ES2565344T3

ES2565344T3 - Semianticuerpos con auto-ensamblaje

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Publication number: ES2565344T3
Application number: ES11719347.4T
Authority: ES
Inventors: Nicolas Ugolin; Caroline Falck; Emilie Lefevre; Sylvie Chevillard; Carine Tisne-Vicrobeck
Original assignee: Commissariat à l'Énergie Atomique et Aux Énergies Alternatives
Current assignee: Commissariat à l'Énergie Atomique et Aux Énergies Alternatives
Priority date: 2010-04-09
Filing date: 2011-04-08
Publication date: 2016-04-04
Anticipated expiration: 2031-04-08
Also published as: US20130101665A1; EP2556089B1; EP2556089A1; FR2958645B1; FR2958645A1; WO2011124869A1

Abstract

Molécula quimérica denominada "semianticuerpo" caracterizada por que comprende o consiste en dos moléculas quiméricas A y B que comprenden o que consisten en: (i) un dominio polipeptídico característico de un dominio variable (o DV) de una cadena pesada o de una cadena ligera de un anticuerpo, estando este dominio polipeptídico posicionado en un extremo de las moléculas quiméricas A y B, siendo el dominio polipeptídico (i) de una de las dos moléculas quiméricas, A o B, característico de un DV de una cadena ligera de un anticuerpo, y siendo el dominio polipeptídico (i) de la otra molécula quimérica, respectivamente, característico de un DV de una cadena pesada de un anticuerpo; y (ii) un dominio nucleotídico monocatenario que consiste en un polinucleótido, o un análogo de un polinucleótido, siendo el dominio nucleotídico de A y el de B capaces de emparejarse en una estructura bicatenaria en medio hídrico; siendo el dominio polipeptídico (i) y el dominio nucleotídico (ii) de cada una de las moléculas quiméricas A y B unidos por una unión covalente, y siendo el dominio (ii) de la molécula quimérica A y el de la molécula quimérica B emparejados en una estructura bicatenaria en medio hídrico.

Description

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posición del extremo libre de la molécula quimérica A o B. Este elemento lipófilo está, llegado el caso, unido a la molécula quimérica A o B por medio de una unión lábil en medio reductor, por ejemplo un puente disulfuro.

Según un modo de realización particular de la invención, dicho o dichos o uno de dichos elementos lipófilos pueden ser sustituidos con un dominio beta-peptídico, es decir un dominio que consiste en o que comprende uno o varios (por ejemplo 2, 3, 4, 5 o 6) restos de aminoácidos beta, por ejemplo de 1 a 5 restos de aminoácidos beta. Dicho dominio beta-peptídico puede, por ejemplo, comprender o consistir en una cadena de 2, 3, 4, 5 o 6 restos de aminoácidos beta sucesivos. A título de ejemplo de aminoácido beta, se citará la beta-alanina.

Según un modo de realización particular, un semianticuerpo de la invención es tal que:

* la primera molécula quimérica, A o B, comprende o consiste en:

-un dominio polipeptídico (i) tal como se ha definido en la presente solicitud, y los dominios siguientes, posicionados sucesivamente en el orden siguiente, a partir del extremo C-terminal del dominio polipeptídico (i):

-llegado el caso, un enlazador (por ejemplo un enlazador peptídico) tal como se define en la presente solicitud,

-un dominio nucleotídico (ii) tal como se define en la presente solicitud,

-llegado el caso, un enlazador (por ejemplo un enlazador nucleico) unido, preferentemente, por medio de una unión lábil en medio reductor, por ejemplo un puente disulfuro o por medio de una unión persistente en medio reductor, por ejemplo por medio de una unión establecida con un ácido maleimida, a

-un dominio marcador o un dominio biológicamente activo tal como se define en la presente solicitud, y

-llegado el caso, un elemento lipófilo tal como se define en la presente solicitud, estando dicho elemento lipófilo, llegado el caso, unido al dominio marcador o al dominio biológicamente activo por medio de una unión lábil en medio reductor, por ejemplo un puente disulfuro o por medio de un enlazador (por ejemplo un enlazador peptídico o nucleico) tal como se define en la presente solicitud; y

* la segunda molécula quimérica, respectivamente B o A, comprende o consiste en:

-un dominio polipeptídico (i) tal como se define en la presente solicitud, siendo este dominio y el dominio polipeptídico (i) de la primera molécula quimérica, preferentemente característico de DV de un mismo anticuerpo, siendo uno de estos dominios característico de un DV de la cadena ligera de un anticuerpo dado y siendo el otro característico de un DV de la cadena pesada del mismo anticuerpo,

y los dominios siguientes, posicionados sucesivamente en el orden siguiente, a partir del extremo C-terminal del dominio polipeptídico (i):

-llegado el caso, un enlazador (por ejemplo un enlazador peptídico) tal como se define en la presente solicitud, y

-un dominio nucleotídico (ii) tal como se define en la presente solicitud.

En un modo de realización particular de la invención, por "los dominios siguientes, posicionados sucesivamente en el orden siguiente", se entiende "dominios siguientes, unidos sucesivamente en el orden siguiente".

En un modo de realización particular de la invención, un semianticuerpo de la invención, denominado HAC_1, es tal que:

* la primera molécula quimérica, A o B, comprende o consiste en:

-un dominio polipeptídico (i) tal como se define en la presente solicitud, y los dominios siguientes, posicionados sucesivamente en el orden siguiente, a partir del extremo C-terminal del dominio polipeptídico (i): -llegado el caso, un enlazador (por ejemplo un enlazador peptídico) tal como se define en la presente solicitud, -un dominio nucleotídico (ii) tal como se define en la presente solicitud, denominado S1, -llegado el caso, un enlazador (por ejemplo un enlazador nucleico) tal como se define en la presente solicitud,

unido, preferentemente mediante un doble enlace lábil en medio reductor, por ejemplo un puente disufluro, a -llegado el caso, un dominio marcador o un dominio biológicamente activo tal como se define en la presente solicitud, unido, llegado el caso, por ejemplo, por medio de un enlace covalente, a

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-llegado el caso, un enlazador (por ejemplo un enlazador nucleico o peptídico) tal como se define en la presente solicitud,

-un segundo dominio nucleotídico, denominado S3, preferentemente unido por medio de un enlace lábil, que comprende o consiste en un polinucleótido, en particular un ADN o un ARN, o un análogo de un polinucleótido, en particular un ANP, un LNA, un ácido nucleico metilfosfonato, o un ácido nucleico tioato, y que es capaz de emparejarse en una estructura bicatenaria con un dominio nucleotídico complementario denominado S4, por ejemplo en medio hídrico, en particular en medio reductor; y

-estando el dominio S3 o dicho enlazador unido al extremo C-terminal de un segundo dominio polipeptídico, denominado DV2a, que es característico de un DV de una cadena pesada o de una cadena ligera de un anticuerpo, siendo DV2a y el dominio polipeptídico (i) de esta primera molécula quimérica (A o B) preferentemente característicos de DV anticuerpos distintos, y

-llegado el caso, un elemento lipófilo tal como se define en la presente solicitud, estando dicho elemento lipófilo unido a DV2a por medio de un enlace lábil en medio reductor, por ejemplo un puente disulfuro o por medio de un enlazador (por ejemplo un enlazador nucleico) tal como se define en la presente solicitud, comprendiendo dicho enlazador una unión lábil en medio reductor, por ejemplo un puente disulfuro o estando unido a DV2a por medio de un enlace lábil en medio reductor, por ejemplo un puente disulfuro, y

-un dominio polipeptídico (i) tal como se define en la presente solicitud, siendo este dominio y el dominio polipeptídico (i) de la primera molécula quimérica (de HAC_1) preferentemente característicos de DV de un mismo anticuerpo, siendo uno de estos dominios característico de un DV de la cadena ligera de un anticuerpo dado y siendo el otro característico de un DV de la cadena pesada del mismo anticuerpo,

-un dominio nucleotídico (ii) tal como se define en la presente solicitud, denominado S2, capaz de emparejarse en una estructura bicatenaria con S1 en medio hídrico, en particular en medio reductor.

En un modo de realización particular, un semianticuerpo de la invención, denominado HAC_2 es tal que:

* la primera molécula quimérica, A o B, comprende o consiste en:

-un dominio polipeptídico (i) tal como se define en la presente solicitud, y los dominios siguientes, posicionados sucesivamente en el orden siguiente, a partir del extremo C-terminal del dominio polipeptídico (i):

-un dominio nucleotídico (ii) tal como se define en la presente solicitud, denominado S5,

-llegado el caso, un enlazador (por ejemplo un enlazador nucleico o peptídico) tal como se define en la presente solicitud, comprendiendo dicho enlazador, llegado el caso, una unión lábil en medio reductor (por ejemplo un puente disulfuro), o estando unido por medio de una unión lábil en medio reductor (por ejemplo un puente disulfuro) a:

-un segundo dominio nucleotídico, denominado S4, preferentemente unido por medio de un enlace lábil, que comprende o consiste en un polinucleótido, en particular un ADN o un ARN, o un análogo de un polinucleótido, en particular un ANP, un LNA, un ácido nucleico metilfosfonato, o un ácido nucleico tioato, y que es capaz de emparejarse en una estructura bicatenaria con un dominio nucleotídico complementario denominado S3, por ejemplo en medio hídrico, en particular en medio reductor; y

-estando el dominio S4 o dicho enlazador unido al extremo C-terminal de un segundo dominio polipeptídico, denominado DV2b, que es característico de un DV de una cadena pesada o de una cadena ligera de un anticuerpo, siendo DV2b y el dominio polipeptídico (i) de esta primera molécula quimérica (A o B) característicos de DV de anticuerpos distintos, y

-llegado el caso, un elemento lipófilo tal como se define en la presente solicitud, estando dicho elemento lipófilo

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unido a DV2b por medio de un enlace lábil en medio reductor, por ejemplo un puente disulfuro o por medio de un enlazador (por ejemplo un enlazador nucleico) tal como se define en la presente solicitud, comprendiendo dicho enlazador una unión lábil en medio reductor (por ejemplo un puente disulfuro) o estando unido a DV2a por medio de un enlace lábil en medio reductor (por ejemplo un puente disulfuro), y

-un dominio polipeptídico (i) tal como se define en la presente solicitud, siendo este dominio y el dominio polipeptídico (i) de la primera molécula quimérica (de HAC_2) preferentemente característicos de DV de un mismo anticuerpo, siendo uno de estos dominios característico de un DV de la cadena ligera de un anticuerpo dado y siendo el otro característico de un DV de la cadena pesada del mismo anticuerpo,

-un dominio nucleotídico (ii) tal como se define en la presente solicitud, denominado S6, capaz de emparejarse en una estructura bicatenaria con S5 en medio hídrico, en particular en medio reductor.

