ES2566150T3 - Plantas de girasol resistentes al herbicida - Google Patents

Abstract

Planta de girasol o descendiente de la misma que tiene al menos una copia de al menos un gen que codifica un polinucleótido de una subunidad grande de una acetohidroxiácido sintasa (AHASL), donde dicho polinucleótido AHASL codifica una proteína AHASL que confiere resistencia a un herbicida de imidazolinona, un herbicida de sulfonilurea, un herbicida de triazolopirimidina y un herbicida de pirimidiniloxibenzoato, dicha proteína AHASL comprende una mutación en la posición del aminoácido 574 o posición equivalente, donde la posición del aminoácido 574 o posición equivalente es leucina, y donde dicha planta de girasol o descendiente de la misma tiene resistencia aumentada a un herbicida de imidazolinona, un herbicida de sulfonilurea, un herbicida de triazolopirimidina y un herbicida de pirimidiniloxibenzoato, en comparación con una planta de girasol de tipo salvaje.

Description

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DESCRIPCION

Plantas de girasol resistentes al herbicida Campo de la invencion

[0001] Esta presente invencion se refiere al campo de la biotecnologia agricola, particularmente a plantas de girasol resistentes a los herbicidas que contienen secuencias polinucleotidas nuevas que codifican proteinas con subunidades grandes de acetohidroxiacido sintasa de girasol resistentes a los herbicidas.

Antecedentes

[0002] Acetolactato sintasa (ALS) o acetohidroxiacido sintasa (AHAS) es la primera enzima en la via biosintetica de la valina de aminoacidos de cadena ramificada, leucina e isoleucina en plantas y microorganismos. Cinco familias diferentes de compuestos inhiben la enzima de AHAS y se usan como herbicidas de amplio espectro no selectivos: sulfonilureas (SUs), imidazolinonas (IMIs), triazolopirimidinas (TPS), sulfonilaminocarboniltriazolinonas (SCTs) y pirimidiniloxibenzoatos (POBs).

[0003] Dado su alta eficacia y baja toxicidad, ciertos herbicidas son preferidos para uso agricola. Sin embargo, la capacidad para usar algunos de estos herbicidas en un sistema de production de planta de cultivo particular depende de la disponibilidad de variedades resistentes de la planta de cultivo de interes. Para producir tales variedades resistentes, los criadores de plantas necesitan desarrollar lineas de cultivo con caracteristicas de resistencia. Por consiguiente, lineas de cultivo resistentes al herbicida y variedades de plantas de cultivo, al igual que metodos y composiciones para la produccion y uso de lineas de cultivo resistentes y variedades, son necesarias.

[0004] Una variedad de plantas de cultivo, incluyendo maiz (Zea mays L., canola (Brassica napus L.), remolacha (Beta vulgaris L.), arroz (Oryza sativa L.), algodon (Gossypium hirsutum L.) girasol (Helianthus annuus L.), lino (Linum usitatissimum L.), semilla de soja [Glycine max (L.) Merr.] y trigo (Triticum aestivum L.), resistente a herbicidas de inhibition de AHAS han sido desarrollados por una variedad de metodos, incluyendo selection de celulas somaticas, cultivo de mutation, transformation de plantas e hibridacion interespecifica (Anderson and Georgeson, 1989; Croughan, 1996; D'Halluin et al., 1992; Newhouse et al., 1991, 1992; Hart et al., 1992; Wright and Penner, 1998; Swanson et al., 1989; Subramanian et al., 1990; Rajasekaran et al., 1996; Sebastian et al., 1989; Pozniak and Hucl, 2004; Al-Khatib and Miller, 2002; Mallory-Smith et al., 1990; McHughen, A. 1989). La resistencia en la mayor parte de estos casos se debe a una forma de AHAS que es menos sensible a la inhibicion herbicida debido a la union al herbicida reducida provocada por mutaciones en el gen o genes que codifican para la subunidad catalitica de AHAS. Diferentes autores han analizado mutaciones conocidas de los genes de AHAS que confieren resistencia a los herbicidas inhibidores de AHAS en plantas (Preston and Mallory-Smith; 2001; Tranel and Wright, 2002; Tan et al., 2005). Ninguna sustitucion de aminoacidos conocida en la subunidad reguladora se ha comunicado que confiera resistencia herbicida. La WO2007/054555 divulga girasoles con resistencia aumentada a herbicidas de imidazolinona. Estas plantas de girasol comprenden al menos una copia de AHASL con una isoleucina en la position de aminoacido 188. La combination con otras mutaciones tales como leucina en la posicion 559 es tambien descrita.

[0005] Poblaciones de girasol salvaje (Helianthus annuus L.) resistentes a imidazolinonas (IMIs) o sulfonilureas (SUs) se han descubierto (Al-Khatib et al. 1998, White et al. 2002). La caracteristica de resistencia al herbicida fue introgresada en las lineas innatas de elite de girasol por metodos de cultivo convencionales para el desarrollo y el despliegue de cultivos resistentes a IMI y resistentes a SU (Al-Khatib and Miller,2002; Miller and Al-Khatib, 2002, 2004). Basandose en estudios moleculares, Kolkman et al. (2004) identificaron y caracterizaron tres genes de AHAS en el girasol (AHAS1, AHAS2 Y AHAS3) y demostraron que los genes resistentes a IMI y resistentes a SU eran variantes alelicas del mismo locus (AHASL1). Ademas, mostraron que el alelo resistente a iMi albergaba una mutacion C-a-T en el codon 205 (nomenclatura de Arabidopsis thaliana), mientras que el alelo resistente a SU albergaba una mutacion C-a-T en el codon 197 (Kolkman et al., 2004).

Resumen

[0006] Se proporcionan plantas de girasol que tienen resistencia multiple al herbicida segun la revindication 1. Las plantas son resistentes a al menos un herbicida de imidazolinona, un herbicida de sulfonilurea, un herbicida de triazolopirimidina y un herbicida de pirimidiniloxibenzoato y mezclas de estos herbicidas. Ventajosamente, las semillas de la planta tienen un contenido en aceite que es mayor del 40%, un rendimiento de semilla que es mas de una tonelada por hectarea y/o una planta de girasol que tiene una unica cabeza. En otras formas de realization, las plantas tienen combinaciones de estas caracteristicas. En algunas formas de realizacion, las plantas resistentes tienen un gen de AHAS que codifica una mutacion en los aminoacido 574 o su equivalente, que confiere aparentemente la caracteristica resistente, donde la mutacion puede ser la sustitucion de un triptofano en esa posicion con otro aminoacido, por ejemplo leucina. Formas de realizacion especificas incluyen plantas que contienen un gen AHASL1 que tienen la secuencia de nucleotidos expuesta en SEC ID n.°: 1, o una proteina AHASL1 que tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID n.°: 2.

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[0007] Moleculas de acidos nucleicos aislados que codifican genes de AHASL1 mutantes tambien se proporcionan, por ejemplo un acido nucleico aislado que contiene una secuencia SEC ID n.°: 1. Tambien se proporcionan celulas vegetales transformadas de forma estable con un acido nucleico que tiene la secuencia de SEC ID n.°: 1, y planta de girasol transgenica que contiene un transgen que contiene SEC ID n.°: 1. En otras formas de realizacion, las plantas contienen un casete de expresion que tiene un promotor activo en las plantas de girasol que esta operativamente enlazado con un acido nucleico aislado que codifica una proteina que tiene la secuencia codificada por SEC ID n.°: 1.

[0008] Tambien se describen metodos para controlar malas hierbas que rodean una planta de girasol resistente del tipo anteriormente descrito, aplicando un herbicida a los hierbajos y a la planta de girasol, donde el herbicida es un herbicida de imidazolinona, un herbicida de sulfonilurea, un herbicida de triazolopirimidina o un herbicida de pirimidiniloxibenzoato, o mezclas de estos herbicidas.

[0009] Tambien se proporcionan semillas de girasol y la planta crecida a partir de estas semillas. La plantas tienen resistencia al herbicida para un herbicida de imidazolinona, un herbicida de sulfonilurea, un herbicida de triazolopirimidina, un herbicida de pirimidiniloxibenzoato y sus mezclas derivadas. En formas de realizacion especificas, las plantas que crecen de la semilla tienen un contenido de aceite de semilla que es superior al 40%, un rendimiento de semilla que es mas de una tonelada por hectarea y/o una planta de girasol tiene una unica cabeza. Otras formas de realizacion incluyen combinaciones de las caracteristicas anteriormente mencionadas. Estas plantas pueden contener un mutante AHASL1 como se ha descrito anteriormente.

[0010] Tambien se han descrito metodos para mejorar la tolerancia al herbicida en una planta de girasol. Formas de realizacion preferidas incluyen la regeneracion de una celula de girasol en una planta de girasol donde la celula de girasol es transformada con un constructo que tiene una secuencia de acidos nucleicos que codifica de la proteina codificada por SEC ID n.°: 1, la regeneracion de la celula de girasol en una planta de girasol y la selection de plantas de flor fertiles que son vegetativas y reproductivas resistentes a una dosis efectiva de herbicida. El herbicida se selecciona del grupo que consiste en una sulfonilurea, una imidazolinona, un pirimidiniloxibenzoato, una triazolopirimidina y sus mezclas derivadas.

[0011] Tambien se proporcionan aqui metodos para producir una planta de girasol resistente al herbicida por retrocruce. Formas de realizacion preferidas incluyen cruce de una primera planta de girasol que tiene actividad de AHAS resistente al herbicida con una segunda planta de girasol que no tiene actividad de AHAS resistente al herbicida, donde la primera planta de girasol tiene un acido nucleico que codifica la proteina codificada por SEC ID n.°: 1. Ventajosamente, se selecciona la progenie de las plantas que tienen actividad de AHAS resistentes al herbicida. Ademas, formas de realizacion preferidas incluyen una semilla que tiene las caracteristicas resistentes al herbicida de la primera planta de girasol.

[0012] En una forma de realizacion especifica, una semilla de cultivo de girasol denominada RW-B esta provista. Esta semilla y la planta correspondiente tienen todas las caracteristicas fisiologicas, resistentes a los herbicidas y morfologicas anteriormente descritas. Una semilla representativa de este cultivo de girasol se ha depositado en la American Type Culture Collection (ATCC) bajo numero de acceso: PTA-9176.

[0013] Tambien se ha proporcionado un cultivo de tejido de celulas regenerables de las plantas de girasol resistentes anteriormente mencionadas. Formas de realizacion preferidas incluyen cultivos de tejido donde las celulas del cultivo de tejido comprenden una hoja, polen, un embrion, un cotiledon, un hipocotilo, celulas meristematicas, una raiz, una punta de raiz, un antera, una flor, una semilla, un vastago, ovulos, brotes, tallos, troncos, capsulas de medula o una vaina. Plantas de girasol resistentes se pueden generar a partir del cultivo de tejido anteriormente mencionado y expresar todas las caracteristicas morfologicas y fisiologicas del cultivo de girasol RW-B.

[0014] Otros objetos, caracteristicas y ventajas de la presente invention se haran aparentes a partir de la siguiente descripcion detallada.

Breve descripcion de los dibujos

[0015]

La figura 1 muestra el alineamiento de la secuencia de ADN parcial de la region codificante del gen AHASL1 a partir de la linea HA89, B770, la linea resistente RW-B, el gen ALS de Xantium sp. y Arabidopsis thaliana.

La figura 2 muestra la alineacion de secuencia de aminoacidos parcial de la proteina AHASL1 a partir de la linea HA89, B770, la linea resistente RW-B, el gen ALS de Xantium sp. y Arabidopsis thaliana.

La figura 3 muestra la herencia de resistencia a IMI en RW-B.

La figura 4 muestra el indice de fitotoxicidad de siete lineas de girasol pulverizadas con diferentes herbicidas inhibidores de AHAS en forma de tabla.

La figura 5 muestra la respuesta de plantas de girasol, resistentes (R) y susceptibles (S), a imazapir en una prueba de alelismo en generaciones F1, F2 y BC1F1.

La figura 6 muestra segregation del haplotipo AHAS1 y la reaction de plantas de girasol, resistentes (R) y susceptibles (S), a imazapir aplicadas a razon de 320 g a.i. ha-1

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La figura 7 muestra la secuencia de nucleotidos completa del gen AHASL1 de la linea RW-B (SEC ID n.°: 1).

La figura 8 muestra la secuencia de aminoacidos completa del gen AHASL1 de la linea RW-B (SEC ID n.°: 2).

La figura 9 muestra la reduccion en altura (como porcentaje de las plantas de control no tratadas) para 4 lineas que portan alelos mutantes diferentes en el locus AHASL1 de dias del girasol 14 despues de la aplicacion de indices aumentados de imazapir.

La figura 10 muestra el indice de fitotoxicidad para 4 lineas de girasol que portan alelos mutantes diferentes en el locus AHASL1 de girasol cuando se inoculan con indices aumentados de imazapir.

La figura 11 muestra curvas de respuesta a la dosis para biomasa de peso en seco sobre el suelo (como porcentaje de las plantas de control no tratadas) para 4 lineas de girasol que portan alelos mutantes diferentes en el locus AHASL1 cuando es inoculada con indices aumentados de imazapir.

La figura 12 muestra el indice de fitotoxicidad para 4 lineas de girasol que portan alelos mutantes diferente en el locus AHASL1 de girasol cuando son inoculadas con indices aumentados de metsulfuron.

La figura 13 muestra curvas de respuesta a la dosis se curva para biomasa de peso en seco sobre el suelo (como porcentaje de las plantas de control no tratadas) para 4 lineas de girasol que portan diferentes alelos mutantes en el locus AHASL1 cuando se inoculan con indices aumentados de metsulfuron.

Descripcion detallada

[0016] Se proporcionan plantas de girasol que tienen resistencia aumentada a los herbicidas con respecto a las plantas de girasol de tipo salvaje segun la reivindicacion 1. Estas plantas contienen una mutacion genetica nueva en el gen AHAS que confiere una resistencia de amplio espectro a los herbicidas inhibidores de AHAS, y esta mutacion ha sido identificada y caracterizada. La disponibilidad de esta mutacion nueva, junto con el uso de herbicidas inhibidores de AHAS disponibles, proporciona un sistema de produccion de planta de cultivo de girasol tolerante a los herbicidas y representa una opcion de control de hierbas nueva y potente para los productores de girasol.

[0017] Diferentes sustituciones de AHAS supondran resistencia a los inhibidores de AHAS; la magnitud de la resistencia a diferentes herbicidas inhibidores de AHAS, sin embargo, varia mucho entre sustituciones (Saari et al.,1994; Tranel and Wright,2002). Aunque existen excepciones, la resistencia provocada por un AHAS alterado se puede clasificar generalmente en tres tipos basandose en la resistencia de cruce: (1) resistencia especifica de SU, (2) resistencia especifica de IMI y (3) resistencia cruzada amplia. Mutaciones puntuales que dan como resultado sustituciones de prolina (Pro)197 confieren altos niveles de resistencia a la sulfonilurea con solo pequenos aumentos en la resistencia a las imidazolinonas y las triazolopirimidinas (Haughn et al.,1988; Lee et al.,1988; Guttieri et al.,1992; Harms et al.,1992; Mourad and King 1992; Guttieri et al.,1995; Wright et al.,1998). Las sustituciones de alanina (Ala)205, por otro lado, muestran una amplia resistencia cruzada, sin embargo, los niveles de resistencia son moderados (Saari et al., 1994; Tranel and Wright, 2002). Las substituciones de (Ala)122 dan como resultado resistencia a IMI pero no a Su (vease, por ejemplo, Sala et al., 2008 a & b).

[0018] Las caracteristicas y los genes de resistencia a herbicidas inhibidores de AHAS en girasol han recibido nombres diferentes. El alelo resistente a IMI fue designado como Imr1 (Bruniard and Miller, 2001), Arpur o A205V (Kolkman et al. 2004) o AHASL1-1 (vease, por ejemplo, Sala et al. 2008b) y la caracteristica fue denominada IMISUN. El alelo resistente a SU fue designado como Arkan o P197L (Kolkman et al. 2004) o AHASL1-2 (vease, por ejemplo, Sala et al., 2008b) y la caracteristica se conoce como SURES. El alelo altamente resistente a IMI presente en CLHA-Plus fue designado como AHASL1-3 o A122T (vease, por ejemplo, Sala et al., 2008b).

[0019] Los presentes inventores sorprendentemente descubrieron que una mutacion nueva en el codon 574 (nomenclatura de Arabidopsis thaliana) del gen de girasol AHASL1 confiere altos niveles, y resistencia de amplio espectro a al menos cuatro de las cinco familias de herbicidas inhibidores de AHAS. Esta mutacion unica, que cambia un triptofano en una leucina en la proteina de AHAS, es responsable de esta amplitud destacable de resistencia al herbicida donde los girasoles de la invention de forma imprevista tienen resistencia a todos los herbicidas IMI, SU, TP y POB. Por consiguiente, esta mutacion nueva proporciona varias ventajas tecnologicas sobre todas las mutaciones resistentes actualmente conocidas en el girasol. Estas ventajas incluyen, pero de forma no limitativa, la capacidad para: aplicar nuevos tipos de herbicidas a plantas de cultivo de girasol que ordinariamente no se podrian aplicar sin que afectara negativamente al propio girasol; aplicar una mezcla de dos o mas herbicidas al mismo tiempo a plantas de cultivo de girasol que de otro modo no sedan combinables; variar el tiempo y tipo de aplicacion herbicida al girasol; y aplicar mas de una post emergencia herbicida debido a resistencia sobrante.

[0020] Se proporcionan metodos para combatir la vegetation no deseada o controlar los hierbajos tratando las semillas de girasol de las plantas resistentes con un herbicida inhibidor de AHAS o una mezcla de herbicidas antes de la siembra y/o despues de la pregerminacion. Las semillas tratadas son luego sembradas, por ejemplo, en el suelo en un campo o en un medio de encapsulamiento en el invernadero. Las plantas resultantes tambien se pueden tratar con un herbicida inhibidor de AHAS o una mezcla de herbicidas para combatir vegetacion no deseada y/o para controlar hierbajos en la proximidad inmediata de las plantas de girasol.

[0021] Experimentos de retrocruce asistido por marcadores permitieron el desarrollo de plantas de girasol resistentes al herbicida multiples comercialmente utiles descritas aqui. En el retrocruce, la selection directa se puede aplicar donde un locus genetico actua como una caracteristica parcialmente dominante tal como con la caracteristica de resistencia al

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herbicida. Para seleccionar las plantas de girasol de las invenciones, los descendientes del cruce inicial fueron pulverizados con el herbicida antes del retrocruce. Las plantas eliminadas con la pulverizacion que no tuvieron la caracteristica de resistencia al herbicida deseada, y las planta que tenian el gen de resistencia herbicida se usaron en retrocruzamientos posteriores. Este proceso fue repetido para todas las generaciones de retrocruce adicionales, hasta que se obtuvieron las plantas que se producian de verdad para resistencia a multiples herbicidas.

[0022] Ademas de resistencia al herbicida, las plantas de girasol tambien tienen otras muchas caracteristicas ventajosas. Asi, las semillas de girasol tienen una o mas de las siguientes caracteristicas, un contenido en aceite mayor del 40%, un rendimiento de semilla de mas de una tonelada por hectarea y una planta de girasol que tiene una unica cabeza. Sorprendentemente, estas caracteristicas se encuentran en combinaciones entre si y con la resistencia al herbicida de amplio espectro conferida por la mutacion en el codon 574.

[0023] Debido a que las plantas de girasol descritas aqui son, notablemente, resistentes a cuatro o mas familias de herbicidas, los agricultores pueden tratar las plantas de cultivo con una gama mas amplia de herbicidas que lo que habia previamente disponible para el uso con girasoles. Controlar hierbajos en las plantas de cultivo de girasol es necesario para evitar el crecimiento pobre y la perdida de rendimiento, y la capacidad de usar mas de un herbicida al mismo o en momentos diferentes durante la temporada de crecimiento proporciona ventajas de control de hierbajos significativas sobre las variedades de girasol convencionales. Por ejemplo, debido a que los girasoles que crecen a partir de semillas pueden tardar hasta dos semanas en aparecer, los hierbajos pueden muy facilmente establecerse y luego hacer sombra a las semillas de girasol, lo que impedira el crecimiento de los girasoles. Sin control, la competicion de las hierbas en las plantas de cultivo de girasol lleva a mayores perdidas economicas para los productores debido a reducciones del rendimiento que alcanzan hasta un 50%. Las plantas de la presente invention evitan estos problemas porque su resistencia a mas de una familia de herbicida existente permite protocolos de aplicacion de herbicidas mejorados.

[0024] Otra ventaja de resistencia al herbicida para familias multiples de herbicidas es que los agricultores pueden comercialmente explotar plantas de cultivo de girasol sin los gastos adicionados del desarrollo de nuevos herbicidas. Herbicidas de cultivo de girasol nuevos no son faciles de desarrollar debido al alto coste de registro del herbicida. Las resistencias multiples a herbicidas conocidos es tambien ventajosa para las plantas de cultivo de girasol susceptibles de danos por arrastre. El arrastre se produce cuando los herbicidas de la planta de cultivo precedente afecta al crecimiento de la planta de cultivo actual. Tener resistencia a herbicidas multiples reduce el dano provocado a las plantas de cultivo de girasol debido al arrastre. Ademas, la capacidad aumentada para controlar los hierbajos en las plantas de girasol de la invencion significa que problemas de hierbajos futuros en las plantas de cultivo cultivadas despues de los girasoles tambien estan limitadas.

