ES2564809T3 - Pronóstico de cirrosis hepática alcohólica - Google Patents

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Abstract

Un método para evaluar el pronóstico en un individuo que padece cirrosis alcohólica,método que comprende (a) (i) poner en contacto una muestra de plasma de dicho individuo con una población de neutrófilos normales que no son de dicho individuo, para producir una población de ensayo de neutrófilos y (ii) proporcionar una muestra de control que comprende una población de neutrófilos normales que no son de dicho individuo en el que dicha muestra de control no se pone en contacto con dicha muestra de plasma, (b) evaluar la capacidad de fagocitosis de la población de ensayo de neutrófilos de (a)(i), (c) comparar dicha capacidad de fagocitosis de (b) con la capacidad de fagocitosis de dicha muestra de control de neutrófilos de (a)(ii), en el que un nivel más bajo de fagocitosis de neutrófilos en dicha población de ensayo, en comparación con el nivel de fagocitosis de neutrófilos en dicha muestra de control es indicativo de un pronóstico de infección y/o insuficiencia orgánica y/o mortalidad.

Description

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DESCRIPCION
Pronostico de cirrosis hepatica alcoholica Campo de la invencion
La invencion se refiere a un metodo para evaluar la funcion hepatica, en particular para predecir el resultado clmico de cirrosis alcoholica.
Antecedentes de la invencion
Los datos de un registro europeo de insuficiencia hepatica sugieren que la incidencia de enfermedad hepatica esta aumentando con aproximadamente 1 millon de pacientes en la actualidad con insuficiencia hepatica en Europa occidental, una proporcion significativa secundaria al alcohol. En la mayona de los pacientes, la insuficiencia
hepatica es el resultado de un suceso causante tal como infeccion o hepatitis alcoholica en los antecedentes de
enfermedad hepatica cronica establecida; una entidad que se denomina "insuficiencia hepatica aguda sobre cronica (ACLF)". Una vez establecida la insuficiencia hepatica, los tratamientos espedficos se limitan a apoyo organico y las tasas de mortalidad se aproximan a un 50 %. En pacientes con ACLF secundaria a hepatitis alcoholica grave (AH), se cree que aproximadamente un 40 % de las muertes son el resultado de sepsis.
Fujimoto et al., (Alcohol Clin Exp Res, 24: 48S-54S, 2000) informa de una evaluacion de niveles de endotoxina en plasma y concentraciones en suero de citoquinas y protema de union a lipopolisacarido durante la fase aguda y de recuperacion de pacientes con hepatitis alcoholica. La Patente de Estados Unidos N.° 5.998.389 describe ensayos para endotoxina y en particular metodos para reducir el numero de falsos positivos en un ensayo de endotoxina debido a una via enzimatica sensible a glucano en un lisado de amebocitos. El documento WO 2004/071645 describe metodos para uso en la determinacion de si un paciente se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista del receptor 4 de tipo toll, tal como un compuesto de antiendotoxina. El documento de Patente US
2004/0228829 describe un dispositivo para eliminar toxinas de la sangre de pacientes que parecen insuficiencia
hepatica aguda. El documento WO 96/41183 describe metodos y kits para el pronostico de colitis ulcerosa, colangitis esclerosante primaria y el tipo 1 de la hepatitis autoinmune. Rolando et al., (European Journal of Gastroenterology and Hepatology, 12: paginas 1135-1140, 2000) informa que la fagocitosis se reduce en neutrofilos de pacientes con insuficiencia hepatica aguda en comparacion con los pacientes de control.
Sumario de la invencion
Los inventores examinaron pacientes con enfermedad hepatica alcoholica y han descubierto un factor humoral, presente en plasma, que destruye la funcion inmune en tales pacientes. La eliminacion de endotoxinas conduce a la restauracion de la funcion, lo que sugiere que el factor humoral es una molecula de tipo endotoxina. La deteccion de esta molecula de tipo endotoxina en esos pacientes se puede usar para evaluar su diagnostico clmico, en particular, riesgo de infeccion, riesgo de mortalidad, riesgo de insuficiencia organica y la probabilidad de respuesta a terapias convencionales tales como tratamiento con inmunosupresores.
Los inventores han establecido que el factor humoral es capaz de estimular la activacion de neutrofilos. La presencia de la molecula de tipo endotoxina se puede determinar mediante la evaluacion de la funcion de los neutrofilos del individuo. En consecuencia, la funcion anomala de los neutrofilos, tal como activacion de neutrofilos o disminucion de la capacidad fagodtica de neutrofilos, representan importantes marcadores biologicos importantes de resultado nocivo de insuficiencia hepatica. Estos marcadores se pueden usar como un indicador fiable de progresion y resultado en pacientes con insuficiencia hepatica. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invencion se proporciona un metodo para evaluar el pronostico de un individuo que padece cirrosis alcoholica, metodo que comprende
(a)
(i) poner en contacto una muestra de plasma de dicho individuo con una poblacion de neutrofilos normales que no son de dicho individuo para producir una poblacion de ensayo de neutrofilos y
(ii) proporcionar una muestra de control que comprende una poblacion de neutrofilos normales que no son de dicho individuo en el que dicha muestra de control no se pone en contacto con dicha muestra de plasma,
(b) evaluar la capacidad de fagocitosis de la poblacion de ensayo de neutrofilos de (a)(i),
(c) comparar dicha capacidad de fagocitosis de (b) con la capacidad de fagocitosis de dicha muestra de control de neutrofilos de (a)(ii),
en el que un nivel mas bajo de fagocitosis de neutrofilos en dicha poblacion de ensayo, en comparacion con el nivel de fagocitosis de neutrofilos en dicha muestra de control es indicativo de un pronostico de infeccion y/o insuficiencia organica y/o mortalidad.
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Breve descripcion de las figuras
Figura 1: Representaciones de analisis de FACS representativas para Phagotest® y Bursttest®. (A) Los neutrofilos se seleccionaron de acuerdo con sus caractensticas de dispersion directa y lateral. (B) Analisis de fagocitosis: En una muestra sin marcadores bacterianos se establece que mas de un 99 % de los neutrofilos seleccionados estan dentro del primer marcador. (C) Representacion de FACS representativa de un paciente con estallido oxidativo en reposo elevado. Se mide el porcentaje de dobles positivos (celulas positivas para CD16 que producen metabolites reactivos de oxfgeno determinadas con fluorescencia de color verde en FL-1). (D) Representacion de FACS correspondiente de un paciente con una media geometrica de intensidad de fluorescencia muy baja (GMFI) (E) Representacion de FACS representativa de un paciente con estallido oxidativo en reposo bajo. (F) Representacion de FACS correspondiente de un paciente con GMFI baja. (G) Representacion de FACS representativa de un sujeto de control sano. (H) Representacion de FACS correspondiente de un control sano con GMFI normal.
Figura 2: Estallido oxidativo en reposo, estallido oxidativo despues de estimulacion con fMLP o E. coli y GMFI relativa para controles, pacientes con cirrosis alcoholica y cirrosis + AH. * Significativo con respecto al control. § Significativo con respecto al control y cirrosis.
Figura 3: (A) Analisis de tiempo para infeccion (Kaplan-Meier) para pacientes con estallido en reposo elevado frente a bajo. (B) Curva de supervivencia de Kaplan Meier y analisis de rango logantmico para pacientes con sin infeccion positiva del cultivo.
Figura 4: (A) Area bajo la curva de funcionamiento del receptor para determinar la utilidad predictiva de la medida del estallido oxidativo para determinar la supervivencia. Un punto de corte de estallido en reposo < 55 % tema una sensibilidad de un 75 % y una especificidad de un 64 % para prediccion de muerte. Area = 0,77; Error Estd. = 0,07; significancia = 0,003; punto de corte = 55; sensibilidad = 0,77; especificidad = 0,69. (B) Curva de supervivencia de Kaplan Meier y analisis de rango logantmico para pacientes estratificados para estallido oxidativo en reposo elevado (>/= 55 %) o bajo (< 55 %).
Dfa
20 40 60 80
Sucesos
4 5 10 12
En riesgo
50 44 36 33
Figura 5: (A) Area bajo la curva de funcionamiento del receptor para determinar la utilidad predictiva de la medida de la media geometrica de intensidad de fluorescencia (GMFI) en para determinar la supervivencia. Un punto de corte de GMFI < 295 % tema una sensibilidad de un 86 % y una especificidad de un 76 % para prediccion de muerte. Area = 0,80; Error Estd. = 0,08; significancia = 0,002; punto de corte = 42; sensibilidad = 0,86; especificidad = 0,70. (B) Curva de supervivencia de Kaplan Meier y analisis de rango logantmico para pacientes estratificados para GMFI baja (< 295) o elevada (>/= 295).
Dfa
20 40 60 80
Sucesos
4 4 5 5
En riesgo
29 29 26 24
Figura 6: Estallido oxidativo en reposo en sangre completa de pacientes y en neutrofilos normales incubados con plasma de pacientes. El plasma de pacientes con estallido elevado tambien induda un estallido elevado en neutrofilos normales, mientras que el plasma de pacientes con estallido en reposo bajo no lo hadan. WB sangre completa, NN neutrofilos normales, PP plasma de pacientes, H estallido en reposo elevado (>/= 55 %), L estallido en reposo bajo (< 55 %). * p = 0,002 con respecto a normal. ** p = 0,0005 con respecto a normal.
Figura 7: Capacidad de inversion del estallido oxidativo en reposo por incubacion de neutrofilos de pacientes con plasma normal. PN neutrofilos de paciente, PP plasma de paciente, NP plasma normal.
Figura 8: Influencia del plasma en fagocitosis. Los neutrofilos de paciente incubados en su propio plasma mostraron disminucion de fagocitosis. La incubacion de neutrofilos normales con plasma de pacientes con estallido en reposo bajo no cambia la fagocitosis, del plasma de pacientes con estallido elevado disminuye la fagocitosis. La incubacion de neutrofilos de paciente con plasma normal restablece la funcion fagodtica. PN neutrofilos de paciente, PP plasma de paciente, NN neutrofilos normales, NP plasma normal, H estallido en reposo elevado, L estallido en reposo bajo. Figura 9: Aumento dependiente de la dosis en estallido en reposo a traves de incubacion con endotoxina. * p < 0,05;
** p < 0,001.
Figura 10: La incubacion con endotoxina no cambia la fagocitosis en neutrofilos normales pero disminuye la fagocitosis en neutrofilos de pacientes.