-según un modo de realización particular, en HAC_1 y en HAC_2,

-un enlace lábil en medio reductor (por ejemplo un puente disulfuro) está presente entre el dominio (ii) y el dominio S3 (o S4); pero

-ningún enlace lábil en medio reductor está presente entre los dominios S3 (o S4) y DV2a (o DV2b).

Se puede utilizar HAC_2 en conjunción con HAC_1, por ejemplo administrado a un mismo hospedante, en particular a un mamífero humano o no humano, siendo HAC_1 y HAC_2 administrados separadamente (estando HAC_1 y HAC_2 presentes en composiciones, vesículas o partículas virales de la invención distintas, simultánea o separadamente en el tiempo).

Diferentes tipos de HAC_1 y/o diferentes tipos de HAC_2 pueden ser administrados a un mismo hospedante, en particular a un mamífero humano o no humano.

Los HAC_1 y HAC_2 administrados (simultánea o separadamente en el tiempo) a un mismo hospedante (en particular un mamífero humano o no humano), pueden también ser administrados en forma injertada por medio de unión lábil en medio reductor en nanopartículas no tóxicas, por ejemplo nanopartículas de diamante (véase en particular el ejemplo de la figura 10). HAC_1 y HAC_2 pueden, en efecto, estar unidos (o injertados) en una misma nanopartícula o sobre dos nanopartículas distintas. Este injerto se realiza por medio de uno o varios enlace(s) lábil(es) en medio reductor, por ejemplo uno o varios enlaces disulfuro, a partir del extremo C-terminal de la molécula quimérica (A o B) que comprende el dominio DV2a o DV2b, y en particular (cuando DV2a o DV2b se encuentran en la posición C-terminal en HAC_1 o HAC_2) a partir del extremo N-terminal de la parte DV2a o DV2b de HAC_1 o de HAC_2, llegado el caso por medio de un enlazador.

Así, los sistemas S3-DV2a y S4/DV2b pueden ser proporcionados (a través de HAC_1 y HAC_2 respectivamente) en una misma célula cuando HAC_1 y HAC_2 o la o las nanopartículas en las que HAC_1 y/o HAC_2 están injertadas, están internalizadas y que las uniones lábiles (por ejemplo los puentes disulfuro) están escindidas.

Los semianticuerpos HAC_1 y HAC_2 injertados en una misma nanopartícula pueden ser idénticos o diferentes, y en particular diferir por sus dominios S3/DV2a (o S4-DV2b) y/o por sus dominios (i)/(ii). Así, los HAC_1 y/o HAC_2 injertados en una misma nanopartícula pueden comprender:

-un solo tipo de dominios S3/DV2a (o S4-DV2b) y un solo tipo de dominios (i)/(ii);

-diferentes tipos de dominios S3/DV2a (o S4-DV2b) y un solo tipo de dominios (i)/(ii);

-un solo tipo de dominios S3/DV2a (o S4-DV2b) y diferentes tipos de dominios (i)/(ii); o

-diferentes tipos de dominios S3/DV2a (o S4-DV2b) y diferentes tipos de dominios (i)/(ii).

Unos dominios x/y son denominados "de diferentes tipos" en el sentido de la presente solicitud, cuando difieren en su dominio x y/o en su dominio y. Según un modo de realización, al mismo tiempo x e y difieren entre dos dominios x/y "de diferentes tipos".

Una nanopartícula en la que se injertan HAC_1 y/o HAC_2 que comprende diferentes tipos de dominios (i)/(ii)

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permite determinar unos epítopos diferentes y permitir por lo tanto generalmente determinar diferentes tipos de células. Sin embargo, una nanopartícula en la que se injertan HAC_1 y/o HAC_2 que comprende un solo tipo de dominios (i)/(ii) permite determinar un solo tipo de epítopo y por lo tanto generalmente un solo tipo de células.

En un modo de realización particular, las nanopartículas utilizadas tienen un tamaño medio comprendido entre 1 y 100 nanómetros, preferentemente entre 1 y 50 nanómetros. Por ejemplo, su tamaño medio puede ser de 10 nanómetros o inferior a 10 nanómetros.

Así, en las células del hospedante que ha integrado al mismo tiempo HAC_1 y HAC_2, podrá formarse un tercer tipo de semianticuerpo, constituido de una parte de HAC_1 y de una parte de HAC_2.

A título de ejemplo, en un modo de realización particular, este semianticuerpo, denominado HAC_3, es tal que:

* la primera molécula quimérica, A o B, comprende o consiste en:

-el dominio polipeptídico DV2a, y los dominios siguientes, posicionados sucesivamente en el orden siguiente, a partir del extremo C-terminal del dominio DV2a:

-el dominio nucleotídico S3,

-llegado el caso, un enlazador (por ejemplo un enlazador nucleico o peptídico) tal como se define en la presente solicitud, y

-el dominio marcador o el dominio biológicamente activo presente en HAC_1; y

-el dominio polipeptídico DV2b, y los dominios siguientes, posicionados sucesivamente en el orden siguiente, a partir del extremo C-terminal del dominio DV2b:

-el dominio nucleotídico S4.

En un modo de realización particular de la invención, uno de los dominios DV2a y DV2b tales como se definen en la presente solicitud, es característico de un DV de la cadena ligera de un anticuerpo dado y el otro de estos dominios es característico de un DV de la cadena pesada del mismo anticuerpo.

Cuando se utilizan unos semianticuerpos HAC_1 y unos semianticuerpos HAC_2 y en particular cuando están presentes en una misma partícula (en particular una misma nanopartícula), puede ser ventajoso proteger (temporalmente) las partes S3 y S4, por ejemplo hibridando estos dominios con un ARN. Esto permite impedir (temporalmente) una eventual asociación entre S3 y S4, de tal manera que estos dos dominios no puedan asociarse antes de alcanzar la célula diana (en particular esto permite evitar una asociación prematura de S3 y S4 cuando HAC_1 y HAC_2 están injertados en una misma partícula) los ARN son después deshibridados o digeridos, lo que hace entonces posible una asociación entre S3 y S4.

Cuando se desea determinar un antígeno de interés que es soluble, y en particular que circula en un hospedante (es decir que no está expresado en la superficie de una célula), puede ser interesante utilizar un (o varios) semianticuerpo HAC_1 en conjunto con un (o varios) semianticuerpo HAC_2, y concebir estos semianticuerpos de tal manera que el paratopo de HAC_1 y el paratopo HAC_2 (es decir el sitio de reconocimiento presente en su extremo N-terminal) sean específicos del mismo antígeno soluble o, más específicamente, de un mismo epítopo de este antígeno soluble.

Según un modo de realización particular, un semianticuerpo HAC_1 y un semianticuerpo HAC_2 se asocian con el fin de reconstituir un anticuerpo completo (que presenta dos sitios de reconocimiento de un epítopo). Tales anticuerpos reconstituidos pueden ser utilizados en particular con fines terapéuticos y/o de diagnósticos y en particular cuando el o los antígenos de interés son solubles. A título de ejemplo, se pueden utilizar unos HAC_1 y HAC_2 cuyos paratopos son específicos del mismo antígeno soluble o, más específicamente, de un mismo epítopo de este antígeno soluble.

La invención tiene también por objeto una molécula quimérica A o B, tal como se define en la presente solicitud.

La invención tiene también por objeto una vesícula, en particular un liposoma, y más particularmente un liposoma constituido de membrana viral, por ejemplo de membrana de partículas del virus del VIH-1 o VIH-2, o una partícula

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viral, comprendiendo dicha vesícula o dicha partícula viral uno o varios semianticuerpos tales como se definen en la presente solicitud, y/o una o varias moléculas quiméricas A y/o B tales como se definen en la presente solicitud.

La invención tiene también por objeto unas nanopartículas (en particular unas nanopartículas tales como se definen en la presente solicitud), en las que uno o varios semianticuerpos tales como se definen en la presente solicitud, y en particular uno o varios semianticuerpos HAC_1 y/o uno o varios semianticuerpos HAC_2 y/o uno o varios semianticuerpos HAC_4 (véase a continuación) están unidos (o injertados) por medio de uniones lábiles en medio reductor, por ejemplo un puente disulfuro (véase la figura 11).

A título de ejemplo, en un modo de realización particular, la vesícula o dicha partícula viral, la partícula o la nanopartícula tal como se define en la presente solicitud comprende un semianticuerpo HAC_1 o un semianticuerpo HAC_2 tales como se han definido anteriormente, y en particular:

* un semianticuerpo HAC_1, en el que:

-el dominio polipeptídico (i) de las moléculas quiméricas A y B es preferentemente característico de un mismo anticuerpo dirigido contra un primer antígeno presente en la superficie de células de mamífero o dirigido contra un antígeno viral, por ejemplo contra la proteína de recubrimiento externo de un virus de VIH; y

-el dominio polipeptídico DV2a es preferentemente característico de un anticuerpo anti retro-transcriptasa, en particular anti-retrotranscriptasa de VIH-1 o VIH-2; o

* un semianticuerpo HAC_2, en el que

-el dominio polipeptídico (i) de las moléclas quiméricas A y B es preferentemente característico de un DV de un mismo anticuerpo dirigido contra un segundo antígeno presente en la superficie de células de mamífero, por ejemplo contra la proteína CD4, o dirigido contra un antígeno viral; y

-el dominio polipeptídico DV2b es preferentemente característico de un DV del mismo anticuerpo que el DV de dominio DV2a, siendo DV2a o DV2b característico de un DV de la cadena ligera de un anticuerpo dado, por ejemplo un anticuerpo anti retrotranscriptasa y siendo el otro dominio, respectivamente DV2b o DV2a, característico de un DV de una cadena pesada del mismo anticuerpo.