[0025] En el contexto de la presente invencion, los terminos “tolerante a los herbicidas” y “resistente a los herbicidas” se usan de forma intercambiable y tienen un significado equivalente y un alcance equivalente. De forma similar, los terminos “tolerancia a los herbicidas” y “resistencia a los herbicida” se usan de forma intercambiable y tienen un significado equivalente y un alcance equivalente. Asimismo, los terminos para las familias de herbicidas, por ejemplo “resistente a la imidazolinona” y “resistencia a la imidazolinona”, se usan de forma intercambiable y tienen significados equivalentes y ambitos como los terminos “tolerante a la imidazolinona” y “tolerancia a la imidazolinona”, respectivamente.

[0026] Polinucleotidos AHASL resistentes a los herbicidas y proteinas AHASL resistentes a los herbicidas se proporcionan. El termino “polinucleotido AHASL resistente a los herbicidas” se refiere, para fines de esta invencion, a un polinucleotido que codifica una proteina que comprende actividad de AHAS resistente a los herbicidas. Un “proteina AHASL tolerante a los herbicidas” o “proteina AHASL resistente a los herbicidas,” es una proteina AHASL que muestra actividad de AHAS hasta cierto grado mas alta, con respecto a la actividad de AHAS de una proteina AHASL de tipo salvaje, cuando esta en presencia de al menos un herbicida que es conocido por interferir con la actividad de AHAS y en una concentration o nivel del herbicida que es conocido por inhibir la actividad de AHAS de la proteina AHASL de tipo salvaje. Una planta “tolerante a los herbicidas” o “resistente a los herbicidas” es una planta que es tolerante o resistente a al menos un herbicida, aplicado en una cantidad especifica, que normalmente mataria o inhibiria el crecimiento de una planta normal o de tipo salvaje. En una forma de realization, las plantas tolerantes a los herbicidas de la presente invencion comprenden una proteina AHASL tolerante a los herbicidas o resistente a los herbicidas. Aunque publicaciones recientes sugieren designaciones de nomenclatura diferentes, aqui y en todas partes, el termino AHASL se usara para representar la subunidad catalitica o grande (L) de la enzima AHAS. Vease, por ejemplo, Duggleby et al., 2008 Plant Physiol. Biochem. 46: 309-324.

[0027] Ademas, una proteina AHASL tolerante a los herbicidas o resistente a los herbicidas se puede introducir en una planta de girasol por transformation de una planta o ancestro de la misma con una secuencia de nucleotidos que codifica una proteina AHASL tolerante a los herbicidas o resistente a los herbicidas. Tales proteinas AHASL tolerantes a los herbicidas o resistentes a los herbicidas son codificadas por los polinucleotidos AHASL tolerantes a los herbicidas o resistentes a los herbicidas. Alternativamente, una proteina AHASL tolerante a los herbicidas o resistente a los herbicidas puede producirse en una planta de girasol como resultado de una mutacion de origen natural o inducida en un gen AHASL endogeno en el genoma de una planta o progenitor de la misma. La presente invencion proporciona plantas de girasol, tejidos de planta, celulas vegetales y celulas huesped con resistencia o tolerancia aumentada a uno o

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varios herbicidas, incluyendo, pero no limitado a, un herbicida I MI, un herbicida SU, un herbicida TP, un herbicida POB. Ventajosamente, la plantas tienen resistencia o tolerancia aumentada a dos o mas de los herbicidas anteriores y, mas ventajosamente, resistencia o tolerancia aumentada a tres o mas de los herbicidas anteriores. De forma mas ventajosa, la plantas tienen resistencia o tolerancia aumentada a cuatro o mas de los herbicidas anteriores.

[0028] La cantidad o concentration preferida del herbicida que se aplica a las plantas o las semillas como se describe en este caso es una “cantidad eficaz” o “concentracion eficaz”. Los terminos “cantidad eficaz” y “concentracion eficaz” se refieren, para fines de esta invention, a una cantidad y concentracion, respectivamente, que es suficiente para matar o inhibir el crecimiento de una planta, tejido vegetal, celula vegetal o celula huesped similar de tipo salvaje, pero que dicha cantidad no mata o inhibe tan seriamente el crecimiento de las plantas resistentes al herbicida, tejidos de planta, celulas vegetales y celulas huesped de la presente invencion. Tipicamente, una cantidad eficaz de un herbicida es una cantidad que se usa de forma rutinaria en sistemas de production agricolas para matar hierbajos de interes. Tal cantidad se conoce por las personas expertas en la materia. Una planta, tejido vegetal, celula vegetal o celula huesped de tipo salvaje,” es una planta, tejido vegetal, celula vegetal o celula huesped, respectivamente, que carece de caracteristicas de resistencia a los herbicidas y/o polinucleotido particular de la invencion. El termino “tipo salvaje” no implica que una planta, tejido vegetal, celula vegetal u otra celula huesped carezca de ADN recombinante en su genoma, y/o no posea caracteristicas resistentes a los herbicidas que sean diferentes a los aqui descritos. El termino “planta” se refiere a una planta en cualquier fase de desarrollo, al igual que cualquier parte o partes de una planta que se pueda unir o separar de una planta intacta entera. Tales partes de una planta incluyen, pero de forma no limitativa, organos, tejidos y celulas de una planta. Ejemplos de partes de planta particular incluyen un vastago, una hoja, una raiz, una florescencia, una flor, un flosculo, una fruta, un pediculo, un pedunculo, un estambre, un antera, un estigma, un estilo, un ovario, un petalo, un sepalo, un carpelo, una punta de raiz, una cofia radicular, un pelo de raiz, un pelo de hoja, un pelo de semilla, un grano de polen, una microespora, un cotiledon, un hipocotilo, un epicotilo, xilema, floema, parenquima, endospermo, una celula acompanante, una celula guarda y cualquiera de los demas organos, tejidos y celulas de una planta conocidos. Ademas, se reconoce que una semilla es una planta.

[0029] La presente invencion describe una planta de girasol que tiene resistencia aumentada a un herbicida IMI, un herbicida SU, un herbicida TP, un herbicida POB, y/o mezclas derivadas en comparacion con una variedad de tipo salvaje de la planta. Se proporciona aqui una description detallada del cultivo y selection de plantas de girasol que tienen tal resistencia aumentada a un herbicida IMI, un herbicida SU, un herbicida TP, un herbicida POB, y/o mezclas derivadas. Una planta derivada de estos procedimientos se deposita en el ATCC (Patent Deposit Designation Number PTA-9176) y se designa aqui como la variedad de girasol RW-B. Un deposito de 2.500 semillas de la variedad de girasol RW-B se hizo en la American Type Culture Collection el 25 de abril de 2008. Este deposito se hizo conforme a los terminos y provisiones del Tratado de Budapest sobre el deposito de microorganismos. El deposito se hizo por un periodo de al menos treinta anos y al menos cinco anos despues de que se haya producido una solicitud mas reciente de suministro de una muestra del deposito recibida por el ATCC.

[0030] Las plantas de girasol de la presente invencion incluyen tanto plantas no transgenicas como plantas transgenicas. Un “planta no transgenica” es una planta que carece de ADN recombinante en su genoma. Un “planta transgenica” es una planta que comprende ADN recombinante en su genoma y se pueden producir por introduction de ADN recombinante en el genoma de la planta. Cuando tal ADN recombinante se incorpora al genoma de la planta transgenica, la progenie de la planta puede tambien comprender el ADN recombinante. Una planta progenie que comprende al menos una parte del ADN recombinante de al menos una planta transgenica madre es tambien una planta transgenica. Un ejemplo de una planta de girasol no transgenica que tiene resistencia aumentada a un herbicida IMI, un herbicida SU, un herbicida TP, un herbicida POB y/o mezclas derivadas es la planta de girasol RW-B o un derivado geneticamente modificado de la planta de girasol RW-B, o de cualquier descendiente de la planta de girasol RW-B, o una planta que comprende las caracteristicas de tolerancia al herbicida de la planta de girasol RW-B.

[0031] Las plantas de girasol se pueden propagar a traves de tecnicas de cultivo de tejido y celular. Esencialmente, cualquier tejido vegetal con celulas capaces de division celular se puede usar para la propagation de la planta a traves de tecnicas de cultivo de tejido y celular. Los cultivos se pueden comenzar a partir de una hoja, polen, un embrion, un cotiledon, un hipocotilo, celulas meristematicas, una raiz, una punta de raiz, un antera, una flor, una semilla, un vastago, ovulos, brotes, tallos, varillas, capsula de mesocarpio o una vaina. Los tejidos tomados del area vascular de tallos y raices son especialmente adecuados. Las patentes de EE.UU. n°.: 4.670.391, 4.670.392, 4.673.648, 4.681.849, 4.687.743 y 5.030.572 describen metodos para regenerar plantas de girasol a partir de cultivos celulares derivados de tejidos de girasol. El estado de la tecnica es tal que metodos ejemplares de obtencion de plantas de girasol a partir de cultivos de celulas y cultivos de tejidos son ahora bien conocidos por un experto en la materia. Una variedad de tecnicas de cultivo de plantas se puede utilizar para regenerar plantas enteras, tal y como se describe en Gamborg and Phillips, “Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods”, Springer Berlin, Evans et al. “Protoplasts Isolation and Culture”, Handbook of Plant Cell Culture, Macmillian Publishing Company, New York,1983; o Binding, “Regeneration of Plants, Plant Protoplasts”, CRC Press, Boca Raton,1985; o en Klee et al., Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467 (1987). Descripciones detalladas de sistemas de cultivo para Helianthus annuus se pueden encontrar en Capitulo 11, Sunflower Biotechnology, Bidney, D. L. and Scelonge,C. J., paginas 559-593 y referencias citadas en el, Sunflower Technology and Production, editado por A. A. Schneiter, Agronomy 35, editores, American Society of Agronomy Inc. 1997, Transformation of Sunflower.

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[0032] Plantas de girasol resistentes a los herbicidas se pueden producir usando metodos de cultivo de tejido para seleccionar celulas vegetales que comprendan mutaciones de resistencia a los herbicidas y luego regenerar plantas resistentes a los herbicidas a partir de ellas. Vease, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n°.: 5.773.702 y 5.859.348. Detalles adicionales de cultivo con mutacion se pueden encontrar en “Principals of Cultivar Development” Fehr, 1993 Macmillan Publishing Company.

Un gen mutante y su proteina codificada confieren amplia resistencia al herbicida en plantas de girasol

[0033] Los presentes inventores han descubierto que la substitucion por el triptofano en la posicion del aminoacido 574, o una posicion equivalente (nomenclatura de Arabidopsis thaliana), en una proteina AHASL puede hacer que una planta de girasol exprese esa proteina que ha mejorado resistencia a un herbicida, particularmente un herbicida IMI, un herbicida SU, un herbicida TP, un herbicida POB y/o mezclas derivadas. Mas especificamente, esta proteina mutante confiere resistencia a herbicidas multiples en las plantas.

[0034] Por consiguiente, las plantas de girasol resistentes a los herbicidas descritas aqui incluyen, pero de forma no limitativa, plantas de girasol que tienen en sus genomas al menos una copia de un polinucleotido AHASL que codifica una proteina AHASL resistente a los herbicidas que tiene una sustitucion de leucina en la posicion del aminoacido 574 (nomenclatura de Arabidopsis thaliana). Ademas, los expertos en la materia reconoceran que tales posiciones de aminoacidos pueden variar dependiendo de si los aminoacidos son agregados o retirados de, por ejemplo, el extremo N- terminal de una secuencia de aminoacidos. Asi, formas de realization de la presente invention abarcadas aqui incluyen sustituciones de aminoacidos en la posicion nombrada o posicion equivalente (por ejemplo, “posicion del aminoacido 574 o posicion equivalente”).

[0035] Una unica sustitucion de aminoacido que puede utilizarse para producir proteinas AHASL de girasol resistentes a los herbicidas se proporciona junto con los polinucleotidos que codifican tales proteinas, y plantas resistentes a los herbicidas, tejidos de planta, celulas vegetales y semillas que portan esta mutacion. Tambien se proporcionan polinucleotidos AHASL1, AHASL2 Y AHASL3 de girasol aislados que codifican proteinas AHASL1, AHASL2 Y AHASL3 resistentes a los herbicidas, respectivamente. Tales proteinas AHASL1 AHASL2 y AHASL3 resistentes a los herbicidas comprenden cada una un aminoacido diferente del triptofano en la posicion 574 o posicion equivalente (nomenclatura de Arabidopsis thaliana). Preferiblemente, en tales proteinas AHASL1, AHASL2 y AHASL3 resistentes a los herbicidas, el aminoacido en la posicion 574 o posicion equivalente es leucina.

[0036] Ademas, se proporcionan polipeptidos aislados que codifican proteinas AHASL. Los polipeptidos aislados codifican una secuencia de aminoacidos que tiene las secuencias de aminoacidos expuestas en la FIG. 8 (secuencia de aminoacidos del gen AHASL1 de la linea RW-B, SEC ID n.°: 2), las secuencias de aminoacidos codificadas por secuencias de nucleotidos expuestas en la FIG. 7 (secuencia de nucleotidos del gen AHASL1 de la linea RW-B, SEC ID n.°: 1), y fragmentos funcionales y variantes de dichas secuencias de aminoacidos que codifican un polipeptido AHASL que comprende actividad de AHAS.

[0037] Las deleciones, inserciones y sustituciones de las secuencias proteinicas abarcadas aqui no se espera que produzcan cambios radicales en las caracteristicas de la proteina. Sin embargo, cuando es dificil predecir el efecto exacto de la sustitucion, deletion o insertion antes de hacerla, un experto en la tecnica apreciara que el efecto sera evaluado por ensayos de selection rutinarios. Esto es, la actividad se puede evaluar por ensayos de actividad de AHAS. Vease, por ejemplo, Singh et al. (1988) Anal. Biochem. 171: 173-179. Adicionalmente, las proteinas descritas aqui abarcan tanto proteinas de origen natural como variaciones y formas modificadas de las mismas. Tales variantes seguiran poseyendo la actividad de AHAS deseada.

[0038] La invencion tambien proporciona polinucleotidos y proteinas aislados o purificados. Una molecula de polinucleotido o proteina “aislada” o “purificada”, o parte biologicamente activa de la misma, esta sustancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente acompanan o interactuan con la molecula de polinucleotido o proteina como se encuentra en su ambiente de origen natural. Asi, una molecula de polinucleotidos o proteina aislada o purificada esta sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce por tecnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores quimicos u otros productos quimicos cuando se sintetizan quimicamente. Preferiblemente, un acido nucleico “aislado” esta libre de secuencias (preferiblemente secuencias codificantes de proteina) que naturalmente flanquean el acido nucleico (es decir, secuencias localizadas en las extremidades 5' y 3' del acido nucleico) en el ADN genomico del organismo del que se deriva el acido nucleico. Por ejemplo, en varias formas de realizacion, la molecula de polinucleotido aislado puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 Kb, 3 Kb, 2 Kb, 1 Kb, 0,5 Kb, 0,4 Kb, 0,3 Kb, 0,2 Kb o 0,1 kb de secuencias de nucleotidos que naturalmente flanquean la molecula de polinucleotido en el ADN genomico de la celula de la que se deriva el acido nucleico. Una proteina que esta sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteina que tienen menos de aproximadamente 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1% (por peso en seco) de proteina contaminante. Cuando la proteina de la presente invencion o parte biologicamente activa de la misma se produce de forma recombinante, preferiblemente el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1% (por peso en seco) de precursores quimicos o productos quimicos de interes no proteicos.

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[0039] Se proporcionan moleculas de polinucleotidos aislados que tienen secuencias de nucleotidos que codifican proteinas AHASL y las proteinas correspondientes. Tambien se proporcionan secuencias de nucleotidos que codifican una proteina AHASL resistente a los herbicidas a partir de una planta de girasol resistente a los herbicidas. En una forma de realization, las proteinas AHASL de girasol resistentes a los herbicidas tienen una sustitucion triptofano-a- leucina en la position del aminoacido 574 o position equivalente (nomenclatura de Arabidopsis thaliana) cuando se compara con la secuencia de aminoacidos de tipo salvaje correspondiente. En particular, se proporcionan moleculas de polinucleotidos aislados que comprenden secuencias de nucleotidos que codifican las secuencias de aminoacidos mostradas en la FIG. 8 y fragmentos y variantes de las mismas que codifican polipeptidos que comprenden actividad de AHAS. Ademas, se proporcionan polipeptidos que tienen una secuencia de aminoacidos codificada por una molecula de polinucleotido descrita aqui, por ejemplo las expuestas en la FIG. 7, y fragmentos y variantes de las mismas que codifican polipeptidos que comprenden actividad de AHAS.

[0040] Ademas, el experto en la materia apreciara tambien que cambios se pueden introducir por mutation en las secuencias de nucleotidos de la invention llevando asi a cambios en la secuencia de aminoacidos de las proteinas AHASL codificadas sin alterar la actividad biologica de las proteinas AHASL. As^ una molecula de polinucleotido aislado que codifica una proteina AHASL que tiene una secuencia que difiere de la de SEC ID n.°: 2, se puede crear por introduction de una o mas sustituciones, adiciones o deleciones de nucleotidos en la secuencia de nucleotidos correspondiente descrita aqui, de manera que una o mas sustituciones, adiciones o deleciones de aminoacidos se introduzcan en la proteina codificada. Se pueden introducir mutaciones por tecnicas estandar, tales como mutagenesis dirigida al sitio y mutagenesis mediada por PCR.

[0041] Las moleculas de polinucleotidos AHASL resistentes a los herbicidas aislados de la invencion se pueden usar en constructos polinucleotidos para la transformation de plantas, particularmente plantas de cultivo, para mejorar la resistencia de las plantas a los herbicidas, particularmente herbicidas que son conocidos por inhibir la actividad de AHAS, mas particularmente un herbicida I MI, un herbicida SU, un herbicida TP, herbicida POB y/o mezclas derivadas. Tales constructos polinucleotidos se pueden usar en los casetes de expresion, vectores de expresion, vectores de transformacion, plasmidos y similares. Las plantas transgenicas obtenidas tras la transformacion con tales constructos polinucleotidos muestran resistencia aumentada para herbicidas inhibidores de AHAS tales como, por ejemplo, un herbicida IMI, un herbicida SU, un herbicida TP, un herbicida POB y/o mezclas derivadas.

[0042] Las moleculas de polinucleotidos aislados que tienen una secuencia de nucleotidos que codifica una proteina AHASL mutante como se ha descrito anteriormente se pueden usar en vectores para transformar plantas de modo que las plantas creadas tengan resistencia a los herbicidas mejorada, particularmente a un herbicida IMI, un herbicida SU, un herbicida TP, un herbicida POB y/o mezclas derivadas. Las moleculas de polinucleotidos AHASL aislados de la presente invencion se pueden usar en vectores solas o en combination con una secuencia de nucleotidos que codifica la subunidad pequena de la enzima AHAS (AHASS) confiriendo la resistencia al herbicida en plantas. Vease la patente de EE.UU. n° 6.348.643.

[0043] Moleculas de polinucleotidos que difieren de las secuencias de nucleotidos descritas aqui estan tambien abarcadas por la presente invencion. Las secuencias de nucleotidos de la presente invencion incluyen aquellas secuencias que codifican las proteinas AHASL descritas aqui pero que difieren de forma conservadora debido a la degeneracion del codigo genetico. Estas variantes alelicas de origen natural se pueden identificar con el uso de tecnicas de biologia molecular bien conocidas, tal como reaction en cadena de polimerasa (PCR) y tecnicas de hibridacion como se esboza por debajo. Las secuencias de nucleotidos tambien incluyen secuencias de nucleotidos sinteticamente derivadas que han sido generadas, por ejemplo, usando mutagenesis dirigida al sitio pero que aun codifican la proteina AHASL. Generalmente, variantes de la secuencia de nucleotidos de la presente invencion tendran al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de nucleotidos particular descrita aqui. La secuencia de nucleotidos AHASL codificara una proteina AHASL, respectivamente, que tiene una secuencia de aminoacidos que tiene al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de una proteina AHASL descrita aqui.

[0044] Formas de realizacion de la invencion tambien se refieren a un vector de expresion de planta que tiene un promotor que dirige la expresion en una planta operativamente enlazada a una molecula de polinucleotido aislado de la presente invencion. La molecula de polinucleotido aislado comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una proteina AHASL, o un fragmento funcional y variante de la misma. Los vectores de expresion de planta de las formas de realizacion de la presente invencion no dependen de un promotor particular, solo que tal promotor es capaz de dirigir la expresion genica en una celula vegetal. Promotores preferidos incluyen promotores constitutivos y promotores preferidos del tejido.

[0045] Los vectores de transformacion pueden utilizarse para producir plantas transformadas con un gen de interes. El vector de transformacion tendra gen marcador seleccionable de la presente invencion y un gen de interes que se va a introducir y tipicamente expresado en la planta transformada. Tal gen marcador seleccionable tiene un polinucleotido AHASL resistente al herbicida de la presente invencion operativamente enlazado a un promotor que dirige la expresion en una celula huesped. Para su uso en plantas y celulas vegetales, el vector de transformacion tiene un gen marcador seleccionable que comprende un polinucleotido AHASL resistente a los herbicidas de la presente invencion

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operativamente enlazado a un promotor que dirige la expresion en una celula vegetal. Los genes de interes de la presente invencion varian dependiendo de los resultados deseados. Por ejemplo, varios cambios en el fenotipo pueden ser de interes, incluyendo la modificacion de la composition del acido graso en una planta, alteration del contenido de aminoacido de una planta, alteracion de un insecto de planta y/o mecanismos de defensa patogena y similares. Estos resultados se pueden conseguir proporcionando expresion de productos heterologos o expresion aumentada de productos endogenos en las plantas. Alternativamente, los resultados se pueden conseguir proporcionando una reduccion de la expresion de uno o mas productos endogenos, particularmente enzimas o cofactores en la planta. Estos cambios suponen un cambio en el fenotipo de la planta transformada.