Figura 11: El estallido oxidativo en reposo es reversible pasando plasma sobre una columna de eliminacion de endotoxinas o incubacion con anticuerpos CD14. Las columnas o los anticuerpos CD14 no influyen en el estallido en reposo cuando se usa plasma de pacientes con estallido bajo o plasma de control. NN + PP H con respecto a NN + pP H CD14 p < 0,001. NN + PP H con respecto a NN + PP H Columna p < 0,001.
Figura 12: la disminucion de la fagocitosis es reversible pasando plasma sobre una columna de eliminacion de
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endotoxinas o incubacion con anticuerpos CD14. Las columnas o los anticuerpos CD14 no influyen en el estallido en reposo cuando se usa plasma de pacientes con estallido bajo o plasma de control. NN + PP H con respecto a NN + Pp H CD14 p = 0,004 Nn + PP H con respecto a NN + PP H Columna p = 0,03.
Figura 13: muestra la relacion entre estallido en reposo de neutrofilos (%) y actividad de mieloperoxidasa (MPO) en plasma (sin celulas), expresada en unidades de guayacol x10-3 (mGU) por mililitro de plasma en 10 pacientes con gravedad variable de enfermedad hepatica. Se indica el ajuste mediante regresion lineal, mostrando una relacion significativa entre estas dos medidas (p = 0,0075, r2 = 0,66). Los dos sujetos que posteriormente murieron se indican con sfmbolos huecos.
Descripcion detallada de la invencion
A lo largo de esta memoria descriptiva, se entendera que el termino "comprender", o variaciones tales como "comprendido" o "que comprende", implica la inclusion de un elemento indicado, numero entero o etapa o grupo de elementos, numeros enteros o etapas, pero no la exclusion de cualquier otro elemento, numero entero o etapa, o grupo de elementos, numeros enteros o etapas.
La referencia a cualquier tecnica anterior en esta memoria descriptiva no es, y no se debena tomar como, un reconocimiento o cualquier forma de sugerencia de que esa tecnica anterior forma parte del conocimiento general en Australia o en otro lugar.
Las estrategias actuales para el tratamiento de la hepatitis alcoholica incluyen administracion de agentes inmunosupresores tales como esteroides y mas recientemente se han usado estrategias anti-TNF. Los datos para el uso de estos farmacos en hepatitis alcoholica son contradictorios y, aunque los esteroides se usan ampliamente, existe una heterogeneidad considerable en los resultados de los ensayos clmicos existentes. De forma analoga, se ha demostrado que el uso de estrategias anti-TNF en la hepatitis alcoholica en pacientes tiene un efecto positivo en algunos estudios mientras que el aumento del riesgo de infeccion (y mortalidad) ha dado como resultado la detencion del ensayo clmico en otros estudios.
Por lo tanto, existe una necesidad de identificar que pacientes van a responder probablemente a que tratamientos terapeuticos. Hay una necesidad particular de identificar si algunos pacientes en particular presentan riesgo de infeccion mas elevado, insuficiencia organica y/o mortalidad y si algunos reglamentos en particular pueden aumentar estos riesgos.
Los inventores han determinado que la deteccion o medicion de endotoxina o actividad de endotoxina en plasma o sangre completa de pacientes con enfermedad hepatica permite la clasificacion de esos pacientes en grupos de riesgo bajo o riesgo elevado. Esto permite la prediccion del pronostico de un paciente. En particular, esto permite la determinacion del riesgo relativo de mortalidad, riesgo de infeccion y el riesgo de insuficiencia organica en pacientes con insuficiencia hepatica. La evaluacion de endotoxinas o la actividad de endotoxina o tambien puede ayudar a definir la asignacion a una terapia espedfica. Esto se puede usar para determinar si un paciente se debe tratar con, por ejemplo, antibioticos, corticosteroides, anti-TNF o terapia extracorporea. Esto tambien se puede usar para predecir si es probable que dichas terapias conduzcan a efectos secundarios no deseados, tales como un aumento del riesgo de infeccion. Esta informacion la puede usar un medico con el fin de tomar una decision clmica en cuanto a la mejor manera de tratar un paciente individual.
Los inventores han demostrado que el uso de tales medidas actua como un indicador fiable de los resultados en pacientes con hepatitis alcoholica grave. Se cree que la aplicacion de un ensayo como se describe en el presente documento ayuda a definir aquellos pacientes en los que el tratamiento con agentes inmunosupresores, tales como estrategias con esteroides o anti-TNF sera eficaz. Esto tambien ayudara a definir a otros pacientes en los que tales terapias con inmunosupresores pueden conducir a un aumento del riesgo de infeccion. Tambien se cree que la aplicacion de este ensayo ayuda a definir a los pacientes con insuficiencia hepatica progresiva en los que se justifica la intervencion temprana con los sistemas de soporte hepatico, en comparacion con las puntuaciones de pronostico disponibles en la actualidad (DF, MELD, Child-Pugh). Su uso tambien se puede ampliar a una poblacion de pacientes que esperan un trasplante para estratificar la utilizacion de organos para trasplante o para determinar la funcion del organo despues del trasplante hepatico ortotopico.
La presencia del factor humoral de tipo endotoxina se puede evaluar mediante la deteccion del factor de forma directa, por ejemplo mediante la deteccion de la presencia de endotoxina, o se puede evaluar mediante la deteccion del factor de forma indirecta. Por ejemplo, un metodo puede comprender la deteccion de actividad de endotoxina como un indicador de la presencia de tal factor humoral, o la deteccion de un efecto corriente abajo causado por la presencia del factor humoral.
En todo este documento, las expresiones factor humoral, factor transmisible, factor de tipo endotoxina y endotoxina se usan indistintamente para describir el factor identificado en los Ejemplos en pacientes que tienen una enfermedad hepatica. Estos terminos pretenden hacer referencia a un factor que se puede encontrar en la sangre o plasma de tales pacientes, que es transmisible y que tiene actividad de endotoxina.
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El factor humoral se puede transmitir en plasma. Es dedr, la activacion de neutrofilos se puede causar en una poblacion de neutrofilos normales por exposicion a plasma que ha estado en contacto con una poblacion de neutrofilos activados. Por ejemplo, como se demuestra en los Ejemplos, el factor humoral puede causar la activacion de los neutrofilos que no se activaron previamente. Por lo tanto, un metodo para detectar endotoxina (factor humoral) puede implicar la puesta en contacto del plasma del individuo con una muestra de neutrofilos normales no de ese individuo y determinar si esto causa una funcion anomala, tal como activacion, en esos neutrofilos. Los neutrofilos pueden ser cualquier muestra de neutrofilos normales como se describe en el presente documento. Por ejemplo, los neutrofilos pueden ser de un individuo que no tiene insuficiencia hepatica, pueden ser de una poblacion de neutrofilos que han sometido a ensayo con anterioridad y que han demostrado tener una funcion normal, por ejemplo muestra que no se van a activar, o pueden ser de una lmea celular de neutrofilos. Alguna funcion de los neutrofilos, tal como activacion de neutrofilos se puede medir con cualquiera de los metodos que se describen en el presente documento, por ejemplo mediante la evaluacion de estallido oxidativo o niveles de MPO. Tal ensayo se puede realizar en una muestra de plasma del individuo y se puede realizar in vitro.
La presencia de un factor en el plasma de un individuo que padece insuficiencia hepatica, factor que es capaz de activar los neutrofilos, es indicativo de que el propio individuo ha activado neutrofilos y es indicativo de que el individuo se puede clasificar como de alto riesgo como se describe en el presente documento.
Los inventores han demostrado que la actividad transmisible del factor humoral en plasma se puede eliminar mediante la eliminacion de endotoxina. De forma analoga, la activacion de neutrofilos se puede estimular mediante la exposicion de esos neutrofilos a endotoxina.
Los ensayos con respecto al factor transmisible se pueden adaptar por lo tanto para la deteccion de endotoxina o sus efectos. Por ejemplo, los ensayos pueden detectar la presencia de endotoxina en el plasma del individuo, o efectos espedficos de esa endotoxina. La presencia o actividad de endotoxina se puede detectar usando metodos conocidos en la tecnica.
La medida de la actividad de endotoxina se puede conseguir en una variedad de maneras. Por ejemplo, un metodo de la invencion comprende la evaluacion de la funcion de los neutrofilos del individuo mediante la evaluacion de la capacidad de fagocitosis de los neutrofilos. Otras funciones de neutrofilos incluyen su capacidad para realizar otras funciones de neutrofilos esenciales tales como estallido oxidativo o desgranulacion. Algunos efectos bioqmmicos espedficos de la activacion de neutrofilos tambien se pueden evaluar, como la liberacion de oxidantes reactivos o produccion de acido hipocloroso despues de la activacion de MPO por una poblacion de neutrofilos.
La presencia de, o cantidad de, endotoxina se puede evaluar en una variedad de maneras. Esto implicara la deteccion de, y/o medida de, endotoxina, una actividad de endotoxina, o un efecto de la endotoxina corriente abajo, y una comparacion con la presencia, cantidad, o nivel de endotoxina, actividad de endotoxina o un efecto de la endotoxina corriente abajo en un individuo normal. Por ejemplo, esto puede implicar la deteccion de, y/o medida de una funcion de los neutrofilos en el individuo y una comparacion con el mismo o equivalente funcion en neutrofilos normales. Por ejemplo, la presencia, cantidad o efecto de endotoxina, como funcion de los neutrofilos, en una muestra de un individuo con insuficiencia hepatica se puede comparar con la presencia, cantidad o efecto de endotoxina, tal como funcion de los neutrofilos, en una muestra de control, tal como una muestra (por ejemplo, de neutrofilos) que no es de ese individuo. La muestra de control para comparacion puede ser de un individuo que no tiene enfermedad hepatica o un individuo que no tiene insuficiencia hepatica, tal como un individuo que tiene una funcion hepatica normal. Tal comparacion con una muestra normal, tal como neutrofilos con funcionamiento normal permitira una evaluacion de si los niveles de endotoxina (por ejemplo, funcion de los neutrofilos) en el individuo con insuficiencia hepatica son normales, y por lo tanto el individuo presenta un riesgo bajo de los factores que se describen en el presente documento, o si los niveles de endotoxina (por ejemplo, funcion de los neutrofilos) son anomalos, y por lo tanto el individuo presenta un riesgo elevado para la factores que se describen en el presente documento.
