ES2565856T3 - Procedimiento de preparación de estructuras tridimensionales para ingeniería tisular - Google Patents

Abstract

La presente invención pertenece al campo de la ingeniería tisularconcretamente se refiere a un método para obtener estructuras tridimensionales para ingeniería tisular y a las estructuras obtenidas por dicho procedimiento. La invención también se refiere a unmétodo ex vivo para regenerar un tejido usando las estructuras tridimensionales de la invención y al uso de las estructuras así tratadas para su transplante a la zona a regenerar del paciente.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento de preparacion de estructuras tridimensionales para ingeniena tisular Campo de la invencion

La presente invencion pertenece al campo de la ingeniena tisular y concretamente se refiere a un procedimiento para obtener estructuras tridimensionales para ingeniena tisular y a las estructuras obtenidas por dicho procedimiento. La invencion tambien se refiere a un procedimiento ex vivo para regenerar un tejido usando las estructuras tridimensionales de la invencion y al uso de las estructuras asf tratadas para su trasplante a la zona a regenerar del paciente.

Antecedentes de la invencion

La obtencion de un tejido u organo nuevo que pueda sustituir el danado es uno de los objetivos de la medicina regenerativa. Para ello hay que recurrir a tecnicas de Ingeniena Tisular, cuya base es la reconstruccion del organo o tejido danado a partir de pequenos restos de tejido sano (Sipe J et al, Ann N. Y. Acad. Sci. 961: xiii-xiv, 2002). La posibilidad de reconstruir un organo o tejido danado a partir de celulas de otros tejidos del organismo o incluso a partir de celulas embrionarias multipotentes se ha anadido en la actualidad a esta tecnologfa.

Las celulas son un elemento indispensable en la produccion de nuevos tejidos. Las celulas constituyen el componente vivo de los tejidos y son las que realizan las funciones biologicas caractensticas del mismo (por ejemplo la produccion de albumina por los hepatocitos, la filtracion por las celulas del glomerulo etc.). La tecnologfa del cultivo celular permite, a partir de un pequeno numero de celulas presentes en un fragmento de tejido sano, aumentar su numero en proporciones logantmicas sin que estas celulas pierdan sus caractensticas. En algunos casos tambien permite transdiferenciar celulas (por ejemplo de celulas grasas a celulas oseas) o incluso orientar celulas indiferenciadas hacia celulas de un tejido determinado (de celulas embrionarias hacia celulas productoras de insulina). Sin embargo, a pesar de toda esta tecnologfa desarrollada, no se pueden fabricar tejidos con las celulas aisladas, ya que en tales tejidos las celulas se encuentran distribuidas en una estructura tridimensional y esta distribucion espacial es cntica para el desarrollo de la funcion del organo o tejido. Esta estructura tridimensional esta proporcionada por la matriz extracelular de los tejidos. Esta matriz, no es solo una estructura para sostener las celulas, sino que presenta motivos de adhesion para que las celulas queden convenientemente fijadas. La matriz extracelular se produce y se destruye de forma coordinada por las propias celulas que componen el organo o tejido. Por este motivo, en la mayona de los modelos de ingeniena tisular, es necesario proporcionar a las celulas previamente cultivadas una estructura o soporte (scaffolds) para que, una vez introducidas en ella y colocadas en tres dimensiones, las celulas comiencen a comportarse de la manera mas fisiologica posible (Godbey WT and Atala A. Ann N. Y. Acad Sci. 961: 10-26, 2002).

Desafortunadamente no existe tecnologfa suficiente para producir matrices extracelulares semejantes a las de los tejidos adultos. La busqueda de estas estructuras tridimensionales, soportes, andamiajes es uno de los campos de investigacion mas importantes en el campo de la Ingeniena Tisular (Griffith L, Ann N. Y. Acad Sci, 961: 83-95, 2002).

El andamiaje no solo debe proporcionar una estructura tridimensional, es necesario que las celulas sean capaces de adherirse a el. El producto base del andamiaje no debe contener sustancias toxicas para las celulas. Tambien precisa otras caractensticas, tales como la resistencia mecanica (variable segun el organo o tejido a reconstruir) o la capacidad de degradacion. El andamiaje ideal debe degradarse y permitir que sea sustituido por la matriz extracelular normal del tejido correspondiente. El andamiaje, debe tener una estructura que permita a las celulas acceder a su interior, por lo que la mayona de estas estructuras se fabrican de materiales porosos. Multitud de sustancias han sido utilizadas como andamiajes en Ingeniena Tisular, esto da una idea de la complejidad de las necesidades que un andamiaje ideal debe tener.

Algunos biopolfmeros han sido empleados ampliamente como andamiaje. Los poli(alfa-hidroxiacidos) (Kulkarny et al, Arch Surg, 93: 839-843, 1993), tal como el acido poliglicolico (PGA) o el acido poli-L-lactico (PLLA) o combinaciones de ambas sustancias (PLGA) destacan entre ellos.