[0046] En una forma de realization, los genes de interes incluyen genes de resistencia a los insectos tales como, por ejemplo, genes de proteina de toxina de Bacillus thuringiensis (Patente de EE.UU. n.: 5.366.892, 5.747.450, 5.736.514, 5.723.756, 5.593.881; y Geiser et al. (1986) Gene 48: 109). Las proteinas o polipeptidos AHASL descritos aqui se pueden purificar a partir de, por ejemplo, plantas de girasol. Tambien, una molecula de polinucleotido aislado que codifica una proteina AHASL de la presente invencion puede utilizarse para expresar una proteina AHASL de la presente invencion en un microbio tal como E. coli o una levadura. La proteina AHASL expresada se puede purificar a partir de extractos de E. coli o levadura por cualquier metodo conocido por los expertos en la materia.

[0047] Las formas de realizacion de la presente invencion abarcan moleculas de polinucleotidos AHASL y fragmentos y variantes de las mismas. Para fines de esta invencion, el termino “fragmentos y variantes” se refiera a fragmentos y variantes de los polipeptidos ejemplificados que comprenden actividad de AHAS. En formas de realizacion determinadas, los metodos implican el uso de plantas tolerantes a los herbicidas o resistentes a los herbicidas. Un fragmento de una secuencia de nucleotidos AHASL de la presente invencion puede codificar una parte biologicamente activa de una proteina AHASL, o puede ser un fragmento que se puede usar como una sonda de hibridacion o cebador PCR usando metodos descritos mas abajo. Una parte biologicamente activa de una proteina AHASL se puede preparar por aislamiento de una parte de una de las secuencias de nucleotidos AHASL de la presente invencion, expresando la parte codificada de la proteina AHASL (por ejemplo, por expresion recombinante in vitro) y evaluando la actividad de la parte codificada de la proteina AHASL1. Moleculas de polinucleotidos que son fragmentos de una secuencia de nucleotidos AHASL comprenden al menos aproximadamente 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 nucleotidos, o hasta el numero de nucleotidos presentes en una secuencia de nucleotidos en toda su longitud descrita aqui dependiendo del uso destinado.

[0048] Un fragmento de una secuencia de nucleotidos AHASL que codifica una parte biologicamente activa de una proteina AHASL de la presente invencion codificara al menos aproximadamente 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325 o 350 aminoacidos contiguos, o hasta el numero total de aminoacidos presente en una proteina AHASL en toda su longitud de la presente invencion. Fragmentos de una secuencia de nucleotidos AHASL que son utiles como sondas de hibridacion para cebadores de PCR necesitan no codificar una parte biologicamente activa de una proteina AHASL.

[0049] Secuencias de nucleotidos AHASL variantes se pueden hacer por introduction de mutaciones de forma aleatoria a lo largo de toda o parte de una secuencia codificante AHASL, tal como por mutagenesis de saturation, y los mutantes resultantes se pueden seleccionar para actividad de AHAS para identificar mutantes que retengan actividad de AHAS, incluyendo actividad de AHAS resistente a los herbicidas. Tras la mutagenesis, la proteina codificada se puede expresar de forma recombinante, y la actividad de la proteina se puede determinar utilizando tecnicas de ensayo estandar. Asi, las secuencias de nucleotidos de la invencion incluyen las secuencias descritas aqui al igual que fragmentos y variantes de las mismas. Las secuencias de nucleotidos AHASL de la presente invencion, y fragmentos y variantes de las mismos, se pueden usar como sondas y/o cebadores para identificar y/o clonar homologias AHASL en otras plantas, tales sondas pueden utilizarse para detectar transcritos o secuencias genomicas que codifican las mismas proteinas o proteinas identicas. De esta manera, metodos tales como PCR, hibridacion y similares puede utilizarse para identificar tales secuencias que tienen identidad sustancial con las secuencias de la presente invencion. Vease, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY) y Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY). Secuencias de nucleotidos AHASL aisladas basadas en su identidad de secuencia con las secuencias de nucleotidos AHASL expuestas aqui o con fragmentos y variantes de las mismas estan abarcados por la presente invencion.

Transgenesis

[0050] Se describen aqui metodos para crear una planta transgenica que sea resistente a los herbicidas. Los metodos incluyen la transformation de una planta con un vector de expresion de planta que tiene un promotor que dirige la expresion en una planta que esta operativamente enlazada con una molecula de polinucleotido aislado de la invencion. La molecula de polinucleotido aislado tiene una secuencia de nucleotidos que codifica una proteina AHASL o un fragmento funcional y variante de las secuencias de aminoacidos.

[0051] Las formas de realizacion de la presente invencion proporcionan plantas, organos vegetales, tejidos vegetales, celulas vegetales, semillas y celulas huesped no humanas que se transforman con al menos una molecula de polinucleotido, casete de expresion o vector de transformacion de la invencion. Tales plantas transformadas, organos

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vegetales, tejidos vegetales, celulas vegetales, semillas y celulas huesped no humanas tienen tolerancia o resistencia mejorada a al menos un herbicida, a niveles del herbicida que mata o inhibe el crecimiento de una planta no transformada, tejido vegetal, celula vegetal o celula huesped no humana, respectivamente.

[0052] Los polinucleotidos AHASL descritos aqui se usan en metodos para mejorar la resistencia de plantas tolerantes a los herbicidas. En una forma de realizacion, las plantas tolerantes a los herbicidas tienen una proteina AHASL tolerante a los herbicidas o resistente a los herbicidas. Las plantas tolerantes a los herbicidas incluyen tanto plantas transformadas con una secuencias de nucleotidos AHASL tolerante a los herbicidas como plantas que tienen en sus genomas un gen endogeno que codifica una proteina AHASL tolerante a los herbicidas. Secuencias de nucleotidos que codifican proteinas AHASL tolerantes a los herbicidas y plantas tolerantes a los herbicidas que tienen un gen endogeno que codifica una proteina AHASL tolerante a los herbicidas incluyen los polinucleotidos y las plantas descritas aqui y las que se conocen en la tecnica. Vease, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n°.: 5,013,659, 5,731,180, 5,767,361, 5,545,822, 5,736,629, 5,773,703, 5,773,704, 5,952,553 y 6,274,796. Tales metodos para mejorar la resistencia de plantas tolerantes a los herbicidas comprenden la transformation de una planta tolerante a los herbicidas con al menos una construction de polinucleotidos que tiene un promotor que dirige la expresion en una celula vegetal que esta operativamente enlazada a un polinucleotido AHASL resistente a los herbicidas de la invention, particularmente el polinucleotido codifica una proteina AHASL resistente a los herbicidas y fragmentos y variantes dichos de polinucleotidos que codifican polipeptidos que comprenden actividad de AHAS resistente a los herbicidas. Ninguna de las proteinas AHASL antes de la presente invencion fueron capaces, sin embargo, de conferir el amplio espectro y la potente resistencia al herbicida obtenidos utilizando el gen AHASL de la presente invencion.

[0053] Numerosos vectores de transformacion de planta y metodos para transformar plantas estan disponibles. Vease, por ejemplo, An, G. et al. (1986) Plant Physiol. 81:301-305; Fry, J., et al. (1987) Plant Cell Rep. 6:321-325; Block, M. (1988) Theor. Appl Genet.76:767-77; Hinchee, et al. (1990) Stadler. Genet. Symp. 203212.203-212; Cousins et al. (1991) Aust. J. Plant Physiol,18:481-494; Chee, P. P. y Slightom, J. L. (1992) Gene 118:255-260; Christou, et al. (1992) Trends. Biotechnol. 10:239-246; D'Halluin, et al. (1992) Bio/Technol. 10:309-314; Dhir, et al. (1992) Plant Physiol. 99:8188; Casas et al. (1993) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:11212-11216; Christou, P. (1993) In Vitro Cell. Dev. Biol- Plant; 29P:119-124; Davies, et al. (1993) Plant Cell Rep. 12:180-183; Dong, J. A. and Mchughen, A. (1993) Plant Sci. 91: 139148; Franklin, C. I. y Trieu, T. N. (1993) Plant Physiol. 102:167; Golovkin, et al. (1993) Plant Sci. 90:41-52; Guo Chin ScL Bull. 38:2072-2078; Asano, et al. (1994) Plant Cell Rep. 13; Ayeres N. M. and Park, W. D. (1994) Crit. Rev. Plant. Sci. 13:219-239; Barcelo, et al. (1994) Plant. J. 5:583-592; Becker, et al.,(1994) Plant. J. 5:299-307; Borkowska et al. (1994) Acta. Physiol. Plant 16:225-230; Christou, P. (1994) Agro. Food. Md Hi Tech. 5: 17-27; Eapen et al. (1994) Plant Cell Rep. 13:582-586; Hartman, et al. (1994) Bio-Technology 12: 919923; Ritala, et al. (1994) Plant. Mol. Biol. 24:317-325; y Wan, Y. C. and Lemaux, P. G. (1994) Plant Physiol. 104:3748.

[0054] Formas de realizacion de los metodos de la invencion incluyen la introduction de una construccion de polinucleotido en una planta. El termino “introduccion” se refiere a la presentation a la planta del constructo polinucleotido de manera que el constructo tenga acceso al interior de una celula de la planta. Los metodos no dependen de un metodo particular para la introduccion de un constructo de polinucleotido en una planta, solo que el constructo de polinucleotido tiene acceso al interior de al menos una celula de la planta. Metodos para introducir constructos de polinucleotidos en plantas se conocen en la tecnica incluyendo, pero no limitado a, metodos de transformacion estable, metodos de transformacion transitoria y metodos mediados por virus. El termino “transformacion estable” se refiere a que el constructo de polinucleotidos introducido en una planta se integra en el genoma de la planta y es capaz de ser heredado por la progenie de la misma. El termino “transformacion transitoria” significa que un constructo de polinucleotidos introducido en una planta no se integra en el genoma de la planta.

[0055] Para la transformacion de plantas y celulas vegetales, las secuencias de nucleotidos de la invencion son insertadas usando tecnicas estandar en cualquier vector conocido en la tecnica que sea adecuado para la expresion de las secuencias de nucleotidos en una planta o celula vegetal. La selection del vector depende de la tecnica de transformacion preferida y las especies vegetales objetivo que se quieren transformar. En una forma de realizacion de la presente invencion, una secuencia de nucleotidos AHASL esta operativamente enlazada a un promotor vegetal que se conoce por la expresion de alto nivel en una celula vegetal, y este constructo se introduce luego en una planta que es susceptible a uno o mas de los siguientes herbicidas, un herbicida I MI, un herbicida SU, un herbicida TP o un herbicida POB, y una planta transformada es regenerada. La planta transformada es tolerante a la exposition a un nivel de un herbicida IMI, un herbicida SU, un herbicida TP, un herbicida POB y/o mezclas derivadas que matarian o danarian significativamente una planta no transformada. Este metodo se puede aplicar a cualquier especie vegetal, sin embargo, es preferiblemente beneficioso cuando se aplica a plantas de girasol.

[0056] Metodologias para construir casetes de expresion de planta e introducir acidos nucleicos foraneos en plantas se conocen generalmente en la tecnica y se han descrito previamente. Por ejemplo, el ADN foraneo se puede introducir en plantas, usando vectores plasmidos de induction tumoral (Ti). Otros metodos utilizados para la entrega de ADN foraneo implican el uso de transformacion de protoplastos mediada por PEG, electroporation, filamentos de microinyeccion y bombardeo biolistico o de micro proyectil para dirigir la asimilacion de ADN. Tales metodos se conocen en la tecnica. (Patente de EE.UU. n°: 5,405,765 para Vasil et al.; Bilang et al. (1991) Gene 100: 247-250; Scheid et al.,(1991) Mol. Gen. Genet.,228: 104-112; Gnerche et al.,(1987) Plant Science 52: 111-116; Neuhause et al.,(1987) Theor. Appl Genet. 75: 30-36; Klein et al.,(19S7) Nature 327: 70-73; Howell et al. (1980) Science 208:1265; Horsch et al. (19S5) Science

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227: 1229-1231; DeBlock et al. (1989) Plant Physiology 91: 694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds.) Academic Press, Inc. (1988) and Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, Eds.) Academic Press, Inc. (1989). El metodo de transformacion depende de la celula vegetal que va a ser transformada, estabilidad de los vectores usados, el nivel de expresion de los productos geneticos y otros parametros.

[0057] Otros metodos adecuados de introduccion de secuencias de nucleotidos en celulas vegetales y posterior insercion en el genoma vegetal incluyen microinyeccion como en Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334, electroporacion como se describe en Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606, transformacion mediada por Agrobacterium como se describe en Townsend et al., Patente de EE.UU. n°.: 5,563,055, Zhao et al., Patente de EE.UU. n°: 5,981,840, transferencia de gen directa como se describe en Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722), y aceleracion de particula balistica como se describe en, por ejemplo, Sanford et al., Patente de EE.UU. n°: 4,945,050; Tomes et al., Patente de EE.UU. n°.:; Tomes et al., Patente de EE.UU. n°: 5,886,244; Bidney et al., Patente de EE.UU. n°: 5,932,782; Tomes et al. (1995) “Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Micro projectile Bombardment,” in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer- Verlag, McCabe et al. (1988) Biotechnology) 6:923-926); and Lecl transformation (WO 00/28058) Vease tambien; De Wet et al. (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman,New York), paginas 197-209 (pollen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 and Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (whisker-mediated transformation); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4: 1495-1505 (electroporation); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255.

[0058] Los polinucleotidos de las formas de realizacion de la presente invencion se pueden introducir en plantas poniendo en contacto la planta con un virus o acidos nucleicos virales. Generalmente, tales metodos implican la incorporacion de un constructo de polinucleotido de la presente invencion dentro de un ADN virico o molecula de ARN. Se reconoce que la proteina AHASL de la presente invencion puede ser inicialmente sintetizada como parte de una poliproteina virica, que mas tarde se puede procesar por proteolisis in vivo o in vitro para producir la proteina recombinante deseada. Ademas, se reconoce que los promotores de la presente invencion tambien abarcan promotores utilizados para la transcripcion por polimerasas de ARN virico. Metodos para introducir constructos polinucleotidos en plantas y expresar una proteina codificada en el mismo, implicando ADN virico o moleculas ARN, se conocen en la tecnica. Vease, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n.: 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367 y 5.316.931.

[0059] Las celulas que han sido transformadas se pueden cultivar en plantas conforme a formas convencionales. Vease, por ejemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas puede luego se cultivan, y bien empolinizan con la misma cepa transformada o cepas diferentes, y el hibrido resultante tienen expresion constitutiva de la caracteristica fenotipica identificada deseada. Dos o mas generaciones se pueden cultivar para asegurar que la expresion de la caracteristica fenotipica deseada se mantiene y se hereda de forma estable y luego semillas se cosechan las semillas para asegurar que la expresion de la caracteristica fenotipica deseada se ha conseguido. De esta manera, las formas de realizacion de la presente invencion proporcionan una semilla transformada (tambien denominada “semilla transgenica”) que tiene un constructo de polinucleotido de la presente invencion, por ejemplo, un casete de expresion de la presente invencion, incorporado de forma estable en su genoma. Las plantas resistentes a los herbicidas descritas aqui encuentran su uso en metodos para controlar las malas hierbas. Asi, la divulgacion incluye metodos para controlar malas hierbas que esten cerca de una planta resistente a los herbicidas de la presente invencion. Los metodos comprenden la aplicacion de una cantidad eficaz de un herbicida a los hierbajos y a la planta resistente a los herbicidas, donde la planta tiene resistencia aumentada a uno o mas de los siguientes herbicidas, un herbicida I MI, un Herbicida SU, un Herbicida TP, un Herbicida POB y/o mezclas derivadas, cuando se compara con una planta de tipo salvaje.

[0060] Formas de realizacion de la presente invencion proporcionan semillas no transgenicas y transgenicas con tolerancia aumentada a uno o mas herbicida, particularmente un herbicida inhibidor de AHAS, mas particularmente un herbicida IMI, un Herbicida SU, un Herbicida TP, un Herbicida POB y/o mezclas derivadas. Tales semillas incluyen, por ejemplo, semillas de girasol no transgenicas que comprenden las caracteristicas de tolerancia a los herbicidas de la planta de girasol RW-B, y semillas transgenicas que comprenden una molecula de polinucleotido de la presente invencion que codifica una proteina AHASL resistente a los herbicidas.

Prueba para presencia del gen AHASL mutante

[0061] Las secuencias de nucleotidos de las formas de realizacion de la presente invencion pueden utilizarse para aislar secuencias correspondientes a partir de otros organismos, particularmente otras plantas, mas particularmente otras dicotiledoneas. De esta manera, metodos tales como PCR, hibridacion y similares pueden utilizarse para identificar tales secuencias basadas en su homologia de secuencia con las secuencias expuestas aqui. Secuencias aisladas basadas en su identidad de secuencia con las secuencias de polinucleotidos AHASL enteras expuestas aqui o con fragmentos de las mismas estan abarcadas por la presente invencion. Asi, secuencias de polinucleotidos aislados que codifican para una proteina AHASL y que hibridan bajo condiciones rigurosas a las secuencias descritas aqui o a fragmentos de las mismas, se incluyen en la presente invencion.

[0062] En un metodo de PCR, cebadores oligonucleotidos se pueden disenar para su uso en reacciones de PCR para amplificar secuencias de ADN correspondientes a partir de ADNc o ADN genomico extraidos de cualquier planta de

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interes. Metodos para disenar cebadores de PCR y clonacion de PCR son generalmente conocidos en la tecnica. Vease Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York) e Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York). Metodos conocidos de PCR incluyen, pero de forma no limitativa, metodos que utilizan cebadores pareados, cebadores anidados, cebadores especificos unicos, cebadores degenerados, cebadores especificos de gen, cebadores especificos de vector, cebadores parcialmente desequilibrados y similares. Las secuencias de polinucleotidos AHASL de la presente invencion se proporcionan en los casetes de expresion para la expresion en la planta de interes. El casete incluira secuencias reguladoras 5' y 3' operativamente enlazadas a una secuencia de polinucleotidos AHASL de la presente invencion. “Operativamente enlazado” es un enlace funcional entre un promotor y una segunda secuencia, donde la secuencia promotora inicia y media la transcripcion de la secuencia de ADN que se corresponde con la segunda secuencia. Generalmente, operativamente enlazado significa que las secuencias de acidos nucleicos que estan enlazadas son contiguas y, cuando es necesario para unir dos regiones codificantes proteina, contigua y en lo mismo marco de lectura. El casete puede adicionalmente contener al menos un gen adicional que se va a cotransformar en el organismo. Alternativamente, el(los) gen(es) adicional(es) se puede(n) proporcionar en los casetes de expresion multiples.

[0063] Tales casetes de expresion disponen de una pluralidad de sitios de restriccion para que la insertion de la secuencia de polinucleotidos AHASL este bajo la regulation transcripcional de las regiones reguladoras. El casete de expresion puede adicionalmente contener genes marcadores seleccionables. El casete de expresion incluira en la direction de transcripcion 5'-3', una region de initiation transcripcional y traduccional (es decir, un promotor), una secuencia de polinucleotidos AHASL de la presente invencion y una region de terminacion transcripcional y traduccional (es decir, region de terminacion) funcional en plantas. El promotor puede ser nativo o analogo, o foraneo o heterologo, del huesped vegetal y/o de las secuencias de polinucleotidos AHASL de la invencion. Adicionalmente, el promotor puede ser la secuencia natural o alternativamente una secuencia sintetica. Cuando el promotor es “foraneo” o “heterologo” del huesped vegetal, se entiende que el promotor no se encuentra en la planta nativa en la que se introduce el promotor. Cuando el promotor es “foraneo” o “heterologo” de la secuencia de polinucleotidos AHASL, se entiende que el promotor no es el promotor nativo o de origen natural para la secuencia de polinucleotidos AHASL operativamente enlazada. Como se utiliza en este caso, un gen quimerico comprende una secuencia codificante operativamente enlazada con una region de iniciacion de transcripcion que es heterologo de la secuencia codificante.

[0064] Mientras los polinucleotidos AHASL resistentes a los herbicidas descritos aqui se pueden usar como genes marcadores seleccionables para transformation de plantas, los casetes de expresion que contienen estos polinucleotidos pueden incluir otro gen marcador seleccionable para la selection de celulas transformadas. Los genes marcadores seleccionables, se utilizan para la seleccion de celulas transformadas o tejidos. Los genes marcadores incluyen, pero de forma no limitativa, genes que codifican resistencia al antibiotico, tales como los que codifican la neomicina fosfotransferasa II (NEO) e higromicina fosfotransferasa (HPT), al igual que genes que confieren resistencia a 5 compuestos herbicidas, tales como amonio de glufosinato, bromoxinil, imidazolinonas y 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4- D). Vease generalmente, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 1:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley et al. (1980) en The Operon, pag. 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555-566; Brown et al. (1987) Cell 10 49:603-612; Figge et al. (1988) Cell 52:713-722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5400-5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph. D. Thesis, University of Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1917-1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 15 89:3952-3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad, Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) "Topics Mol. Struc. Biol." 10:143-162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschr M et al. (1988) Biochemistry 27: 1094-1104; Bonin (1993) PhD. Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:5547-5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill et al. (1988) Nature 334:721-724. La lista anterior de genes marcadores seleccionables no tiene intention de ser limitativa y cualquier gen marcador seleccionable se pueden usar segun sea necesario.

