ES2270227T3 - Promotor met-1 del maiz. - Google Patents
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Abstract
Una molécula aislada de ácido nucleico con una secuencia para un promotor capaz de iniciar la transcripción en una célula vegetal, donde dicha secuencia nucleótida se selecciona de: a) Una secuencia nucleótida que incluye la secuencia notada en SEQ ID NO: 1; b) Una secuencia nucleótida depositada como Accesión ATCC No. 207120; c) Una secuencia nucleótida que incluye al menos 40 nucleótidos contiguos de la secuencia notada en SEQ ID No. 1; d) Una secuencia nucleótida que se hibrida bajo condiciones severas a una secuencia de a), b) o c); y e) Una secuencia nucleótida que tiene al menos 70% de la identidad de la secuencia notadas en a) o b).
Description
Promotor met-1 del maíz.
La presente invención tiene que ver con el campo
de la biología molecular vegetal, más particularmente con la
regulación de la expresión genética en las plantas.
La expresión de secuencias heterogéneas de ADN
en una planta huésped depende de la presencia de un promotor que
esté unido en forma operacional y sea funcional dentro de la planta
huésped. La escogencia de la secuencia del promotor determinará
cuándo y dónde, dentro del organismo, se expresa la secuencia
heterogénea de ADN. Así, donde se desea una expresión continua a
través de las células de la planta, se utilizan promotores
constitutivos. En contraste, donde se desea una expresión genética
en respuesta a un estímulo, promotores inducibles son los elementos
regulatorios de escogencia. En cualquiera de los casos, secuencias
regulatorias adicionales corriente arriba y/o corriente abajo con
relación al núcleo de la secuencia promotora, pueden ser incluidas
en constructos de expresión de vectores de transformación con el fin
de producir variados niveles de expresiones constitutivas o
inducibles de secuencias nucleótidas heterólogas en una planta
transgénica.
Con frecuencia es deseable tener la expresión
constitutiva de una secuencia de ADN a través de las células de un
organismo. Por ejemplo, la resistencia mejorada de una planta a
infecciones por patógenos presentes en el suelo y el aire puede
lograrse mediante manipulación genética del genoma de la planta con
el fin de incluir un promotor constitutivo unido en forma
operacional a un gen heterólogo que presente resistencia al
patógeno, de tal manera que las proteínas resistentes al patógeno
sean continuamente expresadas a través de los tejidos de la
planta.
En forma alternativa, puede ser deseable el
inhibir la expresión de una secuencia nativa de ADN dentro de los
tejidos de una planta con el fin de obtener un fenotipo deseado. En
este caso tal inhibición se puede llevar a cabo con la
transformación de la planta para que incluya un promotor
constitutivo unido en forma operacional a una secuencia nucleótida
antisentido, de tal forma que la expresión constitutiva de la
secuencia antisentido produzca una transcripción del ARN que
interfiera con la traducción del mARN de la secuencia ADN
nativa.
De ésta manera, el aislamiento y caracterización
de los promotores constitutivos que pueden servir como regiones
regulatorias para la expresión constitutiva de secuencias
nucleótidas heterólogas de interés son requeridos para la
manipulación genética de plantas que exhiban rasgos fenotípicos
especiales.
Se proveen composiciones y métodos para la
regulación de secuencias nucleótidas heterólogas en una planta.
La invención, por lo tanto, provee una molécula
de ácido nucleico aislada con una secuencia nucleótida para un
promotor capaz de iniciar la traducción en una célula vegetal donde
dicha secuencia nucleótida sea seleccionada de:
a) una secuencia nucleótida que incluya la
secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1;
b) una secuencia nucleótida depositada como
adquisición ATCC No. 207120;
c) una secuencia nucleótida que incluya, al
menos, 40 nucleótidos contiguos de la secuencia expuesta en SEQ ID
NO: 1;
d) una secuencia nucleótida que se hibride, bajo
condiciones estrictas, en una secuencia de a), b) o c); y
e) una secuencia nucleótida que tenga, al menos,
el 70% de identidad con una secuencia expuesta en a) o b).
La invención también provee un constructo de ADN
que incluye una secuencia nucleótida de la invención unida en forma
operacional a una secuencia nucleótida heteróloga de interés.
La invención también provee un vector que
incluye constructo de ADN de acuerdo a la invención.
La invención también provee una célula huésped
que ha incorporado en su genoma, de una manera estable, el
constructo de ADN de la invención.
Se provee una composición que incluye una
secuencia nucleótida nueva para un promotor vegetal constitutivo
aislado del gen del maíz que codifica una metalotioneína.
También se provee un método para expresar
constitutivamente una secuencia nucleótida heteróloga en una planta
utilizando la secuencia promotora revelada aquí. El método incluye
el transformar una célula vegetal con un vector de transformación
que incluye una secuencia nucleótida unida en forma operacional al
promotor vegetal de la presente invención y el regenerar una planta
transformada, de manera estable, a partir de la célula vegetal
transformada.
La invención también provee una célula vegetal o
planta transformada, de manera estable, con un constructo de ADN de
acuerdo a la invención y una semilla de dicha planta.
La figura 1 muestra el vector plásmido PHP3953
que incluye el gen GUS unido en forma operacional al promotor
ubiquitina. Fragmentos promotores de la presente invención fueron
reclonados en éste plásmido en lugar del promotor ubiquitina y el
plásmido ADN resultante se puso a disposición para su uso en
estudios de transformación con el fin de probar la actividad del
promotor.
La composición de la presente invención es una
molécula de ácido nucleico que incluye una secuencia nucleótida
novedosa para un promotor vegetal, más particularmente el promotor
constitutivo para el gen del maíz que codifica a la
metalotioneina-1. La secuencia nucleótida para éste
promotor es dado en SEQ ID NO: 1. En particular, la presente
invención provee una molécula de ácido nucleico aislada que incluye
una secuencia nucleótida que codifica a la secuencia de ADN
depositada en una bacteria huésped como Adquisición ATCC No. 207120,
sus variantes y fragmentos de la misma. El promotor para este gen
del maíz fue aislado de la región 5' no traducida, flanqueando su
respectivo sitio de inicio de la traducción. Los métodos para
aislar las regiones promotoras son bien conocidos en el arte. El
méto-
do específico utilizado para obtener el promotor de la presente invención es descrito más adelante en el ejemplo 1.
do específico utilizado para obtener el promotor de la presente invención es descrito más adelante en el ejemplo 1.
Un plásmido que contiene la secuencia nucleótida
promotora de la invención ha sido depositado con American Type
Culture Collection (ATCC), manassas, Virginia, y se le ha asignado
la Adquisición No. 207120. Este depósito será mantenido bajo los
términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento
Internacional de Depósitos de Microorganismos para Propósitos de
Procedimientos de Patentes.
La invención abarca una composición de ácido
nucleico aislado o substancialmente purificado. Una molécula de
ácido nucleico "aislada" o "purificada", o una porción
suya biológicamente activa, está substancialmente libre de otro
material celular, o de medio de cultivo cuando es producida mediante
técnicas recombinantes, o substancialmente libre de precursores
químicos u otros productos químicos, cuando se le sintetiza
químicamente. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" es
libre de secuencias (preferiblemente de secuencias que codifican
proteínas) que flanquean de modo natural al ácido nucleico (por ej.,
secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico)
en el ADN genómico del organismo del cual se deriva el ácido
nucleico. Por ejemplo, en varias modalidades, la molécula de ácido
nucleico aislado puede contener menos de cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb,
2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias nucleótidas que en forma
natural flanquean la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico
de la célula de la cual se deriva el ácido nucleico.
