RS54868B1 - Biljke suncokreta rezistentne na herbicide - Google Patents

Abstract

Biljka suncokreta ili njeno potomstvo, naznačeni time, što imaju najmanje jednu kopiju najmanje jednog gena koji kodira polinukleotid velike subjedinice sintaze acetohidroksi-kiselina (AHASL), gde pomenuti AHASL polinukleotid kodira AHASL protein koji daje rezistenciju na imidazolinonski herbicid, sulfonilurea herbicid, triazolopirimidinski herbicid i pirimidiniloksibenzoatni herbicid, pomenuti AHASL protein sadrži mutaciju na aminokiselinskoj poziciji 574 ili ekvivalentnoj poziciji, gde je aminokiselinska pozicija 574 ili ekvivalentna pozicija leucin, i gde pomenuta biljka suncokreta ili njeno potomstvo imaju povećanu rezistenciju na imidazolinonski herbicid, sulfonilurea herbicid, triazolopirimidinski herbicid, i pirimidiniloksibenzoatni herbicid, u poređenju sa biljkom suncokreta divljeg tipa.Prijava sadrži još 11 patentnih zahteva.

Description

OBLAST PRONALASKA

[0001]Predmetni pronalazak odnosi se na oblast poljoprivredne biotehnologije, preciznije, na biljke suncokreta rezistentne na herbicide, koje sadrže nove polinukleotidne sekvence koje kodiraju proteine velike subjedinice sintaze acetohidroksi-kiselina suncokreta rezistentne na herbicide.

OSNOVAPRONALASKA

[0002]Acetolaktat-sintaza (acetolactate svnthase, ALS) ili sintaza acetohidroksi-kiselina (acetohydroxyacid svnthase, AHAS) prvi je enzim biosintetskog puta granatih amino-kiselina valina, leucina i izoleucina u biljkama i mikroorganizmima. Pet različitih porodica jedinjenja ima inhibitorno dejstvo na AHAS enzim i koriste se kao neselektivni herbicidi širokog spektra: sulfoniluree (sulfonylureas, SU), imidazolinoni (imidazolinones, IMI), triazolopirimidini (triazolopvrimidines, TP), sulfonilamino-karboniltriazolinoni (sulfonylaminocarbonyltriazolinones, SCT) i pirimidiniloksi-benzoati (pyrimidinyloxybenzoates, POB).

[0003]S obzirom na visoku efikasnost i nisku toksičnost, nekim herbicidima se daje prednost pri upotrebi u poljoprivredi. Međutim, mogućnost korišćenja nekog od ovih herbicida u sistemima za proizvodnju određenih useva zavisi od raspoloživosti rezistentnih varijeteta usevskih biljaka od interesa. Da bi se proizveli takvi rezistentni varijeteti, potrebno je da odgajivači biljaka odgaje linije koje poseduju osobine rezistencije. Prema tome, postoji potreba za odgajivačkim linijama i varijetetima usevskih biljaka, koji su rezistentni na herbicide, za metodima i smešama za njihovu proizvodnju, kao i potreba za korišćenjem rezistentnih odgajivačkih linija i varijeteta.

(0004]Različiti usevi, uključujući kukuruz( Zea maysL.), kanolu( Brassica napusL.), šećernu repu{ Bela vulgarisL.), pirinač( Oryza sativaL.), pamuk{ Gossypiurn hirsutumL.), suncokret{Hdianthus annuusL.), lan{ Linum usitatissimumL.), soju[ Gfrcine max

(L.) Merr.] i pšenicu[Triticum aestivumL.), rezistentni na AHAS-inhibirajuće herbicide razvijeni su različitim pristupima, uključujući selekciju somatskih ćelija, mutacioni odgoj, transformaciju biljke i intcrspecfičnu hibridizaciju (Anderson and Georgeson, 1989; Croughan, 1996; D<?>Halluin et al.. 1992: Nevvhouse et al.. 1991, 1992; Hart et al., 1992; Wright and Penner, 1998; Swanson ct al., 1989; Subramanian et a!., 1990; Rajasekaran et al., 1996; Sebastian et al., 1989; Pozniak and Huci, 2004; Al-Khatib and Miller, 2002; Mallory-Smith et al., 1990;McHughen, A. 1989). U većini ovih slučajeva, rezistencija nastaje zbog formiranja AHAS koja je manje osetljiva na inhibiciju herbicidima, zbog smanjenog vezivanja herbicida prouzrokovanog mutacijama u genu ili genima kodirajućim za katalitičku subjedinicu AHAS. Nekoliko autora dalo je pregled poznatih mutacija AHAS gena, koje biljkama daju rezistenciju na AHAS-inhibirajuće herbicide (Preston and Mallory-Smith; 2001; Tranel and Wright, 2002; Tan et al., 2005). Za regulatornu subjedinicu nisu poznate supstitucije amino-kiselina za koje je saopšteno da doprinise rezistenciji na herbicide. WO2007/054555 objavljuje suncokrete sa povećanom rezistencijom na imidazolinonske herbicide. Ove biljke suncokreta sadrže najmanje jednu kopiju AHASL sa izoleucinom na aminokiselinskoj poziciji 188. Objavljena je i kombinacija sa drugim mutacijama, na primer sa leucinom na poziciji 559.

[0005] Otkrivene su populacije divljeg suncokreta{ Helianthus annuusL.) rezistentne na imidazolinone (IM1) ili sulfoniluree (SU) (Al-Khatib et al 1998, VVhite et al 2002). U elitne inbred linije suncokreta, osobine rezistencije na herbicide introgresiranc su konvencionalnim odgajivačkim metodima, u svrhu razvijanja i primene IMI-rezistentnih i SU-rezistentnih sorti (Al-Khatib and Miller, 2002; Miller and Al-Khatib, 2002; 2004). Na osnovu molekularnih studija, Kolkman et al. (2004) identifikovali su i okarakterisali triAHASgena u suncokretu( AHAS1, AHAS2iAHAS3)i pokazali da su geni za IMI-rezistenciju i SU-rezistenciju alelske varijante istog lokusa( AHASL1).Pored toga, oni su pokazali da atel za IMI-rezistenciju nosi mutaciju C u T u kodonu 205( Arahidopsis thaliananomenklatura), dok alel za SU-rezistenciju nosi mutaciju C u T u kodonu 197 (Kolkman et al., 2004).

SAŽETAK

[0006] Obezbeđene su biljke suncokreta koje imaju višestruku rezistenciju na herbicide prema zahtevu 1. Ove biljke su rezistentne bar na imidazolinonski herbicid, sulfonilurea herbicid, triazolopirimiđinski herbicid i pirimidiniloksibenzoatni herbicid i mešavine ovih herbicida. Pogodno, seme biljke ima sadržaj ulja veći od 40%, prinos semena koji iznosi više od jedne tone po hektaru, i/ili biljka suncokreta ima jednu glavu. U drugim formama, biljke imaju kombinacije ovih karakteristika. U nekim formama, rezistentne biljke imaju AHAS gen koji kodira mutaciju na amino-kiselini 574 ili njenom ekvivalentu, koja očigledno daje osobinu rezistencije, pri čemu mutacija može biti zamena triptofana na toj poziciji drugom amino-kiselinom, na primer leucinom. Specifične forme uključuju biljke koje sadržeAHASLIgen sa nukleotidnom sckvcncom navedenom u SEQ ID NO: 1, iliAHASLIprotein koji ima aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 2. [0007| Obezbeđeni su i izolovani molekuli nukleinske kiseline, koji kodiraju mutantneAHASLIgene, na primer izolovana nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu SEQ ID NO: 1. Obezbeđene su i biljne ćelije stabilno transformisane nukleinskom kiselinom koja ima sekvencu SEQ ID NO: 1, i transgena biljka suncokreta koja sadrži transgen sa SEQ ID NO:l. U drugim formama, biljke sadrže ekspresionu kasetu sa promotorom aktivnim u biljkama suncokreta, koji je operabilno povezan sa izolovanom protein-kodirajućom nukleinskom kiselinom sa sekvencom navedenom kao SEQ ID NO: 1.

[0008J Objavljeni su i metodi kontrole korova u blizini rezistentne biljke suncokreta gore opisanog tipa, koji obuhvataju nanošenje herbicida na korov i biljku suncokreta, pri čemu je herbicid imidazolinonski herbicid, sulfonilurea herbicid, triazolopiirmiđinski herbicid ili pirimidiniloksibenzoatni herbicid, ili mešavina ovih herbicida.

[0009] Obezbeđeno je i seme suncokreta, kao i biljka izrasla iz tog semena. Biljke su rezistentne na imidazolinonski herbicid, sulfonilurea herbicid, triazolopirimiđinski herbicid ili pirimidiniloksibenzoatni herbicid i njihove mešavine. U specifičnim formama, biljke izrasle iz semena imaju sadržaj ulja u semenu veći od 40%, prinos semena veći od jedne tone po hektaru, i/ili biljka suncokreta ima jednu glavu. Druge forme uključuju kombinacije gore pomcnutih osobina. Ove biljke mogu da sadrže mutantniAHASLI,kako je gore opisano. {001 OjObjavljeni su i metodi poboljšanja tolerancije na herbicide kod biljke suncokreta. Poželjne forme uključuju regenerisanje ćelije suncokreta u biljku suncokreta, pri čemu se ćelija suncokreta transformiše konstruktom koji ima protein-kodirajuću sekvencu nukleinske kiseline navedenu kao SEQ ID NO: 1, regenerisanje ćelije suncokreta u biljku suncokreta i selekciju biljaka sa fertilnim cvetovima, koje su vegetativno i reproduktivno rezistentne na efikasnu dozu herbicida. Herbicid se bira iz grupe koja se sastoji od sulfoniluree, imidazolinona, pirimidiniloksibenzoata, triazolopirimidina i njihovih mešavina.

[0011]U ovom tekstu obezbeđeni su i metodi proizvodnje biljke suncokreta rezistentne na herbicide, povratnim ukrštanjem. Poželjne forme uključuju ukrštanje prve biljke suncokreta koja ima AHAS aktivnost rezistentnu na herbicide, sa drugom biljkom suncokreta koja nema AHAS aktivnost rezistentnu na herbicide, pri Čemu prva biljka suncokreta ima protein-kodirajuću nukleinsku kiselinu navedenu kao SEQ ID NO: 1. Pogodno, biraju se biljke potomci koje imaju AHAS aktivnost rezistentnu na herbicide. Druge poželjne forme uključuju seme koje ima karakteristike rezistencije na herbicide prve biljke suncokreta.

[0012]U specifičnoj formi, obezbeđeno je seme suncokretove sorte označene kao RW-B. Ovo seme i odgovarajuća biljka imaju sve gore opisane fiziološke karakteristike, rezistenciju na herbicide i gore opisane morfološke karakteristike. Reprezentativno seme ove sorte suncokreta deponovano je u American Type Culture Collection (ATCC) pod Accession No: PTA-9176. |0013]Obezbeđena je i tkivna kultura regenerabilnih ćelija gore pomenutih rezistentnih biljaka suncokreta. Poželjne forme uključuju tkivne kulture u kojima ćelije tkivne kulture uključuju list, polen, embrion, kotiledon, hipokotil. meristemske ćelije, koren, vrh korena, anteru, cvet, seme, stabljiku, ovule, izdanke, stabljike, drške, kapsule semena ili mahune. Rezistentne biljke suncokreta mogu izrasti iz gore pomenute kulture tkiva i eksprimirati sve morfološke i fiziološke karakteristike sorte suncokreta RVV-B.

[0014]Drugi ciljevi, osobine i prednostii predmetnog pronalaska postaće očigledni iz detaljnog opisa koji sledi.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0015] SL. 1 prikazuje parcijalno poravnavanje DNK sekvenci kodirajućeg regionaAHASLIgena iz HA89, B770 linije, rezistentne linije RW-B, ALS gena Xanthium sp. iArabidopsis thaliuna.

SL. 2 prikazuje parcijalno poravnavanje aminokiselinskih sekvenciAHASLIproteina iz HA89, B770 linije, rezistentne linije RW-B, ALS gena Xanthium sp. iArabidopsis thaliuna.

SL. 3 prikazuje inheritancu IMI rezistencije u RW-B.

SL. 4 u tabelarnoj formi prikazuje indeks fitotoksičnosti sedam linija suncokreta prskanih različitim AHAS-inhibirajućim herbicidima.

SL. 5 prikazuje odgovor biljaka suncokreta, rezistentnih (resistant, R) i osetljivih (susceptible, S), na imazapir u testu alelizma u generacijama F|, Fti BC|Fi. SL. 6 prikazuje haplotipsku segregacijuAHAS Ii reakciju biljaka suncokreta, rezistentnih (R) i osetljivih (S), na imazapir primenjen pri stopi od 320 g a.i. ha"<1>(a.i. active ingredient, aktivni sastojak).

SL. 7 prikazuje kompletnu nukleotidnu sekvencuAHASLIgena linije RW-B

(SEO ID NO: 1).

SL. 8 prikazuje kompletnu aminokiselinsku sekvencuAHASLIgena linije RW-B (SEQ ID NO: 2).

SL. 9 prikazuje smanjenje visine (kao procenat visine netretiranih kontrolnih biljaka) za 4 linije koje nose različite mutantne alele naAHASLIlokusu suncokreta, 14 dana posle nanošenja rastućih koncentracija imazapira. SL. 10 prikazuje indeks fitotoksičnosti za 4 linije suncokreta koje nose različite mutantne alele naAHASLIlokusu suncokreta posle izazivanja rastućim koncentracijama imazapira.

SL. 11 prikazuje krive doznog odgovora suve težine nadzemne biomase (kao procenat vrednosti kod netretiranih kontrolnih biljaka), za 4 linije suncokreta koje nose različite mutantne alele naAHASLIlokusu suncokreta, posle izazivanja rastućim koncentracijama imazapira.

SL. 12 prikazuje indeks fitotoksičnosti za 4 linije suncokreta koje nose različite mutantne alele naAHASLIlokusu suncokreta, posle izazivanja rastućim koncentracijama metsulfurona.

SL. 13 prikazuje krive doznog odgovora suve težine nadzemne biomase (kao procenat vrednosti kod netretiranih kontrolnih biljaka), za 4 linije suncokreta koje nose različite mutantne alele naAHASLIlokusu, posle izazivanja rastućim koncentracijama metsulfurona.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

|0016]Obezbeđene su biljke suncokreta koje imaju povišenu rezistenciju na herbicide u poređenju sa biljkama suncokreta divljeg tipa, prema zahtevu 1. Ove biljke sadrže novu genetsku mutaciju u AHAS genu, koja daje široki spektar rezistencije na AHAS-inhibirajuće herbicide, i ova mutacija je identifikovana i okarakterisana. Dostupnost ove nove mutacije, zajedno sa korišćcnjem raspoloživih AHAS-inhibirajućih herbicida, obezbeđuje sistem za proizvodnju useva suncokreta tolerantnih na herbicide i, za odgajivače suncokreta, predstavlja novu i moćnu opciju za kontrolu korova.

|0017]Nekoliko AHAS-supstitucija za rezultat će imati rezistenciju na AHAS-inhibitore; jačina rezistencije na različite AHAS-inhibirajuće herbicide, međutim, široko varira zavisno od supstitucije (Saari et al., 1994; Tranel and VVright, 2002). Iako postoje izuzeci, rezistencija prouzrokovana izmenjenim AHAS generalno se, na osnovu ukrštene rezistencije, može razdvojiti na tri tipa: (I) SU-specifična rezistencija, (2) IM1-specifična rezistencija, i (3) široka unakrsna rezistencija. Tačkaste mutacije koje za rezultat imaju supstitucije prolina (Pro)197 daju visoke nivoe rezistencije na sulfonilureu, uz samo mali porast rezistencije na imidazolinone i triazolopirimidine (Haughn et al., 1988; Lee et al., 1988; Guttieri et al., 1992; Harms et al., 1992; Mourad and King 1992; Guttieri et al., 1995; Wright et al., 1998). Supstitucije alanina (Ala)205, sa druge strane, pokazuju široku unakrsnu rezistenciju, međutim, nivoi rezistencije su umereni (Saari et al., 1994; Tranel and VVright, 2002). Supstitucije (Ala)122 za rezultat imaju rcziistenciju na IMI, ali ne i na SU (vidi, npr., Sala et al., 2008 a & b).

[0018]Osobine i geni za rezistenciju na AHAS-inhibitorne herbicide kod suncokreta dobili su različita imena. Alel za IMI-rezistenciju označen je kaoImrI(Bruniard and Miller, 2001),Arpiirili A205V (Kolkman et al. 2004) iliAhasLl- 1(vidi, npr., Sala et a! 2008b), a osobina je dobila ime IM1SUN. Alel za SU-rezistenciju označen je kaoAi\ mili P197L (Kolkman et al. 2004) iliAhasLi- 2(vidi, npr., Sala et al., 2008b), a osobina je poznata kao SURES. Alel za visoku IMI-rezistenciju prisutan u CLHA-PIus označen je kaoAhasll- 3ili A122T (vidi, npr., Sala et al., 2008b).

[0019]Neočekivano, ovi istraživači pronašli su da nova mutacija na kodonu 574{ Arabidopsis thaliunanomenklatura) suncekretovogAHASLIgena daje visoke nivoe i širok spektar rezistencije na najmanje četiri od pet familija AHAS-inhibitomih herbicida. Ova pojedinačna mutacija koja menja triptofan u lcucin u AHAS proteinu, odgovorna je za ovu upadljivo Široku rezistenciju na herbicide pri kojoj suncokreti pronalaska neočekivano imaju rezistenciju na svaki od IM1, SU, TP i POB herbicida. Prema tome, ova nova mutacija obezbeđuje brojne tehnološke prednosti nad svim danas poznatim mutacijama za rezistenciju kod suncokreta. Ove prednosti uključuju, ali se ne ograničavaju na mogućnost: primene novih tipova herbicida na useve suncokreta koji uobičajeno ne bi mogli da se koriste, a da ne izazovu neželjene efekte na samom suncokretu; nanošenje mešavine dva ili više herbicida istovremeno na useve suncokreta, koji inače ne bi mogli da se kombinuju; variranja vremena i tipa nanošenja herbicida na suncokret; i primene više od jednog herbicida posle klijanja, zbog prenošenja rezistencije.

[0020]Obezbeđeni su metodi borbe protiv neželjene vegetacije ili metodi kontrole korova, tretiranjem semena suncokreta rezistentnih biljaka AHAS-inhibirajućim herbicidom ili mešavinom herbicida, pre sejanja i/ili posle pregerminacije. Tretirano seme se zatim seje, na primer u poljsko zemljište ili u medijum u posudi za gajenje u stakleniku. Dobijene biljke takođe mogu da se tretiraju AHAS-inhibirajućim herbicidom ili mešavinom herbicida, u cilju borbe protiv neželjene vegetacije i/ili za kontrolu korova u neposrednoj blizini biljaka suncokreta.

[0021]Eksperimenti povratnog ukrštanja uz asistenciju markera omogućili su razvijanje ovde opisanih komercijalno korisnih biljaka suncokreta sa višestrukom rezistencijom na herbicide. U povratnom ukrštanju, može se primeniti direktna selekcija pri kojoj genski lokus deluje kao delimično dominantna osobina kao što je osobina rezistencije na herbicide. Da bi se izvršila selekcija suncokretovih biljaka pronalaska, potomstvo iz inicijalnog ukrštanja prska se herbicidom pre povratnog ukrštanja. Prskanjem se eliminišu biljke koje nemaju željenu karakteristiku rezistencije na herbicide, a biljke koje imaju gen za rezistenciju na herbicide koriste se u kasnijim povratnim ukrštanjima.. Ovaj proces se ponavlja u svim dodatnim generacijama povratnog ukrštanja, dok se ne dobiju odgajene biljke sa stvarnom rezistencijom na herbicide.

[0022JPored rezistencije na herbicide, biljke suncokreta imaju i brojne druge pogodne karakteristike. Tako, seme suncokreta ima jednu ili više od sledećih karakteristika, sadržaj ulja veći od 40%, prinos semena više od ione po hektaru i suncokretova biljka ima jednu glavu. Neočekivano, ove karakteristike nađene su u kombinaciji jedna sa drugom i sa širokim spektrom rezistencije na herbicide, dobijene mutacijom na kodonu 574.

|0023|Zbog toga što su biljke suncokreta opisane u ovom tekstu u značajnoj meri rezistentne na Četiri ili više familija herbicida, poljoprivrednici mogu tretirati useve širim opsegom herbicida od onog kojim su ranije raspolagali za upotrebu na suncokretu. Kontrolisanje korova u usevima suncokreta potrebno je da bi se izbegao loš rast i gubitak prinosa, a mogućnost korišćenja više od jednog herbicida istovremeno tokom sezone rasta obezbeđuje značajne pogodnosti kontrole korova u poređenju sa konvencionalnim varijetetima suncokreta. Na primer. zbog loga što suncokretu koji raste iz semena može biti potrebno do dve nedelje da nikne, korov lako može da nikne i da zakloni mladice suncokreta, što će omesti njihov rast. Bez kontrole, kompeticija sa korovom će na usevima suncokreta izazvati velike ekonomske gubitke, zbog smanjenja prinosa, koji mogu dostići nivo od čak 50%. Biljkama predmetnog pronalaska izbegavaju se ovi problemi jer njihova rezistencija na više od jedne familije postojećih herbicida dozvoljava korišćenje protokola za pojačano nanošenje herbicida.

[0024]Još jedna pogodnost rezistencije na više familija herbicida je ta što poljoprivrednici mogu komercijalno da eksploatišu useve suncokreta bez dodatnih troškova za razvijanja novih herbicida. Razvoj novih herbicida namenjenih usevima suncokreta nije verovatan bez visokih troškova registracije herbicida. Rezistencija na više poznatih herbicida pogodna je i za useve suncokreta osetljive na oštećenje usled prenošenja. Do prenošenja dolazi kada herbicidi korišćeni kod prethodnog useva ometaju rast trenutnog useva. Rezistencija na više herbicida smanjuje oštećenje useva suncokreta nastalo prenošenjem. Pored toga, mogućnost povećane kontrole korova u suncokretovim biljkama pronalaska znači i ograničavanje kasnijih problema u rastu biljaka koje će se gajiti posle suncokreta.

