ES2566549T3

ES2566549T3 - Formulaciones estables de enzima degradante de hialuronano

Info

Publication number: ES2566549T3
Application number: ES12735366.2T
Authority: ES
Inventors: Tzung-Horng Yang; Michael James LABARRE; Daniel Edward VAUGHN; Christopher L. CASTER; Francois Nicol; Donghyun Kim
Original assignee: Halozyme Inc
Current assignee: Halozyme Inc
Priority date: 2011-06-17
Filing date: 2012-06-15
Publication date: 2016-04-13
Anticipated expiration: 2032-06-15
Also published as: WO2012174478A2; JP6224802B2; EA201400031A1; KR20140043438A; MX340172B; CA2839511C; IL229749A0; EP2720712B1; EA033472B1; JP2017036313A; AU2012271359A1; NZ717728A; MX2013014923A; JP2017197556A; KR101874401B1; WO2012174478A9; EP2720712A2; CN103974715A; JP2014518216A; CA2839511A1

Abstract

Una composición que comprende: una cantidad terapéuticamente eficaz de una hialuronidasa; y lisil lisina (Lys-Lys) en una cantidad suficiente para hacer que la hialuronidasa sea estable.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

imagen8

0,02 %; 0,025 %; 0,03 %; 0,035 %; 0,04 %; 0,045 %; 0,05 %; 0,055 %; 0,06 %; 0,065 %; 0,07 %; 0,08 % o 0,9 %. El tensioactivo puede seleccionarse de entre un propilenglicol, polietilenglicol, glicerina, sorbitol, poloxamer y polisorbato. En un ejemplo particular, el tensioactivo se selecciona de entre poloxamer 188, polisorbato 20 y polisorbato 80.

5 En algunos ejemplos, las composiciones proporcionadas que contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de una enzima degradante de hialuronano y lisil lisina (Lys-Lys) también contienen un antioxidante. Por ejemplo, las composiciones contienen un antioxidante que se selecciona de entre cisteína, triptófano y metionina. En un ejemplo particular, el antioxidante es metionina. En algunos ejemplos, el antioxidante está presente a una concentración de entre o desde aproximadamente entre 5 mM a 50 mM, 5 mM a 40 mM, 5 mM a 20 mM o 10 mM a 20 mM, incluidos. En otros ejemplos, el antioxidante está presente a una concentración que es o es de aproximadamente o es de al menos 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM o 50 mM.

En algunos ejemplos, las composiciones proporcionadas que contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de una

15 enzima degradante de hialuronano y lisil lisina (Lys-Lys) también contienen un modificador de la tonicidad para mantener la osmolaridad entre o aproximadamente entre 245 mOsm/kg a 500 mOsm/kg, incluidos. En algunos ejemplos, las composiciones contienen un modificador de la tonicidad para mantener la osmolaridad de la formulación a aproximadamente o a al menos aproximadamente 245 mOsm/kg, 250 mOsm/kg, 255 mOsm/kg, 260 mOsm/kg, 265 mOsm/kg, 270 mOsm/kg, 275 mOsm/kg, 280 mOsm/kg, 285 mOsm/kg, 290 mOsm/kg, 300 mOsm/kg, 350 mOsm/kg, 400 mOsm/kg, 450 mOsm/kg o 500 mOsm/kg. En algunos ejemplos, el modificador de la tonicidad se selecciona de entre glicerina, NaCl, aminoácidos, polialcoholes o trehalosa. En un ejemplo particular, el modificador de la tonicidad es NaCl y la concentración de NaCl es o es de aproximadamente 20 mM a 200 mM, 40 mM a 160 mM, 80 mM a 120 mM, 20 mM a 80 mM o 50 mM a 150 mM, incluidos. En otros ejemplos, el modificador de la tonicidad es NaCl y la concentración de NaCl es de 0 mM a 150 mM, 10 mM a 50 mM, 50 mM a 100 mM y 100

25 mM a 130 mM. En algunos ejemplos, el NaCl está a una concentración de menos de 150 mM, menos de 140 mM, menos de 130 mM, menos de 120 mM, menos de 110 mM, menos de 100 mM, menos de 90 mM, menos de 80 mM, menos de 70 mM, menos de 60 mM, menos de 50 mM, menos de 40 mM, menos de 30 mM, menos de 20 mM, menos de 10 mM, o menos.

Cualquiera de las composiciones proporcionadas que contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de una enzima degradante de hialuronano y lisil lisina (Lys-Lys) también pueden contener una cantidad suficiente de un agente tamponador para mantener el intervalo de pH a entre o aproximadamente entre 6,5 a 8,0, 6,8 a 7,8, o 7,0 a 7,6, 6,5 a 7,2, 6,8 a 7,4, incluidos. En algunos ejemplos, el agente tamponador se selecciona entre Tris, histidina, fosfato y citrato. En un ejemplo particular, el agente tamponador es un fosfato que es fosfato de sodio. En otro

35 ejemplo particular, el agente tamponador es Tris. En algunos ejemplos, la concentración del agente tamponador en las composiciones es de entre o es de entre aproximadamente 1 mM a 100 mM, 10 mM a 80 mM, 5 mM a 50 mM o 20 mM a 40 mM, incluidos.

La enzima degradante de hialuronano en cualquiera de las composiciones proporcionadas que contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de una enzima degradante de hialuronano y lisil lisina (Lys-Lys) es una hialuronidasa. En algunos ejemplos, la enzima degradante de hialuronano es una hialuronidasa que es activa a pH neutro. En algunos ejemplos, la enzima degradante de hialuronano carece de un anclaje de glucosilfosfatidilinositol (GPI) o no está asociado a membrana cuando se expresa a partir de una célula. En otros ejemplos, la enzima degradante de hialuronano es una enzima degradante de hialuronano que contiene truncamientos C-terminales de

45 uno o más restos de aminoácidos para eliminar la totalidad o parte de un anclaje de GPI.

En otros ejemplos de las composiciones proporcionadas, la enzima degradante de hialuronano es una hialuronidasa que es una PH20 o un fragmento truncado en C-terminal de la misma. En algunos ejemplos, la enzima degradante de hialuronano es una PH20 que es una PH20 humana o no humana. En algunos ejemplos, la PH20 tiene una secuencia de aminoácidos que contiene al menos los aminoácidos 36-464 de la SEQ ID NO: 1, o tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85 % con una secuencia de aminoácidos que contiene al menos los aminoácidos 36-464 de SEQ ID NO: 1 y retiene actividad de hialuronidasa. Por ejemplo, la PH20 tiene al menos un 86%, 87%; 88%; 89 %; 90%; 91%; 92%; 93%; 94%; 95%; 96%; 97%; 98 % o 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que contiene al menos los aminoácidos 55 36-464 de SEQ ID NO: 1 y retiene actividad de hialuronidasa. En algunos ejemplos de las composiciones, la enzima degradante de hialuronano es un polipéptido de PH20 que tiene una secuencia de aminoácidos que contiene un truncamiento C-terminal después de la posición de aminoácidos 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 o 500 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1, o es una variante del mismo que muestra una identidad de secuencia de al menos el 85 % con una secuencia de aminoácidos que contiene un truncamiento C-terminal después de la posición de aminoácidos 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 o 500 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 y retiene actividad de hialuronidasa. En ejemplos particulares, la enzima degradante de hialuronano es una PH20 truncada en C-terminal que tiene una

65 secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 4-9.