Por "promotor" se significa una región
reguladora de ADN, que usualmente incluye una caja TATA, capaz de
direccionar la ARN polimerasa II para que inicie la síntesis de ARN
en el sitio adecuado de transcripción para una secuencia codificante
en particular. Un promotor puede incluir adicionalmente otras
secuencias de reconocimiento, generalmente posicionadas cadena
arriba o 5' respecto a la caja TATA, a las cuales se hace referencia
como elementos promotores corriente arriba, las cuales influyen en
la velocidad de iniciación de la transcripción. Es reconocido que
habiendo identificado la secuencia nucleótida para la región
promotora revelada aquí, está dentro del estado del arte el aislar
e identificar elementos reguladores adicionales en la región 5' no
traducida corriente arriba de la región promotora en particular
identificada aquí. De ésta manera la región promotora revelada aquí
puede incluir elementos reguladores corriente arriba adicionales que
confieren expresiones específicas de tejido de cualquier secuencia
nucleótida heteróloga operacionalmente unida a la secuencia
promotora revelada. Ver particularmente la Patente Australiana No.
AU-A-77751/94 y las Patentes U.S
Nos. 5'466.785 y 5'635.618.
Cuando la secuencia promotora del maíz de la
presente invención es ensamblada con un constructo de ADN de tal
manera que el promotor quede operacionalmente unido a una secuencia
heteróloga de interés, se habilita la expresión constitutiva de la
secuencia nucleótida heteróloga en las células de una planta
transformada en forma estable con éste constructo de ADN. Por
"secuencia nucleótida heteróloga" se entiende una secuencia
que no esté ocurriendo en forma natural con la secuencia del
promotor. Mientras que ésta secuencia nucleótida es heteróloga a la
secuencia del promotor, puede ser homóloga, o nativa, o heteróloga o
foránea para la planta huésped. Por "constitutiva" se entiende
la expresión en las células a lo largo de una planta, la mayor parte
del tiempo y en la mayoría de los tejidos.
La secuencia promotora aislada de la presente
invención puede ser clasificada como un promotor constitutivo débil.
Generalmente, por "promotor débil" se entiende un promotor que
conduce la expresión de una secuencia codificante a un nivel bajo.
Por "nivel bajo" se entiende niveles cercanos a, entre
aproximadamente 1/10.000 transcritos y aproximadamente 1/500.000
transcritos. Por el contrario, un promotor fuerte conduce
expresiones de una secuencia codificante a un nivel alto o a cerca
de, entre 1/10 de transcritos a unos 1/1000 transcritos.
La secuencia nucleótida para el promotor
constitutivo de la presente invención puede ser la secuencia que
ocurre en forma natural o cualquier secuencia que posea una
homología substancial. Por "homología substancial" se entiende
una secuencia que exhibe una equivalencia funcional y estructural
substancial con la secuencia nativa o de ocurrencia natural.
Cualquier diferencia natural o estructural entre secuencias
substancialmente homólogas no afecta la habilidad de la secuencia
para funcionar como promotora tal como se revela en la presente
invención. Así, cualquier secuencia que posea homología substancial
de secuencia con la secuencia del promotor constitutivo de la
presente invención va a dirigir la expresión constitutiva de una
secuencia nucleótida heteróloga unida en forma operacional. Dos
secuencias nucleótidas promotoras se consideran substancialmente
homólogas cuando presentan al menos desde cerca del 50%, 60% hasta
70%, generalmente alrededor del 80%, preferiblemente cerca del 85%,
90%, hasta el 98% de la homología de la secuencia.
Las secuencias substancialmente homólogas de la
presente invención incluyen variantes de las secuencias reveladas,
tales como las que resultan de la mutagénesis específica puntual,
así como de secuencias sintéticamente derivadas. Los métodos para
mutagénesis y alteraciones de secuencias nucleótidas son bien
conocidas en el arte. Ver, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc.
Natl. Acad Sci. USA 82: 488-492; Kunkel et
al. (1987) Methods Enzymol. 154: 367-382;
Patente U.S No. 4'873.192; Walker et al., eds. (1983)
Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing
Company, New York) y las referencias citadas allí. De ésta forma,
la secuencia nucleótida promotora de la invención incluye ambas, la
secuencia de ocurrencia natural, así como las formas mutantes y
derivadas sintéticamente. Generalmente, las variantes de la
secuencia nucleótida de la invención tendrán al menos desde cerca
del 50%, 60% hasta el 70%, generalmente al rededor del 80%,
preferiblemente desde cerca del 85%, 90% hasta el 98% de la
identidad de la secuencia con relación a su respectiva secuencia
nucleótida nativa.
Los fragmentos de la secuencia nucleótida
promotora revelada aquí también están incluidos en la presente
invención. Por "fragmento" se entiende una porción de la
secuencia nucleótida promotora. Los fragmentos de una secuencia
nucleótida promotora pueden retener su actividad biológica. Así, por
ejemplo, menos de la secuencia promotora completa revelada aquí
puede ser utilizada para conducir la expresión de una secuencia
nucleótida de interés unida en forma operacional tal como una
secuencia nucleótida que codifique a una proteína heteróloga. Está
dentro del arte el determinar si tales fragmentos disminuyen los
niveles de expresión o alteran la naturaleza de la expresión, ej.,
expresión constitutiva. En forma alterna, los fragmentos de una
secuencia nucleótida promotora que son útiles como sondas de
hibridación generalmente no retienen esta actividad biológica.
Las moléculas de ácido nucleico que son
fragmentos de una secuencia nucleótida promotora constan de por lo
menos 40, 45, 50, 75, 100, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 500, 550,
600, 650, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200 ó 1.300 nucleótidos. O
hasta el número de nucleótidos presentes en una secuencia nucleótida
promotora completa revelada aquí (p. ej., 1300 para SEQ ID NO: 1).
Generalmente, los fragmentos de una secuencia promotora que retienen
su actividad biológica constan de al menos 40 nucleótidos contiguos,
preferiblemente de al menos 50 nucleótidos contiguos, más
preferiblemente de al menos 75 nucleótidos contiguos, aún más
preferiblemente de al menos 100 nucleótidos contiguos de la
secuencia nucleótida contigua revelada aquí. Las longitudes de
fragmento preferidas dependen del objetivo y variarán también
dependiendo de la secuencia promotora.
Las secuencias nucleótidas de tales fragmentos
usualmente incluirán la secuencia de reconocimiento TATA de la
secuencia promotora. Tales fragmentos pueden ser obtenidos por uso
de enzimas de restricción para romper la secuencia nucleótida
promotora que ocurre naturalmente y que es revelada aquí;
sintetizando una secuencia nucleótida a partir de la secuencia de
ocurrencia natural de la secuencia de ADN promotora.; o puede ser
obtenida a través del uso de tecnología PCR. Ver, en particular,
Mullis et al. (1987) Methods Enzymol. 155:
335-350, y Erlich, ed. (1989) PCR Technology
(Stockton Press, New York). Variantes de estos fragmentos
promotores, tales como aquellos resultantes de mutagénesis dirigida
puntual, son abarcadas por las composiciones de la presente
invención.
La secuencia nucleótida promotora revelada puede
ser utilizada para aislar secuencias promotoras homólogas en otras
especies vegetales. Métodos para la hibridación de secuencias de
ácidos nucleicos se encuentran fácilmente disponibles en el arte.
Secuencias promotoras de otras plantas pueden ser aisladas de
acuerdo a técnicas bien conocidas basadas en sus homologías de
secuencia con relación a la secuencia promotora establecida aquí. En
estas técnicas parte o toda la secuencia nucleótida conocida se usa
como una sonda que se hibrida selectivamente a otras secuencias
nucleótidas promotoras presentes en una población de fragmentos de
ADN genómico clonados o fragmentos cADN (ej., librerías genómicas o
cADN) de un organismo seleccionado.