(0025) U kontekstu predmetnog pronalaska, izrazi "tolerantan na herbicide" i "rezistentan na herbicide" koriste se naizmenično i imaju ekvivalentno značenje i ekvivalentan okvir. Slično tome. izrazi koji se odnose na familije herbicida, na primer "rezistentan na imidazolinon" i "rezistencija na imidazolinon" koriste se naizmenično i imaju ekvivalentno značenje i okvir kao izrazi "tolerantan na imidazolinon", odnosno "tolerancija na imidazolinon". |0026} Obezbeđeni su AHASL polinukleotidi rezistentni na herbicide i AHASL proteini rezistentni na herbicide. Izraz "AHASL polinukleotid rezistentan na herbicide" označava, u svrhu pronalaska, polinukleotid kodirajući za protein koji ima AHAS aktivnost rezistentnu na herbicide. "AHASL protein tolerantan na herbicide" ili "AHASL protein rezistentan na herbicide" je AHASL protein koji ispoljava merljivo višu AHAS aktivnost, u poređenju sa AHAS aktivnošću divljeg tipa AHASL proteina, kada se nađe u prisustvu najmanje jednog herbicida za koji se zna da interferira sa AHAS aktivnošću i pri koncentraciji ili nivou herbicida za koji se zna da inhibira AHAS aktivnost AHASL proteina divljeg tipa. "Biljka tolerantna na herbicide" iii "biljka rezistentna na herbicide" je biljka koja je tolerantna ili rezistentna na najmanje jedan herbicid, primenjen u određenoj količini, koji bi normalno ubio ili inhibirao rast normalne biljke divljeg tipa. U jednoj formi, biljke tolerantne na herbicide, ovog pronalaska, sadrže AHASL protein tolerantan na herbicide ili rezistentan na herbicide. Iako posleđnje publikacije sugerišu različite nomenklature, ovde i u ćelom tekstu, izraz AHASL će se koristiti da da bi se predstavila katalitička ili velika (large, L) subjedinica AHAS enzima. Vidi, npr., Duggleby et al., 2008 Plant Phvsiol. Biochem. 46: 309-324.

|0027] Pored toga, AHASL protein tolerantan na herbicide ili rezistentan na herbicide može da se uvede u biljku suncokreta transformisanjem biljke ili njenog pretka nukleotidnom sekvencom koja kodira AHASL protein tolerantan na herbicide ili rezistentan na herbicide. Takvi AHASL proteini tolerantni na herbicide ili rezistentni na herbicide kodirani su AHASL polinukleotidima tolerantnim na herbicide ili rezistentnim na herbicide. Alternativno, AHASL protein tolerantan na herbicide ili rezistentan na herbicide može da se nađe u biljci suncokreta kao rezultat prirodne ili indukovane mutacije u endogenom AHASL genu, u genomu biljke ili njenog pretka. Predmetni

pronalazak obezbeđuje biljke suncokreta, biljna tkiva, biljne ćelije i ćelije-domaćine sa povećanom rezistencijom ili tolerancijom na jedan ili više herbicida. uključujući, ali ne ograničavajući se na IMI herbicid, SU herbicid, TP herbicid, POB herbicid. Pogodno, biljke imaju povišenu rezistenciju ili toleranciju na dva ili više od gore pomenutih herbicida i. još pogodnije, imaju povišenu rezistenciju ili toleranciju na tri ili više od gore pomenutih herbicida. Najpogodnije, biljke imaju povišenu rezistenciju ili toleranciju na četiri ili više od gore pomenutih herbicida.

[0028| Poželjna količina ili koncentracija herbicida, koja se nanosi na biljke ili seme kako je ovde opisano je "efikasna količina" ili "efikasna koncentracija". Izrazi "efikasna količina" i "efikasna koncentracija" znače, za potrebe ovog pronalaska, količinu odnosno koncentraciju koja je dovoljna da ubije ili inhibira rast slične biljke divljeg tipa, biljno tkivo, biljnu ćeliju ili ćeliju-domaćina. ali ta pomenuta količina ne ubija ili ne inhibira tako snažno rast herbicid-rezistentnih biljaka, biljnog tkiva, biljne ćelije ili ćelije-domaćina predmetnog pronalaska. Tipično, efikasna količina herbicida je količina koja se rutinski koristi u poljoprivrednim proizvodnim sistemima, za uništavanje korova od interesa. Ta količina poznata je uobičajeno obučenom stručnjaku u oblasti. "Biljka, biljno tkivo, biljna ćelija ili ćelija-domaćin divljeg tipa" su biljka, biljno tkivo, biljna ćelija odnosno ćelija-domaćin. koji ne poseduju karakteristike rezistencije na herbicide i/ili određeni polinukleotid pronalaska. Izraz "divlji tip" ne znači da biljka, biljno tkivo, biljna ćelija ili ćelija-domaćin ne poseduje rekombinantnu DNK u svom genomu i/ili ne poseduje karakteristike rezistencije na herbicide, koje su različite od onih opisanih u ovom tekstu. Izraz "biljka" treba da označi biljku na bilo kojem stupnju razvoja, kao i bilo koji deo ili delove biljke, koji mogu biti prikačeni ili odvojeni od cele intaktne biljke. Takvi delovi uključuju, ali se ne ograničavaju na organe, tkiva i ćelije biljke. Primeri određenih delova biljke uključuju stabljiku, list. koren, cvast, cvet. cvetić, plod. pedicel, pedunkul, prašnik, anteru. žig, stubić, ovarijum, krunične listiće, čašične listiće, tučak, vrh korena, korenovu kapu, korenovu dlaku, lisnu dlaku, dlaku semena, zrno polena, mikrosporu, kotiledon, hipokotil, epikotil, ksilem, ftoem, parenhim, endosperm, ćeliju-pomoćnicu, ćeliju-zatvaračicu i svaki drugi poznati organ, tkivo i ćeliju biljke. Pored toga, seme se razmatra kao biljka.

[0029] Predmetni pronalazak opisuje biljku suncokreta koja ima povećanu rezistenciju na IMI herbicid, SU herbicid, TP herbicid, POB herbicid, i/ili njihove mešavine, u poređenju sa varijetetom biljke divljeg tipa. Ovde je dat detaljan opis uzgajanja i selekcije biljaka suncokreta koje imaju povećanu rezistenciju na IMI herbicid, SU herbicid, TP herbicid, POB herbicid, i/ili njihove mešavine. Jedna biljka dobijena ovim postupcima deponovana je sa ATCC (broj koji označava patentni depozit. Patent deposit designation number PTA-9176) i označena je u ovom tekstu kao RVV-B varijetet suncokreta. Depozit od 2500 semena RW-B varijeteta suncokreta napravljen jc sa American Type Culture Collection, 25. aprila 2008. Ovaj depozit je napravljen u skladu sa pravilima i uslovima Budimpeštanskog sporazuma (Budapest Treaty) u vezi sa deponovanjem mikroorganizama. Depozit je napravljen za rok od najmanje trideset godina i najmanje pet godina posle najskorijeg zahteva podnetog ATCC-u za izdavanje deponovanog uzorka.

[0030]Biljke suncokreta predmetnog pronalaska uključuju i netransgene biljke i transgene biljke. "Netransgena biljka" je biljka koja u svom genomu ne sadrži rckombinantnu DNK. "Transgena biljka" je biljka koja u svom genomu sadrži rekombinantnu DNK i može da se proizvede introdukovanjem rekombinantne DNK u genom biljke. Kada je takva rekombinantna DNK inkorporisana u genom transgene biljke, potomstvo biljke takođe može da sadrži rekombinantnu DNK. Potomstvo biljke koja sadrži bar deo rekombinantne DNK najmanje jedne progenitorske transgene biljke takođe je transgena biljka. Primer netransgene biljke suncokreta koja ima povećanu rezistenciju na IMI herbicid, SU herbicid, TP herbicid, POB herbicid, i/ili njihove mešavine je biljka suncokreta RW-B ili genetički inženjerisani derivat biljke suncokreta RW-B, ili bilo koji potomak biljke suncokreta RW-B, ili biljka koja sadrži karakteristike tolerancije na herbicide biljke suncokreta RVV-B. (00311Biljke suncokreta mogu da se propagiraju putem tehnika kulture tkiva i ćelija. Suštinski, svako biljno tkivo sa ćelijama sposobnim za ćelijsku deobu može da se koristi za propagaciju biljke putem tehnika kulture tkiva i ćelija. Kulture mogu poći od lista, polena, embriona, kotiledona, hipokotila. meristemskih ćelija, korena. vrha korena, antere, cveta, semena, stabljike, ovula, izdanaka, stabljika, drški, omotača semena, ili mahune. Posebno su pogodna tkiva uzeta iz vaskularne oblasti stabljika i korena. U.S. Pat. No. 4,670,391. 4,670,392, 4,673,648, 4,681,849, 4,687,743 i 5,030,572 opisuju metode regenerisanja biljaka suncokreta iz kultura ćelija poreklom iz tkiva suncokreta. Stanje tehnike jc trenutno takvo da su primeri metoda dobijanja suncokretovih biljaka iz

ćelijskih kultura dobro poznati uobičajeno obučenom stručnjaku u oblasti. Za regenerisanje celih biljaka mogu se koristiti različite tehnike kultivisanja biljaka, kao što su one opisane u Gamborg and Phillips, "Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods", Springer Berlin, 1995); Evans et al. "Protoplasts Isolation and Culture", Handbook of Plant Cell Culture, Macmillian Publishing Companv, New York, 1983; ili u Binding, "Regeneration of Plants, Plant Protoplasts", CRC Press, Boca Raton, 1985; ili u Klee et al., Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467 (1987). Detaljni opisi sistema za kultivisanjeHeliunthus ttnnuusmogu se naći u Sunflovver Biotechnologv, Chapter 11, Bidnev, D. L. and Scelonge, C. J., pp. 559-593 i tamo navedenim referencama, Sunflower Tcchnology and Production, edited by A. A. Schneiter, Agronomy 35, izdavači, American Society of Agronomy Inc. 1997, Transformation of Sunflower.

[0032jBiljke suncokreta rezistentne na herbicide mogu se proizvesti tako što će se metodi kultivisanja tkiva koristiti za selekciju biljnih ćelija koje sadrže mutacije za rezistenciju na herbicide, a zatim će se od njih regenerisati biljke rezistentne na herbicide. Vidi, npr., U.S. Patent No. 5,773,702 i 5,859,348. Dodatni detalji o mutacionom uzgajanju mogu se naći u "Principals of Cultivar Development" Fehr, 1993 Macmillan Publishing Company.

Mutantni gen i protein koji on kodira daju biljkama suncokreta široku rezistenciju

na herbicide

[0033]Sadašnji izumitelji otkrili su da supstitucija triptofana na poziciji 574, ili ekvivalentnoj poziciji( Arabidopsis thaliunanomenklatura), u AHASL proteinu može dovesti do toga da biljka suncokreta koja eksprimira taj protein ima pojačanu rezistenciju na herbicide, posebno na IMI herbicid, SU herbicid, TP herbicid, POB herbicid, i/ili njihove mešavine. Preciznije, ovaj mutantni protein daje biljkama višestruku rezistenciju na herbicide.

[0034]U skladu sa tim, herbicid-rezistentne biljke suncokreta opisane u ovom tekstu uključuju, ali se ne ograničavaju na biljke suncokreta koje u svojim genomima imaju najmanje jednu kopiju AHASL polinukleotida koji kodira AHASL protein rezistentan na herbicide, sa leucinskom supstitucijom na aminokiselinskoj poziciji 574

( Arabidopsis thaliunanomenklatura). Pored toga, prosečno obučeni stručnjak prepoznaće da takve aminokiselinske pozicije mogu biti različite u zavisnosti od toga da li se amino-kiseline dodaju ili uklanjaju sa, na primer, N-terminalnog kraja aminokiselinske sekvence. Tako, forme predmetnog pronalaska obuhvaćene ovim tekstom uključuju aminokiselinske supstitucije na navedenoj poziciji ili ekvivalnentoj poziciji (npr., "aminokiselinska pozicija 574 ili ekvivalentna pozicija").

[0035| Obezbeđena je jedna aminokiselinska supstitucija koja može da se koristi za proizvodnju suncokretovih AHASL proteina rezistentnih na herbicide, zajedno sa polinukleotidima koji kodiraju te proteine, i herbicid-rezistentne biljke, biljna tkiva, biljne ćelije i semena koji nose tu mutaciju. Obezbeđeni su i izolovani suncokretovi polinukleotidiAHASLI, AHASLIiAHASL3koji kodirajuAHASLI, AHASL2iAHASL3proteine rezistentne na herbicide, respektivno. Svaki od tihAHASLI. AHASLIiAHASL3proteina rezistentnih na herbicide sadrži amino-kiselinu različitu od triptofana na poziciji 574 ili ekvivalentnoj poziciji( Arabidopsis thaliunanomenklatura). Poželjno u takvimAHASLI, AHASLIiAHASL3proteinima rezistentnim na herbicide, amino-kiselina na poziciji 574 ili ekvivalentnoj poziciji je leucin.

[0036| Pored toga, obezbeđeni su izolovani polipeptidi koji određuju AHASL proteine. Izolovani polipeptidi određuju aminokiselinsku sekvencu sa redosledom amino-kiselina navedenim na SL. 8 (aminokiselinska sekvencaAHASLIgena linije RVV-B, SEQ ID NO: 2), aminokiselinske sekvence određene redosledima nukleotida navedenim na SL. 7 (nukleotidna sekvencaAHASLIgena linije RVV-B, SEQ ID NO: 1), i funkcionalne fragmente i varijante pomenutih aminokiselinskih sekvenci koje određuju AHASL polipeptid sa AHAS aktivnošću.

[0037] Ne očekuje se da bi delecije, insercije i supstitucije u sekvencama proteina koji su obuhvaćeni ovim tekstom dovele do radikalnih promena karakteristika proteina. Međutim, u slučajevima kada je teško predvideti tačne efekte supstitucije, delecije ili insercije pre njihovog uvođenja, stručnjak u oblasti će razumeti da se fekat može proceniti rutinskim skrining-testovima. Drugim recima, aktivnost može da se cvaluira testovima AHAS aktivnosti. Vidi, na primer, Singh et al. (1988) Anal. Biochem. 171: 173-179. Pored toga, proteini opisani u ovom tekstu obuhvataju i prirodne proteine i njihove varijacije i modifikovane oblike. Takve varijante će i dalje posedovati željenu AHAS aktivnost.

[0038]Pronalazak takođe obezbeđuje izolovane ili prečišćene polinukleotide i proteine. "Izolovani" ili "prečišćeni" polinukleotidni molekul ili protein, ili njegov biološki aktivni dco, suštinski ili esencijalno ne sadrže komponente koje normalno prate ili interaguju sa polinukleotidnim molekulom ili proteinom kada se nalaze u svom prirodnom okruženju. Tako, izolovani ili prečišćeni polinukleotidni molekul ili protein suštinski ne sadrže drugi ćelijski materijal ili kultivacioni medijum, u slučaju da su proizvedeni rekombinantnim tehnikama, ili suštinski ne sadrže hemijske prekursore ili druge hemikalije, u slučaju da su sintetisani hemijskim putem. Poželjno, "izolovana" nukleinska kiselina ne sadrži sekvence (poželjno sekvence koje kodiraju proteine) koje se prirodno nalaze bočno na nukleinskoj kiselini (tj., sekvence locirane na 5'- i 3'-kraju nukleinske kiseline) u genomskoj DNK organizma iz kojeg nukleinska kiselina vodi poreklo. Na primer. u različitim formama, izolovani polinukleotidni molekul može da sadrži manje od oko 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, 0.4 kb, 0.3 kb, 0.2 kb ili 0.1 kb nukleotidnih sekvenci koje se normalno nalaze bočno na polinukleotidnom molekulu genomske DNK ćelije iz koje nukleinska kiselina vodi poreklo. Protein koji suštinski ne sadrži ćelijski materijal uključuje preparate proteina sa manje od oko 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ili 1% (suve težine) kontaminirajućeg proteina. Kada je protein predmetnog pronalaska ili njegov biološki aktivan deo proizveden rekombinantno, poželjno kultivacioni medijum predstavljen je sa manje od oko 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ili 1% (suve težine) hemijskih prekursora ili hemijskih supstanci, koje nisu protein od interesa.

[0039] Obezbeđeni su izolovani polinukleotidni molekuli sa nukleotidnim sekvencama koje kodiraju AHASL proteine, i odgovarajući proteini. Obezbeđene su i nukleotidne sekvence koje kodiraju AHASL protein rezistentan na herbicide iz biljke suncokreta rezistentne na herbicide. U jednoj formi, suncokretovi AHASL proteini rezistentni na herbicide nose supstituciju triptofana leucinom na aminokiselinskoj poziciji 574 ili ekvivalentnoj poziciji{ Arabidopsis ihaliananomenklatura), u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinskom sekvencom divljeg tipa. Tačnije. obezbeđeni su izolovani polinukleotidni molekuli koji sadrže nukleotidne sekvence kodirajuće za aminokiselinske sekvence prikazane na SL. 8, i njihovi fragmenti i varijante koji kodiraju polipeptide sa AHAS aktivnošću. Obezbeđeni su i polipeptidi sa aminokiselinskom sekvencom kodiranom polinukleotidnim molekulom opisanim u ovom tekstu, na primer onim navedenim na SL. 7, i polipeptidi sa AHAS aktivnošću kodirani fragmentima i varijantama istog.

[0040]Pored toga, obučeni stručnjak će prepoznati da se u nukleotidne sekvence pronalaska mogu uvesti mutacione promene koje će dovesti do promena aminokiselinske sekvence datog AHASL proteine, bez menjanja biološke aktivnosti AHASL proteina. Prema tome, izolovani polinukleotidni molekul koji kodira AHASL protein sa sekvencom različitom od SEQ ID NO: 2, može da se kreira tako što će se u odgovarajuću ovde opisanu nukleotidnu sekvencu, uvesti jedna ili više nukleotidnih supstitucija, adicija ili delecija, tako da se u kodirani protein uvede jedna ili više aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija. Mutacije mogu da se uvedu standardnim tehnikama, kao što su usmerena mutageneza i PCR-posredovana mutageneza.

[0041]Izolovani herbicid-rezistentni AHASL polinukleotidni molekuli pronalaska mogu da se koriste u polinukleotidnim konstruktima, za transformaciju biljaka, posebno usevskih biljaka, da bi se povećala rezistencija tih biljaka na biljne herbicide, posebno herbicide za koje je poznato da inhibiraju AHAS aktivnost, tačnije IMI herbicid, SU herbicid, TP herbicid, POB herbicid, i/ili njihove mešavine. Takvi polinukleotidni konstrukti mogu da se koriste u ekspresionim kasetama, ckspresionim vektorima, transformacionim vektorima, plazmidima i slično. Transgene biljke dobijene posle transformacije takvim polinukleotidnim konstruktima pokazuju povećanu rezistenciju na AHAS-inhibirajuće herbicide kao što su na primer IMI herbicid, SU herbicid, TP herbicid, POB herbicid, i/ili njihove mešavine.

[0042]Izolovani polinukleotidni molekuli sa nukleotidnom sekvencom koja kodira mutantni AHASL protein, kako je gore opisano, mogu da se koriste u vektorima za transformisanje biljaka tako da kreirane biljke imaju povećanu rezistenciju na herbicide, posebno IMI herbicid, SU herbicid, TP herbicid, POB herbicid, i/ili njihove mešavine. Izolovani AHASL polinukleotidni molekuli predmetnog pronalaska mogu da se koriste u vektorima sami ili u kombinaciji sa nukleotidnom sekvencom koja kodira malu subjedinicu AHAS (AHASS) enzima, dajući biljkama rezistenciju na herbicide. Vidi, U.S. Patent No. 6,348,643.

[0043] Polinukleotidni molekuli koji se razlikuju od nukleotidnih sekvenci opisanih u ovom tekstu takođe su obuhvaćeni predmetnim pronalaskom. Nukleotidne sekvence predmetnog pronalaska uključuju one sekvence koje kodiraju AHASL proteine opisane u ovom tekstu, ali koji se konzervativno razlikuju zbog degeneracije genetskog koda. Ove prirodne alelske varijante mogu da se identifikuju korišćenjem dobro poznatih tehnika molekularne biologije kao što su tehnike lančane reakcije polimeraze (PCR) i hibridizacija, kako je navedeno kasnije u tekstu. Nukleotidne sekvence uljučuju i sintetski izvedene nukleotidne sekvence koje su stvorene, na primer, korišćenjem usmerene mutageneze, ali koje i dalje kodiraju AHASL protein. Generalno, varijante nukleotidnih sekvenci predmetnog pronalaska imaće sekvencionu identičnost od najmanje oko 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99%, sa određenom nukleotidnom sekvencom opisanom u ovom tekstu. AHASL nukleotidna sekvenca kodiraće respektivni AHASL protein koji ima aminokiselinsku sekvencu sa najmanje oko 70%. 75%. 80%. 85%. 90%. 91%. 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% sekvencione identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom AHASL proteina opisanog u ovom tekstu.

[0044] Forme pronalaska odnose se i na biljni ekspresioni vektor sa promotorom koji pokreće ekspresiju u biljci, operabilno povezanim sa izolovanim polinukleotidnim molekulom predmetnog pronalaska. Izolovani polinukleotidni molekul sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira AHASL protein, ili njegov funkcionalni fragment i varijantu. Biljni ekspresioni vektori formi predmetnog pronalaska ne zavise od određenog promotora, nego samo od sposobnosti tog promotora da pokrene gensku ekspresiju u biljnoj ćeliji. Poželjni promotori uključuju konstitutivne promotore i tkivno-preferentne promotore.

[0045] Transformacioni vektori mogu da se koriste za proizvodnju biljaka transformisanih genom od interesa. Transformacioni vektor će imati selektabilni marker-gen predmetnog pronalaska i gen od interesa, koji će se uvesti i tipično eksprimirati u transformisanoj biljci. Takav selektabilni marker-gen sa AHASL polinukleotidom rezistentnim na herbicide, predmetnog pronalaska, operabilno je povezan sa promotorom koji pokreće ekspresiju u ćeliji-domaćinu. Za korišćenje u biljkama i biljnim ćelijama, transformacioni vektor ima selektabilni marker-gen koji uključuje AHASL polinukleotid rezistentan na herbicide, predmetnog pronalaska, operabilno povezan sa promotorom koji pokreće ekspresiju u biljnoj ćeliji. Geni od interesa predmetnog pronalaska variraju zavisno od željenog ishoda. Na primer, od interesa mogu biti različite promene fenotipa, uključujući modifikovanje sastava masnih kiselina u biljci, promenu odbrambenih mehanizama biljke prema insektima i/ili patogenima i slično. Ovi rezultati mogu da se ostvare tako što će se obezbediti ekspresija heterologih proizvoda ili povećati ekspresije endogenih proizvoda u biljkama. Alternativno, rezultati mogu da se ostvare tako što će se obezbediti smanjena ekspresija jednog ili više endogenih proizvoda, posebno enzima ili kofaktora, u biljci. Ove promene za rezultat imaju promene fenotipa transformisane biljke. [0046|U jednoj formi, geni od interesa uključuju gene za rezistenciju na insekte kao što su na primer, geni proteinskog toksinaBacillus thuringiensis(U.S. Patent No. 5,366,892; 5,747,450; 5,736,514; 5,723,756; 5,593,881; i Geiser et al. (1986) Gene 48: 109). AHASL proteini ili polipeptidi opisani u ovom tekstu mogu da se prečiste iz. na primer, biljaka suncokreta, Isto tako, izolovani polinukleotidni molekul koji kodira AHASL protein predmetnog pronalaska može da se koristi za ekspresiju AHASL proteina predmetnog pronalaska u mikrobu, npr.,E. coliili kvascu. Eksprimirani AHASL protein može da se prečisti iz ekstrakataE. coliili kvasca bilo kojim metodom poznatim prosečno obučenom stručnjaku u oblasti.

