,1-10 mg/kg de peso animal de conjugado de ARNip y 5-60 mg/kg de peso animal de poffmero de suministro. Una cantidad preferida en ratones es 0,25-2,5 mg/kg de conjugado de ARNi y 10-40 mg/kg de poffmero de suministro. Mas preferiblemente, se administran aproximadamente 12,5-20 mg/kg de poffmero de suministro. La cantidad de conjugado de polinucleotido de ARNi se aumenta facilmente porque ffpicamente no es toxico en dosis mayores.
Como se usa en la presente memoria, in vivo significa que tiene lugar dentro de un organismo, y mas espedficamente un proceso realizado en o sobre el tejido vivo de un organismo multicelular vivo, completo (animal), tal como un mairnfero, en oposicion a una parte o uno muerto.
Ejemplos
Smtesis de poffmero
Ejemplo 1. Copoffmeros aleatorios de poli(eter vimlico).
A. Monomeros de eter vimlico para la incorporacion de monomeros que contienen amina. La 2-viniloxietil-ftalimida se preparo haciendo reaccionar el eter de 2-cloroetilo y vinilo (25 g, 0,24 mol; n° CAS 110-75-8) y ftalimida potasica (25 g, 0,135 mol; n° CAS 1074-82-4) en W,W-dimetilformamida (DMF, 75 ml) a 100°C usando bromuro de tetra-n- butilamonio (0,5 g; n° CAS 1643-19-2) como el catalizador de transferencia de fase. Esta disolucion se calento durante 6 h y despues se precipito en agua y se filtro. Este solido despues se recristalizo dos veces en metanol para dar cristales blancos.
B. Smtesis de terpoffmeros de poliamina de poli(eter vimlico) activos en la membrana, anfipaticos, solubles en agua. Se anaden X % en moles de eter vimlico con amina protegida (p. ej., 2-vinilioxietil-ftalimida) a un matraz de fondo redondo secado en horno, bajo una capa de nitrogeno en diclorometano anhidro. A esta disolucion se anaden Y % en moles de eter vimlico con grupo hidrofobo inferior (p. ej., propilo, butilo) y opcionalmente Z % en moles de eter vimlico con grupo hidrofobo superior (p. ej., dodecilo, octadecilo) (FIG. 1). Esta disolucion se pone en un bano de -50 a -78°C, y se deja que precipita la 2-viniloxietil-ftalimida. A esta disolucion se anaden 10% en moles de BFa-(OCH2CHa)2 y se deja que la reaccion proceda durante 2-3 h de -50 a -78°C. La polimerizacion se termina por la adicion de disolucion de hidroxido amonico en metanol. El poffmero se lleva a sequedad a presion reducida y despues se pone en 1,4-dioxano/metanol (2/1). Se anaden 20 eq. molares de hidrazina por ftalimida para eliminar el grupo protector de la amina. La disolucion se calienta a reflujo durante 3 h y despues se lleva a sequedad a presion reducida. El solido resultante se disuelve en HCl 0,5 mol/l y se calienta a reflujo durante 15 min para formar la sal de hidrocloruro del poffmero, se diluye con agua destilada, y se calienta a reflujo durante una hora adicional. La disolucion despues se neutraliza con NaOH, se enfna a temperatura ambiente (t.a.), se transfiere a un tubo dialisis de filtracion molecular de celulosa, se dializa contra agua destilada y se liofiliza. El poffmero se puede ademas purificar usando cromatograffa de exclusion por tamanos u otra cromatograffa. El peso molecular de los poffmeros se calcula usando columnas de acuerdo con procedimientos convencionales, incluyendo cromatograffa anafftica de exclusion por tamano molecular y cromatograffa de exclusion por tamano molecular con dispersion de luz multiangulos (SEC-MALS).
C. Smtesis de DW1360. Se sintetizo un terpoffmero de poli(eter vimlico) con amina/butilo/octadecilo a partir de los monomeros 2-viniloxietil-ftalimida (5 g, 23,02 mmol), eter de butilo y vinilo (0,665 g, 6,58 mmol), y eter de octadecilo y vinilo (0,488 g, 1,64 mmol). Se anadio la 2-viniloxietil-ftalimida a un matraz de fondo redondo de 200 ml secado en horno, que contema una barra agitadora magnetica, bajo una capa de argon en 36 ml de diclorometano anhidro. A esta disolucion se anadio eter de butilo y vinilo y eter de n-octadecilo y vinilo. Los monomeros se disolvieron completamente a temperatura ambiente (t.a.) para obtener una disolucion homogenea transparente. Despues, el recipiente de reaccion que contema la disolucion transparente se puso en un bano a -50°C generado por adicion de hielo seco a una disolucion 1:1 de alcohol desnaturalizado de calidad ACS y etilenglicol, y se dejo que se formara un precipitado visible de monomero de ftalimida. Despues de enfriar durante aproximadamente 1,5 min, se anadio BF3 (OCH2CH3)2 (0,058 g, 0,411 mmol) para iniciar la reaccion de polimerizacion. El monomero de ftalimida se disolvio tras el inicio de la polimerizacion. La reaccion se dejo avanzar durante 3 h a -50°C. La polimerizacion se detuvo por la adicion de 5 ml de hidroxido amonico al 1% en metanol. Despues los disolventes se separaron por evaporacion rotatoria.
Despues el poffmero se disolvio en 30 ml de 1,4-dioxano/metanol (2/1). A esta disolucion se anadio hidrazina (0,147 g, 46 mmol) y la mezcla se calento a reflujo durante 3 h. Despues los disolventes se separaron por evaporacion rotatoria y el solido resultante despues se puso en 20 ml de HCl 0,5 mol/l y se calento a reflujo durante 15 minutos, se diluyo con 20 ml de agua destilada, y se calento a reflujo durante una hora adicional. Despues esta disolucion se neutralizo con NaOH, se enfrio a t.a., se transifirio a tubo de dialisis de celulosa con corte de peso molecular 3.500, se dializo durante 24 h (2x20 litros) frente a agua destilada y se liofilizo.
Aunque se describen poffmeros que contienen los monomeros de eter vimlico indicados, la invencion no se limita a estos monomeros particulares.
D. Smtesis de terpoKmeros de poliamina de poliacrilato activos en la membrana, anfipaticos, solubles en agua. Los heteropoKmeros de poliacrilato y polimetacrilato se pueden sintetizar usando el esquema de reaccion de radicales libres general (como se usa en la presente memoria, un polimetacrilato-poliamina es un subgenero del genero de poliacrilato-poliamina):
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en donde R es independientemente un hidrogeno o grupo metilo y X representa los grupos colgantes de los monomeros deseados presentes en el polfmero en las relaciones deseadas.
Para la smtesis de polfmero, los monomeros adecuados incluyen, pero no se limitan a: monomeros que contienen amina protegida con BOC (M):
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en donde n = 1-4 y la eliminacion del grupo protector BOC da una amina primaria. Monomeros con grupo hidrofobo inferior (N):
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en donde n = 1-5 y uno o mas carbonos pueden estar insaturados. Monomeros con grupo hidrofobo superior (O):
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en donde n = 8-24 y uno o mas carbonos pueden estar insaturados.
Usando los monomeros anteriores, se pueden sintetizar heteropolfmeros activos en la membrana con las siguientes composiciones: M puede ser 50-90% en moles; N puede ser 10-50 % en moles; O puede ser 0-10% en moles.
E. Smtesis de terpolfmeros de poliacrilato-poliamina activos en la membrana, anfipaticos, solubles en agua.
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R, R', y R" son independientemente hidrogeno o metilo
x = 2, 3, o 4
y = 0, 1, 2, 3, 4 o 5 [metilo (C1) - hexilo (C6)] z = numero entero > 8 [decilo (C10) o mayor]
a, b, y d son numeros enteros seleccionados de modo que el polfmero tenga la relacion deseada de monomeros como se ha descrito antes.
Se anaden X % en moles de monomero de acrilato con amina protegida, Y % en moles de monomero de acrilato con grupo hidrofobo inferior, y opcionalmente Z % en moles de monomero de acrilato con grupo hidrofobo superior, a un tubo de reaccion equipado con una barra agitadora. Se anade un disolvente adecuado (p. ej., acetonitrilo o dioxano), seguido de un catalizador adecuado (p. ej., AIBN), y la mezcla de reaccion se purga con N2. Los tubos de reaccion despues se tapan y se transfieren a un bano de aceite y se calientan (p. ej., 60°C) durante un tiempo suficiente para permitir la polimerizacion (p. ej., 3 h). El poffmero bruto se puede purificar por medios adecuados, incluyendo, pero no limitado a dialisis, cromatograffa en columna y precipitacion, antes de eliminar los grupos protectores BOC. Los grupos protectores BOC se eliminan por reaccion con HCl 2 M en acido acetico glacial. La eliminacion de los grupos protectores BOC da aminas primarias en polfmero y un poliacrilato-poliamina activo en la membrana, soluble en agua. Despues el poffmero se puede purificar por medios adecuados, incluyendo dialisis, cromatograffa en columna y precipitacion.
Smtesis de (Ant 40911-3 23-28, Ant 40911-35-2). El 2,2'-azobis(2-metilpropionitrilo) (AIBN, iniciador de radicales), acetonitrilo, y dioxano se adquirieron en Sigma Aldrich. Los monomeros de acrilato y metacrilato se filtraron para separar los inhibidores. Se hizo reaccionar el 3-(BOC-amino)1-propanol (TCI) con cloruro de acriloilo (CAS 814-68-6) para producir acrilato de BOC-amino-propilo (BAPA).
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En un matraz de fondo redondo de 2 litros, equipado con una barra agitadora, se disolvio 2-(2-aminoetoxi)etanol (21,1g, 202,9 mmol) en 350 ml de diclorometano. En un matraz de 1 litro separado, se disolvio anhffdrido de BOC (36,6 g, 169,1 mmol) en 660 ml de diclorometano. El matraz de fondo redondo de 2 litros se equipo con un embudo de adicion y se anadio la disolucion de anhffdrido de BOC al matraz a lo largo de 6 h. La reaccion se dejo agitar durante la noche. En un embudo de separacion, el producto se lavo con 300 ml de cada uno de acido citrico al 10%, K2CO3 al 10%, disolucion saturada de NaHCO3, y disolucion saturada de NaCl. El producto, el 2-(2- aminoetoxi)etanol protegido con BOC, se seco sobre Na2SO4, se filtro por gravedad, y se evaporo el DCM usando evaporador rotatorio y alto vado.