Para obtener secuencias promotoras homólogas, se
puede utilizar la secuencia nucleótida promotora completa o
porciones de la misma como sondas capaces de hibridarse
específicamente a secuencias promotoras correspondientes. Con el fin
de lograr una hibridación específica bajo una variedad de
condiciones, tales sondas incluyen secuencias que son únicas y que
preferiblemente se componen de, al menos, unos 10 nucleótidos en
longitud, y lo más preferiblemente de al menos 20 nucleótidos en
longitud. Tales sondas pueden ser usadas para amplificar las
secuencias promotoras de interés a partir de un organismo
seleccionado mediante el conocido proceso de la reacción de la
cadena de polimerasa (PCR). Esta técnica puede ser empleada para
aislar secuencias promotoras adicionales a partir de un organismo
deseado o como un ensayo diagnóstico para determinar la presencia de
secuencias promotoras en un organismo.
Tales técnicas incluyen hibridación preliminar
de librerías de ADN plated (ya sea placas o colonias; ver, por ej.,
Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory
Manual(2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview,
New York) y amplificación por PCR utilizando oligonucleótidos
cebadores (ver, por ej., Innis et al., eds. (1990) PCR
Protocols, a Guide to Methods and Applications. Academic
Press. New York).
Por ejemplo, la hibridación de tales secuencias
puede efectuarse bajo condiciones de reducida restricción,
restricción mediana o aún condiciones restringidas (ej., condiciones
representadas por un lavado severo con formamida
35-40% con solución de Denhardt 5x, SDS 0,5% y SSPE
1x a 37°C; condiciones representadas por un lavado severo con
formamida 40-45% con solución de Denhardt 5x, SDS
0,5% y SSPE 1x a 42ºC ; y condiciones representadas por un lavado
severo con formamida 50% con solución de Denhardt 5x, SDS 0,5% y
SSPE 1x a 42°C respectivamente) a ADN para la secuencia promotora
revelada aquí en un ensayo estándar de hibridación. Ver Sambrook
et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory
Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview,
New York). En general, las secuencias homólogas que son
secuencias promotoras y se hibridan a la secuencia promotora
revelada aquí, serán al menos 70% homólogas, y aún 80%, 85%, 90%,
95% homólogas o más con relación a la secuencia revelada. Esto es,
la similitud de secuencia de las secuencias puede variar,
compartiendo al menos cerca al 70%, y aún cerca al 80%, 85%, 90%,
95%, 98% de la similitud de secuencia.
Los siguientes términos son empleados para
describir las relaciones de secuencia entre dos o más ácidos
nucléicos: (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de
comparación", (c) "identidad de secuencia", (d)
"porcentaje de identidad de secuencia" y (e) "identidad
substancial".
(a) Como se utiliza aquí, "secuencia de
referencia" es una secuencia definida usada como base comparativa
de secuencias. Una secuencia de refencia puede ser subconjunto de
una secuencia completa especificada o la secuencia completa; por
ejemplo, como un segmento de una secuencia completa de cADN o gen, o
como la secuencia completa cADN o gen.
(b) como se utiliza aquí, "ventana de
comparación" hace referencia a un segmento contiguo y
especificado de una secuencia polinucleótida, donde la secuencia
polinucleótida en la ventana de comparación puede incluir adiciones
o deleciones (ej., gaps) comparado con la secuencia de referencia
(la cual no incluye adiciones o deleciones) para alineación óptima
de las dos secuencias. Generalmente, la ventana de comparación tiene
una longitud de al menos 20 nucleótidos contiguos y, opcionalmente,
30, 40, 50, 100 o más. Los entendidos en el arte comprenden que con
el fin de evitar una alta similitud con una secuencia de referencia
debido a una inclusión de gaps en la secuencia polinucleótida,
generalmente se introduce una penalización de gap y se resta del
número de coincidencias.
Métodos de alineación de secuencias son bien
conocidos en el arte. Una alineación óptima de las secuencias que se
van a comparar puede ser efectuada mediante el algoritmo de
homología local de Smith et al. (1981) Adv. Appl.
Math. 2:482; mediante el algoritmo de alineación de Needleman
et al (1970) J. Mol. Biol. 48: 443; mediante el
método de búsqueda de similitudes de Pearson et al.(1988)
Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444; mediante las
implementaciones computarizadas de estos algoritmos, incluyendo pero
no limitadas a: CLUSTAL en el programa PC/Gene de Intelligenetics,
Mountain View, California; GAP, BESTFIT, BLAST y TFASTA en el
paquete Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer
Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin; el programa
CLUSTAL esta bien descrito por Higgins et al. (1988)
Gene 73: 237-244 (1988); Higgins et
al. (1988) Gene 73: 237-244 (1988);
Higgins et al. (1989) CABIOS 5: 151-153;
Corpet et al. (1988) Nuc. Acids Res. 16:
10881-90: Huang et al. (1992) Computer
Applications in the Biosciences 8: 155-65, y
Person et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:
307-331; Los métodos preferidos de alineación por
computador también incluyen los algoritmos BLASTP, BLASTN y BLASTX
(ver Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:
403-410). La alineación también es a menudo
realizada por inspección y alineación manual.
(c) Como se utiliza aquí, "identidad de
secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de
ADN, hace referencia a los residuos en las dos secuencias que son
iguales cuando se han alineado con la máxima correspondencia sobre
una ventana de comparación especificada.
(d) Como se utiliza aquí, "porcentaje de
identidad de secuencia" significa el valor determinado por
comparación de dos secuencias óptimamente alineadas sobre una
ventana de comparación, donde la porción de la secuencia nucleótida
en la ventana de comparación puede incluir adiciones o deleciones
(ej., gaps) con relación a la secuencia de referencia (que no
incluye adiciones o eliminaciones) para una alineación óptima de las
dos secuencias. El porcentaje es calculado determinando el número de
posiciones en las cuales la base de ácido nucleico ocurre en ambas
secuencias con el fin de obtener el número de posiciones de
coincidencia, dividiendo el número de coincidencias por el número
total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicando el
resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de
secuencia.
(e) (i) El término "identidad substancial"
de las secuencias polinucleótidas significa que un polinucleótido
incluye una secuencia que tiene al menos el 70% de identidad de
secuencia, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al
menos 90% y, lo más preferiblemente, al menos 95%, comparado con una
secuencia de referencia que utiliza uno de los programas de
alineación descritos empleando parámetros estándares.
Otra indicación de que las secuencias
nucleótidas son substancialmente idénticas es si dos moléculas se
hibridan entre sí bajo condiciones restringidas. Generalmente las
condiciones restringidas son seleccionadas para que sean
aproximadamente desde 5ºC hasta cerca de 20ºC por debajo del punto
térmico de fusión (T_{m}) de la secuencia específica a una fuerza
iónica y pH definidos. El T_{m} es la temperatura (bajo fuerza
iónica y pH definidos) a la cual el 50% de la secuencia objetivo se
hibrida con una sonda perfectamente coincidente. Típicamente, las
condiciones severas de lavado son aquellas en las cuales la
concentración de la sal es de al rededor de 0,02 molar a pH 7 y la
temperatura es, al menos, aproximadamente 50, 55 o 60ºC.
La secuencia nucleótida para el promotor
constitutivo revelado en la presente invención, así como una
variante o fragmento suyo, es útil en la manipulación genética de
cualquier planta cuando se ensambla dentro de un constructo de ADN,
de tal forma que la secuencia promotora este unida en forma
operacional con una secuencia nucleótida heteróloga cuya expresión
constitutiva se va a controlar con el fin de lograr una respuesta
fenotípica deseada. Por "unido en forma operacional" se
significa que la trascripción o traducción de la secuencia
nucleótida heteróloga esta bajo la influencia de la secuencia
promotora. De esta manera, la secuencia nucleótida para el promotor
de la invención se provee en casetes de expresión junto con
secuencias nucleótidas heterólogas para expresión en la planta de
interés. Se reconoce que la secuencia promotora de la invención
puede también ser usada con su secuencia codificante nativa con el
fin de aumentar o disminuir la expresión de la secuencia codificante
nativa, resultando de ahí en un cambio de fenotipo en la planta
transformada.
