ES2565481T3

ES2565481T3 - Anticuerpo anti-PlGF novedoso

Info

Publication number: ES2565481T3
Application number: ES11160897.2T
Authority: ES
Inventors: Jean Marie Stassen; Peter Carmeliet; Désiré COLLEN
Original assignee: Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB; Life Sciences Research Partners vzw; ThromboGenics NV; Life Sciences Res Partners
Current assignee: Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB; Life Sciences Research Partners vzw; Life Sciences Res Partners; Oxurion NV
Priority date: 2005-03-24
Filing date: 2006-03-24
Publication date: 2016-04-05
Anticipated expiration: 2026-03-24
Also published as: JP2008532557A; CN101184776A; KR101314014B1; EA200702064A1; US20080193455A1; WO2006099698A2; PT1869085E; BRPI0609151A2; US20140178397A1; IL185754A; CN101184776B; UA94707C2; AU2006227571B2; AU2011201340B2; ZA200707258B; JP5164829B2; BRPI0609151B8; US7875704B2; HK1116803A1; WO2006099698A3

Abstract

Un anticuerpo monoclonal, fragmento o derivado del mismo, que es capaz de unirse a PIGF e inhibirlo y comprende una secuencia de la cadena pesada variable de la cual la secuencia de la región CDR1, CDR2 y CDR3 corresponde a la secuencia de SEQ ID NO: 17, 18 y 19, respectivamente y una secuencia de la cadena ligera variable de la cual la secuencia de la región CDR1, CDR2 y CDR3 corresponde a la secuencia de SEQ ID NO: 20, 21 y 22, respectivamente, para su uso en un método para reducir los efectos secundarios en una terapia para inhibir la angiogénesis no deseada con un inhibidor de VEGF que actúa directamente sobre VEGF, donde dichos efectos secundarios están causados por dicho inhibidor de VEGF y donde la dosificación de dicho inhibidor de VEGF es menor en comparación con la dosificación en una terapia para inhibir la angiogénesis no deseada con dicho inhibidor de VEGF.

Description

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Ledeganckstraat 35, B-9000 Gante, BE por Thromb-X el 29 de marzo del 2005 como el número de depósito LMBP 6399CB. La presente descripción proporciona además líneas celulares que producen anticuerpos monoclonales derivados del anticuerpo monoclonal 16D3. Tales líneas celulares pueden obtenerse mediante la modificación de la secuencia codificante para el anticuerpo monoclonal 16D3, lo más particularmente la secuencia codificante que

5 codifica para las regiones que no se unen a antígeno de 16D3. Se describen en el presente documento métodos de determinación de la naturaleza de las modificaciones que van a hacerse, y ejemplos de modificaciones adecuadas.

Un segundo aspecto de la descripción se refiere a moléculas de unión a antígeno que pueden unirse al mismo antígeno que el anticuerpo 16D3. Más particularmente, la descripción se refiere al anticuerpo denominado 16D3 producido por la línea celular 16D3 descrita anteriormente y homólogos, fragmentos y derivados de los mismos que

10 pueden unirse a PlGF e inhibir la actividad de PlGF.

Por tanto, una realización particular de la presente invención proporciona el anticuerpo monoclonal anti-PlGF humano, el anticuerpo 16D3, tal como se produce mediante línea celular LMBP 6399CB, y fragmentos de este anticuerpo. El anticuerpo monoclonal 16D3 se caracteriza por la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de sus cadenas pesada y ligera tal como se da a conocer en SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4, respectivamente.