En un modo de realización particular de la invención, se utilizan dos semianticuerpos, por ejemplo un semianticuerpo HAC_1 y un semianticuerpo HAC_2 tales como se definen en la presente solicitud. Uno de estos semianticuerpos, por ejemplo HAC_2, puede estar presente en una forma incorporada en una vesícula, una partícula viral o fijada sobre una o varias partículas o nanopartículas tales como se definen en la presente solicitud, estando el otro semianticuerpo, por ejemplo HAC_1, presente en solución. HAC_1 y HAC_2 pueden ser en particular dirigidos respectivamente contra un epítopo de un VIH-1 o VIH-2 y un epítopo expresado en la superficie de células de mamíferos en particular de las células T, por ejemplo un epítopo de la proteína CD4 de las células CD4+.

La invención tiene también como objetivo una composición, en particular una composición farmacéutica o terapéutica, inmunológica o vaccínea, que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en:

-uno o varios semianticuerpos tales como se definen en la presente solicitud y/o una o varias moléculas quiméricas A y/o B tales como se definen en la presente solicitud, o una o varias vesículas o partículas virales de la invención, o una o varias partículas o nanopartículas tales como se definen en la presente solicitud, y

-llegado el caso, un soporte, un diluyente y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La expresión "consiste esencialmente en" significa que además de los elementos expresados enumerados, otros ingredientes o moléculas menores pueden estar presentes en la composición de la invención, sin afectar por ello a la actividad de los elementos expresamente enumerados.

Una sustancia o una combinación de sustancias se denominan "farmacéuticamente aceptable" cuando es apropiada para una administración a un hospedante con fines terapéuticos o profilácticos. Por lo tanto, es preferiblemente no tóxica para el hospedante al que se administra.

Un "hospedante" en el sentido de la presente invención designa en particular un hospedante humano (o paciente) o un animal no humano, por ejemplo un mamífero humano o no humano.

En un modo de realización particular, la composición de la invención comprende, consiste en o consiste esencialmente en el semianticuerpo HAC_1 y/o el semianticuerpo HAC_2 tales como se definen en la presente solicitud. La invención tiene también por objeto un kit (o equipo) que comprende:

-uno o varios elementos seleccionados entre: un semianticuerpo de la invención, una molécula quimérica A o B de

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la invención, una vesícula de la invención, una partícula viral de la invención, una partícula o nanopartícula tal como se define en la presente solicitud y una composición de la invención,

-y llegado el caso, un prospecto,

En un modo de realización particular, el kit de la invención comprende el semianticuerpo HAC_1 y/o el semianticuerpo HAC_2 tales como se definen en la presente solicitud.

La invención tiene también por objeto uno o varios elementos seleccionados entre: un semianticuerpo de la invención, una molécula quimérica A o B de la invención, una vesícula de la invención, o una partícula o nanopartícula tal como se define en la presente solicitud, una partícula viral de la invención, una composición de la invención o un kit de la invención, para su utilización como medicamento. Dichos elementos pueden ser utilizados en particular en un hospedante, por ejemplo un ser humano o un mamífero no humano, para la prevención o el tratamiento de una enfermedad genética, por ejemplo una miopatía y/o una enfermedad infecciosa, en particular una enfermedad viral y más particularmente una infección por un lentivirus, por ejemplo VIH-1 o VIH-2, y/o de una infección bacteriana, por ejemplo una infección por una bacteria resistente a antibióticos y/o para la prevención o el tratamiento de un cáncer.

La invención tiene también por objeto la utilización de uno o varios elementos seleccionados entre los indicados anteriormente, para la fabricación de un medicamento destinado a prevenir o tratar las enfermedades o infecciones antes mencionadas, en un hospedante, por ejemplo un ser humano o un mamífero no humano.

La presente solicitud describe también un método para prevenir o tratar las enfermedades o infecciones antes mencionadas en un hospedante que lo necesita, comprendiendo dicho método o consistiendo en una etapa de administración a dicho hospedante de uno o varios elementos seleccionados entre los indicados antes.

Con el fin de aumentar los efectos beneficiosos de estos elementos, se puede considerar proceder a una administración en forma de varias administraciones sucesivas, repetidas a una o varias ocasiones, después de un intervalo de tiempo particular.

La presente solicitud describe también la utilización de uno o varios elementos seleccionados entre los indicados antes, para marcar y/o amplificar los marcados de proteínas, por ejemplo en la superficie de una célula in vitro, in vivo y ex vivo.

La presente solicitud describe también un procedimiento de síntesis de un semianticuerpo tal como se define en la presente solicitud. Este procedimiento puede comprender una etapa en la que el injerto o la unión, en el extremo Cterminal del dominio polipeptídico (i) (por ejemplo el extremo C-terminal de un dominio VH o VL o de una porción de un dominio VH o VL), de un dominio nucleotídico (ii), por ejemplo un ANP modificado en N-o en C-terminal por una lisina, o un ácido nucleico modificado en 5' o en 3' por un NH2, se realiza por la acción del ácido 2 mercaptoetanosulfónico o del ácido 3-mercaptopropiónico, en una cisteína de dicho dominio polipeptídico (i). La lisina o el ácido nucleico modificado pueden ser sustituidos por una beta-alanina, una etil-di-amina, un NH-CH(CONH2)(CH2)4NH, o un NH2(CH2)4(NH2)CH(COOH).

Alternativa o acumulativamente, el procedimiento de síntesis de un semianticuerpo tal como se describe en la presente solicitud puede comprender una etapa en la que los dominios polipeptídicos (i) de dicho semianticuerpo, que son unos DV de anticuerpos (por ejemplo los dominios VH o VL de anticuerpos o que comprenden una o varias parte(s) de un dominio VH o VL de anticuerpo), son obtenidos o bien por digestión de uno o varios anticuerpos por una enzima, por ejemplo la pepsina, la papaína, la tripsina, o bien por la expresión de polinucleótidos que codifican estos DV, en unos sistemas tales como bacterias, levaduras, células de insectos, células de mamíferos, o por síntesis in vitro, después por purificación.

Alternativa o acumulativamente, para clonar los dominios polipeptídicos, por ejemplo los DV tales como se definen en la presente solicitud, estos dominios (o su secuencia nucleica a clonar), son fusionados en su extremo C-terminal (respectivamente 3' de la secuencia a clonar) con una secuencia peptídica LPXTAAAA (leucina -prolina -X-treonina -(Alanina)4, en la que X es un aminoácido cualquiera) respectivamente la secuencia nucleica que codifica para la LPXTAAAA. El dominio nucleotídico a injertar, en particular el ácido nucleico o el ANP a injertar, puede estar por su parte funcionalizado en uno de sus extremos por una poli-G (poli-glicina), eventualmente por medio de una lisina, permaneciendo libre el extremo N-terminal de la poli-G. Un dominio polipeptídico (i) (por ejemplo un DV tal como se define en la presente solicitud) y un dominio nucleotídico (ii) (por ejemplo un ácido nucleico (o polinucleótido) o un ANP, tales como se definen en la presente solicitud), se fusionan entonces bajo la acción de una sortasa A.

La secuencia LPXTAAAA puede ser ventajosamente sustituida por la secuencia LPXTG (leucina -prolina -X treolina -glicina, en la que X es un aminoácido cualquiera; SEC ID nº 7).

Alternativa o acumulativamente, la fusión entre el DV y el ANP se puede obtener por catálisis di-metil-SlCl2'dimetilediclorosilano, que permite el injerto de una función amina en el extremo C-terminal de un péptido.

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siendo el chip utilizado en el ámbito de este método un chip de anticuerpo o un chip mixto anticuerpo/ácidos nucleicos, tal como se define a continuación.

En un modo de realización particular de la invención, dicho método de análisis por biochip comprende o consiste en las etapas siguientes:

a) la etapa a) tal como se ha definido anteriormente;

b) la puesta en contacto de las unidades de hibridación del chip (o al menos de las unidades de hibridación que se han puesto en contacto con el semianticuerpo en la etapa a) con la muestra;

c) la detección de los complejos eventualmente formados entre el semianticuerpo fijado en el chip al final de la etapa b) y uno o varios antígeno(s) de la muestra;

d) la detección de los complejos eventualmente formados entre, por un lado, unos ácidos nucleicos o unos ANP presentes en una o varias unidad(es) de hibridación del chip y, por otro lado, unos ácidos nucleicos complementarios presentes en la muestra;

e) llegado el caso, la cuantificación del o de los antígenos de la muestra detectado(s) en la etapa c) y/o del o de los ácido(s) nucleico(s) de la muestra detectado(s) en la etapa d).

La etapa d) se puede realizar después o antes de la etapa c) o simultáneamente a la etapa c). En un modo de realización particular de la invención, las etapas de detección y/o de cuantificación, o algunas etapas de detección y/o de cuantificación, se realizan por amplificación por PCR y/o por microscopía confocal.

En un modo de realización particular de la invención, las etapas a) y b) están sustituidas por las etapas siguientes:

a) un (o varios) semianticuerpo tal como el definido en la presente solicitud y en particular un semianticuerpo HAC_1, HAC_2 o HAC_4, se pone en contacto con las proteínas o los antígenos de la muestra (o más generalmente con la muestra) en unas condiciones que permiten la formación de complejos proteína / HAC; después

b) el semianticuerpo de la etapa a) se pone en contacto con una o varias unidades de hibridación (o manchas) de un chip de ácido nucleico en el que el semianticuerpo es capaz de fijarse (en particular de hibridarse).