Tales casetes de expresión van a incluir una
región de iniciación de la traducción la cual incluye la secuencia
nucleótida promotora de la presente invención o una variante o
fragmento suyo, unida en forma operacional a la secuencia nucleótida
heteróloga cuya expresión va a ser controlada por el promotor
constitutivo revelado aquí. Tal casete de expresión es provisto con
una pluralidad de sitios de restricción para la inserción de la
secuencia nucleótida que estará bajo la regulación de trascripción
de las regiones regulatorias. El casete de expresión puede contener
adicionalmente marcadores genéticos seleccionables.
Con el fin de aumentar los niveles de
trascripción, se pueden utilizar potenciadores en combinación con la
región promotora de la invención. Los potenciadores son secuencias
nucleótidas que actúan para incrementar la expresión de una región
promotora. Los potenciadores son conocidos en el arte e incluyen la
región potenciadora SV40, el elemento potenciador 35S y los
afines.
El casete trascripcional incluirá, en la
dirección 5'a 3'de la trascripción, una región de iniciación
trascripcional y de traducción, una secuencia nucleótida heteróloga
de interés y una región terminal trascripcional y de traducción
funcional en las plantas. La región terminal puede ser nativa con la
región de iniciación trascripcional, incluyendo la secuencia
nucleótida promotora de la presente invención, puede ser nativa con
la secuencia de ADN de interés o puede ser derivada de otra fuente.
Regiones de interés convenientes son disponibles a partir del
plásmido Ti del A. tumefaciens, tales como las regiones
terminales octopine sintasa y nopalin sintasa. Ver también Guerineau
et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:
141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:
671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes
Dev. 5: 141-149; Mogen et al. (1990)
Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe et al.
(1990) Gene 91: 151-158; Ballas et
al. (1989) Nuc. Acids Res. 15:
9627-9639.
El casete de expresión que incluye la secuencia
promotora de la presente invención, unida en forma operable a una
secuencia nucleótida heteróloga, también puede contener al menos una
secuencia nucleótida adicional para que un gen sea cotransformado en
el organismo. En forma alternativa, la(s) secuencia(s)
adicional(es) pueden proveerse en otro casete de
expresión.
Donde sea apropiado, la secuencia nucleótida
heteróloga cuya expresión va a estar bajo el control de la secuencia
promotora de la presente invención, y cualquier secuencia(s)
adicional(es), puede ser optimizada para aumentar la
expresión en la planta transformada. Esto es, éstas secuencias
nucleótidas pueden ser sintetizadas utilizando codones preferidos
por las plantas con el fin de mejorar la expresión. En el arte hay
disponibles métodos para sintetizar secuencias nucleótidas
preferidas por las plantas. Ver, por ejemplo, U.S. Patent Nos.
5,380,831 y 5,436,391, y Murray et al. (1989) Nuc. Acids
Res. 17:477-498.
Se sabe que modificaciones adicionales a las
secuencias mejoran la expresión del gen en un huésped celular. Estas
incluyen eliminación de secuencias que codifican señales espurias de
poliadenilación, señales de sitio de empalme
exón-intrón, repeticiones tipo transposón y otras
secuencias bien caracterizadas que pueden ser dañinas a la expresión
génica. El contenido G-C de las secuencias
nucleótidas heterólogas puede ser ajustado a niveles promedio para
un huésped celular dado, como ha sido calculado por referencia a
genes conocidos expresados en la célula huésped. Cuando sea posible,
la secuencia es modificada para evitar estructuras secundarias
predichas de mARN en forma de horquilla.
Los casetes de expresión pueden contener
adicionalmente secuencias líderes 5' en el constructo del casete de
expresión. Tales secuencias líderes pueden actuar para mejorar la
traducción. Los traductores líderes se conocen en el arte e
incluyen: líderes picornavirus, por ejemplo el líder EMCV (Región 5'
encefalomiocarditis no codificante) (Elroy-Stein
et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA
86:6126-6130); líderes potivirus, por ejemplo, líder
TEV (virus jaspeado del tabaco) (Allison et al. (1986));
leader MDMV (virus del mosaico enano del maíz) (Virology
154:9-20); proteína enlazante de cadena pesada de
la inmunoglobulina humana (BiP) (Macejak y Samow (1991)
Nature 353:90-94); líder no traducido de la
proteína de la cápside mARN del virus del mosaico de la alfalfa (AMV
RNA 4) (Jobling y Gehrke (1987) Nature 325:
622-625); líder virus del mosaico del tabaco (TMV)
(Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA,
páginas 237-256); y líder virus del moteado
clorótico del maíz (MCMV) (Lommet et al. (1991) Virology 81:
382-385). Ver también Della-Cioppa
et al. (1987) Plant Physiology 84:
965-968. Se pueden utilizar también otros métodos
conocidos para mejorar la traducción y/o estabilidad del mARN , por
ejemplo intrónes y afines.
En aquellos casos donde es deseable tener en
forma constitutiva el producto expresado de la secuencia nucleótida
dirigido a un organelo en particular, tal como el cloroplasto o la
mitocondria, o secretado en la superficie de la célula o
extracelularmente, el casete de expresión puede incluir
adicionalmente una secuencia codificante para un péptido de
tránsito. Tales péptidos de tránsito son bien conocidos en el arte e
incluyen, pero no están limitados a, el péptido de tránsito para la
proteína transportadora del acilo, la pequeña subunidad del RUBISCO,
sintasa vegetal EPSP y las afines.
Al preparar los casetes de expresión se puede
manipular los diversos fragmentos de ADN de tal forma que se provea
las secuencias de ADN en la orientación adecuada y, como es debido,
en el marco de lectura adecuado. Hacia este fin se puede emplear
adaptadores o sitios de unión para unir los fragmentos de ADN u
otras manipulaciones pueden involucrarse con el fin de proveer
sitios convenientes de restricción, remoción de ADN superfluo,
remoción de sitios de restricción o afines. Para este propósito se
puede involucrar mutagénesis in vitro, reparación de
sebadores, restricción, hibridación, resubstituciones, por ejemplo,
transiciones y transversiones.
El casete de expresión que incluye la secuencia
promotora de la presente invención unida en forma operacional a una
secuencia nucleótida heteróloga de interés puede ser utilizado para
transformar cualquier vegetal. De ésta manera se puede obtener
plantas genéticamente modificadas, células vegetales, tejidos
vegetales, semillas y afines. Los protocolos de transformación
pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula vegetal, esto
es, monocotiledónea o dicotiledónea, escogida para la
transformación. Los métodos adecuados para transformar células
vegetales incluyen microinyección (Crossway et al. (1986)
Biotechniques 4: 320-334), electroporación
(Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:
5602-5606), transformación mediada por agrobacterium
(Hinchee et al. (1988) Biotechnology 6:
915-921), transferencia directa de genes (Paszkowski
et al. (1984) EMBO J. 3: 2717-2722) y
aceleración balística de partículas (ver por ejemplo, Sanford et
al. U.S. Patent 4,945.050; Tomes et al. (1995) en
Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods,
ed. Gamborg y Phillips (Springer-Verlag, Berlín); y
McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:
923-926). Ver también Weissinger et al.