15 Según una realización específica, la presente descripción se refiere a fragmentos, más particularmente fragmentos de unión a antígeno del anticuerpo 16D3. Tales fragmentos incluyen, pero no se limitan a Fab, Fab’, F(ab’)2, CDR’s, péptidos con una secuencia de una parte del anticuerpo o sus CDR, dominios variables sencillos y combinaciones de los mismos. Los fragmentos Fab, Fab’ y F(ab’)2 pueden generarse mediante digestión proteolítica de anticuerpos monoclonales usando métodos bien conocidos en la técnica, tal como se describe por Stanworth et al., Handbook of

20 Experimental Immunology (1978), vol. 1 capítulo 8 (Blackwell Scientific Publications). Tales fragmentos, que conservan la capacidad de unirse al antígeno, han perdido varias propiedades del anticuerpo original, tales como la activación del complemento o la capacidad para unirse a receptores de Fc gamma. Más específicamente, la presente invención proporciona fragmentos que comprenden las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de 16D3 que corresponden a SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4 respectivamente. Una realización particular adicional se

25 refiere a fragmentos que comprenden las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de 16D3 y derivados del mismo. Los dos métodos más comúnmente seguidos para identificar CDR son IMGT y KARAT, y se prevén fragmentos que comprenden más de uno de cualquier tipo de CDR de 16D3 dentro del contexto de la invención, así como derivados de 16D3 que comprenden estos fragmentos o CDR. Según la identificación IMGT de CDR, las regiones CDR dentro de las regiones variables de 16D3 corresponden a SEQ ID NO: 17 (GYTFTDYY),

30 SEQ ID NO: 18 (IYPGSGNT); SEQ ID NO: 19 (VRDSPFFDY), SEQ ID NO: 20 (QSLLNSGMRKSF), SEQ ID NO: 21 (WAS) y SEQ ID NO: 22 (KQSYHLFT). Por tanto, la presente descripción proporciona fragmentos del anticuerpo 16D3 que comprenden una o más de las CDR de 16D3 tal como se proporciona en SEQ ID NO: 17 a SEQ ID NO:

22.

Una realización específica adicional de la descripción proporciona fragmentos de 16D3 que son partes variables de

35 cadena sencilla ancladas a la membrana o solubles de 16D3. Un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) es un fragmento de anticuerpo modificado por ingeniería genética que habitualmente consiste en la cadena pesada (VH) y cadena ligera (VL) variables de una inmunoglobulina, o partes de la misma, unidas entre sí mediante un ligador peptídico flexible. Opcionalmente, los scFv comprenden las regiones CDR del anticuerpo de interés y regiones de entramado de otro anticuerpo. La secuencia de aminoácidos de la región de entramado de scFv y/o regiones CDR

40 se humaniza opcionalmente para reducir la antigenicidad para su uso como producto farmacéutico en seres humanos. La descripción proporciona un scFv de 16D3 y una versión humanizada del mismo que comprende SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 26, respectivamente. El experto en la técnica conoce métodos para obtener partes variables de cadena sencilla de anticuerpos y se describen en el ejemplo 6 en el presente documento. Por ejemplo, el método puede incluir la amplificación de las secuencias de ADN de las partes variables de las cadenas pesada y

45 ligera humanas en reacciones separadas y la clonación, seguido por la inserción de una secuencia ligadora de quince aminoácidos, por ejemplo (Gly4 Ser)3 entre VH y VL mediante una reacción en cadena de polimerasa de dos etapas (PCR) (véase por ejemplo Dieffenbach y Dveksler, “PCR Primer, a laboratory manual” (1995), Cold Spring Harbour Press, Plainview, NY, EE.UU.). El fragmento resultante puede insertarse entonces dentro de un vector adecuado para la expresión del fragmento variable de cadena sencilla como polipéptido soluble o presentado en

50 fago. Esto puede lograrse mediante métodos bien conocidos para los expertos en la técnica, tal como se describe por Gilliland et al., Tissue Antigens (1996) 47:1-20.

La presente descripción también proporciona fragmentos de 16D3 que son péptidos de unión a antígeno representativos de la regiones hipervariables del anticuerpo 16D3 o combinaciones de los mismos. Tales péptidos se pueden obtener por síntesis utilizando un sintetizador de Applied Biosystem, por ejemplo, un sintetizador de

55 polipéptidos tal como el modelo 9050 que se puede adquirir de Milligen (EE. UU.) o un modelo de una tecnología relacionada.