[0065] En un metodo de hibridacion, toda o parte de una secuencia de nucleotidos AHASL conocida puede utilizarse para filtrar ADNc o bibliotecas genomicas. Metodos para la construction de tal ADNc y bibliotecas genomicas son generalmente conocidos en la tecnica. Las sondas denominadas de hibridacion pueden ser fragmentos de ADN genomico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN u otros oligonucleotidos, y se pueden marcar con un grupo detectable tal como 32P, o cualquier otro marcador detectable, tal como otros radioisotopos, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimatico. Sondas para hibridacion se pueden hacer mediante la marcacion de oligonucleotidos sinteticos basada en la secuencia de nucleotidos AHASL conocida descrita aqui. Cebadores degenerados disenados basandose en nucleotidos conservados o residuos de aminoacidos en una secuencia de nucleotidos AHASL conocida o secuencia de aminoacidos codificada adicionalmente pueden ser usados. La sonda tipicamente comprende una region de secuencia de nucleotidos que hibridiza bajo condiciones rigurosas hasta al menos aproximadamente 12, preferiblemente aproximadamente 25, mas preferiblemente aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 o mas nucleotidos consecutivos de una secuencia de nucleotidos AHASL de la presente invencion o un fragmento o variante de la misma. La preparation de sondas para hibridacion generalmente se conoce en la tecnica.

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[0066] Por ejemplo, toda la secuencia AHASL descrita aqui, o una o mas partes de la misma, se puede utilizar como una sonda capaz de hibridar especificamente a secuencias AHASL correspondientes y ARNs mensajeros. Tecnicas de hibridacion incluyen seleccion de hibridacion de bibliotecas de ADN en placas (bien placas o colonias). La hibridacion de tales secuencias se puede realizar bajo condiciones rigurosas. Los terminos “condiciones rigurosas” o “condiciones de hibridacion rigurosa” se refieren, para fines de esta invencion, a condiciones bajo las que una sonda hibridara a su secuencia objetivo en un grado detectablemente superior al de otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces que los antecedentes). Las condiciones rigurosas son dependientes de la secuencia y seran diferentes en diferentes circunstancias. Tipicamente, las condiciones rigurosas seran aquellas donde la concentracion de sal sea inferior a aproximadamente 1,5 M de ion de Na, tipicamente aproximadamente de 0,01 a 1,0 M de concentracion ionica de Na (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3 y la temperatura sea al menos aproximadamente de 30°C para sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleotidos) y al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, mas de 50 nucleotidos). Las condiciones rigurosas tambien se pueden conseguir con la adicion de agentes desestabilizantes tales como formamida. Las condiciones de astringencia bajas ejemplares incluyen hibridacion con una solucion tamponada de 30 a 35% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS (dodecilsulfato sodico) a 37°C, y un lavado en IX a 2X sSc (2OX SSC = 3,0 M NaCl/0,3 M citrato de trisodio) a 50 a 55°C. Condiciones de astringencia moderadas ejemplares incluyen hibridacion en 40 a 45% de formamida, 1,0 M de NaCl, 1% de SDS a 37°C y un lavado en 0,5X a IX SSC a 55 a 60°C. Condiciones de astringencia altas ejemplares incluyen hibridacion en 50% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS a 37°C y un lavado en 0,1X SSC a 60 a 65°C. Opcionalmente, tampones de lavado pueden comprender de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1% SDS. La duracion de hibridacion es generalmente menos de aproximadamente 24 horas, normalmente de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas.

[0067] La especificidad es tipicamente la funcion de lavados de post-hibridacion, los factores criticos son la fuerza ionica y la temperatura de la solucion de lavado final. Para ADN-hibridos de ADN, la Tm se puede aproximar a partir de la ecuacion de Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L donde M es la molaridad de cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de nucleotidos de guanosina y citosina en el ADN, % de form es el porcentaje de formamida en la solucion de hibridacion, y L es la longitud del hibrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (bajo fuerza ionica y pH definidos) a la que 50% de una secuencia objetivo complementaria hibridiza a una sonda perfectamente unida. La Tm se reduce en aproximadamente 1°C por cada 1% de no coincidencia; asi, la Tm, la hibridacion y/o las condiciones de lavado se pueden ajustar para hibridar a secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si las secuencias con >90% de identidad estan presentes, la Tm se pueden disminuir 10°C. Generalmente, las condiciones de astringencia se seleccionan por ser aproximadamente 5°C inferiores que punto de fusion termico (Tm) para la secuencia especifica y su complemento en una fuerza ionica y pH definidos. Sin embargo, condiciones de astringencia severas pueden utilizar una hibridacion y/o lavado a 1, 2, 3 o 4°C inferiores al punto de fusion termico (Tm); condiciones de astringencia moderadas pueden utilizar una hibridacion y/o lavado a 6, 7, 8, 9 o 10°C inferiores al punto de fusion termico (Tm); condiciones de astringencia bajas pueden utilizar una hibridacion y/o lavado a 11, 12, 13, 14, 15 o 20°C inferiores al punto de fusion termico (Tm). Utilizando la ecuacion, hibridacion y composiciones de lavado, y la Tm deseada, los expertos entenderan que variaciones en la astringencia de hibridacion y/o soluciones de lavado estan intrinsecamente descritas. Si el grado deseado de no coincidencia da como resultado una Tm inferior a 45°C (solucion acuosa) o 32°C (solucion de formamida), se prefiere aumentar la concentracion de SSC de modo que una temperatura mas alta se pueda usar. Una guia extensa para la hibridacion de acidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capitulo 2 (Elsevier, and Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capitulo 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York).

Transgenesis y optimizacion de expresion

[0068] Se proporcionan metodos para mejorar la actividad de AHAS en una planta por transformation de una planta con un constructo de polinucleotidos que tiene un promotor operativamente enlazado a una secuencia de nucleotidos AHASL1 de la presente invencion. Los metodos implican introduction de un constructo de polinucleotidos de la invencion en al menos una celula vegetal y regeneracion de una planta transformada utilizando un promotor capaz de dirigir la expresion genica en una celula vegetal. Preferiblemente, tal promotor es un promotor constitutivo o un promotor preferido de tejido. Los metodos encuentran uso en el aumento de la resistencia o tolerancia de una planta a al menos un herbicida, y ventajosamente dos, tres o cuatro o mas herbicidas que interfieren con la actividad catalitica de la enzima AHAS, particularmente un herbicida IMI, un herbicida SU, un herbicida TP, un herbicida POB y/o mezclas derivadas.

[0069] Cuando proceda, el(los) gen(s) se puede(n) optimizar para expresion aumentada en la planta transformada. Esto es, los genes se pueden sintetizar utilizando codones preferidos por las plantas para expresion mejorada. Vease, por ejemplo, Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol 92: 1- 11 para una discusion del uso del codon preferido como huesped. Metodos estan disponibles en la tecnica para sintetizar genes preferidos por las plantas. Vease, por ejemplo, patente de EE.UU. n°.: 5.380.831 y 5.436.391 y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498.

[0070] Modificaciones de secuencia adicionales se conocen por mejorar la expresion genica en un huesped celular. Estas incluyen elimination de secuencias que codifican senales de poliadenilacion falsa, senales de sitio de empalme exon-intron, repetidores tipo transposon y otras secuencias tan bien caracterizadas que pueden ser deletereas para la expresion genica. El contenido G-C de la secuencia se puede ajustar a niveles promedio para un huesped celular dado,

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como se calcula por referenda para genes conocidos expresados en la celula huesped. Cuando es posible, la secuencia se modifica para evitar estructuras de ARNm secundario de horquilla predichas. Las secuencias de nucleotidos para mejorar la expresion genica tambien pueden usarse en los vectores de expresion vegetales. Estos incluyen los intrones del maiz Adhl, gen del intron I (Callis et al. Genes and Development 1:1183-1200,1987), y secuencias lider, (W- secuencia) del virus del mosaico del tabaco (TMV), Virus del moteado clorotico del maiz y virus del mosaico de la alfalfa (Gallie et al. Nucleic Acid Res. 15:8693-8711,1987 y Skuzeski et al. Plant Mol.Biol. 15:65-79,1990). El primer intron del locus shrunken-1 de maiz, ha demostrado que aumenta la expresion de genes en los constructos de gen quimerico. Las patentes de EE.UU. n.°: 5.424.412 y 5.593.874 describen el uso de intrones espedficos en los constructos de expresion genica, y Gallie et al. (Plant Physiol. 106:929-939, 1994) tambien han mostrado que los intrones son utiles para regular la expresion genica en una base espedfica de tejido. Para mejorar adicionalmente o para optimizar la expresion genica de la subunidad grande AHAS, los vectores de expresion vegetales de la presente invencion tambien pueden contener secuencias de ADN que contengan regiones de union a la matriz (MARs). Celulas vegetales transformadas con tales sistemas de expresion modificados, luego, pueden mostrar sobreexpresion o expresion constitutiva de una secuencia de nucleotidos de la presente invencion.

[0071] Los casetes de expresion pueden adicionalmente contener secuencias lider 5' en el constructo del casete de expresion. Tales secuencias lider pueden actuar para mejorar la traduccion. Los lideres de traduccion se conocen en la tecnica e incluyen: lideres de picornavirus, por ejemplo, Kder EMCV (region no codificante 5' de encefalomiocarditis) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:6126-6130); lideres de potivirus, por ejemplo, lider TEV (virus del grabado del tabaco) (Gallie et al. (1995) Gene 165(2):233-238), lider MDMV (virus del mosaico enano de maiz) (Virology 154:9-20), y proteina de union a la cadena pesada de inmunoglobulina humana (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94); lider no traducido del ARNm de proteina de revestimiento del virus de mosaico de alfalfa (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); lider de virus de mosaico de tabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) en Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, Nueva York), pags. 237-256); y kder de virus del moteado clorotico de maiz (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Vease tambien, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968. Otros metodos conocidos para mejorar la traduccion tambien se pueden utilizar, por ejemplo, intrones y similares. Al preparar el casete de expresion, los diferentes fragmentos de ADN pueden ser manipulados, para proporcionar a las secuencias de ADN en la orientacion adecuada y, segun sea apropiado, en el marco de lectura apropiado. Con este fin, adaptadores o enlaces se pueden emplear para unir los fragmentos de ADN u otras manipulaciones se pueden utilizar para proporcionar sitios de restriccion convenientes, retirada de ADN superfluo, retirada de sitios de restriccion o similares. Con este fin, mutagenesis in vitro, reparacion de cebador, restriccion, recocimiento, resustituciones, por ejemplo, transiciones y transversiones, pueden estar implicadas.

[0072] Casetes de expresion para expresar polinucleotidos en plantas, tejidos vegetales, celulas vegetales y otras celulas huesped se proporcionan. Los casetes de expresion tienen un promotor expresable en la planta, tejido vegetal, celula vegetal u otras celulas huesped de interes operativamente enlazadas a un polinucleotido de la invencion que tiene una secuencia de nucleotidos que codifica bien una proteina AHASL en toda su longitud (es decir, incluyendo el peptido de transito de cloroplasto) o madura (es decir sin el peptido de transito de cloroplasto). Si se desea una expresion en los plastidos o cloroplastos de plantas o celulas vegetales, el casete de expresion tambien puede tener una secuencia dirigida a cloroplasto operativamente enlazada que codifique un peptido de transito de cloroplasto. Tales casetes de expresion se pueden usar en un metodo para el mejorar la tolerancia al herbicida de una planta o una celula huesped. El metodo implica la transformacion de la planta o celula huesped con un casete de expresion que contiene un promotor que es expresable en la planta o celula huesped de interes y el promotor esta operativamente enlazado a un polinucleotido de una forma de realizacion de la presente invencion que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica, por ejemplo, un herbicida IMI, un herbicida SU, un herbicida TP o una proteina AHASL resistente al herbicida POB.

[0073] El uso del termino “constructos polinucleotidos” no esta limitado a ADN. Aquellos tecnicos en la materia reconoceran que constructos polinucleotidos, particularmente polinucleotidos y oligonucleotidos, compuestos de ribonucleotidos y combinaciones de ribonucleotidos y desoxirribonucleotidos tambien se pueden emplear en los metodos descritos aqui. Tales desoxirribonucleotidos y ribonucleotidos incluyen tanto moleculas de origen natural como analogos sinteticos. Los constructos polinucleotidos de la invencion tambien abarcan todos los tipos de constructos polinucleotidos incluyendo, pero no limitado a, formas monocatenarias, formas bicatenarias, horquillas, estructuras de tallo-y-bucle, y similares. Ademas, se entiende por aquellos tecnicos en la materia que cada secuencia de nucleotidos descrita aqui tambien incluye el complemento de esta secuencia de nucleotidos ejemplificada.

[0074] Los metodos de la invencion pueden emplear un constructo de polinucleotidos que sea capaz de dirigir, en una planta transformada, la expresion de al menos una proteina, o al menos un ARN, tal como, por ejemplo, un ARN antisentido que sea complementario con al menos una parte de un ARNm. Tipicamente, tal constructo de polinucleotido esta compuesto por una secuencia codificante para una proteina o un ARN operativamente enlazado a las regiones reguladoras transcripcionales 5' y 3'. Alternativamente, un constructo de polinucleotido se puede utilizar que no sea capaz de dirigir, en una planta transformada, la expresion de una proteina o un ARN. Para la expresion de un polinucleotido de la presente invencion en una celula huesped de interes, el polinucleotido esta tipicamente operativamente enlazado a un promotor que sea capaz de dirigir la expresion genica en la celula huesped de interes. Los metodos para la expresion de los polinucleotidos en celulas huesped no dependen de promotor particular, e incluyen el uso de cualquier promotor que sea conocido en la tecnica y que sea capaz de dirigir la expresion genica en

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la celula huesped de interes.

[0075] Mientras que puede ser preferible expresar polinucleotidos AHASL que usen promotores heterologos, las secuencias promotoras nativas pueden ser utilizadas. Tales constructos cambiarian los niveles de expresion de la proteina AHASL en la planta o celula vegetal. Asi, el fenotipo de la planta o celula vegetal es alterado. La region de terminacion puede ser nativa con la region de iniciacion transcripcional, puede ser nativa con la secuencia AHASL operativamente enlazada de interes, puede ser nativa con el huesped vegetal, o puede derivarse de otra fuente (es decir, foranea o heterologa al promotor, la secuencia de polinucleotidos AHASL de interes, el huesped vegetal o cualquier combinacion de los mismos). Regiones de terminacion convenientes estan disponibles del plasmido-Ti de A. tumefaciens, como las regiones de terminacion de octopina sintasa y nopalina sintasa. Vease tambien Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

[0076] Varios promotores se pueden usar en la practica de la invencion y se pueden seleccionar basados en los resultados deseados. Los acidos nucleicos se pueden combinar con promotores constitutivos, preferido por el tejido u otros para la expresion vegetal. Tales promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, el promotor de nucleo del promotor Rsyn7 y otros promotores constitutivos descritos en la WO 99/43838 y la patente de EE.UU. n°.: 6.072.050; el promotor CaMV 35S de nucleo (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); actina de arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 y Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:27232730); promotor ALS (patente de EE.UU. n°: 5.659.026) y similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n.: 5.608,149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142; y 6.177.611. Promotores preferidos de tejido se pueden utilizar para obtener expresion AHASL mejorada dentro de un tejido vegetal particular. Tales promotores preferidos de tejido incluyen, pero de forma no limitativa, promotores preferidos de hoja, promotores preferidos de raiz, promotores preferidos de semilla y promotores preferidos de tallo. Promotores preferidos de tejido, son descritos en, por ejemplo, Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen. Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2): 157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3): 1331- 1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773- 778; Lam (1994) Results Prob I. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6): 1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586- 9590; and Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505. Tales promotores pueden ser modificados, si es necesario, para expresion debil.

[0077] En una forma de realizacion, los acidos nucleicos de interes estan dirigidos al cloroplasto para la expresion. De esta manera, donde el acido nucleico de interes no esta directamente insertado en el cloroplasto, el casete de expresion contendra adicionalmente una secuencia dirigida al cloroplasto que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un peptido de transito de cloroplasto para dirigir el producto genico de interes a los cloroplastos. Tales peptidos de transito se conocen en la tecnica. Con respecto a las secuencias dirigidas a cloroplasto, “operativamente enlazado” significa que la secuencia de acidos nucleicos que codifica un peptido de transito (es decir, la secuencia dirigida a cloroplasto) se enlaza al polinucleotido AHASL de manera que las dos secuencias sean contiguas y esten en el mismo marco de lectura. Vease, por ejemplo, Von Heijne el al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; y Shah et al. (1986) Science 233:478-481.

[0078] Mientras las proteinas AHASL descritas aqui pueden incluir un peptido de transito de cloroplasto nativo, cualquier peptido de transito de cloroplasto conocido en la tecnica se puede fusionar con la secuencia de aminoacidos de una proteina AHASL madura de la presente invencion conectando operativamente una secuencia dirigida a cloroplasto al extremo 5' de una secuencia de nucleotidos que codifica una proteina AHASL madura.

[0079] Secuencias que de cloroplasto se conocen en la tecnica e incluyen la subunidad pequena de cloroplasto de ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa (Rubisco) (de Castro Silva Filho et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30:769-780; Schnell et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(5):3335-3342) 5-(enolpiruvil)shikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) (Archer et al. (1990) J Bioenerg. Biomemb. 22(6):789-810) triptofano sintasa (Zhao et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(11):6081-6087) plastocianina (Lawrence et al. (1997) J Biol. Chem. 272(33):20357-20363) corismato sintasa (Schmidt et al. (1993) J Biol. Chem. 268(36):27447-27457) y la clorofila captadora de luz a/b proteina de union (LHBP) (Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:14996-14999). Vease tambien Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark et al. (1989) J Biol. Chem. 264: 17544- 17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421; y Shah et al. (1986) Science 233:478-481.

[0080] Metodos para transformar cloroplastos se conocen en la tecnica. Vease, por ejemplo, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601- 606. El metodo se basa en la entrega con pistola de particulas de ADN que contiene un marcador seleccionable y la direccion del ADN al genoma plastido a traves de recombinacion homologa. Adicionalmente, la transformacion plastida lo que se puede realizar por transactivacion de un transgen de borne plastido silencioso por expresion preferida de tejido de una ARN-polimerasa codificada nuclear y dirigida a plastido. Tal sistema

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ha sido proporcionado en McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305.

[0081] Los acidos nucleicos de interes para dirigirlos al cloroplasto se pueden optimizar para la expresion en el cloroplasto para dar cuenta de las diferencias en el uso de codon entre el nucleo vegetal y este organulo. De esta manera, los acidos nucleicos de interes se pueden sintetizar utilizando codones preferidos por el cloroplasto. Vease, por ejemplo, patente de EE.UU. n°.: 5.380.831.

[0082] Como se describe en este caso, las secuencias de nucleotidos AHASL de las formas de realizacion de la presente invention encuentran uso en la mejora de la tolerancia al herbicida de plantas que comprenden en sus genomas un gen que codifica de una proteina AHASL tolerante a los herbicidas. Tal gen puede ser un gen endogeno o un transgen. Adicionalmente, en formas de realizacion determinadas, las secuencias de acidos nucleicos de la presente invencion se pueden apilar con cualquier una combination de secuencias polinucleotidas de interes para crear plantas con un fenotipo deseado. Por ejemplo, los polinucleotidos se pueden apilar con cualquier otro polipeptido que codifique polinucleotidos que tenga actividad pesticida y/o insecticida, tal como, por ejemplo, las proteinas de toxina de Bacillus thuringiensis (descrita en las patentes de EE.UU. n°: 5.366.892, 5.747.450, 5.737.514, 5.723.756, 5.593.881; y Geiser et al. (1986) Gene 48:109). Las combinaciones generadas tambien pueden incluir copias multiples de cualquiera de los polinucleotidos de interes.

[0083] Las secuencias de nucleotidos descritas aqui tambien se puede usar en la orientation sentido para suprimir la expresion de genes endogenos en plantas. Metodos para suprimir la expresion genica en plantas utilizando secuencias de nucleotidos en la orientacion sentido se conocen en la tecnica. Los metodos generalmente implican la transformation de plantas con un constructo de ADN que comprende un promotor que dirige la expresion en una planta operativamente enlazada a al menos una parte de una secuencia de nucleotidos que corresponde a la transcription del gen endogeno. Tipicamente, tal secuencia de nucleotidos tiene identidad de secuencia sustancial a la secuencia de la transcripcion del gen endogeno, preferiblemente mayor de aproximadamente 65% de identidad de secuencia, mas preferiblemente mayor de aproximadamente 85% de identidad de secuencia, de la forma mas preferible mayor de aproximadamente 95%de identidad de secuencia. Vease patentes de EE.UU. n.°: 5.283.184 y 5.034.323.