En algunos ensayos, se puede evaluar la proporcion de neutrofilos en una muestra que reacciona de una manera en particular. En otros ensayos, la reaccion global de una poblacion se puede cuantificar. En otros ensayos, se puede evaluar la reaccion promedio de los individuos dentro de una poblacion de neutrofilos. Todavfa en otros ensayos, la presencia o ausencia de factores espedficos en una muestra se puede evaluar o cuantificar.
Cuando el ensayo implica la cuantificacion de una medida de presencia, actividad o efecto de endotoxina, tal como funcion de los neutrofilos, una comparacion de la cantidad obtenida en relacion con un individuo que tiene enfermedad hepatica se puede comparar con la cantidad obtenida para un control. Cuando las cantidades son las mismas o similares, la endotoxina en el individuo se puede considerar normal y el individuo se puede clasificar como de bajo riesgo. Una cantidad que es similar a un control puede diferir de la de control en menos de un 1 %, menos de un 2 %, menos de un 5 %, menos de un 10 % o menos de un 20 %. Cuando las cantidades son diferentes, la endotoxina en el individuo se puede considerar anomalo y el individuo se puede clasificar como de alto riesgo. Una cantidad que es diferente a la de un control puede diferir de la del control en mas de un 1 %, mas de un 2 %, mas de un 5 %, mas de un 10 % o mas de un 20 %. Un umbral adecuado para evaluar si existe una diferencia se puede determinar basandose en el ensayo que se esta usando en particular. Por ejemplo, cuando un ensayo tiene un alto
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grado de variabilidad entre muestras de control, una mayor varianza del control se puede considerar una diferencia de acuerdo con la invencion. Cuando un ensayo tiene menos variabilidad y las muestras de control muestran una mayor coherencia, una diferencia mas pequena desde el control se puede considerar tal diferencia.
Como se explica a continuacion con mas detalle, puede que no sea necesario realizar una comparacion directa de muestras de insuficiencia hepatica (por ejemplo, neutrofilos) y muestras normales (por ejemplo, neutrofilos) en cada ocasion. Para algunos ensayos, sera posible establecer un nivel de umbral o punto de corte basandose en los resultados obtenidos a partir de un numero de individuos. Los resultados obtenidos de un individuo se pueden comparar a continuacion con ese nivel de umbral o punto de corte, en lugar de con otra muestra, para determinar si la endotoxina (por ejemplo, funcion de los neutrofilos) es normal o anomala, y si el individuo se clasifica como en alto riesgo o bajo riesgo.
La funcion de los neutrofilos se puede evaluar con el nivel de activacion de los neutrofilos. Un aumento del nivel de activacion de neutrofilos en comparacion con los neutrofilos de un control normal es indicativo de que el individuo esta en riesgo elevado de los factores que se describen en el presente documento. Como se muestra en los Ejemplos, los inventores han encontrado que en algunos individuos (clasificados como de bajo riesgo), los neutrofilos generalmente estan cebados, pero no activados, mientras que en otros individuos (clasificados como de alto riesgo), los neutrofilos estan generalmente activados. Los neutrofilos cebados estan listos para responder a un ataque bacteriano. El cebado de los neutrofilos implica cambios funcionales y estructurales que dan como resultado un aumento de la respuesta a una estimulacion microbiana y se describe bien en la tecnica. Los neutrofilos activados tambien se describen bien en la tecnica.
Una funcion de los neutrofilos que se evalua de acuerdo con la invencion es la fagocitosis de neutrofilos. Los inventores han observado que la fagocitosis de neutrofilos es anomala en individuos clasificados como de alto riesgo para los factores que se describen en el presente documento. Por lo tanto, un individuo que presenta una fagocitosis anomala en comparacion con la fagocitosis por una poblacion normal de neutrofilos se puede clasificar como de alto riesgo para los factores que se describen en el presente documento. Un nivel y grado de fagocitosis de neutrofilos similares es indicativo de que el individuo se debena clasificar como de bajo riesgo para los factores que se describen en el presente documento. Los inventores observaron que en individuos de alto riesgo, los neutrofilos eran capaces de fagocitar bacterias de una manera similar a la de los controles sanos, pero el numero de bacterias fagocitadas por cada neutrofilo se reducfa de forma significativa en comparacion con el control normal de neutrofilos. Por lo tanto, los individuos se pueden clasificar como de alto riesgo si sus neutrofilos muestran tal alteracion en la capacidad de fagocitosis. Esto se puede indicar mediante una disminucion global de la fagocitosis por una poblacion de neutrofilos, o mediante una disminucion en el nivel de la fagocitosis conseguida neutrofilos individuales.
Un numero de enfoques diferentes se puede usar para cuantificar o valorar la fagocitosis. Por ejemplo, algunos metodos evaluaran el numero total o proporcion de neutrofilos que muestran fagocitosis dentro de una muestra. Esto puede proporcionar una indicacion de la actividad fagocftica relativa de diferentes muestras, ya que tales muestras pueden comprender poblaciones de neutrofilos que presentan fagocitosis de forma activa, y poblaciones de neutrofilos que no lo hacen. Como alternativa, algunos metodos pueden evaluar la cantidad total de fagocitosis que se esta produciendo en una muestra, tal como el numero de bacterias que se fagocitan cuando entran en contacto con una poblacion dada de neutrofilos. Tales metodos pueden proporcionar una indicacion de la tasa de destruccion de bacterias por una poblacion de neutrofilos dada. Una tasa de destruccion por celula de neutrofilo tambien se puede determinar en una base de muestra a muestra.
Esto se puede evaluar directamente, mediante la cuantificacion del nivel de fagocitosis conseguido por tales celulas. Esto se puede conseguir mediante etiquetado de material, tal como celulas, que se van a fagocitar, lo que permite que se produzca fagocitosis y a continuacion cuantificar y/o localizar la etiqueta para indicar si y cuantas celulas han fagocitado los neutrofilos. Por ejemplo, el kit Phagotest® (Orpegen Pharma, Heidelberg, Alemania) usa bacterias de E. coli opsonizadas etiquetadas con FITC y se puede usar para medir el porcentaje global de neutrofilos que muestran fagocitosis y el numero de bacterias atrapadas por celula. Por lo tanto, un metodo de la invencion puede cuantificar el numero de neutrofilos en una muestra que presenta fagocitosis. Un metodo de la invencion puede cuantificar el nivel de actividad de fagocitosis mostrada por neutrofilos individuales. Esto se puede conseguir mediante la cuantificacion del numero de celulas que los neutrofilos individuales, o una poblacion de neutrofilos son capaces de fagocitar.
Por lo tanto, de acuerdo con la presente invencion, la funcion de los neutrofilos se evalua en un individuo. Preferentemente con esto se realiza in vitro o ex vivo en una muestra del individuo. Como se explica en el presente documento, la funcion anomala de los neutrofilos se puede usar como un indicador de la progresion de la enfermedad en un paciente con insuficiencia hepatica. Como se ha explicado anteriormente, la funcion anomala de los neutrofilos se puede detectar mediante la reduccion de la actividad fagocftica. Los pacientes en los que se observa reduccion de fagocitosis, se pueden clasificar como de alto riesgo de los factores que se describen en el presente documento.
Los indicadores de la funcion anomala de los neutrofilos se pueden cuantificar mediante comparacion con los niveles relativos en individuos que no padecen enfermedad hepatica. Por ejemplo, una muestra de neutrofilos de un
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individuo que no esta afectado por una enfermedad hepatica o un individuo que no tiene insuficiencia hepatica se puede usar para comparacion. Por lo general, los neutrofilos de control para comparacion debenan ser de una fuente en la que se espera que los neutrofilos sean normales. Un numero de tales muestras se puede usar para conseguir un nivel medio "normal" para la funcion que se esta evaluando. Usando un enfoque de este tipo, puede ser posible establecer niveles particulares de, por ejemplo, fagocitosis u otra funcion de los neutrofilos que seran particularmente indicativos de estos efectos clmicos.
De acuerdo con la presente invencion, una determinacion de la funcion de los neutrofilos mediante una evaluacion de la capacidad de fagocitosis de los neutrofilos, se pueden usar para clasificar individuos. Usando estos metodos, los individuos que tienen insuficiencia hepatica se pueden clasificar como de alto riesgo o de bajo riesgo de una diversidad de factores. Como se ha descrito anteriormente, los individuos se pueden clasificar de esta manera basandose en la funcion de sus neutrofilos.
Los individuos en los que los neutrofilos funcionan por lo general de la misma manera que los neutrofilos normales (por ejemplo, de un individuo que no tiene enfermedad hepatica) se clasifican como de bajo riesgo. Estos individuos tienen un riesgo menor de factores tales como infeccion, insuficiencia organica y mortalidad. Estos individuos son mas propensos a responder a las terapias de insuficiencia hepatica convencionales, tales como agentes inmunosupresores, corticosteroides y antibioticos.
Los individuos en los que los neutrofilos no estan funcionando normalmente se clasifican como de alto riesgo. Como se describe en el presente documento, la funcion anomala de los neutrofilos se puede observar como, por ejemplo, disminucion de fagocitosis. Los individuos en esta categona se encuentran en mayor riesgo de infeccion, mayor riesgo de insuficiencia organica y mayor riesgo de mortalidad. El aumento del riesgo de insuficiencia organica y mortalidad en estos individuos puede ser un resultado directo del aumento del riesgo de infeccion. Tales individuos de alto riesgo tambien son mas propensos a no responder a tratamientos convencionales para la enfermedad hepatica, tales como agentes inmunosupresores, esteroides y antibioticos. Se observa que en los estudios realizados por los inventores, este grupo de pacientes de alto riesgo terna infeccion con multiples organismos no convencionales resistentes a pesar de la terapia con antibioticos, a menudo durante el mismo ingreso hospitalario. El uso de tales tratamientos en individuos de alto riesgo puede aumentar aun mas el riesgo de infeccion en esos individuos, y las posibles consecuencias de tal infeccion, tales como insuficiencia organica y mortalidad.