Una realización adicional de la descripción se refiere a derivados del anticuerpo 16D3 o fragmentos del mismo. Más particularmente, la descripción se refiere a anticuerpos se comprenden una región de la cadena pesada variable y o una región de la cadena ligera variable tal como se describe en SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4, respectivamente, 60 pero cuyas regiones constantes son diferentes de las de 16D3. Adicionalmente, o como alternativa, los derivados del anticuerpo 16D3 de la presente invención comprenden al menos dos de las CDR de 16D3 tal como se proporcionan

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hipertensión pulmonar.

Se describen portadores farmacéuticos adecuados para su uso en las composiciones farmacéuticas de la descripción por ejemplo en Remington’s Pharmaceutical Sciences 16ª ed. (1980) y su formulación la conocen bien los expertos en la técnica. Incluyen cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, 5 agentes antibacterianos y antifúngicos (por ejemplo fenol, ácido sórbico, clorobutanol), agentes isotónicos (tales como azúcares o cloruro de sodio) y similares. Pueden incluirse componentes adicionales con el fin de controlar la duración de acción del principio activo de anticuerpo monoclonal en la composición. Pueden lograrse por tanto composiciones de liberación controlada mediante la selección de portadores de polímero apropiados tales como por ejemplo poliésteres, poliaminoácidos, polivinilpirrolidona, copolímeros de etileno-acetato de vinilo, metilcelulosa, 10 carboximetilcelulosa, sulfato de protamina y similares. La velocidad de liberación de fármaco y la duración de acción también pueden controlarse mediante la incorporación del principio activo de anticuerpo monoclonal en partículas, por ejemplo microcápsulas, de una sustancia polimérica tal como hidrogeles, poli(ácido láctico), hidroximetilcelulosa, poli(metacrilato de metilo) y los otros polímeros anteriormente descritos. Tales métodos incluyen sistemas de administración de fármacos coloidales como liposomas, microesferas, microemulsiones, nanopartículas,

15 nanocápsulas y así sucesivamente. Dependiendo de la vía de administración, la composición farmacéutica que comprende el principio activo puede requerir recubrimientos protectores. La forma farmacéutica adecuada para uso inyectable incluye disoluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de la misma. Por tanto, los portadores típicos incluyen tampones acuosos biocompatibles, etanol, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y mezclas de los mismos.

20 Las moléculas de unión a antígeno pueden proporcionarse a un paciente mediante cualquier medio bien conocido en la técnica, es decir, por vía oral, por vía intranasal, por vía subcutánea, por vía intramuscular, por vía intradérmica, por vía intravenosa, por vía intraarterial, por vía parenteral o mediante cateterización.

Según un aspecto particular de la presente descripción, las moléculas de unión a antígeno de la presente invención se administran mediante terapia génica. La terapia génica basada en anticuerpos hace posible superar varias 25 limitaciones potenciales asociadas con la administración de anticuerpos tales como producción a gran escala, biodistribución, aclaramiento sanguíneo rápido y escasa retención de anticuerpos monovalentes. La producción in vivo hace que los anticuerpos sean menos inmunogénicos y se toleren mejor y da como resultado niveles eficaces y persistentes de moléculas de unión a antígeno o fragmentos de las mismas. Además, los enfoques genéticos hacen posible dotar a las moléculas de unión a antígeno de nuevas funciones. La viabilidad de la producción in vivo y la

30 administración sistémica de anticuerpos monoclonales mediante diferentes células/tejidos se ha demostrado usando transferencia génica in vivo mediante vectores virales (Pelegrin et al., 2004, Gene Ther 4: 347-356). También se ha demostrado la reducción del crecimiento tumoral in vitro e in vivo mediante modificación génica de células de fibrosarcoma con un anticuerpo anti-laminina con actividad antiangiogénica (Sanz et al. 2001, Cancer Immunol Immunother 50:557-565).