[0084] Tambien se proporcionan metodos para aumentar la resistencia al herbicida de una planta de girasol a traves del cultivo de planta convencional que implica la reproduction sexual. Los metodos comprenden cruzamiento de una primera planta de girasol que sea resistente a un herbicida con una segunda planta de girasol que puede ser o no resistente al herbicida o puede ser resistentes a diferente herbicida o herbicidas que la primera planta. La primera planta puede ser cualquiera de las plantas resistentes al herbicida descritas aqui, incluyendo, por ejemplo, RW-B. La segunda planta puede ser cualquier planta que sea capaz de producir plantas descendientes viables (es decir, semillas) cuando se cruza con la primera planta. Tipicamente, pero no necesariamente, la primera y la segunda plantas son de las mismas especies de girasol. Las plantas descendientes producidas por este metodo tienen resistencia aumentada a un herbicida cuando se compara con la primer o segunda planta o ambas. Cuando la primera y la segunda plantas son resistentes a herbicidas diferentes, las plantas descendientes tendran las caracteristicas de tolerancia al herbicida combinadas de la primeras y la segunda planta. Estos metodos pueden ademas implicar a una o mas generaciones de retrocruce de las plantas descendientes del primer cruce con una planta de la misma linea o genotipo ya sea la primera o la segunda planta. Alternativamente, la progenie del primer cruce o cualquier cruce posterior se puede cruzar con una tercera planta que sea de una linea o genotipo diferente de la primera o segunda planta. Ademas, estos metodos pueden adicionalmente implicar la selection de plantas que comprendan las caracteristicas de tolerancia al herbicida de la primera planta, la segunda planta, o la primera y la segunda planta.

Metodos de control de hierbas

[0085] Las plantas de cultivo de girasol se rotan frecuentemente con cereales, tal como el trigo. Los herbicidas SU se emplean frecuentemente como parte del sistema de control de hierbas del trigo. Ademas de los herbicidas SU, los herbicidas IMI se pueden usar como parte del sistema de control de hierbas del trigo cuando se cultivan trigos I MI. El uso de estos herbicidas en una rotation de trigo/girasol produce dano por arrastre. El dano por arrastre de herbicida de girasol se produce cuando los residuos de un herbicida aplicado a la planta de cultivo precedente, en este ejemplo SU o IMI aplicado al trigo, estan presentes en la tierra cuando una planta de cultivo de girasol se planta. De hecho, diferentes herbicidas pueden causar dano por arrastre al girasol, incluyendo muchos inhibidores de AHAS (Blamei et al., 1997). El dano a las plantas de cultivo de girasol se puede reducir usando cultivos de girasol resistentes al herbicida.

[0086] Los cultivos de girasol resistentes al herbicida, sin embargo, muestran gran especificidad y su uso solo permite la pulverization de la misma familia de herbicida en la post-emergencia. Por ejemplo, para proteger una planta de cultivo de girasol del arrastre SU, cultivos resistentes al SU se pueden usar. El uso de cultivos resistentes al SU permite solo que se pulvericen herbicidas SU sobre la planta de cultivo de girasol. Actualmente, solo cultivos especificos resistentes al SU o resistentes a IMI se han mostrado, no se ha descrito ningun cultivo que muestre resistencia cruzada a inhibidores de AHAS diferentes. Sorprendentemente, y de forma imprevista, la presencia del gen descrito aqui y la expresion de la proteina AHAS correspondiente protege las plantas de cultivo de girasol del dano por arrastre potencial provocado por herbicidas inhibidores de AHAS y posteriormente, permite la pulverizacion de una variedad de herbicidas inhibidores de AHAS para controlar los hierbajos en la post-emergencia. Esta capacidad para usar una variedad de herbicidas para el control de hierbas en una planta de cultivo de girasol proporciona una oportunidad mucho mayor para

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los productores de controlar la infestacion de hierba en las plantas de cultivo de girasol.

[0087] El sorprendente descubrimiento de una proteina AHAS que tiene resistencia a multiples herbicidas permite:

1. La posibilidad de aplicar nuevos tipos de herbicidas inhibidores de AHAS para el control de hierbas en la planta de cultivo de girasol (es decir: POBs y TPs) o el registro en el girasol de herbicidas bien conocidos usados en otras plantas de cultivo.

2. La mezcla de dos o mas de los herbicidas para la aplicacion al mismo tiempo en la planta de cultivo de girasol debido a los altos niveles de resistencia cruzada a las diferentes familias de herbicidas inhibidores de AHAS. Adicionalmente, la resistencia cruzada permite disenar y desarrollar formulaciones de herbicidas nuevas que pueden combinar diferentes herbicidas inhibidores de AHAS con el objetivo de aumentar el control del espectro de hierbas en el girasol.

3. Mayor flexibilidad en la gestion de los herbicidas para el control de hierbas en el girasol, esto es, mas de un tipo de herbicida se puede elegir y aplicar en momentos diferentes en la misma temporada dependiendo del tipo de hierba que se quiera controlar.

4. Resistencia al arrastre de herbicida de la planta de cultivo precedente y, al mismo tiempo, resistencia a otro herbicida inhibidor de AHAS aplicado en la post-emergencia.

[0088] El control de la vegetacion no deseada se entiende que se refiere a destruir los hierbajos y/o de otro modo retardar o inhibir el crecimiento normal de los hierbajos. Los hierbajos, en el sentido mas amplio, se entiende que se refiere a todas esas plantas que crecen en ubicaciones donde son indeseadas. Ejemplos de hierbajos incluyen pero de forma no limitativa, por ejemplo, hierbajos dicotiledoneo e monocotiledoneos. Hierbajos dicotiledoneos incluyen, pero de forma no limitativa, hierbajos de los generos: Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus y Taraxacum. Hierbajos monocotiledoneos incluyen, pero de forma no limitativa, hierbajos de los generos: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus y Apera.

[0089] Ademas, los hierbajos puede incluir, por ejemplo, plantas de cultivo que esten crecimiento en una ubicacion no deseada. Por ejemplo, una planta de maiz voluntaria que este en un campo que predominantemente tenga plantas de girasol se puede considerar una hierba, si la planta de maiz no es deseada en el campo de plantas de girasol.

[0090] Formas de realizacion de la presente invencion describen metodos para aumentar la tolerancia o resistencia de

una planta, tejido vegetal, celula vegetal u otra celula huesped a uno o mas herbicidas que interfieren con la actividad de la enzima AHAS Preferiblemente, tal herbicida es un herbicida I MI, un herbicida SU, un herbicida TP, un herbicida POB y/o mezclas derivadas. Ventajosamente resistencia o tolerancia aumentada a dos o mas de los herbicidas anteriores. Mas ventajosamente, resistencia o tolerancia aumentada a tres o mas de los herbicidas anteriores. Muchos ventajosamente, resistencia o tolerancia aumentada a cuatro o mas de los herbicidas anteriores. Los herbicidas IMI pueden incluir, pero de forma no limitativa, PURSUIT® (imazetapir), CADRE® (imazapic), RAPTOR® (imazamox), SCEPTER® (imazaquina), ASSERT® (imazetabenz), ARSENAL® (imazapir), un derivado de cualquiera de los herbicidas anteriormente mencionados, y una mezcla de dos o mas de los herbicidas anteriormente mencionados, por ejemplo, imazapir/imazamox (ODYSSEY®). El herbicida IMI se puede seleccionar de, pero no esta limitado a, acido 2- (4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidiazolin-2-il)-nicotmico, acido [2-(4-isopropil)-4-J-bmetiI-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-3-

quinolinocarboxilico], acido [5-etil-2-(4-isopropil-]-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-nicotmico, acido 2-(4-isopropil-4-metil-5- oxo-2-imidazolin-2-il)-5-(metoximetil)-nicotmico, [acido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-J-imidazolin-2-il)-5-metil-nicotmico y una mezcla de metil-[6-(4-isopropil-4-]metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-m-toluato y metil-[2-(4-isopropil-4-metil-5-]oxo-2- imidazolin-2-il)-p-toluato. El uso de acido 5-etil-2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-nicotmico y acido [2-(4- isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-]il)-5-(metoximetil)-nicotmico es preferido. El uso de acido [2-(4-isopropil-4-]-metil- 5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-(metoximetil)-nicotmico es particularmente preferido.

[0091] Los herbicidas SU puede incluir, pero de forma no limitativa, clorsulfuron, metsulfuron metil, sulfometuron metil, clorimuron etil, tifensulfuron metil, tribenuron metil, bensulfuron metil, nicosulfuron, etametsulfuron metil, rimsulfuron, triflusulfuron metil, triasulfuron, primisulfuron metil, cinosulfuron, amidosulfuron, fluzasulfuron, imazosulfuron, pirazosulfuron etil, halosulfuron, azimsulfuron, ciclosulfuron, etoxisulfuron, flazasulfuron, flupirsulfuron metil, foramsulfuron, iodosulfuron, oxasulfuron, mesosulfuron, prosulfuron, sulfosulfuron, trifloxisulfuron, tritosulfuron, derivados de cualquiera de los herbicidas anteriormente mencionados, y una mezcla de dos o mas de los herbicidas anteriormente mencionados.

[0092] Los herbicidas TP pueden incluir, pero de forma no limitativa, cloransulam, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam y penoxsulam.

[0093] Los herbicidas POB pueden incluir, pero de forma no limitativa, bispiribac, piritiobac, piriminobac, piribenzoxim y piriftalid.

[0094] Se reconoce que los herbicidas POB estan cercanamente relacionados con los herbicidas de

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pirimidiniltiobenzoato y se generalizan en el epigrafe de este ultimo nombre por la Weed Science Society of America. Por consiguiente, los herbicidas pueden incluir herbicidas de pirimidiniltiobenzoato, incluyendo, pero no limitado a, los herbicidas POB anteriormente descritos. En vista de lo anterior, los solicitantes usan los terminos pirimidiniltiobenzoato y pirimidiniloxibenzoato de forma intercambiable con la abreviatura POB.

[0095] El uso de los herbicidas enumerados aqui no tiene intencion de limitar la presente invencion a un herbicida especifico o familia especifica de herbicidas. Los tecnicos en la materia reconoceran que otros herbicidas tambien puede ser empleados.

[0096] Proporcionando plantas que tienen resistencia aumentada a los herbicidas, se pueden emplear una amplia variedad de formulaciones para proteger las plantas de girasol de los hierbajos, de modo que se mejore el crecimiento de la planta de girasol y se reduzca la competicion por nutrientes. Un herbicida se puede usar por si mismo para pre- emergencia, post-emergencia, pre-siembra y en el control de siembra de hierbajos en areas circundantes de las plantas descritas aqui. En una forma de realizacion, una formulacion de herbicida IMI se puede usar que contenga otros aditivos. En otra forma de realizacion, una formulacion de herbicida SU se puede usar que contenga otros aditivos. En otra forma de realizacion, una formulacion de herbicida TP se puede usar que contenga otros aditivos. En otra forma de realizacion, una formulacion de herbicida POB se puede usar que contenga otros aditivos. El(los) herbicida(s) tambien pueden usarse como un tratamiento de semilla. Aditivos encontrados en formulaciones de un herbicida IMI, un herbicida SU, un herbicida TP, un herbicida POB y/o mezclas derivadas pueden incluir otros herbicidas, detergentes, adyuvantes, agentes de extension, agentes de adherencia, agentes estabilizantes o similares. La formulacion de herbicida puede ser una preparacion humeda o seca y pueden incluir, pero no esta limitado a, polvos fluibles, concentrados emulsionables y concentrados Kquidos. El herbicida y las formulaciones herbicidas se pueden aplicar conforme a metodos convencionales, por ejemplo, pulverizando, regando, espolvoreando o similares. En estos metodos, el herbicida inhibidor de AHAS se puede aplicar por cualquier metodo conocido en la tecnica incluyendo, pero no limitado a, tratamiento de semilla, tratamiento de tierra y tratamiento foliar.

[0097] Antes de la aplicacion, el herbicida inhibidor de AHAS se puede convertir en las formulaciones habituales, por ejemplo soluciones, emulsiones, suspensiones, polvos, pulverizados, pastas y granulos. La forma de uso depende del fin particular destinado; en cada caso, deberia asegurar una distribucion fina y uniforme del compuesto segun la presente invencion.

[0098] Las formulaciones se preparan de una manera conocida (vease, por ejemplo, para revision US 3.060.084, EP-A 707 445 (para concentrados liquidos), Browning, “Agglomeration”, Chemical Engineering, Dec. 4, 1967, 147-48, Perry's Chemical Engineer's Handbook, 4th Ed., McGraw-Hill, New York, 1963, paginas 8-57 y et seq. WO 91/13546, US 4.172.714, US 4.144.050, US 3.920.442, US 5.180.587, US 5.232.701, US 5.208.030, GB 2.095.558, US 3.299.566, Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1961, Hance et al., Weed Control Handbook, 8th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989 and Mollet, H., Grubemann, A., Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim (Germany), 2001, 2. D. A. Knowles, Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1998 (ISBN 0-7514-0443-8), por ejemplo mediante la extension del compuesto activo con productos auxiliares adecuados para la formulacion de agroquimicos, tales como solventes y/o portadores, si se desea emulsionantes, surfactantes y dispersantes, conservantes, agentes antiespumantes, agentes anticongelacion, para formulacion de tratamiento de semilla tambien opcionalmente colorantes y/o ligantes y/o agentes gelificantes.

[0099] Ejemplos de solventes adecuados son agua, solventes aromaticos (por ejemplo productos de Solvesso, xileno), parafinas (por ejemplo fracciones de aceite mineral), alcoholes (por ejemplo metanol, butanol, pentanol, alcohol bendlico), cetonas (por ejemplo ciclohexanona, gamma-butirolactona), pirrolidonas (NMP, NOP) acetatos (glicol diacetato), glicoles, dietilamidas de acido graso, acidos grasos y esteres de acido graso.

En principio, mezclas solventes tambien se pueden usar.

[0100] Ejemplos de portadores adecuados son minerales naturales molidos (por ejemplo caolines, arcillas, talco yeso) y minerales sinteticos molidos (por ejemplo silice altamente dispersa, silicatos). Emulsionantes adecuados son emulsionantes no ionicos y anionicos (por ejemplo eteres de alcohol graso de polioxietileno, alquilsulfonatos y arilsulfonatos).

[0101] Ejemplos de dispersantes son soluciones de residuos lignina-sulfito y metilcelulosa.

[0102] Surfactantes adecuados usados son metal alcalino, metal alcalinoterreo y sales amonicas de acido lignosulfonico, acido naftalenesulfonico, acido fenolsulfonico, acido dibutilnaftalenesulfonico, alquilarilsulfonatos, alquil sulfatos, alquilsulfonatos, sulfatos de alcohol graso, acidos grasos y eteres de glicol de alcohol graso sulfatado, ademas condensados de naftaleno sulfonatado y derivados de naftaleno con formaldehido, condensados de naftaleno o de acido naftalenosulfonico con fenol y formaldehido, eter de octilfenol de polioxietileno, isooctilfenol etoxilado, octilfenol, nonilfenol, alquilofenol poliglicol eteres, tributilfenilo poliglicol eter, tristearilfenil poliglicol eter, alcoholes de polieter de alquilaril, condensados oxido de alcohol y de etileno de alcohol graso, aceite de ricino etoxilado, eteres de alquilo de polioxietileno, polioxipropileno etoxilado, lauril alcohol poliglicol eter acetal, esteres de sorbitol, soluciones de residuos de lignosulfito y metilcelulosa.

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[0103] Sustancias que son adecuadas para la preparacion de soluciones directamente pulverizables, emulsiones, pastas o dispersiones de aceite son fracciones de aceite mineral de punto de ebullicion de medio a alto, tales como queroseno o gasoleo, ademas aceites de alquitran de carbon y aceites de origen vegetal o animal, hidrocarburos alifaticos, ciclicos y aromaticos, por ejemplo tolueno, xileno, parafina, tetrahidronaftaleno, naftalenos alquilados o sus derivados, metanol, etanol, propanol, butanol, ciclohexanol, ciclohexanona, isoforona, solventes altamente polares, por ejemplo dimetilsulfoxido, N-metilpirrolidona o agua.

[0104] Tambien agentes anti-congelacion tales como glicerina, etilenglicol, propilenglicol y bactericidas tales se pueden anadir a la formulacion. Agentes antiespumantes adecuados son por ejemplo agentes antiespumantes basados en silicona o estearato de magnesio.

[0105] Conservantes adecuados son por ejemplo diclorofeno y enzilalcoholhemiformal. Formulaciones de tratamiento de semilla de girasol pueden adicionalmente comprender ligantes y opcionalmente colorantes. Los ligantes se pueden anadir para mejorar la adhesion de los materiales activos en las semillas despues del tratamiento. Ligantes adecuados son surfactantes de copolimeros EO/PO en bloque pero tambien polivinilalcoholes, polivinilpirrolidonas, poliacrilatos, polimetacrilatos, polibutenos, poliisobutilenos, poliestireno, polietileneaminas, polietileneamidas, polietilenoiminas (Lupasol®; Polymin®), poli eteres, poliuretanos, polivinilacetato, tilosa y copolimeros derivados de estos polimeros.

[0106] Opcionalmente, colorantes se pueden incluir en la formulacion. Colorantes adecuados o colorantes para formulaciones de tratamiento de semilla son rodamina B, C.I. pigmento rojo 112, C.I. solvente rojo 1, pigmento azul 15:4, pigmento azul 15:3, pigmento azul 15:2, pigmento azul 15:1, pigmento azul 80, pigmento amarillo 1, pigmento amarillo 13, pigmento rojo 112, pigmento rojo 48:2, pigmento rojo 48:1, pigmento rojo 57:1, pigmento rojo 53: 1, pigmento naranja 43, pigmento naranja 34, pigmento naranja 5, pigmento verde 36, pigmento verde 7, pigmento blanco 6, pigmento marron 25, violeta basico 10, violeta basico 49, rojo acido 51, rojo acido 52, rojo acido 14, azul acido 9, amarillo acido 23, rojo basico 10, rojo basico 108.

[0107] Un ejemplo de un agente gelificante adecuado es carragenina (Satiagel®). Polvos, materiales para extension, y productos polvables se pueden preparar mediante la mezcla o trituracion de forma concomitante de las sustancias activas con un portador solido. Granulos, por ejemplo granulos recubiertos, granulos impregnados y granulos homogeneos, se pueden preparar por union de los compuestos activos a portadores solidos. Ejemplos de portadores solidos son suelos minerales tales como geles de silice, silicatos, talco, caolin, atapulgita, piedra caliza, cal, yeso, bole, loes, arcilla, dolomita, tierra diatomacea, sulfato de calcio, sulfato de magnesio, oxido de magnesio, materiales sinteticos molidos, fertilizantes, tales como, por ejemplo, sulfato de amonio, fosfato de amonio, nitrato de amonio, ureas y productos de origen de vegetal, tales como harina de cereales, harina de corteza de arbol, harina de madera y harina de cascara de nuez, polvos de celulosa y otros portadores solidos.

[0108] En general, las formulaciones comprenden de 0,01 a 95% en peso, preferiblemente de 0,1 a 90% en peso, del herbicida inhibidor de AHAS. En este caso, los herbicidas inhibidores de AHAS se emplean en una pureza de 90% a 100% en peso, preferiblemente de 95% a 100% en peso (segun el espectro NIVIR). Para fines de tratamiento de semillas de girasol, formulaciones respectivas se pueden diluir de 2-10 veces llevando a concentraciones en preparaciones listas para su uso de 0,01 a 60% de compuesto activo en peso por peso, preferiblemente de 0,1 a 40% en peso.

[0109] El herbicida inhibidor de AHAS se puede usar como tal, en forma de sus formulaciones o usar formas preparadas a partir de este, por ejemplo en forma de soluciones directamente pulverizables, polvos, suspensiones o dispersiones, emulsiones, dispersiones de aceite, pastas, productos polvables, materiales para extension, o granulos, mediante pulverizacion, atomizacion, espolvoreo, extension o vertido. El uso de formas depende en su totalidad de los fines destinados; se desea garantizar en cada caso la distribucion mas fina posible del herbicida inhibidor de AHAS segun la presente invencion.

[0110] El uso de formas acuosas se puede obtener a partir de concentrados de emulsion, pastas o polvos humedecibles (polvos pulverizables, dispersiones de aceite) anadiendo agua. Para preparar emulsiones, pastas o dispersiones de aceite, las sustancias, como tales o disueltas en un aceite o solvente, se pueden homogeneizar en el agua mediante un humectante, adherente, dispersante o emulsionante. Sin embargo, tambien es posible preparar concentrados compuestos por sustancia activa, humectante, adherente, dispersante o emulsionante y, si es apropiado, solvente o aceite, y tales concentrados son adecuados para dilucion con agua.

[0111] Las concentraciones de compuesto activo en las preparaciones listas para su uso se pueden variar dentro de gamas relativamente amplias. En general, ellos van de 0,0001 a 10%, preferiblemente de 0,01 a 1% por peso.

[0112] En una forma de realizacion de la presente invencion, otro sujeto de la presente invencion es un metodo de tratamiento de tierra mediante la aplicacion, en particular en la sembradora: bien de una formulacion granulosa que contiene el herbicida inhibidor de AHAS como una composicion/formulacion (por ejemplo, una formulacion granulosa, con opcionalmente uno o varios solidos o liquidos, portadores aceptables agricolas y/o opcionalmente con uno o varios surfactantes aceptables agricolas. Este metodo es ventajosamente empleado en semilleros de girasoles.