(1988) Annual Rev. Genet. 22: 421-477;
Sanford et al. (1987) Particulate Science and
Technology 5: 27-7 (cebolla); Christou et
al. (1988) Plant Physiol. 87: 671-674
(semilla de soya); McCabe et al. (1988) Biol
Technology 6: 923-926 (semilla de soya); Datta
et al. (1990) Biotechnology 8: 736-740
(arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85: 4305-4309 (maiz); Klein et al. (1988)
Biotechnology 6: 559-563 (arroz); Klein et
al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:
4305-4309 (maiz); Klein et al. (1988)
Biotechnology 6: 559-563 (maiz); Klein et
al. (1988) Plant Physiol. 91: 440-444
(maiz); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:
833-839; Hooydaas-Van Slogteren and
Hooykaas (1984) Nature (Londres) 311:
763-764; Bytebier et al. (1987) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 84: 5345-5349 (liliacea);
De West et al. (1985) en The Experimental Manipulation of
Ovule Tissues, ed. G. P. Chapman et al. (Longman, New
York), pp. 197-209 (polen); Kaeppler et al.
(1990) Plant Cell Reports 9: 415-418; y
Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:
560-566 (transformación mediada por Whiskers);
D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:
1495-1505 (electroporación); Li et al. (1993)
Plant Cell Reports 12: 250-255 y Christou y
Ford (1995) Annals of Botany. 75: 407-413
(arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:
745-750 (maíz vía Agrobacterium
tumefaciens).
Las células que han sido transformadas pueden
ser crecidas en plantas en concordancia con vías convencionales. Ver
por ejemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell
Reports 5: 81-84. Estas plantas, entonces,
pueden ser cultivadas, y polinizadas, ya sea, con la misma cepa o
con cepas diferentes, y el híbrido resultante puede tener la
expresión constitutiva de la característica fenotípica deseable
identificada. Se puede cultivar dos o más generaciones para asegurar
que la expresión constitutiva de la característica fenotípica
deseable se mantiene y hereda en forma estable y entonces se ha
logrado semillas cultivadas para asegurar la expresión constitutiva
de la característica fenotípica deseable.
La secuencia nucleótida promotora y los métodos
revelados aquí son útiles en la regulación de la expresión
constitutiva de cualquier secuencia nucleótida constitutiva
heteróloga en una planta huésped con el fin de variar el fenotipo de
una planta. Varios cambios en el fenotipo son de interés incluyendo
la modificación de la composición de ácidos grasos en una planta, la
alteración del contenido de aminoácidos de una planta, la
alteración del mecanismo de defensa contra patógenos de una planta,
y los similares. Estos resultados pueden ser obtenidos suministrando
la expresión de productos heterólogos o la expresión aumentada de
productos endógenos en plantas. En forma alternativa, los resultados
pueden ser obtenidos suministrando una reducción de la expresión de
uno o más productos endógenos, particularmente enzimas o cofactores
en la planta. Estos cambios dan como resultado una variación en el
fenotipo de la planta transformada.
Los genes de interés son reflectivos a los
mercados comerciales y a los intereses de aquellos involucrados en
el desarrollo de los cultivos. Los cultivos y mercados de interés
varían y, a medida que las naciones en desarrollo abren mercados
mundiales, nuevos cultivos y tecnologías también van a emerger.
Adicionalmente, a medida que nuestra comprensión de las tendencias
agrícolas y características tales como producción y heterosis
aumenta, la variedad de genes para transformación variará
igualmente. Las categorías generales de genes de interés incluyen,
por ejemplo, aquellos genes involucrados en la información, tales
como dedos de cinc, aquellos involucrados en la comunicación, tales
como quinasas y aquellos involucrados en la manutención de la casa
tales como las proteínas de choque térmico. Categorías más
específicas de transgenes, por ejemplo, incluyen genes que codifican
importantes características agronómicas, resistencia a los insectos,
resistencia a las enfermedades, resistencia a los herbicidas,
esterilidad, características de grano y productos comerciales. Genes
de interés incluyen, generalmente, aquellos involucrados en el
metabolismo de los aceites, almidón, carbohidratos o nutrientes así
como aquellos que afectan el tamaño del grano, carga de sacarosa y
similares.
Características agronómicas importantes como
contenido de aceite, almidón y proteína pueden ser alteradas
genéticamente en adición a la utilización de los métodos
tradicionales de cultivo. Las modificaciones incluyen contenido
incrementado de ácido oleico, aceites saturados e insaturados,
niveles incrementados de lisina y azufre, suministro de aminoácidos
esenciales y también la modificación del almidón. En la U.S. Patent
Application Serial Nos. 08/838,763, solicitada el 10 de abril de
1997, se describen modificaciones de la proteína hordotionina, de
donde se deriva la WO 94/16078 publicada el 21 de julio de 1994; la
08/824,379 solicitada el 26 de marzo de 1997, de la cual se deriva
la WO 96/38562, publicada el 5 de diciembre de 1996; la 08/824,382
solicitada el 26 de marzo de 1997 de la cual se deriva la WO
96/38563, publicada el 5 de diciembre de 1996 y la patente U.S. No.
5,703,409. Otro ejemplo es la proteína rica en lisina y/o azufre
codificada por la albúmina 2S de la semilla de soya descrita en U.S.
Serial No. 08/618,911 Solicitada el 20 de marzo de 1996 de la cual
se deriva la WO 97/35023, publicada el 25 de septiembre de 1997; y
el inhibidor quimotripsina de la cebada, Williamson et al.
(1987) Eur. J. Biochem. 165: 99-106.
Se puede hacer derivaciones de las secuencias
codificantes por mutagénesis dirigida de sitio para aumentar el
nivel de aminoácidos preseleccionados en el polipéptido codificado.
Por ejemplo, el gen que codifica el polipéptido alto de la lisina en
los cereales (BHL) se deriva del inhibidor de la quimotripsina en
los cereales, PCT/US97/20441, solicitada el 31 de octubre de 1997.
Otras proteínas incluyen proteínas vegetales ricas en metionina
tales como las obtenidas de la semilla de girasol (Lilley et
al. (1989) Proceedings of the World Congress on Vegetable
Protein Utilization in Human Foods and Animal Feedsuffs, ed.
Applewhite (American Oil Chemists Society, Champaign, Illinois, pp.
497-502); el maíz (Pedersen et al. (1986)
J. Biol. Chem. 261: 6279; Kirihara et al. (1988)
Gene 71: 359) y arroz (Musumura et al. (1989)
Plant Mol. Biol. 12: 123). Otros genes de importancia
agronómica codifican al látex, Floury 2, factores de crecimiento,
factores de almacenamiento de semilla y factores de
transcripción.
Los genes con resistencia a los insectos pueden
codificar resistencia a plagas que tienen gran despliegue tales como
el gusano de la raíz, el gusano gris, la oruga taladradora del maíz
y similares. Tales genes incluyen, por ejemplo los genes de la
proteína tóxica Bacillus thuringiensis (U.S. Patent Nos.
5,366,892; 5,747,450; 5,737,514; 5,723,756; 5,593,881; Geiser et
al. (1986) Gene 48: 109); lectinas (Van Damme et
al. (1994) Plant Mol. Biol. 24: 825) y las similares.
Los genes que codifican resistencia a
enfermedades incluyen genes de detoxificación tales como contra
fumonosina (U.S. Patent Application Serial No. 08/484,815,
solicitada el 7 de junio de 1995 de la cual se deriva la WO 96/06175
publicada el 29 de febrero de 1996); avirulencia (avr) y genes con
resistencia a enfermedades (R) (Jones et al. (1994)
Science 266: 789; Martin et al. (1993) Science
262: 1432; Mindrinos et al. (1994) Cell 78: 1089; y
los afines.
Las características de resistencia a herbicidas
pueden incluir genes que codifican para resistencia a los herbicidas
que actúan para inhibir la acción de la acetolactato sintasa (ALS),
en particular los herbicidas tipo sulfonilurea (ej. el gen de la
acetolactato sintasa (ALS) contiene mutaciones que conducen a dicha
resistencia, en particular las mutaciones S4 y/o Hra), genes que
codifican para la resistencia a herbicidas que actúan para inhibir
la acción de la glutamina sintasa tales como el fosfinotricin o
basta (ej. el gen de barra) u otros genes similares conocidos en el
arte. El gen de barra codifica resistencia al herbicida basta, el
gen nptll codifica resistencia a los antibióticos kanamicina
y geneticina, y el gen ALS codifica resistencia al herbicida
clorsulfuron.