35 De este modo, según esta realización, la presente descripción proporciona nucleótidos que codifican para las moléculas de unión a antígeno para su uso en terapia génica en el tratamiento de las enfermedades caracterizadas por angiogénesis patológica descritas en el presente documento. Particularmente, la presente descripción proporciona composiciones que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican para la región de cadena pesada variable definida por SEQ ID NO: 2 y/o secuencias de nucleótidos que codifican para la región variable de

40 cadena ligera definida por SEQ ID NO: 4, para su uso en terapia génica. Más particularmente, la presente descripción proporciona composiciones que comprenden la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 3, que corresponden a las secuencias de la línea celular 16D3 que codifican para la región de cadena pesada y ligera del anticuerpo 16D3. Asimismo, dentro del contexto de la presente descripción se proporcionan composiciones que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una o más de las regiones CDR del anticuerpo

45 monoclonal 16D3 tal como se identifican en SEQ ID Nos. 17 a 22. Las realizaciones particulares incluyen la secuencia que codifica scFv y scFv humanizados de 16D3 tal como, pero sin limitarse a, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 25, respectivamente.

El método de tratamiento y/o prevención según la invención puede incluir además el tratamiento o la prevención del mismo estado de angiogénesis patológica mediante la administración, preferiblemente mediante la administración

50 secuencial, al paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente antiangiogénico o antitumoral tal como se dio a conocer anteriormente en el presente documento bajo el encabezamiento de composiciones farmacéuticas. Secuencialmente, tal como se usa en el presente documento, significa que el ligando de la presente invención y el agente antiangiogénesis conocido se administran al paciente secuencialmente pero no simultáneamente.

Aún otro aspecto de la presente descripción se refiere al uso de las moléculas de unión a antígeno de la invención

55 para la detección inmunológica de PlGF en muestras humanas y como componentes de kits adecuados para tal detección. Se conocen en la técnica métodos de detección inmunológica de un antígeno e incluyen, pero no se limitan a, EIA, ELISA y RIA y métodos inmunohistoquímicos. La unión de los anticuerpos murinos de la presente descripción al antígeno PlGF puede detectarse indirectamente por ejemplo por medio de un anticuerpo anti-ratón marcado. Alternativamente, los anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden marcarse directamente. Una

60 realización específica de este aspecto de la descripción se refiere al uso de los anticuerpos contra PlGF y fragmentos de unión a antígeno de los mismos en la identificación de pacientes susceptibles a un tratamiento con

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3. Unión de 16D3/hu16D3 (obtenido tal como se describe en el ejemplo 2) a PlGF (véase la figura 1)

Se recubrieron placas de ELISA durante la noche con 1 µg/ml de huPlGF-2 (Pichia) en PBS, 100 µL/pocillo, 4ºC. Después de bloquear con el 1% de BSA, 1 h, TA, se añadió una serie de diluciones de 16D3/hu16D3, 100 µL/pocillo, se dejó que el anticuerpo se uniera durante 1 h, TA. Se detectó 16D3 unido con HRP-IgG de cabra anti-ser humano

5 o anti-murino (Sigma), 100 µL/pocillo, 1 h, TA. Se reveló el ensayo con OPD.

4. Inhibición de unión de PlGF a receptor huFlt-1 (véase la figura 2)

Se recubrieron placas de ELISA durante la noche con 1 µg/ml de huFlt-1 (R&D Systems), 200 µL/pocillo, durante la noche, 4ºC. Después de bloquear con el 1% de BSA, 1 h, TA, se añadió una serie de diluciones de 16D3/hu16D3, 100 µL/pocillo, y se añadieron 100 µL/pocillo adicionales de huPlGF-2. Después de una incubación de 2 horas a TA,

10 se detectó el PlGF unido con anticuerpo de cabra anti-huPlGF (R&D Systems), 180 µL/pocillo, 1 h, TA, seguido por una incubación con RAG-HRP (DAKO), 1 h, TA. Se reveló el ensayo con OPD.