Por consiguiente, una funcion anomala de los neutrofilos en un individuo con insuficiencia hepatica es indicativo de una mayor probabilidad de infeccion y/o insuficiencia organica, aumento de la mortalidad y disminucion de la probabilidad de que el paciente responda bien a tratamiento con esteroides, antibioticos o inmunosupresores.
Los resultados informados en el presente documento tambien pueden tener implicaciones importantes en la seleccion de pacientes que tienen insuficiencia hepatica para terapia inmunosupresora. Aunque existe controversia en torno al uso de corticosteroides y estrategias anti-TNF para el tratamiento de rutina de enfermedades hepaticas tales como hepatitis alcoholica, existen ciertas dudas sobre su eficacia en pacientes seleccionados. Los metodos que se describen en el presente documento pueden permitir la seleccion de pacientes en los que se debena considerar tal tratamiento, y en pacientes en los que se debena evitar tal tratamiento. Esto tambien permite la identificacion de pacientes en los que se incrementa el riesgo de infeccion. A continuacion, tales individuos se pueden vigilar con mas cuidado y someter a controles y procedimientos mas rigurosos con el fin de evitar que se produzca una infeccion de este tipo.
De forma ideal, el resultado de un metodo de la invencion debena ser predictivo de un resultado espedfico, tal como mortalidad, es decir, de forma ideal, al experto en la materia le gustana ser capaz de determinar el resultado clmico, por ejemplo supervivencia o muerte, sobre la base de tal metodo.
Una curva de funcionamiento del receptor (ROC) caractenstica puede permitir que esto se consiga. Tales curvas exploran la relacion entre la sensibilidad y la especificidad de un ensayo clmico para una diversidad de diferentes puntos de corte, permitiendo de este modo la determinacion de un punto de corte optimo, es decir, sera deseable seleccionar un punto de corte por encima del cual el resultado perjudicial de insuficiencia hepatica, tal como aumento del riesgo de infeccion, aumento de mortalidad y disminucion de la respuesta a la inmunoterapia se indique a continuacion y por debajo del cual se indique un pronostico mas positivo.
Algunas medidas usadas normalmente en la realizacion de un ensayo clmico son la sensibilidad y la especificidad. La sensibilidad es la probabilidad de que la enfermedad (o resultado en el caso de la presente invencion) se diagnostique cuando esta realmente presente y la especificidad es la probabilidad de que la enfermedad se identifique como ausente cuando esta correctamente ausente. De forma ideal, tanto la sensibilidad como la especificidad debenan ser uno. Sin embargo, el cambio del punto de corte para tratar de aumentar una de sensibilidad y especificidad normalmente dara lugar a una disminucion en la otra.
La curva de ROC es una tecnica grafica para establecer el punto de corte optimo. Para construir una curva de ROC se necesita calcular la sensibilidad y la especificidad para cada valor de punto de corte posible. Para hacer el grafico ROC, el eje X es 1 menos la especificidad y el eje Y es la sensibilidad. Una lmea diagonal se extrae de la esquina
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inferior izquierda a la esquina superior derecha. Este grafico refleja las caractensticas de un ensayo sin capacidad de discriminacion. Cuanto mas se acerca el grafico a la esquina superior izquierda, mejor es para discriminar entre casos y no casos. Un mdice de calidad del ensayo es el area bajo la curva - cuanto mas cerca de uno este este valor, mejor es la capacidad de discriminacion del ensayo.
Por consiguiente, una curva de ROC se puede usar para establecer un punto de corte para un ensayo de la invencion. Una puntuacion por encima del punto de corte puede ser indicativa de resultados perjudiciales, mientras que una puntuacion por debajo del punto de corte puede ser indicativa de resultados no perjudiciales.
El punto de corte se puede seleccionar dependiendo de los requisitos del ensayo, por ejemplo si es mas importante excluir falsos positivos o si es mas importante identificar todos los positivos verdaderos. En el caso de un ensayo para identificar a los pacientes ingresados con insuficiencia hepatica que van a morir, es importante que todos esos pacientes se identifiquen como en cuyo caso el punto de corte tambien puede identificar bien un numero de falsos positivos.
Los expertos en la materia pueden identificar un punto de corte apropiado.
Los ejemplos muestran que un punto de corte de un 42 % de GMFI en el ensayo de Phagotest® tema una sensibilidad de un 86 % y una especificidad de un 76 % para prediccion de muerte. Un paciente que tiene menos de un 42 % de la GMFI normal se puede clasificar como con aumento de riesgo de infeccion, aumento de mortalidad y disminucion de la probabilidad de respuesta al tratamiento con inmunosupresores tal como tratamiento con esteroides. Un paciente que tiene un valor mayor o igual que un 42 % de la GMFI normal en este ensayo se puede clasificar como con un aumento del riesgo de infeccion, disminucion de la mortalidad y aumento de la probabilidad de respuesta a tratamiento con inmunosupresores.
Como alternativa, el metodo de la invencion se puede usar para dar informacion de pronostico relativa o comparativa sobre un individuo. Por ejemplo, para algunas medidas de la funcion de los neutrofilos puede existir una relacion lineal, con mayor desviacion de la funcion normal que se correlaciona con un aumento de la gravedad de la enfermedad hepatica o un pronostico cada vez peor para el paciente.
El metodo de la invencion se puede realizar en combinacion con uno o mas sistemas de puntuacion adicionales usados para evaluar la gravedad de enfermedad hepatica y encefalopatfa hepatica y tambien el pronostico de los sujetos. Por ejemplo, de aproximadamente dos, tres, cuatro o mas a aproximadamente cinco, seis, siete, ocho o mas sistemas de puntuacion se pueden combinar con los de la invencion. Tales sistemas de puntuacion adicionales incluyen el sistema de puntuacion de Child-Pugh, Criterios de West Haven, Escala de Coma de Glasgow o sistema de puntuacion de Child-Pugh modificado. Como alternativa, o ademas, se pueden usar DF, SOFA, MELD o sistema de puntuacion APACHE II como sistemas de puntuacion usados. Los puntos se asignan a parametros que incluyan niveles de bilirrubina en suero, niveles de albumina en suero y a signos que incluyen presencia de ascitis o encefalopatfa. Los sujetos a tratar se pueden clasificar en la clase A, B o C de Child-Pugh. Por lo general, los sujetos a tratar se clasifican en la clase C de Child-Pugh.
La evaluacion de la funcion hepatica puede ser util en una amplia gama de situaciones. Por ejemplo, el metodo permite distinguir los pacientes con disfuncion hepatica de los que no tienen disfuncion hepatica. Por lo tanto, la progresion de la cirrosis alcoholica se puede controlar usando el metodo de la invencion; en particular, se pueden identificar aquellos pacientes que son propensos a sufrir un resultado perjudicial. Es decir, el metodo de la invencion se puede usar para predecir el resultado de cirrosis alcoholica.
Por lo tanto, la invencion permite la seleccion de un tratamiento adecuado para un individuo con cirrosis alcoholica. Sera menos probable que un paciente que presenta disminucion de fagocitosis de neutrofilos, como se describe en el presente documento, responda bien a tratamientos convencionales de enfermedad hepatica, tales como tratamiento con esteroides, administracion de antibioticos y terapias con inmunosupresores. De hecho, es probable que si se administran terapias con inmunosupresores a tal paciente, el pronostico de ese paciente podna empeorar, con un aumento del riesgo de infeccion y mortalidad. Por lo tanto, la presente invencion permite la seleccion de un enfoque adecuado para el tratamiento de cirrosis alcoholica en un individuo, dependiendo de si ese individuo tambien presenta una funcion anomala de neutrofilos. Si el paciente no presenta una funcion anomala de neutrofilos, entonces se podna esperar que algunas inmunoterapias, administracion de antibioticos o tratamiento con esteroides fuera beneficios.
La insuficiencia hepatica es la etapa final de la enfermedad hepatica. La insuficiencia hepatica se divide en tipos en funcion de la rapidez del inicio. La insuficiencia hepatica aguda se desarrolla rapidamente, pero la insuficiencia hepatica cronica puede tardar meses o anos en desarrollarse. Por definicion, la insuficiencia hepatica se produce cuando el hngado esta demasiado enfermo, y funciona con deficiencia, que la encefalopatfa es evidente. Cualquier enfermedad hepatica progresiva puede dar como resultado insuficiencia hepatica; algunos ejemplos incluyen: toxicidad con acetaminofeno, cirrosis, hepatitis vmca y cancer metastasico del tngado. Otros signos de enfermedad hepatica tales como ictericia, ascitis, hedor hepatico y fallo de coagulacion indican que el hngado esta teniendo problemas para realizar sus funciones fisiologicas normales, pero no se denomina insuficiencia hepatica hasta que
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aparecen cambios en el estado mental.
El pronostico para pacientes con enfermedad hepatica o insuficiencia hepatica es diffcil de calcular debido a que la afeccion tiene muchas causas. Sin embargo, de acuerdo con la invencion, es posible predecir el resultado clmico de la enfermedad hepatica, en particular en pacientes con insuficiencia hepatica aguda, asf como en aquellos con ACLF. Es particularmente util en la prediccion de la evolucion clmica en pacientes con hepatitis alcoholica.
Por consiguiente, el metodo de la invencion realiza en un individuo que padece cirrosis alcoholica. Este puede ser un individuo cuyo hngado esta descompensado o que muestra encefalopatfa hepatica. El hngado del individuo puede estar en el estado compensado. El metodo se realiza preferentemente en un individuo que se encuentra en insuficiencia hepatica. El individuo puede tener una enfermedad hepatica cronica. El individuo tiene cirrosis hepatica, por ejemplo, con o sin hepatitis alcoholica. El individuo puede tener insuficiencia hepatica aguda. El individuo puede tener encefalopatfa hepatica.