En un modo de realización particular, en la etapa b), los semianticuerpos puestos en contacto con las unidades de hibridación son los semianticuerpos presentes en forma de complejos proteína / HAC.

En un modo de realización particular, los chips utilizados en el ámbito de la invención son unos chips de impedancia, y en particular unos chips tales como los divulgados en las solicitudes WO 2005/036170 y WO 2006/090073.

En un modo de realización particular de la invención, el(los) semianticuerpo(s) o uno de los semianticuerpos utilizados en el método de análisis por biochip según la invención es(son) tal(es) que comprende(n) un dominio nucleotídico (por ejemplo un dominio marcador) complementario de una secuencia nucleotídica presente en una o varias unidad(es) de hibridación del chip utilizado (véase la figura 12).

A título de ejemplo, en un modo de realización particular de la invención, el semianticuerpo utilizado en el método de análisis por biochip según la invención es un semianticuerpo HAC_1 tal que:

* la primera molécula quimérica, A o B, de este semianticuerpo comprende o consiste en:

-un dominio polipeptídico (i) tal como se define en la presente solicitud, y los dominios siguientes, posicionados sucesivamente en el orden siguiente, a partir del extremo C-terminal del domino polipeptídico (i):

-un dominio nucleotídico (ii) tal como se define en la presente solicitud,

-llegado el caso, un enlazador (por ejemplo un enlazador nucleico) unido, preferentemente por medio de una unión lábil en medio reductor (por ejemplo un puente disulfuro) o por medio de una unión persistente en medio reductor (por ejemplo por medio de una unión establecida con un ácido maleimida), a un dominio marcador complementario de una secuencia nucleotídica de una unidad de hibridación en dicho chip (esto permite la fijación de la molécula quimérica en la unidad de hibridación específica del chip, transformando por lo tanto la unidad de hibridación en una unidad de complejación para la fijación de un objetivo por reconocimiento anticuerpo-antígeno; y

* la segunda molécula quimérica, respectivamente B o A, de este semianticuerpo, comprende o consiste en:

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-un dominio polipeptídico (i) tal como se define en la presente solicitud, siendo este dominio y el dominio polipeptídico (i) de la primera molécula quimérica, preferentemente característicos de DV de un mismo anticuerpo, siendo uno de estos dominios característicos de un DV de la cadena ligera de un anticuerpo dado y siendo el otro característico de un DV de la cadena pesada del mismo anticuerpo,

-un dominio nucleotídico (ii) tal como se define en la presente solicitud, capaz de emparejarse en medio hídrico (en particular en medio reductor) en una estructura bicatenaria con el dominio nucleotídico (ii) de la primera molécula quimérica, respectivamente A o B.

La invención tiene también por objeto un chip (o biochip) tal como se define en la presente solicitud, que comprende una o varias unidades de hibridación en las que un (o varios) semianticuerpo tal como se define en la presente solicitud está complejado (o unido). Dicho chip es denominado por lo tanto "chip (o biochip) de anticuerpo" (cuando todas las unidades de hibridación de dicho chip están hibridadas con un semi-anitcuerpo) o un "chip mixto anticuerpo/ácidos nucleicos" (cuando una o varias unidades de hibridación de dicho chip no están hibridadas con un semianticuerpo, sino con un ácido nucleico).

La invención tiene también por objeto un kit, en particular un kit apropiado para una utilización para detectar y, llegado el caso, cuantificar, uno o varios antígeno(s) de interés eventualmente presente(s) en una muestra, comprendiendo o consistiendo dicho kit en:

a)

-un chip de ácido(s) nucleico(s); y

-uno o varios semianticuerpo(s) tal(es) como se define(n) en la presente solicitud o una o varias composición(es) que comprende(n) uno o varios semianticuerpo(s) según la invención; y

-llegado el caso, un prospecto; o

b)

-un chip de anticuerpo o un chip mixto anticuerpo/ácidos nucleicos según la invención; y

-llegado el caso, un prospecto.

La presente invención puede por lo tanto permitir funcionalizar unas unidades de complejación de un chip de ácido nucleico, con el fin de conferir a dichas unidades de complejación la capacidad de reconocer unos antígenos y en particular unos epítopos.

De manera similar, es posible funcionalizar cualquier otro elemento que presenta una superficie, en particular unas partículas por unos semianticuerpos según la invención, por medio por ejemplo de ANP o de ácidos nucleicos complementarios de un dominio marcador presente en dichos semianticuerpos (véase la figura 13).

Así, la invención tiene también por objeto una partícula (por ejemplo una nanopartícula) y en particular una partícula fluorescente o no fluorescente, caracterizada por que uno o varios semianticuerpo(s) tal(es) como se define(n) en la presente solicitud y en particular uno o varios semianticuerpo(s) HAC_1 y/o uno o varios semianticuerpo(s) HAC_4 están unidos a la superficie de dicha partícula. La unión semianticuerpo/partícula puede llevarse a cabo por medio de un ANP o de un ácido nucleico que comprende una secuencia complementaria de una secuencia nucleica de dicho semianticuerpo (por ejemplo complementaria del dominio marador del semianticuerpo.

Dicha partícula puede ser, por ejemplo, un punto cuántico (quantum dot (o Q-dot)).

dicha partícula se puede utilizar en particular para marcar (in vivo, ex vivo o in vitro) unas células diana, es decir unas células en la superficie de las cuales está presente un epítopo reconocido por el sitio de reconocimiento de un semianticuerpo según la invención.

La presente solicitud describe también el direccionamiento (in vivo, ex vivo o in vitro) de una o varias (en particular 2) ANPzima hacia unas células diana.

El ANP catalítico (denominado ANPzima en la presente solicitud) utilizado en la presente solicitud, presenta la capacidad de cortar específicamente un ADN. Esta ANPzima comprende o consiste en una o varias unidad(es) HD

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(histidina -ácido aspártico), o DH (ácido aspártico -histidina), EH (ácido glutámico -histidina) o HE (histidina -ácido glutámico). La utilización de una sola ANPzima permite realizar unos cortes en el ADN mientras que la utilización de dos ANPzimas, de tal manera que dos secuencias contiguas y no complementarias situadas en las dos hebras de un ADN complementario estén cortadas, permite cortar las dos hebras, a la manera de una enzima de restricción que conlleva un corte bicatenario desplazado; la utilización del sistema de ANPzimas contiguos permite introducir unas deleciones en el ADN.

El o los sistemas ANPzimas pueden ser aportados a una célula diana mediante cualquier medio y en particular utilizando uno o varios semianticuerpos de la invención.

La invención se refiere por lo tanto en particular a un semianticuerpo de la invención, en el que el dominio marcador y/o el dominio biológicamente activo comprende o consiste en una o varias ANPzimas (en particular una o varias ANPzimas que comprenden una unidad HD o DH). Cuando se utilizan dos ANPzimas en el ámbito de la invención, son llevadas preferiblemente por el mismo semianticuerpo, que puede ser injertado en una nanopartícula no tóxica (como se describe en la presente solicitud).

En un modo de realización particular, la invención se refiere a un semianticuerpo tal como se define en la presente solicitud, en el que el dominio marcador y/o el dominio biológicamente activo comprende o consiste en dos ANPzimas, en particular dos ANPzimas con unidad HD o DH, que son tales que las dos ANPzimas estén unidas por sus extremos N-terminal o eventualmente por sus extremos C-terminal por medio de un mismo enlazador (estas dos ANPzimas son denominadas en la presente solicitud "doble anpzima de cabeza con cola" o "DAZcc", de manera que estas ANPzimas reconozcan dos secuencias contiguas y no complementarias situadas en las dos hebras de un ADN complementario (véase la figura 14). DAZcc, hibridándose con el ADN, permite realizar un corte bicatenario desplazado entre las dos hebras de una molécula ADN. El direccionamiento de dos DAZcc por dos moléculas quiméricas, fijadas por ejemplo a una misma nanopartícula, y que comprenden el mismo dominio de DV pero dos DAZcc diferentes (por lo tanto que definen unos sitios de cortes desplazados), encuadra una región dada de una molécula de ADN, que permite realizar la deleción de esta región.

Esta herramienta se puede utilizar, en particular para realizar la deleción de la región de la secuencia nucleotídica de un virus, por ejemplo de un virus VIH y en particular del virus de VIH-1, que confiere la resistencia a dicho virus (véase la figura 15) o la deleción de una región de la secuencia nucleotídica de una bacteria que confiere la resistencia a uno o varios antibiótico(s); a título de ejemplo, se puede citar la secuencia PBS o unas secuencias responsables de la penetración en el núcleo.

La presente solicitud describe también una enzima o PNAzima como tal, formada por una estructura que comprende

o que consiste en:

-una secuencia PNA, unida a

-una secuencia peptídica, unida a

-otra secuencia PNA,

pudiendo ser las dos secuencias PNA idénticas o diferentes.

Tal como se describen en la presente solicitud, las secuencias PNA se determinan para dirigir una secuencia de ácido nucleico particular (por ejemplo una secuencia de ADN particular) y emparejarse.

La presente solicitud describe dos estructuras PNAzima tales como se definen anteriormente (pudiendo estas dos PNAzima tener unas secuencias idénticas o diferentes), unidas de tal manera que estén cabeza con cola, es decir unidas por sus extremos C-terminales, o (preferiblemente) por sus extremos N-terminales, preferentemente por medio de un mismo enlazador. Tal doble estructura PNAzima se denomina "doble PNAzima cabeza con cola".

Por "secuencia peptídica" se entiende aquí una cadena de al menos dos (es decir dos o más de dos) aminoácidos.