[0047]Forme predmetnog pronalaska obuhvataju AHASL polinukleotidne molekule i njihove fragmente i varijante. Za potrebe ovog pronalaska, izraz "fragmenti i varijante" označava fragmente i varijante polipeptida za primer, koji imaju AHAS aktivnost. U određenim formama, metodi uključuju korišćenje biljaka tolerantnih na herbicide ili rezistentnih na herbicide. Fragment AHASL nukleotidne sekvence predmetnog pronalaska može kodirati biološki aktivni deo AHASL proteina, ili može biti fragment koji može da se koristi kao hibridizaciona proba ili PCR prajmer, korišćenjem dole opisanih metoda. Biološki aktivni deo AHASL proteina može da se pripremi izolovanjem dela jedne od AHASL nukleotidnih sekvenci predmetnog pronalaska, ekspresijom kodiranog dela AHASL proteina (npr., rckombinantnom ekspresijomin vitro)i procenom aktivnosti kodiranogdela AHASL!proteina. Polinukleotidni molekuli koji su fragmenti AHASL nukleotidne sekvence obuhvataju najmanje oko 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, ili 1100 nukleotida, ili do broja nukleotida prisutnih u ovde opisanoj nukleotidnoj sekvenci pune dužine, zavisno od namene. [0048|Fragment AHASL nukleotidne sekvence koja kodira biološki aktivni deo AHASL proteina predmetnog pronalaska, kodiraće najmanje oko 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175. 200, 225, 250, 275, 300, 325 ili 350 kontinuiranih amino-kiselina, ili do ukupnog broja amino-kiselina prisutnih u AHASL proteinu pune dužine, predmetnog pronalaska. Fragmenti AHASL nukleotidne sekvence, koji se koriste kao hibridizacione probe ili PCR prajmcri, ne moraju da kodiraju biološki aktivni deo AHASL proteina. [0049|Varijante AHASL nukleotidnih sekvenci mogu da se naprave uvođenjem mutacija nasumično duž ceie ili dela AHASL-kodirajuće sekvence, na primer saturacionom mutagenezom, a dobijeni mutanti mogu da se pretražuju u pogledu AHAS aktivnosti, da bi se iđentifikovali mutanti koji su zadržali AHAS aktivnost, uključujući AHAS aktivnost rezistentnu na herbicide. Posle mutageneze, kodirani protein može da se rekombinantno eksprimira i aktivnost proteina može da se odredi korišćenjem standardnih testnih tehnika. Tako. nukleotidne sekvence pronalaska uključuju sekvence opisane u ovom tekstu, kao i njihove fragmente i varijante. AHASL nukleotidne sekvence predmetnog pronalaska, i njihovi fragmenti i varijante, mogu da se koriste kao probe i/ili prajmeri, za identifikovanje i/ili kloniranje AHASL homologa u drugim biljkama, takve probe mogu da se koriste za detektovanje transkripata ili genomskih sekvenci koje kodiraju iste ili identične proteine. Na taj način, metodi kao što su PCR, hibridizacija i slično, mogu da se koriste za identifikovanje sekvenci koje su suštinski slične sa sekvencama predmetnog pronalaska. Vidi, na primer, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: Laboratorv Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Plainvievv, NY) i Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY). AHASL nukleotidne sekvence izolovane na osnovu svoje sekvencione identičnosti sa ovde navedenim AHASL nukleotidnim sekvencama ili njihovim fragmentima i varijantama, obuhvaćene su predmetnim pronalaskom.

Transgeneza

[0050]U ovom tekstu opisani su metodi stvaranja transgene biljke rezistentne na herbicide. Metodi uključuju trans formi sanje biljke biljnim ekspresionim vektorom sa promotorom koji pokreće ekspresiju u biljci, opreabilno povezanim sa izolovanim polinukleotidnim molekulom pronalaska, izolovani polinukleotidni molekul ima nuklcotidnu sekvencu koja kodira AHASL protein ili njegov funkcionalni fragment i varijantu aminokiselinskih sekvenci.

[0051]Forme predmetnog pronalaska obezbeđuju biljke, biljne organe, biljna tkiva, biljne ćelije, semena i nehumane ćelije-domaćine transformisane najmanje jednim polinukleotidnim molekulom, ekspresionom kasetom ili transformacionim vektorom pronalaska. Takve transformisane biljke, biljni organi, biljna tkiva, biljne ćelije, semena i nehumane ćelije-domaćini imaju povećanu toleranciju ili rezistenciju na najmanje jedan herbicid, pri nivoima herbicida koji ubijaju ili inhibiraju rast netransformisane biljke, biljnog tkiva, biljne ćelije, ili nehumane ćelije-domaćina. respektivno.

[0052]AHASL polinukleotidi opisani u ovom tekstu, koriste se u metodima pojačanja rezistencije biljaka tolerantnih na herbicide. U jednoj formi, biljke tolerantne na herbicide imaju AHASL protein tolerantan na herbicide ili rezistentan na herbicide. Biljke tolerantne na herbicide uključuju biljke transformisane AHASL nuklcotiđnim sekvencama tolerantnim na herbicide i biljke koje u svojim genomima imaju endogeni gen koji kodira AHASL protein tolerantan na herbicide. Nukleotidne sekvence koje kodiraju AHASL proteine tolerantne na herbicide i biljke tolerantne na herbicide koje imaju endogeni gen koji kodira AHASL protein tolerantan na herbicid uključuju polinukleotide i biljke opisane u ovom tekstu i one koje su poznate u struci. Vidi, na primer, U.S. Patent No. 5,013,659, 5,731,180, 5,767,361, 5,545,822, 5,736,629, 5,773,703, 5,773,704, 5.952,553 i 6,274,796. Takvi metodi za pojačanje rezistencije herbicid-tolerantnih biljaka uključuju trans formi sanje biljke tolerantne na herbicide najmanje jednom polinukleotidnom konstrukcijom sa promotorom koji pokreće ekspresiju u biljnoj ćeliji, operabilno povezanim sa herbicid-rezistentnim AHASL polinukleotiđom pronalaska, posebno polinukleotidom koji kodira AHASL protein rezistentan na herbicide i fragmente i varijante pomenutih polinukleotida koji kodiraju polipeptide sa herbicid-rezistentnom AHAS aktivnošću. Nijedan od AHASL proteina koji prethode predmetnom pronalasku, međutim, nije sposoban da daje širinu spektra i snagu rezistencije koji se dobijaju korišćenjem AHASL gena predmetnog pronalaska.

[0053]Na raspolaganju postoje brojni biljni transformacioni vektori i metodi transformisanja biljaka. Vidi, na primer, An, G. et al. (1986) Plant Phvsiol. 81:301-305; Fry, J„ et al. (1987) Plant Cell Rep. 6:321-325; Block, M. (1988) Theor. Appl Genet.76:767-77; Hinchee, et al. (1990) Stadler. Genet. Svmp. 203212.203-212; Cousins, et al. (1991) Aust. J. Plant Phvsiol, 18:481-494; Chee, P. P. and Slightom, J. L.

(1992) Gene 118:255-260; Christou, et al. (1992) Trends. Biotechnol. 10:239-246; DTIalluin, et al. (1992) Bio/Technol. 10:309-314; Dhir, et al. (1992) Plant Phvsiol. 99:81-88; Casas et al. (1993) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:11212-11216; Christou, P.

(1993) In Vitro Cell. Dcv. Biol- Plant; 29P:1 19-124; Davies, et al. (1993) Plant Cell Rep. 12:180-183; Dong, J. A. and Mchughen, A. (1993) Plant Sci. 91: 139-148; Franklin, C. 1. and Trieu, T. N. (1993) Plant Phvsiol. 102:167; Golovkin, et al. (1993) Plant Sci. 90:43-52; Guo Chin ScL Buli. 38:2072-2078; Asano, et al. (1994) Plant Cell Rep. 13; Averes N. M. and Park, W. D. (1994) Crit. Rcv. Plant. Sci. 13:219-239; Barcelo, et al. (1994) Plant. J. 5:583-592; Becker, et al., (1994) Plant. J. 5:299-307; Borkovvska et al. (1994) Acta. Phvsiol. Plant 16:225-230; Christou, P. (1994) Agro. Food. Md Hi Tech. 5: 17-27; Eapen et al. (1994) Plant Cell Rep. 13:582-586; Hartman, et al. (1994) Bio-Technology 12: 919923; Ritala, et al. (1994) Plant. Mol. Biol. 24:317-325; i Wan, Y. C. and Lemaux, P. G. (1994) Plant Phvsiol. 104:3748. [00541Forme metoda pronalaska uključuju uvođenje polinukleotidnog konstrukta u biljku. Izraz "uvođenje/introdukovanje" znači prikazivanje biljci polinukleotidnog konstrukta na takav način da konstrukt ima pristup unutrašnjosti biljne ćelije. Metodi ne zavise od određenog metoda uvođenja polinukleotidnog konstrukta u biljku, nego samo od toga da li polinukleotidni konstrukt ima pristup u unutrašnjost najmanje jedne biljne ćelije. Metodi uvođenja poliukleotidnih konstrukata u biljke poznati su u struci i uključuju, ali se ne ograničavaju na metode stabilne transformacije, metode prolazne transformacije i metode posredovane virusima. Izraz "stabilna transformacija" znači da se polinukleotidni konstrukt uveden u biljku inlegriŠe u genom biljke i može ga naslediti njeno potomstvo. Izraz "prolazna transformacija" znači da se polinukleotidni konstrukt uveden u biljku ne integriše u genom biljke. [0055|Da bi se biljke i biljne ćelije transformisale, nukleotidne sekvence pronalaska insertuju se, korišćenjem standardnih tehnika, u bilo koji vektor poznat u struci, pogodan za ekspresiju nukleotidnih sekvenci u biljci ili biljnoj ćeliji. Izbor vektora zavisi od poželjne tehnike transformisanja i ciljne biljne ćelije koja će se trans formi sati. U formi predmetnog pronalaska, AHASL nukleotidna sekvenca operabilno je povezana sa biljnim promotorom koji je poznat po visokom nivou ekspresije u biljnoj ćeliji i ovaj konstrukt se zatim uvodi u biljku koja je osetljiva na jedan više od sledećih herbicida, IMI herbicid, SU herbicid, TP herbicid, ili POB herbicid, i transformisana biljka se regenerišc. Transformisana biljka je tolerantna na izlaganje nivoima IMI herbicida, SU herbicida, TP herbicida, POB herbicida, i/ili njihovih mešavina, koji bi ubili ili značajno oštetili netransformisanu biljku. Ovaj metod može da se primeni kod bilo koje biljne vrste; međutim, metod ispoljava željenu korisnost kada se primenjujc kod biljaka suncokreta. [0056|Metodologije konstruisanja biljnih ekspresionih kaseta i uvođenja stranih nukleinskih kiselina u biljke opšte su poznati u struci i opisani su ranije. Na primer, strana DNK može da se uvede u biljke korišćenjem tumor-indukujućih (Ti) plazmidnih vektora. Drugi metodi koji se koriste za dostavljanje strane DNK uključuju korišćenje PEG-posredovane transformacije protoplasta, elektroporaciju, mikroinjekciona vlakanca i genske pištolje ili mikroprojektilsko bombardovanje, kako bi se direktno preuzela DNK. Ovi metodi poznati su u struci. (U.S. Pat. No. 5,405,765, Vasil et al.; Bilang et al.

(1991) Gene 100: 247-250; Scheid et al., (1991) Mol. Gen. Genet., 228: 104-112; Gnerche et al., (1987) Plant Science 52: 111-116; Neuhause et al., (1987) Theor. Appl Genet. 75: 30-36; Klein et al., (19S7) Nature 327: 70-73; Hovvell et al. (1980) Science 208:1265; Horsch et al. (19S5) Science 227: 1229-1231; DeBlock et al. (1989) Plant Physiology 91: 694-701; Methods for Plant Molecular Biology (VVeissbach and Weissbach, eds.) Academic Press, Inc. (1988) i Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, Eds.) Academic Press, Inc. (1989). Metod transformacije zavisi od biljne ćelije koju treba transformisati. stabilnosti korišćenog vektora, nivoa ekspresije genskog proizvoda i drugih parametara.

[0057]Drugi pogodni metodi uvođenja nukleotidnih sekvenci u biljne ćelije i zatim insertovanja u biljni genom, uključuju mikroinjektiranje opisano u Crossway et al.

(1986) Biotechniques 4:320-334, elektroporaciju opisanu u Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606, Agrobacterium-om posredovanu transformaciju opisanu u Townsend et al., U.S. Patent No. 5,563,055, Zhao et al., U.S. Patent No. 5,981,840, direktni genski transfer opisan u Paszkovvski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722 i balističku akceleraciju čestica opisanu u, na primer, Sanford et al., U.S. Patent No. 4,945,050; Tomes et al., U.S. Patent No. 5,879,918; Tomes et al., U.S. Patent No.

5,886,244; Bidney ct al., U.S. Patent No. 5,932,782; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Micro projectile Bombardment", u Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe et al. (1988) Biotechnology) 6:923-926); i Leci transformaciju (WO 00/28058). Vidi i; De VVet ct al. (1985) u The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York), pp. 197-209 (polen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 i Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (vlakancima posredovana transformacija): D'Halluin et al.

(1992) Plant Cell 4: 1495-1505 (elektroporacija); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255.

[0058jPolinukleotidi formi predmetnog pronalaska mogu da se uvedu u biljke dovođenjem u kontakt biljaka sa virusom ili virusnim nukleinskim kiselinama. Uopšteno. takvi metodi uključuju inkorporisanje polinukleotidnog konstrukta predmetnog pronalaska u DNK ili RNK molekul virusa. Prepoznatljivo je da AHASL protein predmetnog pronalaska nože biti inicijalno sintetisan kao deo virusnog poliproteina, koji kasnije može da se obradi proteolizomin rivoiliin vitro,da bi se proizveo željeni rekombinantni protein. Pored toga, prepoznatljivo je da promotori predmetnog pronalaska obuhvataju i promotore koji se koriste za transkripciju virusnim RNK-polimerazama. Metodi uvođenja polinukleotidnih konstrukata u biljke i eksprimiranja proteina u njima, koji uključuju virusne DNK ili RNK molekule, poznati su u struci. Vidi, na primer, U.S. Patent No. 5,889,191, 5,889,190, 5,866,785, 5,589,367 and 5,316,931.

(0059|Transformisane ćelije mogu na uobičajene načine izrasti u biljke. Vidi, na primer, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Ove biljke zatim mogu da rastu i da se oprašuju istim transformisanim sojem ili različitim sojevima, a dobijeni hibrid koji ima konstitutivnu ekspresiju željene fenotipske karakteristike se identifikuje. Kako bi se osiguralo da će se ekspresija željene fenotipske karakteristike stabilno održati i nasleđivati, mogu se odgajiti dve ili više generacija, a zatim se semena sakupljaju da bi se osiguralo postizanje ekspresije željene fenotipske karakteristike. Na taj način, forme predmetnog pronalaska obezbeđuju transformisano seme (označeno i kao „transgeno seme") koje ima polinukleotidni konstrukt predmetnog pronalaska, na primer, ekspresionu kasetu predmetnog pronalaska stabilno inkorporisanu u genom.

Biljke rezistentne na herbicide, opisane u ovom tekstu, primenjuju se u metod im a kontrole korova. Tako, ova objava uključuje metode kontrole korova u blizini herbicid-rezistentne biljke predmetnog pronalaska. Metodi uključuju nanošenje efikasne količine herbicida na korove u blizini biljke rezistentne na herbicide, pri čemu biljka ima povećanu rezistenciju na jedan ili više od sledećih herbicida. IMI herbicid, SU herbicid, TP herbicid, POB herbicid, i/ili njihove mešavine. u porcđenju sa biljkom divljeg tipa.

|0060]Forme predmetnog pronalaska obezbeđuju netransgena i transgena semena sa povećanom tolerancijom na jedan ili više herbicida. posebno IMI herbicid, SU herbicid, TP herbicid, POB herbicid, i/ili njihove mešavine. Takva semena uključuju, na primer. netransgena semena suncokreta, koja sadrže karakteristike tolerancije na herbicide biljke suncokreta RW-B i transgena semena koja sadrže polinukleotidni molekul predmetnog pronalaska, koji kodira AHASL protein rezistentan na herbicide.

Ispitivanje prisustva mutantnog AHASLgena

[0061]Nukleotidne sekvence formi predmetnog pronalaska mogu da se koriste za izolovanje odgovarajućih sekvenci iz drugih organizama, posebno drugih biljaka, preciznije drugih dikotila. Na taj način, metodi kao što su PCR, hibridizacija i slično, mogu da se koriste za identifikovanje takvih sekvenci na osnovu sekvencione homologije sa sekvencama navedenim u ovom tekstu. Predmetnim pronalaskom obuhvaćene su sekvence izolovane na osnovu sekvencione identičnosti sa celim AHASL polinukleotidnim sekvencama navedenim u ovom tekstu ili njihovim fragmentima. Tako su u predmetni pronalazak uključene izolovane polinukleotidne sekvence koje kodiraju AHASL protein i koje se hibridizuju pod stringentnim uslovima sa sekvencama opisanim u ovom tekstu ili njihovim fragmentima. {0062]U okviru PCR pristupa, mogu se dizajnirati oligonukleotidni prajmeri koji se koriste u PCR reakcijama za umnožavanje odgovarajućih DNK sekvenci iz cDNK ili genomske DNK ekstrahovane iz bilo koje biljke od interesa. Metodi dizajniranja PCR prajmera i PCR kloniranja opšte su poznati u struci. Vidi Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nevv York); i Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nevv York). Poznati metodi PCR uključuju, ali se ne ograničavaju na metode korišćenja parnih prajmera, unutrašnjih (nested) prajmera, jeđnospecifičnih prajmera, degenerisanih prajmera, gen-specifičnih prajmera, vektor-specifičnih prajmera, parcijalno pogrešno sparenih prajmera i slično. AHASL polinukleotidne sekvence predmetnog pronalaska obezbeđene su u uekspresionim kasetama za ekspresiju u biljkama od interesa. Kaseta će uključivati 5"- i 3'-regulatorne sekvence operabilno povezane sa AHASL polinukleotidnom sekvencom predmetnog pronalaska. "Operabilno povezan" odnosi se na funkcionalnu vezu između promotora i druge sekvence, pri čemu promotorska sekvenca inicira i posreduje u transkripciji DNK sekvence koja odgovara drugoj sekvenci. Uopšteno. operabilno povezan znači da su sekvence nukleinskc kiseline koje su povezane kontinuirane i, kada je potrebno da se spoje dva protein-kodirajuća regiona, kontinuirane i nalaze se u istom okviru čitanja. Kaseta može dodatno sadržati još najmanje jedan gen koji će se kotransformisati u organizmu. Alternativno, dodatni gen ili dodatni geni mogu se obezbediti na više ekspresionih kaseta.

[0063]Obezbeđena je takva ekspresiona kaseta sa većim brojem restrikcionih mesta za inserciju AHASL polinukleotidne sekvence koja treba da bude pod transkripcionom regulacijom regulatornih regiona. Ekspresiona kaseta može dodatno sadržati selektabilne marker-gene. Ekspresiona kaseta će, u 5"-3"-smeru transkripcije, sadržati transkripcioni i translacioni inicijacioni region (tj., promotor), AHASL polinukleotidnu sekvencu predmetnog pronalaska i transkripcioni i translacioni terminacioni region (tj., region terminacije), funkcionalnr u biljkama. Promotor može biti nativan ili analog ili stran ili heterolog, za biljku-domaćina i/ili za AHASL polinukleotidnu sekvencu pronalaska. Pored toga, promotor može biti prirodna sekvenca ili, alternativno, sintetska sekvenca. Kada je promotor"stran" ili "heterolog" za biljku-domaćina, znači da se promotor ne nalazi u nativnoj biljci u koju jc promotor introdukovan. Kada je promotor "stran" ili "heterolog" za AHASL polinukleotidnu sekvencu, znači da promotor nije nativan ili prirodan promotor za operabilno vezanu AHASL polinukleotidnu sekvencu. Kako se koristi u ovom tekstu, himerni gen sadrži kodirajuću sekvencu operabilno povezanu sa transkripcionim inicijacionim regionom koji je heterolog za kodirajuću sekvencu.

[0064]Iako herbicid-rezistentni AHASL polinukleotidi opisani u ovom tekstu mogu da se koriste kao selektabilni marker-geni za transformaciju biljke, ekspresione kasete koje sadrže ove polinukleotide mogu da sadrže druge selektabilne marker-gene za selekciju transformisanih ćelija. Selektabilni marker-geni koriste se za selekciju transformisanih ćelija ili tkiva. Markerski geni uključuju, ali se ne ograničavaju na gene koji kodiraju rezistenciju na antibiotike, kao što su oni koji kodiraju neomiein-fosfotransferazu II (NEO) i higromicin-fosfotransferazu (HPT), kao i gene koji daju rezistenciiju na 5 herbicidnih jedinjenja kao što su glufozinat-amonijum, bromoksinil, imidazolinoni i 2,4- dihlorofenoksiacetat (2,4-D). Vidi uopšteno, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 1:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley et al. (1980) u The Operon, pp. 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555-566; Brovvn et al.

(1987) Cell 10 49:603-612; Figge et al. (1988) Cell 52:713-722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5400-5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University ofHeidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1917-1921; Labovv ct al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 15 89:3952-3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad, Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb et al.

(1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschr M et al. (1988) Biochemistry 27: 1094-1104; Bonin (1993) PhD. Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:5547-5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacologv, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); GilI et al. (1988) Nature 334:721-724. Gornja lista selektabilnih marker-gena ne treba da bude ograničavajuća i, po potrebi, može se upotrebiti bilo koji selektabilni marker-gen.

|0065] U metodu hibridizacije, cela poznata AHASL nukleotidna sekvenca ili njeni delovi mogu se koristiti za pretraživanje cDNK ili genomskih biblioteka. Metodi konstruisanja takvih cDNK ili genomskih biblioteka opšte su poznati u struci. Takozvane hibridizacione probe mogu biti fragmenti genomske DNK, cDNK fragmenti, RNK fragmenti ili drugi oligonukleotidi i mogu biti obeleženi detektabilnom grupom kao što je<32>P ili bilo kojim drugim detektabilnim markerom, na primer drugim radioizotopima, fluorescentnim jedinjenjenjima, enzimima ili kofaktorima enzima. Hibridizacione probe mogu se napraviti obeležavanjem sintetskih oligonukleotida

baziranih na poznatim AHASL nukleotidnim sekvencama opisanim u ovom tekstu. Dodatno mogu da se koriste degenerisani prajmeri dizajnirani na osnovu konzerviranih nukleotida ili aminokiselinskih rezidua u poznatoj AHASL nukleotidnoj sekvenci ili kodiranoj aminokiselinskoj sekvenci. Proba tipično sadrži region nukleotidne sekvence koji se hibridizuje pod stringentnim uslovima sa najmanje oko 12, poželjno oko 25, poželjnije oko 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, ili više uzastopnih nukleotida AHASL nukleotidne sekvence predmetnog pronalaska ili njenog fragmenta ili varijante. Pripremanje proba za hibridizaciju je opšte poznato u struci.