La enfermedad hepatica cronica puede ser inducida por alcohol. Un hombre o una mujer a tratar pueden ser, o haber sido, un alcoholico. El o ella pueden ser, o haber sido, consumidores de un promedio de 50 o mas unidades de alcohol a la semana, de 60 o mas unidades de alcohol a la semana, 75 o mas unidades de alcohol a la semana e incluso 100 o mas unidades de alcohol a la semana. El hombre o la mujer pueden ser, o haber sido, consumidores de un promedio de hasta 100 unidades de alcohol a la semana, hasta 150 unidades de alcohol a la semana e incluso hasta 200 unidades de alcohol a la semana. La medida de una unidad de alcohol difiere de un pafs a otro. Aqrn, una unidad equivale a 8 gramos de etanol de acuerdo con el patron del Reino Unido.
El hombre o la mujer puede haber estado consumiendo tales niveles de alcohol durante 5 o mas anos, 10 o mas anos, 15 o mas anos o 20 o mas anos. El individuo puede haber estado consumiendo dichos niveles de alcohol hasta 10 anos, hasta 20 anos, hasta 30 anos e incluso hasta 40 anos. En los casos de cirrosis hepatica inducida por alcohol, el individuo puede aparecer envejecido, por ejemplo, 25 anos o mas, 35 anos o mas, 45 anos o mas e incluso mas de 60 anos.
El individuo puede ser hombre o mujer. Las mujeres pueden ser mas susceptibles a los efectos adversos del alcohol que los hombres. Las mujeres pueden desarrollar enfermedad hepatica cronica alcoholica en un periodo de tiempo mas corto y por cantidades mas pequenas de alcohol que los hombres. No parece que exista ningun factor que tenga en cuenta el aumento de la susceptibilidad al dano hepatico alcoholico en las mujeres, pero el efecto de las hormonas en el metabolismo del alcohol puede desempenar un papel importante.
Por lo tanto, el individuo puede estar padeciendo hepatitis alcoholica. La hepatitis alcoholica puede variar desde una hepatitis leve, con ensayos de laboratorio anomalos siendo la unica indicacion de enfermedad, a disfuncion hepatica grave con complicaciones tales como ictericia (piel amarilla causada por retencion de bilirrubina), encefalopatfa hepatica, ascitis, varices esofagicas sangrantes, coagulacion sangumea anomala y coma.
El individuo puede tener una o mas de una serie de otras afecciones conocidas de las que se sabe que dan como resultado dano hepatico tales como, por ejemplo, cirrosis biliar primaria, hepatitis autoinmune cronica activa, y/o esquistosomiasis (infeccion parasitaria). El individuo puede tener o haber tenido una obstruccion de los conductos biliares. En algunos casos, la causa subyacente de la enfermedad hepatica puede no conocerse. Por ejemplo, el individuo puede haber sido diagnosticado con cirrosis criptogenica. Por consiguiente, se puede sospechar que el individuo tiene cualquiera de las afecciones enumeradas en el presente documento.
Algunos metodos para el pronostico de enfermedad hepatica tales como insuficiencia hepatica aguda y encefalopatfa hepatica se conocen bien en la tecnica y en particular por medicos y veterinarios en el campo. Preferentemente con el individuo habra sido diagnosticado con insuficiencia hepatica, por ejemplo por un profesional medico o veterinario. El individuo puede mostrar uno o mas smtomas asociados con enfermedad hepatica tales como uno o mas de ictericia, ascitis, cambios en la piel, retencion de lfquidos, cambios en las unas, facil aparicion de hematomas, hemorragias nasales, varices esofagicas, y en individuos de sexo masculino puede haber aumento de los pechos. El individuo puede mostrar cansancio, fatiga, perdida de apetito, nauseas, debilidad y/o perdida de peso. El individuo tambien puede mostrar uno o mas smtomas asociados con la encefalopatfa hepatica, tales como uno o mas de confusion, desorientacion, demencia, estupor, coma, edema cerebral, insuficiencia de multiples organos (insuficiencia respiratoria, insuficiencia cardiovascular o insuficiencia renal), inflexibilidad/rigidez muscular, convulsiones o deterioro del lenguaje. El individuo a tratar puede o no estar tomando otros farmacos para tratar la enfermedad hepatica. El individuo a tratar puede presentar riesgo de desarrollo de encefalopatfa hepatica.
La enfermedad hepatica puede haber sido, o ser, confirmada por el examen ffsico que incluye tecnicas tales como ecograffa. Se pueden haber tomado biopsias de tngado para buscar acumulacion de fibrosis, celulas necroticas, degeneracion celular y/o inflamacion y otros rasgos caractensticos de la enfermedad hepatica. La funcion hepatica se puede haber evaluado en el individuo para determinar si esta se ve comprometida en el individuo. La naturaleza y la causa subyacente de la enfermedad hepatica se pueden caracterizar. Se puede determinar cualquier historia de exposicion a agentes causantes de enfermedad hepatica.
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El individuo a tratar pueden presenta riesgo de episodios de encefalopatfa hepatica, por ejemplo pacientes que esperan trasplantes de tugado, pacientes con hipertension quirurgica y/o portal. Una persona en riesgo de episodios de encefalopatfa hepatica es una persona que no ha padecido ningun episodio de encefalopatia hepatica o no ha padecido ningun episodio de encefalopatfa hepatica durante un periodo prolongado de tiempo (aproximadamente 12 semanas o superior), pero tiene un trastorno o afeccion medica que crea un riesgo de episodios de encefalopatfa hepatica. Un episodio de encefalopatia hepatica es una afeccion clmica caracterizada por la presencia de disfuncion cerebral en pacientes con enfermedad o disfuncion hepatica. Hay un amplio espectro de trastornos mentales en la encefalopatia hepatica que vanan desde un mmimo en el que los principales efectos son una reduccion de la calidad de vida, hasta conocimiento publico que conducen a, y por ultimo a la muerte.
En la invencion, se evalua la funcion de los neutrofilos de un individuo. Por lo general, el metodo se realiza in vitro o ex vivo en una muestra del individuo. Por lo general, la muestra sera de un tejido de que se sabe que contiene neutrofilos o un tejido que ha estado en contacto con neutrofilos.
Por lo general, la muestra comprende un fluido corporal del individuo. La muestra puede ser una muestra de sangre del individuo, tal como una muestra de sangre, que comprende neutrofilos. La muestra puede ser una muestra de sangre que se ha procesado para eliminar otros componentes pero dejando algunos componentes, por ejemplo neutrofilos, presentes. Por ejemplo, la muestra puede ser una muestra de sangre que se ha fraccionado y una fraccion que comprende los neutrofilos seleccionados. La funcion de los neutrofilos se puede evaluar en una poblacion de neutrofilos o en los neutrofilos individuales. Por ejemplo, algunos ensayos mediran la proporcion de neutrofilos en una muestra que tienen una caractenstica o respuesta en particular. Otros ensayos evaluaran las caractensticas o la funcion de los neutrofilos individuales. La muestra puede ser un componente de la sangre con la que el neutrofilo ha estado en contacto. La muestra puede contener neutrofilos. La muestra puede no contener neutrofilos. La muestra puede no contener celulas. Por ejemplo, la muestra puede ser una muestra de plasma de un individuo. Estas muestras se pueden obtener de cualquier manera apropiada. Los expertos en la materia conocen bien algunos metodos para obtener la sangre, plasma y otras fracciones de sangre.
La informacion obtenida mediante la evaluacion de endotoxinas (por ejemplo, funcion de los neutrofilos) se puede usar para seleccionar un agente terapeutico adecuado. Por ejemplo, si la evaluacion de la endotoxina conduce a una clasificacion del individuo como de alto riesgo, como se describe en el presente documento, se pueden evitar los tratamientos tales como inmunosupresores, esteroides y antibioticos. Si la evaluacion de la endotoxina conduce a una clasificacion del individuo como riesgo bajo, como se describe en el presente documento, se pueden seleccionar tratamientos tales como inmunosupresores, esteroides y antibioticos para el tratamiento de ese individuo.
Por lo tanto, la invencion tambien se puede usar en combinacion con un metodo para tratamiento de insuficiencia hepatica, metodo que comprende la determinacion de si o no el individuo tiene endotoxinas anomalas usando un metodo como se ha descrito anteriormente y
(a) si el individuo tiene endotoxinas anomalas (por ejemplo, funcion de los neutrofilos anomala), administrar al individuo una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente util en el tratamiento de insuficiencia hepatica que no tiene un efecto inmunosupresor; o
(b) si el individuo no tiene endotoxinas anomalas (por ejemplo, funcion de los neutrofilos), administrara al individuo una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente util en el tratamiento de insuficiencia hepatica que tiene un efecto inmunosupresor.
Los siguientes ejemplos ilustran la invencion.
Ejemplos
METODOS
Seleccion del paciente
Todos los pacientes o sus familiares firmaron el consentimiento informado y el estudio fue aprobado por el comite de etica local. Los pacientes ingresados con evidencia de cirrosis alcoholica se seleccionaron para este estudio, en el momento de una biopsia hepatica transyugular indicada de forma clmica. Los pacientes se inclman si eran admitidos con descompensacion aguda de cirrosis alcoholica manifestada con el aumento de ictericia, ascitis o grado 1 o 2 de encefalopatfa hepatica y asf era si no habfa evidencias microbiologicas (cultivos de rutina de orina, sangre, esputo y ascitis) de la infeccion. Los pacientes se exclrnan si teman <18 o > 75 anos de edad, habfa evidencia de: insuficiencia organica (necesidad de inotropicos, insuficiencia renal - creatinina > 150, grado 3 o 4 de encefalopatfa hepatica, necesidad de ventilacion mecanica, disfuncion cardiaca grave), hiponatremia, neoplasia hepatica/extrahepatica, con 3 dfas de sangrado gastrointestinal o si recibfan alguna terapia con inmunomoduladores antes de la entrada en el estudio.