5. Caracterización adicional de 16D3 y Fab 16D3 con experimentos de Biacore

• Inhibición: se inmovilizó rhuPlGF-2 (Pichia, TX) en un chip CM5 usando una química de EDC/NHS (kit de acoplamiento a amina, Biacore), dando 412 RU. Se inyectó el 16D3 seguido por la quimera rhuFlt-1/Fc (R&D

15 Systems). Esto también se llevó a cabo con tampón en lugar del anticuerpo de ratón. Estos también se inyectaron sobre un canal de flujo de control negativo y estos valores ya se restaron. Este ensayo se llevó a cabo en un tampón fosfato a pH 9,6.

En comparación con la unión máxima del rhuFlt-1 al rhuPlGF-2, la señal de rhuFlt-1 se reduce si en primer lugar se inyectan 16D3 ó 16D3Fab (figura 3).

20 6. Clonación y secuenciación de las regiones variables de ratón de 16D3

•: Aislamiento de ARNm: Se aisló el ARNm de células de hibridoma de 16D3 usando el microkit de purificación de ARNm QuickPrep ™ (Amersham Biosciences). Se usó este ARNm para preparar ADNc usando el kit de síntesis de ADNc de primera cadena (Amersham Biosciences) con el cebador pd(N)6 disponible en el kit.

•: PCR: Se encontraron las secuencias de las partes variables de la cadena pesada y ligera realizando una PCR con

25 una colección de cebadores: 8 cebadores que comenzaban en la secuencia líder y 2 en la región constante de la cadena pesada, 11 cebadores que comenzaban en la secuencia líder y 1 en la región constante de la cadena ligera. Se llevaron a cabo 8 y 11 reacciones de PCR con combinaciones diferentes de los cebadores.

Cebadores usados para la cadena pesada del anticuerpo 16D3: MHVR3 5’-ATG GRA TGG AGC TGK ATC WTT HTC-3’ (SEQ ID NO: 9)

30 MHCR1 5’-CAS AYM CAG GGG CCA GTG GAT AGA C-3’ (SEQ ID NO: 10) Cebadores usados para la cadena ligera del anticuerpo 16D3: MKVR3 5’-ATG RAG TCA CAK ACY CAG GTC TTY RTA-3’ (SEQ ID NO: 11) MKCR1 5’-GCT CAC TGG ATG GTG GGA AGA TGG-3’ (SEQ ID NO: 12) Configuración de PCR: desnaturalización 10 min. 94ºC, desnaturalización 30 s 94ºC, hibridación 30 s 55ºC,

35 prolongación 1 min. 72ºC, prolongación 5 min. 72ºC, número de ciclos 30. La redundancia en la secuencia de SEQ ID NO: 9 a 11 se indica usando las abreviaturas convencionales R = A o G, K= G o T,W=A o T, H= A oC o T, S= C o G, Y= C o T, M= A o C.

• Clonación y secuenciación: Se cargaron los productos de PCR en gel de agarosa, se seleccionaron las bandas correctas, se purificaron (kit de extracción en gel QIAquick®, Qiagen GmbH) y se clonaron en el vector pCR®4Blunt

40 TOPO® suministrado en el kit de clonación de PCR para la secuenciación Zero Blunt® TOPO® (Invitrogen ™ life technologies). Se preparó ADN de plásmido usando el kit de aislamiento de plásmido de alta pureza (Roche Diagnostics GmbH) y se secuenciaron los insertos usando los cebadores inversos T7 y M13 en ABI PRISM ™ 310 (PE Applied Biosystems).

• Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del 45 anticuerpo 16D3 se representan en las SEQ ID NO 1, 2, 3 y 4. (véase la figura 11)

EJEMPLO 2 -Producción y caracterización de anticuerpos humanizados anti-PlGF humano (16D3)

1. Construcción de 16D3 humanizado

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humano tiene una influencia clara sobre el peso y tamaño tumoral.

3. Anticuerpo anti-hPlGF inhibe el crecimiento tumoral en un modelo de tumor de xenoinjerto DanG pancreático humano subcutáneo de una manera dependiente de la dosis.