Otras sustancias de origen biologico utilizadas en el desarrollo de andamiajes son los hialuronatos (Itay S et al, Clin Orthop, 220: 234-300, 1987), los derivados de la quitina de las conchas marinas (chitosan) (Prasitsilp et al, J Mat Sci: Mat in Med, 11: 773-778, 2000) o los alginatos (Fragonas et al, Biomaterials 21: 795-801,2000).

Otra posible fuente de andamiaje son los compuestos que son la base de la matriz extracelular en los mairnferos, el ejemplo mas claro es el uso de geles de colageno tipo I para desarrollar modelos de Ingeniena Tisular (Maraguchi et al, Plast Reconstr Surg, 93: 537-544, 1994). Otra sustancia muy utilizada como andamiaje es el fibrinogeno presente en el plasma (Gurevitch O et al, Tissue Engineering 8: 661-672, 2002, Meana et al, Burns 621-630, 1998).

Un producto biologico utilizado ampliamente en terapeutica es la albumina. La albumina humana o de otra especie de mamffero se obtiene a partir del plasma. La albumina se utiliza normalmente en infusion venosa, aunque tambien se ha utilizado como pegamento biologico, mezclandola con un producto de reticulacion que comprende un aldehfdo, generalmente el glutaraldehfdo. Esta mezcla utilizada en terapeutica produce un adhesivo tisular utilizado

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en cirugfa y descrito en la solicitud WO 2005/00925. Tambien se describe un modelo en forma de estructura tridimensional basado en albumina-glutaraldehndo, que podna reforzarse mediante la inclusion de fibras y/o otros componentes y que podna implantarse en el organismo (documento WO 00/70018). Otros usos de este modelo descritos en el estado de la tecnica son el uso como microesferas para la dispensacion gradual de farmacos (documento US 4349530). Sin embargo, el uso de esta estructura como andamiaje o soporte para tecnicas de Ingeniena Tisular no ha sido posible ya que es una estructura maciza, sin poros en su interior al que puedan acceder las celulas. Ademas, el glutaraldehndo no es un producto apropiado en la preparacion de matrices aptas para cultivar celulas, ya que hace que la matriz sea muy poco degradable y tiende a bloquear las protemas necesarias para la adhesion celular (Biopolymer methods in Tissue Engineering, Hollander P y Haltton PV ed., pg. 11, Humana Press, 2004). El glutaraldehndo que resta en la estructura es muy toxico para las celulas y las celulas sembradas en la superficie de los compuestos albumina-glutaraldefndo prenden mal y/o mueren. Una posibilidad para situar celulas en su interior es mezclar la albumina con las celulas previamente al empleo de la solucion de reticulacion, sin embargo esto tampoco es posible por la toxicidad antes referida. Existe en el estado de la tecnica una posibilidad para hacer porosa esta estructura, como es la mezcla con partmulas tipo carbonato calcico (WO 00/70018), sin embargo esto obliga a tratar la mezcla con soluciones acidas para eliminar las partmulas, el glutaraldehndo residual permanece y este producto resulta toxico y poco recomendable como andamiaje para el desarrollo “in vitro” de tecnicas de Ingeniena Tisular.

Otros andamiajes de albumina han sido descritos como porosos, bien por el uso de un material de construccion porosa inocuo, tal como microesferas de PEG (documento WO2006/099137), NaCl (documento 2004/108810), bicarbonato (documento US2002/059001) o por el propio procedimiento de preparacion (documento DE3517456).

El desarrollo de andamiajes o soportes para Ingeniena Tisular a partir de protemas globulares, tales como la albumina, precisa de otros sistemas que eliminen la toxicidad de la sustancia de reticulacion, proporcionen una estructura porosa y a ser posible incluyan en la misma motivos que favorezcan el anclaje de las celulas.

Breve descripcion de la invencion.

Un primer objetivo de la presente invencion, es un procedimiento para obtener estructuras tridimensionales no toxicas, para desarrollar modelos de ingeniena tisular, a partir de las protemas globulares del plasma (concretamente la albumina), entrecruzadas por un agente de reticulacion (preferentemente glutaraldehndo). La mezcla protema-reticulante se congelara y posteriormente se sometera a liofilizacion. Una vez liofilizado, el producto resultante debe ser hidratado para que tenga resistencia y elasticidad. La hidratacion se realiza mediante el empleo de etanol en concentraciones decrecientes. Finalmente se lava el exceso de etanol en medio de cultivo o solucion salina equilibrada. Se origina asf un soporte poroso, flexible, que puede ser cortado con facilidad sin rotura.

Un segundo objetivo de la invencion es la estructura tridimensional o andamiaje obtenible por el procedimiento referido anteriormente.