Los genes de la esterilidad también pueden ser
codificados en un casete de expresión y proveer una alternativa al
despenachado físico. Ejemplos de genes utilizados de estas maneras
incluyen los genes con preferencia por tejidos masculinos y genes
con fenotipos de esterilidad masculina tales como el QM descrito en
la Patente U.S. No. 5,583,210. Otros genes incluyen quinasas y
aquellos que codifican compuestos tóxicos para, bien sea, el
desarrollo gametofítico masculino o femenino.
La calidad de grano se refleja en
características tales como niveles y tipos de aceites, saturados e
insaturados, calidad y cantidad de aminoácidos esenciales y niveles
de celulosa. En el maíz, proteínas modificadas de hordotionina,
descritas en las patentes U.S. Patent Application Serial Nos.
08/838,763, solicitada el 10 de abril de 1997, de la cual se deriva
la WO 94/16078, publicada el 21 de julio de 1994; la 08/824,379,
solicitada el 26 de marzo de 1997, de la cual se deriva la WO
96/38562, publicada el 5 de diciembre de 1996; la 08/824,382,
solicitada el 26 de marzo de 1997, de la cual se deriva la WO
96/38563, publicada el 5 de diciembre de 1996 y la patente U.S.
Patent No. 5,703,409 expedida el 30 de diciembre de 1997, proveen
descripciones de modificaciones de proteínas para propósitos
deseados.
deseados.
Las características comerciales también pueden
ser codificadas sobre un gene o genes que pudieran incrementar, por
ejemplo, el almidón para la producción de etanol o proveer
expresiones para proteínas. Otro uso comercial importante de las
plantas transformadas es la producción de polímeros y bioplásticos
tales como los descritos en la patente U.S. Patent No. 5,602,321
emitida el 11 de febrero de 1997. Genes tales como la
B-cetotiolasa, PHBase (polihidroxibutirato sintasa)
y acetoacetil-CoA reductasa (ver Schubert et
al. (1988) J. Bacteriol. 170: 5837-5847)
facilitan la expresión de los polihidroxialcanoatos (PHAs).
Los productos exógenos incluyen enzimas
vegetales y productos así como aquellos de otras fuentes incluyendo
los procariotes y otros eucariotes. Tales productos incluyen
enzimas, cofactores, hormonas y afines. Los niveles de proteínas,
particularmente las proteínas modificadas que tienen distribución
mejorada de aminoácidos con el fin de mejorar el valor nutritivo de
la planta, pueden ser incrementados. Esto se logra mediante la
expresión de tales proteínas que tienen contenido mejorado de
aminoácidos.
Así, la secuencia nucleótida heteróloga unida en
forma operable al promotor constitutivo revelado aquí puede ser un
gen estructural que codifica una proteína de interés. Ejemplos de
tales genes heterólogos incluyen, pero no están limitados a, genes
que codifican proteínas que confieren resistencia a estrés abiótico
como sequía, temperatura, salinidad y toxinas como pesticidas y
herbicidas, o a estrés biótico como ataque por hongos, virus,
bacterias, insectos y nemátodos, y desarrollo de enfermedades
asociadas con estos organismos. Más particularmente, el promotor
constitutivo revelado aquí e identificado como un promotor
constitutivo débil es útil en la transformación de plantas para que
expresen constitutivamente un gen de avirulencia como se revela en
ambas solicitudes co-pendientes titulado:
"Métodos para Mejorar la Resistencia de las Plantas a
Enfermedades", U.S. Application Serial No. 60/075,151,
solicitada el 26 de febrero de 1998 y U.S. Application Serial No.
60/092,464, solicitado el 11 de julio de 1988, de los cuales se
deriva WO 99/43823, publicada el 2 de septiembre de 1999. Tal
promotor débil puede causar activación del sistema defensivo de la
planta corta en muerte celular hipersensible. Así, hay una
activación del sistema defensivo de la planta a niveles suficientes
para protegerla de invasión patógena. En este estado hay al menos
una activación parcial del sistema defensivo de la planta donde la
planta produce niveles incrementados de factores antipatogénos tales
como proteínas PR, es decir, PR-1, cattiness,
glucanasas-a, etc; metabolitos secundarios;
fitoalexinas; especies reactivas al oxígeno y similares.
Alternativamente, la secuencia nucleótida
heteróloga unida en forma operacional al promotor constitutivo
revelado aquí puede ser una secuencia antisentido para un gen
escogido. Por "secuencia nucleótida de ADN antisentido" se
significa una secuencia que está en orientación inversa a la
orientación normal 5' a 3' de la secuencia nucleótida. Cuando se
suministra a una célula vegetal, la expresión de la secuencia ADN
antisentido previene la expresión normal de la secuencia nucleótida
de ADN para el gen escogido. La secuencia nucleótida antisentido
codifica un constructo ARN que es complementario a, y capaz de
hibridarse al ARN mensajero endógeno (mARN) producido por la
transcripción de la secuencia nucleótida de ADN para el gen
escogido. En este caso, la producción de una proteína nativa
codificada por el gen escogido es inhibida para lograr una respuesta
fenotípica deseable. Así, la secuencia promotora revelada aquí puede
estar unida en forma operativa a las secuencias ADN antisentido para
reducir o inhibir la expresión de una proteína nativa en la
planta.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de
ilustración y no a modo de limitación.
La región promotora para el gen del maíz que
codifica una metalotioneína fue aislada de plantas de maíz y
clonada. Este gen fue seleccionado como una fuente de un promotor
constitutivo basado en la expresión desarrolladora y espacial de su
producto génico. El método para su aislamiento se describe
abajo.
Las metalotioneínas conforman una clase de
proteínas que son expresadas constitutivamente en bajo número de
copias en las células a lo largo de la planta. La expresión de estas
proteínas en células de mamíferos es inducible en respuesta a estrés
y a concentraciones elevadas de elementos traza y hormonas. La
novedosa secuencia promotora para un gen de maíz que codifica una de
estas metalotioneínas, met-1, es tratada en SEQ ID
NO: 1.
Ejemplo
1
El procedimiento para el aislamiento del
promotor se describe en el Manual del Usuario del kit GenomeWalker
vendido por Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California. El
ADN genómico de la línea del maíz A63 se extrajo moliendo en
nitrógeno líquido hojas de semillero de 10 días y el ADN fue
preparado como lo describen Chen y Dellaporta (1994) en The
Maize Handbook, ed. Freeling y Walbot
(Springer-Verlag, Berlín). Se adicionó RNasa A a 10
\mug/ml y luego se incubó a 37°C durante 1 hr. El ADN fue entonces
extraído una vez con fenol-cloroformo, luego
cloroformo, luego etanol, fue precipitado y resuspendido en TE (10
mM Tris pH 8,0, 1 mMEDTA). El ADN fue entonces utilizado
exactamente como se describe en el Manual del Usuario del kit
GenomeWalker (Clontech PT3042-1 versión PR68687).
Brevemente, el ADN fue digerido en forma separada con enzimas de
restricción Dral, EcoRV, Pvull, Scal y Stul, todas con cortadores de
extremos romos. Los adaptadores GenomeWalker fueron entonces unidos
a los extremos del ADN restringido. Al ADN resultante se le refiere
como DL1-DL5, respecti-
vamente.
vamente.