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[0113] Formas de realizacion de la presente invencion tambien describen semillas de girasol recubiertas con y/o que contienen una formulacion de tratamiento de semilla que comprende al menos un herbicida inhibidor de AHAS seleccionado del grupo que consiste en amidosulfuron, azimsulfuron, bensulfuron, chlorimuron, clorsulfuron, cinosulfuron, ciclosulfamuron, etametsulfuron, etoxisulfuron, flazasulfuron, flupirsulfuron, foramsulfuron, halosulfuron, imazosulfuron, iodosulfuron, mesosulfuron, metsulfuron, nicosulfuron, oxasulfuron, primisulfuron, prosulfuron, pirazosulfuron, rimsulfuron, sulfometuron, sulfosulfuron, tifensulfuron, triasulfuron, tribenuron, trifloxisulfuron, triflusulfuron, tritosulfuron, imazametabenzo, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquin, imazetapir, cloransulam, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam, penoxsulam, bispiribac, piriminobac, propoxicarbazona, flucarbazona, piribenzoxim, piriftalid y piritiobac.

[0114] El termino semilla abarca semillas y propagulos vegetales de cualquier tipo, incluyendo pero no limitado a, semillas reales, piezas de semilla, brotes, cormos, bulbos, fruta, tuberculos, granos, recortes, brotes de corte y similares y se refiere, en una forma de realizacion preferida, a semillas reales.

[0115] El termino “recubierto con y/o que contiene” generalmente significa que la sustancia activa esta en su mayor parte en la superficie del producto de propagacion cuando se aplica, aunque una parte superior o inferior del ingrediente puede penetrar en el producto de propagacion, dependiendo del metodo de aplicacion. Cuando el producto de propagacion es (re)plantado, puede absorber la sustancia activa.

[0116] La aplicacion de tratamiento a la semilla de girasol con el herbicida inhibidor de AHAS o con una formulacion que comprende el herbicida inhibidor de AHAS se realiza pulverizando o espolvoreo las semillas antes de la siembra de las plantas y antes de la emergencia de las plantas.

[0117] En el tratamiento de semillas de girasol, las formulaciones correspondientes se aplican por tratamiento de las semillas con una cantidad eficaz del herbicida inhibidor de AHAS o una formulacion que comprende el herbicida inhibidor de AHAS.

Aqui, los indices de aplicacion son generalmente de 0,1 g a 10 kg del ingrediente activo (”a.i.”) (o de la mezcla de a.i. o de la formulacion) por 100 kg de semilla, preferiblemente de 1 g a 5 kg por 100 kg de semilla, en particular de 1 g a 2,5 kg por 100 kg de semilla.

[0118] Tambien se describe lo siguiente:

1. Una planta de girasol que tiene resistencia a un herbicida de imidazolinona, un herbicida de sulfonilurea, un herbicida de triazolopirimidina, un herbicida de pirimidiniloxibenzoato y sus mezclas derivadas, donde el contenido de aceite de la semilla de dicha planta es mayor de 40%.

2. Una planta de girasol que tiene resistencia para un herbicida de imidazolinona, un herbicida de sulfonilurea, un herbicida de triazolopirimidina, un herbicida de pirimidiniloxibenzoato y sus mezclas derivadas, donde el rendimiento de semilla de dicha planta es de mas de una tonelada por hectarea.

3. Una planta de girasol que tiene resistencia a un herbicida de imidazolinona, un herbicida de sulfonilurea, un herbicida de triazolopirimidina, un herbicida de pirimidiniloxibenzoato, y sus mezclas derivadas, donde dicha planta de girasol tiene una cabeza unica.

4. La planta de girasol segun la forma de realizacion 1 o la forma de realizacion 3, donde dicha planta de girasol produce mas de una tonelada de semilla por hectarea.

5. La planta de girasol segun la forma de realizacion 1 o forma de realizacion 2, donde la planta de girasol tiene una cabeza unica.

6. La planta de girasol segun la forma de realizacion 2 o la forma de realizacion 3, donde el contenido de aceite de la semilla de dicha planta de girasol es mayor de 40%.

7. La planta de girasol de la forma de realizacion 1, donde dicha planta de girasol produce mas de una tonelada de semilla por hectarea, y donde dicha planta tiene una cabeza unica.

8. La planta de girasol segun cualquiera de las formas de realizacion 1-7, donde dicha planta de girasol comprende un gen AHAS mutante, donde dicho gen mutante codifica una mutacion en el aminoacido 574 o su equivalente, donde el aminoacido 574 o su equivalente es un aminoacido diferente del triptofano.

9. La planta de girasol de la forma de realizacion 8, donde el aminoacido 574 o su equivalente es leucina.

10. La planta de girasol segun cualquiera de las formas de realizacion 1-7, dicha planta de girasol tiene un gen AHASL1 con la secuencia de nucleotidos expuesta en SEC ID n.°: 1.

11. La planta de girasol segun cualquiera de las formas de realizacion 1-7, dicha planta de girasol produce una proteina AHASL1 que tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID n.°: 2.

12. Un acido nucleico aislado que comprende SEC ID n.°: 1

13. Una celula vegetal de girasol transformada de forma estable con un acido nucleico que tiene la secuencia de SEC ID n.°: 1.

14. Una planta de girasol transgenico, donde dicha planta comprende un transgen que comprende SEC ID n.°: 1.

15. Un casete de expresion que comprende un activo promotor en plantas de girasol operativamente enlazado a un acido nucleico aislado que codifica una proteina que comprende la secuencia codificada por SEC ID n.°: 1.

16. Un metodo para controlar hierbajos en la proximidad de una planta de girasol que comprende la

aplicacion de un herbicida a los hierbajos y a la planta de girasol, donde el herbicida se selecciona del grupo que consiste en un herbicida de imidazolinona, un herbicida de sulfonilurea, un herbicida de triazolopirimidina, un

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herbicida de pirimidiniloxibenzoato y sus mezclas derivadas,

donde la planta de girasol es una planta segun cualquiera de las formas de realizacion 1-9 o 11-12.

17. Una semilla de girasol, donde la planta crecida a partir de dicha semilla tiene resistencia a un herbicida de

imidazolinona, un herbicida de sulfonilurea, un herbicida de triazolopirimidina, un herbicida de

pirimidiniloxibenzoato y sus mezclas derivadas, y donde el contenido de aceite de la semilla de dicha planta es mayor de 40%.

18. Una semilla de girasol, donde la planta crecida de dicha semilla tiene resistencia a un herbicida de

imidazolinona, un herbicida de sulfonilurea, un herbicida de triazolopirimidina, un herbicida de

pirimidiniloxibenzoato y sus mezclas derivadas, y donde el rendimiento de semilla de dicha planta es mas de una tonelada por hectarea.

19. Una semilla de girasol, donde la planta crecida a partir de dicha semilla tiene resistencia a un herbicida de

imidazolinona, un herbicida de sulfonilurea, un herbicida de triazolopirimidina, un herbicida de

pirimidiniloxibenzoato, y sus mezclas derivadas, y donde dicha planta de girasol tiene una cabeza unica.

20. La semilla de girasol segun la forma de realizacion 17 o la forma de realizacion 19, donde dicha planta de girasol crecida a partir de dicha semilla produce mas de una tonelada de semilla por hectarea.

21. La semilla de girasol segun la forma de realizacion 17 o la forma de realizacion 18, donde la planta de girasol crecida a partir de dicha semilla tiene una cabeza unica.

22. La semilla de girasol segun la forma de realizacion 18 o la forma de realizacion 19, donde el contenido de aceite de la semilla de dicha semilla es mayor de 40%.

23. La semilla de girasol de la forma de realizacion 17, donde la planta de girasol crecida a partir de dicha semilla produce mas de una tonelada de semilla por hectarea, y donde dicha planta tiene una cabeza unica.

24. La semilla de girasol segun cualquier de las formas de realizacion 17-23, dicha planta de girasol tiene un gen AHASL1 con la secuencia de nucleotidos expuesta en SEC ID n.°: 1.

25. La planta de girasol segun cualquier de las formas de realizacion 17-23, dicha planta de girasol produce una proteina AHASL1 que tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID n.°: 2.

26. La semilla de girasol segun cualquiera de las formas de realizacion 17-23, donde dicha semilla de girasol comprende un gen AHAS mutante, donde dicho gen mutante codifica una mutacion en el aminoacido 574 o su equivalente, donde el aminoacido 574 o su equivalente es un aminoacido diferente del triptofano.

27. La semilla de girasol de la forma de realizacion 26, donde el aminoacido 574 o su equivalente es leucina.

28. Un metodo para controlar selectivamente hierbajos en un campo que contiene semillas de girasol plantada o plantas que comprenden:

plantar una semilla de girasol segun cualquiera de las formas de realizacion 17-23 o 26-27, y aplicar una cantidad suficiente de un herbicida para controlar los hierbajos, donde dicho herbicida se selecciona del grupo que consiste en una sulfonilurea, una imidazolinona, unos pirimidiniloxibenzoatos, una triazolopirimidina y sus mezclas derivadas.

29. Un metodo de mejora de la tolerancia al herbicida en una planta de girasol que comprende:

transformar una celula de girasol con un constructo que comprende una secuencia de acidos nucleicos que codifica la proteina codificada por SEC ID n.°: 1, regenerar la celula de girasol en una planta de girasol; y

seleccionar plantas de flor fertil que sean vegetativas y reproductivas resistentes a una dosis efectiva de herbicida, donde el herbicida se selecciona del grupo que consiste en una sulfonilurea, una imidazolinona, unos pirimidiniloxibenzoatos, una triazolopirimidina y sus mezclas derivadas.

30. Un metodo para producir una planta de girasol resistente al herbicida que comprende:

cruzar una primera planta de girasol que tiene actividad de AHAS resistente al herbicida con una segunda planta de girasol que no tiene actividad de AHAS resistente al herbicida, donde dicha primera planta de girasol comprende un acido nucleico que codifica la proteina codificada por SEC ID n.°: 1.

31. El metodo de la forma de realizacion 30, que comprende ademas la selection para una planta descendiente que tiene actividad de AHAS resistente al herbicida.

32. Una semilla de una planta de girasol producida por el metodo de la forma de realizacion 30, donde la semilla comprende las caracteristicas resistentes al herbicida de la primera planta de girasol.

33. Una semilla de cultivo de girasol designada RW-B, una semilla representativa de dicho cultivo de girasol que se ha depositado bajo el numero de acceso de la ATCC: PTA-9176.

34. Una planta de girasol, o una parte de la misma, producido por crecimiento de la semilla de la forma de realizacion 33.

35. Polen de la planta de la forma de realizacion 34.

36. Un ovulo de la planta de la forma de realizacion 34.

37. Una planta de girasol, o una parte de la misma, que tiene todas las caracteristicas fisiologicas, resistentes a los herbicidas y morfologicas de la planta segun la forma de realizacion 34.

38. Semillas de la planta de la forma de realizacion 37, donde plantas producidas por crecimiento de las semillas tienen todas las caracteristicas fisiologicas y morfologicas de las plantas producidas por semillas en crecimiento depositadas bajo el numero de acceso de la ATCC: PTA-9176.

39. Un cultivo de tejido de celulas regenerables de la planta de girasol segun la forma de realizacion 34.

40. El cultivo de tejido segun la forma de realizacion 39, donde las celulas del cultivo de tejido comprenden una hoja, polen, un embrion, un cotiledon, un hipocotilo, celulas meristematicas, una raiz, una punta de raiz, un antera, una flor, una semilla, un vastago, ovulos, brotes, tallos, varillas, capsula de mesocarpio o una vaina.

41. Una planta de girasol generada a partir del cultivo de tejido de la forma de realizacion 40.

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42. Una planta de girasol generada a partir del cultivo del tejido de la forma de realizacion 40, donde la planta regenerada es capaz de expresar todas las caracteristicas morfologicas y fisiologicas del cultivo de girasol RW-B, la semilla representativa del cultivo de girasol RW-B que se ha depositado bajo el numero de acceso de la ATCC: PTA-9176.

43. Un metodo para producir una semilla de girasol que comprende:

cruzar una primera planta de girasol original con una segunda planta de girasol original, y recoger la semilla de girasol de la primera generacion resultante, donde la primer o la segunda planta de girasol original es una planta de girasol segun la forma de realizacion 34 o una planta de girasol que tiene todas las caracteristicas fisiologicas y morfologicas de una planta segun la forma de realizacion 37.

44. Un metodo para producir una planta de girasol derivado de RW-B, que comprende:

cruzar la linea de girasol RW-B, semilla representativa del cultivo de girasol RW-B que se ha depositado bajo numero de acceso de la ATCC:

PTA-9176, con una segunda planta de girasol para producir semilla de girasol descendiente; y cultivar la descendiente para producir la planta de girasol derivado de RW-B.

45. Un cultivo de tejido de celulas regenerables de la planta de girasol segun la forma de realizacion 37.

46. El cultivo de tejido segun la forma de realizacion 45, donde las celulas del cultivo de tejido son de una hoja, polen, un embrion, un cotiledon, un hipocotilo, celulas meristematicas, una raiz, una punta de raiz, un antera, una flor, una semilla, un vastago, ovulos, brotes, tallos, varillas, capsula de mesocarpio o una vaina.

47. Una planta de girasol generada a partir del cultivo de tejido de la forma de realizacion 45.

48. Una planta de girasol generada a partir del cultivo del tejido de la forma de realizacion 45, donde la planta regenerada es capaz de expresar todas las caracteristicas morfologicas y fisiologicas del cultivo de girasol RW-B, la semilla representativa del cultivo de girasol RW-B que se ha depositado bajo el numero de acceso de ATCC: PTA-9176.

[0119] Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustracion y no a modo de limitacion.

Identificacion de plantas resistentes

[0120] 300 semillas de una poblacion de girasol salvaje conocida por ser tolerante a IMIs se sembraron bajo condiciones de invernadero en la Nidera Experimental Station en Venado Tuerto, Santa Fe, Argentina, con las lineas de control HA89; B770 (Susceptible - “S”), BTI-M1 y RHA426 (Resistente - “R”). En la fase V4 todas las plantas fueron pulverizadas con imazapir a razon de 80 gr ai/ha. Dos semanas despues del tratamiento, todas las plantas fueron evaluadas por inspeccion visual para dano. Las lineas S HA89 y B770 fueron matadas por el tratamiento. La linea R RHA426 mostro signos de clorosis y la linea R BTI-M1 1 no presento ninguna senal de dano. En total, 159 Plantas de la poblacion salvaje resistio el tratamiento herbicida y 129 fueron matadas (categorizadas como S). Ademas, 18 de las 159 plantas que sobrevivieron al tratamiento herbicida no mostraron ninguno de los sintomas de dano por herbicida, similar a la linea mutante R BTI-M 1, y fueron categorizadas como R.

Genetica de resistencia

[0121] Un planta R (RW-73) se uso como macho en cruces con las lineas susceptibles cultivadas HA89 y B770. Diez de las 20 plantas F1 de cada cruce fueron pulverizadas con imazapir a razon de 80 gr ai/ha, usando B770 (S) y BTI-M1 (R) como controles. Ninguna de las plantas F1 mostro sintomas de dano por herbicida, lo que fue similar a las plantas BTI- M1. Sin embargo, el tratamiento de imazapir mato las plantas B770.

[0122] Un F1 planta del cruce HA89/RW-73 fue retrocruzada con el original susceptible. Tambien, una planta del cruce B770/RW-73 fue retrocruzada con B770. Semillas F2 fueron obtenidas por polinizacion de plantas F1 entre ellas.

[0123] Las semillas BC 1 F 1 y F2 obtenidas fueron sembradas bajo condiciones de invernadero junto con B770 y BTI- M1, usados como controles susceptibles y resistentes, respectivamente. En la fase V3-V4 todas las plantas fueron pulverizadas con imazapir a razon de 80 gr ai/ha. Las plantas fueron marcadas 14 dias despues del tratamiento como R, S o I (intermedio). Las plantas fueron categorizadas como R si no mostraron ningun dano por herbicida, S si murieron o I si mostraron reduccion de altura o clorosis. Los resultados de la herencia de resistencia a imidazolinona en RW-73 se muestran en la tabla 1 mostrada en la FIG. 3.

[0124] En particular, la Tabla 1 muestra la respuesta de las plantas de girasol [resistente (R), intermedio (I), susceptible (S)] a imazapir aplicado a razon de 80 g a.i.ha-1 en poblaciones F1, F2 y BC1F1 resultantes de cruces entre la linea resistente, RW-73, y uno de las dos lineas susceptibles, B770 y HA89, y las pruebas de chi-cuadrado de modelo de locus unico para control de resistencia.

[0125] Las poblaciones F2 resultantes a partir de cruces de susceptibles con resistentes mostro un buen ajuste para una proporcion 1:2:1 R:I:S, indicando segregation de un gen unico para resistencia a imazapir. Para confirmar estos resultados de las poblaciones F2, plantas F1 se cruzaron en pruebas con los originales susceptibles y los descendientes resultantes fueron evaluados para reaction a imazapir. Las poblaciones BC1F1 dieron un buen ajuste para una proporcion 1:1 I:S, confirmando la hipotesis del locus unico (Tabla 1).

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[0126] Los resultados del estudio genetico indican que la resistencia en RW-73 se hereda como una caracteristica parcialmente dominante conferida por un gen unico codificado nuclear. Este modelo de herencia es compatible con otras conclusiones que han proporcionado el control genetico de resistencia a los herbicidas inhibidores de AHAS.

Desarrollo de una linea de girasol que es homocigotica para la caracteristica de resistencia al herbicida de RW-73

[0127] La condicion heterogenea y heterozigota de la poblacion de girasol salvaje analizada anteriormente excluye su uso en el relativo nivel de comparaciones de resistencia con respecto a las lineas cultivadas que portan caracteristicas de resistencia a los herbicida. Usando el retrocruce asistido por marcador, una linea resistente cercanamente parecida a B770 fue desarrollada y fue codificada RW-B. RW-B era homocigotico para el gen de resistencia dado que su descendiente obtenido por autofecundacion no segrego para susceptibilidad despues la aplicacion de imazapir.

Resistencia de RW-B a diferentes herbicidas inhibidores de AHAS

[0128] Lineas de girasol: las siguientes lineas de girasol genetico fueron usadas en la determination de la resistencia a AHAS: dos lineas S (”B770” y “HA89”), dos lineas resistentes a SUs derivadas de la poblacion SURES (SuBL y SuRL), dos lineas resistente a IMIs derivadas de la poblacion IMISUN (”Rha 426” y “B770imi”) y la linea “Rw-B”. HA89 y Rha426 son lineas innatas publicas liberadas por el USDA. SURES e IMISUN son poblaciones de cultivo liberadas por el USDA. B770 es una linea exclusiva de Nidera. B770imi es una linea exclusiva con antecedentes B770 que llevan el gen resistente Imr1. RW-B se obtuvo como se ha descrito anteriormente.

[0129] Metodo: ocho semillas de cada una de las siete lineas fueron sembradas en vasijas de 20 por 20 por 30 cm. Despues de la emergencia, las plantulas se adelgazaron a mano dejando 4 plantulas por vasija. Cinco vasijas de cada linea fueron tratadas con un herbicida diferente o dosis. Una vasija de control no tratada de cada linea fue incluida en cada experimento Las plantas se cultivaron en un invernadero bajo condiciones de luz natural suplementadas con lamparas halogenas de 400 W para proporcionar un dia de 14 h de duration. Temperaturas de dia/de noche fueron 25 y 20°C, respectivamente. En la fase V4 de desarrollo (Schneiter and Miller 1981) las plantas fueron pulverizadas con tres herbicidas SU (clorsulfuron, nicosulfuron y foramsulfuron), tres IMIs (Imazamox, imazapir e imazapic), un POB (Bispiribac-Na) y un TP (Cloransulam-metil). Catorce dias despues del tratamiento las plantas fueron marcadas fenotipicamente utilizando un indice de fitotoxicidad (PI). El PI es una escala fenotipica de 0 a 9 que fue evaluada para cada vasija por inspection visual. Las plantas sin ningun sintoma fueron registradas como “0”, el aumento en los niveles de retraso en el crecimiento y amarilleo con respecto a las plantas de control no tratadas se registraron como “1” a “4”, niveles en aumento de anomalias en las hojas y necrosis en las hojas fueron registrados de “5” a “8” y las plantas muertas con necrosis total del apice fueron registradas como “9”. Los datos del PI para cada experimento fueron analizados por una prueba ANOVA, fueron comparados por una prueba LSD.

[0130] Los resultados se muestran en la Tabla 2 de la figura 4, que muestra el indice de fitotoxicidad de siete lineas de girasol pulverizadas con herbicidas inhibidores de AHAS diferentes; Tabla 2. Respuesta de lineas de girasol (B770; HA89, SuBL, SuRL, Rha426, B770imi y RW-B) a cuatro familias diferentes de herbicidas inhibidores de AHAS. Los datos MS entre las lineas significan suma cuadrado, *** P< 0,001, menor valor de diferencia significativa LSD. Valores medios con la misma letra indican que no son estadisticamente diferente (P<0,01). El dano fue medido utilizando el indice de fitotoxicidad (PI).

[0131] El lineas S HA89 y B770 fueron matadas por todas las aplicaciones de herbicidas. Las lineas resistentes al SU SuBL y SuRL fueron resistentes a los tres SUs usados, pero fueron matadas por todos los demas herbicidas. Las lineas resistentes a IMI Rha426 y B770imi fueron moderadamente resistentes a los tres IMIs y fueron altamente susceptibles al SUs, el POB y el TP. Notablemente, RW-B, mostro niveles altos de resistencia a las cuatro familias de herbicidas. Sorprendentemente, la linea RW-B mostro lo mismo nivel de resistencia a SUs que las lineas resistentes al SU SuBL y SuRL y un mejor nivel de resistencia a IMIs que las lineas resistentes a IMI Rha426 y B770imi. Ademas, en otro resultado sorprendente, RW-B mostro un nivel alto de resistencia a un POB y un TP. Ningunas de las otras lineas mostro este tipo de resistencia.