[0066| Na primer, cela AHASL sekvenca opisana u ovom tekstu, ili jedan ili više njenih delova, mogu se upotrebiti kao proba sposobna da se specifično hibridizuje sa odgovarajućim AHASL sekvencama i infoimacionim RNK. Tehnike hibridizacije uključuju hibridizacioni skrining zasejanih DNK biblioteka (plake ili kolonije). Ilibridizacija takvih sekvenci može da se obavi pod stringentnim uslovima. Pojmovi "stringentni uslovi" ili "stringentni uslovi hibridizacije" označavaju, za potrebe ovog pronalaska, uslove pod kojima će se proba hibridizovati sa svojom ciljnom sekvencom u detektabiino većem stepenu nego sa drugim sekvencama (npr., najmanje dva puta u odnosu na pozadinu). Stringentni uslovi su sekvenciono zavisni i biće različiti pod različitim okolnostima. Tipično, stringentni uslovi će biti oni u kojima je koncentracija soli manja od oko 1.5 M jona Na, tipično koncentracija iznosi oko 0.01 do 1.0 M jona Na (ili drugih soli), na pH 7.0 do 8.3, i temperaturi od najmanje oko 30°C za kratke probe (npr., 10 do 50 nukleotida), i najmanje oko 60°C za duge probe (npr., više od 50 nukleotida). Stringentni uslovi mogu da se postignu i uz dodavanje destabilišućih sredstava kao što je formamid. Primeri niskostringentnih uslova uključuju hibridizaciju sa puferskim rastvorom 30 do 35% formamida, I M NaCl, 1% SDS (natrijumdodecil-sulfat), na 37°C, i ispiranje u IX do 2X SSC (20X SSC - 3.0 M NaCl/0.3 M trinatrijum-citrat), na 50 do 55°C. Primeri umereno stringentnih uslova uključuju hibridizaciju u 40 do 45% formamidu, 1.0 M NaCl, 1%, SDS, na 37°C i ispiranje u 0.5X do IX SSC na 55 do 60°C. Primeri visokostringentnih uslova uključuju hibridizacju u 50%o formamidu, 1 M NaCl, 1% SDS na 37°C i ispiranje u 0.1X SSC na 60 do 65°C. Opciono, puferi za ispiranje mogu da sadrže oko 0.1% do oko 1% SDS. Dužina hibridizacije je obično manja od oko 24 sata, obično oko 4 do oko 12 sati.

[0067| Specifičnost je, tipično, funkcija posthibridizacioog ispiranja, kritični faktori su jonska snaga i temperatura finalnog rastvora za ispiranje. Za DNK-DNK hibride, Tmmože aproksimativno da se odredi iz jcdnačine Meinkoth-a i Wahl-a (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81.5°C + 16.6 (log M) + 0.41 <%GC) - 0.61 (% forai) - 500/1; gde je M molarnost monovalentnih katjona, %GC je procenat guanozinskih i citozinskih nukleotida u DNK, %form je procenat formamida u rastvoru za hibridizaciju, a L je dužina hibrida u baznim parovima. Tin je temperatura (u uslovima definisane jonske snage i pH) na kojoj se 50% komplementarne ciljne sekvence hibridizuje sa savršeno poklapajućom probom. Tm se smanjuje za oko 1°C za svaki 1% pogrešnog sparivanja; prema tome, Tn„ hibridizacija i/ili uslovi ispiranja mogu da se podese da bi se postiglo hibridizovanje sa sekvencama željene identičnosti. Na primer, ako se traže sekvence sa >90% identičnosti, Tmmože da se smanji za 10°C. Uopšteno, stringentni uslovi se biraju tako da budu oko 5°C niži od termičke tačke topljenja (thermal melting point, Tm) za specifičnu sekvencu i njen komplemcnt, pri definisanoj jonskoj snazi i pH. Međutim, u jako stringentnim uslovima mogu se koristiti hibridizacija i/ili ispiranje na temperaturi koja je 1, 2, 3 ili 4°C niža od termičke tačke topljenja (Tm); u umereno stringentnim uslovima mogu se koristiti hibridizacija i/ili ispiranje na temperaturi koja je 6, 7, 8, 9 ili 10°C niža od termičke tačke topljenja (Tm); u nisko stringentnim uslovima mogu se koristiti hibridizacija i/ili ispiranje na temperaturi koja jc 11, 12, 13, 14, 15 ili 20°C niža od termičke tačke topljenja (Tm). Korišćenjem jednacine, hibridizacije i smeša za ispiranje i željene Tm, prosečno obučeni stručnjaci razumeće da su varijacije u stringentnosti uslova hibridizacije i/ili rastvora za ispiranje inherentno opisani. Ako željeni stepen pogrešnog poklapanja rezultuje Tmmanjom od 45°C (vodeni rastvor) ili 32°C (rastvor formamida), poželjno je povećati koncentraciju tako da može da se koristi viša temperatura. Opširno uputstvo za hibridizaciju nukleinskih kiselina nalazi se u Tijssen (1993) Laboratorv Techniques in Biochemistrv and Molecular Biologv - Hvbridization with Nuclcic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, Nevv York); i Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biologv, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nevv York).

Transgeneza i optimizacija ekspresije

[0068}Obezbeđeni su metodi pojačavanja AHAS aktivnosti u biljci, transtbrmisanjem biljke polinukleotidnim konstruktom koji ima promotor operabilno povezan saAHASIAnukleotidnom sekvencom predmetnog pronalaska. Metodi uključuju uvođenje polinukleotidnog konstrukta pronalaska u najmanje jednu biljnu ćeliju i regenerisanje transformisane biljke korišćenjem promotora sposobnog da pokrene gensku ekspresiju u biljnoj ćeliji. Poželjno, takav promotor je konstitutivni promotor ili tkivno-preferentni promotor. Metodi imaju primenu u povećanju rezistencije ili tolerancije biljke na najmanje jedan herbicid i, pogodno, dva. tri ili Četiri ili pet ili više herbicida koji interferiraju sa katallitičkom aktivnošću AHAS enzima, posebno IMI herbicid, SU herbicid, TP herbicid, POB herbicid, i/ili njihove mešavine.

[0069]Kada je pogodno, gen ili geni mogu da se optimizuju za povećanu ekspresiju u transformisanoj biljci. To jest, geni mogu da se sintetišu uz korišćenje biljno-preferentnih kodona da bi im se poboljšala ekspresija. Vidi, na primer, Campbell and Gowri (1990) Plant Phvsiol 92: 1-11 za diskusiju o upotrebi kodona preferentnih za domaćina. U stanju tehnike postoje raspoloživi metodi za sintetisanje biljno-poželjnih gena. Vidi, na primer, U.S. Patent No. 5,380,831 i 5,436,391 i Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498.

[0070]Poznato je da dodatne modifikacije sekvenci povećavaju ekspresiju gena u ćeliji-domaćinu. One uključuju eliminaciju sekvenci koje kodiraju lažne poliadenilacione signale, signale mesta splajsovanja egzona i introna. transpozonu slične ponovke. i druge tako dobro okarakterisane sekvence koje mogu biti nepovoljne za ekspresiju gena. Sadržaj G-C u sekvenci može da se podesi na nivoe prosečne za datu ćeliju-domaćina. izračunato po ugledu na poznate gene koji se eksprimiraju u ćeliji-domaćinu. Kada je moguće, sekvenca se modifikuje tako da se izbegnu predviđene sekundarne iRNK strukture ukosnice. Nukleotidne sekvence za pojačavanje genske ekspresije mogu da se koriste i u biljnim ekspresionim vektorima. Ovo uključuje introne kukuruza Adhl, intronl gen (Callis et al. Genes and Development 1:1183-1200, 1987), i liderske sekvence, (W-sekvenca) iz virusa mozaika duvana (tobaceo mosaic virus, TMV), virusa hlorotične pegavosti kukuruza i virusa mozaika lucerke (Gallic ct al. Nucleic Acid Res. 15:8693-8711, 1987 i Skuzeski et al. Plant Mol .Biol. 15:65-79, 1990). Pokazano je da prvi intron iz shrunken-1 lokusa kukuruza povećava ekspresiju gena u himemim genskim konstruktima. U.S. Pat. No. 5,424,412 i 5,593,874 opisuju koiršćenje specifičnih introna u gcnskim ekspresionim konstruktima, a Gallie et al. (Plant Phvsiol. 106:929-939, 1994) su takođe pokazali đa su introni korisni za regulisanje genske ekspresije na tkivno-specifičnoj osnovi. Da bi se dodatno poboljšala ili optimizovala ekspresija velike subjedinice AHAS, biljni ekspresioni vektori predmetnog pronalaska mogu sadržati i DNK sekvence sa regionima za prikaČinjanje za matriks (matrix attachment regions, MAR). Kada se biljne ćelije transfonnišu tako modifikovanim ekspresionim sistemima, one mogu da ispolje preteranu ekspresiju ili konstitutivnu ekspresiju nukleotidne sekvence predmetnog pronalaska. |0071]Ekspresione kasete u ekspresionom kasetnom konstruktu dodatno mogu đa sadrže 5"-liderske sekvence. Takve liderske sekvence mogu delovati tako što pojačavaju translaciju. Translacioni lideri poznati su u struci i uključuju: pikornavirusne lidere, na primer, EMCV lider (eneefalomiokarditis 5"-nekodirajući region) (Elroy-Stein et al.

(1989) Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:6126-6130); potivirusne lidere, na primer. TEV lider (virus graviranosti duvana) (Gallie et al. (1995) Gene 165(2):233-238), MDMV lider (virus mozaične kržljavosti kukuruza) (Virology 154:9-20), i proteine koji se vezuju za humani teški lanac imunoglobulina (binding protein, BiP) (Macejak et al.

(1991) Nature 353:90-94); netranslatovani lider iRNK za protein omotača virusa mozaika lucerke (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); lider virusa mozaika duvana (TMV) (Gallie et al. (1989) u Molecular Biology of RNA. ed. Cech (Liss, Nevv York), pp. 237-256); i lider virusa hlorolične pegavosti kukuruza (MCMV)

(Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Vidi i Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968. Mogu se koristiti i drugi metodi za koje se zna da pojačavaju translaciju, na primer, introni i slično. U pripremanju ekspresione kasete, različiti fragmenti DNK mogu da se obrađuju, tako da se obezbede DNK sekvence u pravoj orijentaciji i, kako je pogodno, u odgovarajućem ramu čitanja. Sa tim ciljem, mogu da se koriste adapteri ili linkeri za spajanje DNK fragmenata, ili mogu da se uključe druge manipulacije da bi se obezbedila druga restrikciona mesta, uklanjanje suvišne DNK, uklanjanje restrikcionih mesta, ili slično. U tu svrhu, mogu se upotrebitiin vi tromutageneza, prajmer reparacija, restrikcija, stapanje, resupstitucije, npr., tranzicije.

[0072] Obezbeđene su ekspresione kasete za ekspresiju polinukleotida u biljkama, biljnim tkivima, biljnim ćelijama ili drugim ćelijama-domaćinima. Ekspresione kasete imaju promotore ekspresibilne u biljkama, biljnim tkivima, biljnim ćelijama ili drugim ćelijama-domaćinima od interesa, operabilno povezane sa polinukleotidom pronalaska koji ima nukleotidnu sekvencu kodirajuću za AHASL protein pune dužine (tj.. uključujući i hloroplast-tranzitni peptid) ili zreli AHASL protein (tj., bez hloroplast-tranzitnog peptida). Ako je poželjna ekspresija u plastidima ili hloroplastima biljnih ćelija, ekspresione kasete mogu da sadrže i operabilno vezanu hloroplast-ciljajuću sekvencu koja kodira hloroplast-tranzitni peptid. Takve ekspresione kasete mogu da se koriste u metodu pojačavanja tolerancije biljne ćelije iii ćelije-domaćina na herbicide. Metod uključuje transformisanje biljne ćelije ili ćelije-domaćina ekspresionom kasetom koja sadrži promotor ekspresibilan u biljnoj ćeliji ili ćeliji-domaćinu od interesa, i promotor je operabilno povezan sa polinukleotidom forme predmetnog pronalaska, koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira, na primer. AHASL protein rezistentan na IMI herbicid, SU herbicid, TP herbicid, ili POB herbicid.

[0073] KoriŠćenje izraza "polinukleotidni konstrukti" nije ograničeno na DNK. ProseČno obučeni stručnjaci će prepoznati da polinukleotidni konstrukti, tačnije polinukleotidi i oligonukleotidi koji se sastoje od ribonukleotida i kombinacija ribonukleotida i deoksiribonukleotida, mogu da se koriste u ovde opisanim metodima. Takvi deoksiribonukleotidi i ribonukleotidi uključuju prirodne molekule i sintetske analoge. Polinukleotidni konstrukti pronalaska obuhvataju i sve oblike polinukleotidnih konstrukata uključujući, ali ne ograničavajući se na, jednolančane oblike, dvolančane oblike, ukosnice, strukture matične petlje i slično. Pored toga. prosečno obučeni stručnjak će razumeti da svaka nukleotidna sekvenca opisana u ovom tekstu uključuje i komplement te nukleotidne sekvence date za primer. |0074] U metodima pronalaska može da se koristi polinukleotidni konstrukt koji je sposoban da, u transformisanoj biljci, usmerava ekspresiju najmanje jednog proteina ili najmanje jedne RNK, kao na primer, antisense-RNK koja je komplementarna sa bar delom iRNK. Tipično, takav polinukleotidni konstrukt se sastoji od sekvence kodirajuće za protein ili RNK, operabilno povezane sa 5<*->i 3"-transkripcionim regulatornim regionima. Alternativno, može da se koristi polinukleotidni konstrukt koji nije sposoban da, u transformisanoj biljci, usmeri ekspresiju proteina ili RNK. Za ekspresiju polinukleotida predmetnog pronalaska u ćeliji-domaćinu od interesa, polinukleotid je, tipično, operabilno povezan sa promotorom koji je sposoban da pokrene gensku ekspresiju u ćeliji-domaćinu od interesa. Metodi eksprimiranja polinukleotida u ćeliji-domaćinu ne zavise od određenog promotora i uključuju korišćenje bilo kog promotora za koji se u struci zna da je sposoban da pokrene gensku ekspresiju u ćeliji-domaćinu od interesa.

[0075]Iako eksprimiranje AHASL polinukleotida korišćenjem heterologih promotora može biti poželjno, mogu se koristiti i nativne promotorske sekvence. Takvi konstrukti bi promenili nivoe ekspresije AHASL proteina u biljci ili biljnoj ćeliji. Prema tome, fenotip biljke ili biljne ćelije je izmenjen. Terminacioni region može biti nativan sa transkripcionim inicijacionim regionom, može biti nativan sa operabilno povezanom AHASL sekvencom od interesa, može bili nativan sa biljnim domaćinom ili može biti izveden iz drugog izvora (tj., stran ili heterolog sa promotorom, AHASL polinukleotidnom sekvencom od interesa, biljnim domaćinom, ili bilo kojom kombinacijom toga). Pogodni regioni terminacije mogu se dobiti iz Ti-plazmidaA. tumefaciens,kao što su regioni terminacije oktopin-sintaze i nopalin-sintaze. Vidi i Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-i58; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; i Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

[0076]U primeni pronalaska mogu se koristiti brojni promotori i oni se mogu selektovati na osnovu željenog ishoda. Nukleinskc kiseline mogu da se kombinuju sa konstitutivnim, tkivno-preferentnim ili drugim promotorima, da bi se eksprimirale u biljkama. Takvi konstitutivni promotori uključuju, na primer. sržni promotor Rsyn7 promotora i druge konstitutivne promotore opisane u WO 99/43838 i U.S, Patent No. 6,072,050; sržni CaMV 35S promotor (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); promotor aktina pirinča (McElrov et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171); promotor ubikvitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 i Christensen et al.

(1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS promotor (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); ALS promotor (U.S. Patent No. 5,659,026) i slično. Drugi konstitutivni promotori uključuju, na primer, U.S. Patent No. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142; i 6,177,611. Tkivno-preferentni promotori mogu da se koriste za ciljano pojačanu ekspresiju AHASL u određenom biljnom tkivu. Takvi tkivno-preferentni promotori uključuju, ali se ne ograničavaju na promotore preferentne za list, promotore preferentnc za koren, promotore prefcrentne za seme i promotore preferentne za stabljiku. Tkivno-preferentni promotori opisani su, na primer, u Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Phvsiol. 38(7):792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen. Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2): 157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Phvsiol. 112(3): 1331- 1341; Van Camp et al. (1996) Plant Phvsiol. i 12(2):525-535; Canevascini et al.

(1996) Plant Phvsiol. 112(2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773- 778; Lam (1994) Results Prob I. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al.

(1993) Plant Mol. Biol. 23(6): 1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586- 9590; i Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505. Takvi promotori mogu da se modifikuju, po potrebi, za slabu ekspresiju.

[0077]U jednoj formi, nukleinske kiseline od interesa se na eksprimiranje upućuju ciljano u hloroplast. Tako će. u slučaju kada nukleinska kiselina od interesa nije direktno insertovana u hloroplast. ekspresiona kaseta dodatno sadržati hloroplast-ciljajuću sekvencu koja sadrži nukleotidnu sekvencu kodirajuću za hloroplastni tranzitni peptid, za usmeravanje genskog proizvoda od interesa ka hloroplastima. Takvi tranzitni peptidi poznati su u struci. U pogledu hloroplast-ciljajućih sekvenci,"operabilno povezan7" znači da je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira tranzitni peptid (tj. hloroplast-ciljajuća sekvenca) povezana sa AHASL polinukleotidom, tako da su dve sekvence kontinuirane i u istom ramu čitanja. Vidi. na primer. Von Heijne el al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Phvsiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophvs. Res. Commun. 196:1414-1421; i Shah et al. (1986) Science 233:478-481.

[0078]Iako AHASL proteini opisani u ovom tekstu mogu uključivati nativni hloroplastni tranzitni peptid, svaki u struci poznati hloroplastni tranzitni peptid može da se fuzioniše sa aminokiselinskom sekvencom zrelog AHASL proteina predmetnog pronalaska, operabilnim povezivanjem hloroplast-ciljajuće sekvence sa 5'-krajem nukleotidne sekvence koja kodira zreli AHASL protein.

[0079]Hloroplast-ciljajuće sekvence poznate su u struci i uključuju hloroplastnu malu subjedinicu ribulozo-l,5-bisfosfat karboksilaze (Rubisco) (de Castro Silva Filho et al.

(1996) Plant Mol. Biol. 30:769-780; Schnell et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(5):3335-3342); 5-(enolpiruvil)šikimat-3-fosfat sintazu (EPSPS) (Archer et al. (1990) J Bioenerg. Biomemb. 22(6):789-810); triptofan-sintazu (Zhao et ai. (1995) J. Biol. Chem. 270(11):6081-6087); plastocijanin (Laurencc et ai. (1997) J Biol. Chem. 272(33):20357-20363); horizmat-sintazu (Schmidt et al. (1993) J Biol. Chem. 268(36):27447-27457); i protein koji se vezuje za hlorofil a/b sakupljače svetlosti (Iight harvesting chlorophyll a/b binding protein, LHBP) (Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:14996-14999). Vidi i Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark et al. (1989) J Biol. Chem. 264: 17544- 17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Phvsiol. 84:965-968; Romeret al. (1993) Biochem. Biophvs. Res. Commun. 196: 1414-1421; i Shah et al. (1986) Science 233:478-481.

[0080]Metodi transformacije hloroplasta poznati su u struci. Vidi na primer, Svab et al.

(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601- 606. Metodi se zasnivaju na čestičnoj pištolj-dostavi DNK koja sadrži selektabilni marker i upućivanju DNK u genom plastida homologom rekombinacijom. Dodatno, transformacija plastida može da se obavi transaktivacijom utišanog plastidnog transgena, tkivno-preferentnom ekspresijom nukleusom kodiranom i plastid-usmerenom RNK-polimerazom. Takav sistem je saopšten u McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305.

[0081]Nukleinske kiseline od interesa, koje će se usmeriti ka hloroplastu, mogu da se optimizuju za eksprimiranje u hloroplastu na račun razlika u koriŠćenju kodona, koje postoje između biljnog nukleusa i ove organele. Tako, nukleinske kiseline od interesa mogu da se sintetiŠu korišćenjem kodona preferentnih za hloroplast. Vidi, na primer, U.S. Patent No. 5,380,831.

[0082]Kako je opisano u ovom tekstu, AHASL nukleotidne sekvence formi predmetnog pronalaska imaju primenu u pojačavanju tolerancije na herbicide kod biljaka koje sadrže u svojim genomima gen koji kodira AHASL protein tolerantan na herbicide. Takav gen može da bude endogeni gen ili transgen. Pored toga. u određenim formama, sekvence nukleinskih kiselina predmetnog pronalaska mogu biti poslagane sa bilo kojim drugim polinukleotidima koji kodiraju polipeptide sa pesticidnom i/ili insekticiđnom aktivnošću, kao na primer, proteini toksinaBacillus thuringiensis(opisano u U.S. Patent No. 5,366,892; 5,747,450; 5,737,514; 5,723,756; 5,593,881; i Geiser et al. (1986) Gene 48:109). Generisane kombinacije mogu uključivati i multiple kopije svakog od polinukleotida od interesa.

[0083]Nukleotidne sekvence opisane u ovom tekstu mogu da se koriste i u sense-orijentaciji, za supresiju ekspresije endogenih gena u biljkama. Metodi supresije genske ekspresije u biljkama korišćenjem nukleotidnih sekvenci u sense-orijentaciji poznate su u struci. Metodi, uopšteno, uključuju trans formi sanje biljaka DNK-konstruktom koji sadrži promotor koji pokreće ekspresiju u biljci, operabilno povezan sa bar delom nukleotidne sekvence koja odgovara transkriptu endogenog gena. Tipično, takva nukleotidna sekvenca jc u značajnoj meri identična sa sekvencom transkripta endogenog gena, poželjno sekvenciona identičnost je veća od oko 65%, poželjnije sekvenciona identičnost je veća od oko 85%, najpoželjnije sekvenciona identičnost je veća od oko 95%. Vidi, U.S. Patent Nos. 5,283,184 i 5,034,323. [0084)Obezbeduju se i metodi povećanja rezistencije biljaka suncokreta na herbicide putem konvencionalnog uzgajanja biljaka, koje uključuje polnu reprodukciju. Metodi uključuju ukrštanje prve biljke suncokreta, rezistentne na herbicid, sa drugom biljkom suncokreta koja može, ali ne mora biti rezistentna na herbicid ili može biti rezistentna na herbicid ili herbicide koji su različiti u poredenju sa prvom biljkom. Prva biljka može biti bilo koja od biljaka rezistentnih na herbicide, opisanih u ovom tekstu, uključujući, na primer, RW-B. Druga biljka može biti svaka koja posle ukrštanja sa prvom biljkom može da proizvede vijabilno potomstvo (tj., seme). Tipično, ali ne i neophodno, prva i druga biljka su od iste vrste suncokreta. Biljke-potomci proizvedene ovim metodom imaju povećanu rezistenciju na herbicide u poredenju sa prvom ili drugom biljkom, ili obc. Kada su prva i druga biljka rezistentne na različite herbicide, biljke-potomci imaće kombinovane karakteristike tolerancije na herbicide prve i druge biljke. Ovi metodi mogu uključivati još i jednu ili više generacija povratnog ukrštanja biljaka-potomaka prvog ukrštanja sa biljkom iste Unije ili genotipa kao što su prva ili druga biljka. Alternativno, potomstvo iz prvog ukrštanja ili bilo kojeg kasnijeg ukrštanja može da se ukrsti sa trećom biljkom koja je različite linije ili genotipa od prve ili druge biljke. Pored toga, ovi metodi mogu dodatno uključivati selektovanje biljaka koje imaju karakteristike tolerancije na herbicide prve biljke, druge biljke ili i prve i druge biljke.