Para el aislamiento de la región promotora
específica, se designaron dos cebadores no sobrelapantes de
especificidad génica (27 bp en longitud) de las secuencias de ESTs
abundantes en la base de datos Pioneer/HGS. Los primeros fueron
designados para amplificar la región corriente arriba de la
secuencia codificante, esto es, la región 5' no traducida y la
región promotora del gen. Las secuencias de los primers se dan más
adelante. La primer ronda de PCR se realizó sobre cada muestra de
ADN (DL1-5) con sebador Clontech AP1 (secuencia
5'-gtaatacgactcactatagggc-3'; SEQ ID
NO: 2) y el sebador de especificidad génica (gsp) 1 con la siguiente
secuencia:
| Secuencia metalotioneína gsp1: | 5'-gtacttcttgccgcacttgcagcttga-3' | (SEQ ID NO: 3) |
El PCR se realizó en un termociclador modelo
PTC-100 con HotBonnet de MJ Research (Watertown,
Massachusetts) utilizando reactivos suministrados con el kit
GenomeWalker. Se utilizaron los siguientes parámetros de ciclo: 7
ciclos de 94ºC durante 2 seg, luego 72ºC durante 3 min, seguido por
32 ciclos de 94ºC durante 2 seg y 67ºC durante 3 minutos.
Finalmente, las muestras se mantuvieron a 67ºC durante 4 min, luego
a 4ºC hasta posterior análisis. Tal como se describe en el Manual
del Usuario, el ADN de la primera ronda de PCR fue entonces diluido
y utilizado como una plantilla en una segunda ronda de PCR usando
sebador Clontech AP2 (secuencia
5'-actatagggcacgcgtggt-3'; SEQ ID
NO: 4) y sebador de especificidad génica (gsp)2 con la
siguiente secuencia:
| Secuencia metalotioneína gsp2: | 5'-agccgcagcttgatccgcagttgcaag-3' | (SEQ ID NO: 5). |
Los parámetros del ciclo para la segunda ronda
fueron: 5 ciclos de 94ºC durante 2 seg, luego 72ºC durante 3 min,
seguido por 20 ciclos de 94ºC durante 2 seg y 67ºC durante 3 min.
Finalmente, las muestras se mantuvieron a 67ºC durante 4 min y luego
se mantuvieron a 4ºC.
Aproximadamente 10 \mul de cada reacción
fueron corridos en un gel agarosa 0,8%, y se escinden bandas
(usualmente de 500 bp o más largas), se purificaron con el kit
Sephaglas BandPrep (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) y clonadas en
el vector TA pCR2.1 (Invitrogen, San Diego, California). Se
secuenciaron los clones para verificación y luego se diluyó el
mini-prep ADN 1:30 en agua y 1 \mul se amplificó
con gene-specific primer (gsp)3 (secuencia
más adelante) y el iniciador Clontech AP2 con los siguientes
parámetros de ciclo: cinco ciclos de 94ºC durante 2 seg, 46ºC
durante 30 seg, 72ºC durante min, (Víctor, en el original no dice
cuantos minutos), seguido de 20 ciclos de 94ºC durante 2 seg, 67ºC
durante 3 min, luego 67ºC durante 4 min y se mantuvo a 4ºC.
| Secuencia metalotioneína gsp3: | 5'-gaccatggtgtcgtgtggatccccttgtggtgc-3' | (SEQ ID NO: 6). |
Diez \mul del ADN resultante amplificado
fueron corridos en un gel de agarosa 0,8%, se purificaron con
Sephaglas y se clonaron en el vector PCR2.1 TA. La secuencia final
fue determinada sobre los plásmidos resultantes.
Un ensayo de expresión de gen transiente fue
utilizado para probar la actividad promotora del ADN clonado. El
promotor fue reclonado en el plásmido PHP3953 (Figura 1), digerido
con BGlll y Sphl o con Bglll y Pvull con el fin de remover al
promotor ubiquitina. El nuevo fragmento promotor fue insertado en
lugar del promotor ubiquitina de tal forma que la región 5' no
traducida de la ubiquitina y el intrón estuvieran ahora entre el
promotor de prueba y el gen reportero GUS.
Se realizaron experimentos con embriones
inmaduros, esencialmente la superficie escutelar. Embriones
inmaduros de maíz GS3 fueron aislados de orejas 9-11
días luego de la polinización utilizando un bisturí. Antes del
aislamiento del embrión, a los orejas polinizados se les esterilizó
la superficie con un microdetergente y 25% de mezcla blanqueadora
comercial, luego se lavaron con 3 intercambios de H_{2}O
esterilizada. Los embriones inmaduros aislados
(1,4-1,7 mm) fueron colocados sobre medio de
bombardeo y alineados en una malla blanco en preparación para
bombardeo.
Los embriones inmaduros fueron entonces
tranformados mediante el método biolístico de partículas de
tungsteno (Tomes et al. (1995) en Plant Cell, Tissue, and
Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg y Phillips
(Springer-Verlag, Berlin); Koziel et al.
(1993) Biol Technology 11: 194-200)
utilizando un sistema de suministro de partículas de alta presión
(Sistema de Suministro de Partículas Biolísticas Modelo
PDS-100 de Dupont). Se bombardeó sobre los embriones
inmaduros del maíz ADN plásmido que incluye la secuencia promotora
de la invención unido de forma operacional al gen de GUS. Luego de
incubación durante 40 horas, los embriones bombardeados fueron
teñidos con solución de tinción X-Gluc (McCabe et
al. (1988) Biol Technology 6 (87) :
923-926) durante 12 h a 37 C en la oscuridad. Se
midió entonces la actividad de GUS usando el promotor ubicuito como
un control, contando los puntos azules luego del teñido para la
actividad de GUS como se describe en otro trabajo (ver Jefferson
(1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387-405).
Los datos de la expresión transciente se muestran en la tabla 1.
| Gen | # de puntos azules | Promedio |
| Ubiquitina (control) | 395, 155, 307, 416 | 318 |
| met-1 (metalotioneína) | 163, 111, 27 | 100 |
La actividad promotora de la secuencia promotora
para el gen metalotioneína fue considerablemente inferior que la del
promotor ubiquitina, lo cual indica que este es un promotor
constitutivo débil.
Embriones inmaduros de maíz GS3 fueron
bombardeados con un plásmido que contenía la secuencia promotora
unida en forma operacional al gen GUS más un plásmido que contenía
el gen marcador seleccionable PAT (Wohlleben et al. (1988)
Gene 70: 25-37) que confiere resistencia al
herbicida Bialaphos. La transformación se realizó como se describe
en el ejemplo 1. Ver apéndice para ejemplos de bombardeo (560Y),
selección (560R), regeneración que contiene hormonas (288J) y medio
libre de hormonas (272V).
Un día luego del bombardeo los embriones fueron
transferidos del medio de bombardeo al medio de selección el cual
contenía 3 mg/litro de Biolaphos y fueron
sub-encubados en medio de selección cada 2 semanas.
Luego de aproximadamente 10 semanas de selección, los clones callos
resistentes a la selección fueron transferidos a un medio que
contenía hormonas con el fin de iniciar la regeneración de la
planta. Luego de la maduración somática del embrión
(2-4 semanas), embriones somáticos bien
desarrollados fueron transferidos a un medio para su germinación y
transferidos al cuarto de incubación iluminado. Aproximadamente
7-10 días después, las plántulas en desarrollo
fueron transferidas a un medio libre de hormonas en tubos durante
7-10 días hasta que las plántulas estuvieron bien
establecidas. Las plantas fueron entonces transferidas a insertos en
planos (equivalentes a materas de 2,5'') que contenían suelo de
matera y se dejaron crecer durante 1 semana en una cámara de
crecimiento, se dejaron crecer subsecuentemente durante
1-2 semanas adicionales en un invernadero y luego
fueron transplantadas a pots 600 clásicos (1,6 galones) y se dejaron
crecer hasta su madurez.