Prueba de alelismo

[0132] Plantas RW-B fueron cruzadas con RHA426 para determinar si el gen resistente en RW-B es alelico a Imr1, la mutation previamente descrita en lineas innatas resistentes a la imidazolinona. En este cruce, plantas de hibridos F1 fueron autopolinizadas y retrocruzadas con RHA426 para obtener las generaciones F2 y BC1F1, respectivamente. Plantas de los originales y de F1, F2 y BC1F1 fueron inoculadas con 160 g a.i. ha-1 y 320 g a.i. ha-1 de imazapir en la fase V2-V4. Tras la inoculation, las plantas fueron marcadas como se ha descrito anteriormente. Ningunas de las plantas susceptibles se observaron en las poblaciones F2 y BC1F1 resultantes de este cruce cuando se evaluaron los descendientes en el indice de herbicida inferior, indicando que los genes de resistencia en RW-B y RHA426 son alelos del mismo locus. Estos resultados se muestran en la Tabla 3 de la figura 5. En particular, la Tabla 3 muestra la respuesta de las plantas de girasol (es decir, como resistente (R) y susceptible (S)) a imazapir aplicado a indices de 80 g a.i.ha-1 y 320 g a.i.ha-1 en generaciones F1, F2 y BC1F1 resultantes de cruces entre RW-B y la linea pura que lleva el gen de resistencia a la imidazolinona Imr1, RHA 426.

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[0133] Por otro lado, cuando las poblaciones F2 y BC1F1 se marcaron despues de aplicar el herbicida en el indice mas alto (320 g a.i. ha-1), la segregacion para susceptibilidad se pudo observar. Solo dos clases fenotipicas fueron detectadas, una clase resistente compuesta por plantas no tuvieron signo de dano o solo pequenos sintomas, y un fenotipo susceptible que fue matado en esta dosis de forma similar a la linea de control RHA426. Las proporciones de segregacion observadas sobre 508 plantas F2 seleccionadas no fueron significativamente diferentes de una proporcion de segregacion 3:1 (vease tabla 3). Para confirmar estos resultados, las plantas F1 fueron retrocruzadas con RHA426 y las plantas BC1F1 resultantes fueron seleccionadas en 320 g a.i. ha-1 de imazapir. Las proporciones de segregacion observadas dieron un buen ajuste a una proporcion 1:1 R:S, confirmando que el gen resistente en RW-B mostro dominacion completa sobre el gen resistente en RHA426, y que ambos genes resistentes son alelos del mismo locus, AHAS1.

Cosegregacion de haplotipo AHAS1 con resistencia al herbicida

[0134] Materiales y metodos: ADN fue aislado a partir de hojas jovenes de las lineas B770, RW-B y RHA426 al igual que de plantas individuales F1 y F2 del cruce RW-B/RHA426 utilizando el metodo de Dellaporta (1983). Fragmentos del gen AHAS1 fueron amplificados por PCR utilizando los cebadores p-AHAS18 y p-AHAS 19 (Kolkman et al., 2004). Productos de PCR fueron amplificados en una reaccion de 15-pl que contenia 1 U Taq de ADN polimerasa (Biotools), 70 ng de ADN de girasol genomico, 25 pg de albumina de suero bovino (BSA), con una concentration final de 100 pM de cada dNTP, 0,25 pM de cada cebador, 90 MM Tris-HCl pH 8, 20 mM (NH4)2SO4 y 2,5 mM MgCh. El programa de PCR consistio en un paso de desnaturalizacion inicial a 94°C durante 2 min, seguido de 40 ciclos de 30 s a 94°C, 30 S a 56°C y 30 s a 72°C, seguidos de un paso de alargamiento final a 72°C durante 10 min. Los productos de amplificacion (3 pl/via) fueron separados en un gel de secuenciacion estandar que contenia 6% de poliacrilamida, 8 M de urea y 1X TBE, a una potencia constante de 60 W durante 2 a 3 h, y fueron detectados por coloration de nitrato de plata (Silver Sequence™ Promega Biotech, EE.UU.). El tamano de cada alelo SSR fue estimado utilizando un marcador de peso molecular y una reaccion de secuenciacion estandar en vias adyacentes del gel.

[0135] Resultados: el gen AHAS1 en el girasol presenta un polimorfismo de repetition de secuencia simple (SSR) que permite la discrimination de las lineas que portan el alelo lmr1 a partir de cualquier otro genotipo de girasol (Kolkman et al., 2004). La amplification por PCR del fragmento del gen AHAS1 que contiene esta SSR utilizando los cebadores p- AHAS18 y p-AHAS 19 libero un producto de 321 pares de bases para RW-B y un fragmento de 312 pares de bases para RHA426. Este polimorfismo variante en longitud detectado en RW-B y RHA426 fue aprovechado para investigar la segregacion en las poblaciones F2 y BC1F1 derivadas de cruzamiento de ambas lineas. Ciento once plantas de la poblacion F2 y 126 plantas de la poblacion BC1F1 fueron elegidas al azar, muestreadas para aislamiento de ADN, inoculadas con un indice de aplicacion de imazapir de 320 g a.i. ha-1 y genotipadas usando este marcador. En la poblacion F2, 30 plantas fueron matadas por el herbicida (S) y 81 no mostraron ningun sintoma o dano ligero (R). Estos datos se muestran en la tabla 4. En particular, la Tabla 4 muestra la reaccion de las plantas de girasol (es decir, como resistente (R) y susceptible (S)) a imazapir aplicado a un indice de 320 g a.i. ha-1 y segregacion de haplotipo AHAS1 (A = haplotipo rW-B, B = haplotipo RHA426) en la poblacion F2 y BC1F1 derivada del cruce RW-B / RHA426.

[0136] La proporcion de segregacion observada para resistencia no fue significativamente diferente de la proporcion de segregacion esperada para un factor completamente dominante segregando en F2 (3R: 1 S). La segregacion observada para el marcador SSR de AHAS1 (26 A/A: 55 A/B: 30 B/B) establece una proporcion de segregacion prevista para un marcador codominante segregando en F2 (1:2:1). Todas las plantas susceptibles genotipadas para el SSR de AHAS1 fueron homocigoticas para el halotipo RHA426 (B/B), mientras que las plantas R fueron bien heterocigoticas (A/B) u homocigoticas para el haplotipo RW-B (A/A) (vease tabla 4). La cosegregacion de fenotipos de resistencia al herbicida y haplotipos AHAS1 fue ademas evaluada en 126 descendientes de BC1F1 segregando para resistencia. Proporciones de segregacion observadas para resistencia establecen una proporcion 1:1 como la prevista para la segregacion de un locus en BC1F1. Los haplotipos SSR de AHAS1 cosegregaron completamente con fenotipos para reaccion al herbicida, 64 A/B: 62 BB. Los descendientes susceptibles fueron homocigoticos para el haplotipo RHA426 (B/B), mientras que los descendiente resistentes fueron heterocigoticos para los haplotipos RHA426 y RW-B (A/B). Estos resultados confirman que el gen resistente en RW-B es diferente del gen de resistencia en RHA426 y que ambos genes son variantes alelicas del locus AHAS1.

Amplificacion por PCR y secuenciacion del gen AHAS1 de girasol a partir de RW-B

[0137] ADN genomico fue extraido de tejido de hoja de girasol usando el equipo de Qiagen DNeasy 96 Plant (catalogo n° 69181). El gen AHAS1 fue amplificado por PCR en tres fragmentos y directamente secuenciado por Macrogen EE.UU. La amplificacion por PCR fue realizada con Hotstart Taq ADN polimerasa de Qiagen y reactivos asociados (catalogo n.°: 203205). Los cebadores de PCR para los tres fragmentos son de la siguiente manera: AHAS1F1 (cebador sentido 1-19 pares de bases de la secuencia publico de girasol AY541451) 5'ATGGCGGCTCCTCCCAACC3', AHAS1R1 (cebador antisentido 757-777 pares de bases de la secuencia publica de girasol AY541451) 5'CGGTAACCTCATCGGTTCATC3', AHAS1F2 (cebador sentido 757-777 pares de bases de la secuencia publica de girasol AY541451) 5'GATGAACCGATGAGGTTACCG3', AHAS 1 R2 (cebador antisentido 1794-1814 pares de bases de la secuencia publica de girasol AY541451) 5'TCCGCCTTTTGGGTCACTCGA3', AHAS1F3 (cebador sentido 1248-1269 pares de bases de la secuencia publica de girasol AY541451) 5'GGTGACTAATCTTGATTTTTCG3' y AHAS1R3 (cebador antisentido 1949-1968 pares de bases de la secuencia publica de girasol AY541451)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

5TCAATATTTCGTTCTGCCAT3’.

[0138] Los tres fragmentos de PCR cubren todos los sitios de mutacion conocidos por conferir resistencia a los herbicidas IMI. Una alineacion de nucleotidos fue producida y los cromatografos resultantes examinados para polimorfismos entre la linea susceptible B770 y la linea resistente RW-B.

Resultados de la secuenciacion del gen AHASL1 de girasol

[0139] Productos de PCR fueron secuenciados para producir las secuencias AHASL1 para las lineas de girasol RW-B y B770. Una alineacion de estas secuencias de nucleotidos y las secuencias de nucleotidos del gen AHAS de Xantium sp. (numero de acceso del Genbank U16280) se muestran en la figura 1.

[0140] En particular, la figura 1 muestra una alineacion de secuencia de ADN parcial de la region codificante del gen AHASL1 a partir de HA89 (numero de acceso del GenBank AY541451) (SEC ID N°: 3), linea B770 (SEC ID n.°: 4), linea resistente Rw-B (SEC ID n.°: 5), gen ALS de Xantium sp. (numero de acceso del GenBank U16280) (SEC ID N°: 6) y gen AHAS de Arabidopsis thaliana (numero de acceso del GenBank AY124092) (SEC ID N°: 7). Los asteriscos senalan la mutacion unica encontrada en RW-B, este cambio de base es responsable de la sustitucion Trp-a-Leu en la posicion aminoacidica 574 (basado en la secuencia de Arabidopsis thaliana). Las posiciones de secuencia de nucleotidos se indican por flechas y se numeran segun la secuencia de A. thaliana.

[0141] La alineacion revelo que el gen AHASL1 de RW-B tenia una transition G-a-T con respecto al AHASL1 de B770.

[0142] Una alineacion de las secuencias de aminoacidos predichas de las secuencias de nucleotidos AHASL1 de RW-B, B770, y Xantium sp se proporciona en la figura 2.

[0143] En particular, la figura 2 muestra una alineacion de secuencia de aminoacidos parcial de la proteina AHASL1 de HA89 (numero de acceso del GenBank AY541451) (SEC ID N°: 8), linea B770 (SEC ID n.°: 9), linea resistente RW-B (SEC ID n.°: 10), gen ALS de Xantium sp. (numero de acceso del GenBank U 16280) (SEC ID N°: 11) y gen AHAS de Arabidopsis thaliana (numero de acceso del GenBank AY124092) (SEC ID N°: 12). El asterisco senala la sustitucion de aminoacidos en el codon 574 (basado en la secuencia de Arabidopsis thaliana).

[0144] Con respecto a la secuencia de aminoacidos AHASL1 de B770, la secuencia de aminoacidos AHASL1 de RW-B tiene una sustitucion triptofano-a-leucina en la posicion del aminoacido 574 en la secuencia de aminoacidos en toda su longitud codificada por la secuencia de nucleotidos AHASL de Arabidopsis thaliana. Por esta razon, este nuevo alelo del locus AHASL1 es nombrado aqui como W574L.

Comparacion de las caracteristicas agronomicas (rendimiento de grano y contenido de aceite) de los hibridos de girasol que portan el alelo W574L con respecto a hibridos convencionales (tipo salvaje) y los que portan el alelo A205V (caracteristica IMISUN)

[0145] Objetivo: este experimento fue llevado a cabo para cuantificar y contrastar el rendimiento agronomico de hibridos que portan el alelo W574L con hibridos convencionales (tipo salvaje) e imisun (alelo A205V).

[0146] Materiales: la linea RW-B fue convertida en una linea esteril macho por retrocruce repetido con una linea esteril macho citoplasmica (cms B770).

Despues de 4 retrocruces la linea esteril obtenida fue denominada “cms RW-B”.

[0147] La linea RW-B fue tambien usada como una fuente de resistencia al herbicida para convertir dos lineas convencionales restauradoras diferentes (tipo salvaje): R20 y R54. Las obtenidas cerca de lineas isogenicas fueron designadas R20-574 y R54-574.

[0148] Los hibridos F1 entre lineas convencionales IMISUN y RW-B derivadas fueron obtenidos bajo condiciones de campo. El evento de genealogia y mutacion de estos se muestra en la siguiente tabla.

Tabla 5. Hibrido 4 (cms B770 x R54) e hibrido 6 (cms B770 x IR152) son dos hibridos comerciales registrados conocidos como “Paraiso 33” y “Paraiso 103CL”, respectivamente.

Hibrido

Genealogia Alelo mutante

1

cms RW-B x R20-574 W574L

2

cms RW-B x R54-574 W574L

3

cms B770 x R20 tipo salvaje

4

cms B770 x R54 tipo salvaje

5

cms B770 imi x IR79 A205V

5

10

15

20

25

30

6

cms B770 imi x IR152

A205V

[0149] Metodos: semillas fueron sembradas bajo condiciones de campo (Venado Tuerto, Santa Fe, Argentina) en un diseno de bloque completamente aleatorizado con cuatro replicaciones. Cada grafico consistio en tres filas de 6 metros de largo y distanciadas 0,7 m. Las semillas fueron distanciadas 0,30 m en la fila.

[0150] Se registraron las siguiente variables en cada grafico: dias para floracion, altura y floracion, rendimiento (kg/HA) y porcentaje de aceite en el grano (%). Una prueba anova fue llevada a cabo sobre estas variables y los medios de los eventos diferentes e hibridos fueron comparados con la prueba de Tuckey.

[0151] Resultados: valores medios de cada evento para las 4 variables registradas se dan en la tabla 6. Como se puede observar, los tres eventos tuvieron similares rendimientos medios. El analisis detecto diferencias para contenido de aceite en la semilla entre eventos, ya que los hibridos con el alelo A205V dieron contenido de aceite inferior a los otros dos tipos de hibridos. Dias para la floracion y altura de la planta fueron tambien diferente entre eventos, ya que los hibridos que portaban el alelo W574L fueron ligeramente menores y mas tempranos que los dos otros tipos de hibridos. En conclusion, los dos hibridos que portan el alelo W574L mostraron el mismo rendimiento y contenido de aceite comparable en la semilla que los hibridos convencionales (tipo salvaje) y de IMISUN, que incluyen variedades hibridas comerciales.

[0152] Medidas de cada hibrido para cada una de la variables registradas, y los resultados del analisis de varianza se dan en la tabla 7.

Tabla 6. Valores medios para Altura, Dias para floracion (DTF), Rendimiento y Contenido de aceite para 3 genotipos diferentes (eventos de mutacion) para el locus AHASL1. El valor medio de cada genotipo o evento de mutacion es el valor medio de dos hibridos diferentes.

Alelo

Altura (m) DTF (dias) Rendimiento (kg/ha) Contenido de aceite (%)

W574L

2,14al 63,3 a 3062 a 45,8 a

WT

2,22 b 66,4 b 3523 a 46,3 a

A205V

2,17 ab 65,8 b 3119 a 44,5 b

Media

2,18 65,1 3145 45,6

1CV(%)

2,4 0,75 5,39 0,92

2MS

0,015 21,9 76845 6,58

F-valor

5,61 90,5 267 37,3

3p

<0,015 <0,0001 <0,101 <0,0001

4msd

0,068 0,64 220,2 0,55

1 Letras similares indican que no hay diferencias estadisticamente significativas entre eventos. 2 CV: coeficiente de variacion 3 MS: cuadrado medio entre eventos 4 p: valor de probabilidad del valor F 5 MSD: diferencia significativa minima de Tuckey

Tabla 7. Valores medios para Altura, Dias para floracion (DTF), Rendimiento y Contenido de aceite para 6 hibridos de girasol que portan tres genotipos diferentes (eventos de mutacion) para el locus AHASL1.

Genotipo

Alelo de mutacion Altura (m) ± SD1 DTF (dias) ± SD Rendimiento (kg/ha) ± SD Contenido en aceite (%) ± SD

Hib1

W574L 2,13±0,05 b 63,8±0,5 c 3053±198a 45,48±0,7bc

Hib2

W574L 2,15±0,06 b 62,8±0,5 c 3071±80a 46,18±0,3ab

Hib3

WT 2,28±0,05 a 66,3±0,5 ab 3370±311a 47,13±0,2a

Hib4

WT 2,18±0,05 al 66,5±0,6 a 3135±249a 45,45±0,4 bc

Hib5

A205V 2,20±0ab 65,3±0,5 b 3059±145a 44,80:1:0,2 cd

Hib6

A205V 2,15±0,06 b 66,3±0,5 ab 3179±164a 44,28±0,3 d

Medio

2,18 65,13 3144 45,6

2CV (%)

2,4 6,75 5,4 0,92

3MS

0,00042 9,58 58798,7 4,06

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Valor F

0,15 39,6 2,05 23,04

4p

0,014 0,0001 0,13 0,0001

5msd

0,12 1,13 389,6 0,96

1 SD: desviacion tipica, seguido de una letra que indica si alli existen diferencias entre hibridos: letras similares indican que no hay diferencias estadisticamente significativas.

2 CV: coeficiente de variation

3 MS: cuadrado medio entre hibridos

4 P: valor de probabilidad del valor F.

5 MSD: diferencia significativa minima de Tuckey.___________________________________________________

Tolerancia de la linea RW-B a 4 mezclas diferentes de dos herbicidas inhibidores de AHAS.

[0153] Objetivo: comparar el rendimiento (evaluado como indice de fitotoxicidad) de una linea que lleva el alelo W574L (RW-B) y lineas que portan los alelos P197l (SURES), A205V (IMISUN) y tipo salvaje (convencional).

[0154] Materiales: las siguientes lineas innatas de girasol fueron usadas: dos lineas susceptibles de imidazolinona (”B770” y “HA89”), dos resistentes a herbicidas SUs derivadas de poblacion SURES (”SuBL” y “SuRL”), dos lineas resistentes a los Herbicidas IMIs derivadas de IMISUN (”RHA426” y “B770imi”) y la linea “RW-B”, que porta el alelo W574L. HA89 Y RHA426 son lineas innatas publicas liberadas por el USDA. B770 Y B770imi son lineas patentadas de Nidera S.A., mientras que B770imi tiene un contexto genetico B770 que porta el gen de resistencia hmr1 (=alelo A205V) para resistencia a imidazolinonas. RW-B se obtuvo como se ha descrito anteriormente.

[0155] Metodo: ocho semillas de cada una de las siete lineas fueron sembradas en vasijas de 20 por 20 por 30 cm. Despues de la emergencia, las plantulas fueron adelgazadas a mano dejando 4 plantulas por vasija. Cinco vasijas de cada linea fueron tratadas con una mezcla diferente de herbicidas. Una vasija de control no tratada de cada linea fue incluida en cada experimento. Las plantas se cultivaron en un invernadero bajo condiciones de luz natural suplementada con lamparas halogenas de 400 W para proporcionar un dia de 14 h. Las temperaturas de dia/de noche fueron 25 y 20°C, respectivamente. En la fase V4 de desarrollo (Schneiter and Miller 1981) las plantas fueron pulverizadas con cuatro mezclas diferentes que contenian dos herbicidas inhibidores de AHAS diferentes, una sulfonilurea (metsulfuron) y una imidazolinona (imazapir). Las concentraciones de herbicidas de cada una de las cuatro mezclas herbicidas fueron de la siguiente manera: mezcla uno fue 20 g a.i./ha imazapir y 1.25 g a.i./ha metsulfuron, mezcla B fue 40 g a.i./ha imazapir y 2,5 g a.i./ha metsulfuron, mezcla C fue 80 g a.i./ha imazapir y 5 g a.i./ha metsulfuron y mezcla D fue 160g a.i./ha imazapir y 10 g a.i./ha metsulfuron.

[0156] Catorce dias despues del tratamiento las plantas fueron marcadas fenotipicamente utilizando un indice de fitotoxicidad (PI). El PI es una escala fenotipica de 0 a 9 que fue evaluada para cada vasija por inspection visual. Las plantas sin ningun sintoma se registraron como “0”, niveles en aumento de retraso en el crecimiento y amarilleo con respecto a las plantas de control no tratadas se registraron como “1” a “4”, niveles en aumento de anomalias en las hojas y necrosis en las hojas fueron registrados de “5” a “8” y las plantas muertas con necrosis total del apice fueron registradas como “9”. Los datos de PI para cada experimento fueron analizados por una prueba ANOVA; las medidas fueron comparadas por una prueba de Tuckey.

[0157] Los resultados se muestran en la tabla 8. Las lineas HA89 y B770 fueron matadas por todas las aplicaciones de mezclas herbicida. Las lineas resistentes al SU SuBL y SuRL mostraron algun nivel de tolerancia a la mezcla A y la mezcla B, pero alcanzaron un nivel alto de necrosis de hoja y retraso en el crecimiento segun aumentaron las dosis de herbicidas, por ejemplo con la mezcla C. Todas las plantas fueron matadas con la mezcla D, que tuvo las maximas dosis de ingredientes activos. Las lineas resistentes a IMI RHA426 y B770imi fueron moderadamente resistentes a la mezcla A, mezcla B y mezcla C, aunque mostraron un dano aumentado cuando la dosis de herbicidas aumento. Cuando la mezcla D fue aplicada a estas lineas, todas las plantas fueron matadas. Notablemente, RW-B, mostro tolerancia a todas las mezclas evaluadas, incluso en la mezcla que tenia la maxima concentration de ingredientes activos.