En un matraz de fondo redondo de 500 ml equipado con una barra agitadora y lavado por barrido con argon, se anadio 2-(2-aminoetoxi)etanol protegido con BOC (27,836 g, 135,8 mmol), seguido de 240 ml de diclorometano anhidro. Se anadio diisopropiletilamina (35,5 ml, 203,7 mmol) y el sistema se puso en un bano de hielo seco/acetona. Se diluyo cloruro de acriloilo (12,1 ml, 149,4 mmol) usando 10 ml de diclorometano, y se anadio gota a gota al sistema barrido con argon. El sistema se mantuvo bajo argon y se dejo que llegara a temperatura ambiente y se agito durante la noche. El producto se lavo con 100 ml de cada uno de dH2O, acido citrico al 10%, K2CO3 al
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10%, disolucion saturada de NaHCO3, y disolucion saturada de NaCl. El producto, el acrilato de BOC-aminoetiletoxi (BAEEA), se seco sobre Na2SO4, se filtro por gravedad y el DCM se evaporo usando un evaporador rotatorio. El producto se purifico por cromatograffa en columna en 29 cm de sflice usando una columna de 7,5 cm de diametro. El sistema de disolventes usado era acetato de etilo al 30% en hexano. Rf: 0,30. Se recogieron las fracciones y el disolvente se separo usando un evaporador rotatorio y alto vado. El BAEEA, se obtuvo con 74% de rendimiento. El BAEEA se almaceno en un congelador.
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Polfmero 40911-3 23-28: Relacion de alimentacion en moles 70% de BAPA, 25% de metacrilato de butilo (CAS 9788-1), 5% de metacrilato de octadecilo (CAS 4813-57-4), (3% de catalizador AIBN) (moles totales 0,0139). Se anadieron BAPA (9,739 mmol) (A), metacrilato de butilo (3,478 mmol) (B), y metacrilato de octadecilo (0,6957 mmol) (D) a un tubo de reaccion de 20 ml equipado con una barra agitadora. Se anadio acetonitrilo (16 ml) seguido de AIBN (0,4174 mmol). Se repitieron las etapas anteriores con el fin de tener dos reacciones ejecutadas en tandem. La mezcla de reaccion se purgo con N2 durante 30 min. Despues los tubos de reaccion se taparon y se transfirieron a un bano de aceite y se calentaron a 60°C durante 3 h. Despues se retiraron los tubos y se combinaron los contenidos. El polfmero bruto precipito en agua desionizada, y se hizo reaccionar con acido trifluoroacetico solo (40
ml) durante 1,5 h para eliminar los grupos protectores BOC y producir aminas primarias y un poliacrilato-poliamina activo en la membrana soluble en agua. Se anadieron 200 ml de H2O desionizada (dH2O) a la reaccion, la disolucion se transfirio a un tubo de dialisis de celulosa con corte de exclusion de PM 3500, se dializo frente a disolucion salina alta durante 24 h, despues frente a dH2O durante 18 h. El contenido se evaporo hasta sequedad, se disolvio en 100 ml de dH2O y se liofilizo. El polfmero secado se disolvio en disolucion al 50% de MeOH/formiato amonico 100 mM/acido formico al 0,2%, a concentracion de 25 mg/ml. Se purificaron tres inyecciones de disolucion de polfmero bruto (250 mg, 10 ml) en medio S-200 Sephacryl usando una columna XK50/30 cm con un caudal de 5,0 ml/min. La columna se empaqueto y uso de acuerdo con las instrucciones del fabricante. (GE Healthcare, instrucciones 561130-82 A1, 52-2086-00 AK). La elucion del polfmero se detecto usando un colector de mdice de refraccion Shimadzu RID-10A. Se recogieron las fracciones de 23 min a 28 min y se combinaron para cada ejecucion. Se evaporo el disolvente y el polfmero purificado se liofilizo dos veces.
Polfmero Ant 40911-35-2: Relacion de alimentacion en moles 80% de BAEEA, 15% de metacrilato de butilo, 5% de acrilato de octadecilo, (3% de catalizador AIBN) (moles totales 0,013913). Se anadieron BAEEA (A) (11,13 mmol), metacrilato de butilo (B) (2,086 mmol), y acrilato de octadecilo (D) (0,6957 mmol) a un tubo de reaccion de 20 ml equipado con una barra agitadora. Se anadio dioxano (16 ml) seguido de AIBN (0,4174 mmol). Se repitieron las etapas anteriores con el fin de tener dos reacciones ejecutadas en tandem. La mezcla de reaccion se purgo con N2 durante 30 min. Despues los tubos de reaccion se taparon y se transfirieron a un bano de aceite y se calentaron a 60°C durante 3 h. Despues se retiraron los tubos y se combinaron los contenidos. Se evaporo el dioxano mediante evaporador rotatorio y alto vacm y el polfmero bruto se disolvio en disolucion de 89,8% de diclorometano/10% de tetrahidrofurano/0,2% de trietilamina a 70 mg/ml. Se purificaron tres inyecciones de disolucion de polfmero bruto (700 mg, 10 ml) en una columna de Jordi Gel de divinilbenceno de 104 A (diametro interno: 22 mm, longitud: 500
mm) usando con un caudal de 5,0 ml/min. La elucion del polfmero se detecto usando el colector de mdice de refraccion Shimadzu RID-10A. Se recogieron las fracciones de 15,07 min-17,13 min y se combinaron. El disolvente se evaporo mediante evaporador rotatorio.
Se disolvieron aproximadamente 10 mg de polfmero en 0,5 ml de 89,8% de diclorometano, 10% de tetrahidrofurano, 0,2% de trietilamina. El peso molecular y la polidispersidad (PDI) se midieron usando un detector de dispersion de luz multiangulos Wyatt Helos II conectado a un HPLC Shimadzu Prominence usando una columna Jordi de DVB de 5 |j 7,8x300 Mixed Bed LS. Se obtuvo un peso molecular de 172.000 y una PDI de 1,26.
El polfmero protegido con BOC purificado se hizo reaccionar con acido trifluoroacetico solo (7 ml) durante 1,5 h (o HCl 2 M en acido acetico glacial durante 0,5 h) para eliminar los grupos protectores BOC y producir las aminas. Se anadieron 40 ml de dH2O a la reaccion, la disolucion se transfirio a un tubo de dialisis de celulosa con corte de exclusion de PM 3500, se dializo frente a disolucion salina alta durante 24 h, despues frente a dH2O durante 18 h. El contenido se evaporo hasta sequedad, despues se disolvio en 20-30 ml de dH2O y se liofilizo dos veces. La disolucion de polfmero se almaceno a 2-8°C.
El numero de atomos de carbono que unen la amina a la cadena principal del polfmero y si el conector esta o no ramificado, afecta al pKa de la amina y efectos estericos cerca de la amina. Por ejemplo, para los polfmeros anteriores, la etilamina tiene un pKa de aproximadamente 8,1, la propilamina tiene un pKa de aproximadamente 9,3, y la pentilamina tiene un pKa de aproximadamente 10,2. El pKa de la amina o efectos estericos cerca de la amina, afectan a la labilidad de los grupos enmascaradores unidos a la amina. Para la union reversible de un antndrido maleico a una amina, un pKa mayor de la amina produce una velocidad mas lenta de liberacion de un antndrido de
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la amina. Tambien el aumento del impedimento esterico cerca de la amina, tal como con un conector isopropilo, puede aumentar el pKa de la amina.
Polfmero Lau 41305-38-17-19: Relacion de alimentacion en moles 80% de BAPA, 20% de metacrilato de metilo (CAS 97-63-2), (3% de catalizador AIBN) (moles totales 0,0105). Se anadieron BAPA (A) (8,40 mmol) y metacrilato de metilo (B) (2.10 mmol) a un tubo de reaccion de 15 ml equipado con una barra agitadora. Se anadio acetonitrilo (11,5 ml) seguido de AIBN (0,315 mmol). Se repitieron las etapas anteriores con el fin de tener dos reacciones ejecutadas en tandem. La mezcla de reaccion se purgo con N2 durante 30 min. Despues los tubos de reaccion se taparon y se transfirieron a un bano de aceite y se calentaron a 60°C durante 3 h. Despues se retiraron los tubos y se combinaron los contenidos. Se evaporo el acetonitrilo mediante evaporador rotatorio y alto vado y el polfmero bruto se disolvio en disolucion de 74,8% de diclorometano/25% de tetrahidrofurano/0,2% de trietilamina hasta 50 mg/ml. Se purificaron tres inyecciones de disolucion de polfmero bruto (500 mg, 10 ml) en una columna de Jordi Gel de divinilbenceno fluorado de 104 A (diametro interno: 22 mm, longitud: 500 mm) usada con un caudal de 5,0 ml/min. La elucion del polfmero se detecto usando el colector de mdice de refraccion Shimadzu RID-10A. Se recogieron las fracciones de 17,16 min-19,18 min y se combinaron. El disolvente se evaporo por evaporacion rotatoria. El polfmero protegido con BOC purificado se hizo reaccionar con HCl 2 M en acido acetico glacial (7 ml) durante 1,5 h para eliminar los grupos protectores BOC y producir las aminas. Se anadieron 40 ml de dH2O a la reaccion, la disolucion se transfirio a un tubo de dialisis de celulosa con corte de exclusion de PM 3500, se dializo frente a disolucion salina alta durante 24 h, despues frente a dH2O durante 18 h. El contenido se evaporo hasta sequedad, despues se disolvio en 30 ml de dH2O y se liofilizo dos veces.
F. Se preve que polfmeros similares, sintetizados a partir de monomeros de amina (protegida), monomeros con grupos hidrofobos inferiores, y grupos hidrofobo superiores octadecilo seran eficaces en la practica de la invencion descrita.
Caracterizacion de polfmeros Ejemplo 2. Caracterizacion de DW1360.
A. Analisis anfipatico. La fluorescencia del 1,6-difenil-1,3,5-hexatrieno (DPH, Invitrogen) (Aex = 350 nm; Aem = 452 nm) se potencia en un entorno hidrofobo. Este fluoroforo se uso para analizar el polfmero DW1360. Se anadio DPH 0,5 |jM (concentracion final) a 10 |jg de DW1360 en 0,5 ml de tampon HEPES 50 mM, pH 8,0. Despues se ensayo en la solucion la acumulacion de dPh en un entorno hidrofobo midiendo la fluorescencia del DPH. La mayor fluorescencia del DPH en presencia de los conjugados indica la formacion de un entorno hidrofobo por el polfmero.
B. Peso molecular. Los pesos (masas) moleculares PM de los polfmeros se determinaron en un detector Wyatt Dawn Heleos II junto con optilab rEX en modo de lotes. Los polfmeros se llevaron hasta diferentes concentraciones en disolvente adecuado y se cargo cada uno en el sistema Wyatt. Con el programa Astra despues se calcularon los cambios en el mdice de refraccion en funcion de la concentracion (dn/dc) que se uso en un grafico de Zimm para calcular el PM. El peso molecular medio determinado para el DW1360 purificado era 4000-6000 Da. El peso molecular medio para los polfmeros de acrilato purificados era aproximadamente 100-120 kDa.