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Diseno del estudio
Despues de la correccion de cualquier trastorno electrolftico asociado o hipovolemia, se recogieron muestras de sangre y se usaron para deteccion de bioqmmica de rutina, funcion de los neutrofilos, perfil de citoquinas y acido tiobarbiturico (T-BARS/MDA modificado). La sangre venosa periferica se recogio de forma aseptica en tubos sin pirogenos (BD Vacutainer con Heparina-Litio, 60 U por tubo, Beckton y Dickinson, Plymouth, Reino Unido)) de pacientes y voluntarios sanos. Para experimentos con celulas, la sangre se mantuvo a temperatura ambiente, para recogida de plasma, la sangre se coloco en hielo inmediatamente. Despues de centrifugacion, el plasma se dividio en alrouotas en condiciones sin pirogenos en criotubos sin endotoxinas (Corning Inc., Corning, NY) y se almaceno a -80 °C hasta su analisis posterior. Se usaron 100 pl de sangre completa o 50 pl de neutrofilos aislados y 50 pl de plasma para realizar el Phagoburst® o el Phagotest®. Para todos los experimentos se tomaron precauciones estrictas para evitar la contaminacion con endotoxinas mediante trabajando de forma aseptica y usando equipo sin endotoxinas. Se evaluaron bilirrubina, albumina, ensayos de funcion hepatica, parametros de coagulacion, hemograma completo, y la protema C reactiva (CRP) de forma rutinaria. Se calculo la funcion de Maddrey y la puntuacion de Pugh. Los pacientes se siguieron de forma prospectiva durante un penodo de 90 dfas. La aparicion de disfuncion organica y mortalidad se registraron. La identificacion sistematica de cultivos de sangre se realizo con regularidad, y la polttica de unidad de los inventores era usar antibioticos profilacticos en el momento de la presentacion en la mayona de los pacientes.
Neutrofilos
Los neutrofilos se investigaron en cualquiera de un ensayo de sangre completa (como se describe a continuacion) o despues de aislamiento con una centrifugacion de gradiente de una etapa.
Activacion de neutrofilos (estallido oxidativo) y Fagocitosis
El kit Phagoburst® (Orpegen Pharma, Heidelberg, Alemania) se uso para determinar el porcentaje de neutrofilos se producen oxidantes reactivos mediante estimulacion con bacterias de E. coli opsonizadas o sin ningun estfmulo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El Phagotest® (Orpegen Pharma, Heidelberg, Alemania) se uso para medir el porcentaje total de neutrofilos que presentaban fagocitosis y la actividad fagocftica celular individual usando bacterias de E. coli opsonizadas etiquetadas con FITC (dejase el apendice). Los neutrofilos se seleccionaron de acuerdo con caractensticas de dispersion directa y lateral (figura 2A) y posteriormente se analizo el porcentaje de celulas positivas para CD 16 - celulas positivas para FITC, que correspondfa al porcentaje de neutrofilos experimentando fagocitosis y la media geometrica de intensidad de fluorescencia (GMFI), que corresponde al numero de bacterias atrapadas por una celula (figura 1B, D, F). Para evitar la variabilidad debida a diferencias de lote a lote de bacterias, los resultados se normalizaron con respecto a la media de al menos 3 muestras de control sanas para cada nuevo lote de bacterias usadas. Las muestras se analizaron por triplicado o duplicado.
Incubacion con endotoxina
La endotoxina (Lote 085K4068 de 0111:B4 de E. coli, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) se preparo como una solucion de reserva de 1 mg/ml y se diluyo en el momento con PBS con respecto a las concentraciones indicadas. La sangre completa se incubo durante 1 h con la respectiva concentracion de endotoxina a 37 °C en un bano de agua antes de realizar Phagotest® o Bursttest®.
Eliminacion de endotoxinas de columnas del paciente
Uso de Detoxigel
Se usaron columnas rellenas previamente con Detoxi-Gel® Affinity-pack (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) que conterna un gel de eliminacion de endotoxinas que consiste en polimixina B inmovilizada que se une a la parte del lfpido A de lipopolisacaridos bacterianos para eliminar endotoxinas de muestras de plasma. Se incubaron 100 pl de esta muestra de plasma diluida, sin endotoxinas con 50 pl de suspension celular y se realizo Bursttest® o Phagotest® tal como se ha indicado.
Uso de Anticuerpo CD14:
Se incubaron 100 pl de plasma y 50 pl de PBS con 5 pl de un anticuerpo CD14 anti-humano (Clon 11D18, Immuntools, Friesoythe, Alemania) (conocido por neutralizar a LPS) durante 60 minutos antes de realizar el Phagotest® o el Bursttest®.
Citoquinas
Se determinaron TNFa, sTNFaR1, sTNFaR2, IL-6 e IL-8 en plasma usando kits disponibles en el mercado (BioSource International, Nivelles, Belgica).
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Malondialdeh^do y prostaglandina F2a
El malondialdelmdo (MDA) se determino usando un ensayo modificado de sustancias reactivas de acido tiobarbiturico como se conoce en la tecnica. El 8-Isoprostano F2alfa libre se sometio a ensayo con un kit de EIA comercial (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI).
Estad^sticas
Para comparacion de los grupos se usaron ensayo de Chi-Cuadrado, ensayo de t o ensayo de Mann-Whitney si fuera apropiado, para comparacion de mas de dos grupos se uso ensayo de ANOVA con analisis a posteriori de Turkey (varianzas iguales) o Dunnett C (varianzas distintas) para conjuntos de datos si fuera apropiado. Para evaluar la precision del pronostico, se construyeron curvas de caractensticas de funcionamiento del receptor (ROC) y se calcularon las areas bajo la curva (AUROC). Las diferencias de supervivencia se analizaron con el ensayo de rango logantmico. El coeficiente de correlacion de Pearson se uso para evaluar la relacion entre variables. Los resultados se proporcionan como media ± ETM. Un valor de p < 0,05 se consideraba significativo.
Actividad de mieloperoxidasa
Se selecciono un grupo de 10 pacientes con gravedad variable de enfermedad hepatica. El estallido en reposo de neutrofilos (%) se midio en una muestra de cada paciente como se describe en el presente documento. La actividad de mieloperoxidasa (MPO) libre (sin celulas) tambien se evaluo.
La sangre se recogio en tubos revestidos con EDTA (como un anticoagulante) enfriados previamente y se almacenaron en hielo. A continuacion, las muestras se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 minutos a 4 °C para separar los componentes celulares, y el plasma resultante se recogio y se almaceno en crioviales esteriles a -80 °C hasta el analisis.
El analisis comprendfa la incubacion de plasma (50 jl) en una solucion de tampon de fosfato 100 mM (pH 7), que contema guayacol 13 mM (2-metoxifenol) y bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) al 0,02 % a 37 °C (volumen total de 1 ml). Despues de un penodo de equilibrio de 5 minutos, la reaccion comenzo con la adicion de 1 jmol de peroxido de hidrogeno (H2O2). La evolucion de la reaccion se controlo a 470 nm durante 60 minutos en un espectrofotometro de matriz de diodo. La actividad de MPO se determino a partir de la tasa de cambio en la absorbancia a 470 nm (despues de eliminar las senales de absorbancia de fondo), y se expresa en unidades de guayacol (definidas como la cantidad de enzima que forma 1 jmol de tetraguayacol por minuto, usando un coeficiente de extincion de 26 mM'1cm'1).
Este metodo se adapta a partir de: Cramer et al., J Immunol Methods. 11 de mayo de 1984; 70 (1): 119-25.
RESULTADOS
Caractensticas del paciente
De los 72 pacientes identificados sistematicamente, se incluyeron 63 pacientes. Los pacientes se clasificaron histologicamente en los que teman inflamacion significativa, usando un sistema de puntuacion de NASH modificado (cirrosis + AH) en comparacion con solamente con cirrosis. Los pacientes con cirrosis + AH (n = 23) estaban mas gravemente enfermos tal como se pone en evidencia con una puntuacion de MELD y Pugh mas elevada (p < 0,001) en comparacion con pacientes solamente con cirrosis (n = 40). Los pacientes con cirrosis + AH tambien teman CRP (p < 0,005), globulos blancos (p < 0,001), bilirrubina (p < 0,001) y tiempo de protrombina (p < 0,001) significativamente mas elevados. Los pacientes teman niveles mas elevados de TNFa, IL6, IL8, sTNFaR1, sTNFaR2, MDA y prostaglandina F2a que los controles. Los pacientes con cirrosis + AH teman niveles significativamente mas elevados de IL6, IL8 y sTNFaR2, pero no se observaban cambios estadfsticamente significativos para TNFa, sTNFaR1 y estres oxidativo. No se encontro correlacion con la gravedad de la enfermedad. Para los experimentos ex vivo, se uso sangre o plasma de 16 de estos 63 pacientes. Los datos clmicos de la medida inicial para estos 63 pacientes no era significativamente diferente de la de la poblacion base completa. La Tabla 1 muestran las caractensticas de la medida inicial para todos los pacientes y para los subgrupos que tienen estallido en reposo elevado y bajo (vease a continuacion).
Estallido oxidativo y fagocitosis en pacientes con cirrosis alcoholica
En neutrofilos de paciente sin estimular, el estallido oxidativo de neutrofilos aumentaba cuando se comparaba con los controles. Los neutrofilos de pacientes con cirrosis alcoholica general teman un estallido oxidativo en reposo 5,6 veces mas elevado (p < 0,001) que los controles sanos. Los neutrofilos de pacientes con cirrosis + aH teman estallido oxidativo en reposo significativamente mas elevado en comparacion con pacientes solamente con cirrosis (p < 0,001) o controles (p < 0,001, figura 2A). La estimulacion con fMLP, que indica cebado, causaba una reaccion de estallido oxidativo significativamente mas elevada en pacientes con cirrosis (p = 0,01) y cirrosis + AH (p = 0,001) en comparacion con los controles mientras que no habfa diferencia en la respuesta a PMA entre los grupos. La
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diferencia entre estallido en reposo y respuesta a fMLP era significativamente menor en pacientes con cirrosis + AH (1,8 ± 4,7) que en pacientes con cirrosis (22,4 ± 6,9, p = 0,02), lo que muestra que la adicion de fMLP en pacientes con cirrosis + AH no es capaz de aumentar la funcion de las celulas nunca mas. Ademas, despues de la estimulacion con E. coli, el aumento relativo del estallido oxidativo de los niveles en reposo disminma de forma significativa en pacientes con cirrosis + AH en comparacion con pacientes solamente con cirrosis (p = 0,001) o controles (p < 0,001, figura 2B). La capacidad fagodtica se midio con la media geometrica de intensidad de fluorescencia (GMFI), que indica el numero de bacterias atrapadas por una celula. Los pacientes con cirrosis + AH atrapaban significativamente menos bacterias que los controles (p = 0,031, figura 2C). El porcentaje de celulas que atrapan al menos una bacteria no difena entre los grupos.