La estructura o andamiaje asf disenados se pueden utilizar tras su siembra con diferentes tipos celulares en un procedimiento para regenerar ex vivo el tejido u organo danado. Las celulas se adhieren a esta estructura y son capaces de crecer y/o diferenciarse, comenzando la smtesis de protemas de la matriz extracelular.

Finalmente el andamiaje de la invencion con las celulas en su interior puede ser trasplantado a un ser vivo, en el que la respuesta inmune producira una reabsorcion progresiva del andamiaje y las celulas produciran la matriz extracelular normal del tejido.

El resultado final sera la reparacion de un organo o tejido danados mediante Ingeniena Tisular.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1: la imagen representa el soporte o andamiaje de la invencion observado al microscopio de barrido (X500) realizado a partir de albumina al 20 % (izquierda) y un corte histologico del mismo (derecha).

Figura 2: adhesion de fibroblastos humanos a un soporte o andamiaje realizado directamente con plasma humano. A la derecha expresion de colageno tipo I (la protema extracelular mas importante de la dermis) por estos fibroblastos.

Figura 3: preadipocitos extrafdos a partir de grasa subcutanea de conejo, sembrados sobre una estructura realizada directamente con suero de conejo. Las celulas fueron cultivadas 45 dfas en estufa en medio adipogenico (izquierda, tincion aceite rojo) y medio osteogenico (derecha, tincion de Von Kossa).

Figura 4: estructura tridimensional de acuerdo con la invencion observada con un microscopio electronico de barrido (X200). A la derecha soporte realizado con albumina al 5 % y a la izquierda con albumina al 20 %.

Figura 5: Imagen tomada por microscopio de barrido (X4000). Superficie de los diferentes soportes. Arriba y a la izquierda, albumina al 20 %, a la derecha soporte directamente realizado con suero. Abajo. Soporte realizado a partir de plasma.

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Figura 6: esquema de un prototipo del soporte de la presente invencion en el interior de una dermis artificial basada en plasma y fibroblastos. El soporte proporciona a la dermis basada en fibrina y fibroblastos una consistencia que facilita el trasplante de la misma.

Figura 7: Estructura de una piel tricapa: en la parte inferior adipocitos diferenciados sobre el andamiaje de la presente invencion, en la parte media fibroblastos en gel de plasma y en la superior queratinocitos.

Descripcion detallada de la invencion.

En primer lugar la invencion se refiere a un procedimiento para obtener estructuras tridimensionales para ingeniena tisular que comprende:

a) mezclar una fuente de albumina y un agente de reticulacion e introducir la mezcla en un molde con la forma de la estructura que se ha de obtener

b) congelar lenta y progresivamente la estructura solida obtenida en a)

c) liofilizacion de la estructura de b)

d) rehidratacion progresiva de la estructura de c) por medio de inmersion sucesiva en alcoholes de graduacion descendente.

En el contexto de la invencion la fuente de albumina puede ser un preparado purificado de albumina o puede ser albumina directamente obtenida del suero o plasma del propio paciente, al que posteriormente se le vaya a implantar la estructura o andamiaje con las celulas. El hecho de que se use el propio suero o plasma del paciente tiene la ventaja de que se minimizara la respuesta inmune de rechazo al implante. Ademas el uso de plasma o suero del paciente frente a preparados de albumina tiene la ventaja de que proporciona mas motivos de union o anclaje a las celulas que posteriormente se sembraran en la estructura de la invencion, ya que no solo presenta los motivos propios de la albumina sino del resto de protemas presentes en la sangre.

La concentracion de albumina utilizada para la elaboracion de las estructuras tridimensionales de la invencion dependera de la aplicacion que se le vaya a dar a la misma, es decir, del tipo de tejido que se pretenda regenerar. Por lo general, se pueden usar concentraciones de entre 1-50 % de albumina.

Como agente de reticulacion se puede utilizar cualquiera que produzca el efecto de desnaturalizar y entrecruzar las moleculas de albumina aunque se prefiere el uso de de agentes tipo aldetudo como el formaldehido o glutaraldehido. Este ultimo es especialmente preferente. La concentracion del agente de reticulacion usado en la mezcla con la fuente de albumina puede estar al 0,1-9 %, preferentemente al 0,5-7,5 %.

La reaccion de la mezcla albumina-agente de reticulacion en un molde con forma predeterminada permite que al hacerse solida la estructura resultante adquiera la forma del molde. De este modo se puede adecuar la forma de la estructura al defecto que se quiera suplir o del tejido danado que se quiera regenerar.

Despues de la congelacion lenta y progresiva de la estructura tridimensional obtenida, preferentemente a un ritmo de 1° C/min hasta una temperatura de -70° C, se lleva a cabo un paso clave de la invencion. Este paso supone someter la estructura maciza obtenida tras el entrecruzamiento y la congelacion a una liofilizacion. La liofilizacion produce la anulacion del efecto toxico del agente de reticulacion pero, ademas, produce un material de amplia porosidad, ya que eliminamos la totalidad de la fraccion acuosa del andamiaje (al mismo tiempo se elimina el agente de reticulacion no fijado a la protema globular).