Metodi kontrolekorova

[0085|Usevi suncokreta se Često smenjuju sa cerealijama kao što je pšenica.. SU herbicidi se često koriste kao deo sistema za kontrolu korova u pšenici. Pored SU herbicida, IMI herbicidi mogu da se koriste kao deo sistema za kontrolu korova u pšenici kada se odgaja IMI-pšenica. Korišćenje ovih herbicida u rotaciji pšenica/suncokret dovodi do prenošenja oštećenja. Oštećenje suncokreta prenošenjem herbicida dešava se kada se rezidue herbicida nanetog na prethodni usev, u ovom primeru SU ili IMI nanet na pšenicu, nalaze u zemljištu prilikom zasejavanja useva suncokreta. Zaista, nekoliko herbicida može dovesti do oštećenja suncokreta prenošenjem, uključujući mnoge AHAS-inhibitore (Blamev et al., 1997). Oštećenje useva suncokreta može da se smanji korišćenjem sorti suncokreta rezistentnih na herbicide.

[0086] Sorte suncokreta rezistentne na herbicide, međutim, pokazuju veliku specifičnost i njihovo korišćenje dozvoljava prskanje samo jednom familijom herbicida, posle klijanja. Na primer, da bi se usev suncokreta zaštitio od oštećenja prenošenjem SU, mogu da se koriste sorte rezistentne na SU. Upotreba sorti rezistentnih na SU dopušta da se usevi suncokreta prskaju samo SU herbicidima. Trenutno, pokazane su samo specifične sorte rezistentne na SU ili rezistentne na IMI - nisu opisane sorte koje pokazuju unakrsnu rezistenciju na različite AHAS-inhibitore. Iznenađujuće i neočekivano, prisustvo gena opisanog u ovom tekstu i ekspresija odgovarajućeg AHAS proteina štite useve suncokreta od potencijalnog oštećenja prenošenjem prouzrokovanog AHAS-inhibitomim herbicidima i dopuštaju prskanje različitim AHAS-inhibitornim herbicidima da bi se korov kontrolisao u periodu posle klijanja. Mogućnost korišćenja različitih herbicida za kontrolu korova u usevima suncokreta odgajivačima znatno poboljšava uslove kontrole infestacije useva suncokreta korovom

[0087) Iznenađujuće otkriće AHAS proteina sa rezistencijom na više herbicida dopušta:

1. Mogućnost primene novih tipova AHAS-inhibirajućih herbicida za kontrolu korova u usevu suncokreta (tj.: POB i TP) ili registrovanja dobro poznatih herbicida koji se koriste za druge useve, i za suncokret.2.Mešanje dva ili više herbicida za istovremenu primenu na usevu suncokreta,

zbog visokog nivoa unakrsne rezistencije na različite familije AHAS-inhibitomih herbicida. Pored toga, unakrsna rezistencija omogućava dizajniranje

i razvijanje novih herbicidnih formulacija u kojima mogu da se kombinuju različiti AHAS-inhibitorni herbicidi, sa ciljem povećanja spektra kontrole korova u suncokretu. 3. Veću fleksibilnost u menadžmentu herbicida za kontrolu korova u suncokretu, tj., biranje i nanošenje više od jednog tipa herbicida, u različito vrcme, u istoj sezoni, zavisno od tipa korova koji treba kontrolisati. 4. Rezistenciju na herbicide prcnete sa prethodnog useva i, u isto vreme,

rezistenciju na drugi AHAS-inhibitorni herbicid primenjen u periodu posle isklijavanja.

[0088| Kontrola neželjene vegetacije podrazumeva način ubijanja korova i/ili drugi način usporavanja ili inhibiranja normalnog rasta korova. Podrazumeva se da korov, u najširem smislu, označava biljke koje rastu na lokacijama na kojima su nepoželjne. Primeri korova uključuju, ali se nc ograničavaju na, na primer, dikotiledone i monokotiledone korove. Dikotiledoni korovi uključuju, ali se ne ograničavaju na korove roda: Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthcmis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polvgonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus i Taraxacum. Monokotiledoni korovi uključuju, ali se ne ograničavaju na korove roda: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cvperus, Sorghum, Agropvron, Cvnodon, Monochoria, Fimbristvslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactvloctenium, Agrostis, Alopecurus i Apera.

[0089j Pored toga, korovi mogu uključivati, na primer. usevske biljke koje rastu na neželjenim lokacijama. Na primer, kao korov može da se razmatra samonikla biljka kukuruza iznikla na polju na kojem se prevashodno nalaze biljke suncokreta, ako je biljka kukuruza nepoželjna na polju biljaka suncokreta.

[0090] Forme predmetnog pronalaska opisuju metode povećanja tolerancije ili rezistencije biljke, biljnog tkiva, biljne ćelije ili druge ćelije-domaćina na jedan ili više herbicida koji interferiraju sa aktivnošću AHAS enzima. Poželjno, takav herbicid je IMI herbicid, SU herbicid, TP herbicid, POB herbicid, i/ili njihove mešavine. Pogodno, povećana je rezistencija ili tolerancija na dva ili više od gore navedenih herbicida. Još pogodnije, povećana je rezistencija ili tolerancija na tri ili više od gore navedenih herbicida. Najpogodnije, povećana je rezistencija ili tolerancija na četiri ili više od gore navedenih herbicida. IMI herbicidi mogu da uključuju, ali se ne ograničavaju na PURSUIT<*>(imazetapir), CADRE* (imazapik), RAPTOR<*>(imazamoks), SCEPTER<*>

(imazakvin), ASSERT<®>(imazetabenz), ARSENAL* (imazapir), derivat bilo kojeg od gore pomenutih herbicida i mešavine dva ili više bilo kojih od gore pomenutih herbicida, na primer, imazapir/imazamoks (ODYSSEY<R>). IMI herbicid može da se bira, ali se ne ograničava na 2-(4-izopropil-4-metil-5-okso-2-imidiazoIin-2-il)-nikotinsku kiselinu, [2-(4-izopropil)-4-J bmetiI-5-okso-2-imidazolin-2-i])-3-hinolinkarboksilnu] kiselinu, [5-etil-2-(4-izopropil-]4-metil-5-okso-2-imidazolin-2-iI)-nikotinsku kiselinu, 2-(4-izopropil-4-metil-5-okso-2-imidazolin-2-il)-5-(metoksimetil)-nikotinsku kiselinu, [2-(4-izopropiI-4-metil-5-okso-2-J-imidazolin-2-il)-5-metilnikotinsku kiselinu i meša-vinu metil-[6-(4-izopropil-4-]metil-5-okso-2-imidazoIin-2-il)-m-toluata i metil-[2-(4-izopropil-4-metil-5-]okso-2-imidazolin-2-il)-p-toluata. Poželjna je upotreba 5-etil-2-(4-izopropil-4-metiI-5-okso-2-imidazolin-2-il)-nikotinske kiseline i [2-(4-izopropil-4-metil-5-okso-2-imidazolin-2-]il)-5-(metoksimetil)-nikotinske kiseline. Posebno je poželjna upotreba [2-(4-izopropil-4-]-metil-5-okso-2-imidazolin-2-il)-5-(metoksimetil)-nikotinske kiseline.

[0091] SU herbicidi mogu da uključuju, ali se ne ograničavaju na hlorsulfuron, metsulfuron metil, sulfometuron metil, hlorimuron etil, tifensulfuron metil, tribenuron metil, bensulfuron metil, nikosulfuron, etametsulfuron metil, rimsulfuron, triflusulfuron metil, triasulfuron, primisulfuron metil, cinosulfuron, amidosulfuron, fluzasulfuron, imazosulfiiron, pirazosulfuron etil, halosulfuron, azimsulfuron, ciklosulfuron, etoksisulfuron, flazasulfuron, fiupirsulfuron metil, foramsulfuron, jodosulfuron, oksasulfuron, mezosulfuron, prosulfuron, sulfosulfuron, trifloksisulfuron, tritosulfuron, derivate bilo kojeg od gore pomenutih herbicida i mešavine dva ili više od gore pomenutih herbicida.

[0092] TP herbicidi mogu da uključuju, ali se ne ograničavaju na kloransulam, diklosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam i penoksulam. |0093)POB herbicidi mogu da uključuju, ali se ne ograničavaju na bispiribak, piritiobak, piriminobak, piribenzoksim i piriftalid.

[0094] Prepoznaje se da su POB herbicidi blisko povezani sa pirimidiniltiobenzoatskim herbicidima i generalizovani su pod ovim drugim nazivom od strane Weed Science Societv of America. Prema tome, herbicidi mogu uključivati pirimidiniltiobenzoatske herbicide, uključujući, ali ne ograničavajući se na gore opisane POB herbicide. U svetlu gore rečenog, podnosioci koriste izraze pirimidiniltiobenzoat i pirimidiniloksibenzoat naizmenično sa skraćenicom POB.

[0095] Korišćenje gore nabrojanih herbicida ne treba da znači da je predmetni pronalazak ograničen na specifični herbicid ili specifičnu familiju herbicida. Prosečno obučeni stručnjak u oblasti prepoznaće da mogu da se koriste i drugi herbicidi.

[0096] Obezbeđivanjem biljaka sa povećanom rezistencijom na herbicide. stiču se uslovi da se za zaštitu biljaka suncokreta od korova koriste veoma raznovrsne formulacije, tako da se poboljša rast biljaka suncokreta i smanji kompeticija za nutrijente. Sam herbicid može da se koristi za kontrolisanje korova u oblastima koje okružuju biljke opisane u ovom tekstu, pre isklijavanja, posle isklijavanja, pre sejanja i u vreme sejanja. U formi, može da se koristi formulacija IMI herbicida koja sadrži druge aditive. U drugoj formi, može da se koristi formulacija SU herbicida koja sadrži druge aditive. U sledećoj formi, može da se koristi formulacija TP herbicida koja sadrži druge aditive. U sledećoj formi, može da se koristi formulacija POB herbicida koja sadrži druge aditive. Herbicid ili herbicidi mogu da se koriste i za tretiranje semena. Aditivi koji se nalaze u formulacijama IMI herbicida, SU herbicida, TP herbicida, POB herbicida i/ili njihovim mešavinama mogu uključivati druge herbicide, deterdžente, adjuvanse, sredstva za rasprostiranje, sredstva za adheziju. stabilišuća sredstva, ili slično. Herbicidna formulacija može da bude suvi ili vlažni preparat i može da uključuje, bez ograničavanja, sipljive praškove, emulzibilne koncentrate i tečne koncentrate. Herbicid i herbicidne formulacije mogu da se primenjuju u skladu sa konvencionalnim metodima, na primer, prskanjem, irigađjom. zaprašivanjem ili slično. U ovim metodima, AHAS-inhibirajući herbicid može da se primenjuje bilo kojim metodom poznatim u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na tretman semena. tretman zemljišta i tretman zelenih delova biljke.

[0097]Pre primene, AHAS-inhibirajući herbicid može da se konvertuje u uobičajene formulacije, na primer, rastvore, emulzije, suspenzijee. prašine, prahove, paste i granule. Upotrebna forma zavisi od odgovarajuće namene. u svakom slučaju, treba obezbediti finu i jednaku distribuciju jedinjenja prema predmetnom proonalasku. |0098]Formulacije se pripremaju na poznati način (za pregled, vidi npr., US 3,060,084, EP-A 707 445 (za tečne koncentrate), Brovvning, "Agglomeration", Chemical Engineering, Dec. 4, 1967, 147-48, Perry"s Chemical Engineer's Handbook, 4th Ed., McGravv-Hill, Nevv York, 1963, strane 8-57 iet seq.WO 91/13546, US 4,172,714, US 4,144,050, US 3,920,442, US 5,180,587, US 5,232,701, US 5,208,030, GB 2,095,558, US 3,299,566, Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley and Sons, Inc., Nevv York, 1961, Hance et al., Weed Control Handbook, 8th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989 i Mollet, H., Grubemann, A., Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, VVeinheim (Germany), 2001, 2. D. A. Knovvles, Chcmistry and Technology of Agrochemical Fonnulations, Kluvver Academic Publishers, Dordrecht, 1998 (ISBN 0-7514-0443-8), na primer, dodavanjem aktivnom jedinjenju pomoćnih supstanci pogodnih za formulisanje agrohcmijskih sredstava, kao što su rastvarači i/ili prenosnici, po želji emulgatori. surfaktantni i dispergujuća sredstva, prezervansi. sredstva protiv penušanja. sredstva protiv smrzavanja, za formulacije za tretiranje semena takođe opciono koloranti i/ili povezivači i/ili želatinizujuća sredstva.

[0099]Primeri pogodnih rastvarača su voda, aromatični rastvarači (na primer Solvesso proizvodi, ksilen), parafini (na primer frakcije mineralnih ulja), alkoholi (na primer metanol, butanol, pentanol, benzil alkohol), ketoni (na primer cikloheksanon, gama-butirolakton), pirolidoni (NMP, NOP), acetati (glikol diacetat), glikoli, masnokiselinski dietilamidi, masne kiseline i estri masnih kiselina. U principu, mogu da se koriste mešavine rastvarača.

[0100]Primeri pogodnih nosača su usitnjeni prirodni minerali (na primer kaolini, gline, talk, kreda) i usitnjeni sintetski minerali (na primer visoko disperzni silicij um, silikati). Pogodni emulgatori su nejonski i anjonski emulgatori (na primer polioksietilen-masnokiselinski etri, alkilsulfonati i arilsulfonati).

[0101]Primeri dispergujućih sredstava su lignin-sulfitni tečni otpad i metilceluloza.

[0102]Surfaktantni pogodni za korišćenje su alakalni metali, zemno-alkalni metali i amonijum-soli lignosulfonske kiseline, naftalensulfonske kiseline, fenolsulfonske kiseline, dibutilnaftalensulfonske kiseline, alkilarilsulfonati, alkil sulfati, alkilsulfonati, masni alkohol-sulfati, masne kiseline i sulfatisani etri masnih alkohola i glikola, pored toga kondenzati sulfonisanog naftalena i naftalenskih derivata sa formaldehidom, kondenzati naftalena ili naftalensulfonske kiseline sa fenolom i formaldehidom, polioksietilen oktilfenol etar, etoksilisani izooktilfenol, oktilfenol, nonilfenol, alkilfenol poliglikol etri, tributilfenil poliglikol etar, tristearilfenil poliglikol etar, alkilaril polietar alkoholi, alkohol i masni alkohol-etilen oksid kondenzati, etoksilisano ricinusovo ulje, polioksietilen alkil etri, etoksilisani polioksipropilen, lauril alkohol-poliglikol etar acetal, sorbitol estri, lignosulfitni tečni otpad i metilceluloza. 10103]Supstance koje su pogodne za pripremanje direktno raspršivih rastvora, emulzija, pasti ili uljanih disperzija su frakcije nineralnih ulja srednje do visoke tačke ključanja, kao što su kerozin ili dizel ulje, pored toga ulja ugljenog katrana i ulja biljnog ili životinjskog porekla, alifatični, ciklični i aromatični ugljovodonici, na primer toluen, ksilen, parafin, tetrahidronaftalen, alkilisani naftaleni ili njihovi derivati, metanol, etanol, propanol. butanol, cikloheksanol, cikloheksanon, izoforon, visoko polarni rastvarači, na primer dimetil sulfoksid, N-metilpirolidon ili voda.

[0104]U formulaciju mogu da se dodaju i sredstva protiv zamrzavanja kao što su glicerin, etilen glikol, propilen glikol i baktericidi. Pogodna sredstva protiv penušanja su, na primer, sredstva protiv penušanja na bazi silicijuma ili magnezijum stearata.

[0105]Pogodni prezervansi su, na primer, dihlorofen i benzilalkoholhemiformal. Formulacije za tretiranje semena suncokreta mogu da sadrže još i povezivače i, opciono, kolorante. PovezivaČi mogu da se dodaju da bi se poboljšala adhezija aktivnih materijala za seme, posle tretmana. Pogodni povezivači su blok-kopolimeri EO/PO surfaktanti, ali i polivinilalkoholi, polivinilpirolidoni, poliakrilati, polimetakrilati, polibuteni, poliizobutileni, polistiren, polietilenamini, polietilenamidi, polietilenimini (Lupasol<*>, Polvmin<*>), polietri, poliuretani, polivinilacetat, tilos i kopolimeri izvedeni iz ovih polimera. |0106]Opciono, u formulaciju mogu biti uključeni koloranti. Pogodni koloranti ili boje za formulacije kojima se tretiraju semena su rodamin B, CI. pigment crveno 1 12, CI. rastvarač crveno 1, pigment plavo 15:4, pigment plavo 15:3, pigment plavo 15:2, pigment plavo 15:1, pigment plavo 80, pigment žuto 1, pigment žuto 13, pigment crveno 112, pigment crveno 48:2, pigment crveno 48:1, pigment crveno 57:1, pigment crveno 53: 1, pigment oranž 43, pigment oranž 34, pigment oranž 5, pigment zeleno 36, pigment zeleno 7, pigment belo 6, pigment braon 25, bazni violet 10, bazni violet 49, kiselo crveno 51, kiselo crveno 52, kiselo crveno 14, kiselo plavo 9, kiselo žuto 23, bazno crveno 10, bazno crveno 108. (0107|Primer pogodnog želatinizirajućeg sredstva je karagenan (Satiagel*). Praškovi. materijali za rasprostiranje, i prašinasti proizvodi mogu da se pripreme mešanjem ili istovremenim mrvljenjem aktivnih supstanci i čvrstog nosača. Granule, na primer obložene granule, impregnirane granule i homogene granule, mogu da se pripreme vezivanjem aktivnih jedinjenja za čvrste nosače. Primeri čvrstih nosača su zemljini minerali kao silicijumski gelovi, silikati, talk, kaolin, ata-glina, krečnjak, kreč, kreda, mrka glina, les, glina, dolomit, dijatomejska zemlja, kalcijum sulfat, magnezijum sulfat, magnezijum oksid, mrvljeni sintetski materijali, fertilizeri, kao na primer, amonijum sulfat, amonijum fosfat, amonijum nitrat, uree, i proizvodi biljnog porekla kao što su kaša od žitarica, kaša od kore drveta, drvena kaša i kaša od orahove ljuske, celulozni praškovi i drugi čvrsti nosači.

[0108]Uopšteno, formulacije sadrže od 0.01 do 95% po težini, poželjno od 0.1 do 90% po težini, AHAS-inhibirajućeg herbicida. U tom slučaju, AHAS- inhibirajući herbicidi se koriste sa čistoćom od 90% do 100% po težini, poželjno 95% do 100% po težini (prema NIVIR spektru). Za potrebe tretiranja semena sunokreta, respektivne formulacije mogu da se razblaže 2-10 puta, Čime se u preparatima spremnim za upotrebu dobijaju koncentracije od 0.01 do 60% po težini aktivnog jedinjenja, poželjno 0.1 do 40% po težini.

[0109]AHAS-inhibirajući herbicid može da se koristi kao takav u vidu svojih formulacija ili od njih pripremljenih upotrebnih oblika, na primer u vidu rastvora direktno nanosivih prskanjem, praskova. suspenzija ili disperzija, emulzija, uljanih disperzija, pasti, prašinastih proizvoda, materijala za rasprostiranje, ili granula, putem raspršivanja, atomiziranja, naprašivanja. raznošenja ili sipanja. Upotrebni oblici zavise isključivo od svrhe kojoj su namenjeni; oni treba da osiguraju u svakom slučaju najfiniju moguću distribuciju AHAS-inhibirajućeg herbicida prema predmetnom pronalasku.

[0110|Vodeni upotrebni oblici mogu da se pripreme od emulzionih koncentrata, pasti ili ovlažujućih praskova (sprejabilni praškovi. uljane disperzije), dodavanjem vode. Da

bi se pripremile emulzije, paste ili uljane disperzije, supstance, kao takve ili rastvorene u ulju ili rastvaraču, mogu da se homogenizuju u vodi puteni ovlaživaca, sredstva za ađheziju, disperzanta ili emulgatora. Međutim, takođe je moguće pripremiti koncentrate sastavljene od aktivne supstance, ovlaživaca, sredstva za adheziju, disperzanta ili emulgatora i, ako je pogodno, rastvarača ili ulja, i takvi koncnetrati su pogodni za razblaživanje vodom.

|0111|Koncentracije aktivnog jedinjenja u preparatima spremnim za upotrebu mogu varirati u relativno Širokim opsezima. Uopšteno, one iznose od 0.0001 do 10%, poželjno od 0.01 do 1% po težini.

[0112|U jednoj formi predmetnog pronalaska, još jedan cilj ovog pronalaska je metod tretiranja zemljišta primenom, naročito pomoću sejalica: granularne formulacije koja sadrži AHAS-inhibirajući herbicid kao smešu/formulaciju (npr., granularna formulacija, sa opciono jednim ili više čvrstih ili tečnih poljoprivredno prihvatljivih nosača i/ili opciono sa jednim ili više poljoprivredno prihvatljivih surfaktanata. Ovaj metod sc pogodno koristi u rasadnicima suncokreta.

[0113]Forme predmetnog pronalaska opisuju i seme suncokreta koje je obloženo i/ili sadrži formulaciju za tretman semena, koja uključuje najmanje jedan AHAS-inhibirajući herbicid odabran iz grupe koja se sastoji od amidosulfurona, azimsulfurona, bensulfurona, hlorimurona, hlorsulfurona, cinosulfurona, ciklosulfamurona, etametsulfurona, etoksisulfurona, flazasulfurona, fiupirsulfurona, foramsulfurona, halosulfurona, imazosulfurona, jodosulfurona, mczosulfurona, metsulfurona, nikosulfurona, oksasulfurona, primisulfurona, prosulfurona, pirazosulfurona, rimsulfurona, suifometurona, sulfosulfurona, tifensulfurona, triasulfurona, tribenurona, trifloksisulfurona, triflusulfurona, tritosulfurona, imazametabenza, imazamoksa, imazapika, imazapira, imazakvina, imazetapira, kloransulama, diklosulama, florasulama, flumetsulama, metosulama, penoksulama, bispiribaka, piriminobaka, propoksikarbazona, flukarbazona, piribenzoksima, piriftalida i piritiobaka.