10

imagen9

imagen10

En algunos ejemplos, las composiciones se formulan para su administración usando una infusión subcutánea continua de insulina. También se proporciona en el presente documento una jeringuilla o vial que contiene cualquiera de las composiciones proporcionadas en el presente documento.

5 En el presente documento se describen composiciones que contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de una enzima degradante de hialuronano y MgCl2 en una cantidad suficiente de tal modo que la enzima degradante de hialuronano retiene al menos un 50 % de la actividad inicial de hialuronidasa durante al menos tres (3) días a 37 °C. En algunos ejemplos, las composiciones contienen MgCl2 a una concentración que es de entre o de aproximadamente entre 50 mM a 150 mM, 75 mM a 125 mM o 80 mM a 100 mM, incluidos. Por ejemplo, las composiciones contienen MgCl2 a una concentración que es al menos de o es de aproximadamente o es de 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM o 150 mM. En algunos ejemplos de las composiciones, la enzima degradante de hialuronano retiene al menos un 50 % de la actividad de hialuronidasa inicial a 37 °C durante al menos 4 días, 5 días, 6 días, una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses o más. Por ejemplo, la enzima degradante de

15 hialuronano retiene al menos un 50 % de la actividad inicial de hialuronidasa durante al menos un mes a 37 °C, tal como al menos un 60 %, 70 %; 75 %; 80 %; 85 %; 90 %; 95 % o más de la actividad de hialuronidasa inicial.

Las composiciones que contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de una enzima degradante de hialuronano y MgCl2 pueden tener un pH que es de entre o de aproximadamente entre 6,5 a 8,0, 6,5 a 7,4, 6,8 a 7,8, 7,0 a 7,6 o 6,8 a 7,2. En algunos ejemplos, el pH de la composición es o es de aproximadamente o de al menos 6,5 ± 0,2, 6,6 ± 0,2, 6,7 ± 0,2, 6,8 ± 0,2, 6,9 ± 0,2, 7,0 ± 0,2, 7,1 ± 0,2, 7,2 ± 0,2, 7,3 ± 0,2, 7,4 ± 0,2, 7,5 ± 0,2, 7,6 ± 0,2, 7,7 ± 0,2 o 7,8 ± 0,2. Las composiciones pueden contener además un agente estabilizante que se selecciona de entre un aminoácido, un derivado de aminoácido, una amina, un azúcar, un poliol, una sal y un tensioactivo. En algunos ejemplos, el agente estabilizante es un tensioactivo y la cantidad de tensioactivo, como un % de concentración en

25 masa (p/v) en la formulación, es de entre o aproximadamente entre el 0,0005 % al 1,0 %, del 0,0005 % al 0,005 %, del 0,001 % al 0,01 %, del 0,01 % al 0,5 %, del 0,01 % al 0,1 %, del 0,01 % al 0,05 % o del 0,01 % al 0,02 %, incluidos. Por ejemplo, el agente estabilizante es un tensioactivo y la cantidad de tensioactivo, como un % de concentración en masa (p/v) en la formulación, es o es de aproximadamente o de al menos el 0,001 %, 0,005 %; 0,01 %; 0,015 %; 0,02 %; 0,025 %; 0,03 %; 0,035 %; 0,04 %; 0,045 %; 0,05 %; 0,055 %; 0,06 %; 0,065 %; 0,07 %; 0,08 % o 0,9 %. En algunos ejemplos, el tensioactivo se selecciona de entre un propilenglicol, polietilenglicol, glicerina, sorbitol, poloxamer y polisorbato. En ejemplos particulares, el tensioactivo se selecciona de entre poloxamer 188, polisorbato 20 y polisorbato 80.

En algunos ejemplos, las composiciones que contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de enzima degradante

35 de hialuronano y MgCl2 contienen un antioxidante que se selecciona de entre cisteína, triptófano y metionina. En ejemplos particulares, el antioxidante es metionina. En algunos ejemplos, el antioxidante se encuentra a una concentración de entre o desde aproximadamente entre 5 mM a 50 mM, 5 mM a 40 mM, 5 mM a 20 mM o 10 mM a 20 mM, incluidos. Por ejemplo, el antioxidante es metionina y la concentración es o es de aproximadamente o es de al menos 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM o 50 mM.

En algunos ejemplos, las composiciones contienen una cantidad suficiente de un agente tamponador para mantener el intervalo de pH a entre o entre aproximadamente 6,5 a 8,0, 6,8 a 7,8, 7,0 a 7,6, 6,5 a 7,2 o 6,8 a 7,4. En algunos ejemplos, el agente tamponador se selecciona entre Tris, histidina, fosfato y citrato. En un ejemplo particular, el agente tamponador es clorhidrato de histidina. La concentración del agente tamponador en las composiciones puede

45 ser de entre o entre aproximadamente 1 mM a 100 mM, 10 mM a 80 mM, 5 mM a 50 mM o 20 mM a 40 mM.

En algunos ejemplos, las composiciones que contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de una enzima degradante de hialuronano y MgCl2 contienen una enzima degradante de hialuronano que es una hialuronidasa o una condroitinasa. En algunos ejemplos, la enzima degradante de hialuronano es una hialuronidasa que es activa a pH neutro. En otros ejemplos, la enzima degradante de hialuronano carece de un anclaje de glucosilfosfatidilinositol (GPI) o no está asociado a membrana cuando se expresa a partir de una célula. Por ejemplo, la enzima degradante de hialuronano es una enzima degradante de hialuronano que contiene truncamientos C-terminales de uno o más restos de aminoácidos para eliminar la totalidad o parte de un anclaje de GPI.

55 En otros ejemplos, la enzima degradante de hialuronano es una hialuronidasa que es una PH20 o un fragmento truncado en C-terminal de la misma. La PH20 puede ser una PH20 humana o no humana. En algunos ejemplos de las composiciones, la PH20 tiene una secuencia de aminoácidos que contiene al menos los aminoácidos 36-464 de la SEQ ID NO: 1, o tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85 % con una secuencia de aminoácidos que contiene al menos los aminoácidos 36-464 de SEQ ID NO: 1 y retiene actividad de hialuronidasa. Por ejemplo, la PH20 tiene al menos un 86 %, 87 %; 88 %; 89 %; 90 %; 91 %; 92 %; 93 %; 94 %; 95 %; 96 %; 97 %; 98 % o 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que contiene al menos los aminoácidos 36-464 de SEQ ID NO: 1 y retiene actividad de hialuronidasa. En otros ejemplos, el polipéptido PH20 tiene una secuencia de aminoácidos que contiene un truncamiento C-terminal después de la posición de aminoácidos 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482,

65 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 o 500 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1, o es una variante del mismo que muestra una identidad de secuencia de

13

al menos el 85 % con una secuencia de aminoácidos que contiene un truncamiento C-terminal después de la posición de aminoácidos 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 o 500 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 y retiene actividad de hialuronidasa. En ejemplos particulares, la enzima

5 degradante de hialuronano es una PH20 truncada en C-terminal que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 4-9.

