JPH11302193A - 血管新生阻害剤 - Google Patents

血管新生阻害剤

Info

Publication number
JPH11302193A
JPH11302193A JP12964698A JP12964698A JPH11302193A JP H11302193 A JPH11302193 A JP H11302193A JP 12964698 A JP12964698 A JP 12964698A JP 12964698 A JP12964698 A JP 12964698A JP H11302193 A JPH11302193 A JP H11302193A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
vegf
vpf
antibody
minocycline
angiogenesis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP12964698A
Other languages
English (en)
Inventor
Ayako Koda
綾子 幸田
Makoto Asano
誠 浅野
Hideo Suzuki
日出夫 鈴木
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toagosei Co Ltd
Original Assignee
Toagosei Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toagosei Co Ltd filed Critical Toagosei Co Ltd
Priority to JP12964698A priority Critical patent/JPH11302193A/ja
Publication of JPH11302193A publication Critical patent/JPH11302193A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】 抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦ抗体とミノサイクリン等
の血管新生阻害剤との併用による相乗作用に基づく有効
な血管新生阻害方法、特に、癌血管新生阻害方法を提供
する。 【解決手段】 ＶＥＧＦ／ＶＰＦアンタゴニストとミノ
サイクリンを有効成分とする血管新生阻害剤。ＶＥＧＦ
／ＶＰＦアンタゴニストは抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦモノクロ
ーナル抗体であることが好ましく、下記配列１〜３の少
なくとも１つと反応する抗体であることが特に好まし
い。 １．ＫＰＳＣＶＰＬＭＲ ２．ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣＲＰ ３．ＫＣＥＣＲＰＫＫＤＲＡＲ

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、血管透過性因子(V
PF)[血管内皮細胞増殖因子(VEGF)とも呼称されており、
本明細書では「ＶＥＧＦ／ＶＰＦ」と総称する] アンタ
ゴニストとミノサイクリンとを併用した血管新生阻害
剤、とりわけ腫瘍の治療薬として有用な血管新生阻害剤
に関する。
【０００２】
【従来の技術】血管新生は、既存の血管から内皮細胞が
出芽して新しい血管が形成される現象であり、生体にお
いては主として病変部位で起こり、健常成人では女性の
性周期、妊娠などの場合以外には起こらない。血管新生
を伴う血管形成性疾患としては、固形腫瘍の増殖や腫瘍
の転移、糖尿病網膜症や加齢黄斑変性症などの眼内血管
新生病、リウマチ様関節炎、乾癬症、カポジ肉腫、動脈
性硬化症疾患などがある。
【０００３】血管新生は種々の血管新生促進因子によっ
て制御されているが、中でも、内皮細胞に対して選択的
に作用するペプチド性の分泌型増殖因子であるＶＥＧＦ
／ＶＰＦは、上記の生体における疾患の血管新生に直接
的な役割を担っていることが示唆されている。そして、
ある種の抗VEGF/VPF抗体を用いてVEGF/VPFを中和するこ
とにより、癌細胞の成長及び転移を抑制できることが報
告されている(M. Asano等、CANCER RESEARCH 55, 5296-
5301, November 15, 1995)。
【０００４】かかる抗体の拮抗作用を利用した癌の治療
方法は、腫瘍そのものを標的とする現在の一般的な治療
方法と異なり、腫瘍血管の新生を抑制することによって
間接的に腫瘍の増殖を阻害するという新しい作用機作に
基づくものであり、副作用が極めて軽微であるため、効
果的な癌の化学療法として期待されている。
【０００５】その他の血管新生阻害剤として、従来、血
管内皮細胞培養系を用いたin vitro培養系およびin viv
o血管新生モデルを用いて、血管新生を選択的に阻害す
る物質がスクリーニングされており、これまでに、例え
ば、プロタミン（Taylor, S.et al., Nature, 297, 30
7, 1982)、ヘパリンとコーチゾンの併用剤（Folkman,J.
et al., Science, 221, 71, 1983)、プレドニゾロン・
アセテート（Robin,J. B., Arch. Opthalmol., 103, 28
4, 1985）、硫酸化多糖（特開昭63-119500号公報）、ハ
ービマイシンＡ（特開平63-295509号公報）、フマギリ
ン（特開平1-279828号公報）、インターフェロンβ（国
際公開第WO/29092号公報）等が知られている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】ミノサイクリンはテト
ラサイクリン系抗生物質の一つであるが、これについて
は、ウサギ角膜法を用いたin vivo血管新生モデルにお
いて、コーチゾン単独又はコーチゾンとヘパリンの併用
系よりも有意に血管新生を抑制したとの報告がある(R.