El producto asf obtenido es muy friable y no ofrece suficiente resistencia mecanica para su utilizacion. Para mejorar estas caractensticas, este producto liofilizado debe ser hidratado. Esta hidratacion se debe realizar, preferentemente, de forma lenta y progresiva para evitar roturas. La hidratacion se realizara mediante el tratamiento con alcoholes en graduacion descendente, preferentemente mediante la inmersion en alcohol absoluto, alcohol de 96°, 90°, 80°, 70° y 50°. La estructura obtenida tras la hidratacion sera lavada en medio de cultivo o en solucion equilibrada de sal, para eliminar los restos de alcohol que pudieran quedar.

El resultado final de este procedimiento, que es tambien objeto de la invencion, es una estructura tridimensional porosa, elastica, no toxica (figura 1) en la que pueden sembrarse celulas cultivadas que son capaces de adherirse al andamiaje de la invencion.

El siguiente objetivo de la presente invencion se deriva gracias a esta capacidad de la estructura tridimensional de adherir celulas. Este objetivo es un procedimiento ex vivo para regenerar un tejido que comprende:

a) sembrar celulas en la estructura tridimensional anteriormente descrita;

b) incubar las celulas en un medio de cultivo dentro de una estufa o biorreactor hasta el momento en que la estructura se vaya a implantar en el paciente.

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El andamiaje o estructura tridimensional con estas celulas sembradas en su interior ya sea por agitacion, agitacion intermitente o en un biorreactor, se puede mantener “in vitro” en estufas de cultivo celular o en biorreactores. Durante este periodo, las celulas pueden seguir creciendo, se comportan de una manera fisiologica (figura 2) y segun los factores de crecimiento o diferenciacion presentes en el medio de cultivo, expresar el fenotipo completo de la estirpe celular sembrada o ser diferenciados hacia celulas de otros tipos de tejidos (figura 3). Este crecimiento y/o diferenciacion se realiza sin que se aprecie una degradacion de la parte estructural del andamiaje de la invencion, incluso por periodos de hasta 6 meses de cultivo “in vitro”. En una realizacion preferente de la invencion las celulas sembradas y cultivadas y/o diferenciadas son osteoblastos, preadipocitos, condrocitos o fibroblastos dermicos.

Finalmente, el producto de la invencion asf manipulado, que es tambien objeto de la invencion, puede ser trasplantado a un ser vivo, en el que la estructura originada por el entrecruzamiento de la albumina sera degradada por parte del sistema inmunitario del individuo, las celulas aportadas continuaran con la produccion de matriz extracelular que ira sustituyendo lentamente a la estructura proteica inicial. El resultado de este trasplante, originara como producto final un nuevo tejido u organo capaz de suplir la parte danada, objetivo final de los procesos de Ingeniena Tisular.

Modo de realizacion de la invencion

La base del producto de la invencion son las protemas globulares del plasma entrecruzadas con una sustancia tipo aldehndo. La albumina es la principal protema del plasma y es la base estructural del producto y puede ser utilizada a diferentes concentraciones con resultados estructurales distintos, (entre el 50 y el 4 %) (figura 4). La sustancia de reticulacion, por ejemplo el glutaraldehndo puede tambien utilizarse a diferentes concentraciones, entre el 0,5 y el 7,5 % con respecto al volumen de albumina.

Tras la mezcla, esta se deposita en un molde y se produce la rapida solidificacion. El producto se desmolda y se somete a una congelacion lenta y progresiva. Una vez congelado el producto se somete a liofilizacion, cuando esta finaliza el producto de la presente invencion tiene un aspecto poroso pero es extremadamente friable y se rompe ante una minima fuerza. Para lograr un producto utilizable como soporte o andamiaje se debe hidratar. La hidratacion produce un cambio drastico en las caractensticas ffsicas del producto, volviendolo elastico y resistente a la manipulacion. Si este producto se hidrata bruscamente parte de la estructura se puede romper, por lo que es conveniente someterlo a una hidratacion progresiva. Para ello, se introduce el producto en alcohol etilico absoluto (entre una y ocho horas dependiendo del tamano de la estructura), posteriormente se introduce en alcohol de 96°, 90° y 80°, durante el mismo periodo de tiempo. Tras el paso por el alcohol de 80° las caractensticas ffsicas del producto cambian, el producto es mas elastico, los poros son mas visibles y se puede cortar en finas laminas. Se continua con la hidratacion del producto, dejandolo en alcohol de 70° durante 24 horas, alcohol de 50° y de aqrn en medio de cultivo (DMEM, RPMI...) o soluciones salinas equilibradas. Se cambia la solucion salina al menos 3 veces para eliminar todos los restos de alcohol presentes. El producto final es una esponja elastica en la que pueden verse los poros con claridad. Este producto puede almacenarse en el medio de cultivo durante meses sin perder su capacidad funcional.