En algunos ejemplos, las composiciones que contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de una enzima degradante de hialuronano y MgCl2 contienen una enzima degradante de hialuronano en una cantidad que es de entre o entre aproximadamente 10 U/ml a 5000 U/ml, 50 U/ml a 4000 U/ml, 100 U/ml a 2000 U/ml, 300 U/ml a 2000 U/ml, 600 U/ml a 2000 U/ml, 100 U/ml a 1000 U/ml, 200 U/ml a 800 U/ml, 100 U/ml a 500 U/ml, o 150 U/ml a 300 U/ml, incluidos. Por ejemplo, las composiciones contienen una enzima degradante de hialuronano en una cantidad que es de al menos o es de aproximadamente o es de 30 U/ml, 35 U/ml, 40 U/ml, 45 U/ml, 50 U/ml, 55 U/ml, 60 U/ml, 65 U/ml, 70 U/ml, 75 U/ml, 80 U/ml, 85 U/ml, 90 U/ml, 95 U/ml, 100 U/ml, 105 U/ml, 110 U/ml, 115 U/ml, 120

15 U/ml, 125 U/ml, 130 U/ml, 135 U/ml, 140 U/ml, 145 U/ml, 150 U/ml, 155 U/ml, 160 U/ml, 170 U/ml, 180 U/ml, 190 U/ml, 200 U/ml, 250 U/ml, 300 U/ml, 350 U/ml, 400 U/ml, 450 U/ml, 500 U/ml, 600 U/ml, 700 U/ml, 800 U/ml, 900 U/ml, 1000 U/ml o 2000 U/ml.

En el presente documento se describen composiciones que contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de una enzima degradante de hialuronano y MgCl2 en donde el pH de la composición es de entre o entre aproximadamente 6,5 a 7,2 y la composición contiene una enzima degradante de hialuronano en una cantidad que es de entre o entre aproximadamente 100 U/ml a 500 U/ml, incluidos; MgCl2 a una concentración que es de entre o de aproximadamente entre 50 mM a 150 mM, incluidos; un tensioactivo que es polisorbato 80 a un porcentaje (%) de concentración en masa (p/v) de entre o aproximadamente entre el 0,01 % al 0,05 %, incluidos; metionina a una

25 concentración que es de entre o de aproximadamente entre 5 mM a 20 mM, incluidos; e histidina/HCl a una concentración que es de entre o de aproximadamente entre 5 mM a 50 mM, incluidos.

En algunos ejemplos, el volumen de las composiciones es de entre o aproximadamente entre 0,5 ml a 50 ml, 1 ml a 40 ml, 1 ml a 20 ml, 1 ml a 10 ml, o 3 ml a 10 ml, incluidos. Las composiciones pueden formularse para su administración usando un vial, jeringa, bolígrafo, reservorio para una bomba o un sistema de bucle cerrado. También se describe en el presente documento una jeringuilla o vial que contiene cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento.

Las composiciones descritas en el presente documento que contienen una insulina, tal como una insulina regular o

35 un análogo de insulina de acción rápida (por ejemplo, aspart, lispro o glulisina u otro análogo de insulina), pueden usarse en métodos y usos para tratar la diabetes. Por ejemplo, en el presente documento se describen métodos para tratar la diabetes mediante la administración a un sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de las composiciones estables proporcionadas en el presente documento. La diabetes que se va a tratar incluye diabetes mellitus de tipo 1, diabetes mellitus de tipo 2 o diabetes gestacional. También se describen en el presente documento métodos para controlar los niveles de glucosa en sangre en un sujeto mediante la administración a un sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición estable proporcionada en el presente documento que contiene una insulina de acción rápida. En la práctica de los métodos del presente documento, las composiciones estables se administran por vía subcutánea o intraperitoneal, por ejemplo, mediante una jeringuilla o bolígrafo de insulina o mediante infusión subcutánea continua. En la práctica de los métodos del presente

45 documento, las composiciones pueden administrarse antes de una comida como terapia de insulina prandial. En los métodos, las composiciones estables pueden administrarse usando un método de administración para lograr la infusión de insulina subcutánea continua, tal como mediante una bomba de insulina o un sistema de bucle cerrado. En algunos casos, los métodos incluyen administrar otro fármaco contra la diabetes, que se selecciona de entre, pero sin limitación, sulfonilureas, biguanidas, meglitinidas, tiazolidindionas, inhibidores de alfa-glucosidasa, análogos peptídicos, incluyendo análogos del péptido similar a glucagón (GLP) y análogos del péptido inhibidor gástrico (GIP) e inhibidores de DPP-4.

Descripción detallada

55 A. Definiciones

B. FORMULACIONES DE ENZIMA DEGRADANTE DE HIALURONANO Y GENERACIÓN DE COFORMULACIONES DE INSULINA

1.: Formulaciones de enzima degradante de hialuronano

2.: Formulaciones de insulina de acción rápida

3.: Coformulaciones de enzima degradante de hialuronano e insulina

a. Requisitos de estabilidad opuestos

65 i. Conservantes

ii. NaCl y pH

14 5

15

25

35

45

55

65

b. Coformulación compatible

C. ENZIMAS DEGRADANTES DE HIALURONANO

1. Hialuronidasas

a.: Hialuronidasas PH20 de tipo mamífero

b.: Hialuronidasas bacterianas

c.: Hialuronidasas de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos

2. Enzimas degradantes de hialuronano truncadas u otras formas solubles

a.: PH20 humana truncada en C-terminal

b.: rHuPH20

3.: Glucosilación de enzimas degradantes de hialuronano

4.: Modificaciones de enzimas degradantes de hialuronano para mejorar sus propiedades farmacocinéticas

D. FORMULACIONES DE ENZIMA DEGRADANTE DE HIALURONANO ESTABLES

1.: Enzima degradante de hialuronano

2.: Catión divalente

3.: pH y tampón

4.: Tensioactivo

5.: Agente antioxidante

6.: Modificador de la tonicidad

7.: Otros agentes o excipientes

8.: Formulaciones de enzima degradante de hialuronano estables ejemplares

E. POLIPÉPTIDOS DE INSULINA Insulinas de acción rápida

a.: Insulina regular

b.: Análogos de acción rápida (también denominados insulinas de acción rápida)

i. Insulina Lispro

ii. Insulina Aspart

iii. Insulina Glulisina

F. COFORMULACIONES ESTABLES DE INSULINA Y ENZIMA DEGRADANTE DE HIALURONANO

1. Componentes de coformulaciones estables

a.: Insulina de acción rápida

b.: Enzima degradante de hialuronano

c.: Conservante

d.: NaCl

e.: pH

f.: Tampón

g.: Lys-Lys

h.: Excipientes o estabilizantes adicionales ejemplares

i. Tensioactivos

ii. Modificador de la tonicidad

iii. Glicerina

iv.: Antioxidantes

v.: Cinc

vi. Estabilizador de aminoácidos

vii. Inhibidor de hialuronidasa

viii. Compuesto nicotínico

ix. Otros excipientes o agentes

2. Coformulaciones estables ejemplares

15

a.: Coformulaciones de inyección multidosis (MDI) ejemplares

b.: Coformulaciones de infusión de insulina subcutánea continua (CSII) ejemplares

c.: Coformulaciones de Lys-Lys ejemplares

5 G. DOSIFICACIÓN Y ADMINISTRACIÓN Modo de administración

a.: Jeringuillas

b.: Bolígrafo de insulina

c.: Bombas de insulina y otros dispositivos de administración de insulina

d.: Sistemas de bomba de infusión continua

i. Sistemas de bucle abierto

ii. Sistemas de bucle cerrado

15

H. MÉTODOS PARA PRODUCIR ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN UNA INSULINA O UNA ENZIMA DEGRADANTE DE HIALURONANO Y POLIPÉPTIDOS DE LOS MISMOS