La actividad promotora en los tejidos vegetales
transformados fue evaluada midiendo la expresión de GUS. Muestras de
tejido vegetal fueron colocadas en los pozos de racimos de cultivo
de 12 pozos y se tiñeron con solución de tinción
X-Gluc durante 12 h a 37ºC en la oscuridad. A las
muestras entonces se les calificó la tinción de GUS. La calificación
de la tinción de GUS va desde 0 (negativo) hasta 6 (máximo). Estas
calificaciones de teñido sirvieron como una medición del nivel de
expresión de GUS. Los resultados se muestran en la Tabla 2.
Cuatro eventos de transformación han sido
evaluados para el promotor met-1. En general, tres
eventos tuvieron puntaje correspondiente a una expresión de GUS
fuerte y un evento a una expresión mediana. La expresión de GUS fue
hallada en todos los tejidos vegetales incluyendo hoja, raíz,
cáscara, seda y bellota, estos tejidos tuvieron puntajes en su
mayoría entre 4-5.
El promotor ubiquitina fue usado como control.
Cinco eventos de transformación han sido evaluados. En general, dos
eventos obtuvieron puntajes para la expresión de GUS fuerte y tres
para expresión débil. La expresión de GUS fue hallada en todos los
tejidos vegetales incluyendo hoja, raíz, cáscara, seda y bellota.
Con los eventos de transformación que exhibían expresión débil Gus
fue expresado en hoja, raíz y bellota, el puntaje de estos tejidos
estuvo en su mayoría entre 1 y 3. Se dio muy poca expresión de GUS
en los tejidos de cáscara y seda en aquellos eventos de
transformación que exhibían expresión débil.
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\newpage
\hskip1.3cm272 V
\hskip1.3cm288 J
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\hskip1.3cm560 R
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\hskip1.3cm560 Y
Todas las publicaciones y aplicaciones por
patente mencionadas en la especificación son indicativo del nivel de
aquellos expertos en el arte a quienes pertenece esta invención.
Aunque la actual invención ha sido descrita en
algún detalle a modo de ilustración y ejemplo para propósitos de
claridad de entendimiento, será obvio que ciertos cambios y
modificaciones pueden ser practicadas dentro de las reivindicaciones
anexas.
<110> Pioneer Hi-Bred
International, Inc.
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<120> Promotor de maíz
Met-1
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<130> N80441A
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<150> 60/076,075
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<151>
1998-02-26
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<160> 6
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<170> PatentIn Ver. 2.0
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<210> 1
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<212> ADN
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<213> Zea mays
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Sebador de PCR
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Sebador PCR para gen específico del maíz
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Sebador PCR para gen específico del maíz
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<212> ADN
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artificial: Sebador PCR para gen específico del maíz
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<212> ADN
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artificial: Sebador PCR para gen específico del maíz
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LISTADO DE LA
SECUENCIA
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International, Inc.
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Met-1
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1998-02-26
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<170> PatentIn Ver. 2.0
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<212> ADN
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artificial: Sebador PCR
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artificial: Sebador PCR para gen específico del maíz
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artificial: Sebador PCR para gen específico del maíz
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<212> ADN
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LISTA DE LA
SECUENCIA
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<110> Pioneer Hi-Bred
International, Inc.
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Met-1
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LISTADO DE LA
SECUENCIA
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<110> Pioneer Hi-Bred
International, Inc.
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<211> 1769
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 461
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 467
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 467
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 565
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Primer PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtaatacgac tcactatagg gc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Sebador PCR para gen específico del maíz
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcgggctcc tcctccgccg gcttctt
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial; Sebador PCR para gen específico del maíz
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtacttcttg ccgcacttgc agcttga
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial; Sebador PCR para gen específico del maíz
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtcttgtca ccgggcatct gaccatc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial; Sebador PCR para gen específico del maíz
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcctgtggt ggtcgacttg ccagagt
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial; Sebador PCR para gen específico del maíz
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttcttcctcc aggccttctg ctttcca
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial; Sebador PCR para gen específico del maíz
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggagacgac gacggcacgt tcacggc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial; Sebador PCR de gen específico del maíz
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaatcggtgc tgatgaaggg gtcgttc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<121> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial; Sebador PCR para gen específico del maíz
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactatagggc acgcgtggt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggcttcttc tcggccttgg gcgccat
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial; Sebador PCR para gen específico del maíz
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagccgcagct tgatccgcag ttgcaag
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sebador PCR para gen específico del maíz
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccagcacgc gtttccgacc tggatac
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial; Sebador PCR de gen específico del maíz
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggccaataa ccacaatgtt gatgtg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sebador PCR para gen específico del maíz
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcttgtgca tcgagtcacg cgagata
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<313> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial; Sebador PCR para gen específico del maíz
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaggctgtg gaggagaggg ccatggt
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sebador PCR para gen específico del maíz
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacccattgat cccgatcttg atct
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial; Sebador PCR para gen específico del maíz
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaccatggtg tcgtgtggat ccgatgcggc tgct
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sebador PCR para gen específico del maíz
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaccatggtg tcgtgtggat ccccttgtgg tgc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sebador PCR para gen específico del maíz
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaccatggtg tcgtgtggat ccggtgttgt tgaacg
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sebador PCR para gen específico del maíz
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaccatggtg tcgtgtggat ccgtgagatt gaac
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sebador PCR para gen específico del maíz
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaccatggtg tcgtcgtgtg gatccgtgaa gcttaa
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sebador PCR para gen específico del maíz
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaccatggtg tcgtgtggat ccgcctgctc cttgtc
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<121> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sebador PCR para gen específico del maíz
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaccatggtg tcgtgtggat cctgcactgc tac
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sebador PCR para gen específico del maíz
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaccatggtg tcgtgtggat ccacaaacac aagc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (13)
1. Una molécula aislada de
ácido nucleico con una secuencia para un promotor capaz de iniciar
la transcripción en una célula vegetal, donde dicha secuencia
nucleótida se selecciona de:
- a)
- Una secuencia nucleótida que incluye la secuencia notada en SEQ ID NO: 1;
- b)
- Una secuencia nucleótida depositada como Accesión ATCC No. 207120;
- c)
- Una secuencia nucleótida que incluye al menos 40 nucleótidos contiguos de la secuencia notada en SEQ ID No. 1;
- d)
- Una secuencia nucleótida que se hibrida bajo condiciones severas a una secuencia de a), b) o c); y
- e)
- Una secuencia nucleótida que tiene al menos 70% de la identidad de la secuencia notadas en a) o b).
2. Un constructo de ADN que
incluye una secuencia nucleótida de la reivindicación 1 unida en
forma operacional a una secuencia nucleótida heteróloga de
interés.
3. Un vector que incluye el
constructo de la reivindicación 2.
4. Una célula huésped que
tiene incorporado en su genoma el constructo de la reivindicación
2.
5. Un método de expresar en
forma constitutiva una secuencia nucleótido en una planta, dicho
método incluye el transformar una célula vegetal con un constructo
de ADN como se define en la reivindicación 2.
6. Un método de la
reivindicación 5, donde dicha planta es monocotiledónea o
dicotiledónea.
7. El método de la
reivindicación 6, donde dicha monocotiledónea es maíz.
8. Una célula vegetal
transformada en forma estable con un constructo de ADN como se
define en la reivindicación 2.
9. Una planta transformada en
forma estable con un constructo de ADN como se define en la
reivindicación 2.
10. Una célula vegetal de la
reivindicación 8 donde dicha célula vegetal es de una
monocotiledónea o de una dicotiledónea.
11. Una planta de la
reivindicación 9 donde dicha planta es monocotiledónea o
dicotiledónea
12. Una célula vegetal de la
reivindicación 10 o planta de la reivindicación 11, donde dicha
monocotiledónea es maíz.
13. Semilla de la planta de la
reivindicación 9, 11 o 12 incluyendo un constructo de ADN de la
reivindicación 2.
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