Se ha comentado previamente que la concentracion de albumina para la realizacion del producto podna ser muy variable. Cuando se utilizan concentraciones de albumina bajas (4 %), el producto es ligeramente menos resistente que con albuminas al 20 %. Sin embargo, cuando se utilizan concentraciones bajas de albumina el producto sigue siendo estable y elastico. El plasma humano contiene entre el 3 y el 5 % de albumina, por lo que este andamiaje se podna realizar directamente a partir de plasma humano. El empleo directo de plasma o suero en la produccion del andamiaje permite la posibilidad de fabricar una estructura tridimensional partiendo directamente de la sangre del paciente, al que sera posteriormente implantado. Para ello, mediante venopuncion, se extraena una pequena cantidad de sangre del paciente (entre 10 y 100 ml) dependiendo del tejido a reconstruir, en medio sin anticoagulante (suero) o con el (plasma). Se centrifuga para quitar el componente celular de la sangre y se mezcla con el glutaraldetndo, se coloca en el molde y se deja que el producto solidifique. A partir de aqrn se continua con la congelacion lenta, la liofilizacion y la hidratacion progresiva. El resultado final es un producto aparentemente semejante al preparado con la albumina a bajas concentraciones, una estructura tridimensional, en la que celulas de mairnfero pueden ser sembradas. Este soporte ha perdido totalmente su toxicidad. Los soportes/andamiajes generados a partir de plasma o suero son claramente diferentes de los generados directamente a partir de concentrados de albumina, ya que en ellos tambien estan presentes otras protemas normalmente presentes en la sangre. Esta diferencia produce tambien cambios importantes en la funcion del andamiaje, que se comentaran en el siguiente parrafo.

Una vez conseguida la estructura tridimensional, se procede a la siembra de celulas. Uno de los grandes problemas de la mayona de los andamiajes previamente disenados son que no aportan las senales necesarias para facilitar el anclaje de las mismas al soporte, ya que la interaccion celulas soporte es un proceso dinamico en el que la celulas reconoce una superficie favorable y, una vez iniciado el contacto ffsico, las celulas comienzan a sintetizar las protemas espedficas de union con la matriz extracelular. Los estudios previos, realizados con el andamiaje de la presente invencion muestran que las celulas tienen una capacidad limitada para unirse directamente a los andamiajes de albumina, sin embargo esta capacidad aumenta hasta hacerse al menos 10 veces mayor cuando se utilizan andamiajes realizados directamente con suero o preferentemente con plasma. El estudio estructural realizado mediante microscopfa electronica de barrido, demuestra que la superficie de estas estructuras es muy

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diferente (figura 5). Estas claras diferencias son debidas a que en el suero y en el plasma existen muchas mas protemas que en un preparado purificado de albumina y parte de esas protemas seran atrapadas dentro del entrecruzamiento producido entre la albumina y el agente de reticulacion.

Esto posibilita, dependiendo de la estrategia a seguir, la utilizacion de andamiajes diferentes dependiendo de si lo que interesa es una mayor proliferacion de las celulas (preferentemente las celulas crecen mejor en adhesion) o una mayor diferenciacion de las mismas.

Una vez conseguido el andamiaje, este se puede guardar sin perder sus caractensticas dejandolo en medio de cultivo, o se puede utilizar. Para ello se procede a sembrar las celulas propias del tejido a regenerar. Para la siembra se pueden seguir diversas estrategias (agitacion, agitacion intermitente, biorreactor...).

El andamiaje sembrado con el componente celular quedara entonces en la estufa o biorreactor hasta el momento del implante. Este periodo de tiempo sera muy variable segun el tipo celular empleado y el grado de diferenciacion que las celulas precisen. Durante este periodo se puede observar como las celulas se fijan al andamiaje y como comienzan a producir las protemas espedficas del tejido adulto. Por ejemplo, si a un andamiaje de acuerdo con la invencion se le siembran fibroblastos y se le deja en un medio de crecimiento tfpico (por ejemplo DMEM, 10 % Gracias a esta capacidad de la estructura tridimensional de adherir celulas se deriva suero fetal de bovino) se observa como a los pocos dfas de la siembra los fibroblastos comienzan a sintetizar colageno tipo I (figura 2). Si por ejemplo se siembran sobre este andamiaje celulas cultivadas a partir de implantes oseos y dejamos estas celulas en medio de osteogenesis observaremos a los pocos dfas como las celulas depositan sales de calcio sobre el andamiaje, y expresan el enzima fosfatasa alcalina. Si se siembran condrocitos cultivados y se coloca el andamiaje en medio de diferenciacion condral se observara la produccion de colageno tipo II. Cuando se siembran celulas mas indiferenciadas, los plazos necesarios para el intervalo entre la siembra y el andamiaje pueden ser mayores. Un ejemplo sena cuando sembramos celulas madre de mesenquima obtenidas a partir de una biopsia de grasa subcutanea y las dejamos en medio osteogenico, se precisa un periodo superior a los 15-20 dfas de cultivo “ex vivo” para ver la expresion de protemas propias del hueso. A pesar de estos periodos tan prolongados el andamiaje de la presente invencion no se digiere (o lo hace mmimamente) y conserva la estructura tridimensional sin alteraciones en cultivo “ex vivo” hasta 6 meses despues de la siembra.