1.: Vectores y células

2.: Restos enlazadores

3.: Expresión

a. Células procariotas

b. Células de levadura 25 c. Células de insecto

d.: Células de mamífero

e.: Plantas

4. Técnicas de purificación

I. MÉTODOS PARA EVALUAR LA ESTABILIDAD Y LA ACTIVIDAD

1.: Insulina

2.: Enzimas degradantes de hialuronano

35

J. USOS TERAPÉUTICOS

1. Diabetes mellitus

a.: Diabetes de tipo 1

b.: Diabetes de tipo 2

c.: Diabetes gestacional

2. Terapia de insulina para pacientes críticos

45

K. TERAPIAS DE COMBINACIÓN

L. ARTÍCULOS DE FABRICACIÓN Y KITS

M. EJEMPLOS

A. DEFINICIONES

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado entendido de manera común por un experto en la materia a la que pertenece la invención. En caso de que haya una diversidad de definiciones para los términos en el presente documento,

55 prevalecerán aquellas en esta sección. En los casos donde se hace referencia a una URL u otro identificador o dirección similar, se entiende que dichos identificadores pueden cambiar y que la información concreta en internet puede aparecer y desaparecer, pero se conoce información equivalente y puede accederse a ella fácilmente, tal como efectuando una búsqueda en internet y/o en bases de datos adecuadas. La referencia a las mismas evidencia la disponibilidad y diseminación pública de dicha información.

Tal como se usa en el presente documento, "insulina" se refiere a una hormona, precursor o un análogo sintético o recombinante que actúa para aumentar la captación y almacenamiento de glucosa y/o reducir la producción de glucosa endógena. Una insulina humana ejemplar se traduce como un polipéptido precursor de 110 aminoácidos, preproinsulina (SEQ ID NO: 101), que contiene un péptido de señal de 24 aminoácidos que dirige la proteína al 65 retículo endoplasmático (ER) en donde se escinde la secuencia de señal, dando como resultado proinsulina (SEQ ID NO: 102). La proinsulina se procesa adicionalmente para liberar el péptido C-terminal o de cadena conectora de 31

16

imagen11

Tal como se usa en el presente documento, las insulinas humanas de acción rápida o las composiciones de insulina humana de acción rápida incluyen cualquier insulina o composición de una insulina humana que es de acción rápida, pero excluye a las insulinas no humanas, tales como a la insulina regular de cerdo.

5 Tal como se usa en el presente documento, las expresiones "insulinas de acción basal" o "insulinas basales" se refieren a insulinas administradas para mantener un nivel de insulina basal como parte de un régimen de tratamiento general para tratar una afección crónica, tal como la diabetes. Típicamente, se formula una insulina de acción basal para mantener un nivel de insulina aproximadamente de estado estacionario mediante la liberación controlada de insulina cuando se administra de manera periódica (por ejemplo, una o dos veces al día). Las insulinas de acción basal incluyen insulinas cristalinas (por ejemplo, NPH y Lente®, insulina protamina, insulina sulfen), análogos de insulina basal (insulina glargina, HOE 901, NovoSol Basal) y otras formulaciones químicas de insulina (por ejemplo, suspensiones de goma arábiga, lecitina o aceite) que retrasan la velocidad de absorción de la insulina regular. Tal como se usa en el presente documento, las insulinas de acción basal pueden incluir insulinas que se entienden típicamente como de larga acción (típicamente alcanzando un pico de concentración relativamente bajo, a la vez que

15 tiene una duración máxima de la acción de más de aproximadamente 20-30 horas) o de acción inmediata (provocando típicamente picos de concentraciones de insulina aproximadamente a las 4-12 horas después de la administración).

Tal como se usa en el presente documento, las expresiones "afección hiperglucémica" o "hiperglucemia" se refieren a una elevación no deseada de la glucosa en sangre.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "afección hipoglucémica" o "hipoglucemia" se refiere a un descenso no deseado de la glucosa en sangre.

25 Tal como se usa en el presente documento, el control glucémico o "control de los niveles de glucosa en sangre" se refiere al mantenimiento de las concentraciones de glucosa en sangre a un nivel deseado, típicamente entre 70130 mg/dl o 90-110 mg/dl.

Tal como se usa en el presente documento, un sistema de bucle cerrado es un sistema integrado para proporcionar control glucémico continuo. Los sistemas de bucle cerrado contienen un mecanismo para medir la glucosa en sangre, un mecanismo para administrar una o más composiciones, incluyendo una composición de insulina, y un mecanismo para determinar la cantidad necesaria de insulina a administrar para lograr el control glucémico. Típicamente, por lo tanto, los sistemas de bucle cerrado contienen un sensor de glucosa, un dispositivo de administración de insulina, tal como una bomba de insulina, y un controlador que recibe información del sensor de

35 glucosa y proporciona órdenes al dispositivo de administración de insulina. Las órdenes pueden generarse mediante un programa informático en el controlador. El programa informático incluye un algoritmo para determinar la cantidad de insulina que hay que administrar para lograr el control glucémico, basándose en los niveles de glucosa en sangre detectados por el sensor de glucosa o anticipados por el usuario. Un sistema de bucle abierto se refiere a dispositivos similares, excepto en que los dispositivos no miden y responden de manera automática a los niveles de glucosa.

Tal como se usa en el presente documento, la pauta de dosificación se refiere a la cantidad de insulina administrada y a la frecuencia de administración. La pauta de dosificación es una función de la enfermedad o afección que se va a tratar, y por lo tanto puede variar.