[0114]Izraz seme obuhvata seme i biljne propagule svih vrsta uključujući, ali ne ograničavajući se na pravo seme, delove semena, mladice, izdanke, lukovice, plod, tubere, zrna, reznice, pelcere i slično, i znači, u poželjnoj formi, pravo seme.

|0115]Izraz "koji je obložen i/ili sadrži" obično označava da je aktivni sastojak u najvećoj meri prisutan na površini propagacionog proizvoda u vreme primene. iako veći

ili manji deo sastojka može prodreti unutar propagacionog proizvoda, zavisno od metoda primene. Kada se propagacioni proizvod zasadi ili ponovo zasadi, on može apsorbovati aktivni sastojak.

[0116]Tretiranje suncokretovog semena nanošenjem AHAS-inhibirajućeg herbicida ili formulacije koja sadrži AHAS-inhibirajući herbicid, obavlja se prskanjem ili zaprašivanjem semena pre sejanja biljaka i pre nicanja biljaka. [01I7| Pri tretiranju semena suncokreta, odgovarajuće formulacije se primenjuju tako Što se seme tretira efikasnom količinom AHAS-inhibirajućeg herbicida ili formulacije koja sadrži AHAS-inhibirajući herbicid. U ovom tekstu, stope primene su obično od 0.1 g do 10 kg aktivnog sastojka ("a.i.") (ili mešavine a.i. ili formulacije) na 100 kg semena, poželjno od 1 g do 5 kg na 100 kg semena, posebno od 1 g do 2.5 kg na 100 kg semena.

[0118)Objavljuje se i sledeće:

1. Biljka suncokreta koja ima rezistenciju na imidazolinonski herbicid, sulfonilurea herbicid, triazolopirimiđinski herbicid, pirimidiniloksibenzoatni herbicid i njihove mešavine. pri čemu je sadržaj ulja u semenu iz pomenute biljke veći od 40%. 2. Biljka suncokreta koja ima rezistenciju na imidazolinonski herbicid, sulfonilurea herbicid, triazolopirimiđinski herbicid, pirimidiniloksibenzoatni herbicid i njihove mešavine, pri čemu je prinos semena iz pomenute biljke veći od jedne tone po hektaru. 3. Biljka suncokreta koja ima rezistenciju na imidazolinonski herbicid,

sulfonilurea herbicid, triazolopirimiđinski herbicid, pirimidiniloksibenzoatni herbicid i njihove mešavine. pri čemu pomenuta biljka suncokreta ima jednu glavu.

4. Biljka suncokreta prema formi 1 ili formi 3, pri čemu pomenuta biljka

suncokreta daje više od jedne tone semena po hektaru.

5. Biljka suncokreta prema formi 1 ili formi 2, pri čemu biljka suncokreta ima

jednu glavu.

6. Biljka suncokreta prema formi 2 ili formi 3, pri čemu je sadržaj ulja u semenu

iz pomenute biljke suncokreta veći od 40%.

7. Biljka suncokreta forme 1, pri čemu pomenuta biljka suncokreta daje više od jedne tone semena po hektaru i pri čemu pomenuta biljka ima jednu glavu. 8. Biljka suncokreta prema bilo kojoj od formi 1-7. pri čemu biljka suncokreta sadrži mutantni AHAS gen. pri čemu mutantni gen kodira mutaciju na amino-kiselini 574 ili njenom ekvivalentu, pri čemu je amino-kiselina 574 ili njen ekvivalent amino-kiselina različita od triptofana. 9. Biljka suncokreta iz forme 8, gde je amino-kiselina 574 ili njen ekvivalent leucin. 10. Biljka suncokreta prema bilo kojoj od formi 1-7, pomenuta biljka suncokreta imaAHASLIgen sa nukleotidnom sekvenem navedenom u SEQ ID NO: 1. 11. Biljka suncokreta prema bilo kojoj od formi 1 -7, pomenuta biljka suncokretaproizvodi AHASLIprotein koji ima aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 2.

12. Izolovana nukleinska kiselina koja uključuje SEQ ID NO: 1

13. Biljka suncokreta stabilno transformisana nukleinskom kiselinom koja ima sekvencu SEQ ID NO: 1. 14. Transgena biljka suncokreta, pri čemu pomenuta biljka sadrži transgen koji uključuje SEQ ID NO: 1. 15. Ekspresiona kaseta koja sadrži promotor aktivan u biljkama suncokreta, povezan sa izolovanom nukleinskom kiselinom koja kodira protein koji sadrži sekvencu kodiranu sa SEQ ID NO: 1. 16. Metod kontrole korova u blizini biljke suncokreta koji uključuje nanošenje herbicida na korov i biljku suncokreta, pri čemu se herbicid bira iz grupe koja se sastoji od imidazolinonskog herbicida, sulfonilurea herbicida, triazolopiirmidinskog herbicida, pirimidiniloksibenzoatnog herbicida i njihovih mešavina, pri čemu je biljka suncokreta biljka prema bilo kojoj od formi 1-9 ili 11-12. 17. Seme suncokreta, pri čemu biljka izrasla iz pomenutog semena ima rezistenciju na imidazolinonski herbicid, sulfonilurea herbicid, triazolopiirmiđinski herbicid, pirimidiniloksibenzoatni herbicid i njihove mešavine i pri Čemu je sadržaj ulja u semenu iz pomenute biljke veći od 40%. 18. Seme suncokreta, pri čemu biljka izrasla iz pomenutog semena ima rezistenciju na imidazolinonski herbicid, sulfonilurea herbicid, triazolopirimiđinski herbicid, pirimidiniloksibenzoatni herbicid i njihove mešavine i pri Čemu je prinos semena iz pomenute biljke veći od jedne tone po hektaru. 19. Seme suncokreta, pri čemu biljka izrasla iz pomenutog semena ima rezistenciju na imidazolinonski herbicid, sulfonilurea herbicid, triazolopirimiđinski herbicid, pirimidiniloksibenzoatni herbicid i njihove mešavine i pri Čemu pomenuta biljka suncokreta ima jednu glavu. 20. Biljka suncokreta prema formi 17 ili formi 19, pri čemu pomenuta biljka suncokreta izrasla iz pomenutog semena daje više od jedne tone semena po hektaru. 21. Biljka suncokreta prema formi 17 ili formi 18. pri čemu biljka suncokreta izrasla iz pomenutog semena ima jednu glavu. 22. Biljka suncokreta prema formi 18 ili formi 19, pri čemu je semenski sadržaj ulja pomenutog semena veći od 40%. 23. Biljka suncokreta iz forme 17. pri čemu pomenuta biljka suncokreta izrasla iz pomenutog semena daje više od jedne tone semena po hektaru i pri čemu pomenuta biljka ima jednu glavu. 24. Seme suncokreta prema bilo kojoj od formi 17-23, pomenuta biljka suncokreta imaAHASLIgen sa nukleotidnom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 1. 25. Biljka suncokreta prema bilo kojoj od formi 17-23, pomenuta biljka suncokreta proizvodiAHASLIprotein koji ima aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 2. 26. Seme suncokreta prema bilo kojoj od formi 17-23, gde pomenuto seme suncokreta sadrži mutantni AHAS gen, pri čemu pomenuti mutantni gen kodira mutaciju na amino-kiselini 574 ili njenom ekvivalentu, pri čemu amino-kiselina 574 ili njen ekvivalent nisu triptofan. 27. Seme suncokreta iz forme 26, gde je amino-kiselina 574 ili njen ekvivalent leucin. 28. Metod selektivne kontrole korova u polju koje sadrži zasejano seme ili biljke suncokreta, koji uključuje sadnju semena suncokreta prema bilo kojoj od formi 17-23 ili 26-27, i nanošenje dovoljne količine herbicida za kontrolu korova, gde se pomenuti herbicid bira iz grupe koja sadrži sulfonilureu, imidazolinon, pirimiđiniloksibenzoate, triazolopirimidin i njihove mešavine. 29. Metod poboljšanja tolerancije na herbicide kod biljke suncokreta koji uključuje: transformisanje ćelija suncokreta konstruktom koji sadrži protein-kodirajuću sekvencu nukleinske kiseline navedenu kao SEQ ID NO: 1, regenerisanje suncokretove ćelije u biljku suncokreta; i selektovanje fertilnih cvetajućih biljaka koje su vegetativno i reproduktivno rezistentne na efikasnu dozu herbicida, pri Čemu se herbicid bira iz grupe koja sadrži sulfonilureu, imidazolinon, pirimiđiniloksibenzoate, triazolopirimidin, i njihove mešavine. 30. Metod proizvodnje biljke suncokreta rezistentne na herbicide, koji uključuje: ukrštanje prve biljke suncokreta koja ima herbicid-rezistentnu AHAS aktivnost sa drugom biljkom suncokreta koja nema herbicid-rezistentnu AHAS aktivnost, pri čemu prva biljka suncokreta sadrži prorcin-kodirajuću nukleinsku kiselinu navedenu kao SEQ ID NO: 1. 31. Metod iz forme 30, koji uključuje još i selektovanje biljke-potomka koja ima herbicid-rezistentnu AHAS aktivnost. 32. Seme biljke suncokreta proizvedene metodom iz forme 30, pri čemu seme sadrži karakteristike rezistencije na herbicide prve biljke suncokreta. 33. Seme sorte suncokreta označene kao RW-B, reprezentativno seme pomenute sorte suncokreta deponovano je pod ATCC Accession No: PTA-9176. 34. Biljka suncokreta, ili njen deo, proizvedeni rastom iz semena iz forme 33.

35. Polen biljke iz forme 34.

36. Ovula biljke iz forme 34.

37. Biljka suncokreta, ili njen deo sa svim fiziološkim karakteristikama, karakteristikama rezistencije na herbicide i morfološkim karakteristikama biljke prema formi 34. 38. Seme biljke iz forme 37, gde biljke proizvedene rastenjem iz semena imaju sve fiziološke i morfološke karakteristike biljaka proizvedenih rastenjem iz semena deponovanog pod ATCC Accession No: PTA-9176.

39. Kultura tkiva ili regenerabilne ćelije biljke suncokreta prema formi 34.

40. Kultura tkiva prema formi 39, pri čemu ćelije tkivne kulture uključuju list, polen, embrion, kotiledon, hipokotil, meristemske ćelije, koren, vrh korena, anteni, cvet, seme, stabljiku, ovule, izdanak, stabljiku, drške, omotač semena ili mahunu.

41. Biljka suncokreta nastala iz tkivne kulture iz forme 40.

42. Biljka suncokreta nastala iz tkivne kulture iz forme 40, pri čemu je regenerisana biljka sposobna da eksprimira sve morfološke i fiziološke karakteristike sorte suncokreta RW-B, reprezentativno seme sorte suncokreta RW-B deponovano je pod ATCC Accession No: PTA-9176. 43. Metod proizvodnje semena suncokreta koji uključuje ukrštanje prve roditeljske biljke suncokreta sa drugom roditeljskom biljkom suncokreta i sakupljanje dobijene prve generacije suncokretovog semena. pri čemu je prva ili druga biljka suncokreta biljka suncokreta prema formi 34 ili biljka suncokreta sa svim fiziološkim i morfološkim karakteristikama biljke prema formi 37. 44. Metod proizvodnje RW-B-izvedene biljke suncokreta, koji uključuje: ukrštanje linije suncokreta RW-B, reprezentativno seme sorte suncokreta RW-B deponovano je pod ATCC Accession No: PTA-9176, sa drugom biljkom suncokreta da bi se dobilo seme suncokreta potomka; i rast potomstva da bi se dobila RW-B-izvedena biljka suncokreta.

45. Tkivna kultura regenerabilnih ćelija biljke suncokreta prema formi 37.

46. Tkivna kultura prema formi 45, gde su ćelije tkivne kulture iz lista, polena, embriona, kotiledona, hipokotila. meristemskih ćelija, korena. vrha korena.

antere, cveta, semena, stabljike, ovula. izdanaka, stabljika, drški, omotača semena ili mahune.

47. Biljka suncokreta nastala iz kulture tkiva iz forme 45.

48. Biljka suncokreta nastala iz kulture tkiva iz forme 45, pri čemu je

regenerisana biljka sposobna da eksprimira sve morfološke i fiziološke karakteristike sorte suncokreta RW-B, reprezentativno seme sorte suncokreta RW-B deponovano je pod ATCC Accession No: PTA-9176.

[0119|Sledeći primeri ponuđeni su kao ilustracija i nisu ograničavajući.

Identifikacija rezistentnih biljaka

|0120]300 semena populacije divljeg suncokreta za koji se zna daje tolerantan na IMI, zaseje se u uslovima staklene bašte u Nidera Experimental Station u Venado Tuerto, Santa Fe, Argentina, zajedno sa kontrolnim linijama HA89, B770 (Susceptible, osetljiva - "S"), BTI-M1 i RHA426 (Resistant, rezistentna - "R"). Na stupnju V4 sve biljke se prskaju imazapirom pri stopi od 80 g a.i./ha. Dvc nedelje posle tretmana, sve biljke se vizuelno evaluiraju u pogledu oštećenja. S linije HA89 i B770 bile su ubijene tretmanom. R linija RHA426 pokazala je znake hloroze, a R linija BTI-M1 nije pokazala nikakve znake oštećenja. Ukupno, 159 bljaka divlje populacije opstalo je posle tretmana herbicidom, a 129 ih je ubijeno (kategorisane kao S). Pored toga, 18 od 159 biljaka koje su preživele tretman herbicidom nije pokazalo znake oštećenja herbicidom, slično kao mutantna R linija BTI-MI, i one su kategorisane kao R.

Genetika rezistencije

|0121|Jedna R biljka (RW-73) upotrebljena je kao muška u ukrštanjima sa kultivisanim osetljivim linijama HA89 i B770. Deset do 20 Fl biljaka iz svakog ukrštanja prskano je imazapirom pri stopi od 80 g a.i./ha, uz korišćenje B770 (S) i BTI-MI (R) kao kontrole. Nijedna od Fl biljaka nije pokazala simptome oštećenja herbicidom, što je bilo slično BTI-MI biljkama. Međutim, tretman imazapirom ubio je B770 biljke.

[0122]Jedna F| biljka iz ukrštanja HA89/RVV-73 povratno je ukrštena sa osetljivim roditeljem. Isto tako, jedna biljka iz ukrštanja B770/RVV-73 povratno je ukrštena sa B770. F2seme je dobij eno polinacijom Fl biljaka međusobno.

[0123] Dobijeno BC1F1i F2seme. zasejano je pod uslovima staklene bašte zajedno sa B770 i BTI-MI, korišćenim kao osetljiva, odnosno rezistentna kontrola. Na stupnju V3-V4 sve biljke su prskane imazapirom pri stopi od 80 g a.i./ha. Biljke su ocenjivane 14 dana posle tretmana kao R, S ili I (intermedijarno). Biljke su kategorisane kao R ako nisu pokazivale oštećenje herbicidom, S ako su umrle ili I ako su pokazale smanjenu visinu ili hlorozu. Rezultati nasleđivanja rezistencije na imidazolinon u RW-73 pokazani su u Tabeli 1 na SL. 3. [0124|Preciznije, Tabela 1 pokazuje odgovor biljaka suncokreta [rezistentna (R), intermedijama (I), osetljiva (S)] na imazapir nanet pri stopi od 80 g a.i.ha"1 u Fh Ft i BCiFipopulacijama nastalim ukrštanjem rezistentne linije, RVV-73, i jedne od dve osetljive linije, B770 i HA89, i Hi4fvadrat testove modela jednog lokusa za kontrolu rezistencije.

[0125]Ft populacije dobijene ukrštanjem osetljiva x rezistentna, dobro se uklapaju u 1:2:1 R:I:S odnos, što ukazuje na segregaciju jednog gena za rezistenciju na imazapir. Da bi se potvrdili rezultati iz Fi populacija, F| biljke testno su ukrštane sa osetljivim roditeljima i dobijeno potomstvo je procenjivano u pogledu reakcije na imazapir. BCiFipopulacije dobro se uklapaju u 1:1 I:S odnos, čime je potvrđena hipoteza jednog lokusa (Tabela 1).

[0126]Rezultati genetičke studije ukazali su na to da se rezistencija u RW-73 nasleđuje kao delimično dominantna osobina određena jednim kodirajućim genom smeštenim u nukleusu. Ovaj obrazac nasleđivanja konzistentan je sa drugim nalazima koji ukazuju na genetičku kontrolu rezistencije na AHAS-inhibitorne herbicide.

Razvijanjelinijesuncokreta koja jehomozigotnaza karakteristiku rezistencije naherbicideRW-73

[0127]Heterogeni i heterozigotni uslovi populacije divljeg suncokreta analiziranog gore, isključuju njegovo korišćenje za određivanje relativnog nivoa rezistencije u odnosu na kultivisane linije koje nose osobine rezistencije na herbicide. Korišćenjem marker-asistiranog povratnog ukrštanja. razvijena je rezistentna linija koja je vrlo slična sa B770, označena kao RW-B. RW-B je homozigotna za gen rezistencije jer njeno potomstvo dobijeno samoukrštanjem nije pokazalo segregaciju osetljivosti posle primene imazapira.

Rezistencija RW-B na različite AHAS-inhibitorne herbicide

|0128)Linije suncokreta: sledeće genetičke linije suncokreta korišćene su za određivanje AHAS rezistencije: dve S linije ("B770" i "HA89"), dve linije rezistentne na SU izvedene iz populacije SU RES (SuBL i SuRL), dve linije rezistentne na IMI izvedene iz populacije IMISUN ("Rha 426" i "B770imi") i linija "RW-B". HA89 i Rha426 su javne inbred linije koje plasira USDA. SURES i IMISUN su uzgajane populacije koje plasira USDA. B770 je linija u vlasništvu Nidera. B770imi je vlasnička linija sa B770 osnovom, koja nosi rezistentni gen/m/7.RVV-B dobijena je kako je gore opisano.

[0129]Metod: Osam semena od svake od sedam linija zasadi se u posude dimenzija 20 x 20 x 30 cm. Posle pojave biljaka, mladice se ručno razrede, ostavljajući 4 mladice po posudi. Pet posuda od svake linije tretira se različitim herbicidom iii dozom. U svaki eksperiment uključena je po jedna netretirana kontrolna posuda za svaku liniju. Biljke su rasle u stakleniku, pod uslovima prirodnog osvetljenja dopunjenog halogenim lampama od 400 W, da bi se obezbedila 14-časovna dužina dana. Dnevne/noćne temperature bile su 25 odnosno 20°C. Na stupnju razvoja V4 (Schneiter and Miller 1981), biljke su prskane sa tri SU herbicida (hlorsulfuron, nikosulfuron i foramsulfuron), tri IMI herbicida (imazamoks, imazapir i imazapik), POB herbicidom (bispiribak-Na) i TP herbicidom (kloransulam-metil). Četrnaest dana posle tretmana procenjivan je fenotip biljaka, korišćenjem indeksa fitotoksičnosti (phytotoxicity index, PI). PI je fenotipska skala od 0 do 9, na osnovu koje je svaka posuda procenjena vizuelno. Biljke bez simptoma ocenjene su kao "0", rastući nivoi zaostajanja u rastu i pojave žutila u odnosu na netretirane kontrolne biljke označavani su sa "1" do "4", rastući nivoi abnormalnosti listova i lisna nekroza označavani su sa "5" do "8" i mrtve biljke sa potpunom nekrozom apeksa označavane su kao "9". PI podaci za svaki eksperiment analizirani su ANOVA testom, srednje vrednosti su upoređivane LSD testom. |0130j Rezultati su prikazani u Tabeli 2 na SL. 4, koja pokazuje indeks fitotoksičnosti za sedam linija suncokreta prskanih različitim AHAS-inhibirajućim herbicidima; Tabela 2. Odgovor linija suncokreta (B770, HA89, SuBL, SuRL, Rha426, B770imi i RVV-B) na četiri različite familije AHAS-inhibirajućih herbicida. Podaci predstavljaju MS između zbira kvadrata srednjih vrednosti za linije,<***>P< 0.001, LSD vrednost najmanje značajne razlike. Srednje vrednosti označene istim slovom nisu statistički značajno različite (P<0.01). Oštećenje je mereno korišćenjem indeksa fitotoksičnosti (PI). [01311Svi herbicidi ubijaju S linije HA89 i B770. SU-rczistentnc linije SuBL i SuRL bile su rezistentne na sva tri upotrebljena SU, ali su ih svi drugi herbicidi ubijali. IMI-rezistentne linije Rha426 i B770imi bile su umereno rezistentne na tri IMI i visoko osetljive na SU, POB i TP. Što je značajno, RW-B, pokazuje visoke nivoe rezistencije na sve četiri familije herbicida. Iznenađujuće, RW-B linija pokazala je isti nivo rezistencije na SU kao SU-rezistentne linije SuBL i SuRL i bolji nivo rezistencije na IMI nego IMI-rezistentne linije Rha426 i B770imi. Pored toga, u sledećem iznenađujućem rezultatu, RW-B pokazuje veći nivo rezistencije na POB i TP. Nijedna druga linija nije pokazala ovaj tip rezistencije.

Test alelizma

[0132]RW-B biljke su ukrštene sa RHA426 da bi se odredilo da lije gen za rezistenciju u RW-B alelan saImrI,mutacijom prethodno opisanom u imidazolinon-rezistentnim inbred linijama. U ovom ukrštanju, Fihibridne biljke su samooprašene i povratno ukrštene sa RHA426 da se dobiju F2i BC|Fjgeneracija, respektivno. Biljke roditelja i Fi, Fti BCiFitestirane su sa 160 g a.i. ha"<1>i 320 g a.i. ha"<1>imazapira, na stupnju V2-V4. Posle izazivanja, biljke su ocenjivane kako je gore opisano. Kada je potomstvo testirano nižom stopom herbicida, nisu zapažene osetljive biljke u F2i BCiF| populacijama nastalim iz ovog ukrštanja, što je ukazivalo na to da su geni rezistencije u RW-B i RHA426 aleli istog lokusa. Ovi rezultati prikazani su u Tabeli 3, na SL. 5. Preciznije, Tabela 3 pokazuje odgovor biljaka suncokreta (tj., rezistentnih (R) i osetljivih (S)) na imazapir primenjen pri stopama od 80 g a.i.ha"<1>i 320 g a.i.ha"<1>u F|, Ft i BC|F| generacijama nastalim iz ukrštanja RVV-B i inbred linije koja nosi gen za rezistenciju na imidazolinon Imrl, RHA 426. |0133) S druge strane, kada su F2i BCjF| populacije procenjivane posle nanošenja herbicida pri višoj stopi (320 g a.i. ha"<1>), mogla je da se zapazi segregacija osetljivosti. Detektovane su samo dve fenotipske klase, rezistentna klasa sastavljena od biljaka koje su bile bez znakova oštećenja ili samo sa blagim simptomima, i osetljivi fenotip koji je bio ubijen pri ovoj dozi na isti način kao kontrolna liija RHA426. Zapaženi odnosi segeregacije kod 508 Ft pregledanih biljaka nisu bili značajno različiti od 3:1 segregacionog odnosa (vidi Tabelu 3). Da bi se ovi rezultati potvrdili, F| biljke su povratno ukrštane sa RHA426 i dobijene BC|Fibiljke su procenjivane pri 320 g a.i. ha"<1>imazapira. Zapaženi segregacioni odnosi dobro su se uklapali u 1:1 R:S odnos, Čime je potvrđeno da je gen za rezistenciju u RW-B pokazao potpunu dominancu nad rezistentnim genom u RHA426, i da su oba gena za rezistenciju aleli istog lokusa,

AHASL

AHAS1haplotipska kosegregacija sa rezistencijom na herbicide

[0134] Materijali i metodi: DNK se izoluje iz mladih listova linija B770, RVV-B i RHA426 kao i iz pojedinačnih F| i F2biljaka iz ukrštanja RVV-B/RHA426, korišćenjem metoda po Dellaporta (1983).AHAS1genski fragmenti su PCR amplifikovani korišćenjem prajmera p-AHAS18 i p-AHAS 19 (Kolkman et al., 2004). PCR proizvodi su amplifikovani u 15 u.l-skoj reakciji koja je sadržala 1 U Taq DNK polimeraze (Biotools), 70 ng genomske suncokretove DNK, 25 ug goveđeg serum albumina (BSA), finalnu koncentraciju od 100 uM svakog od dNTP, 0.25 uM svakog prajmera, 90 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM (NH4)2S04i 2.5 mM MgCl2. PCR program se sastojao od inicijalnog koraka denaturacije na 94°C, 2 min, što je praćeno sa 40 ciklusa od 30 s, na 94°C, 30 s na 56°C i 30 s na 72°C, praćeno finalnim korakom elongacije na 72°C, 10 min. Proizvodi amplifikacije (3 {.il/traci) razdvojeni su na standardnom gelu za sekvencioniranje koji sadrži 6% poliakrilamida, 8 M ureu, i IX TBE, na 60 W konstantne snage, 2 do 3 h, i detektovani su bojenjem srebro-nitratom (Silver Sequence™ Promega Biotech. USA). Veličina svakog SSR alela procenjivana je korišćenjem markera molekulske težine i standardne reakcije sekvencioniranja u susednim trakama gela.