Asociacion de estallido oxidativo en reposo y fagocitosis con infeccion, insuficiencia organica y supervivencia
Diecisiete (26%) desarrollaron insuficiencia organica y 13 (21% de todos los pacientes estudiados) murieron durante el ingreso hospitalario. La insuficiencia organica mas comun encontrada era renal, observada en 15 de los pacientes con insuficiencia organica (88 %), con 4 pacientes desarrollando esto como parte de insuficiencia multiorganica con necesidades de ventilacion y apoyo circulatorio. A los 90 dfas, 14 (22 %) pacientes hadan muerto, 47 estaban vivos y 2 se perdieron durante el seguimiento. Se encontro que el estallido oxidativo en reposo era predictivo de supervivencia de 90 dfas (AUROC 0,77, p = 0,003, figura 4A) e insuficiencia organica (AUROC 0,76, p < 0,001). Un punto de corte de estallido en reposo < 55 % tema una sensibilidad de un 77 % y una especificidad de un 69 % para prediccion de muerte. Los pacientes con un estallido oxidativo en reposo < 55 % sobreviven de forma significativamente mejor que los que tienen un estallido en reposo >/= 55 % (p < 0,005, figura 4B). La funcion fagodtica tambien era predictiva de supervivencia (AUROC 0,80, p = 0,02, figura 5A) e insuficiencia organica (AUROC 0,91, p< 0,0001). Una GMFI inferior a un 42% de la normal dentro de la poblacion de pacientes estudiados tema una sensibilidad de un 86 % y una especificidad de un 76 % para predecir mortalidad (figura 5B).
En 42 (66 %) pacientes, se sospechaba de infeccion clmica durante el transcurso del ingreso hospitalario aunque ninguno de los pacientes incluidos teman una infeccion demostrada en el momento de evaluar la funcion de los neutrofilos. Estos datos debenan considerar en contexto ya que el protocolo de los investigadores para la gestion necesita el uso de antibioticos de amplio espectro en cuanto se sospecha de una infeccion. En 26 de estos pacientes (62 %), se verifico infeccion positiva en cultivo. En 13, se encontro mas de un organismo. Era mas probable que los pacientes con un elevado en reposo estallido (> 55 %) desarrollaron infecciones positivas en cultivo (un 57 % con respecto a un 27%, chi-cuadrado p = 0,01), antes durante la estancia en el hospital (8 con respecto a 23 dfas, p = 0,04) y con mas de un organismo (n = 10; n = 3 en pacientes con estallido en reposo bajo). Era mas probable que los pacientes con cirrosis + AH desarrollaron infecciones positivas en cultivo (un 65 % con respecto a un 28 %, p = 0,004). Era mas probable que esos pacientes que desarrollaban infecciones positivas en cultivo desarrollaron insuficiencia organica (p = 0,001) y murieran (p = 0,002). Un 67 % de pacientes con una GMFI inferior a un 42 % desarrollaron infeccion positiva en cultivo, mientras que solamente un 21 % de pacientes con una GMFI superior a un 42 % (p = 0,007) tambien murieron. Los pacientes con GMFI baja desarrollaron infecciones antes durante su estancia en el hospital (9 con respecto a 47 dfas, p = 0,03).
Efecto de plasma de pacientes y plasma normal en estallido oxidativo de neutrofilos
El plasma de pacientes con un estallido en reposo elevado (> 55 %; n = 6) induda un estallido en reposo en neutrofilos normales elevado (p = 0,005) mientras que el plasma de pacientes con un estallido en reposo bajo (< 55 %; n = 6) fallaba al hacer esto (Figura 6). El efecto de induccion de estallido era detectable inmediatamente despues de mezclar el plasma en las celulas pero tambien se podna haber mostrado despues de hasta una hora incubacion (los resultados no se muestran). Este resultado indicaba que hay un factor transmisible presente en el plasma del paciente que provoca la activacion de los neutrofilos.
Cuando los neutrofilos aislados de pacientes con estallido en reposo elevado en el ensayo de sangre completa se incubaban con plasma normal, el estallido en reposo disminma de forma significativa en comparacion con los neutrofilos aislados incubados con el plasma de los propios pacientes (p = 0,02; Figura 7). Estos experimentos sugenan que la eliminacion de un factor presente en el plasma era capaz de reducir el estallido en reposo elevado en celulas de los pacientes.
Efecto de la plasma y plasma normal de pacientes sobre la fagocitosis
Los neutrofilos normales incubados con plasma de pacientes con un estallido en reposo bajo no se diferencian ante los del control, mientras que los neutrofilos normales incubados con plasma de pacientes con estallido en reposo elevado presentaban una disminucion de un 22 % en la GMFI (p = 0,03, n = 6) (Figura 8). Los neutrofilos de los pacientes incubados durante 60 minutos con plasma normal presentaban un aumento de un 22 % (p = 0,03, n = 6) en la fagocitosis en comparacion con neutrofilos de pacientes incubados con su propio plasma. Estos resultados indican que la alteracion de la funcion fagodtica se puede deber a un factor en suero que es transmisible y reversible.
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Efecto de endotoxinas en estallido oxidativo y fagocitosis
La sangre de cinco voluntarios sanos se incubo con concentraciones crecientes de endotoxina. Se produjo un aumento dependiente de la dosis en estallido en reposo (p < 0,0001, ANOVA de una via con analisis de Turkey a posteriori; figura 9). Mediante la incubacion de neutrofilos del paciente con endotoxina, la GMFI relativa se redujo en un 20 % (n = 8, p = 0,02, Figura 10). Estos resultados indican que la endotoxina activa los neutrofilos normales de una manera dependiente de la dosis imitando de este modo el efecto observado mediante incubacion de plasma de los pacientes.
Efecto de eliminacion de endotoxinas de plasma de pacientes
Uso de columnas de Detoxi-Gel
El plasma de algunos pacientes del que se muestra que tiene un estallido en reposo elevado en el ensayo de sangre completa era capaz de inducir un estallido en reposo elevado en neutrofilos normales. El plasma sin endotoxinas (obtenido de pasaje a traves de las columnas) no inducfa un estallido en reposo elevado en neutrofilos normales (p < 0,001, n = 9). El plasma de pacientes con estallido en reposo bajo (p = 0,91, n = 4) y el plasma normal (p = 0,25, n = 3) no cambiaba el estallido en reposo. (Figura 11) La eliminacion de endotoxinas del plasma de pacientes con un estallido en reposo elevado (n = 11) aumentaba la GMFI en un 31 % (p = 0,03) en comparacion con las celulas incubadas con plasma sin tratar. El plasma de pacientes con estallido en reposo bajo (p = 0,16, n = 8) y el plasma normal (p = 0,85, n = 5) que se pasaron sobre la columna causaban cualquier cambio en GMFI (figura 12). Este conjunto de experimentos muestra que la eliminacion de endotoxinas con polimixina B invierte el efecto de induccion de estallido y disminucion de fagocitosis de plasma del paciente.
Uso de anticuerpos de neutralizacion de LPS
La incubacion con un anticuerpo CD14 anti-humano de neutralizacion de LPS editaba la induccion de estallido elevado en celulas normales mediante plasma de pacientes con un estallido elevado (p <0,001, n = 7). La incubacion de plasma de pacientes con estallido bajo (p = 0,733, n = 8) o plasma normal (p = 0,25, n = 3) con el anticuerpo no cambiaba el estallido (figura 11). La incubacion de plasma de pacientes con un estallido elevado con un anticuerpo CD14 anti-humano de neutralizacion de LPS aumenta la GMFI en un 20 % (p = 0,04, n = 11) mientras que este anticuerpo no produce ningun cambio en la GMFI cuando se usaba plasma de pacientes con estallido bajo (p = 0,17, n = 8) o plasma normal (p = 0,78, n = 3) (figura 12). Este hallazgo respalda la observacion de que la endotoxina puede ser responsable de la induccion de estallido en reposo elevado en neutrofilos.
Actividad de mieloperoxidasa
Una comparacion de actividad de estallido en reposo de neutrofilos (%) y mieloperoxidasa (MPO) en plasma (sin celulas) mostraba una relacion significativa (Figura 13). Esto indica que existe una fuerte union entre la actividad de los neutrofilos en reposo medida y la cantidad de MPO liberada en el plasma. Dado que la MPO se podna considerar perjudicial para la funcion metabolica normal, cuando se libera desde el entorno controlado de los neutrofilos, este hallazgo puede indicar un mecanismo de dano que se produce dentro de la enfermedad hepatica. Estos datos tambien indican que la actividad de MPO en plasma puede proporcionar una medida util de la gravedad de la enfermedad.
metodologJa
Activacion de neutrofilos (estallido oxidativo) y Fagocitosis
El kit Phagoburst® (Orpegen Pharma, Heidelberg, Alemania) se uso para determinar el porcentaje de neutrofilos que producen oxidantes reactivos mediante estimulacion con bacterias de E. coli opsonizadas o sin ningun estfmulo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, se incubaron 100 pi de sangre completa heparinizada o neutrofilos aislados (como se indica) durante 20 minutos con 20 pl de las bacterias, N-formilmetionil-leucil- fenilalanina (fMLP), 12-miristato 13-acetato de forbol (PMA) o sin estimulo a 37 °C. La formacion de los oxidantes reactivos durante el estallido oxidativo se controlo mediante la adicion y la oxidacion de dihidrorodamina 123. Para identificar neutrofilos, las celulas se tineron con anticuerpo anti-CD16-PE (IOTest , Beckman Coulter) y se analizaron con clasificacion celular activada con fluorescencia, (FACS), (Becton Dickinson FACScan, San Jose, CA.) usando el software Cellquest™. Los neutrofilos se seleccionaron de acuerdo con caractensticas de dispersion directa y lateral (figura 1A) y posteriormente el porcentaje de celulas positivas CD 16 que produce metabolitos reactivos de oxfgeno determinados con medida de fluorescencia de color verde (FL-1) (figura 1C, E, G). Las muestras se analizaron por triplicado de duplicado. El coeficiente de variacion (CV) interensayos para el estallido en reposo era de un 5,4 %, un 4,2 % para estallido estimulado, el CV intraensayos para el estallido en reposo era de un 4,7 %, un 2,4 % para estallido estimulado.