45 Tal como se usa en el presente documento, una enzima degradante de hialuronano se refiere a una enzima que cataliza la escisión de un polímero de hialuronano (también citado como ácido hialurónico o HA) en fragmentos de menor peso molecular. Los ejemplos de enzimas degradantes de hialuronano ejemplares son hialuronidasas, y condroitinasas y liasas particulares que tienen la capacidad de despolimerizar el hialuronano. Las condroitinasas ejemplares que son enzimas degradantes de hialuronano incluyen, pero sin limitación, condroitin ABC liasa (también conocida como condroitinasa ABC), condroitin AC liasa (también conocida como condroitin AC liasa (también conocida como sulfato liasa o condroitin sulfato eliminasa) y condroitina C liasa. La condroitin ABC liasa contiene dos enzimas, condroitin-sulfato-ABC endoliasa (EC 4.2.2.20) y condroitin-sulfato-ABC exoliasa (EC 4.2.2.21). Las condroitin-sulfato-ABC endoliasas y condroitin-sulfato-ABC exoliasas incluyen, pero sin limitación, aquellas de

55 Proteus vulgaris y Flavobacterium heparinum (la condroitin-sulfato-ABC endoliasa de Proteus vulgaris se expone en la SEQ ID NO: 98; Sato et al. (1994) Appl. Microbial. Biotechnol. 41(1):39-46). Las enzimas condroitinasa AC ejemplares de bacterias incluyen, pero sin limitación, aquellas de Flavobacterium heparinum, expuestas en las SEQ ID NO: 99, Victivallis vadensis, expuestas en las SEQ ID NO: 100 y Arthrobacter aurescens (Tkalec et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35; Ernst et al. (1995) Critical Reviews in Biochemistiy and Molecular Biology 30(5):387-444). Las enzimas condroitinasa C ejemplares de bacterias incluyen, pero sin limitación, aquellas de Streptococcus y Flavobacterium (Hibi et al. (1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4; Michelacci et al. (1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8; Tsuda et al. (1999) Eur. J. Biochem. 262:127-133).

Tal como se usa en el presente documento, la hialuronidasa se refiere a una clase de enzimas degradantes de

65 hialuronano. Las hialuronidasas incluyen hialuronidasas bacterianas (EC 4.2.2.1 o EC 4.2.99.1), hialuronidasas de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos (EC 3.2.1.36), e hialuronidasas de tipo humano (EC 3.2.1.35). Las

18

hialuronidasas incluyen también cualquiera de origen no humano, incluyendo, pero sin limitación, murino, caninas, felinas, leporinas, aviares, bovino, ovino, porcinas, equinas, de peces, de ranas, bacterianas, y cualquiera de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos. Las hialuronidasas no humanas ejemplares incluyen, hialuronidasas de vaca (SEQ ID NO: 10, 11, 64 y BH55 (Patentes de Estados Unidos n.º 5.747.027 y 5.827.721), avispa de chaqueta 5 amarilla (SEQ ID NO: 12 y 13), abeja melífera (SEQ ID NO: 14), avispa de cabeza blanca (SEQ ID NO: 15), avispa papelera (SEQ ID NO: 16), ratón (SEQ ID NO: 17-19, 32), cerdo (SEQ ID NO: 20-21), rata (SEQ ID NO: 22-24, 31), de conejo (SEQ ID NO: 25), oveja (SEQ ID NO: 26, 27, 63 y 65), orangután (SEQ ID NO: 28), mono cinomolgo (SEQ ID NO: 29), cobaya (SEQ ID NO: 30), de chimpancé (SEQ ID NO: 185), mono rhesus (SEQ ID NO: 186), Arthrobacter sp. (cepa FB24) (SEQ ID NO: 67), Bdellovibrio bacteriovorus (SEQ ID NO: 68), Propionibacterium acnes (SEQ ID NO: 69), Streptococcus agalactiae (SEQ ID NO: 70) 18RS21 (SEQ ID NO: 71); serotipo Ia (SEQ ID NO: 72); serotipo III (SEQ ID NO: 73), Staphylococcus aureus (cepa COL) (SEQ ID NO: 74); cepa MRSA252 (SEQ ID NO: 75 y 76); cepa MSSA476 (SEQ ID NO: 77); cepa NCTC 8325 (SEQ ID NO: 78); cepa bovina RF122 (SEQ ID NO: 79 y 80); cepa USA300 (SEQ ID NO: 81), Streptococcus pneumoniae (SEQ ID NO: 82); cepa ATCC BAA-255 / R6 (SEQ ID NO: 83); serotipo 2, cepa D39 / NCTC 7466 (SEQ ID NO: 84), Streptococcus pyogenes (serotipo M1) 15 (SEQ ID NO: 85); serotipo M2, cepa MGAS10270 (SEQ ID NO: 86); serotipo M4, cepa MGAS10750 (SEQ ID NO: 87); serotipo M6 (SEQ ID NO: 88); serotipo M12, cepa MGAS2096 (SEQ ID NO: 89 y 90); serotipo M12, cepa MGAS9429 (SEQ ID NO: 91); serotipo M28 (SEQ ID NO: 92); Streptococcus suis (SEQ ID NO: 93-95); Vibrio fischeri (cepa ATCC 700601/ ES114 (SEQ ID NO: 96)), y la enzima hialuronidasa de Streptomyces hyaluronolyticus, que es específica para el ácido hialurónico y no escinde a la condroitina o el sulfato de condroitina (Ohya, T. y Kaneko, Y. (1970) Biochim. Biophys. Acta 198:607). Las hialuronidasas también incluyen aquellas de origen humano. Las hialuronidasas humanas ejemplares incluyen HYAL1 (SEQ ID NO: 36), HYAL2 (SEQ ID NO: 37), HYAL3 (SEQ ID NO: 38), HYAL4 (SEQ ID NO: 39), y PH20 (SEQ ID NO: 1). Entre las hialuronidasas también se incluyen hialuronidasas solubles, incluyendo, PH20 ovina o bovina, PH20 humana soluble y rHuPH20 soluble. Los ejemplos de hialuronidasas bovinas u ovinas solubles comercialmente disponible incluyen Vitrase® (hialuronidasa ovina) y

25 Amphadase® (hialuronidasa bovina).

La referencia a la enzima degradante de hialuronano, hialuronidasa o PH20 incluye polipéptidos precursores de enzima degradante de hialuronano y polipéptidos maduros de enzima degradante de hialuronano (tales como aquellos en los que se ha eliminado la secuencia de señal), formas truncadas de los mismos que tienen actividad(por ejemplo, formas truncadas en C-terminal), e incluye variantes alélicas y variantes de especie, variantes codificadas por variantes de corte y empalme, y otras variantes, incluyendo polipéptidos que tienen al menos un 40%, 45%; 50%; 55%; 60%; 65%; 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; 95%; 96%; 97%; 98%; 99% o más identidad de secuencia con los polipéptidos precursores expuestos en las SEQ ID NO: 1 y 10-48, 63-65, 67-100, o la forma madura de los mismos. Por ejemplo, la referencia a una enzima degradante de hialuronano (por ejemplo,

35 PH20) incluye la PH20 humana madura expuesta en la SEQ ID NO: y formas truncadas de la misma que tengan actividad, e incluye variantes alélicas y variantes de especie, variantes codificadas por variantes de corte y empalme y otras variantes, incluyendo polipéptidos que tienen al menos un 40 %, 45 %; 50 %; 55 %; 60 %; 65 %; 70 %; 75 %; 80 %; 85 %; 90 %; 95 %; 96 %; 97 %; 98 %; 99 % o más identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2. Por ejemplo, la referencia a la enzima degradante de hialuronano también incluye variantes del polipéptido precursor de PH20 expuestas en las SEQ ID NO: 50-51. Las enzimas degradantes de hialuronano también incluyen aquellas que contienen modificaciones químicas o postraduccionales y aquellas que no contienen modificaciones químicas o postraduccionales. Dichas modificaciones incluyen, pero sin limitación, pegilación, albuminación, glucosilación, farnesilación, carboxilación, hidroxilación, fosforilación, y otras modificaciones de polipéptidos conocidas en la técnica.