Finalmente y una vez conseguida “ex vivo” la estructura y diferenciacion celular deseada, el andamiaje de la presente invencion puede ser trasplantado.

Tras el trasplante un andamiaje siempre se comporta como un cuerpo extrano y generara una respuesta inflamatoria. Esta respuesta debera ser moderada y producir una degradacion paulatina y controlada del material extrano. Los estudios “in vivo” relacionados con el andamiaje de la presente invencion muestran una muy moderada degradacion sin objetivarse una gran inflamacion en la zona del trasplante. Mientras la estructura del andamiaje original es degradada, se produce la integracion de la nueva matriz extracelular producida por las celulas sembradas en el andamiaje, generandose un nuevo tejido que puede reproducir las funciones del tejido originalmente danado.

En resumen el andamiaje de la presente invencion permite una serie de ventajas que lo diferencian claramente de lo previamente conocido en el estado de la tecnica:

- Aporta una estructura tridimensional para las celulas, pero tambien aporta a la vez senales de adhesion. Esto confiere al producto una composicion idonea para el desarrollo de modelos de Ingeniena Tisular.

- Es un andamiaje que permite el cultivo “in vitro” durante largos periodos (hasta 6 meses), sin perdida de la estructura tridimensional. Esto permite el desarrollo de modelos de diferenciacion “in vitro”.

- Es un material biologico ampliamente empleado en la clmica.

- El producto original es de muy facil obtencion (concentrados de albumina) o sangre total (venopuncion).

- La posibilidad de construir un soporte para ingeniena tisular, a partir de pequenas cantidades de sangre total, ofrece la posibilidad de obtener estas estructuras partiendo de productos biologicos autologos, es decir, obtenidos del propio paciente al que van a ser implantados.

Los siguientes ejemplos describen la utilizacion de este andamiaje en medicina regenerativa, aunque no pretenden ser limitativos respecto al ambito de la invencion.

Ejemplo 1: Preparacion de un andamiaje para reparar una artrosis en una diafisis femoral con albumina al 20

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El andamiaje tipo para pseudoartrosis en una diafisis femoral posee una dimension aproximada de 3 cm de diametro por 2 cm de altura. Para su preparacion se partio de 10 ml de albumina humana al 20 % de la que habitualmente se utiliza en la clmica para su infusion. La albumina se mezclo con 1 ml de glutaraldehudo al 25 % e inmediatamente despues se deposito en un molde de las dimensiones antes referidas. Se dejo solidificar la mezcla a temperatura ambiente durante 30-45 minutos y posteriormente se coloco en un refrigerador electrico a -80° C durante 18-24

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horas. Una vez congelado el andamiaje se desmoldo y sin descongelar se introdujo en el liofilizador hasta que la muestra quedo totalmente liofilizada. Finalizado este proceso la muestra se coloco en alcohol etilico absoluto durante 2 horas. Entonces, el andamiaje se paso a etanol al 96 % y se dejo durante otras 2 horas. El etanol a 96 % se sustituyo por etanol al 80 % y posteriormente por etanol al 70 % donde se dejo a temperatura ambiente durante 24 horas. Tras esta incubacion el andamiaje se introdujo durante 2 horas en etanol al 50 %, en agua pura esteril y finalmente en una solucion isotonica tipo PBS, solucion de Ham o incluso medio de cultivo tipo RPMI o DMEM. Se lavo varias veces con esta solucion para eliminar todos los restos de etanol que pudieran quedar en el producto. Tras esta incubacion se tomo una minima muestra del andamiaje para control bacteriologico y el andamiaje se dejo en la solucion salina hasta su utilizacion.

Ejemplo 2: Preparacion de un andamiaje para reparar cartilago articular con plasma del paciente

Para reparar una lesion aguda del cardlago articular de la rodilla se utilizo directamente plasma procedente del propio paciente. En primer lugar mediante procedimientos radiograficos (resonancia nuclear magnetica), o mejor durante la exploracion artroscopica de la rodilla lesionada, se midio aproximadamente la lesion condral a reparar. Al mismo tiempo esta artroscopia permitio la toma de una minima biopsia del cartflago articular sano para cultivo y expansion “ex vivo” de estas celulas.