J. Tamargo等、CANCER RESEARCH 51, 672-675, January
15, 1991)。しかし、いずれの場合も、投与を継続して
暫くすると、その血管新生阻害効果が薄れてくる傾向が
見られる。
【０００７】本発明者等は、上記の抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦ
抗体と上記のミノサイクリン等の血管新生阻害剤との併
用系については未だ検討されていないことに鑑み、両者
の相乗作用にに基づく更に有効な血管新生阻害方法、特
に、癌血管新生阻害方法を提供することを目的として鋭
意研究した結果、本発明を完成するに至った。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、ＶＥＧＦ／Ｖ
ＰＦアンタゴニストとミノサイクリンを有効成分とする
血管新生阻害剤に関するものである。すなわち、本発明
は、ＶＥＧＦ／ＶＰＦアンタゴニストとミノサイクリン
とを併用して投与することにより血管新生を有効に阻害
する点に特徴を有する。
【０００９】したがって、本発明の別の局面によれば、
ＶＥＧＦ／ＶＰＦアンタゴニストとミノサイクリンとを
併用して投与することを特徴とする血管新生阻害方法が
提供される。
【００１０】理論に拘束されるものではないが、本発明
者等の知見によれば、本発明は、以下のような作用機作
でその優れた効果を発現しているものと考えられる。す
なわち、血管新生を伴う病的部位をミノサイクリンなど
の血管新生阻害剤で処理すると、該病的部位の血流が絶
たれてその部位が低酸素状態になる。しかし、ＶＥＧＦ
／ＶＰＦは低酸素状態になる誘導される性質があるた
め、ミノサイクリンなどの血管新生阻害剤で処理してか
ら暫くするとＶＥＧＦ／ＶＰＦが誘導され、逆に血管新
生が亢進される状況が生まれる。しかし、本発明にした
がって、該病的部位にＶＥＧＦ／ＶＰＦアンタゴニスト
を併用すると、ＶＥＧＦ／ＶＰＦの作用が阻害されて、
ＶＥＧＦ／ＶＰＦの誘導後もミノサイクリンなどの血管
新生阻害剤による血管新生阻害効果が有効に維持される
ものと考えられる。
【００１１】ミノサイクリンはテトラサイクリン系抗生
物質として知られている化合物であるが、本発明におい
ては、ミノサイクリン、その塩酸塩等の塩の他、同等の
薬効を有する誘導体も包含され、細粒、顆粒、錠剤、カ
プセル、静注用剤等の形態で市販されている如何なる形
態のものであっても使用することができる。
【００１２】ＶＥＧＦ／ＶＰＦは、直接的に血管内皮細
胞に作用し、血管新生すなわち毛細血管内皮細胞の増
殖、移動および組織への浸潤という現象を誘発し、胎児
の生長、創傷治癒、癌細胞の増殖などの生理または病理
的現象において重要な作用を果たしている。ＶＥＧＦ／
ＶＰＦは、マウス、ラット、モルモット、ウシ及びヒト
の正常又は腫瘍細胞株で分泌されており、また組織別で
は脳、下垂体、腎臓、卵巣に存在することが明らかにさ
れている[Ferrara, N.等、Endocrine Reviews 13: 18(1
992)]。
【００１３】ヒトＶＥＧＦ／ＶＰＦ遺伝子についてはそ
のcDNAがすでに単離されて塩基配列が決定され、アミノ
酸配列も推定されている。この遺伝子からアミノ酸残基
数の異なる４種類の蛋白（アミノ酸残基数１２１個、１
６５個、１８９個、２０６個の４種類）が作られ、それ
らの中で１２１個のアミノ酸残基数のもの（ＶＥＧＦ
121）と１６５個のアミノ酸残基数のもの（ＶＥＧ
Ｆ165）が成熟蛋白であると言われている[Ferrara, N.