45 Tal como se usa en el presente documento, PH20 se refiere a un tipo de hialuronidasa que sucede en el esperma y es neutra-activa. PH-20 aparece en la superficie del esperma, y en el acrosoma derivado de lisosomas, donde se une a la membrana acrosómica interna. PH20 incluye aquellas de cualquier origen incluyendo, pero sin limitación, humanos, chimpancé, mono cinomolgo, mono rhesus, murino, bovino, ovino, cobaya, conejo y rata. Las proteínas PH20 ejemplares incluyen, pero sin limitación, PH20 humana (polipéptido precursor expuesto en la SEQ ID NO: 1, polipéptido maduro expuesto en la SEQ ID NO: 2), bovina (SEQ ID NO: 11 y 64), de conejo (SEQ ID NO: 25), ovina (SEQ ID NO: 27, 63 y 65), polipéptidos de PH20 de mono cinomolgo (SEQ ID NO: 29), cobaya (SEQ ID NO: 30), de rata (SEQ ID NO: 31), de ratón (SEQ ID NO: 32), de chimpancé (SEQ ID NO: 185) y de mono rhesus (SEQ ID NO: 186). La referencia a PH20 incluye polipéptidos de PH20 precursores y polipéptidos de PH20 maduros (tales como

55 aquellos en los que se ha eliminado una secuencia de señal), formas truncadas de los mismos que tienen actividad, e incluye variantes alélicas y variantes de especie, variantes codificadas por variantes de corte y empalme, y otras variantes, incluyendo polipéptidos que tienen al menos un 40 %, 45 %; 50 %; 55 %; 65 %; 70 %; 75 %; 80 %; 85 %; 90 %; 95 %; 96 %; 97 %; 98 %; 99 % o más identidad de secuencia con los polipéptidos precursores expuestos en las SEQ ID NO: 1, 10, 25, 27, 30-31, 63-65, 185-186, o las formas maduras de los mismos. Los polipéptidos de PH20 también incluyen aquellos que contienen modificaciones químicas o postraduccionales y aquellas que no contienen modificaciones químicas o postraduccionales. Dichas modificaciones incluyen, pero sin limitación, PEGilación, albuminación, glucosilación, farnesilación, carboxilación, hidroxilación, fosforilación, y otras modificaciones de polipéptidos conocidas en la técnica. Los ejemplos de hialuronidasas bovinas u ovinas solubles comercialmente disponible incluyen hialuronidasa Vitrase® (hialuronidasa ovina) e hialuronidasa Amphadase®

65 (hialuronidasa bovina).

19

Tal como se usa en el presente documento, una hialuronidasa soluble se refiere a un polipéptido que se secreta de células y no está anclado o asociado a membrana, y por lo tanto puede caracterizarse por su solubilidad en condiciones fisiológicas. Las hialuronidasas solubles pueden distinguirse, por ejemplo, por su reparto en la fase acuosa de una solución de Triton X-114 calentada a 37 °C (Bordier et al., (1981) J. Biol. Chem., 256:1604-7). Las 5 hialuronidasas ancladas a membrana, tal como ancladas a lípidos, se repartirán en la fase rica en detergente, pero se repartirán en la fase pobre en detergente o acuosa después de tratamiento con fosfolipasa C. Entre las hialuronidasas solubles se incluyen hialuronidasas ancladas a membrana en las que se eliminan o modifican una o más regiones asociadas con el anclaje de la hialuronidasa a la membrana, en donde la forma soluble retiene la actividad de hialuronidasa. De este modo, la hialuronidasa soluble, tales como polipéptidos de PH20 solubles, incluyen formas truncadas de los mismos, por ejemplo, formas truncadas en C-terminal en las que están ausentes uno o más aminoácidos del anclaje de glucosil-fosfatidilinositol (GPI). Las hialuronidasas solubles incluyen hialuronidasas solubles recombinantes y aquellas contenidas en o purificadas a partir de fuentes naturales, tales como, por ejemplo, extractos de testículo de ovejas o vacas. Los ejemplos de dichas hialuronidasas solubles son PH20 humana soluble. Otras hialuronidasas solubles incluyen PH20 ovinas (SEQ ID NO: 27, 63, 65) y bovinas (SEQ

15 ID NO: 11, 64).

Tal como se usa en el presente documento, PH20 humana soluble o sHuPH20 incluyen polipéptidos de PH20 maduros que carecen de la totalidad o una parte del sitio de unión de glucosilfosfatidilinositol (GPI) en el extremo Cterminal, de tal forma que tras la expresión, los polipéptidos no se asocian con la membrana de una célula hospedadora en la que se producen de tal forma que se secretan y, por lo tanto, son solubles en el medio de cultivo celular. De este modo, PH20 humana soluble incluye polipéptidos de PH20 humana truncados en C-terminal. Los polipéptidos de PH20 solubles o truncados en C-terminal ejemplares incluyen polipéptidos maduros que tienen una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 4-9, 47-48, 234-254, y 267-273, o un polipéptido que muestra al menos un 70 %, 75 %; 80 %; 85 %; 86 %; 87 %; 88 %; 89 %; 90 %; 91 %; 92 %; 93 %;

25 94 %; 95 %; 96 %; 97 %; 98 %; 99 % o más identidad de secuencia con una cualquiera de las SEQ ID NO: 4-9, 4748, 234-254, y 267-273. Los polipéptidos de sHuPH20 ejemplares incluyen polipéptidos maduros que tienen una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 4-9 y 47-48. Los polipéptidos precursores para dichos polipéptidos de sHuPH20 ejemplares incluyen una secuencia de señal. Los ejemplos de los precursores son aquellos expuestos en las SEQ ID NO: 3 y 40-46, cada uno de los cuales contiene una secuencia de señal de 35 aminoácidos en las posiciones de aminoácido 1-35. Los polipéptidos de HuPH20 solubles también incluyen aquellos que se degradan durante o después de los métodos de producción y purificación descritos en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, una PH20 humana recombinante citada como rHuPH20 se refiere a una

35 forma soluble secretada de PH20 humana que se expresa de manera recombinante en células de ovario de hámster chino (CHO). rHuPH20 soluble es el producto producido por el ácido nucleico que codifica una secuencia de señal, tal como la secuencia de señal nativa, e incluye ácido nucleico que codifica los aminoácidos 36-482 y para los que una secuencia ejemplar, incluyendo el ácido nucleico que codifica la secuencia de señal nativa se expone en la SEQ ID NO: 49. También se incluyen moléculas de ADN que son variantes alélicas de los mismos y otras variantes solubles. El ácido nucleico que codifica rHuPH20 soluble se expresa en células CHO, que secretan el polipéptido maduro. Ya que se produce en el medio de cultivo, existe heterogeneidad en el extremo C-terminal de tal forma que el producto incluye una mezcla de especies que pueden incluir una cualquiera o más de las SEQ ID NO: 4-9 en diversas abundancias. Se incluyen también variantes alélicas correspondientes y otras variantes, incluyendo aquellas correspondientes a los polipéptidos precursores de PH20 humano expuestos en las SEQ ID NO: 50-51.