C. Analisis de partmulas y potencial zeta. El potencial zeta de los polfmeros se midio usando un instrumento Series Malvern Zetasizer nano (Nano ZS). El potencial zeta de los polfmeros enmascarados con CDM vanaba entre 0 y -30 mV y de forma mas predominante entre 0 y -20 mV. El potencial zeta se midio en glucosa isotonica tamponada a pH 8 con HEPES residual. A pH 7, se espera que los conjugados ganen alguna carga positiva debido a la protonacion de algunas aminas.
D. Cuantificacion de los grupos amina en conjugado despues de modificacion con reactivo CDMEl polfmero DW1360 se sintetizo como se ha descrito previamente seguido de tratamiento con 14 equivalentes en peso de base HEPES y 7 equivalentes en peso de una mezcla 2:1 en p:p de CDM-NAG y CDM-PEG (media 11 unidades). Una hora mas tarde, el contenido de amina del conjugado tratado con derivado de anhfdrido maleico se midio por tratamiento con acido trinitrobencenosulfonico (TNBS) en NaHCO3 100 mM. Cuando se normalizo respecto a un conjugado que no se habfa modificado con maleamato, se determino que la cantidad de aminas modificadas era aproximadamente 75% del total. Este grado de modificacion se puede variar cambiando la cantidad de anhfdrido maleico anadida o alterando las condiciones de reaccion.
E. Lisis de liposomas. Se hidrataron 10 mg de fosfatidilcolina de huevo con 1 ml de tampon que contema carboxifluorescema 100 mM (CF) y HEPES 10 mM pH 7,5. Despues los liposomas se extruyeron a traves de filtros de policarbonato de poros de 100 nm (Nucleopore, Pleasanton, CA). La CF no atrapada se elimino por cromatograffa de exclusion por tamano molecular usando Sepharose 4B-200 eluyendo con HEPES 10 mM a pH 8 y NaCl 0,1 mol/l. Se anadio una parte almuota de 200 jl de liposomas cargados con CF a 1,8 ml de tampon isotonico. Se midio la fluorescencia (Aex=488, Aem=540) 30 min despues de la adicion de 0,25 jg de polfmeros a las suspensiones de vesmulas. Al final de cada experimento, las vesmulas se alteraron por la adicion de 40 jl de una disolucion de Triton X-100 al 1% para determinar la lisis maxima.
Agentes de enmascaramiento del polfmero
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Ejemplo 3. Agentes de enmascaramiento.
A. Smtesis del precursor del agente de enmascaramiento anhndrido 2-propionico-3-metilmaleico (anhndrido carboxidimetilmaleico o CDM).
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A una suspension de hidruro sodico (0,58 g, 25 mmol) en 50 ml de tetrahidrofurano anhidro se anadio 2- fosfonopropionato de trietilo (7,1 g, 30 mmol). Despues de parar la evolucion de hidrogeno gaseoso, se anadio 2- oxoglutarato de dimetilo (3,5 g, 20 mmol) en 10 ml de tetrahidrofurano anhidro y se agito durante 30 min. Despues se anadieron 10 ml de agua, y el tetrahidrofurano se elimino por por evaporacion rotatoria. La mezcla de solido y agua resultante se extrajo con 3x50 ml de eter etflico. Las extracciones con eter se combinaron, se secaron con sulfato magnesico y se concentraron hasta un aceite amarillo claro. El aceite se purifico por cromatograffa en gel de silice, elucion con eter:hexano 2:1 para dar 4 g (82% de rendimiento) del triester puro. Despues se formo el anhfdrido 2-propionico-3-metilmaleico disolviendo este triester en 50 ml de una mezcla de agua y etanol 50/50 que contema 4,5 g (5 equivalentes) de hidroxido potasico. Esta disolucion se calento a reflujo durante 1 h. Despues se separo el etanol por evaporacion rotatoria y la disolucion se acidifico a pH 2 con acido clorhfdrico. Esta disolucion acuosa despues se extrajo con 200 ml de acetato de etilo, se aislo, se seco con sulfato magnesico y se concentro hasta un solido blanco. Despues este solido se recristalizo en diclorometano y hexano para dar 2 g (80% de rendimiento) de anhfdrido 2-propionico-3-metilmaleico.
Se pueden sintetizar tioesteres, esteres y amidas a partir del CDM por conversion del CDM en su cloruro de acido con cloruro de oxalilo seguido de la adicion de un tiol, ester o amina y piridina. El CDM y sus derivados se modifican facilmente, por metodos convencionales en la tecnica, con ligandos directores, estabilizantes estericos, grupos cargados y otros grupos reactivos. Las moleculas resultantes se pueden usar para modificar aminas reversiblemente.
Los agentes de enmascaramiento se sintetizaron por modificacion del CDM para producir preferiblemente agentes de carga neutra:
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en donde R1 comprende un ligando que dirige al ASGPr o estabilizante esterico (p. ej. PEG).
B. Agente de enmascaramiento que contiene un grupo que dirige al ASGPr. Los ligandos que dirigen a hepatocitos mas ampliamente estudiados se basan en galactosa, que se une por el receptor de asialoglicoprotema (ASGPr) en los hepatocitos. Se ha mostrado que la union de galactosa o un derivado de galactosa facilitan el direccionamiento a los hepatocitos de algunos polfmeros no cargados, muy solubles, que incluyen: el oligosacarico chitosan, un derivado de poliestireno y una poliacrilamida HPMA. Los grupos que dirigen al ASGPr se generan facilmente usando lactosa, un disacarido de galactosa-glucosa, por modificacion del resto de glucosa. El acido lactobionico (LBA), un derivado de lactosa en el que la glucosa se ha oxidado a acido gluconico) se incorpora rapidamente a un derivado de anhfdrido maleico usando tecnicas de acoplamiento de amida convencionales.
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C. Smtesis de estabilizante esterico CDM-PEG y grupo director CDM-NAG (N-acetil-galactosamina). A una solucion de CDM (300 mg, 0,16 mmol) en 50 ml de cloruro de metileno, se anadio cloruro de oxalilo (2 g, 10 eq. en peso) y dimetilformamida (5 jl). La reaccion se dejo avanzar durante la noche, despues de lo cual el exceso de cloruro de oxalilo y cloruro de metileno se elimino con evaporador rotatorio para dar el cloruro de acido CDM. El cloruro de acido se disolvio en 1 ml de cloruro de metileno. A esta disolucion se anadieron 1,1 equivalentes molares de eter monometflico del polietilenglicol (PM medio 550) para CDM-PEG o (aminoetoxi)etoxi-2-(acetilamino)-2-desoxi-p-D- galactopiranosido (es decir, amino-bisetoxil-etil-NAG) para CDM-NAG, y piridina (200 jl, 1,5 eq) en 10 ml de cloruro de metileno. La disolucion despues se agito 1,5 h. Despues se separo el disolvente y el solido resultante se disolvio en 5 ml de agua y se purifico usando HPLC de fase inversa usando un gradiente de agua con TFA al 0,1%/acetonitrilo.
imagen22
Preferiblemente, se une PEG que contiene de 5 a 20 unidades de etileno al anhfdrido maleico disustituido. Mas preferiblemente, se une PEG que contiene de 10-14 unidades de etileno al anhndrido maleico disustituido. El PEG puede ser de longitud variable y tener una longitud media de 5-20 o 10-14 unidades de etileno. Alternativamente, el PEG puede ser monodisperso, uniforme o discreto; teniendo, por ejemplo, exactamente 11 o 13 unidades de etileno.
imagen23
Como se ha mostrado antes, un espaciador de PEG se puede colocar entre el grupo anhndrido y el grupo que dirige al ASGPr. Un espaciador de PEG preferido contiene 1-10 unidades de etileno.
imagen24
Modificacion de polfmeros reversible
Ejemplo 4. Modificacion/enmascaramiento reversible de la poliamina activa en la membrana; es decir, modificacion del polfmero activo en la membrana con CDM-NAG o una mezcla de CDM-NAG mas CDM-PEG. A una disolucion de x mg de poliamina activa en la membrana (p. ej., DW1360 descrito antes) en glucosa isotonica, se anadieron 14* mg de base libre de HEPES seguido de 7* mg de CDM-NAG o una mezcla de 2,3x mg de CDM-NAG y 4,6* mg de CDM-PEG, para un total de 7* agente de enmascaramiento anhndrido maleico disustituido. Despues la disolucion se incubo durante al menos 30 min a t.a. antes de la administracion animal. La reaccion de CDM-NAG o CDM-PEG con la poliamina dio:
imagen25
en donde R es el poKmero y R1 comprende un resto que dirige a ASGPr o estabilizante esterico. El antndrido- carboxilo producido en la reaccion entre el antndrido y la amina del polfmero presenta ~1/20a parte de la carga esperada (Rozema et al. Bioconjugate Chemistry 2003). Por lo tanto, el polfmero activo en la membrana se 5 neutraliza eficazmente en lugar de convertirse en un polianion con carga negativa alta.
Conjugado de siRNA
Ejemplo 5. Conjugados de polinucleotido de ARNi-resto director
A. Conjugado de ARNip-grupo hidrofobo. Se unieron covalentemente diferentes grupos hidrofobos a los extremos 3' o 5' de moleculas de ARNip usando tecnicas convencionales en la materia.
10 B. Conjugado de ARNip-agrupacion de GalNAc. La agrupacion de GalNAc se hizo por union de tres grupos GalNAc- PEG3 a las aminas en un punto de ramificacion de dilisina. El grupo carboxilo en la dilisina esta entonces disponible para la union covalente al polinucleotido de ARNi, tal como un ARNip.
imagen26
Suministro in vivo de ARNip
15 Ejemplo 6. Administracion de polinucleotidos de ARNi in vivo y suministro a hepatocitos. Los conjugados del polinucleotido de ARNi y los polfmeros enmascarados se sintetizaron como se ha descrito antes. Se obtuvieron ratones de 6 a 8 semanas de edad (cepa C57BL/6 o ICR, -18-20 g cada uno) de Harlan Sprague Dawley (Indianapolis IN). Los ratones se alojaron al menos 2 dfas antes de la inyeccion. La alimentacion se realizo a voluntad con dieta para roedores Harlan Teklad (Harlan, Madison WI). Los conjugados del polinucleotido de ARNi y 20 los polfmeros enmascarados se sintetizaron como se ha descrito antes. Se inyectaron a los ratones 0,2 ml de disolucion de polfmero de suministro y 0,2 ml de conjugados de ARNip en la vena de la cola. Para la inyeccion simultanea del polfmero y el ARNip, el conjugado de ARNip se anadio al polfmero modificado antes de la inyeccion, y se inyecto la cantidad entera de 0,4 ml. La composicion era soluble y no se agregaba en condiciones fisiologicas. Para inyecciones en las que el polfmero y el ARNip se inyectan por separado, el polfmero se inyecto en 0,2 ml de 25 disolucion de formulacion y el ARNip se inyecto en 0,2 ml de glucosa isotonica. Las disoluciones se inyectaron por infusion en la vena de la cola. La inyeccion en otros vasos, p. ej., inyeccion retroorbital, era igualmente eficaz.