等、Endocrine Reviews 13: 18(1992)]。ＶＥＧＦ121は
ＶＥＧＦ165のカルボキシル末端側の４４個のアミノ酸
が欠失したものであるが、ＶＥＧＦ121とＶＥＧＦ165の
間に、血管内皮細胞に対する作用の違いがあるかどうか
については明らかにされていない。
【００１４】本発明において、ＶＥＧＦ／ＶＰＦアンタ
ゴニストとは、上記のＶＥＧＦ／ＶＰＦの作用を阻害す
る機能を有するものをさし、その機能を有するものであ
れば如何なる形態のものでもよく、最も一般的には、Ｖ
ＥＧＦ／ＶＰＦに作用する抗体、またはその一部分が挙
げられるが、それらに限定されることなく、例えば、Ｖ
ＥＧＦ／ＶＰＦの作用を阻害する不活性なＶＥＧＦ／Ｖ
ＰＦ、またはその一部分、ＶＥＧＦ／ＶＰＦの受容体の
機能を損なう、例えば、血管透過性因子受容体に対する
抗体、またはその一部分、さらには、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ
の産生そのものを抑制する薬剤等を挙げることができ
る。
【００１５】ＶＥＧＦ／ＶＰＦに作用する抗体は、アミ
ノ酸残基数１２１個、１６５個、１８９個又は２０６個
の４種類のＶＥＧＦ／ＶＰＦサブタイプの何れに対する
抗体であってもよい。
【００１６】代表的なＶＥＧＦ／ＶＰＦアンタゴニスト
としては、抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦモノクローナル抗体が挙
げられ、特に、該抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦモノクローナル抗
体が、ＶＥＧＦ／ＶＰＦのアミノ酸配列の一部である下
記配列１〜３：
【００１７】１．ＫＰＳＣＶＰＬＭＲ ２．ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣＲＰ ３．ＫＣＥＣＲＰＫＫＤＲＡＲ
【００１８】の少なくとも１つと反応する抗体がである
ことが好ましい。
【００１９】上記の抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦ抗体としては、
マウス抗体等もあげられるが、ヒトへの投与において副
作用を軽減するための処理を行ったものも使用すること
ができる。例えば、マウスモノクローナル抗体をポリエ
チレングリコールのような物質で化学修飾を行い、抗原
性を軽減させたもの、また、マウスモノクローナル抗体
の可変領域を残して他の部分をヒトの抗体に変換させた
マウス・ヒトキメラ抗体や、マウスモノクローナル抗体
の抗原との結合領域であるＣＤＲ領域を残して他の領域
をヒト抗体に抗原との結合力を保持させたまま置き換え
たヒト化抗体も使用することができる。さらに、これら
を酵素的に切断して低分子化した抗体も使用することが
できる。該キメラ抗体またはヒト化抗体としては、Ｉｇ
Ｇタイプ又はＩｇＡタイプ等があげられ、該ＩｇＧのイ
ソタイプとしては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又は
ＩｇＧ４があげられる。
【００２０】本発明は、ミノサイクリンの投与により活
力が低下して低酸素状態となった病的部位に誘導された
ＶＥＧＦ／ＶＰＦの作用をＶＥＧＦ／ＶＰＦアンタゴニ
ストの作用によって中和し、該病的部位における血管新
生を抑制するという作用機作に基づくため、癌細胞を含
むあらゆる血管形成性疾患の治療に対して有効に適用で
きると考えられる。したがって、本発明の血管新生阻害
剤を投与する場合、投与する対象は特に限定されない。
例えば、個々の血管形成性疾患の予防或いは治療を特異
目的として局所又は全身投与することができる。投与す
る方法は経口又は非経口でもよく、経口投与には舌下投
与を包含する。
【００２１】非経口投与には注射例えば皮下、筋肉、血
管内、腹腔内又は胸腔内などへの注射、点滴、座剤等を
含む。又、その投与量および有効成分の割合は動物か人
間かによって、又年齢、投与経路、投与回数により異な
り、広範囲に変えることができる。この場合ＶＥＧＦ／
ＶＰＦアンタゴニスト及びミノサイクリンの有効量と適
切な希釈剤および薬学的に使用し得る担体の組成物とし
て投与される有効量は０.１〜１００mg/kg体重/日であ
り１日１回から数回に分けて毎日又は数日に１回又は１
〜２週間に１回投与される。ＶＥＧＦ／ＶＰＦアンタゴ
ニストとミノサイクリンは、任意の割合で併用すること
ができ、両者は混合した状態で、又は、別々の状態で併
用することも可能である。
【００２２】本発明の血管新生阻害剤を非経口投与する
場合には、安定剤・緩衝剤・保存剤・膨張化剤等の添加
剤を含有し通常単位投与量アンプル若しくは多投与量容
器又はチューブの状態で提供される。たとえば、注射用
製剤は、精製されたＶＥＧＦ／ＶＰＦアンタゴニスト及
び／又はミノサイクリンを溶剤、たとえば、生理食塩