45 Otras variantes pueden tener un 60 %, 70 %; 80 %; 85 %; 90 %; 91 %; 92 %; 93 %; 94 %; 95 %; 96 %; 97 %; 98 %; 99 % o más identidad de secuencia con una cualquiera de las SEQ ID NO: 4-9 y 47-48 en tanto que retengan actividad de hialuronidasa y sean solubles.

Tal como se usa en el presente documento, "composición de insulina de acción súper rápida" se refiere a una composición de insulina que contiene una insulina de acción rápida, particularmente un análogo de insulina de acción rápida, tal como un análogo de insulina con una insulina de acción más rápida, y una enzima degradante de hialuronano (tal como, pero sin limitación, preparaciones de rHuPH20), de tal forma que la composición de insulina, durante los primeros cuarenta minutos después de la administración parenteral a un sujeto, proporciona una exposición a insulina sistémica acumulativa en el sujeto que es mayor que la exposición a insulina sistémica

55 acumulativa proporcionada al sujeto durante el mismo periodo después de administrar la misma dosificación de insulina de acción rápida, a través de la misma ruta, en ausencia de la enzima degradante de hialuronano. La composición de insulina de acción súper rápida puede incluir opcionalmente una insulina de acción basal.

Tal como se usa en el presente documento, una formulación se refiere a una composición que contiene al menos un agente activo o farmacéutico y uno o más excipientes.

Tal como se usa en el presente documento, una coformulación se refiere a una composición que contiene dos o más agentes activos o farmacéuticos y uno o más excipientes. Por ejemplo, una coformulación de una insulina de acción rápida y una enzima degradante de hialuronano contiene una insulina de acción rápida, una enzima degradante de

65 hialuronano, y uno o más excipientes.

20

Tal como se usa en el presente documento, se dice que una composición es estable en condiciones definidas si los ingredientes activos en la misma retienen al menos un nivel requerido de actividad y/o pureza y/o potencia o recuperación en comparación con la actividad y/o pureza y/o potencia o recuperación iniciales. Para los fines del presente documento, una composición es estable si retiene al menos un 50 % de la actividad de enzima degradante

5 de hialuronano y/o si retiene al menos un 90 % de la potencia o recuperación de la insulina y/o al menos un 90 % de la pureza de la insulina.

Tal como se usa en el presente documento, una coformulación estable, que contiene al menos dos ingredientes activos, es estable si cada ingrediente activo retiene al menos el nivel requerido de actividad y/o pureza y/o potencia

o recuperación en comparación con la actividad y/o pureza y/o potencia o recuperación inicial. Para los fines del presente documento, una coformulación es estable si retiene al menos un 50 % de la actividad de enzima degradante de hialuronano y si retiene al menos un 90 % de la potencia o recuperación de la insulina y/o al menos un 90 % de la pureza de la insulina.

15 Tal como se usa en el presente documento, las condiciones definidas se refieren a condiciones de almacenamiento y/o uso.

Tal como se usa en el presente documento, "almacenamiento" significa que una formulación no se administra inmediatamente a un sujeto una vez preparada, pero se mantiene durante un periodo de tiempo en condiciones particulares (por ejemplo, una temperatura particular, tiempo, en forma líquida o liofilizada) antes de su uso. Por ejemplo, una formulación líquida puede almacenarse durante días, semanas, meses o años, antes de su administración a un sujeto a diversas temperaturas, tales como refrigeradas (0° a 10 °C, tal como de 2 °C a 8 °C), a temperatura ambiente (por ejemplo, una temperatura de hasta 32 °C, tal como de 18 °C a aproximadamente o a 32 °C), o a temperatura elevada (por ejemplo, de 30 °C a 42 °C, tal como de 32 °C a 37 °C o de 35 °C a 37 °C).

25 Tal como se usa en el presente documento, "uso" en referencia a una condición asociada con la estabilidad se refiere al acto de emplear la formulación para un fin específico. Las aplicaciones particulares pueden influenciar la actividad o las propiedades de una proteína o agente. Por ejemplo, determinadas aplicaciones pueden requerir que la formulación se someta a determinadas temperaturas durante determinados periodos de tiempo, que se someta a fluctuaciones de temperatura y/o se someta a agitación, sacudidas, removido u otro movimiento similar que puede afectar a la estabilidad (por ejemplo, actividad y/o solubilidad) de los agentes activos. Los ejemplos de una condición son métodos de infusión continua, mediante los cuales los agentes activos se infunden de manera continua a un sujeto a partir de una bomba asociada al usuario o infusor durante un periodo de varios días. Dicha condición puede asociarse con agitación y fluctuaciones de temperatura.

35 Tal como se usa en el presente documento, las condiciones definidas para almacenamiento o uso en las que se mide la estabilidad incluyen condiciones de temperatura, condiciones de tiempo de almacenamiento y/o condiciones de uso. Por ejemplo, las condiciones de temperatura definidas incluyen temperaturas bajas o refrigeradas de 2 °C a 8 °C, temperaturas ambientales de 20 °C a 30 °C o temperaturas elevadas de 32 °C a 40 °C. En otro ejemplo, las condiciones de tiempo definidas se refieren a la duración del almacenamiento a diversas condiciones de temperatura, tal como almacenamiento durante días (al menos 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días), semanas (al menos una semana, al menos dos semanas, al menos tres semanas o al menos cuatro semanas) o meses (al menos 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 12 meses, 18 meses, 24 meses o más). En un ejemplo adicional, las condiciones de uso definidas se refieren a condiciones que modifican o alteran a la mezcla de

45 composición, tales como condiciones de agitación.

Tal como se usa en el presente documento, una formulación de una sola dosis se refiere a una formulación o coformulación para administración directa. En general, una formulación de una sola dosis es una formulación que contiene una sola dosis de agente terapéutico para administración directa. Las formulaciones de una sola dosis no contienen generalmente conservantes.

Tal como se usa en el presente documento, una formulación multidosis se refiere a una formulación que contiene múltiples dosis de un agente terapéutico y que puede administrarse directamente para proporcionar varias dosis individuales del agente terapéutico. Las dosis pueden administrarse durante el trascurso de minutos, horas,

55 semanas, días o meses. las formulaciones multidosis pueden permitir el ajuste de la dosis, el agrupamiento de dosis y/o la separación de dosis. Debido a que las formulaciones multidosis se usan durante tiempo, contienen generalmente uno o más conservantes para prevenir el crecimiento bacteriano. Las formulaciones multidosis pueden formularse para inyección o infusión (por ejemplo, infusión continua).