Determinacion de los niveles de ApoB en el suero. Los ratones se dejaron en ayunas durante 4 h (16 h para ratas) antes de recoger suero por sangrado submandibular. Los niveles de protema ApoB en el suero se determinaron por metodos ELISA de tipo sandwich convencionales. Brevemente, se uso un anticuerpo policlonal de cabra anti-ApoB
de raton y un anticuerpo de conejo anti-ApoB de raton (Biodesign International) como anticuerpos de captura y deteccion, respectivamente. Despues se aplico un anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo conjugado con HRp (Sigma) para unirse al complejo de ApoB/anticuerpo. Despues se midio la absorbancia del desarrollo colorimetrico de la tetrametil-benzidina (TMB, Sigma) por un lector de microplacaTecan Safire2 (Austria, Europa) a 450 nm.
5 Mediciones de la actividad del factor VII (F7) plasmatico. Las muestras de plasma de los ratones se prepararon recogiendo sangre (9 volumenes) por sangrando submandibular, en tubos de microcentnfuga que conteman anticoagulante citrato sodico 0,109 mol/l (1 volumen) siguiendo procedimientos convencionales. La actividad del F7 en el plasma se midio con un metodo cromogenico usando un kit BIOPHEN VII (Hyphen BioMed/Aniara, Mason, OH) siguiendo las recomendaciones del fabricante. La absorbancia del desarrollo colorimetrico se midio usando un lector 10 de microplaca Tecan Safire2 a 405 nm.
Ejemplo 7. Suministro de ARNip a hepatocitos in vivo usando conjugados de ARNip-grupo hidrofobo coadministrados con polfmero de suministro DW1360 enmascarado. El ARNip y el polfmero de suministro se prepararon y administraron como se ha descrito antes usando las dosis indicadas de ARNip y polfmero.
A. Suministro de polinucleotido de ARNi a hepatocitos in vivo. La coadministracion del conjugado de ARNip- 15 colesterol y polfmero de suministro DW1360 enmascarado produjo menores niveles de protema ApoB en el suero, indicando el suministro del ARNip a los hepatocitos y la inhibicion de la expresion del gen apoB. El suministro eficaz requena tanto el polfmero de suministro como la conjugacion del colesterol con el polinucleotido de ARNi (tabla 1, FIG. 2). No se observo inactivacion significativa con hasta 5 mg/kg de ARNip no conjugado. Ademas, el grupo hidrofobo se podfa unir al extremo 5' o 3' del ARNip.
20 Tabla 1. Inactivacion del gen diana in vivo despues de inyeccion del conjugado de ARNip-grupo hidrofobo mas polfmero de suministro DW1360, efecto de la dosis de conjugado de ARNip.
ARNip
dosis de ARNip (mg/kg) Dosis de polfmero (mg/kg) % relativo de ApoBa,D
5'-colesterol apoB
0,1 20 75 ±5
0,25 20 42 ±3
0,5 20 25 ±6
1 20 26 ±17
3'-colesterol apoB
1 20 25 ±2
5 0 102 ±33
ARNip no conjugado
0,5 16 87 ±4
5 16 71 ±20
aPorcentaje de inactivacion con respecto al grupo de control (n=3) inyectado con disolucion de glucosa isotonica.
bratones ICR
B. Efecto del tamano del grupo hidrofobo en el suministro del polinucleotido de ARNi a hepatocitos. El suministro 25 eficaz del ARNip a hepatocitos usando la coadministracion con el polfmero de suministro DW1360 requena que el ARNip se conjugara con un grupo hidrofobo que tuviera aproximadamente 20 o mas atomos de carbono (Tabla 2, FIG. 3). Los conjugados de ARNip-grupo hidrofobo que teman restos directores hidrofobos con menos de 20 atomos de carbono presentaban progresivamente menos suministro funcional eficaz. Los restos directores hidrofobos que teman seis (6) o menos carbonos eran ineficaces. La eficacia del suministro no mejoro significativamente 30 aumentando el tamano del resto director hidrofobo mas alla de 20 atomos de carbono.
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Tabla 2. Inactivacion del gen diana in vivo despues de inyeccion del conjugado de ARNip-grupo hidrofobo mas poKmero de suministro DW1360, efecto del tamano del grupo hidrofobo.
ARNip
Atomos de carbono b dosis de ARNip (mg/kg) Dosis de polfmero (mg/kg) % relativo de Factor VIIa,c
5'-hexilo VII
6 2,5 12,5 108 ±18
5'-dodecilo fVII
12 2,5 12,5 66 ±18
5'-octadecilo fVII
18 2,5 12,5 61 ±19
5'-(decilo)2 fVII
20 2,5 12,5 31 ±8
5'-(dodecilo)2 fVII
24 2,5 12,5 15 ±5
5'-colesterol fVII
27 2,5 12,5 15 ±3
5'-(octadecilo)2 fVII
36 2,5 12,5 16 ±3
aPorcentaje de inactivacion con respecto al grupo de control (n=3) inyectado con disolucion de glucosa isotonica. b numero de atomos de carbono en el grupo hidrofobo conjugado con el ARNip c ratones C57BL/6
C. Efecto de la dosis de ARNip en el suministro de conjugados de ARNip-grupo hidrofobo a hepatocitos. La inactivacion de la expresion del gen diana in vivo depende de la dosis de ARNip. Para el tratamiento de ratones, la administracion de dosis de ARNip de mas 1,25 mg/kg no mejoro la inactivacion del gen diana in vivo (Tabla 3, FIG. 4). Sin embargo, una dosis tan baja como 0,25 mg/kg proporciono inactivacion significativa de la expresion del gen diana en ratones cuando se coadministro con el polfmero de suministro.
Tabla 3. Inactivacion del gen diana in vivo despues de inyeccion del conjugado de ARNip-grupo hidrofobo mas polfmero de suministro DW1360, efecto de la dosis de ARNip.
ARNip
dosis de ARNip (mg/kg) Dosis de polfmero (mg/kg) % relativo de Factor VIIa,b
5'-(dodecilo)2 fVII
2,5 12,5 15 ±5
1,25
12,5 25 ±6
0,5
12,5 44 ±14
0,25
12,5 61 ±8
5'-(octadecilo)2 fVII
2,5 12,5 16 ±3
1,25
12,5 12 ±9
0,5
12,5 23 ±10
0,25
12,5 25 ±3
5'-colesterol fVII
2,5 12,5 15 ±3
1,25
12,5 9 ±1
0,5
12,5 31 ±8
0,25
12,5 28 ±11
aPorcentaje de inactivacion con respecto al grupo de control (n=3) inyectado con disolucion de glucosa isotonica. b ratones C57BL/6
D. La inactivacion de la expresion del gen diana in vivo depende de la dosis de polmero de suministro. Para el tratamiento de ratones, la administracion de aproximadamente 12,5 mg/kg de polfmero de suministro proporciono el suministro de polinucleotido de ARNi maximo o casi maximo, puesto de manifiesto por la inactivacion del gen diana
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(Tabla 4, FIG. 5). A la inactivacion del gen diana le afecta la dosis de poKmero. El exceso de conjugado de ARNip no mejoro la inactivacion del gen diana en ausencia de suficiente polfmero de suministro.
Tabla 4. Inactivacion del gen diana in vivo despues de inyeccion del conjugado de ARNip-grupo hidrofobo mas polfmero de suministro DW1360, efecto de la dosis de polfmero de suministro.
ARNip
dosis de ARNip (mg/kg) Dosis de polfmero (mg/kg) % relativo de ApoB a
1 5 112 ±11 b
1 8,75 54 ±20 b
1 12,5 27 ±5 b
1 17,5 28 ±14 b
3'-colesterol apoB
1 25 12 ±4 b
1 3,75 91 ±21 c
1 7 59 ±30 c
1 12,5 38 ±19 c
10 3,75 74 ±13 c
10 7 71 ±24 c
aPorcentaje de inactivacion con respecto al grupo de control (n=3) inyectado con disolucion de glucosa isotonica. b ratones ICR c ratones C57BL/6
E. Administracion secuencial. El conjugado de polinucleotido de ARNi-resto director hidrofobo y el polfmero de suministro se administraron al animal de forma secuencial. Para los conjugados de polinucleotido de ARNi-resto director hidrofobo, el conjugado de ARNi se puede administrar hasta 30 min antes de la administracion del polfmero de suministro. Tambien para los conjugados de polinucleotido de ARNi-resto director hidrofobo, el polfmero de suministro se puede administrar hasta dos horas antes de la administracion del conjugado de ARNi (Tabla 5).
Tabla 5. Inactivacion del gen diana in vivo despues de inyeccion de conjugado de ARNip-grupo hidrofobo mas polfmero de suministro DW1360, efecto de la administracion secuencial del ARNip y el polfmero.
ARNip
Primera inyeccion Intervalo Segunda inyeccion % relativo de ApoBa
5'-colesterol apoB
ARNip 0,5 mg/kg 15 min polfmero 12,5 mg/kg 25 ±5
30 min
35 ±13
120 min
90 ±20
polfmero 12,5 mg/kg
120 min ARNip 0,5 mg/kg 20 ±5
3'-colesterol apoB
ARNip 0,5 mg/kg 0 min polfmero 12,5 mg/kg 27 ±11
15 min
25 ±9
30 min
34 ±12
polfmero 12,5 mg/kg
15 min ARNip 0,5 mg/kg 41 ±6
30 min
41 ±15
aPorcentaje de protema con respecto al grupo de control (n=3) inyectado con disolucion de glucosa isotonica.
F. Polfmero de suministro de poliacrilato activos en la membrana. Las poliacrilato-poliaminas activas en membrana, anfipaticas, enmascaradas reversiblemente, funcionan como polfmeros de suministro eficaces. Los polfmeros de poliacrilato se prepararon como se ha descrito antes y se coadministraron con conjugados de ARNip-colesterol a ratones como se ha descrito para los polfmeros de suministro DW1360. Los polfmeros de suministro de poliacrilato eran eficaces para facilitar el suministro de ARNip a hepatocitos in vivo, como indica la disminucion de ApoB en el
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suero (Tabla 6). El suministro eficaz requena tanto el poKmero de suministro como la conjugacion del colesterol con el polinucleotido de ARNi.