Tal como se describe en la presente solicitud, la secuencia peptídica presente en una PNAzima constituye un dominio catalítico de una enzima y en particular de una nucleasa, preferiblemente de una ADNsa.

Tal como se describe en la presente solicitud, dicha secuencia peptídica comprende o consiste en una o varias unidades DH (ácido aspártico -histidina), HD (histidina -ácido aspártico), EH (ácido glutámico -histidina) o HE (histidina -ácido glutámico).

Una PNAzima y en particular una doble PNAzima cabeza con cola permite realizar, como con una enzima de restricción, un corte monocatenario o bicatenario en un ADN. Además, la utilización de dos dobles PNAzimas cabeza con cola (por lo tanto 4 PNAzimas) permite la creación de deleciones en un ADN bicatenario, llegado el caso, mediante cortes contiguos sobre dos hebras de ADN complementarias.

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Otros modos de realización particulares, características y ventajas de la invención aparecerán en los ejemplos siguientes, así como en las figuras, y en particular en la figura 12.

Descripción de los dibujos

Figura 1: Ejemplo de síntesis realizado. 1: anticuerpo nativo; 2: puente disulfuro (o puente S-S); 3: dominios variables (DV) de cadena ligera y de cadena pesada; 4: dominios nucleotídicos estructurales (ANP estructural o Zipper); 5: semianticuerpo; 5a: sitio activo (DV1a+DV1b; sitio que comprende un sitio de reconocimiento de un epítopo) de semianticuerpo estructurado; 5b: ácidos nucleicos estructurales emparejados que forman una estructura de tipo Zipper; 6-8: secuencia nucleotídica marcadora que comprende una secuencia biológicamente activa; 6: secuencia del enlazador/espaciador; 7: puente disulfuro lábil; 8: secuencia biológicamente activa (ANP, LNA, etc.); 9: elemento lipófilo (por ejemplo: triptófano).

Figura 2. Reactor. 10: electrodo o electrodo y gel unidos a los bornes de un generador; 11: Tubo de latón que contiene la solución a reducir; 12: Gel duracryl & billes SH; 13: Tubo de material plástico (Tycon) aislante eléctrico;

14: Guía de electrodo; 15: Espiral de enfriamiento, Radiador en el que circula agua a una temperatura inferior a 10ºC.

Figura 3: 16: Análisis por transferencia Western, anticuerpos nativos; 17: Análisis por transferencia western, anticuerpos desnaturalizados; 18: Análisis por transferencia Western, anticuerpo electrorreducidos en el reactor de latón/Tycon a 100V, 2mA, 10s.

Figura 4. 19: antisentido ácidos nucleicos bloqueantes; 22: Interacción, puesta en evidencia por RMN, entre un ANP w-GTCCCGUCCCCGCCA-c; SEC ID nº 1 (w: triptófano; c: cisteína); 23: bucle de la actividad ARNsa o ADNsa de una ADNzima ANP/ADNzima; 24: unidad DH o HD de un bucle enzimático de una ANPzima.

Figura 5. 6: secuencia de enlazador/espaciador; 7: puente disulfuro lábil; 8: secuencia biológicamente activa (ANP, LNA...); 25: HAC_tag (1); 26: ANP estructural 1 (S3); 27: DV2a); 28: DV2b); 29: ANP estructural 1 (S4); 30: HAC_tag (2); 31: HAC_tag (3)

Figura 6: 20: interacción, puesta en evidencia por RMN, entre un ANP w-CGCCA-c (w: triptófano y c: cisteína con Nterminal 5' y C-terminal 3'); 21: Interacción, puesta en evidencia por RMN, entre un ANP w-GTCCC-c (w: triptófano y

c: cisteína con N-terminal 5' y C-terminal 3'); 22: Interacción, puesta en evidencia por RMN, entre un ANP w-GTCCCGUCCCCGCCA-c; SEC ID nº 1 (w: triptófano; c: cisteína).

Figura 7: reconocimiento anticuerpo/antígeno sobre membrana de nitrocelulosa. A. Anticuerpos electrorreducidos + BSA. B. Quimera + BSA.

Figura 8: Resultados de la fluorescencia por marcado sobre membrana de nitrocelulosa. (1) Fluorescencia del sobrenadante quimera/BSA sobre nitrocelulosa; (2) control negativo (sonda fluorescente sobre BSA).

Figura 9: Resultados de la fluorescencia sobre las trampas magnéticas. (1) sobrenadante de las trampas magnéticas / quimeras marcadas; (2) control negativo (sonda fluorescente con trampas magnéticas).

Figura 10: Quimera libre y quimera injertada sobre partículas. 7: puente disulfuro lábil; 25: HAC_tag (1); 26: ANP estructural 1 (S3); 27: DV2a); 28: DV2b); 29: ANP estructural 1 (S4); 30: HAC_tag (2); 31: HAC_tag (3); 32: partícula.

Figura 11: quimera injertada sobre partículas. 7: puente disulfuro lábil; 25: HAC_tag (1); 26: ANP estructural 1 (S3);

27: DV2a); 28: DV2b); 29: ANP estructural 1 (S4); 30: HAC_tag (2); 31: HAC_tag (3); 32: partícula.

Figura 12: chip ácido nucleico mixto proteína/ácido nucleico. 8': secuencia marcadora tag (ANP, LNA. etc.); 25: HAC_tag; 35: chip (ANP, LNA, ácidos nucleicos, etc.); 34 Puntos ANP Anti-secuencia marcadora; 36: Mancha ANP Anti-secuencia ADN/ARN. 37: ácido nucleico diana.

Figura 13: Funcionalización partícula fluorescente. 8': secuencia marcadora tag (ANP, LNA, etc.); 25: HAC_tag; 38: partícula fluorescente; 39 secuencia complementaria de la etiqueta tag.

Figura 14. 24: unidad enzimática DH o HD de una ANPzima; 40: parte ANP de la APNzima; 41: sitio de corte enlazadores NN o CC entre ANP, LNA, etc. complementarios; 42: enlazador que une las partes C-terminales de dos ANPZimas cabeza con cola; 43: DNA diana a suprimir.

Figura 16. 6: secuencia enlazador/espaciador; 44: ANP estructural S1; 45: DVA; 46: DVB; 47: ANP estructural (S2).

Figura 17: Resultados de dot blots de la purificación de las moléculas SP1 & SP2. 48: Sobrenadante 1 / Moléculas SP(1/2) → solución que comprende la proteína HS-LPGTG + la enzima sortasa A + ANP SP(1/2); 49: Elución enz

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AcTev/ Moléculas SP(1/2) → solución que comprende la proteína HS-LPGTG + la enzima sortasa A + ANP SP(1/2);

50: Elución imidazol/moléculas SP(1/2) → solución que comprende la proteína HS-LPGTG + la enzima sortasa A + ANP SP(1/2); 51: Sobrenadante 1 /CNI → control negativo 1 solución que comprende la proteína HS-LPGTG + La enzima sortasa A; 52: Elución enz AcTev/CNI → control negativo 1 solución que comprende la proteína HS-LPGTG

+ La enzima sortasa A; 53: Elution imidazole/CNI → control negativo 1 solución que comprende la proteína HS-LPGTG + La enzima sortasa A; 54: Sobrenadante 1 / CNII → Control negativo II, solución que comprende la proteína HS-LPGTG + ANP SP1; 55: Elución enz AcTev/ CNII → Control negativo II, solución que comprende la proteína HS-LPGTG + ANP SP1; 56: Elution imidazol/ CNII → Control negativo II, solución que comprende la proteína HS-LPGTG + ANP SP1;

Sobrenadante 1: solución proteica no retenida sobre las perlas NI-NTA

Elución enz Actev: 1ª elución de las proteínas retenidas sobre las perlas NI-NTA por la enzima AcTev

Elución imidazol: 2ª elución de las proteínas retenidas sobre las perlas NI-NTA por imidazol 400mM.

Figura 18: Reconocimiento Dot blotting antígeno(HEL_DL488)/Anticuerpo comprimido. 56: Ac nativos anti-HEL no diluido, depositados sobre nitrocelulosa (1x2ul a 650uM) + HEL_DL488 en solución; 57: Ac nativos anti-HEL diluido (5*x2uL a aproximadamente 10uM) + HEL_DL488 en solución; 58: Moléculas SP1&SP2 emparejadas (parte variable del anticuerpo comprimido) (5x2uL a aproximadamente 10uM) + HEL_DL488 en solución.

Figura 19: Resultado de la digestión de PBS de VIH-I por la ANPzima PZ1; 59: PBS ARN no cortado; 60: PBS ARN cortado; 61: Gel nativo 20% acrilamida; 62: Gel desnaturalizante 20% acrilamida; 63: Dúplex PBS/ANPZIMA; 64: PBS solo; 65: PBS + PZ1 a T0; 66 PBS + PZ1 a T6h, desaparición del PBS; PB: marcador de pesos moleculares; A: PBS (ARN) solo; B: PBS (ARN) + PZ1 (6H a 37°C); C: PBS (ARN) + PZ1 (0H a 37°C); D: PBS (ARN) + PZ1 (6H a 37°C).

Ejemplos

Se sintetizan nuevas moléculas quiméricas denominadas "semianticuerpos", capaces de autoensamblarse en un medio apropiado. Comprenden una parte de naturaleza polipeptídica y una parte constituida de una secuencia nucleotídica o de un análogo.

Preferiblemente, la parte polipeptídica está constituida de partes de anticuerpos, y más precisamente de los dominios variables de uno o varios anticuerpos que proceden de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo y que, estructurándose forman específicamente un sitio de reconocimiento del epítopo. La segunda parte está constituida de un ácido nucleico o de un análogo tal como un ANP o un LNA.

Un primer tipo de HAC consiste en dos dominios DV (un dominio procedente de una cadena pesada de un anticuerpo y un dominio procedente de una cadena ligera del mismo anticuerpo, que reconocen específicamente el antígeno) y de dos secuencias nucleicas.