Tambien en ese momento se extrajeron 10 ml de sangre en EDTA, esta sangre se centrifugo, por ejemplo a 3000 rpm durante 10 minutos. Tras la centrifugacion se recogio el plasma, 3 ml de este plasma se mezclaron con 300 pl de glutaraldelddo al 25 % y se coloco en una placa Petri de 35 mm de diametro, se dejo que la mezcla solidificase (30-60 minutos) y se coloco en un congelador electrico a -80° C hasta el dfa siguiente. Sin descongelar se desmoldo y se coloco en un liofilizador hasta que el producto quedo completamente liofilizado. Tras esto se introdujo en etanol absoluto unas 2 horas y se paso por etanol al 96 %, al 80 % y al 70 %, en el que quedo unas 18-24 horas.

Posteriormente se coloco durante 2 horas en etanol al 50 % y en solucion salina tipo PBS o medio de cultivo. Se tomo muestra para control bacteriologico del andamiaje asf preparado. Se lavo al menos 3 veces con la solucion salina para eliminar los restos de etanol. En esta fase se ajusto el tamano del andamiaje al de la lesion cartilaginosa, cortando este por ejemplo con un bistun. El andamiaje quedo listo para ser sembrado de celulas.

Ejemplo 3: Regeneracion de hueso maxilar para implantes dentales

A un paciente que precisaba implantes dentales y no posefa suficiente masa osea se le extrajeron 10 ml de sangre y se llevo a cabo un proceso similar al del ejemplo 2 pero usando un molde muy similar al defecto que debfa ser regenerado. Al mismo tiempo se le extrajeron unos pequenos fragmentos esponjosos del maxilar. Tras la congelacion del material, liofilizacion e hidratacion del mismo el andamiaje se reservo para la siembra de celulas e implante. Los fragmentos del hueso del paciente se sembraron sobre un frasco de cultivo celular por la tecnica de explantes y se espero a que crecieran las celulas viables presentes. Tras el crecimiento, las celulas se subcultivaron segun las diferentes tecnicas descritas. Una vez alcanzo una masa celular de celulas oseas suficiente, se sembraron sobre el andamiaje, se dejaron un periodo de tiempo en la estufa para que las celulas prendiesen y se trasplantaron a la zona a reconstruir. El andamiaje se fue degradando lentamente y las celulas que contiene produjeron la matriz adulta del hueso.

Ejemplo 4: Regeneracion de hueso maxilar para implantes dentales

Se siguio otra estrategia similar a la del ejemplo 3 con otro paciente. En vez de extraer un fragmento de hueso, se utilizo como fuente celular una pequena biopsia de grasa subcutanea. La grasa se digirio en colagenasa y las celulas se sembraron en un frasco de cultivo celular en medio de crecimiento (DMEM, 10 % de suero fetal de bovino). Tras alcanzar una masa cntica, los preadipocitos cultivados se sembraron sobre el andamiaje y se dejaron en medio de diferenciacion osea, hasta que por el seguimiento se apreciaron signos de diferenciacion hacia osteoblasto. Posteriormente el andamiaje y las celulas que conteman se trasplantaron al defecto maxilar a regenerar.

Ejemplo 5: Regeneracion de una deformidad del pabellon auricular

Una deformidad del pabellon auricular se reparo mediante el empleo de un andamiaje de suero del paciente. Los materiales y procedimientos son sustancialmente aquellos usados en el ejemplo 2, aunque el andamiaje se endurecio sobre un molde que reproduda la estructura del cartflago de la oreja. Al mismo tiempo se tomo una pequena muestra sana del cartflago auricular del paciente. Por un lado el andamiaje se congelo, liofilizo e hidrato segun la metodologfa descrita en el ejemplo 2. Por otra parte el cartflago se digirio sometiendose a enzimas proteoltticos y los condrocitos obtenidos se cultivaron hasta obtener una masa celular suficiente para ser sembradas sobre el andamiaje. Tras la siembra, los condrocitos sufrieron un proceso de rediferenciacion mediante cultivo en estufa (25-45 dfas) y finalmente se trasplantaron a la zona lesionada.

Esta misma estrategia podna seguirse para la reparacion de un cartflago articular, cambiando el origen de la fuente de condrocitos.

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40

45

Ejemplo 6: Regeneracion del tejido graso subcutaneo

Se tomo sangre de la paciente, se realizo el andamiaje de la forma descrita en el ejemplo 2 y se sembro con preadipocitos cultivados a partir de una biopsia de tejido graso de la paciente. Una vez sembrado en andamiaje, este se quedo cultivando en la estufa en medio de diferenciacion adiposa hasta que las celulas sembradas comenzaron a acumular trigliceridos en su interior. Posteriormente se trasplanto a la region a reconstruir.