水、緩衝液などに溶解し、それに、吸着防止剤、たとえ
ば、Ｔｗｅｅｎ８０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン
（ＨＳＡ）などを加えたものであり、または、使用前に
溶解再構成するために凍結乾燥したものであってもよ
い。凍結乾燥のための賦形剤としては例えばマンニトー
ル、ブドウ糖などの糖アルコールや糖類を使用すること
ができる。同様に、点眼液、点眼軟膏、乳化剤等の形態
としたり、滞留を延長させるためにリポソームやマイク
ロスフェアーにして使用することも出来る。
【００２３】また経口投与する場合はそれに適用される
錠剤・顆粒剤・細粒剤・散剤・カプセル剤等は通常それ
らの組成物中に製剤上一般に使用される結合剤・包含剤
・賦形剤・滑沢剤・崩壊剤・湿潤剤のような添加剤を含
有する。又、経口用液体製剤としては内用水剤・懸濁剤
・乳剤・シロップ剤等いずれでの状態であってもよく、
又、使用する際に再溶解させる乾燥生成物であっても良
い。更にその組成物は添加剤・保存剤の何れを含有して
も良い。
【００２４】
【発明の実施の形態】以下、本発明の好ましい具体例に
ついて、ＶＥＧＦ／ＶＰＦアンタゴニストとして抗ＶＥ
ＧＦ／ＶＰＦモノクローナル抗体を用いて詳細に説明す
る。
【００２５】モノクローナル抗体の製造 各モノクローナル抗体は動物をＶＥＧＦ／ＶＰＦで免疫
し、その脾細胞を取り出しこれをミエローマ細胞と融合
して得たハイブリドーマ細胞を培養することにより製造
することができる。このハイブリドーマの製造は例えば
KohlerとMilsteinの方法[Nature,256:495(1975)]等によ
り行うことができる。
【００２６】(1)抗体産生細胞の調製 免疫用動物にはマウス、ラット、ウサギ等の齧歯類が用
いられる。ミエローマ細胞としてはマウスまたはラット
由来の細胞が用いられる。そして免疫動物１匹に対して
ＶＥＧＦ／ＶＰＦ１０〜１００μｇの量を抗原として２
〜４週間の間隔で少なくとも計２〜３回の免疫を行う。
動物の飼育及び脾細胞の採取は常法に従って行われる。
尚、免疫の際には抗原に例えばグルタチオン-Ｓ-トラン
スフェラーゼ等を融合させて得られた蛋白質又はキーホ
ールリンペットヘモシアニン等を結合させて得られた複
合蛋白質を抗原として用いることもできる。
【００２７】(2)ミエローマ細胞の調製 ミエローマ細胞としてはマウスミエローマSp2/O-Ag14(S
p2)、P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)、P3×63-Ag.8.U・1(P3U1)等
が挙げられる。これらの細胞の継代培養は常法に従って
行われる。
【００２８】(3)細胞融合 脾細胞とミエローマ細胞とを１：１〜１０：１の割合で
混合してポリエチレングリコールと混合するか電気パル
ス処理することにより細胞融合を行うことができる。
【００２９】(4)ハイブリドーマの選択 融合細胞（ハイブリドーマ）の選択はヒポキサンチン
(１０-3〜１０-5Ｍ)、アミノプテリン(１０-6〜１０-7
Ｍ)、チミジン(１０-5〜１０-6Ｍ)を含む培地を用いて
培養して生育してくる細胞をハイブリドーマとすること
により行われる。
【００３０】(5)ハイブリドーマの培養 ハイブリドーマのクローン化は限界希釈法により少なく
とも２回繰り返して行う。ハイブリドーマを通常の動物
細胞と同様にして培養すれば培地中に本発明のモノクロ
ーナル抗体が産生される。又、ハイブリドーマ細胞をマ
ウス腹腔内に移植して増殖させることにより腹水中に本
発明のモノクローナル抗体を蓄積させることもできる。
【００３１】(6)モノクローナル抗体の採取及び精製 ハイブリドーマ細胞の培養液中又は腹水中に蓄積したモ
ノクローナル抗体は従来から用いられている硫安分画
法、ＰＥＧ分画法、イオン交換クロマトグラフィー及び
ゲル濾過クロマトグラフィーを用いる方法で精製され
る。又、プロテインＡやプロテインＧ等のアフィニティ
ークロマトグラフィーによる方法も利用できる。
【００３２】モノクローナル抗体の選別には酵素免疫測
定法、ウエスタンブロッティング法等が用いられる。
又、モノクローナル抗体のアイソタイプの決定はモノク
ローナル抗体の酵素免疫測定法又はオクタロニー法等に
よって行うことができる。
【００３３】
【実施例】以下実施例により本発明をさらに具体的に説
明する。但し本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。
【００３４】参考例１（抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦモノクロー
ナル抗体ＭＶ833の調製） （１）抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマの作製 単離したヒトＶＥＧＦ／ＶＰＦのcＤＮＡにて形質転換