Uno de los dominios DV (figura 1.3) está acoplado de manera covalente (figura 1.4) en el extremo C-terminal, bien en el extremo 5' de un ácido nucleico (LNA, ácido nucleico metilfosfonato, ácido nucleico tioato, etc.), o bien en el extremo N-terminal de un ANP.

El otro dominio DV está acoplado de manera covalente en su extremo C-terminal, bien en el extremo extremo 3' de un ácido nucleico (LNA, ácido nucleico metilfosfonato, ácido nucleico tioato, etc.), o bien en el extremo C-terminal de un ANP.

Las dos secuencias nucleotídicas complementarias y orientadas de manera anti-paralela se emparejan creando una hélice alfa que permite a las dos partes proteicas adquirir una forma funcional. En otras palabras, las secuencias ANP y/o ácido nucleico injertadas detrás de los péptidos del dominio DV actúan como una estructura de tipo "Zipper" (ANP "zipper" o estructurales) y los dos dominios DV se disponen enfrente para reformar el sitio activo de un semianticuerpo (figura 1.5a), capaz de dirigir un antígeno intra y/o extra-celular.

Este auto-ensamblaje se puede utilizar para asociar, según ensamblajes nuevos, unos dominios DV nuevos o unos dominios DV procedentes de dominios DV existentes no asociados a fin de buscar nuevas afinidades. Esta invención describe también un procedimiento de síntesis para las quimeras HAC y finalmente unos ejemplos particulares de utilización de HAC específicos, en particular para luchar contra el VIH-1 y 2.

Espaciadores/enlazadores peptídicos: polímero de 1 a 20 carbonos:

En un modo de realización particular, los dominios DV utilizados conservan al menos una cisteína que permite establecer unos puentes disulfuros entre los dominios DV. Los ácidos nucleicos y/o los ANP se injertan entonces después de dichas cisteínas, de manera que hibridándose, los ácidos nucleicos y/o ANP injertados disponen

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juiciosamente las cisteínas permitiendo la formación de los puentes disulfuros entre las dos cadenas DV que formarán el sitio activo del semianticuerpo. El emparejamiento de las secuencias nucleicas de tipo zipper permite la formación de una molécula estable, con un puente disulfuro que tiene un potencial redox modificado. Este puente disulfuro se mantiene en medio intracelular, lo que aumenta la posibilidad de tener un sitio semianticuerpo funcional.

En algunos modos de realización, unas moléculas espaciadoras enlazadoras, tales como la lisina, la etil-diamina, la beta-alanina, etc., o cualquier otra cadena hidrógeno-carbonada, pueden ser intercaladas entre el ácido nucleico y/o el ANP estructural del dominio DV, de manera que una vez que los nucleótidos estén hibridados entre sí, el desplazamiento introducido por los espaciadores enlazadores entre los dos dominios DV permiten la optimización de la formación del sitio activo del semianticuerpo.

Injerto:

Según un modo de realización preferido, un ANP (a) se injerta en el extremo C-terminal de un dominio DV, por medio del NH2 de la cadena lateral de una lisina unida al extremo C-terminal de dicho ANP (a) por una unión peptídica. El ANP (a) es por lo tanto de orientación C hacia N, opuesta a la orientación N hacia C del DV, y la lisina tiene el papel de espaciador enlazador. El segundo dominio DV está unido por su extremo C-terminal al extremo Nterminal de otro ANP (b), gracias a una unión peptídica o amida con uno de los NH2 de una lisina, estando dicha lisina unida, por su grupo COOH, al extremo N-terminal del ANP (b) complementario del ANP (a). El ANP (b) está por lo tanto orientado N hacia C, al igual que DV.

En un modo de realización particular, el injerto, de un ANP modificado en N-o en C-terminal por una lisina o de un ácido nucleico modificado en 5' o en 3' por un NH2, sobre el extremo C-terminal de los dominios DV se realiza por la acción del ácido 2-mercapto-etanosulfónico o por la acción del ácido 3-mercaptopropiónico en la cisteína de los DV implicada en la formación del puente disulfuro que une la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo.

Dominios peptídicos DV utilizados:

Los dominios DV utilizados para realizar las quimeras pueden provenir bien de la digestión de los anticuerpos por la pepsina, la papaína, la tripsina (o cualquier otra enzima), o bien de la expresión de los genes que codifican estos péptidos en unos sistemas celulares tales como bacterias, levaduras, células de insectos, síntesis in vitro (kits), etc., después de la purificación. El tamaño de estos dominios puede variar por ejemplo de 10 a 300, de 20 a 200 o de 40 a 200 restos de aminoácidos.

Ácidos nucleicos estructurales "zipper" (o dominios nucleotídicos (ii); figura 1.4; 1.5b):

Los ácidos nucleicos utilizados para estructurar el semianticuerpo son unas secuencias complementarias, cuyo tamaño puede variar, por ejemplo, de 3 a 100 o de 5 a 60 nucleótidos. Estas secuencias pueden ser simples secuencias nucleotídicas, ANP, LNA, etc.

Clonación:

En el caso de la clonación de los dominios DV, el dominio DV puede ser fusionado en su extremo C con una secuencia peptídica LPXTAAAA (leucina-prolina-X-treonina-alanina(4) (X = un aminoácido cualquiera); SEC ID nº 2). El ácido nucleico o el ANP a injertar, por su parte, está funcionalizado en uno de sus extremos por una poli-G, eventualmente por medio de una lisina, permaneciendo libre el extremo N-terminal de la poli-G.El dominio DV y el ácido nucleico o el ANP son entonces fusionados bajo la acción de sortasa A.

La secuencia LPXTAAAA puede estar ventajosamente sustituida con la secuencia LPXTG (leucina-prolina-Xtreonina-glicina, en la que X es un aminoácido cualquiera; SEC ID nº 7).

En un modo de realización particular, es posible combinar unos DV de anticuerpos diferentes complejándolos gracias a ANP estructurales complementarios para obtener nuevos anticuerpos dirigidos contra nuevos antígenos. Es así posible efectuar unos cribados de antígenos para la búsqueda de nuevos anticuerpos.

En un modo de realización particular, los semianticuerpos ADN/AC descritos tienen al mismo tiempo la capacidad de alcanzar específicamente la célula diana (propiedad de reconocimiento conferida por la parte anticuerpo) y la de proporcionar al interior de la célula un dominio biológicamente activo (propiedad conferida por la secuencia hidrófoba adicionada). Así, la molécula quimérica asegura el direccionamiento del ácido nucleico a la célula pero también su penetración en el interior de la célula.

La invención se refiere también a un HAC que puede ser utilizado para dirigirse a unas células específicas a fin de introducir en ellas, por ejemplo, un dominio nucleico biológicamente activo (por ejemplo: ANP) dirigida contra una diana particular. Este dominio biológicamente activo está injertado por una unión covalente detrás una de las secuencias nucleicas zipper descritas anteriormente. En este caso, el sitio activo o de reconocimiento anticuerpo de HAC está dirigido hacia unos antígenos de superficie. Esto permite por un lado reconocer específicamente las

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células diana y, por otro lado, favorecer la penetración de un dominio biológicamente activo acercándolo a la membrana.

En otras palabras, la molécula quimérica está constituida de las partes variables de un semianticuerpo DV1a/DV1b (figura 1.5a). Sobre cada péptido DV se injerta un ácido nucleico estructural (zipper), de tal manera que este ácido nucleico injertado en un péptido DV1a sea complementario y antiparalelo al ácido nucleico estructural (zipper) injertado en el segundo péptido DV1b. Los dos péptidos DV forman entonces un semianticuerpo con su sitio activo o de reconocimiento. Uno de los dos ácidos nucleicos estructurales está seguido de una secuencia nucleotídica (tag) (figura 1.6 a 1.8) que comprende un domino biológicamente activo.

En un modo aún más particular, el semianticuerpo permite dirigirse a unos orgánulos o unas moléculas intracelulares.

Dominio biológicamente activo (o dominio Tag; figuras 1.6 a 1.9)

El dominio biológicamente activo puede ser un ácido nucleico, un ANP, una secuencia mixta ANP/ácido nucleico, ANP/péptido y más generalmente una secuencia nucleotídica o un análogo (ANP, LNA, metilfosfonatos, metilsulfonatos, ácidos nucleicos o desoxinucleicos modificados, o una mezcla de estas diferentes moléculas, etc.) una ADNzima, una ANPzima, o una MiRNA, eventualmente un antisentido, que entrando en la célula diana impedirá la expresión de una secuencia diana o la degradará, o presentará una actividad ADNasa o ARNAsa, o una combinación de estas dos propiedades (figura 4.19).

En un modo de realización particular, el dominio biológicamente activo es una secuencia antisentido que comprende todo o parte del ARNtLys3, por ejemplo GTCCC o GUCCC, complementario de una parte del ARB viral VIH-1.

En la figura 6.21, se presenta la interacción, puesta en evidencia por RMN, entre ANP w-GTCCC-c (w triptófano y c cisteína con N-terminal 5' y C-terminal 3') y las secuencias Primer Binding Site (PBS) de VIH-1. La secuencia forma un complejo extremadamente estable con el PBS de VIH-1, capaz de desplazar el complejo ARNtARNtLys3/PBS de VIH-1.

En otro modo de realización, el dominio biológicamente activo es una secuencia antisentido que comprende todo o parte de la secuencia terminal de tRNA_Lys3, por ejemplo CGCCA, complementaria de una parte del ARN viral VIH

1.

En la figura 6.20 se presenta la interacción, puesta en evidencia por RMN, entre un ANP w-CGCCA-c (W triptófano y c cisteína con N-terminal 5' y C-terminal 3') y las secuencias PBS de VIH-1. La secuencia forma un complejo extremadamente estable con PBS de VIH-1, capaz de desplazar el complejo ARNtARNtLys3/PBS VIH-1.