(0135)Rezultati:AIIAS1gen u suncokretu prikazuje SSR (simple sequence repeat, ponavljanje jednostavne sekvence) polimorfizam koji omogućava diskriminaciju linija koje noseItnrJalel iz bilo kojeg genotipa suncokreta (Kolkman et al., 2004). PCRamplifikacija AHAS1genskog fragmenta koji sadrži ovaj SSR, korišćenjem prajmera p-AHAS18 i p-AHAS 19, daje proizvod od 321 bp za RW-B i fragment od 312 bp za RHA426. Ovaj dužinski varijantni polimorfizam deteklovan u RW-B i RHA426 korišćenje za ispitivanje segregacije u F2i BC|F| populacijama izvedenim iz ukrštanja obeju linija. Sto jedanaest biljaka iz F2populacije i 126 biljaka iz BC|F[populacije odabrano je nasumično, izolovani su uzorci DNK, izvršeno je izazivanje nanošenjem imazapira pri stopi od 320 g a.i. ha"<1>i obavljena je genotipizacija korišćenjem ovog markera. U F2populaciji, 30 biljaka je ubijeno herbicidom (S), a 81 nije pokazala simptome ili je blago oštećena (R). Ovi podaci prikazani su u Tabeli 4. Preciznije, Tabela 4 pokazuje reakciju biljaka suncokreta (tj., rezistentnih (R) i osetljivih (S)) na imazapir primenjen pri stopi od 320 g a.i. ha ' i AHAS1 haplotipsku segregaciju (A = RW-B haplotip, B = RHA426 haplotip) u F2i BC|F| populaciji izvedenoj iz ukrštanja RW-B / RHA426.

[0136]Dobijeni segregacioni odnos za rezistenciju nije značajno različit od očekivanog segregacionog odnosa za kompletno dominantni faktor segregiran u F2(3R:1S). Dobijena segregacija zaAHAS!SSR marker (26 A/A: 55 A/B: 30 B/B) poklapa se sa očekivanim odnosom segregacije za kođominantni marker segregiran u F2(1:2:1). Sve osetljive biljke genotipizirane zaAHAS1SSR bile su homozigotne za RHA426 haplotip (B/B), dok su R-biljke bile heterozigotne (A/B) ili homozigotne za RW-B haplotip (A/A) (vidi Tabelu 4). Kosegregacija herbicid-rezistentnih fenotipova iAHAS1haplotipova dalje procenjivana je na 126 jedinki BC|F]potomstva segregiranom na rezistenciju. Zapaženi segregacioni odnosi za rezistenciju uklapaju se u odnos 1:1, kako se očekuje za segregaciju jednog lokusa u BC|F|.AHAS1SSR haplotipovi kompletno kosegregiraju za reakciju herbicida, 64 A/B: 62 BB. Osetljivo potomstvo bilo je homozigotno za RHA426 haplotip (B/B), dok je rezistentno potomstvo bilo heterozigotno za RHA426 i RW-B haplotipove (A/B). Ovi rezultati potvrđuju daje gen za rezistenciju u RW-B različit od gena za rezistenciju u RHA426 i da su oba gena alelske varijante lokusaAHASL

PCR amplifikacija i sekvencioniranje suncokretovog AHAS1genaiz RW-B

|0137|Genomska DNK ekstrahuje se iz tkiva lista suncokreta korišćenjem Qiagen-ovog DNeasv 96 Plant kita (kataloŠki br. 69181). AHAS1 gen se PCR-amplifikuje u tri fragmenta i direktno sekvencionira pomoću Macrogcn USA. PCR amplifikacija se obavi Qiagen-ovom Hotstart Taq DNK polimcrazom i pridruženim reagcnsima (kataloŠki br. 203205). PCR prajmeri za tri fragmenta su sledeći: AHASIF1 (forvvard-prajmer na baznom paru 1-19 suncokretove javne sekvence AY541451) 5"ATGGCGGCTCCTCCCAACC3\ AHAS1R1 (reverse-prajmer na baznom paru 757-777 suncokretove javne sekvence AY541451) 5TGGTAACCTCATCGGTTCATC3". AHAS1F2 (fonvard-prajmer na baznom paru 757-777 suncokretove javne sekvence AY541451) 5 'GATGA ACCGATGAGGTTACCG3'. AUAS 1 R2 (reverse-prajmer na baznom paru 1794-1814 suncokretove javne sekvence AY54145i) 5'TCCGCCTTTTGGGTCACTCGA3'. AHAS1F3 (fonvard-prajmer na baznom paru 1248-1269 suncokretove javne sekvence AY541451) 5<?>GGTGACTAATCTTGATTTTTCG3" i AHAS1R3 (reverse-prajmer na baznom paru 1949-1968 suncokretove javne sekvence AY541451)

5' TCAATATTTCGTTC TGCCAT3'.

[0138]Tri PCR fragmenta pokrivaju sva tri mutaciona mesta za koja se zna da daju rezistenciju na IMI herbicide. Obavljeno je poravnavanje nukleotida i dobijeni hromatogrami su ispitani na polimorfizam između osetljive linije B770 i rezistentne linije RVV-B.

Rezultati sekvencioniranja suncokretovogAHASLIgena

[0139]PCR proizvodi su sekvencionirani da se proizveduAHASLIsekvence za RW-B i B770 linije suncokreta. Poravnavanje ovih nukleotidnih sekvenci i nukleotidnih sekvenci AHAS gena Xanthium sp. (Genbank Accession No U16280) prikazano je na SL. 1. (0140]Preciznije, SL. 1 prikazuje parcijalno poravnavanje DNK sekvence kodirajućeg regionaAHASLIgena iz HA89 (GenBank acc. no. AY541451) (SEO ID NO: 3), B770 linije (SEQ ID NO: 4), rezistentne linije RW-B (SEQ ID NO: 5),Xanthhtm sp.ALS gens (GenBank acc. no. U16280) (SEQ ID NO: 6) iArabidopsis thalianaAHAS gena (GenBank acc. no. AY124092) (SEQ ID NO: 7). Asterisk pokazuje jednu mutaciju nađenu u RW-B, promena ove baze odgovorna je za supstituciju Trp u Lcu na aminokiselinskoj poziciji 574 (bazirano na sekvenciArabidopsis thaliana).Pozicije u nuklcotidnoj sekvenci naznačene su strelicama i numerisane prema sekvenciA.

thaliana.

[0141]Poravnavanje je pokazalo daAHASLIgen iz RVV-B ima tranziciju G u T, uodnosu na AHASLIB770.

[0142]Poravnavanje aminokiselinskih sekvenci pretpostavljenih izAHASLInukleotidnih sekvenci RW-B, B770, i Xanthium sp. dato je na SL. 2.

(01431Preciznije, SL. 2 prikazuje parcijalno poravnavanje aminokiselinske sekvenceAHASLIproteina iz HA89 (GenBank acc. no. AY541451) (SEQ ID NO: 8), B770 linije (SEQ ID NO: 9), rezistentne linije RW-B (SEQ ID NO: 10),Xanthium sp.ALS gena (GenBank acc. no. U 16280) (SEQ ID NO: 11) iArabidopsis thalianaAHAS gena (GenBank acc. no. AY124092) (SEQ ID NO: 12). Asterisk pokazuje aminokisclinsku supstituciju u kodonu 574 (bazirano na sekvenciArabidopsis thaliana).

|0144]U odnosu naAHASLIaminokiselinsku sekvencu B770,AHASLIaminokiselinska sekvenca RW-B ima supstituciju triptofan u leucin, na aminokiselinskoj poziciji 574 u aminokiselinskoj sekvenci pune dužine kodiranoj AHASL nukleotidnom sekvencomkrabidopsis thaliana.Zbog toga je ovaj novi alelAhaslI lokusanazvan u ovom tekstu W574L.

Upoređivanje agronomskih karakteristika (prinos zrnaisadržajulja) hibridasuncokreta,koji nosi W574L alel uodnosu na konvencionalnihibrid (divlji tip) ionekojinose A205Valel(IMISUN osobina).

[0145]Cilj: Ovaj eksperiment sproveden je da bi se kvantifikovale i uporedile agronomske osobine hibrida koji nosi W574L alel sa konvencionalnim (divlji tip) i imisun (alel A205V) hibridima.

[0146] Materijali: Linija RVV-B konvertovana je u mušku sterilnu liniju, ponavljanim povratnim ukrštanjem sa citoplazmičkom muškom sterilnom linijom (cms B770). Posle 4 povratna ukrštanja đobijena sterilna linija nazvana je "cms RW-B".

[0147]Linija RW-B korišćena je i kao izvor rezistencije na herbicide, za konvertovanje dve različite konvencionalne (divlji tip) uspostavijujuće linije: R20 i R54. Dobijene skoro izogene linije označene su kao R20-574 i R54-574.

[0148]F| hibridi konvencionalne, IMISUN i RW-B izvedene linije dobijeni su u uslovima gajenja u polju. Pedigre i mutacioni događaji za njih prikazani su u sledećoj Tabeli.

Tabela5.Hibrid 4 (cms B770xR54)ihibrid 6(cmsB770xIR152) su dva registrovana komercijalna hibrida poznata kao "Paraiso33"odnosno "Paraiso 103CL".

[0149]Metodi: Seme jc zasejano u poljskim uslovima (Venado Tuerto, Santa Fe, Argentina), u potpuno nasumičnom blok-dizajnu, sa četiri ponavljanja. Svaki plot (deo zemljišta) sastojao se od tri reda duga 6 metara, sa razmacima od 0.7 m. Semena su bila razmaknuta 0.30 m u redu.

[0150]Za svaki plot praćene su sledeće varijable: dani do cvetanja, visina u trenutku cvetanja, prinos (kg/ha) i procenat ulja u zrnu (%). Anova test urađen je za ove varijable i srednje vrednosti različitih događaja i hibrida upoređivane su Tuckey-jevim testom.

[0151]Rezultati: Prosečne vrednosti za svaki događaj za 4 praćene varijable date su u Tabeli 6. ICako što se može videti. tri događaja imala su sličan prosečan prinos. Anaiiza je detektovala razlike za sadržaj ulja u semenu između događaja, pošto su hibridi sa A205V alelom imali manji sadržaj ulja nego druga dva tipa hibrida. Dani do cvetanja i visina biljke takođe su se razlikovali između događaja, pošto su hibridi koji su nosili VV574L alel bili malo manji i ranije su cvetali nego druga dva tipa hibrida, U zaključku, dva hibrida koja su nosila alel W574L pokazala su isti prinos i uporedivi sadržaj ulja u semenu u odnosu na konvencionalni hibrid (divlji tip) i IMISUN hibrid, koji uključuju komercijalne hibridne varijetete. |0152|Srednje vrednosti svakog hibrida za svaku praćenu varijablu i rezultati analize varijanse dati su u Tabeli 7.

Tabela 6. Prosečne vrednostizavisinu, dane do cvetanja(daysto flowering, DTF),

prinos i sadržaj ulja za 3 različita genotipa (mutacioni događaji) zaAHASLI lokus.

Prosečna vrednost za svaki genotip ili mutacioni događaj jcsrednjavrednostdva

različita hibrida.

Tabela 7. Prosečne vrednosti za visinu, dane do cvetanja (DTF), prinos i sadržaj ulja za 6 hibrida suncokreta koji nose tri različita genotipa (mutacioni događaji) za

AHASLI lokus.

Tolerancija linije RW-B na 4 različite mešavine dva AHAS-inhibitorna herbicida.

[01531C' lj: uporediti osobine (procenjivano indeksom fitotoksičnosti) linije koja nosi W574L alel (RW-B) i linija koje nose P197L (SURES), A205V (IMISUN), i alel divljeg tipa (konvencionalni).

[0154|Materijali: Korišćene su sledeće inbred linije suncokreta: dve linije osetljive na imidazolinon ("B770" i "HA89"), dve linije rezistentne na SU herbicide izvedene iz SURES populacije ("SuBL" i "SuRL"), dve linije rezistentne na IMI herbicide izvedene iz IMISUN ("RHA426" i "B770imi") i linija "RW-B", koja nosi alel W574L. HA89 i RHA426 su javne inbred linije koje plasira USDA. B770 i B770imi su linije u vlasništvu Nidera S.A., dok B770imi ima B770-gcnetičku osnovu i nosi gen rezistencije

hmrl(=A205V alel) za rezistenciju na imidazolinone. RVV-B je dobijena kako je gore opisano.

|0155]Metod: Osam semena iz svake od sedam linija zasadi se u posude dimenzija 20 x 20 x 30 cm. Posle pojave biljaka, mladice se ručno razrede, ostavljajući 4 mladice po posudi. Pet posuda od svake linije tretira se različitom mešavinom herbicida. U svaki eksperiment uključena jc po jedna netrctirana kontrolna posuda od svake linije. Biljke su rasle u stakleniku pod uslovima prirodnog osvetljenja dopunjenog halogenim lampama od 400 W da bi se obezbedila 14-časovna dužina dana. Dnevne/noćne temperature bile su 25 odnosno 20°C. Na razvojnom stupnju V4 (Schneiter and Miller 1981) biljke su prskane sa četiri različite mešavine koje su sadržale dva različita AHAS-inhibirajuća herbicida, sulfonuilureu (metsulfuron) i imidazolinon (imazapir). Koncentracije herbicida u svakoj od četiri herbicidne mešavine bile su sledeće; mešavina A 20 g a.i./ha imazapira i 1.25 g a.i./ha metsulfurona, mešavina B 40 g a.i./ha imazapira i 2.5 g a.i./ha metsulfurona, mešavina C 80 g a.i./ha imazapira i 5 g a.i./ha metsulfurona i mešavina D 160 g a.i./ha imazapira i 10 g a.i./ha metsulfurona.

[0156]Četrnaest dana posle tretmana procenjivan je fenotip biljaka korišćenjem indeksa fitotoksičnosti (PI). PI je fenotipska skala od 0 do 9 na osnovu koje je svaka posuda procenjivana vizuelno. Biljke bez simptoma ocenjense su kao "0", rastući nivoi zaostajanja u rastu i žutila u poredenju sa netretiranim kontrolnim biljkama označavani su sa "1" do "4", rastući nivoi abnormalnosti listova i lisna nekroza označavani su sa "5" do "8" i mrtve biljke sa potpunom nekrozom apeksa označavane su sa "9." PI podaci za svaki eksperiment analizirani su ANOVA testom, srednje vrednosti su upoređivane Tuckey-vim testom. [0157|Rezultati su prikazani u Tabeli 8. Linije HA89 i B770 bile su ubijene posle primene svih herbicidnih mešavina. SU-rezistentne linije SuBL i SuRL pokazale su izvestan stepen tolerancije na mešavinu A i mešavinu B, ali su dostigle visok nivo lisne nekroze i zaostajanje u rastu sa porastom doze herbicida, na primer posle primene mešavine C. Sve biljke bile su ubijene mešavinom D, koja je imala najviše doze aktivnih sastojaka. IMl-rezistentne linije RHA426 i B770imi bile su umereno rezistentne na mešavinu A. mešavinu B i mešavinu C, iako su pokazivale porast oštećenja sa povećanjem doze herbicida. Kada je mešavina D naneta na ove linije, sve biljke su ubijene. Što je značajno, RVV-B pokazuje toleranciju na sve testne mešavine. čak i na mešavinu sa najvišom koncentracijom aktivnih sastojaka. |0158] Zaključak: RW-B pokazuje ne samo visok nivo tolerancije na svaki od AHAS-inhibirajućih herbicida testiranih pojedinačno nego i najviši nivo tolerancije na kombinaciju herbicida testiranih istovremeno u mešavini.

Tabela 8. Prosečan indeks fitotoksičnosti 7 linija suncokreta koje nose različite mutacione događaje na lokusuAHASLIkada se izazovu sa 4 mešavine dva AHAS-inhibitorna herbicida.

Odgovor linija suncokreta homozigotnih za W574L alel u poredenju sa linijama

homozigotnim za A205V i P197L alele i osetljivim haplotipom, na imazapir na

nivou celc biljke.

[0159]Cilj: Ovaj eksperiment je sproveden da bi se kvantifikovala i uporedila osctljivost na imazapir linija suncokreta, koje nose homozigotni W574L alel u poredenju sa linijama homozigotnim za P197L i A205V alele na nivou celc biljke.

Materijali:

[0160]

[01611Semena su zasejana u Petrijeve posude i posle klijanja mladice su transplantirane u posude dijametra 10 cm, sa medijumom za presađivanje, koji se sastoji od jednakih količina vermikulita, zemlje i peska. Biljke su rasle u stakleniku pod prirodnim osvetljenjem dopunjenim natrijum-halidnim lampama od 400 W da bi se obczbedila 16-časovna dužina dana. Dnevne/noćne temperature bile su 25 odnosno 20°C. Na stupnju razvoja V2-V4 (Schneiter and Miller 1981), po 10 biljaka od svakog genotipa nasumično je određeno za jedan od tretmana koji su se sastojali od osam doza imazapira (0, 40, 80, 160, 320, 480, 640 i 800 g a.i./ha, bez tretmana, 0.5x, lx, 2x, 4x, 6x, 8x i 10x respektivno), i određena im je biomasa u nultom vremenu. Eksperiment je organizovan kao nasumični blok-dizajn sa punim faktorijalnim (linija suncokreta x tretman) aranžmanom tretmana i 10 replika.

[0162]Na dan nanošenja herbicida, po deset biljka od svakog genotipa je isečeno na kotiledonskom čvoru i osušeno na 60°C, 48 h, za određivanje težine u nultom vremenu.

[0163]Preostale biljke održavane su još 14 dana posle tretmana imazapirom (DAT) i određivane su im visina, indeks fitotoksičnosti (PI) i biomasa nadzemnog dela. Visina je određivana kao distanca između kotiledonskog čvora i vrha svake biljke. Podaci dobijeni za masu nadzemnog dela biljke konvertovani su u akumulaciju biomase posle nanošenja, oduzimanjem odgovarajuće prosečne biomase u nultom trenutku za svaki uzorak. Podaci za suvu biomasu konvertovani su u procente netretiranih kontrolnih biljaka unutar svake linije da bi se omogućilo direktno poređenje medu grupama. PI je skala od 0 do 9 za procenjivanje fenotipa na osnovu koje je svaka posuda procenjivana vizuelno. Biljke bez simptoma ocenjene su sa "0", rastući nivoi zaostajanja u rastu i hloroze u odnosu na netretirane kontrolne biljke označavani su sa "1" do "4", rastući nivoi abnormalnosti listova i lisna nekroza označavani su sa "5" do "8" i mrtve biljke sa potpunom nektozom apeksa označavane su sa "9."

[0164|Rezultati:

Visina. Posle primene imidazolinona visina biljke bila je izrazito smanjena kod osetljivih (B770) i SU tolerantnih (SuBL) linija. U stvari, čak i pri nižim stopama prskanja herbicidom (0.5x), visina je smanjena sa 100% za netretirane kontrolne biljke na 35. 0% odnosno 42.7% za osetljive i SU tolerantne linije. IMI tolerantna linija (B770IMI) pokazala je značajno smanjenje visine tek posle nanošenja herbicida pri stopi od 2x, i zatim, sa porastom stope herbicida smanjenje je raslo, dostižući nivo osetljive linije pri 10x (32.8%).

[0165]Nasuprot tome, linija suncokreta RW-B ispoljila je manje smanjenje kada je izlagana rastućim dozama imidazolinona. Ovo smanjenje visine dostiglo je samo 75% od visine netretiranih kontrolnih biljaka pri stopama nanošenja herbicida od 4x do 10x.

(Tabela 10 i SL. 9).

Tabela 10. Smanjenje visine (kao procenat netretiranih kontrolnih biljaka) za 4

linije koje nose različite mutantne aleie naAHASLIlokusu suncokreta kadase

testiraju rastućim stopama imazapira.

Indeks fitotoksičnosti

[0166] Četiri testirana mutanta pokazala su velike razlike u simptomima posle nanošenja rastućih stopa imazapira. Sa porastom stopa herbicida, linija suncokreta RW-B pokazala je samo blago smanjenje veličine lista i bleđe zelenu boju u poredenju sa kontrolnim biljkama (Tabela 11). Nasuprot tome, iako biljke koje su nosile A205V alel (B770IMI) nisu pokazale oštećenje pri stopi od 0.5x. pokazale su povećan nivo oštećenja (hloroza, deformacija lista i lisna nekroza) kako su doze imazapira povećavane od 1 x do 10x. SU-tolerantne i osetljive linije pokazale su gotovo identično ponašanje: potpuna osetljivost pri stopama nanošenja herbicida od 0.5x do 10x.

Suva težina biomase nadzemnog dela biljke

|01671Krive dozno-zavisnog odgovora za suvu težinu mutanata W574L, P197L i 205V prikazane su na SI. 11. Suva težina biomase događaja W574L u homozigotnom stanju smanjena je u odnosu na netretirane kontrolne biljke samo posle primene herbicida pri stopama od 6x, 8x i 10x. Suva težina RW-B biljaka pri stopi od 10x bila je 78% od netretiranih kontrola. U isto vreme. suva težina svih drugih mutanata značajno se razlikovala od ovih linije RW-B, pri svakoj od testiranih doza (Tabela 12).

Tabela 12. Suva težina nadzemne biomase (kao procenat netretiranih kontrolnih

biljaka) za 4 linije suncokreta koje nose različite mutantne alele naAHASLI

lokusu suncokreta kada se testiraju rastućim stopama imazapira.