した酵母の培養液よりヒトＶＥＧＦ／ＶＰＦを精製し
(特開平７−３１４９６号参照)、キーホールリンペット
ヘモシアニン(ＫＬＨ)とグルタルアルデヒドを用いて複
合体を作製し、得られた蛋白を抗原として常法に従って
マウスモノクローナル抗体を作製した。即ち、ＫＬＨ-
ＶＥＧＦ／ＶＰＦで免疫したマウスの脾細胞とマウスミ
エローマ細胞(Ｓp2)をポリエチレングリコール存在下で
細胞融合させた。得られたハイブリドーマは限界希釈法
によりクローニングした。ＶＥＧＦ／ＶＰＦとクローン
化したハイブリドーマの培養上清の反応性を酵素免疫測
定法により調べ、ＶＥＧＦ／ＶＰＦと反応するモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマを選択した。又、
このハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体をＭ
Ｖ833と命名した。なお、得られたモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマは通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−５６６９として
寄託されている。
【００３５】（２）抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦモノクローナル
抗体の調製 選択したハイブリドーマをヌードマウスの腹腔内に移植
し、モノクローナル抗体を大量に含む腹水を採取した。
この腹水中からプロテインＧアフィニティーカラム(Ｍ
ＡbＴrapＧII、ファルマシア社製）を用いてモノクロー
ナル抗体を精製した。又、抗体のクラスを抗マウス免疫
グロブリンサブクラス特異的抗体を用いた酵素免疫測定
法により調べた結果、ＭＶ833抗体のクラスはＩgＧ1で
あった。
【００３６】又、下記の方法で測定したＶＥＧＦ121及
びＶＥＧＦ165に対する解離定数は以下の通りであり本
発明のモノクローナル抗体はＶＥＧＦ／ＶＰＦに対して
強い親和性を有することがわかる。
【００３７】○ ５.７０×１０-11Ｍ±０.３５×１０
-11Ｍ（ＶＥＧＦ121) ○ １.１０×１０-10Ｍ±０.１１×１０-10Ｍ（ＶＥＧ
Ｆ165)
【００３８】解離定数の測定方法 モノクローナル抗体を０.１Ｍ塩化ナトリウムを含む２
５mＭ炭酸緩衝液(pＨ=９.０)で２μg/mlに調製し、取り
外し可能な有穴プレートに１００μlずつ添加し４℃で
一晩放置する。次に穴から溶液を除き１％ＢＳＡ-ＰＢ
Ｓを３００μlずつ添加し３７℃で４時間放置する。１
％ＢＳＡ-ＰＢＳを取り除いた後０.１％ＢＳＡ-ＰＢＳ
で調製したＶＥＧＦと125Ｉ標識ＶＥＧＦ(125Ｉ標識Ｖ
ＥＧＦ121はＶＥＧＦ121をクロラミンＴ法により標識、
125Ｉ標識ＶＥＧＦ165はアマシャム社より購入)反応混
液を穴あたり２００μl添加して一晩放置する。この反
応混液中のＶＥＧＦ濃度はＶＥＧＦ121が０〜１ng/穴，
ＶＥＧＦ165が０〜１０ng/穴、125Ｉ標識ＶＥＧＦが１
×１０4cpm/穴(125Ｉ標識ＶＥＧＦ121; ６６.７pg/穴、
1 25Ｉ標識ＶＥＧＦ165；１１６pg/穴)とする。穴から反
応混液を取り除き０.１％ＢＳＡ-ＰＢＳで６回洗浄した
後、穴を１個ずつ切り離して分析用チューブに入れガン
マーカウンターにてカウントし、その結果より作成した
散布図から解離定数を求める。
【００３９】又、下記の方法で測定した本発明のモノク
ローナル抗体の等電点はpＩ＝５.２〜５.５であった。
現時点で報告のある他のＩgＧ1タイプの抗ＶＥＧＦ／Ｖ
ＰＦモノクローナル抗体の等電点は我々の報告している
ＭＶ101がpＩ＝７.０〜７.５でありジェネンテック社の
Ａ４.６.１がpＩ＝４.２〜５.２[Kim,K.J. et.al. Grow
th Factors,7:53(1992)]であり本発明の物質はいずれの
物質とも異なる物質である。
【００４０】等電点の測定方法 モノクローナル抗体の等電点電気泳動は市販の等電点電
気泳動用アガロースゲル(和科盛社)を使用し同社の等電
点電気泳動層にて泳動した。泳動は等電力出力可能なパ
ワーサプライ(バイオラド社)により３Ｗで３０分間泳動
した。泳動後ゲルは銀染色キット(バイオラド社)にて蛋
白染色した。モノクローナル抗体の等電点は同時に泳動
した等電点マーカー蛋白の泳動度より抗体の等電点を求
めた。
【００４１】（３）ＶＥＧＦ／ＶＰＦ中のモノクローナ
ル抗体の反応部位の同定 (3-1)ＶＥＧＦ／ＶＰＦのアミノ酸配列の一部分に相当
するペプチドの作製 ヒトＶＥＧＦ121のアミノ配列の連続した１２個のアミ
ノ酸を１つのペプチドとして全配列を網羅する６７種の
ペプチドを考案し、各ペプチドをマルチピンペプチド合
成法[Maeji,N,J, et.al. J.Immunol.method,134:23(199
0)]により合成した。