Tabla 6. Inactivacion del gen diana in vivo despues de inyeccion del conjugado de ARNip-grupo hidrofobo mas polfmeros de suministro de poliacrilato enmascarados.
Polfmero de poliacrilato
ARNip dosis de ARNip (mg/kg) Dosis de polfmero (mg/kg) % relativo de ApoB
Ant 40911-3 23-38
5'-colesterol apoB 0,5 15 14 ±4
Ant 40911-35-2
5'-colesterol apoB 0,5 20 23±10
G. El suministro del conjugado de polinucleotido de ARNip-grupo hidrofobo en el hngado no dependfa del receptor de LDL o de la protema relacionada con el receptor de lipoprotema. La coadministracion del conjugado de ARNip para factor VII-colesterol y el polfmero de suministro DW1360 enmascarado produjo disminucion en el suero de los niveles de protema factor VII en ratones con inactivacion genica del receptor LDL y ratones con inactivacion genica doble de la protema relacionada con el receptor de lipoprotema/receptor de LDL. Por lo tanto, el ARNip-colesterol se dirige a los hepatocitos mediante otros distintos de las partmulas LDL, recetor de LDL o protema relacionada con el receptor de lipoprotema (tabla 7).
Tabla 7. Inactivacion del gen diana in vivo despues de inyeccion del conjugado de ARNip-colesterol mas polfmero de suministro DW1360; efecto del receptor de LDL y protema relacionada con el receptor de lipoprotema en el suministro de ARNip
ARNip
Dosis de ARNip (Mg) Dosis de polfmero3 (Mg) Modificacion del polfmero % relativo de Factor VIIa
Ratones con inactivacion genica del receptor de LDL
colesterol-ARNip para Factor VII
0 0 100 ±18
20
400 NAG + PEG 35 ±18
20
400 NAG 26 ±7
20
400 PEG 99 ±9
Ratones con inactivacion genica doble de la prote'ma relacionada con el receptor de lipoprote'ina /receptor de LDL
colesterol-ARNip para Factor VII
0 0 100 ±20
20
400 NAG + PEG 11 ±4
20
400 NAG 26 ±9
20
400 PEG 88 ±26
a % relativo de protema
H. Muestras de poli(eter vimlico) liofilizadas. Para ensayar si el polfmero de suministro se podfa liofilizar para mejorar el almacenamiento y transporte, el polfmero de suministro en disolucion se congelo y se puso con alto vado en un liofilizador. Despues de 16 h, la muestra era un polvo cristalino que despues se volvio a disolver por adicion de agua desionizada. A la muestra de polfmero redisuelto se le anadio ARNip (5'-colesterol apoB), y se inyecto la muestra. La liofilizacion no mostro efectos perjudiciales en el polfmero de suministro.
ARNip dirigido por agrupacion de galactosas
Ejemplo 8. Suministro de ARNip a hepatocitos in vivo usando conjugados de ARNip-agrupacion de galactosas coadministrados con polfmero de suministro DW1360 enmascarado. El ARNip y el polfmero de suministro se prepararon y administraron como se ha descrito antes usando las dosis indicadas de ARNip y polfmero.
A. Coadministracion de conjugado de ARNip-agrupacion de galactosas y polfmero de suministro DW1360 enmascarado. La coadministracion del conjugado de ARNip-agrupacion de galactosas y polfmero de suministro DW1360 enmascarado produjo menores niveles de protema ApoB en el suero, indicando el suministro del ARNip a los hepatocitos y la inhibicion de la expresion del gen apoB. El suministro eficaz requena tanto el polfmero de suministro como la conjugacion de la agrupacion de galactosas con el polinucleotido de ARNi (tabla 8). No se
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observo inactivacion significativa con hasta 5 mg/kg de ARNip no conjugado. Como con el conjugado hidrofobo de ARNip anterior, el inicio de la inhibicion maxima se obtiene con una dosis de polfmero de suministro de aproximadamente 12,5 mg/kg. No se observo inactivacion del gen diana en ausencia de polfmero de suministro coadministrado. El conjugado de agrupacion de galactosas-ARNip no presento actividad por sf mismo.
Tabla 8. Inactivacion del gen diana in vivo despues de inyeccion del conjugado de ARNip-agrupacion de galactosas mas polfmero de suministro, efecto de la dosis de polfmero.
ARNip
dosis de ARNipa (mg/kg) Dosis de polfmeroa (mg/kg) % relativo de ApoBb
5'-agrupacion de GalNAc apoB
0,5 10 48 ±9
0,5
20 26 ±12
0,5
40 15 ±6
0,5
60 18 ±10
ARNip no conjugado
0,5 16 87 ±4
mg de ARNip o polfmero por kilogramo de peso animal
b % relativo de protema
B. ARNip-agrupacion de galactosas frente a ARNi-monomero de galactosa. El suministro funcional del ARNip a hepatocitos in vivo cuando se coadministraba con polfmero de suministro, requena un resto director de galactosa triantenaria conjugado con el polinucleotido de ARN interferente. No se observo inactivacion del gen diana cuando se conjugo una sola molecula de galactosa al ARNip (tabla 9). Se sabe que el derivado de galactosa GalNPr (N- propionil-galacosamina) tiene una afinidad mayor por el ASGPr que el derivado de galactosa GalNAc (N-acetil- galactosamina), indicando ademas la necesidad de la agrupacion de galactosas triantenaria para el suministro eficaz.
Tabla 9. Inactivacion del gen diana in vivo despues de inyeccion del conjugado de ARNip-agrupacion de GalNAc mas polfmero de suministro; conjugado de ARN y galactosa trivalente frente a monovalente.
ARNip
Ligando dosis de ARNipa (mg/kg) Dosis de polfmeroa (mg/kg) % relativo de dosis b
apoB
5'-GalNPr monomeroc 0,25 12,5 100 ±7
5'-agrupacion de GalNAcd
0,25 12,5 56 ±11
amg de ARNip o polfmero por kilogramo de peso animal
b% relativo de protema
cmonomero de N-Propionil-galactosamina
dAgrupacion de N-Acetil-Galactosamina (tnmero)
C. Efecto de la modificacion del polfmero con derivado de galactosa, PEG o derivado de galactosa mas PEG. El ARNip-agrupacion de galactosas y el polfmero de suministro se prepararon como se ha descrito antes, excepto en lo siguiente: el polfmero de suministro se enmascaro con N-acetilgalactosamina solo, PEG solo, o N- acetilgalactosamina mas PEG. Despues se administraron el ARNip y el polfmero de suministro a ratones como se ha descrito antes. Despues se recogieron muestras de sangre de ratones y se analizaron para determinar los niveles de ApoB. Tanto la galactosa como el PEG eran necesarios para el suministro optimo. Al modificar el polfmero activo en la membrana tanto con galactosa como con PET, solo era necesaria la mitad de la dosis de ARNip para lograr el mismo efecto que el polfmero modificado solo con galactosa. La modificacion del polfmero con PEG solo produjo la disminucion del suministro de ARNip comparado con el polfmero modificado con galactosa solo o con galactosa mas PEG.
Tabla 10. Inactivacion del gen diana in vivo despues de inyeccion del conjugado de ARNip-agrupacion de GalNAc mas polfmero de suministro; efecto de la modificacion del poUmero.
ARNip
dosis de ARNipa (mg/kg) Dosis de polfmeroa (mg/kg) Modificacion del polfmero % relativo de ApoBb
5'-agrupacion de GalNAc apoB
0,5 20 CDM-NAG + CDM-PEG 26 ±12
1
20 CDM-NAG 23 ±10
1 20 CDM-PEG 45 ±10
amg de ARNip o poKmero por kilogramo de peso animal
b% relativo de protema
5 D. Evolucion de la inactivacion genica espedfica de secuencia despues de coadministracion de conjugado de ARNip-resto director y polfmero de suministro. El ARNip y el polfmero de suministro se prepararon y administraron a ratones como se ha descrito antes. Despues se recogieron muestras de sangre de los ratones en los tiempos indicados y se analizaron para determinar los niveles de ApoB. Se observo que los niveles de ApoB disminman gradualmente hasta que alcanzaban 3% del nivel de control despues de 72 h. Por lo tanto, la inactivacion maxima 10 del gen diana se puede producir despues de aproximadamente tres dfas (3). Este retraso en el inicio de la disminucion maxima en niveles de protemas puede reflejar el tiempo necesario para limpiar o degradar la protema ApoB en lugar del tiempo necesario para el suministro maximo del polinucleotido de ARNi o para la inactivacion genica.
Tabla 11.Inactivacion del gen diana in vivo despues de inyeccion del conjugado de ARNip-agrupacion de GalNAc 15 mas polfmero de suministro; evolucion de la inactivacion del gen diana.
ARNip
dosis de ARNipa (mg/kg) Dosis de polfmeroa (mg/kg) Horas despues de inyeccion % relativo de protemab
5 134 ±15
5'-agrupacion de GalNAc apoB
1 20 24 35 ±3
48 12 ±2
72 3 ±1
amg de ARNip o polfmero por kilogramo de peso animal
b% relativo de protema
E. Inyeccion secuencial del conjugado de ARNip-agrupacion de galactosas y polfmero de suministro. Las cantidades indicadas de conjugado de ARNip-agrupaciones de galactosa y el polfmero de suministro se prepararon y 20 administraron a los ratones como se ha descrito antes. Despues se recogieron muestras de sangre de ratones y se analizaron para determinar los niveles de ApoB. Para el ARNip dirigido al hngado con la agrupacion de galactosas, se observo suministro optimo con el suministro simultaneo del ARNip y el polfmero de suministro. Se observo un suministro significativo de ARNip cuando el conjugado de ARNip se administro hasta 15 minutos despues de administrar el polfmero. Solo se observo un suministro modesto cuando el conjugado de ARNip se administro antes 25 (hasta 15 min) del polfmero de suministro.
Tabla 12. Inactivacion del gen diana in vivo despues de inyeccion del conjugado de ARNip-agrupacion de GalNAc mas polfmero de suministro; administracion simultanea y administracion separada.
ARNip
Primera inyeccion Intervalo Segunda inyeccion % relativo de ApoB
5'-agrupacion de GalNAc apoB
ARNip 0,25 mg/kg 0 min polfmero 12,5 mg/kg 28 ±14
polfmero 12,5 mg/kg
15 min ARNip 0,25 mg/kg 56 ±18
ARNip 0,25 mg/kg
15 min polfmero 12,5 mg/kg 88 ±14
F. Insercion de un conector de PEG entre el ligando director de agrupacion de galactosas y el polinucleotido de 30 ARNi. Los conjugados de ARNip-agrupacion de galactosa se prepararon insertando espaciadores PEG, PEG19 o
5
PEG24 entre la agrupacion de galactosas y el ARNip, o se prepararon sin espaciador de PEG entre la agrupacion de galactosas y el ARNip. Despues los conjugados de ARNip se coadministraron con polfmero de suministro. La insercion de espaciadores de PEG no mejoro el suministro del ARNip a los hepatocitos, determinado por la inactivacion genica.