[0168]Zaključak: linija RW-B, koja nosi mutantni događaj W574L u homozigotnom stanju naAHASLIlokusu suncokreta, pokazuje viši nivo tolerancije na sve testirane doze imazapira nego SU-tolerantne i već poznate I MI-tolerantne linije.

Odgovor W574L mutantnog alela u poredenju sa A205ViP197L mutacijama i

osetljivim haplotipom na metsulfuron, na nivou cele biljke

[0169]Cilj: Ovaj eksperiment je sproveden da bi se kvantifikovala i uporedila osetljivost na metsulfuron na nivou cele biljke linija suncokreta koje nose W574L alel u homozigotnom stanju u odnosu na homozigotne linije koje nose P197L i A205V alele.

Materijali:

[0170[

[0171JSemena su zasejana u Petrijeve posude i posle klijanja mladice su transplantirane u posude dijametra 10 cm sa medijumom za presađivanje koji se sastoji od jednakih količina vermikulita, zemlje i peska. Biljke su rasle u stakleniku pod prirodnim

osvetljenjem dopunjenim natrijum-halidnim lampama od 400 W da bi se obezbedila 16 časovna dužina dana. Dnevne/noćne temperature bile su 25 odnosno 20°C. Na stupnju razvoja V2-V4 (Schneiter and Miller 1981), po 10 biljake svakog genotipa nasumično je određeno za jedan od tretmana koji su se sastojali od osam doza imazapira (0, 2.5, 5, 10, 15, 20 g a.i./ha, bez tretmana, 0.5x, lx, 2x, 3x, i 4x, rcspcktivno), i određivana je biomasa u nultom vremenu. Eksperiment je organizovan kao nasumični blok-dizajn sa punim faktorijalnim (linija suncokreta x tretman) aranžmanom tretmana i 10 replika.

[0172|Na dan nanošenja herbicida, po deset biljka od svakog genotipa isečeno je na kotiledonskom čvoru i sušeno na 60°C, 48 h za određivanje težine u nultom vremenu.

{0173JPreostale biljke održavane su još 14 dana posle tretmana imazapirom (DAT) i određivani su im indeks fitotoksičnosti (PI) i nadzemna suva biomasa. Podaci dobijeni za nadzemnu biomasu konvertovani su u akumulaciju biomase posle nanošenja, oduzimanjem odgovarajuće prosečne biomase u nultom vremenu za svaki uzorak. Podaci za suvu biomasu konvertovani su u procente netretiranih kontrolnih biljaka unutar svake linije, da bi se omogućilo direktno poređenje među grupama. PI je skala od 0 do 9 za procenjivanje fenotipa na osnovu koje je svaka biljka procenjivana vizuelno. Biljke bez simptoma ocenjene su sa "0", rastući nivoi zaostajanja u rastu i hloroze u odnosu na netretirane kontrolne biljke označavani su sa "1" do "4", rastući nivoi abnormalnosti listova i lisna nekroza označavani su sa "5" do "8" i mrtve biljke sa potpunom nektozom apeksa označavane su sa "9".

Rezultati

10174JIndeks fitotoksičnosti: Mutanti su pokazali velike razlike u odgovoru na rastuće stope primenjenog metsulfurona (Tabela 13 i SL. 12). Konvencionalni genotip (B770) bio je ubijen već najnižim dozama metsulfurona. Sa porastom stope herbicida od 0.5 do 3x, linija suncokreta koja jc nosila W574L mutaciju u homozigotnom stanju pokazala je samo blagu redukciju veličie biljke i svetlije zelenu boju nego kontrolne biljke (Tabela 13). U stvari, pokazala je samo hlorozu i deformacije pri stopi nanošenja metsulfurona od 4x. Nasuprot tome, linija koja je nosila A205V alel (B770IMI) pokazala je porast nivoa oštećenja pri stopama od 0.5x do 4x. U stvari pri stopi primene metsulfurona od 2x, gotovo sve biljke ove linije bile su ubijene herbicidom.

[0175]SU-tolerantna linija (SuBL) koja nosi već poznati mutantni ale] za toleranciju suncokreta na sulfonilureu, ne pokazuje simptome ili pokazuje samo blagu hlorozu pri primenjenim dozama metsulfurona od 0.5x i lx, ali zatim nivo oštećenja raste dostižući ocenu 9 (sve biljke su ubijene herbicidom), pri stopi metsulfurona od 4x.

Rezultati:

[0176]Suva težina nadzemne biomase: Krive doznog odgovora za suvu težinu mutanata W574L, P197L i A205V prikazane su na SL. 5 i Tabeli 14. IMI-tolerantne i osetljive linije pokazuju momentalno smanjenje suve težine posle primene herbicida. Sa porastom stope metsulfurona od 0.5 do 4x, biomasa SU-tolerantne linije smanjena je sa 83.3% na 30.3% od vrednosti netretiranih kontrolnih biljaka.

[0177|Zanimljivo, RW-B linija nije pokazala značajno smanjenje suve težine posle primene metsulfurona pri stopama od 0.5 i lx. Sa porastom doza, zapaženo je značajno

smanjenje suve težine. Međutim, ova linija pokazala je zanačajno veću suvu težinu nego sve druge linije, pri svakoj od testiranih doza.

[01781Zaključak: linija RW-B, koja nosi mutantni događaj W574L u homozigotnom stanju naAHASLIlokusu suncokreta, pokazuju veći nivo tolerancije na sve testirane doze metsulfurona nego IMI-tolerantne i već poznate SU- tolerantne linije.

Reference

[0179|

Al-Khatib K., J.R. Baumgartner, D.E. Pcterson, and R.S. Currie. 1998. Imazethapvr resistance in common sunflower (Helianthus annuus). VVeed Sci. 46:403-407.

Al-Khatib K., and J.F. Miller. 2002. Registration of four gcnetic stocks of sunflovver resistant to imidazolinone herbicides. Crop Sci. 40:869-870. Anderson, P. C. and M. Gcorgcson. 1989. Herbicide-tolerant mutants of corn. Genomc 34:994-999.

Ashbumer, M. 1990. Drosophila, A Laboratorv Handbook. Cold Spring Harbor Laboratorv Press. Cold Spring Harbor, NY.

Bentlv, A., B. Mac Lennan, J. Calvo, and C.R. Dearolf. 2000. Target ed recovery of mutations in Drosophila. Genetics 156:1169-1173.

Bernasconi, P., A.R. Woodworth, B.A. Rosen, M.V. Subramanian, and D.L, Siehl. 1995. A naturally occurring point mutation confers broad rangc tolerance to herbicides thattarget acetolactate svnthase. J. Biol. Chem. 270:17381-17385. Bradford, M.M.1976. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72:248-254.

Bruniard J.M. and J.F. Miller. 2001. Inhcritancc of imidazolinone herbicide resistance in sunflovver. Helia 24:11 -16.

Chong, C.K. and J.D.Choi. 2000. Amino acid residues conferring herbicide tolerance in tobaceo acetolactate svnthase. Biochem. Biophvs.Res. Commun. 279 :462-467.

Croughan, T. P. 1996. Herbicide resistant rice. U.S. patent 5,545,822.

Devine, M. D., M.A.S. Marles, and L. M. Hali. 1991. Inhibition of acetolactate svnthase in susceptible and resistant biotypes of Stellaria media. Pestic. Sci. 31:273-280.

D'Halluin, K. M., M. Bossut, E. Bonne, B. Mazur, J. Leemans, and J. Botterman. 1992. Transformation of sugarbeet (Beta vulgaris L.) and evaluation of herbicide resistance in transgenic plants. Bio/Technology 10:309-314. Duggleby, R. G. and S. S. Pang. 2000. Acetohydroxyacid synthase. J. Biochem. Mol. Biol. 33:1-36.

Grula J.W., R.L. Hudspeth, S.L. Hobbs and D.M. Anderson. 1995. Organization, inheritance and expression of acetohydroxyacid synthase genes in the cotton allotetraploid Gossypium hirsutum. Plant Mol. Biol. 28:837-846.

Guttieri, M.J., C.V. Eberlein, C.A. Mallory-Smith, D.C. Thill, and D.L. Hoffman. 1992. DNA sequence variation in Domain A of the acetolactate svnthase genes of herbicide-resistant and -susceptible weed biotvpes. VVeed Sci. 40:670-676.

Guttieri, M.J., C.V. Eberlein, and D.C. Thill. 1995. Diverse mutations in the acetolactate svnthase allele confer chlorsulfuron resistance in Kochia seoparia biotypes. VVeed Sci. 43:175-178.

Harms, C.T., S.L. Armour, JJ. DiMaio, L.A. Middlesteadt, D. Murray, D.V. Negrotto, H. Thompson-Tyler, K. Weymann, A.L. Montova, R.D. Shillito, and G.C. Jen. 1992. Herbicide resistance due to amplification of a mutant acetohydroxyacid synthase allele. Mol. Gen. Genet. 233:427-435.

Hart, S.E., J.W. Saunders, and D. Penner. 1992. Chlorsulfuron resistant sugar beet: Cross-resistance and physiological basis of resistance. VVeed Sci. 40:378-383.

Haughn, G.W., J. Smith, B. Mazur, and C. Somerville. 1988. Transformation with a mutant Arabidopsis acetolactate svnthase gene renders tobaceo resistant to sulfonvlureas. Mol. Gen. Genet. 211:266-271.

Inukai, T., A. Sako, H.Y. Hirano, and Y. Sano. 2000. Analysis of intragenic recombination at wx in rice: Correlation betvveen molecular and genetic maps within the locus. Genome 43:589-596.

Jander, G., S.R. Baerson, J.A. Hudak, K.A. Gonzalez, K.J. Gruys, and R.L. Last. 2003. Ethylmethanesulfonate saturation mutagenesis in Arabidopsis to determine frequency of herbicide resistance. Plant Phvsiol. 131:139-146. Kolkman, J.M., M.B. Slabaugh, J.M. Bruniard, S. Berry, B.S. Bushman, C. Olungu, N. Maes, G. Abratti, A. Zambelli, J.F. Miller, A. Leon, and S.J. Knapp. 2004. Acetohydroxyacid synthase mutations conferring resistance to imidazolinone or sulfonylurea herbicides in sunflovver. Thcor. Appl. Genet. 109:1147-1159.

Kozik A., R.W. Michelmore, S.J. Knapp, M.S. Matvienko, L. Rieseberg, H. Lin, M. van Damme, D. Lavelle, P. Chevalier, J. Ziegle, P. Ellison, J.M. Kolkman, M.B. Slabaugh, K. Livingston, L.Z. Zhou, S. Church, S. Edberg, L. Jackson, R. Kesseli and K. Bradford. 2002. Sunflovver and lettuce ESTs from the compositae genom e project.

http://compgenomics.ucdavis.edu

Lee, Y.T. and R.G. Duggleby. 2001. Identification of the regulatory subunit of Arabidopsis thaliana acetohydroxyacid synthase and reconstitution vvith its catalytic subunit. Biochemistry 40:6836-6844.

Lee, Y.T. and R.G. Duggleby. 2002. Regulatory interactions in Arabidopsis thaliana acetohydroxyacid synthase. FEBS Lett. 512:180-184.

Lee, K.Y., J. Tovvnsend, J. Tepperman, M. Black, C.F. Chui, B. Mazur, P. Dunsmuir, and J. Bedbrook. 1988. The molecular basis of sulfonylurea resistance in tobacco. EMBO J. 7:1241 -1248.

Mal!ory-Smith C.A., D.C. Thill and M.J. Dial.1990. Identification of sulfonylurea herbicide-resistant prickly lettuce (Lactuca serriola). VVeed Technol. 4:163-168.

Marshall M.W., K. Al-Khatib, and T. Loughin. 2001. Gene flow, grovvth, and competitiveness of imazethapvr-resistant common sunflovver. VVeed Sci. 49:14-21.

Massinga RA, K. Al-Khatib, P. St. Amanđ and J.F. Miller. 2003. Gene flovv from imidazolinone-resistant domesticated sunflower to wild relatives. Weed Sci. 51:854-862.

McCourt, J.A. and R.G. Duggleby. 2006. Acetohydroxyacid synthase and its role en the biosvnthetic pathway for branehed-ebain amino acids. Amino Acids 31(2): 173.

McCourt, J.A., S.S. Pang, J. King-Scott, L.VV. Guddat and R.G. Duggleby. 2006. Herbicide-binding sites revealed in the strueture of plant acetohydroxyacid svnthase. PNAS 103(3): 569-573.

McHughen, A. 1989. Agrobacterium mediated transfer of chlorsulfuron resistance to commercial flax cultivars. Plant Cell Rep. 8:445-449. McNaughton, K.E., J. Letarte, E,A. Lee and F.J. Tardif. 2005. Mutations in ALS confer herbicide resistance in redroot pigweed (Amaranthus retroflexus) and Povvell amaranth (Amaranthus povvellii). VVeed Sci. 53:17-22.

Miller J.F., and K. Al-Khatib. 2002. Registration of imidazolinone herbicide-resistant sunflovver maintainer (HA425) and fertilitv restorer (RHA426 and RHA427) germplasms. Crop Sci. 42:988-989.

Miller J.F., and K. Al-Khatib. 2004. Registration of two oilseed sunflovver genetic stocks, SURES-1 and SURES-2, resistant to tribenuron herbicide. Crop Sci. 44:1037-1038.

Milliman, L.D., D.E. Riechers, L.M. Wax and F.VV. Simmons. 2003. Characterization of two biotvpes of imidazolinoneresistant eastern black nightshade (Solanum ptycanthum). VVeed Sci. 51:139-144.

Mourad, G., and J. King. 1992. Effect of four classes of herbicides on growth and acetolactate svnthase activity in several variants of Arabidopsis thaliana. Planta 188:491-497.

Newhouse, K., B.K. Singh, D.L. Shaner, and M. Stidham. 1991. Mutations in corn (Zea mays L.) conferring resistance to imidazolinones. Theor. Appl. Genet. 83:65-70.

Nevvhouse, K., VV. Smith, M. Starrett, T. Schaefer, and B.K. Singh. 1992. Tolerance to imidazolinone herbicides in vvheat. Plant Physiol. 100:882-886. Ouellet T., R.G. Rutledge and B.L., Miki. 1992. Members of the acetohydroxyacid synthase multigene family of Brassica napus have divergent patterns of expression. Plant J. 2:321-330.

Powles S.B. and J.A.M. Holtum. 1994. Herbicide resistance in plants: biology and biochemistry. Levvis Publishers. Boca Raton, Fla.

Pozniak C.J., and P.J. Huci. 2004. Genetic analysis of imidazolinone resistance in mutation-derived lines of common vvheat. Crop Sci. 44:23-30.

Preston, C. and C.A. Mallory-Smith. 2001. Biochemical mechanisms, inheritance, and molecular genetics of herbicide resistance in weeds. In: S.B. Powles and D.L. Shaner (eds).Herbicide Resistance and World Grains, CRC Press, Boca Raton, FL, pp 23-60.

Rajasekaran, K., J.W. Grula, and D.M. Anderson. 1996. Selection and characterization of mutant cotton (Gossypium hirsutum L.) cell lines resistant to sulfonylurea and imidazolinone herbicides. Plant Sci. 199:115-124.

Ray, T.B. 1984. Site of action of chlorsulfuron. Inhibition of valine and isoleucine biosvnthesis in plants. Plant Phvsiol. 75:827-83 3.

Saari, L. L., J. C. Cotterman, and D. C. Thill. 1994. Resistance to acetolactate svnthase inhibiting herbicides. Pagcs 83-139 in S. B. Povvles and J.A.M. Holtum, eds. Herbicide Resistance in Plants: Biology and Biochemistry. Ann Arbor, MI: Levvis.

Sala, C.A, Bulos, M. & Echarte, A.M. 2008a. Genetic analysis of an induced mutation conferring imidazolinone resistance in sunflovver. Crop Science 48:1817-1822.

Sala, C.A., M. Bulos, M. Echarte, S.R. VVhitt, R. Ascenzi. 2008b. Molecular and bioehemical characterization of an induced mutation conferring imidazolinone resistance in sunflovver. Theoretical and Applied Genetics 108 (1): 115-112. Santel, H.J., B.A. Bovvden, V.M. Sorenson, K.H. Mueller, and J. Reynolds. 1999. Flucarbazone-sodium-a nevv herbicide for grass control in vvheat. Proc. Vvest. Soc. VVeed Sci. 52:124-125.

Schneiter, A.A., and J.F. Miller. 1981. Description of sunflovver grovvth stages. Crop Sci. 21:901-903.

Sebastian, S.A., G.M. Fadcr, J.F. Ulrich, D.R. Forney, and R.S. Chaleff. 1989. Semi-dominant soybean mutation for resistance to sulfonylurea herbicides. Crop Sci. 29:1403-1408.

Seefeldt, S.S., J.E. Jcnsen and E.P. Fuerst. 1995. Log-logistic analysis of herbicide dose response relationships. VVeed Technol. 9:218-227.

Shaner D.L. 1991. Physiological effects of the imidazolinone herbicides. In: Shaner DL, O'Connor SL (eds) The imidazolinone herbicides. Levvis, Ann Arbor, Mich., pp 129-138.

Shaner, D.L., P.C. Anderson, and M.A. Stiđham. 1984. Imidazolinones: Potent inhibitors of acetohydroxyacid synthase. Plant Physiol. 76:545-546.

Singh, B.K. 1999. Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine. P. 227-247. In B.K. Singh (ed.) Plant amino acids. Marccl Dekker Inc., Nevv York.

Singh, B.K., M.A. Stidham, and D.L. Shaner. 1988. Assay of acetohydroxyacid svnthase. Ann. Biochem. 171:173-179.

Snow, E.T., R.S. Foote, and S. Mitra. 1984. Base-pairing properties of 0-6-Methvlguanine in template DNA during in vitro DNA replication. J. Biol. Chem. 259:8095-8100.

Subramanian, M.V., and B.C. Gervvick. 1989. Inhibition of acetolactate svnthase by triazolopvirmidines: a review of recent developments. P. 277-288. In J.R. VVhitaker, P.E. Sonnet, eds, Biocatalysis in Agricultural BiotechnoIogy. American Chemical Society, VVashington, DC.

Subramanian, M.V., H.Y. Hung, J.M. Dias, V.W. Miner, J.H. Butler, and J.J. Jachetta. 1990. Properties of mutant acetolactate synthases resistant to triazolopyrimidine sulfonanilide. Plant Physiol. 94:239-244.

Svvanson, E.B., M.J. Hergescll, M. Arnoldo, D.VV. Sippell, and R.S.C. VVong. 1989. Microspore mutagenesis and selection: Canola plants with field tolerance to imidazolinones. Theor. Appl. Genet. 78:525-530.

Tan, S., R.R. Evans, M.L. Dahmer, B.K. Singh, and D.L. Shaner. 2005. lmidazolinone-tolerant crops: history, currcnt status and future. Pest Manag. Sci. 61:246-257.

Tranel, P.J. and T.R. VVright. 2002. Resistance of weeds to AHAS inhibiting herbicides: what have we learned? VVeed Sci 50:700-712.

Trucco, F., A.G. Hager and P.J. Tranel. 2006. Acetolactate synthase mutation conferring imidazolinone-specific herbicide resistance in Amaranthus hybridus. J. Plant Phvsiol. 163:475-479.

Umbarger, H.E. 1978. Amino acid biosvnthesis and its regulation. Annu. Rev. Biochem. 47:533-606.

VVhite A.D., M.D. Owen, R.G. Harfzler, and J. Cardina. 2002. Common sunflower resistance to acetolactate-inhibiting herbicides. Weed Sci. 50:432-437.

VVright, T.R., N.F. Bascomb, S.F. Sturner, and D. Penner. 1998. Biochemical mechanism and molecular basis for ALS-inhibiting herbicide resistance in sugar beet (Beta vulgaris) somatic cell seleetions. VVeed Sci. 46:13-23.

Wright, T.R., and D. Penner. 1998. Cell selection and inheritance of imidazolinone resistance in sugar beet (Beta vulgaris). Theor. Appl. Genet. 96:612-620.

Claims (12)

1. Biljka suncokreta ili njeno potomstvo, naznačeni time. što imaju najmanje jednu kopiju najmanje jednog gena koji kodira polinukleotid velike subjedinice sintaze acetohidroksi-kiselina (AHASL), gde pomenuti AHASL polinukleotid kodira AHASL protein koji daje rezistenciju na imidazolinonski herbicid, sulfonilurea herbicid, triazolopirimiđinski herbicid i pirimidiniloksibenzoatni herbicid, pomenuti AHASL protein sadrži mutaciju na aminokiselinskoj poziciji 574 ili ekvivalentnoj poziciji, gde je aminokiselinska pozicija 574 ili ekvivalentna pozicija leucin, i gde pomenuta biljka suncokreta ili njeno potomstvo imaju povećanu rezistenciju na imidazolinonski herbicid, sulfonilurea herbicid, triazolopirimiđinski herbicid, i pirimidiniloksibenzoatni herbicid, u poredenju sa biljkom suncokreta divljeg tipa.

2. Biljka suncokreta prema zahtevu 1, naznačena time. što pomenuti polinukleotid kodira AHASL protein koji daje rezistenciju na mešavinu herbicida koji inhibiraju sintazu acetohidroksi-kiselina (AHAS), herbicidi koji inhibiraju AHAS su imidazolinonski herbicid, sulfonilurea herbicid, triazolopirimiđinski herbicid i pirimidiniloksibenzoatni herbicid.

3. Biljka suncokreta prema zahtevu 1 ili 2, naznačena time. što pomenuta biljka suncokreta ima AHASLI gen sa nukleotidnom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 1 (Slika 7).

4. Biljka suncokreta prema bilo kojem od zahteval-3, naznačena time. što pomenuta biljka suncokreta proizvodi AHASLI protein koji ima aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 2 (Slika 8).

5. Izolovana nukleinska kiselina, naznačena time, što sadrži SEQ ID NO: 1 (Slika 7).

6. Ekspresiona kaseta,naznačena time.što sadrži promotor aktivan u biljkama, operabilno povezan sa izolovanom nukleinskom kiselinom koja kodira protein koji sadrži sekvencu kodiranu izolovanom nukleinskom kiselinom iz zahteva 5.

7. Transgena biljka suncokreta,naznačena time,što pomenuta biljka sadrži transgcn koji uključuje izolovanu nukleinsku kiselinu iz zahteva 5.

8. Biljka suncokreta prema bilo kojem od zahteva 1-4 ili 7,naznačena time,što pomenuta biljka suncokreta ima jednu glavu.

9. Biljka suncokreta prema bilo kojem od zahteva 1 -4, 7 ili 8,naznačena time,što prinos semena iz pomenute biljke suncokreta iznosi više od jedne tone po hektaru.

10. Seme suncokreta,naznačeno time.što ima AHASLI gen sa nukleotidnom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 1 (Slika 7).

11.Polen biljke suncokreta,naznačen time,što polen sadrži AHASLI gen sa nukleotidnom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 1 (Slika 7).

12. Ovula biljke suncokreta,naznačena time.što ovula sadrži AHASLI gen sa nukleotidnom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 1 (Slika 7).