【００４２】まず９６穴アッセイプレート用ピンブロッ
クのピンの先端に導入された9-フルオレニルメトキシカ
ルボニル(Ｆmoc)-β-アラニンからピペリジンによりＦm
oc基を除去した後、ジシクロヘキシカルボジイミドとヒ
ドロキシベンゾトリアゾール存在下でＦmoc-アミノ酸を
縮合させた。N,N-ジメチルホルムアミドで洗浄後、再び
ジシクロヘキシカルボジイミドとヒドロキシベンゾトリ
アゾール存在下でＦmoc-アミノ酸を縮合させ、この操作
を繰り返すことにより目的のペプチドを合成した。縮合
反応終了後、無水酢酸でアセチル化を行い、さらにトリ
フルオロ酢酸で側鎖保護基を除去した。ピン上で合成し
たペプチドはピンを中性溶液中に浸すことにより切り出
した。合成したペプチドの定量はオルトフタルアルデヒ
ドを用いてアミノ基を定量することにより行った。合成
した６７種のペプチドのアミノ酸配列を表１に示した。
数字はペプチド識別番号を示す。
【００４３】
【表１】
【００４４】(3-2)ＭＶ833抗体と反応するペプチドの同
定 以上のようにして合成した６７種のペプチドはヒトＶＥ
ＧＦ121の全領域に対応するものである。したがって６
７種のペプチドとＭＶ833抗体との反応性を調べること
によりＭＶ833抗体がＶＥＧＦ／ＶＰＦのどの部位に反
応しているかを明らかにすることができる。そこで酵素
免疫測定法により６７種のペプチドとＭＶ833抗体との
反応性を調べた。９６穴ＮＯＳプレート(コースター社
製)に６７種の２０μＭペプチド溶液を入れ室温で２時
間放置した。０.１％ＢＳＡ-ＰＢＳでプレートの穴を３
回洗浄した後、２％ＢＳＡ-ＰＢＳを入れ室温で１時間
放置した。２％ＢＳＡ-ＰＢＳを除いた後、ＭＶ833(１
％ＢＳＡ-ＰＢＳ溶液)を入れ室温で１時間放置した。
０.１％ＢＳＡ-ＰＢＳで６回洗浄後ペルオキシダーゼ標
識したヒツジ抗マウスＩgＧ(アマシャム社)(０.１％Ｂ
ＳＡ-ＰＢＳ溶液)を入れ室温で１時間放置した。０.１
％ＢＳＡ-ＰＢＳで６回洗浄後８.３mg/mlオルトフェニ
レンジアミン２塩酸塩および０.０１％過酸化水素を含
む０.２Ｍトリス−クエン酸緩衝液(pＨ=５.２)を入れて
発色させた。反応は２規定硫酸を加えて停止させた後、
吸光度(ＯＤ４９０／６５０)を測定した。なお、反応性
の測定には、上記のような酵素免疫測定法の他、オクタ
ロニー法、ウエスタンブロッティング法等を用いてもよ
い。
【００４５】ＭＶ833抗体は６７種類のペプチドの中で
ペプチド識別番号３１、３２、３３、６０、６３の５つ
のペプチドに強く反応した。ペプチド識別番号３１〜３
３のペプチドにはＫＰＳＣＶＰＬＭＲという配列が共通
に含まれていることより、この領域ではＭＶ833抗体は
ＫＰＳＣＶＰＬＭＲというアミノ酸配列部分と反応して
いると考えられる。したがって、ＭＶ833抗体はＶＥＧ
Ｆ／ＶＰＦのＫＰＳＣＶＰＬＭＲ配列（配列番号１）と
ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣＲＰ配列（配列番号２）とＫＣＥ
ＣＲＰＫＫＤＲＡＲ配列（配列番号３）とに反応してい
ることが予想される。抗体はタンパク質の表面に露出し
ている部分を認識すると考えられるため、この２種類の
アミノ酸配列部分はＶＥＧＦ／ＶＰＦの表面に露出して
いる部分であると言える。又、モノクローナル抗体は抗
原決定基が単一であると言われているが、高次構造をと
っている蛋白質などの高分子物質が抗原の場合は抗体が
立体的に抗原を認識し、蛋白質の一次構造レベルで抗体
の反応性を調べた時に二箇所以上の不連続なアミノ酸配
列に反応することがある。ＭＶ833抗体がＶＥＧＦ／Ｖ
ＰＦ中の二箇所のアミノ酸配列部分に反応したことよ
り、本抗体は二箇所のアミノ酸配列部分を立体的に同時
に認識していると考えられる。
【００４６】微量タンパク質やウイルスの研究を行う場
合現在ではその遺伝子のクローニングを行い、その塩基
配列よりタンパク質のアミノ酸配列が予想できる。この
アミノ酸配列をもとにして親水性の高い部位を探索し、
その部位の合成ペプチドに対するポリクローナル抗体や
モノクローナル抗体を作製して免疫学的解析に用いてい
る。親水性の高い部位の探索にはHoop＆Woodsらの方法
[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824(1981)]などを用
いて解析しているが、あらゆるタンパク質にあてはまる
とは限らない。したがって本発明によりＶＥＧＦ／ＶＰ
Ｆの表面に露出している部位の中で血管新生等の阻害に
重要である部分が明らかにされたことにより強い抗癌活
性を有したＶＥＧＦ／ＶＰＦ抗体を容易に作製できるよ
うになり、また、本発明に採用された方法は蛋白質の表
面に露出している部位を明らかにする方法としても適用
できる。
【００４７】実施例１（抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦモノクロー
ナル抗体ＭＶ８３３とミノサイクリンの併用による腫瘍
抑制試験）
【００４８】固形癌の増殖モデルとしてヒト線維肉腫株
ＨＴ−１０８０の２ｍｍ角をBALB/cnu/nu（ヌードマウ
ス、雄、６週令、ｎ＝４又は５）の腹部皮下に常法に従
って移植した。
【００４９】移植翌日から以下に示す投与量及びスケジ
ュールに従って、尾静脈からの投与を行った。 ・ミノサイクリン単独投与群（●）：10mg/kg, 1、2、
3、4、7、8、9、10、11日目投与 ・ＭＶ８３３単独投与群（▲） ：12.5μg/マウス、
1、5、9、13、17日目投与 ・ＭＶ８３３とミノサイクリン併用投与群（■）：ＭＶ
８３３：12.5μg/マウス、 1、5、9、13、17日目投与 ミノサイクリン：10mg/kg, 1、2、3、4、7、8、9、10、
11日目投与 ・コントロール群（○）：PBS(-)0.2ml/マウス、 1、
5、9、13、17日目投与
【００５０】各群の経時的な腫瘍径をノギスで測定し、
（短径）2×（長径）／２の式に従って腫瘍体積を算出
し、その結果を図１に示した。
【００５１】図１から、ＭＶ８３３とミノサイクリン併
用投与群では、夫々の単独使用群よりも有意に腫瘍増殖
が抑制され、特に、ミノサイクリン投与終了後（１２日
目以降）でも高い抑制効果が得られることが判る。した
がって、抗VEGF/VPF抗体とミノサイクリンの血管新生阻
害作用とが相乗的に固形腫瘍形成阻害に作用することが
示された。また、ミノサイクリンの投与終了後に抗VEGF
/VPF抗体を投与し続けることでも、腫瘍増殖が有効に抑
制されることが示された。したがって、ミノサイクリン
が投与されて低酸素状態となった腫瘍細胞から誘導され
るVEGF/VPFを中和すれば、腫瘍細胞の血管新生が抑制さ
れ、その結果、腫瘍増殖も効果的に抑制できることが示
唆された。
【００５２】
【発明の効果】本発明によれば、ＶＥＧＦ／ＶＰＦアン
タゴニスト及びミノサイクリンを併用することにより、
腫瘍の増殖及びそれに伴う血管新生を有効に抑制するこ
とができる。したがって、本発明は、各種の癌、及びそ
の他の血管形成性疾患の治療に有効に利用されるもので
ある。
【００５３】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 起源： セルライン：
【００５４】配列番号：２ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 起源： セルライン：
【００５５】配列番号：３ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 起源： セルライン：
【図面の簡単な説明】
【図１】ミノサイクリン単独、抗VEGF/VPF抗体単独、両
者の併用によるヒト線維肉腫細胞の増殖に対する阻害効
果を経時的に示す図である。

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＶＥＧＦ／ＶＰＦアンタゴニストとミノ
    サイクリンを有効成分とする血管新生阻害剤。
  2. 【請求項２】 ＶＥＧＦ／ＶＰＦアンタゴニストが抗Ｖ
    ＥＧＦ／ＶＰＦモノクローナル抗体であることを特徴と
    する請求項１の血管新生阻害剤。
  3. 【請求項３】 抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦモノクローナル抗体
    がＶＥＧＦ／ＶＰＦのアミノ酸配列の一部である下記配
    列１〜３の少なくとも１つと反応する抗体であることを
    特徴とする請求項２の血管新生阻害剤。 １．ＫＰＳＣＶＰＬＭＲ ２．ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣＲＰ ３．ＫＣＥＣＲＰＫＫＤＲＡＲ
  4. 【請求項４】 ＶＥＧＦ／ＶＰＦアンタゴニストとミノ
    サイクリンとを併用して投与することを特徴とする血管
    新生阻害方法。
  5. 【請求項５】 ＶＥＧＦ／ＶＰＦアンタゴニストとミノ
    サイクリンとを併用して投与した後、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ
    アンタゴニスト単独の投与を継続することを特徴とする
    請求項４に記載の血管新生阻害方法。
JP12964698A 1998-04-22 1998-04-22 血管新生阻害剤 Pending JPH11302193A (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP12964698A JPH11302193A (ja) 1998-04-22 1998-04-22 血管新生阻害剤