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Agrupacion de galactosas con espaciador de PEG; ligando director unido al ARNip por el grupo carboxilo.
Tabla 13. Inactivacion del gen diana in vivo despues de inyeccion del conjugado de ARNip-agrupacion de GalNAc mas polfmero de suministro; efecto del conector PEG en el conjugado de aRn.
ARNip
dosis de ARNipa (mg/kg) conector PEG Dosis de polfmeroa (mg/kg) % relativo de ApoBb
5'-agrupacion de GalNAc apoB
0,25 ninguno 12,5 28 ±14
5'- agrupacion de GalNAc- PEG19 apoB
0,25 PEG19 12,5 82 ±19
5'-agrupacion de GalNAc-PEG24 apoB
0,25 PEG24 12,5 72 ±13
amg de ARNip o polfmero por kilogramo de peso animal
b% relativo de protema
Ejemplo 9. Suministro de ARNip a hepatocitos de primate in vivo. Los conjugados de polinucleotido de ARNi y los polfmeros enmascarados se sintetizaron como se ha descrito antes.
Se inyecto a macaco Rhesus (macho de 3,9 kg) via i.v. 7,8 ml de una disolucion que contiene colesterol-siApoB 1,0 mg/ml y DW1360 7,5 mg/ml modificado con 7x CDM-PEG:CDM-NAG relacion en peso 2:1, dando una dosis final de colesterol-siApoB de 2 mg/kg y DW1360 15 mg/kg. Se inyecto a otro mono Rhesus (macho de 4,5 kg) glucosa isotonica y sirvio como un control.
Determinacion de los niveles de ApoB en el suero. Se vigilaron los niveles de protema ApoB en el suero durante la evolucion. Los primates estuvieron en ayunas 4 h antes de recoger el suero. Los niveles de protema ApoB en el suero se determinaron por metodos ELISA de tipo sandwich convencionales. Brevemente, se uso un anticuerpo policlonal de cabra anti-ApoB de raton y un anticuerpo de conejo anti-ApoB de raton (Biodesign International) como anticuerpos de captura y deteccion, respectivamente. Despues se aplico un anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo conjugado con hRp (Sigma) para unirse al complejo de ApoB/anticuerpo. Despues se midio la absorbancia del desarrollo colorimetrico de la tetrametil-benzidina (TMB, Sigma) mediante un lector de microplaca Tecan Safire2 (Austria, Europa) a 450 nm. Los resultados se dan en la tabla 14. El mono Rhesus que recibio el colesterol-ipApoB ARNip mostro una disminucion de los niveles de ApoB en el suero a lo largo del tiempo, alcanzando una inactivacion maxima de 76% el dfa 15 despues de inyeccion, comparado con los niveles del dfa -1 antes de de la dosis. Los niveles de ApoB se recuperaron hasta cerca de los niveles del dfa -1 antes de la dosis, el dfa 50. No se observo diminucion de los niveles de ApoB en el suero en el animal de control.
Tabla 14. Niveles de ApoB en el suero normalizados respecto al dfa 1.
Dfa
Tratamiento
Glucosa isotonica
col-ARNip (ApoB) + polfmero
1
1,00
1
2
1,24 1,07
4
1,38 0,69
7
1,22 0,56
11
1,39 0,32
15
1,43 0,24
18
1,36 0,25
22
1,44 0,31
29
1,13 0,30
36
1,21 0,48
Ejemplo 10. Inactivacion simultanea de dos genes. La coadministracion de conjugados de ARNip-colesterol a dos genes independientes, apoB y factor VII, y el polfmero de suministro DW1360 enmascarado produjo la inhibicion simultanea de ambos genes. La composicion se administro a ratones como se ha descrito antes. (Tabla 15).
Tabla 15. Inactivacion simultanea de 2 genes diana in vivo despues de inyeccion de dos conjugados de ARNip-grupo 5 hidrofobo diferentes mas 400 |jg de polfmero de suministro DW1360.
3'-colesterol-apoB (jg)
3'-colesterol-factor VII (jg) % relativo de ApoBa % relativo de Factor VIIa
0
0
100 ±19 100 ±25
20
0 12 ±4 124 ±21
0
20 81 ±12 14 ±5
20
20
10 ±6 12 ±1
aPorcentaje de inactivacion con respecto al grupo de control (n=3) inyectado con disolucion de glucosa isotonica.
Evaluacion de la toxicidad
Ejemplo 11. Toxicidad. La potencial toxicidad del sistema de suministro se evaluo midiendo los niveles en el suero de enzimas hepaticas y citoquinas. Se detectaron ligeras elevaciones de los niveles de ALT y AST en ratones que 10 recibfan ARNip de control o conjugados de ARNip para apoB-1, comparado con los ratones tratados con disolucion salina 48 h despues de inyeccion. Sin embargo, los niveles mayores no eran significativos (p<0,05) y el examen histologico de secciones de hngado no puso de manifiesto signos de toxicidad hepatica. De forma similar, el analisis de los niveles de TNF-a e IL-6 en el suero usando ELISA, puso de manifiesto que ambos eran ligeramente mayores 6 h despues de inyeccion del conjugado de ARNip-polfmero. Los niveles de ambos volvieron a los valores iniciales 15 en 48 h. No se midio toxicidad estadfsticamente significativa con la dosis eficaz minima en ratones o ratas. Estos resultados indican que el sistema de suministro dirigido era bien tolerado.
Ejemplo 12. Los ARNip teman las siguientes secuencias:
ARNip para apoB:
codificante 5' GGAAUCuuAuAuuuGAUCcAsA 3' (SEQ ID 1)
sentido contrario 5' uuGGAUcAAAuAuAAGAuUCcscsU 3' (SEQ ID 2)
ARNip para factor VII
codificante 5' GGAUfCfAUfCfUfCfAAGUfCfUfUfACfdTdT 3' (SEQ ID 3)
sentido contrario 5' GUfAAGACfUfUfGAGAUfGAUfCfCfdTsdT 3' (SEQ ID 4)
20 minusculas = sustitucion 2-O-CH3 s = union fosforotioato f despues de nucleotido = sustitucion 2'-F d antes de nucleotido = 2'-desoxi Ejemplo 13. Smtesis de agrupacion de GalNAc .
25 A. Ester bendlico del acido {2-[2-(2-Hidroxi-etoxi)-etoxi]-etoxi}-acetico
imagen28
Se disolvio el 2-[2-(2-hidroxi-etoxi)-etoxi]-etanol (62,2 g, 414 mmol) en atmosfera de argon en 875 ml de DMF abs. y se enfrio a 0°C. Se anadio con cuidado NaH (12,1 g, 277 mmol, 55% en aceite mineral), se retiro el bano de hielo, se continuo agitando durante 1 h a 80°C. La mezcla de reaccion se enfrio a temperatura ambiente y se trato con acido 30 bromoacetico (18,98 g, 137 mmol) que se anadio mediante embudo de adicion como disolucion de DMF (20 ml). Despues de 30 min adicionales a 75°C, se anadio bromometil-benceno (23,36 g, 137 mmol) y se dejo que la esterificacion avanzara durante 30 min. El enfriamiento, vertido con cuidado sobre hielo triturado, extraccion con acetato de etilo, lavado con agua, secado sobre Na2SO4, y evaporacion de todos los disolventes seguido de
cromatograffa ultrarrapida (SiO2, acetato de etilo / heptano = 8/2) dio 6,41 g del compuesto del t^tulo en forma de un aceite amarillo. MS (ISP): 299,2 [M+H]+.
B. Ester de (3aR,5R,6R,7R,7aR)-6-acetoxi-5-acetoximetil-2-metil-5,6,7,7a-tetrahidro-3aH-pirano[3,2-d]oxazol-7-ilo del acido acetico.
5
imagen29
Se disolvio ester de (2S,3R,4R,5R,6R)-4,5-diacetoxi-6-acetoximetil-3-acetilamino-tetrahidro-piran-2-ilo del acido acetico (10,0 g, 26 mmol) en 116 ml de CH2Cl2 abs. y se trato con triflato de trimetilsililo (l4,27 g, 64 mmol). La reaccion se dejo avanzar durante la noche a 45°C. Despues de enfriar a 0°C, se anadio trietilamina (4,88 ml, 35 mmol), la mezcla se diluyo con CH2O2 y se lavo con disolucion de NaHCO3 y agua. El secado sobre Na2SO4 y la 10 evaporacion del disolvente dieron 10,3 g del compuesto del tffulo en forma de un aceite parduzco que se uso en la siguiente etapa sin mas purificacion. MS (ISP): 330,0 [M+H]+.
C. Ester bendlico del acido (2-{2-[2-((2R,3R,4R,5R,6R)-4,5-diacetoxi-6-acetoximetil-3-acetilamino-tetrahidro-piran-2- iloxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-acetico.
imagen30
15 El ester de (3aR,5R,6R,7R,7aR)-6-acetoxi-5-acetoximetil-2-metil-5,6,7,7a-tetrahidro-3aH-pirano[3,2-d]oxazol-7-ilo del acido acetico (10,3 g, 26 mmol) preparado antes y el ester bendlico del acido {2-[2-(2-hidroxi-etoxi)-etoxi]-etoxi}- acetico (8,62 g, 29 mmol) se mezclaron en 520 ml de CH2Cl2 y se trataron con 63 g de tamices moleculares de 4 Angstrom. Despues de 1 h, se anadio triflato de trimetilsililo (6,13 g, 28 mmol). La mezcla de reaccion se agito a lo largo del fin de semana a temperatura ambiente. Se anadio trietilamina (5,21 ml, 37 mmol), los tamices moleculares 20 se separaron por filtracion, el filtrado se diluyo con CH2O2 y se lavo con NaHCO3 y agua. El secado sobre Na2SO4 y la evaporacion del disolvente seguido de cromatograffa ultrarrapida (SiO2, acetato de etilo / AcOH / MeOH / agua = 60 / 3 / 3 / 2) dio 15,7 g del compuesto del fftulo en forma de un aceite parduzco. MS (ISP): 626,6 [M-H]".