Se inyectaron por vía subcutánea 1x106 células tumorales dentro del costado derecho de ratones hembra nu/nu

5 NMRI de 11 semanas de edad. Después de que los tumores alcanzaron un tamaño de aproximadamente 60 mm3, se inició el tratamiento con anticuerpo anti-hPlGF, IgG (1C8; 50 mg/kg), 16D3 (50 mg/kg, 37,5 mg/kg, 25 mg/kg, 12,5 mg/kg de peso corporal; n=10 para cada concentración) y vehículo (n=10). (B) Se sacrificaron los ratones al día 18 después de la inoculación del tumor.

Los resultados se muestran en la figura 5. Volumen tumoral medio ± EEM: 16D3, 50 mg/kg de peso corporal: 450 ± 10 37 mm3; 37,5 mg/kg de peso corporal: 469 ± 97 mm3; 25 mg/kg de peso corporal: 493 ± 107 mm3; 12,5 mg/kg de peso corporal: 693 ± 107 mm3; IC8: 865 ± 109 mm3; vehículo: 889 ± 100 mm3.

4. Anticuerpo anti-huPlGF inhibe el crecimiento tumoral en un modelo de tumor de xenoinjerto MDA-MB de mama humano subcutáneo.

Se inyectaron por vía subcutánea 1x107 células tumorales dentro del costado derecho de ratones hembra nu/nu 15 NMRI de 11 semanas de edad. Después de que los tumores alcanzaron un tamaño de aproximadamente 60 mm3, tratamiento con anticuerpo anti-hPlGF, 16D3 (50 mg/kg de peso corporal; n=10) y vehículo (n=10).

Los resultados se muestran en la figura 6 (y la tabla 1 a continuación).

Tabla 1

Media: EEM N Valor de P

Peso del TM PBS: 1086 154,1 10

Peso del TM 16D3: 586,6 71,89 10 0,0088

Tamaño del TM PBS: 991,5 160,8 10

Tamaño del TM 16D3: 485,9 63,76 10 0,0091

5. Anticuerpo anti-huPlGF inhibe el crecimiento tumoral en un modelo de tumor de xenoinjerto LOVO de colon 20 humano subcutáneo.

Se inyectaron por vía subcutánea 1X107 células tumorales dentro del costado derecho de ratones hembra nu/nu NMRI de 11 semanas de edad. Después de que los tumores alcanzaron un tamaño de aproximadamente 60 mm3, tratamiento con anticuerpo anti-hPlGF, 16D3 (50 mg/kg de peso corporal; n=10) y vehículo (n=10).

Los resultados se muestran en la figura 7 y la tabla 2 a continuación.

25 Tabla 2

Media: EEM N Valor de P

Peso del TM PBS: 669,3 103 10

Peso del TM 16D3: 415 65,85 10 0,052

Tamaño del TM PBS: 568,3 95,38 10

Tamaño del TM 16D3: 306,4 50,27 10 0,0258

6. Anticuerpo anti-huPlGF inhibe el crecimiento tumoral en un modelo de tumor de xenoinjerto Mel2a de melanoma humano subcutáneo.

Se inyectaron por vía subcutánea 4x106 células tumorales dentro del costado derecho de ratones hembra nu/nu NMRI de 11 semanas de edad. Después de que los tumores alcanzaron un tamaño de aproximadamente 60 mm3, 30 tratamiento con anticuerpo anti-hPlGF, 16D3 (50 mg/kg de peso corporal; n=10) y vehículo (n=10).

Los resultados se muestran en la figura 8 y la tabla 3 a continuación.

Tabla 3

Media: EEM N Valor de P

Peso del TM PBS: 753,3 87,26 10

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Cebadores para la amplificación de fragmentos VL de scFv16D3 humanizado: 16D3VLBackAgel 5’-CCACCGGTGACATTGTGCTGACCCAGTCTCC-3’ (SEQ ID NO: 29) 16D3VLForBsiWI 5’-CACCGTACGTTTTATTTCCAACTTTGTCCCCGAG-3’ (SEQ ID NO: 30)

2. Construcción de vectores de cadena pesada y ligera

5 En primer lugar se clonó el producto de PCR de la cadena ligera dentro de un vector pCR4blunt-TOPO. Después de la secuenciación se eliminó la cadena ligera mediante digestión con AgeI y BsiWI y se clonó dentro del vector pKANEO-CM30-Lvar#7. Después de la digestión se clonó el producto de PCR de la cadena pesada directamente en pKANEO-MCS50-Fabvar#3.