Esta misma estrategia podna seguirse tras las mastectoirnas debidas a neoplasias de mama

Ejemplo 7: Reconstruccion osea

Un andamiaje para reconstruccion de lesiones oseas se puede desarrollar como en el ejemplo 1. Sin embargo, puede que algunas reconstrucciones oseas requieran una mayor consistencia del andamiaje que el basado en plasma o suero, por lo que se anadina al plasma o suero del paciente un porcentaje de albumina humana para reforzar la estructura, manteniendo las propiedades de anclaje celular. Finalmente este andamiaje podna ser sembrado con celulas del paciente extrafdas a partir de una biopsia osea o como en el ejemplo 4 de grasa subcutanea.

Ejemplo 8: Regeneracion dermica tras una quemadura

La base de este tratamiento consistio en la produccion de laminas de pequeno grosor del andamiaje de la presente invencion, sembrados a partir de fibroblastos dermicos del propio paciente y trasplantados sobre el sitio de la lesion. En esta modalidad los fibroblastos podnan ser de otro paciente sano dado que los fibroblastos son celulas con escaso poder de generar rechazo inmunologico. Este prototipo de andamiaje en forma de lamina mas fibroblastos dermicos se puede asociar a membranas semipermeables tipo silicona, que proporcionan un efecto de barrera y protegen la herida y el implante de posibles infecciones.

Este tipo de estrategia podna usarse en otras lesiones de la piel (ulceras, amputaciones quirurgicas en el pie diabetico)

Ejemplo 9: Estructura de refuerzo

El andamiaje de la presente invencion tambien puede ser utilizado como estructura interna de refuerzo de otros materiales ya empleados en ingeniena tisular. Un ejemplo de esta aplicacion es la asociacion de una lamina del prototipo aqu descrito a una lamina de plasma que contiene fibroblastos vivos. En este ejemplo el plasma humano conteniendo fibroblastos se siembra sobre una lamina del andamiaje de la invencion, se anade cloruro calcico para coagular el plasma y el andamiaje queda en el interior del plasma sirviendo de armazon interno y facilitando el trasplante de esta dermis artificial. Tambien si se siembran queratinocitos sobre esta dermis artificial se consigue una piel artificial con un armazon interno que le aporta rigidez y facilita el trasplante. En la figura 6 se esquematiza este prototipo.

Ejemplo 10: Prototipo de piel artificial

Este prototipo puede ser asociado con un modelo de piel artificial definido en el ejemplo 9 para generar una piel cultivada tricapa que incorpore grasa subcutanea.

Para ello a partir de una pequena biopsia de grasa se obtienen las celulas que se cultivan en un medio de expansion (DMEM 10 % de suero bovino). Cuando se alcanza un numero suficiente de celulas, estas se siembran en el andamiaje de presente invencion y se cultivan en un medio de diferenciacion hacia adipocito. Cuando las celulas presentan signos de diferenciacion grasa (figura 3, izquierda), se anade al andamiaje, fibroblastos dermicos, plasma y se recalcifican para provocar la coagulacion. Sobre su superficie se siembran los queratinocitos epidermicos y se cultivan hasta que se hacen confluentes. El modelo que se obtendna sena una parte inferior con celulas grasas unidas al andamiaje de la presente invencion, uniendose a el una capa inmediatamente superior de plasma con fibroblastos semejante a la dermis humana y en la parte superior una capa epitelial (figura 7), es decir una piel humana con 3 capas mucho mas parecida a la natural que la generada con estrategias diferentes.

Claims (10)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento de obtencion de estructuras tridimensionales para ingeniena tisular que comprende:

   a) mezclar una fuente de albumina y un agente de reticulacion e introducir la mezcla en un molde con la forma de la estructura que se ha de obtener

   b) congelar lenta y progresivamente la estructura solida obtenida en a)

   c) liofilizacion de la estructura de b)

   d) rehidratacion progresiva de la estructura de c) por medio de inmersion sucesiva en alcoholes de concentracion decreciente.
2. 2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la fuente de albumina se selecciona entre un preparado purificado de albumina, suero o plasma.
3. 3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el agente de reticulacion es un aldehfdo.
4. 4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 3, en el que el aldehudo es glutaraldehfdo.
5. 5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la fuente de albumina posee una concentracion de albumina entre el 1 % y el 50 %.
6. 6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que la fuente de albumina posee una concentracion de 35 %.
7. 7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el agente de reticulacion posee una concentracion entre el 0,1 y el 9 %.
8. 8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 7, en el que el agente de reticulacion posee una concentracion de 0,5-7,5 %.
9. 9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la congelacion se hace a un ritmo de -1° C/min hasta una temperatura de -70° C.
10. 10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la rehidratacion progresiva se lleva a cabo por inmersion sucesiva en alcohol absoluto, alcohol de 96°, 90°, 80°, 70°, 50° y por ultimo en medio de cultivo o soluciones salinas equilibradas.