[0158] Conclusion: RW-B muestra no solo un nivel mas alto de tolerancia a cada uno de los herbicidas de inhibidores de AHAS evaluados solo sino tambien, el maximo nivel de tolerancia a una combination de herbicidas evaluados simultaneamente en una mezcla.

5

10

15

20

25

30

Tabla 8. Indice de fitotoxicidad medio de 7 lineas de girasol que portan diferentes eventos de mutacion en el locus AHASL1 cuando se inoculan a las 4 mezclas de dos herbicidas inhibidores de AHAS.

Mezcla de herbicidas

A

B

D

AHAS1

imazapir

(ga.i.ha-1)

20

40

80

160

Genotipo

Alelo

metsulfuron

-1

(ga.i.ha- )

1,25

2,5

10

B770

WT

imagen1

Ha89

WT

SuBL

P197L

imagen2

0,8c

3c

8,4a

SuRL

P197L

2,2b

4,4b

8,4a

B770imi

A205V

1,2c

2,2

4,4c

8,8a

Rha426

A205V

0,8c

3,4c

5,4b

RW-B

W574L

imagen3

0e

0,2d

0,8b

Media

3,3

4,4

47,1

34,8

6,4

32,5

7,8

28,6

p

3"

<0,0001

<0,0001

<0,0001

<0,0001

MSD

0,634

0,835

0,919

0,495

1 MS: cuadrado medio

2 p: probabilidad

3 MSD: diferencia significativa minima

C

5

a

a

a

a

9

9

9

9

a

a

a

a

9

9

9

9

a

9

a

9

a

9

a

0

Respuesta de las lineas de girasol homocigoticas para el alelo W574L comparado con las lineas homocigoticas para los alelos A205V y P197L, y el haplotipo susceptible a imazapir en toda la planta.

[0159] Objetivo: este experimento fue llevado a cabo para cuantificar y contrastar la sensibilidad a imazapir de lineas de girasol que portan el alelo homocigotico W574L comparado con lineas homocigoticas para los alelos P197L y A205V en toda la planta.

Materiales:

[0160]

Tabla 9 muestra semillas de las diferentes lineas de girasol, que fueron obtenidas bajo condiciones de campo.

Codigo

Alelo

B770

Tipo salvaje (susceptible)

B770IMI

A205V

SuBL

P197L

RW-B

W574L

[0161] Se sembraron semillas en placas de Petri y, despues de la germinacion, las plantulas fueron trasplantadas a vasijas de 10 cm de diametro en unos medios de encapsulamiento consistentes en partes iguales de vermiculita, tierra y arena. Las plantas se cultivaron en un invernadero bajo condiciones de luz natural suplementada con lamparas halogenas de 400 W para proporcionar un dia de 16 h de duracion. Las temperaturas de dia/de noche fueron 25 y 20°C, respectivamente. En la fase V2-V4 (Schneiter & Miller, 1981) 10 plantas de cada genotipo fueron asignadas de forma aleatoria a cada tratamiento que consistio en ocho dosis de imazapir (0, 40, 80, 160, 320, 480, 640 y 800 g ai/ha, sin tratamiento, 0,5x, 1x, 2x, 4x, 6x, 8x y 10x respectivamente), y una determinacion de biomasa de tiempo cero. El experimento se realizo como un diseno de bloque aleatorizado con una disposicion factorial completa (linea de girasol x tratamiento) de tratamientos y 10 replicaciones.

[0162] En el dia de la aplicacion del herbicida diez plantas de cada genotipo fueron cortadas en el nodo cotiledonal y secadas a 60°C durante 48 horas para determinar el peso en seco a tiempo cero.

[0163] Las plantas restantes fueron mantenidas durante 14 dias despues del tratamiento con imazapir (DAT) y su altura,

5

10

15

20

25

30

35

40

indice de fitotoxicidad (PI) y biomasa sobre el suelo seco fueron determinados. La altura fue determinada como la distancia entre el nodo cotiledonal y el apice de cada planta. Los datos de biomasa sobre el suelo de cada linea fueron convertidos a acumulacion de biomasa despues de aplicacion por sustraccion de la biomasa de tiempo cero media apropiada de cada muestra. Los datos de biomasa seca fueron convertidos en porcentajes de las plantas de control no tratadas dentro de cada linea para permitir comparaciones directas entre grupos. El PI es una escala fenotipica de 0 a 9 que fue evaluada para cada planta por inspeccion visual. Las plantas sin sintomas fueron registradas como “0”, niveles en aumento de retraso en el crecimiento y clorosis con respecto a las plantas de control no tratadas fueron registrados como “1” a “4”, niveles en aumento de anomalias en las hojas y necrosis en las hojas fueron registrados de “5” a “8”, y plantas muertas con necrosis total del apice fueron registradas como “9”.

[0164] Resultados:

Altura. Despues de la aplicacion de imidazolinona la altura de la planta fue seriamente reducida en las lineas susceptible (B770) y tolerante a SU (SuBL). De hecho, incluso en el indice inferior de pulverization de herbicida (0,5x), la altura fue reducida de 100% en las plantas de control no tratadas a 35,0% y 42,7% en las lineas susceptible y tolerante a SU, respectivamente. La linea tolerante a IM1 (B770IMI) mostro una reduction significativa en la altura solo despues del indice 2x de aplicacion herbicida, y luego, segun aumento el indice de herbicida la reduccion de altura fue superior, acercandose al mismo nivel que la linea susceptible a 10x (32,8%).

[0165] En cambio, la linea de girasol RW-B mostro una reduccion de altura menor cuando se inoculo con dosis aumentadas de imidazolinonas. Esta reduccion en la altura alcanzo solo el 75% de las plantas de control no tratadas de 4x a 10 x indices de aplicacion de herbicida. (Tabla 10 y figura 9).

Tabla 10. Reduccion de altura (como porcentaje de las plantas de control no tratadas) para 4 lineas que portan alelos mutantes diferentes en el locus AHASL1 de girasol cuando se inoculan con indices aumentados de imazapir.

Altura (como % de las plantas no tratadas)

Dosis (x)

0 0,5 1 2 4 6 8 10

SuBL

100 42,7b 39,1b 37,2c 37,0c CD CO 35,5c 35,1b

B770IMI

100 97,7a 95,2a 70,2b 64,0b 51,9b 40,7b 32,8c

B770

100 35,0c 31,8c 31,9d 31,9d 31,6d 31,7d 31,4c

RW-B

100 98,0a 95,4a 85,7a 75,6a 73,9a 73,9a 73,4a

Media

68,3 65,4 56,2 52,1 48,4 45,4 43,2 MS1

2926,8

3008,3 1682,6 1109,8 913,7 934,1 1022,3 P2 <0,0001

<0,0001

<0,0001

<0,0001

<0,0001

<0,0001

<0,0001

MSD3 1,27 1,287

1,159

1,216 1,129 1,294 1,558

~1------------------------------'----------------------------------------'-------------------------------------'—

MS: cuadrado medio

2 P: probabilidad

3 MSD: diferencia significativa minima

Indice de fitotoxicidad

[0166] Los cuatro mutantes evaluados mostraron grandes diferencias en sus sintomas despues de la aplicacion de indices aumentados de imazapir. La linea de girasol RW-B mostro solo una ligera reduccion de tamano de hoja y color verde mas claro que las plantas de control segun aumentaban los indices de herbicida (tabla 11). En cambio, aunque las plantas que portan el alelo A205V (B770IMI) no mostraron ningun dano en el indice 0,5x, presentaron un nivel aumentado de dano (clorosis, deformation de la hoja y necrosis de la hoja) segun las dosis de imazapir aumentaron de 1 x a 10x. Las lineas susceptibles y tolerantes a Su mostraron un comportamiento casi identico: una susceptibilidad total de 0,5x a 10 x indices de aplicacion de herbicida.

Tabla 11. Indice de fitotoxicidad para 4 lineas de girasol que portan alelos mutantes diferentes en el locus AHASL1 de girasol cuando se inoculan con indices aumentados de imazapir.

Dosis (x)

0 0,5 1 2 4 6 8 10

B770

0 8,9a 9a 9a 9a 9a 9a 9a

SuBL

0 8,6a 9a 9a 9a 9a 9a 9a

B770IMI

0 0,2b 1,7b 4,5b 4,9b 5,8b 6,8b 7b

RW-B

0 0b 0,1c 0,7c 0,9c 1,5c 2,3c 2,4c

5

10

15

20

25

30

Media

4,4 4,9 5,8 5,9 6,3 6,8 6,8

ms1

62,5 55,9 40,3 37,8 31,6 25,0 24,3

P2

<0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001

MSD3

0,464 0,605 0,421 0,365 0,445 0,498 0,428

~1------------------------------'---------------------------------------'-----------------------------------'—

MS: cuadrado medio

2 P: probabilidad

3 LSD: diferencia significativa minima

Biomasa de peso en seco sobre el suelo

[0167] Curvas de respuesta a la dosis para peso en seco de mutantes W574L, P197L y 205V se muestran en la fig. 11. Peso en seco de biomasa de evento W574L en la condition homocigotica se redujo con respecto a las plantas de control no tratadas solo en 6x, 8x y 10x indices de aplicacion herbicida. El peso en seco de plantas RW-B en 10x indice fue 78% de los controles no tratados. Mientras tanto, el peso en seco de todos los demas mutantes y linea de tipo salvaje difirieron significativamente de los de la linea RW-B en cada una de las dosis evaluadas (tabla 12).

Tabla 12. Biomasa de peso en seco sobre el suelo (como porcentaje de las plantas de control no tratadas) par 4 lineas de girasol que portan alelos mutantes diferente en el locus AHASL1 de girasol cuando se inoculan con indices aumentados de imazapir.

Peso en seco (como un % de las plantas no tratadas)

Dosis (x)

0 0,5 1 2 4 6 8 10

SuBL

100 46,6c 41,3c 38,9c 38,0c 37,8c 37,4c 36,4c

B770IMI

100 96,2b 88,5b 73,7b 69,0b 62,5b 52,1b 42,2b

B770

100 32,7d 30,2d 27,6d 26,5d 25,9d 25,7d 25,2d

RW-B

100 99,1a 97,9a 97,0a 92,1a 85,1a 80,2a 78,2a

Media

68,6 64,5 59,3 56,4 52,8 48,8 45,5

MS1

2888,5 2839,5 2542,4 2222,2 1738,9 1384,3 1312,9

P2

<0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001

MSD3

1,127 1,009 1,480 1,137 1,076 0,846 1,377

~1------------------------------'---------------------------------------'-----------------------------------'—

MS: cuadrado medio

2 P: probabilidad

3 LSD: diferencia significativa minima

[0168] Conclusion: la linea RW-B, que porta el evento mutante W574L en la condicion homocigotica en el locus AHASL1 de girasol, presento un nivel superior de tolerancia a todas las dosis evaluadas de imazapir que las lineas tolerantes a Su y tolerantes a IMI conocidas.

Respuesta del alelo mutante W574L comparado con las mutaciones A205V y P197L y el haplotipo susceptible a metsulfuron en toda la planta.

[0169] Objetivo: este experimento se llevo a cabo para cuantificar y contrastar la sensibilidad a metsulfuron en toda la planta de las lineas de girasol que portan el alelo W574L en la condicion homocigotica con lineas homocigoticas que llevan los alelos P197L y A205V

Materiales:

[0170]

Tabla 13 muestra las semillas de las diferentes lineas de girasol, que fueron obtenidas bajo condiciones de campo

Codigo

Alelo

B770

WT - Susceptible

B770IMI

A205V

SuBL

P197L

RW-B

W574L

5

10

15

20

25

30

35

40

45

[0171] Las semillas fueron sembradas en placas de Petri y, despues de la germinacion, las plantulas fueron trasplantadas a vasijas de 10 cm de diametro en unos medios de encapsulamiento consistentes en partes iguales de vermiculita, tierra y arena. Las plantas se cultivaron en un invernadero bajo condiciones de luz natural suplementada con lamparas halogenas de 400W para proporcionar una duracion de luz de 16hr. Las temperaturas de dia/de noche fueron 25 y 20oC, respectivamente. En la fase V2-V4 (Schneiter & Miller, 1981) 10 plantas de cada genotipo fueron asignadas de forma aleatoria a cada tratamiento consistente en ocho dosis de imazapir (0, 2,5, 5, 10, 15, 20 g ai/ha, sin tratamiento, 0,5x, 1x, 2x, 3x y 4x respectivamente), y una determinacion de biomasa de tiempo cero. El experimento fue dispuesto como un diseno de bloque aleatorizado con una disposition factorial completa (linea de girasol x tratamiento) de tratamientos y 10 replicaciones.

[0172] En el dia de la aplicacion de herbicida, diez plantas de cada genotipo fueron cortadas en el nodo cotiledonal y secadas a 60°C durante 48 horas para determinacion de peso seco de tiempo cero.

[0173] Las plantas restantes fueron mantenidas durante 14 dias despues del tratamiento con imazapir (DAT) y su indice de fitotoxicidad (PI) y biomasa sobre el suelo seco fueron determinados. Los datos de biomasa sobre el suelo de cada linea fueron convertidos en acumulacion de biomasa despues de la aplicacion por sustraccion de la biomasa de tiempo cero media apropiada de cada muestra. Los datos de biomasa seca fueron convertidos en porcentajes de las plantas de control no tratadas dentro de cada linea para permitir comparaciones directas entre grupos. El PI es una escala fenotipica de 0 a 9 que fue evaluada para cada planta por inspection visual. Las plantas sin sintomas fueron registradas como “0”, niveles en aumento de retraso en el crecimiento y clorosis con respecto a las plantas de control no tratadas fueron registrados como “1” a “4”, niveles en aumento de anomalias en las hojas y necrosis en las hojas fueron registrados de “5” a “8” y plantas muertas con necrosis total del apice fueron registradas como “9”.

Resultados

[0174] indice de fitotoxicidad: los mutantes mostraron grandes diferencias en su respuesta a indices aumentados de aplicacion de metsulfuron (tabla 13 y figura 12). El genotipo convencional (B770) fue matado incluso en las dosis inferiores de metsulfuron. La linea de girasol que portaba la mutation W574L en la condition homocigotica mostro solo una reduction ligera del tamano de planta y color verde mas claro que las plantas de control segun los indices de herbicida aumentaron de 0,5 a 3x (tabla 13). De hecho, solo mostro clorosis y deformaciones cuando 4x indice de metsulfuron fue aplicado. En cambio, la linea que portaba el alelo A205V (B770lMl) mostro un nivel aumentado de dano de 0,5x a 4x indice. De hecho, en el 2x indice de aplicacion de metsulfuron, casi todas las plantas de esta linea fueron matadas por el herbicida.

[0175] La linea tolerante a Su (SuBL), que porta el ya conocido alelo mutante para tolerancia a sulfonilurea en el girasol, no mostro ninguno de los sintomas o una ligera clorosis en dosis 0,5x y 1x de aplicacion de metsulfuron, pero entonces su nivel de dano aumento, alcanzando una puntuacion de 9 (todas las plantas fueron matadas por el herbicida) en 4x indice de metsulfuron.

Tabla 13. indice de fitotoxicidad para 4 lineas de girasol que portan alelos mutantes diferente en el locus AHASL1 de girasol cuando se inoculan con indices aumentados de metsulfuron.

Dosis (x)

0 0,5 1 2 3 4

B770

0 9a 9a 9a 9a 9a

SuBL

0 0,1c 1,7c 4,3c 7,2b 9a

B770IMI

0 3,3b 5,2b 8,5b 9a 9a

RW-B

0 0C 0,6d 1,1d NO OO o 5,6b

Media

3,10 4,13 5,73 7,00 8,15

MS1

178,2 144,1 139,5 85,6 28,9

P2

<0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001

MUD3

0,325 0,498 ,430 0,387 0,316

1 MS: cuadrado medio 2 P: probabilidad 3 LSD: diferencia significativa minima

Resultados:

[0176] Biomasa de peso en seco sobre el suelo: las curvas de respuesta a la dosis para peso en seco de mutantes W574L, P197L y A205V se muestran en la figura 5 y la tabla 14. Las lineas tolerantes y susceptibles a IMI mostraron

5

10

15

20

25

30

35

40

45

una reduccion inmediata en el peso en seco despues de la aplicacion de herbicida. La biomasa de la linea tolerante a Su fue reducida de 83,3% a 30,3% de las plantas de control no tratadas como indices de metsulfuron aumentado de 0,5 a 4x.

[0177] De manera interesante, la linea RW-B no mostro una reduccion significativa en el peso en seco a 0,5 y 1x indice de aplicacion de metsulfuron. Segun aumentaron las dosis, una reduccion significativa de peso en seco fue observada. Sin embargo, esta linea mostro significativamente un peso en seco mas alto que cualquiera de las otras lineas en cada unas de las dosis evaluadas.

Tabla 14. Biomasa de peso en seco sobre el suelo (como porcentaje de las plantas de control no tratadas) para 4 lineas de girasol que portan alelos mutantes diferente en el locus AHASL1 de girasol cuando se inoculan con indices aumentados de metsulfuron.

Peso en seco (como un % de las plantas no tratadas)

Dosis (x)

0 0,5 1 2 3 4

SuBL

100 83,3b 72,4b 52,2b 35,7b 30,3b

B770IMI

100 42c 30,1c 30,4c o CO 30,2b

Suscp

100 23,7d K) O Q 19,4d 19,2d 19,4c

RW-B

100 94,6a 90,4a 73,9a 60,7a 38,1a

Media

60,9 53,2 44,2 36,4 29,5

MS1

11261,7 11294,4 5895,2 3092,6 590,3

P2

<0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001

MSD3

2,998 2,099 2,07 1,630 1,992

1---------------1-----------------1----------

MS: cuadrado medio

2 P: probabilidad

3 LSD: diferencia significativa minima

[0178] Conclusion: la linea RW-B, que porta el evento mutante W574L en la condicion homocigotica en el locus AHASL1 de girasol, presento un nivel superior de tolerancia a todas las dosis evaluadas de metsulfuron que las lineas tolerantes a IMI y tolerantes a SU ya conocidas.

Referencias

[0179]

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5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

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10

15

20

25

30

35

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Claims (12)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Planta de girasol o descendiente de la misma que tiene al menos una copia de al menos un gen que codifica un polinucleotido de una subunidad grande de una acetohidroxiacido sintasa (AHASL), donde dicho polinucleotido AHASL codifica una proteina AHASL que confiere resistencia a un herbicida de imidazolinona, un herbicida de sulfonilurea, un herbicida de triazolopirimidina y un herbicida de pirimidiniloxibenzoato, dicha proteina AHASL comprende una mutacion en la posicion del aminoacido 574 o posicion equivalente, donde la posicion del aminoacido 574 o posicion equivalente es leucina, y donde dicha planta de girasol o descendiente de la misma tiene resistencia aumentada a un herbicida de imidazolinona, un herbicida de sulfonilurea, un herbicida de triazolopirimidina y un herbicida de pirimidiniloxibenzoato, en comparacion con una planta de girasol de tipo salvaje.
2. 2. Planta de girasol segun la reivindicacion 1, donde dicho polinucleotido AHASL codifica una proteina AHASL que confiere resistencia a una mezcla de herbicidas que inhiben la acetohidroxiacido sintasa (AHAS), los herbicidas que inhiben AHAS son un herbicida de imidazolinona, un herbicida de sulfonilurea, un herbicida de triazolopirimidina y un herbicida de pirimidiniloxibenzoato.
3. 3. Planta de girasol segun la reivindicacion 1 o 2, donde dicha planta de girasol tiene un gen AHASL1 con la secuencia de nucleotidos expuesta en SEC ID n.°: 1 (figura 7).
4. 4. Planta de girasol segun cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde dicha planta de girasol produce una proteina AHASL1 que tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID n.°: 2 (figura 8).
5. 5. Acido nucleico aislado que comprende SEC ID n.°: 1 (figura 7).
6. 6. Casete de expresion que comprende un promotor activo en plantas operativamente enlazado a un acido nucleico aislado que codifica una proteina que comprende la secuencia codificada por el acido nucleico aislado segun la reivindicacion 5.
7. 7. Planta de girasol transgenica, donde dicha planta comprende un transgen que comprende el acido nucleico aislado segun la reivindicacion 5.
8. 8. Planta de girasol segun cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o 7, donde dicha planta de girasol tiene una cabeza unica.
9. 9. Planta de girasol segun cualquiera de las reivindicaciones 1-4, 7 u 8, donde el rendimiento de semilla de dicha planta de girasol es mas de una tonelada por hectarea.
10. 10. Semilla de girasol que tiene un gen AHASL1 con la secuencia de nucleotidos expuesta en SEC ID n.°: 1 (figura 7).
11. 11. Polen de una planta de girasol donde el polen comprende un gen AHASL1 con la secuencia de nucleotidos expuesta en SEC ID n.°: 1 (figura 7).
12. 12. Ovulo de una planta de girasol donde el ovulo comprende un gen AHASL1 con la secuencia de nucleotidos expuesta en SEC ID n.°: 1 (figura 7).