3. Unión de los constructos de cadena pesada y ligera

10 Ambos vectores (descritos anteriormente), que contenían el segmento ligero y pesado, se unieron entre sí mediante la eliminación del casete que contenía el segmento ligero y su adición al vector que contenía el segmento pesado usando las enzimas PmeI y PacI, para obtener el constructo final, hp16D3mutcmplFab/pKANEO-MCS50-Fabvar#3 (véase la figura 16).

EJEMPLO 9. Análisis de unión a antígeno e inhibición de la interacción PlGF/flt-1 mediante scFv 16D3 y scFv16D3 15 humanizado (figura 14)

1. ELISA de unión a antígeno

Se recubrieron placas de ELISA durante la noche con 1 µg/ml de huPlGF-1 en PBS, 200 µL/pocillo, 4ºC. Después de bloquear con el 1% de BSA, 1 h, TA, se añadió una serie de diluciones de scFv16D3/scFv16D3 humanizado, 200 µL/pocillo, se permitió que el fragmento de anticuerpo se uniera durante 1 h, TA. Se detectó scFv16D3 unido

20 con anticuerpo murino anti-HA (180 µL/pocillo, 1 h, TA) seguido por incubación con HRP-IgG de cabra anti-murino (Sigma), 170 µL/pocillo, 1 h, TA. Se reveló el ensayo con OPD.

2. Inhibición de interacción PlGF/Flt-1 mediante ELISA

Se recubrieron las placas de ELISA durante la noche con 1 µg/ml de huFlt-1 (R&D Systems), 200 µL/pocillo, durante la noche, 4ºC. Después de bloquear con el 1% de BSA, 1 h, TA, se añadió una serie de diluciones de

25 scFv16D3/scFv16D3 humanizado, 100 µL/pocillo, y se añadieron 100 µL/pocillo adicionales de huPlGF-2. Después de una incubación de 2 horas a TA, se detectó PlGF unido con anticuerpo de cabra anti-huPlGF (R&D Systems), 180 µL/pocillo, 1 h, TA, seguido por una incubación con RAG-HRP (DAKO), 1 h, TA. Se reveló el ensayo con OPD.

EJEMPLO 10. Análisis de unión a antígeno e inhibición de la interacción PlGF/Flt-1 mediante Fab16D3 humanizado

1. ELISA de unión a antígeno

30 Se recubrieron placas de ELISA durante la noche con 1 µg/ml de huPlGF-1 en PBS, 100 µL/pocillo, 4ºC. Después de bloquear con el 1% de BSA, 1 h, TA, se añadió una serie de diluciones de Fab16D3 humanizado, 100 µL/pocillo, se permitió que el fragmento de anticuerpo se uniera durante 1 h, TA. Se detectó Fab16D3 humanizado unido con HRP-IgG anti-ser humano (específico de Fab) (100 µL/pocillo, 1 h, TA). Se reveló el ensayo con OPD. Los resultados se proporcionan en la figura 17A.

35 2. Inhibición de la interacción PlGF/Flt-1 mediante ELISA

Se recubrieron placas de ELISA durante la noche con 1 µg/ml de huFlt-1 (R&D Systems), 200 µL/pocillo, durante la noche, 4ºC. Después de bloquear con el 1% de BSA, 1 h, TA, se añadió una serie de diluciones de Fab16D3 humanizado, 100 µL/pocillo, y se añadieron 100 µL/pocillo adicionales de huPlGF-2. Después de una incubación de 2 horas a TA, se detectó el PlGF unido con anticuerpo de cabra anti-huPlGF (R&D Systems), 180 µL/pocillo, 1 h, TA,

40 seguido por una incubación con RAG-HRP (DAKO), 1 h, TA. Se reveló el ensayo con OPD. Los resultados se proporcionan en la figura 17B.

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