D. Acido (2-{2-[2-((2R,3R,4R,5R,6R)-4,5-diacetoxi-6-acetoximetil-3-acetilamino-tetrahidro-piran-2-iloxi)-etoxi]-etoxi}- etoxi)-acetico.
imagen31
El ester bendlico del acido (2-{2-[2-((2R,3R,4R,5R,6R)-4,5-diacetoxi-6-acetoximetil-3-acetilamino-tetrahidro-piran-2- iloxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-acetico (15.7 g, 25 mmol) preparado antes, se disolvio en 525 ml de acetato de etilo y se hidrogeno sobre 1,6 g de Pd / C (10%) bajo 1 atm de H2 a temperatura ambiente durante 3 h. La filtracion sobre Celite y evaporacion del disolvente, seguido de cromatograffa ultrarrapida (SO2, CH2Ch/ MeOH = 80 / 20) dio 6,07 g 30 del compuesto del fftulo en forma de una goma parduzca. MS (ISP): 536,5 [M-H]".
E. Ester bendlico de la agrupacion de GalNAc.
imagen32
El acido (2-{2-[2-((2R,3R,4R,5R,6R)-4,5-diacetoxi-6-acetoximetil-3-acetilamino-tetrahidro-piran-2-iloxi)-etoxi]-etoxi}- 5 etoxi)-acetico (2,820 g, 5,246 mmol) preparado antes y el hidrocloruro del ester bendlico del acido (S)-6-amino-2- ((S)-2,6-diamino-hexanoilamino)-hexanoico (vease la preparacion a continuacion, 0,829 g, 1,749 mmol) se disolvieron en una mezcla de 32 ml de CH2Cl2 y 3,2 ml de DMF, se trataron sucesivamente con base de Hunig (2,096 ml, 12,25 mmol), 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (0,714 g, 5,248 mmol) e hidrocloruro de 1 -(3-dimetil- aminopropil)-3-etilcarbodiimida (1,006 g, 5,248 mmol), y se agitaron durante la noche a temperatura ambiente. Se 10 separaron todos los disolventes a vado, y la mezcla de reaccion bruta se purifico por HPLC preparativa (38 ejecuciones, Gemini, 5 p, C18) para dar despues de liofilizacion 1,650 g del producto del tttulo en forma de un polvo blanco. MS (ISP): 1945,8 [M+Na]+. RMN (600 MHz, DMSO).
F. Acido libre de la agrupacion de GalNAc. Acido (17S,20S)-1-((2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diacetoxi-6- (acetoximetil)tetrahidro-2H-piran-2-iloxi)-20-(1-((2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diacetoxi-6- 15 (acetoximetil)tetrahidro-2H-piran-2-iloxi)-11-oxo-3,6,9-trioxa-12-azahexadecan-16-il)-17-(2-(2-(2-(2- ((2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diacetoxi-6-(acetoximetil)-tetrahidro-2H-piran-2- iloxi)etoxi)etoxi)etoxi)acetamido)-11,18-dioxo-3,6,9-trioxa-12,19-diazahenicosan-21-oico.
imagen33
El ester bendlico de la agrupacion de GalNAc anterior (0,674 g, 0,350 mmol) se disolvio en 50 ml de MeOH y se hidrogeno sobre 0,065 g de Pd / C (10%) a 1 atm de H2 a temperature ambiente durante 4 h. La filtracion a traves de Celite y evaporacion del disolvente, dejo 0,620 g del compuesto del tftulo en forma de una espuma blanca. MS (ISP): 5 1917,0 [M+2H]2+. RMN (600 MHz, DMSO).
Ejemplo 14. Hidrocloruro del ester bendlico del acido (S)-6-amino-2-((S)-2,6-diamino-hexanoilamino)-hexanoico. La unidad estructural hidrocloruro del ester bendlico del acido (S)-6-amino-2-((S)-2,6-diamino-hexanoilamino)- hexanoico se sintetizo como sigue:
A. Ester bendlico del acido (S)-6-terc-butoxicarbonilamino-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-hexanoico.
10
El acido (S)-6-terc-butoxicarbonilamino-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-hexanoico (5,00 g, 10,67 mmol) y fenil-metanol (2,305 g, 21,34 mmol) se disolvieron en 25 ml de CH2Cl2 y se trataron sucesivamente con N- hidroxibenzotriazol (1,933 g, 11,74 mmol), hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC, 2.250 g, 11,74 mmol), y etil-diisopropil-amina (2,137 ml, 12,49 mmol). Despues de agitar durante 90 min, los productos 15 volatiles se separaron a vado a temperatura ambiente, el residuo se recogio en acetato de etilo, se lavo con agua, solucion de N^Cl y salmuera, se seco sobre Na2SO4, y se evaporo. Despues la mezcla bruta se disolvio en 20 ml de etanol y el producto precipito por adicion de 10 ml de agua. La filtracion y secado dieron 5,669 g del compuesto del tftulo que se recristalizo enetanol / hexano para dar 4,27 g del ester bendlico puro. MS (ISP): 559,2 [M+H]+.
imagen34
B. Ester bendlico del acido (S)-2-((S)-2,6-Bis-terc-butoxicarbonilamino-hexanoilamino)-6-terc-butoxicarbonilamino- hexanoico.
imagen35
El ester bendlico del acido (S)-6-terc-butoxicarbonilamino-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxi-carbonilamino)-hexanoico (4,270 5 g, 7,643 mmol) preparado antes se disolvio en 15 ml de THF y se trato con 15 ml de dietilamina. Despues de 4 h a temperatura ambiente, el analisis por MS y TLC indicaban la ausencia de material de partida. La evaporacion de los disolventes y secado azeotropico con tolueno dieron 4,02 g de la amina libre que se uso directamente en la siguiente etapa.
El acido (S)-2,6-bis-terc-butoxicarbonilamino-hexanoico (3,177 g, 9,17 mmol) disponible en el comercio se disolvio 10 en 13 ml de CH2Cl2 y se trato a 0°C con etil-diisopropil-amina (4,71 ml, 27,5 mmol), tetrafluoroborato de O-(1,2- dihidro-2-oxo-pyridil)-1,1,3,3-tetrametiluronio (TPTU, 2,725 g, 9,172 mmol) y, 15 min despues, con la amina preparada antes como una disolucion en la cantidad minima de CH2Cl2 y 1,57 ml de etil-diisopropil-amina (1,2 eq.). La reaccion se dejo avazanzar durante 2 h a temperatura ambiente. Todos los productos volatiles se separaron a vado, el residuo se recogio en acetato de etilo, se lavo con disolucion de NaHCOa, disolucion de NH4Cl y agua, se 15 secaron sobre Na2SO4, y se evaporaron. La cromatograffa ultrarrapida (SiO2, heptano / acetato de etilo = 4 / 6) seguido de cristalizacion en heptano/cantidad minima de acetato de etilo, produjo 4,516 g del compuesto del tttulo en forma de un solido blanco. MS (ISP): 665,4 [M+H]+.
C. Trihidrocloruro del ester bendlico del acido (S)-6-amino-2-((S)-2,6-diamino-hexanoilamino)-hexanoico.
imagen36
20 El ester bendlico del acido (S)-2-((S)-2,6-bis-terc-butoxicarbonilamino-hexanoilamino)-6-terc-butoxicarbonilamino- hexanoico (4,516, 6,793 mmol) preparado antes se disolvio en HCl 4 mol/l en dioxano. Despues de un par de minutos, evoluciono el gas y se formo un precipitado. Despues de 3 h a temperatura ambiente, la mezcla de reaccion se evaporo con cuidado y se seco escrupulosamente para dar 3,81 g del compuesto del tftulo en forma de una espuma blanquecina que se uso sin mas purificacion para el ejemplo 13. E. Ester bendlico de la agrupacion de 25 GalNAc anterior. MS (ISP): 365,3 [M+H]+.
Ejemplo 15. Conjugados de agrupacion de GalNAc-ARNip
A. El compuesto 1 (150 mg, 0,082 mmol) se disolvio en metanol seco (5,5 ml) y se anadieron 42 pl de metilato sodico (solucion al 25% en MeOH). La mezcla se agito en atmosfera de argon durante 2 h a t.a. Se anadio una cantidad igual de metanol asf como porciones de material de intercambio ionico Amberlite IR-120 para generar un 30 pH de aproximadamente 7,0. El material Amberlite se separo por filtracion. La disolucion se seco con Na2SO4, y el disolvente se separo a presion reducida. El compuesto 2 se obtuvo con rendimiento cuantitativo en forma de una espuma blanca. TLC (SO2, diclorometano (DCM)/MeOH 5:1 + CH3COOH al 0,1%): Rf 2 = 0,03; para la deteccion se uso una disolucion de acido sulfurico (5%) en MeOH seguido de calentamiento. ESI-MS, inyeccion directa, modo
negativ°; [M-H] calculado: 1452,7; [M-H] medido: 1452,5.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
B. El compuesto 2 (20 mg, 0,014 mmol) se coevaporo con piridina en diclorometano. El residuo se disolvio en DMF seca (0,9 ml) y se anadio una disolucion de N-hidroxisuccinimida (NHS) en DMF (1,6 mg, 0,014 mmol) con agitacion en atmosfera de argon. A 0°C se anadio lentamente una disolucion de N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) en DMF (3,2 mg, 0,016 mmol). La reaccion se dejo calentar a t.a. y se agito durante la noche. El compuesto 3 se uso sin mas purificacion para la conjugacion con el ARN.
C. Smtesis del ARN modificado con amino. El ARN equipado con un conector C-6-amino en el extremo 5' del sentido de la cadena, se produjo por procedimientos qmmicos de fosforamidita convencionales en fase solida a escala de 1215 |jmol usando un AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Alemania) y vidrio de poro controlado como soporte solido. El ARN que contema 2'-O-metil-nucleotidos se genero usando las correspondientes fosforamiditas, 2'-O-metil-fosforamiditas y TFA-hexilamino-conector amidita. La escision y desproteccion as^ como la purificacion, se lograron por metodos conocidos en la materia (Wincott F., et al, NAR 1995, 23,14,2677-84).
El ARN modificado con amino se caracterizo por HPLC de intercambio anionico (pureza: 96,1%) y la identidad se confirmo por ESI-MS ([M+H]1+calculado: 6937,4; [M+H]1+medid0: 6939,0. Secuencia: 5'-
(NH2C6)GGAAUCuuAuAuuuGAUCcAsA-3' (SEQ ID 1); u,c: 2'-O-metil-nucleotidos de las bases correspondientes, s: fosforotioato.