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Fagocitosis de Neutrofilos
El Phagotest® (Orpegen Pharma, Heidelberg, Alemania) se uso para medir el porcentaje total de neutrofilos que mostraban fagocitosis y la actividad fagocftica celular individual usando bacterias de opsonizadas E. coli etiquetadas con FITC. Se incubaron 100 jl de sangre completa o neutrofilos aislados (como se indica a continuacion) con 20 jl de bacterias a 37 °C durante 20 min mientras que una muestra de control negativo permaneda en hielo. Para identificar neutrofilos, las celulas se tineron con anticuerpo anti-CD-16-PE (lOTest®, Beckman Coulter). Los neutrofilos se seleccionaron de acuerdo con caractensticas de dispersion directa y lateral (figura 2A) y posteriormente se analizo el porcentaje de celulas positivas para CD 16 - celulas positivas para FITC, correspondiente al porcentaje de neutrofilos que experimentan fagocitosis y la media geometrica de intensidad de fluorescencia (GMFI), correspondiente al numero de bacterias atrapadas por una celula (figura 1B, D, F). Para evitar la mala interpretacion de los resultados debido a la variabilidad de lote a lote de las bacterias, los resultados se normalizan con respecto a la media de al menos 3 muestras de control sanas para cada nuevo lote de bacterias usado. Las muestras se analizaron por triplicado de duplicado. El CV interensayos para el porcentaje de fagocitosis era de un 6,8 %, para el GMFI un l0,1 % del respectivo CV intraensayos para el porcentaje de fagocitosis era de un 4,1 %, y un 1,6 % para el GMFI.
Aislamiento de Neutrofilos
Se depositaron 4 ml de sangre completa sobre 5 ml de Polymorfoprep (Axis-Shield, Oslo, Noruega) y se centrifugo durante 30 min a 400 g, a temperatura ambiente. Los neutrofilos se cosecharon de la segunda superficie de contacto y se lavaron con PBS ((Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA). El recuento de neutrofilos se hace en un Thoma- hemocitometro y se vuelven a suspender en PBS a una densidad de 5 x 106 celulas en 50 jl. Para un ensayo se usaron 50 jl de suspension celular y 50 jl de plasma. La viabilidad se sometio a ensayo mediante exclusion con Azul de Tripano y era de aproximadamente un 98 %.
Columnas de Eliminacion de Endotoxinas
Para retirar endotoxinas de muestras de plasma se usaron columnas rellenas previamente con Detoxi-Gel Affinity- pack (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) que conteman un gel para eliminacion de endotoxinas que consistfa en polimixina B inmovilizada que se une a la parte del lfpido A de lipopolisacarido bacteriano. Las columnas se regeneraron con desoxicolato sodico al 1 % (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), se lavaron con agua esteril y se equilibraron con cloruro sodico esteril al 0,9 % complementado con 50 lU/ml de heparina (Multipharm, Waxham, UK) a temperatura ambiente. Las muestras de plasma se diluyen a 1:1 con PBS y se aplican en la columna y despues de descartar el vado la muestra se recogio en un tubo de muestra sin pirogenos. Se incubaron 150 jl de esta muestra de plasma diluida, sin endotoxinas con 50 jl de suspension celular y se realizo Bursttest® o Phagotest® como se ha indicado.
Citoquinas
TNFa, sTNFaR1, sTNFaR2, IL-6 e IL-8 se determinaron a partir de muestras de plasma anticoagulado con etilendiamina-tetraacetato usando equipos disponibles en el mercado (BioSource International, Nivelles, Belgica) siguiendo las instrucciones del fabricante. El lfmite inferior para la deteccion de las citoquinas era 3 pg/ml. El coeficiente de variacion intraensayos era de un 5,4 % a un 6,4 %. IL-6 e IL-8 eran indetectables en los controles.
TABLA 1
todos (n = 63) estallido en reposo bajo (n = 35) estallido en reposo elevado (n = 28)
Muerte (%)
22 9 42
Insuficiencia organica (%)
26 12 43
Edad (anos)
50,3 ± 1,3 52,4 ±2,0 47,8 ± 1,6
Funcion hepatica
Bilirrubina (mmol/l)
151,2 ± 20,9 104,8 ± 21,8 199,8 ± 34,81
PT (seg)
15,3 ± 0,61 13,5 ± 0,5 16,8 ± 0,91
Albumina (g/l)
29,8 ± 1,1 32,7 ± 1,3 28,8 ± 1,31
DF de Maddrey (n = 23 con AH)
43,4 ±6,8 40,0 ± 9,5 44,6 ± 8,0
Puntuacion de Pugh
9,3 ± 0,4 8,3 ± 0,4 10,2 ± 0,51
MELD
15,6 ± 1,8 12,2 ±2,0 19,1 ± 3,5
Cebado (respuesta a fMLP)
57,5 ± 5,1 47,5 ± 7,92 89,1 ± 3,21,2
todos (n = 63) estallido en reposo bajo (n = 35) estallido en reposo elevado (n = 28)
Citoquina / Inflamacion
TNFa (pg/ml)
19,6 ±6,5 18,3 ± 6,9 22,3 ± 14,6
IL-6 (pg/ml)
49,4 ± 14,9 21,9± 7,9 106,1 ± 39,6
IL-8 (pg/ml)
180,5 ± 56,9 101,8 ± 55,8 337,9 ± 122,8
Estres Oxidativo
MDA (pM/l)
3,2 ± 0,5 3,2 ± 0,58 3,0 ± 0,7
Prostaglandina F2a (pg/ml)
346,8 ±49,6 296,9 ±43,8 394,7 ± 81,2
1 estallido significativo con respecto a bajo
2 significativo con respecto al control
TABLA 2
Child C (n = 27) Child B (n = 26) Child A (n = 10) control (n = 13)
estallido en reposo %
67,0 ±6,51,2,3 38,2 ± 7,21,3 36,0 ± 9,01 8,9 ±2,7
% de estallido despues de estimulacion - estallido en reposo
32,4 ±6,81,2,3 57,5 ± 7,01,3 60,4 ± 8,71 76,8 ± 7,7
% de fagocitosis
105,9 ±2,8 110,18 ± 3,3 107 ± 5,5 99,4 ± 7,5
% de GMFI
50,7 ± 9,51 87,1 ± 13,6 104,6 ± 17,1 101,0 ± 9,2
1 p < 0,05 con respecto a control 2 p < 0,05 con respecto a Child B 3 p < 0,05 con respecto a Child A
TABLA DE INFECCIONES
Infecciones positivas de cultivo documentadas en pacientes estudiados estallido elevado estallido bajo
primer organismo paciente dia organismo
dia segundo organismo organismo paciente primer organismo dia organismo dia segundo organismo organismo
1
4 EC 29 MRSA 2 16 EC
4
14 EC 19 CNS 14 23 E.coli
5
9 CNS 34 EC 17 9 MRSA
7
4 EC 10 CNS 23 15 St. aureus
12
2 C. albicans 33 15 Propionibacterium 34 CNS
13
10 St. aureus
15
8 CNS
20
5 EC 5 CNS
35
6 EC
36
4 CNS 4 EC
45
2 CNS 3 CNS
48
20 E.coli
61
6 C. albicans
62
7 C. albicans 9 EC
EC: Enterococo, MRSA: Staphylococcus aureus resistente a meticilina, CNS: Estafilococo negativo para coagulasa, St.: Estafilococo, Str.: Estreptococo, C.: Candidia_____________________________________________________
5

Claims (7)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para evaluar el pronostico en un individuo que padece cirrosis alcoholica, metodo que comprende
    (a)
    (i) poner en contacto una muestra de plasma de dicho individuo con una poblacion de neutrofilos normales que no son de dicho individuo, para producir una poblacion de ensayo de neutrofilos y
    (ii) proporcionar una muestra de control que comprende una poblacion de neutrofilos normales que no son de dicho individuo en el que dicha muestra de control no se pone en contacto con dicha muestra de plasma,
    (b) evaluar la capacidad de fagocitosis de la poblacion de ensayo de neutrofilos de (a) (i),
    (c) comparar dicha capacidad de fagocitosis de (b) con la capacidad de fagocitosis de dicha muestra de control de neutrofilos de (a)(ii),
    en el que un nivel mas bajo de fagocitosis de neutrofilos en dicha poblacion de ensayo, en comparacion con el nivel de fagocitosis de neutrofilos en dicha muestra de control es indicativo de un pronostico de infeccion y/o insuficiencia organica y/o mortalidad.
  2. 2. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que dicha muestra de control de (a)(ii) es una muestra de sangre completa o una fraccion de una muestra de sangre completa que comprende dicha poblacion de celulas de neutrofilos.
  3. 3. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la etapa (b) comprende la evaluacion de
    (a) el numero total de neutrofilos dentro de la muestra que presentan fagocitosis,
    (b) la proporcion de neutrofilos dentro de la muestra que presentan fagocitosis,
    (c) el numero total de bacterias que se fagocitan cuando se ponen en contacto con la muestra de neutrofilos, o
    (d) el numero de celulas que un neutrofilo individual o una poblacion de neutrofilos son capaces de fagocitar.
  4. 4. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende:
    (a) etiquetado de un material a fagocitar
    (b) permitir que se produzca fagocitosis
    (c) cuantificar y/o localizar la etiqueta para indicar la cantidad de fagocitosis que se ha producido.
  5. 5. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 4 en el que dicho material a fagocitar son celulas.
  6. 6. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 4 en el que dicho material etiquetado a fagocitar son bacterias E. coli opsonizadas etiquetadas con FITC.
  7. 7. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el individuo que padece cirrosis alcoholica tambien padece hepatitis alcoholica.
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