En un modo de realización aún más particular, el dominio biológicamente activo propiamente dicho es una combinación de las dos secuencias GTCCC o GUCCC y CGCCA (figura 6.22) (N' ATGGTAGAG-cisteína C' y N' cisteína-CTCTACCAT C').

En un modo de realización particular, la secuencia antisentido propiamente dicha es una secuencia complementaria de toda o parte de la región PBS o de la región TAR del ARN viral de VIH-1 o VIH-2.

En un modo de realización particular, el dominio biológicamente activo antisentido comprende unos ANP (figura 6.22).

En un modo de realización particular, el dominio biológicamente activo es una secuencia de actividad enzimática de tipo ADNzima y unas secuencias de reconocimiento complementarias de toda o parte de la secuencia PBS.

En un modo de realización aún más particular, el dominio biológicamente activo está constituido de un dímero DNA/ANPzima. La parte ANP (que flanquea a ambos lados el bucle ADNzima) es complementaria de una secuencia diana de interés que puede ser toda o parte de la secuencia PBS o TAR del VIH-1 o del VIH-2 (figura 4.22) y la parte ADNzima, formada de 2 a 23 restos, presenta una estructura en bucle (figura 4.23) y conllevará la degradación de la secuencia diana debido a su actividad ARNsa o ADNsa.

En un modo de realización particular, la totalidad de la secuencia enzimática es un ANP, formando así una ANPzima.

En un modo de realización particular, el bucle enzimático de ANPzima está completa o parcialmente sustituido por una unidad que comprende al menos un aminoácido tal como DH (ácido aspártico -histidina), HD (histidina -ácido aspártico), EH (ácido glutámico -histidina) o HE (histidina -ácido glutámico) (figura 4.24).

En un modo de realización particular, la secuencia ANPzima, antisentido, ANP/ADNzima propiamente dicha se utiliza sola o en combinación de cualquier parte de HAC:Tag (HAC, secuencia espaciador, extremo lipófilo o

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aromático).

El sistema de secuencia biológicamente activa puede ser adaptado a cualquier tipo de virus, de bacterias, en particular que tienen como objetivo los genes de resistencia a los antibióticos a fin de inhibir la resistencia y hacer las bacterias sensibles al antibiótico correspondiente.

En un modo de realización particular, la secuencia antisentido propiamente dicha comprende toda o parte de la secuencia ARN o ADN de los genes bacterianos de resistencia a los antibióticos o una secuencia antisentido complementaria de toda o parte de esta secuencia.

Espaciadores/enlazadores nucleicos (figura 1.6):

La secuencia injertada puede comprender una secuencia espaciadora de 5 a 50 nucleótidos que tienen como objetivo optimizar la distancia entre el dominio nucleico ii) y el dominio biológicamente activo que debe penetrar en la célula.

En un modo de realización preferido, la secuencia tag comprende una parte ácido desoxirribonucleico que actúa como espaciador (figura 1.6). El espaciador está unido a una secuencia ANP (o a otro ácido nucleico, modificado o no) que constituye el dominio biológicamente activo propiamente dicho (figura 1.8).

El dominio biológicamente activo está, por ejemplo, unido por uno de sus extremos a la secuencia espaciadora por una secuencia lábil en medio reductor, por ejemplo un puente disulfuro SS (figura 1.7).

En un modo de realización particular, la secuencia espaciadora está ausente y el dominio biológicamente activo está unido al semianticuerpo por una unión covalente.

En un modo de realización particular, una función tiol está presente en el otro extremo libre de la secuencia espaciadora. Esta función permite injertar otra molécula en la secuencia espaciadora por el establecimiento, por ejemplo, de una unión SS. Esta unión SS es lábil en medio reductor tal como el medio del citoplasma celular. Esta unión, después de la reducción del puente SS, permite la separación del HAC y del dominio biológicamente activo. Según un modo de realización particular de la invención, la función tiol está introducida en el extremo de la secuencia espaciadora por fusión, con dicha secuencia, de una secuencia que comprende una función tiol en uno de los extremos. La fusión de la secuencia espaciadora y de la secuencia que comprende una función tiol en su extremo libre puede ser obtenida gracias a una ligasa.

El dominio biológicamente activo puede, por ejemplo, comprender una función tiol en uno de sus extremos para el establecimiento de un puente disulfuro entre el dominio biológicamente activo y la secuencia espaciadora. Esta función tiol puede estar sustituida por un ácido maleimida a fin de que la unión entre la secuencia espaciadora y el dominio biológicamente activo sea persistente en un medio reductor.

Paso transmembranario:

El objetivo de este HAC puede ser extra o intracelular, lo que implica, en este último caso, el paso del ácido nucleico a través de la membrana plásmica. Este paso se hace posible por la adición de una secuencia hidrófoba en el extremo libre del ácido nucleico (dominio biológicamente activo) a transferir. Este grupo lipófilo (figura 1.9) permite al dominio biológicamente activo atravesar la membrana celular más fácilmente. En un modo de realización aún más preferido, el grupo lipófilo es aromático, con el fin de intercalarse en una hélice mixta ANP/ácido nucleico a fin de estabilizar esta estructura formada entre el antisentido ANP y la diana ácido nucleico.

El sitio de reconocimiento de la estructura HAC_tag se fija específicamente en las células que comprenden los antígenos diana; la función lipófila injertada en el dominio biológicamente activo (ANP antisentido, ADNzima, etc.) permite al brazo nucleotídico atravesar la membrana, y más particular, al dominio biológicamente activo. Al ser el medio intracelular un medio reductor, los puentes SS que unen el dominio biológicamente activo a la secuencia espaciadora son reducidos, liberando así el dominio biológicamente activo en el interior de la célula diana.

Por ejemplo, el ANP antisentido se compleja entonces con las secuencias sentido dianas (ARN en el citoplasma o ADN en el núcleo) y bloquea las posibilidades de expresión de la secuencia diana (a nivel de la transcripción, retrotranscripción, replicación y/o traducción). La molécula aromática, tal como el triptófano introducido en el extremo del ANP antisentido, estabiliza el dúplex ANP/ADN o ARN que se forma, y mejora así la eficacia de bloqueo por el ANP.

Anticuerpos o dominios peptídicos DV

En un modo de realización particular, el anticuerpo utilizado para realizar el HAC_tag es un anticuerpo que reconoce una proteína de una cubierta viral o bacteriana.

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En un modo de realización particular, el anticuerpo utilizado para realizar HAC_tag es capaz de fijarse sobre la partícula viral.

En un modo de realización particular, el anticuerpo utilizado para realizar HAC_tag es el anticuerpo anti gp 120-17b. El HAC_tag-gp120-17b puede fijarse sobre las partículas virales y es llevado por ellas hasta las células diana del virus gracias a las interacciones CD4/gp120. Después de la fijación de los viriones en los objetivos, el brazo nucleico de HAC-tag puede atravesar la membrana celular gracias a la función lipófila injertada en el extremo del dominio biológicamente activo. Después del paso a través de la membrana celular, el puente SS, que une la secuencia espaciadora y el dominio biológicamente activo, se reduce en el citosol, liberando el dominio biológicamente activo en la célula. La secuencia biológicamente activa bloquea o bloquea y degrada la secuencia viral, según si el dominio biológicamente activo es un antisentido o un antisentido/ANPzima.

Según un modo de realización particular, el anticuerpo utilizado para la síntesis del semianticuerpo está constituido de un anticuerpo anti-retrotranscriptasa, en particular anti-retrotranscriptasa VIH-1 o VIH2. En esta configuración, el semianticuerpo está unido al dominio biológicamente activo por medio de una unión persistente en medio reductor, por ejemplo por medio de un ácido maleimida. Una secuencia espaciadora puede eventualmente ser intercalada entre el semianticuerpo y el dominio biológicamente activo, siendo las uniones que unen HAC, secuencia espaciadora y dominio biológicamente activo, persistentes en medio reductor. El dominio biológicamente activo es preferiblemente una secuencia ANPzima, ADNzima o ANP antisentido. El HAC-tag así constituido se compleja con la transcriptasa inversa mientras que el dominio biológicamente activo degrada y/o bloquea el ARN viral.

Los HAC_tag pueden también ser incluidos (en particular encapsulados) en microesferas o liposomas, más particularmente los HAC_tag estarán incluidos en liposomas constituidos de membrana viral.

La invención se refiere también a un sistema que comprende (véase la figura 5):

1) un primer HAC (GAC_1; figura 5.25), dirigido por ejemplo contra un antígeno presente en la superficie de las células o un antígeno viral y que comprende o que está constituido de:

*: dos dominios DV (DV1a y DV1b), unidos respectivamente a

*: dos secuencias zipper (S1 y S2) complementarias, antiparalelas

*: un espaciador unido a una secuencia zipper de HAC_1, unido por uno de sus extremos y por medio de un puente SS a

*: un dominio biológicamente activo (figura 5.8), unido por medio de una unión covalente a

*: un ácido nucleico estructural, S3 (figura 5.26), de un tercer HAC (HAC_3),

*: estando el otro extremo de la secuencia estructural (S3) unido a

*: un dominio DV (DV2a; figura 5.27);

2) un segundo HAC (HAC_2), dirigido por ejemplo contra un antígeno presente también en la superficie de las células y que comprende o que está constituido de:

*: dos dominios DV (DV3a y DV3b), unidos respectivamente a

*: dos secuencias zipper (S5 y S6) complementarias, antiparalelas

*: un espaciador que comprende un puente disulfuro o unido por medio de un puente disulfuro a

*: un ácido nucleico estructural, S4 (figura 5.29), complementario, antiparalelo a S3, unido a

*: un dominio DV (DV2b; figura 5.28). 3) En una célula que comprende HAC_1 y HAC_2, se forma un tercer HAC, HAC_3. Éste comprende:

*: dos DV (DV2a y DV2b), unidos a los

*: dos ácidos nucleicos estructurales, S3 y S4, complementarios, antiparalelos (derivados respectivamente de HAC_1 y HAC_2),

*: estando S3 unido por medio de una unión covalente al

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* dominio biológicamente activo derivado de HAC_1 (figura 5.8).