D. Conjugacion de la agrupacion de GalNAc al ARN. ARN (2,54 jmol) equipado con un conector amino C-6 en el extremo 5' se liofilizo y se disolvio en 250 jl de tampon de borato sodico (borato sodico 0,1 mol/l, pH 8,5, KCl 0,1 mol/l) y 1,1 ml de DMSO. Despues de anadir 8 jl de N,N-diisopropiletilamina (DIPEA), se anadio lentamiente una disolucion del compuesto 3 (teorico 0,014 mmol) en DMF con agitacion continua, a la disolucion de ARN. La mezcla de reaccion se agito a 35°C durante la noche. La reaccion se controlo usando RP-HPLC (Resource RPC 3 ml, tampon: A: acetato de trietilamonio 100 mM (TEAA, 2,0 M, pH 7,0) en agua, B: TEAA 100 mM en acetonitrilo al 95%, gradiente: de 5% de B a 22% de B en 20 VC). Despues de precipitar el ARN usando acetato sodico (3 M) en EtOH a -20°C, el conjugado de ARN se purifico usando las condiciones descritas antes. Las fracciones puras se juntaron y el conjugado 4 deseado se precipito usando acetato sodico/EtOH para dar el conjugado de ARN puro. El conjugado 4 se aislo con 59 % de rendimiento (1,50 jmol). La pureza del conjugado 4 se analizo por HPLC de intercambio anionico (HPLC: 85,5%) y la identidad se confirmo por ESI-MS ([M+Hp calculado: 8374,4; [M+H] 1+ medido: 8376,0. (FIG. 6).
E. El conjugado 4 (cadena codificante) se asocio con una cadena de sentido contraria modificada con 2-O-metilo. Secuencia: 5'-uuGGAUcAAAuAuAAGAuUCcscsU-3' (SEQ ID 2). El conjugado de ARNip dirigido contra el ARNm de apolipoprotema B se genero mezclando una disolucion equimolar de cadenas complementarias en tampon de asociacion (fosfato sodico 20 mM, pH 6,8; cloruro sodico 100 mM), se calento en un bano de agua a 85-90°C durante 3 min, y se enfrio a t.a. a lo largo de un periodo de 3-4 h. La formacion de duplex se confirmo por electroforesis en gel sin modificar.
Ejemplo 16. Conjugados de grupo hidrofobo-ARNip. (SEQ ID 3):
(NHSCIO)GGAUfCfAUfCfUfCfAAGUfCfUfUfACfdTsdT
Amina
(Amine)(COC9)GGAUfCfAUfCfUfCfAAGUfCfUfUfACfdTsdT
La smtesis de ARN se llevo a cabo en fase solida por procedimientos qmmicos de fosfoaramidita convencionales en un AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Alemania) y vidrio de poro controlado (CPG) como soporte solido.
La cadena codificante modificada con 5'-ester C10-NHS, (NHSC10)GGAUfCfAUfCfUfCfAAGUfC-fUfUfACfdTsdT (SEQ ID 3) se preparo usando la 5'-amidita C10 modificador de Carboxi de Glen Research (Virginia, EE.UU.). El ARN activado, todavfa unido al soporte solido se uso para la conjugacion con aminas lipofilas citadas en la siguiente tabla. Cf y Uf son 2'-fluoronucleotidos de las bases correspondientes y s es una union fosforotioato.
Secuencia de la cadena codificante: 5'-(COC9)GGAUfCfAUfCfUfCfAAGUfCfUfUfACfdTsdT-3' (SEQ ID 3)
Secuencia de la cadena de sentido contrario: 5'-GUfAAGACfUfUfGAGAUfGAUfCfCfdTsdT-3' (SEQ ID 4)
Se mezclaron 100 mg de la cadena codificante CPG (carga 60 jmol/g, 0,6 jmol de ARN) con 0,25 mmol de la correspondiente amina obtenida de Sigma Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Alemania) o Fluka (Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza).
Tabla 16. Aminas lipofilas usadas en la formacion de conjugados de grupo hidrofobo-ARNip
N°
Amina lipofila mg mmol ml de disolvente
2
N-Hexilamina 25 0,25 1 ml de CH2Cl2
3
Dodecilamina 50 0,25 0,55 ml de CH3CN, 0,45 ml de CH2O2
4
Octadecilamina 67 0,25 1 ml de CH2Cl2
5
Didecilamina 74 0,25 1 ml de CH2Cl2
6
Didodecilamina 88 0,25 1 ml de CH2Cl2
7
Dioctadecilamina 67 0,12 0,45 ml de CH2Cl2, 0,45 ml de ciclohexano
La mezcla se agito durante 18 h a 40°C. El ARN se escindio del soporte solido y se desprotegio con una disolucion acuosa de hidroxido amonico (NH3, al 33 %) a 45°C durante la noche. El grupo protector en 2' se separo con 5 TEAx3HF a 65°C durante 3,5 h. Los oligonucleotidos se purificaron por RP-HPLC (Resource RPC 3 ml, tampon: A: TEAA 100 mM en agua, B: TEAA 100 mM en CH3CN al 95%, gradiente: de 3% de B a 70% de B en 15 VC, excepto para el n° 7: gradiente de 3% de B a 100% de B en 15 VC).
Tabla 17. Conjugados de grupo-hidrofobo-ARN, caracterizados por RP- HPLC y ESI-MS (modo negativo).
N°
Pureza por RP-HPLC % ESI-MS [M-H] calculado ESI-MS [M-H] encontrado
2
90 6963,4 6963,0
3
99 7047,4 7047,2
4
98 7131,5 7131,4
5
99 7159,6 7159,3
6
99 7215,7 7215,0
7
98 7384,0 7383,2
10 Para generar el ARNip a partir del ARN monocatenario, se mezclaron cantidades equimolares de las cadenas codificante y de sentido contrario complementarias en tampon de asociacion (fosfato sodico 20 mM, pH 6,8; cloruro sodico 100 mM), se calento a 80°C durante 3 min, y se enfrio a t.a. a lo largo de un periodo de 3-4 h. Los ARNip, que se dirigen contra el ARNm del factor VII, se caracterizaron por electroforesis en gel.

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    REIVINDICACIONES
    1. Un sistema de suministro de conjugado para suministrar polinucleotido de ARN interferente a una celula hepatica in vivo, que comprende:
    imagen1
    en donde,
    P es una poliamina activa en la membrana anfipatica;
    L2 es una union labil frente al pH
    M1 es un agente de enmascaramiento de carga neutra que contiene un derivado de galactosa,
    M2 es un agente de enmascaramiento de carga neutra que contiene un polietilenglicol,
    N es un polinucleotido de ARN interferente,
    A es un tnmero de galactosa o un grupo hidrofobo que tiene al menos 20 atomos de carbono,
    y es un numero entero mayor o igual a 1 y z es un numero entero mayor o igual a 0, en donde el valor de y y z juntos es mayor que 50% del numero de aminas de la poliamina P;
    la carga positiva de la poliamina P se neutraliza y la actividad en la membrana de la poliamina P es inhibida reversiblemente por union de M1 y M2 por la union labil frente al pH L2, y la escision de L2 en respuesta a una disminucion del pH restablece la actividad en la membrana de la poliamina P;
    N y A no estan, directa o indirectamente, covalentemente unidos a P, L2, M1 o M2
  2. 2. Sistema de suministro segun la reivindicacion 1, en donde la poliamina activa en la membrana anfipatica se puede obtener por polimerizacion aleatoria de monomeros que contienen amina y monomeros que contienen grupo hidrofobo inferior; o por polimerizacion aleatoria de monomeros que contienen amina, monomeros que contienen grupo hidrofobo inferior y monomeros con grupo hidrofobo superior;
  3. 3. Sistema de suministro segun la reivindicacion 1 o reivindicacion 2, en donde L2 es una union maleamato.
  4. 4. Sistema de suministro segun la reivindicacion 3, en donde L2 es una union maleamato disustituido.
  5. 5. Sistema de suministro segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la celula hepatica es un hepatocito.
  6. 6. Sistema de suministro de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el polinucleotido de ARN interferente se selecciona del grupo que consiste en: ARNbc, ARNip y miARN.
  7. 7. Sistema de suministro de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde
    / (l'-m1)*
    p
    \ (L2—M2) z ,
    es soluble en agua.
  8. 8. Sistema de suministro de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde P es un copolfmero aleatorio.
  9. 9. Sistema de suministro de la reivindicacion 8, en donde P es un copolfmero aleatorio de poli(eter vimlico) y poliacrilato.
  10. 10. Sistema de suministro de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el valor de y y z juntos es mayor que 60%, preferiblemente mayor que 70% del numero de aminas de la poliamina P.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
  11. 11. Sistema de suministro de la reivindicacion 1, en donde
    P
    \ (L2—M2)z ,
    tiene un potencial zeta entre 0 y -20 mV a pH 8.
  12. 12. Sistema de suministro de la reivindicacion 1, en donde la relacion del derivado de galactosa al polietilenglicol PEG unido a P es de 1 a 0,5-2.
  13. 13. Sistema de suministro de la reivindicacion 1, en donde el derivado de galactosa consiste en N- acetilgalactosamina.
  14. 14. Sistema de suministro de la reivindicacion 1, en donde el tnmero de galactosa consiste en tnmero de N- acetilgalactosaminas.
  15. 15. Un metodo para la fabricacion de una composicion de suministro de oligonucleotido de ARN interferente, que comprende:
    a) formar una poliamina activa en la membrana anfipatica, dicha poliamina activa en la membrana se puede obtener preferiblemente por polimerizacion aleatoria de monomeros que contienen amina y monomeros que contienen grupo hidrofobo inferior; o por polimerizacion aleatoria de monomeros que contienen amina, monomeros que contienen grupo hidrofobo inferior y monomeros con grupo hidrofobo superior;
    b) formar un primer agente de enmascaramiento que comprende un anhndrido maleico disustituido de carga neutra que contiene un derivado de galactosa;
    c) formar un segundo agente de enmascaramiento que comprende un anhndrido maleico disustituido de carga neutra que contiene un polietilenglicol;
    d) inhibir reversiblemente la actividad en la membrana de la poliamina activa en la membrana anfipatica, en donde la inhibicion consiste en la modificacion de 50% o mas de las aminas en la poliamina, haciendo reaccionar la poliamina con el primero y el segundo agentes de enmascaramiento, uniendo asf una pluralidad de derivados de galactosa y una pluralidad de polietilenglicoles al polfmero activo en la membrana por uniones de maleamato disustituido labiles frente al pH en condiciones fisiologicas; y,
    e) unir el polinucleotido de ARN interferente al tnmero de galactosa o un grupo hidrofobo que tiene al menos 20 atomos de carbono;
    f) proporcionar el polinucleotido de ARN interferente y la poliamina activa en la membrana reversiblemente inhibida en disolucion adecuada para la administracion in vivo.
    en donde dicho nucleotido de ARN interferente unido a dicho tnmero de galactosa o un grupo hidrofobo que tiene al menos 20 atomos de carbono, no esta unido covalentemente, directa o indirectamente, a dicha poliamina activa en la membrana reversiblemente inhibida.
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