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP12964698A JPH11302193A (ja) 1998-04-22 1998-04-22 血管新生阻害剤

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH11302193A true JPH11302193A (ja) 1999-11-02

Family

ID=15014673

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP12964698A Pending JPH11302193A (ja) 1998-04-22 1998-04-22 血管新生阻害剤

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JPH11302193A (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012136522A (ja) * 2005-03-24 2012-07-19 Thrombogenics Nv 新規な抗ｐｌｇｆ抗体

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012136522A (ja) * 2005-03-24 2012-07-19 Thrombogenics Nv 新規な抗ｐｌｇｆ抗体

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5882644A (en) Monoclonal antibodies specific for the platelet derived growth factor β receptor and methods of use thereof
Matsuzaki et al. Monoclonal antibodies against heparin-binding growth factor II/basic fibroblast growth factor that block its biological activity: invalidity of the antibodies for tumor angiogenesis.
JP2001072589A (ja) 制癌剤
US6419928B1 (en) Monoclonal antibodies to transforming growth factor-beta and methods of use
US6572857B1 (en) Anti-CD6 monoclonal antibodies and their uses
EP0783893B1 (en) Inhibition of abnormal growth of synovial cells using il-6 antagonist as active ingredient
KR20190082815A (ko) 중화 항-tl1a 단일 클론 항체
CZ291047B6 (cs) Farmaceutický prostředek obsahující antagonisty faktoru růstu vaskulárních endoteliálních buněk
JP2002507580A (ja) 炎症媒介物質のアンタゴニスト
JP2002539076A (ja) 新脈管形成抑制のための方法および組成物
JPH09124697A (ja) ペプチド及びモノクローナル抗体
KR100693260B1 (ko) 항혈전제 및 인간화 항-폰빌레브란트 인자 모노클로날 항체
US20010021381A1 (en) Anti-TNFalpha antibodies in therapy of asthma
EP1283217B1 (en) Antibodies against the IL-8 receptor, and their therapeutic uses
KR20210071987A (ko) 항-cd79 항체 및 이들의 용도
JP2004506603A (ja) ヒトｌｄｌ受容体に対するモノクローナル抗体、その産生および用途
JP3519096B2 (ja) モノクローナル抗体、ハイブリドーマおよびそれらの用途
JPH11302193A (ja) 血管新生阻害剤
JP2003529370A (ja) 血管浸透性に対する有害な作用を有さないｖｅ−カドヘリンに対する拮抗薬抗体
JPH10508831A (ja) ビタミンｂ１２／トランスコバラミンｉｉレセプターおよび結合部位に対する抗レセプターおよび増殖阻止剤
JPH11310537A (ja) 温熱療法及び薬剤
JPH10114680A (ja) 制癌剤
JP2001002586A (ja) 重粒子線療法用薬剤
JPH1149701A (ja) 抗癌剤
JPH10245347A (ja) 体液再貯留抑制剤