Según un modo de realización particular, HAC_1 está dirigido contra la proteína gp120, HAC_2 está dirigido contra la proteína CD4.

Según un modo de realización particular, DV2a y DV2b forman un sitio de reconocimiento HAC_3 (figura 5.31) anti retro-transcriptasa cuando los dos ácidos nucleicos estructurales S3 y S4 se hibridan.

Este sistema puede ser declinado de diversas maneras para proporcionar, en el interior de una célula, las dos partes de un semianticuerpo, que pueden así autoensamblarse en la célula. Se pueden utilizar en particular unas partículas virales para proporcionar específicamente los semianticuerpos y su dominio biológicamente activo en la célula.

Preparación de las moléculas quiméricas por fusión de puentes disulfuros.

a) reactor

El anticuerpo sufre una reducción electroquímica llevado a cabo en un reactor enfriado. El reactor se compone de un tubo vertical de latón de 2 mm de diámetro y de 1,5 cm de longitud que contiene la solución del anticuerpo a electroreducir. El extremo inferior del tubo está unido al borne positivo de un generador por un electrodo mixto compuesto de una aguja rellena y rodeada de un gel duracryl 20% (124 µl de duracryl (Sigma) 30% + 30 µl de Tris 1,5M pH 8,9

+ 43,6 µl H2O + 50 µl de tampón de electro-reducción + 5 µl APS 10% + 2 µl de Temed) contenido en un tubo Tycon (Norton) de 1,5 cm, cerrado por un lado con la ayuda de la llama de un mechero Bunsen. El electrodo de gel permite el paso de los electrolitos, pero limita la difusión de los anticuerpos o de sus formas reducidas. El extremo superior del reactor está unido al polo negativo del generador por una aguja, a fin de impedir cualquier contacto entre las paredes del reactor y el electrodo gracias a un cono de pipeta que guía la aguja en el interior del reactor. El reactor está rodeado por un sistema de enfriamiento constituido de otro tubo de latón trenzado para formar una espiral en la que circula agua a temperatura de fusión del hielo, bajo la acción de una bomba peristáltica. Los parámetros utilizados para la reducción del anticuerpo en semianticuerpo son: +100V, 2mA, 10s.

b) funcionalización de los semianticuerpos por oxidación de las funciones tioles

Se utiliza una solución de 4 l de anticuerpos anti-BSA a 0,5 µg/µl, 4 µL de tampón 0,12% β-mercaptoetanol y de 6 µl de la secuencia Tag_C a 500 ng/µl (5'HS-TCAAGTAGCTTCAGAATCTTTTCCCCCC3'; SEC ID nº 3), para funcionalizar las funciones tioles (SH) liberadas en los anticuerpos después de la reducción por electro-oxidación a 100V, 2mA, durante 10 segundos.

Puesta en evidencia por fluorescencia

El marcaje de las secuencias TAG_C de las quimeras se realiza gracias a una secuencia nucleotídica (tag_D = 5'CTGAAGCT3_cisteína) complementaria de la secuencia tag_C y funcionalizada en 3' por un fluoróforo cianina 3. Se añaden 15 µl de secuencia tag_D (0,3 µg/µl) a 10 µl de una solución de quimeras funcionalizadas por una secuencia tag_C y diluida (1/1000) en leche/TBS1X. En esta solución, un depósito de antígeno BSA sobre membrana nitrocelulosa se incuba durante la noche a 4°C. Después de tres lavados con TBS 1X durante 5 minutos para eliminar los enganches específicos, la membrana se desnaturaliza por 50 µl de β-mercaptoetanol 2,5%, a una temperatura de 95°C, durante 20 minutos. Se depositan 2 µl de sobrenadante sobre una lámina de vidrio. El depósito se seca durante 20 minutos al aire libre y protegido de la luz, y después se escanea la lámina (Packard Bioscience) a 455 nm.

Un control negativo se efectúa en paralelo: una membrana que comprende un depósito de antígeno es incubada con 15 l de tag-D y 1 ml de leche/TBS 1X a 4ºC toda la noche con agitación. La membrana sufre el mismo protocolo que anteriormente. Se depositan también 2 l que proceden de su desnaturalización en lámina de vidrio y se escanean para evaluar el enganche específico.

c) fusión de los dominios (i) DV y (ii) Zipper por un protocolo de transpeptidación enzimática por sortasa A (figura 16)

c.1) sortasa A

El plásmido pLLC092 (http://isisbiolab.dabbledb.com/publish/laboratorvstocks/ff0e3c28-ca9a-4280-95cef170e7f7a39a/allentries.txt) que contiene la secuencia de la sortasa contigua a un Tag Histidina, se ha transfectado en las células competentes BL21(DE3) (biolabs) bajo el control de un promotor Lac inducido por IPTG (isopropilo βD-1-tiogalactopiranosido). La expresión de la sortasa A es entonces inducida por IPTG (1 mM). La enzima sortasa A se purifica después mediante el kit Ni-NTA Fast Start Kit (Qiagen).

c.2) Proteínas HS-LPGTG y LS-LPGTG

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Una secuencia TTTTTC se añade en final de SP1 a fin de poder poner en evidencia la quimera formada marcándola con un ácido nucleico GAAAAA fluorescente.

SP1 y SP2 se recogen en una solución de 10% de N-metil-2-pirrolidona (NMP) para la concentración final de 100 5 micro M.

ensayo-I: Se preparan una solución de 50 l de SP1 y una solución de 50 l de SP2, a una concentración final de 20M que contiene 20M de HS-LPGTG (I-A), y respectivamente 20M LS-LPGTG (I-B), la enzima SrtA a 20M, Tris-HCL pH 7,5 a 50mM, NaCl a 150mM y CaCl2 a 5mM.

10 Se realizan también cuatro controles negativos (figura 17):

-CNI-sp1 (solución sin ANP) 50l de solución que contiene HS-LPGTG (I-A) a 20M y la enzima SrtA a 20M.

15 -CNII-sp1 (solución sin srtA) 50l de solución que contiene HS-LPGTG (I-A) a 20M y le ANP-SP1 a 20M.

-CNI-Sp2 (solución sin ANP) 50l de solución que contiene LS-LPGTG (I-B) a 20M y la enzima SrtA a 20M.

-CNII-SP2 (solución sin srtA) 50l de solución que contiene LS-LPGTG (I-B) a 20M SP2 a 20M.

20 Los tubos se incuban durante 24H a 37°C.

c.3 Purificación por bolas magnéticas y enzima AcTev

25 Se precipitan 25 l de perlas magnéticas de agarosa Ni-NTA (Qiagen), se retira el sobrenadante. Se añaden sobre estas perlas 50l de solución a purificar + 100l de tampón de unión a proteínas (50mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH8). Se incuba durante 1H30 sobre molino de rueda a temperatura ambiente a 7rpm. Se precipitan estas perlas y se recupera el sobrenadante n°1. Se realizan dos lavados de las perlas con 150 l de tampón de unión a proteínas. Se recorta el marcador 6histidina por la enzima AcTev proteasa (Invitrogen) 10l de 5X

30 Tev Buffer, 5l de 0,01 M de DTT, 0,5l de enzima AcTev proteasa, 34,5l de H2O, se incuba durante 4h a 30°C. Se precipitan las perlas, se recupera el sobrenadante n°2 (que contiene las moléculas que han sufrido la transpeptidación). Se realizan dos lavados de las perlas con 150 l de tamón de unión a proteínas. Se eluyen las proteínas todavía presentes en las perlas por 50l de elución de tampón de proteína (50mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH8) durante 1h a temperatura ambiente sobre molino de rueda a 7 rpm. Se precipitan las

35 perlas y se recupera el sobrenadante n°3.

c.4 Puesta en evidencia de la fusión (véase la figura 17).

Para SP1 y respectivamente SP2, se depositan 2 l de cada sobrenadante (ensayo, CNI, CNII) recuperados sobre

40 una membrana de nitrocelulosa proteica (Whatman). Se secan los depósitos durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se saturan con una solución de leche el 5%/TBS1X pH 7,6 a 4°C durante 20 minutos. Se hibrida la membrana durante la noche a 4°C bajo una ligera agitación en un tampón de leche al 5%/TBS1X pH 7,6 que contiene 50 pM de secuencias, marcadas por fluorescencia en Cy-3 y 6-FAM respectivamente, complementarias del ANP-SP1 o del ANP-SP2 respectivamente. Se realizan tres lavados de 15 minutos de la membrana con una

45 solución de leche al 5%/TBS1X pH 7,6. Se escanea con Typhoon 8600 (Amersham Biosciences).

Se presentan los resultados, demuestran la fusión entre la molécula SP1 y SP2 con los péptidos HS-LPGTG y LS-LPGTG respectivamente para obtener SP1(I-II) y SP2(I-II).

50 d) Auto-ensamblaje de la quimera.

d.1) Hibridación de las moléculas SP1 (i-ii) con las moléculas SP2 (I-II)

Se ponen a hibridar durante 1h a 37ºC, 12,5l de sobrenadante n°2 producido en C.3 (véase anteriormente) de

55 moléculas SP1(I-II) y 12,5 l de sobrenadante n°2 producido en C.3 (véase anteriormente) de moléculas SP2 (I-II) + 25 l de tampon neutro (200 l de glicerol 99%, 33 l de tris 3M pH6,8, 267l de H2O).

d.2) Verificación de la funcionalidad de la molécula (véase la figura 18).

60 Se depositan 5 veces 2 l de solución obtenida en D.1 sobre una membrana de nitrocelulosa proteica (Whatman) con un secado de 10 minutos entre cada depósito a fin de formar una zona de depósito o mancha.

Se efectúan dos controles tales que:

Claims

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