Tal como se usa en el presente documento, una "coformulación para inyección multidosis estable (MDI)" se refiere a una coformulación estable que es estable durante al menos 6 meses a una temperatura desde o desde aproximadamente 2 °C a 8 °C y/o durante al menos 14 días a una temperatura desde o desde aproximadamente 20 °C a 30 °C, de tal forma que se mantiene el nivel requerido de actividad y/o de pureza y/o de potencia o recuperación durante el tiempo y temperatura definidos en comparación con la actividad y/o la pureza y/o la potencia

65 o recuperación iniciales. Por ejemplo, una formulación de inyección de múltiples dosis estable retiene al menos un 50 % de la actividad de la enzima degradante de hialuronano y al menos un 90 % de la potencia o recuperación de

21

imagen12

ensayo durante un periodo de 28 días. Los parámetros para llevar a cabo una prueba de eficacia antimicrobiana son conocidos para un experto en la materia, tal como se describe en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, una cantidad antimicrobiana o antimicrobianamente eficaz de un

5 conservador se refiere a una cantidad del conservante que elimina o inhibe la propagación de organismos microbianos en una muestra que pueden introducirse a causa de su almacenamiento o uso. Por ejemplo, para envases multidosis, una cantidad antimicrobianamente eficaz de un conservante inhibe el crecimiento de microorganismos que pueden introducirse mediante la extracción repetida de dosis individuales. La USP y la EP (EPA y EPB) tienen requisitos antimicrobianos que determinan la eficacia del conservante, y que varían respecto de su rigurosidad. Por ejemplo, una cantidad antimicrobianamente eficaz de un conservante es una cantidad tal que tiene lugar una reducción de al menos 1,0 log10 unidades en organismos bacterianos a los 7 días después de la inoculación en una prueba de eficacia del conservante antimicrobiano (APET). En un ejemplo particular, una cantidad antimicrobianamente eficaz de un conservante es una cantidad tal que tiene lugar una reducción de al menos 1,0 log10 unidades en organismos bacterianos a los 7 días después de la inoculación, tiene lugar una

15 reducción de al menos 3,0 log10 unidades en organismos bacterianos a los 14 días después de la inoculación, o al menos no tiene lugar un aumento adicional de organismos bacterianos tras 28 días después de la inoculación; y al menos no tiene lugar un aumento en los organismos fúngicos tras 7 días después de la inoculación. En un ejemplo adicional, una cantidad antimicrobianamente eficaz de un conservante es una cantidad tal que tiene lugar una reducción de al menos 1,0 log10 unidades de organismos bacterianos a las 24 horas después de la inoculación, o tiene lugar una reducción de al menos 3,0 log10 unidades de organismos bacterianos a los 7 días después de la inoculación, no se produce un aumento en los organismos bacterianos tras 28 días después de la inoculación, o tiene lugar una reducción de al menos 1,0 log10 unidades de organismos fúngicos a los 14 días después de la inoculación, y al menos no tiene lugar un aumento adicional en los organismos fúngicos tras 28 días después de la inoculación. En un ejemplo adicional, una cantidad antimicrobianamente eficaz de un conservante es una cantidad

25 tal que tiene lugar una reducción de al menos 2,0 log10 unidades de organismos bacterianos a las 6 horas después de la inoculación, o tiene lugar una reducción de al menos 3,0 log10 unidades de organismos bacterianos a las 24 horas después de la inoculación, no se produce recuperación de organismos bacterianos tras 28 días después de la inoculación de la composición con el inóculo microbiano, o tiene lugar una reducción de al menos 2,0 log10 unidades de organismos fúngicos a los 7 días después de la inoculación, y al menos no tiene lugar un aumento adicional en los organismos fúngicos tras 28 días después de la inoculación.

Tal como se usa en el presente documento, el "excipiente" se refiere a un compuesto en una formulación de un agente activo que no proporciona el efecto biológico del agente activo cuando se administra en ausencia del agente activo. Los excipientes ejemplares incluyen, pero sin limitación, sales, tampones, estabilizantes, modificadores de la

35 tonicidad, metales, polímeros, tensioactivos, los conservantes, aminoácidos y azúcares.

Tal como se usa en el presente documento, un "tampón" se refiere a una sustancia, generalmente una solución, que puede mantener su pH constante, a pesar de la adición de ácidos fuertes o bases fuertes y la influencia externa de la temperatura, presión, volumen y potencial redox. El tampón previene el cambio en la concentración de otra sustancia bioquímica, por ejemplo, sistemas de donante y aceptor de protones que previenen cambios notables en la concentración de ión hidrógeno (pH). Los valores de pH de todos los tampones son dependientes de la temperatura y de la concentración. La elección del tampón para mantener un valor o intervalo de pH puede determinarse empíricamente por un experto en la materia basándose en la capacidad tamponadora conocida de los tampones conocidos. Los tampones ejemplares incluyen, pero sin limitación, tampón bicarbonato, tampón cacodilato, tampón

45 fosfato o tampón Tris. Por ejemplo, el tampón Tris (trometamina) es un tampón de base amina que tiene un pKa de 8,06 y tiene un intervalo de pH eficaz entre 7,9 y 9,2. Para los tampones Tris, el pH aumenta aproximadamente 0,03 por cada disminución de °C, y se reduce de 0,03 a 0,05 unidades por cada dilución de factor diez.

Tal como se usa en el presente documento, la actividad se refiere a una actividad o actividades funcionales de un polipéptido o porción del mismo asociada con una proteína de longitud completa (entera). Las actividades funcionales incluyen, pero sin limitación, actividad catalítica o enzimática, antigenicidad (capacidad para unirse o competir con un polipéptido por la unión a un anticuerpo anti-polipéptido), inmunogenicidad, capacidad para formar multímeros, y la capacidad para unirse específicamente a un receptor o ligando para el polipéptido.

55 Tal como se usa en el presente documento, la actividad de hialuronidasa se refiere a la capacidad para catalizar enzimáticamente la escisión del ácido hialurónico. El ensayo XXII de la Farmacopea de Estados Unidos (USP) para hialuronidasa determina la actividad de hialuronidasa de manera indirecta midiendo la cantidad de sustrato de ácido hialurónico de mayor peso molecular, o hialuronano, (HA) restante después de que se deje reaccionar la enzima con el HA durante 30 min a 37 °C (USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD). Puede usarse una solución de patrón de referencia en un ensayo para determinar la actividad relativa, en unidades, de cualquier hialuronidasa. Los ensayos in vitro para determinar la actividad de hialuronidasa de las hialuronidasas, tales como rHuPH20 soluble, se conocen en la técnica y se describen en el presente documento. Los ensayos ejemplares incluyen el ensayo de microturbidez descrito más adelante (véase, por ejemplo, el ejemplo 2) que mide la escisión de ácido hialurónico por hialuronidasa indirectamente mediante la detección del

65 precipitado insoluble formado cuando el ácido hialurónico se une con albúmina de suero. Pueden usarse patrones de

23

imagen13

imagen14

imagen15

imagen16

Tal como se usa en el presente documento, un polipéptido o proteína o una porción biológicamente activa del mismo aislado o purificado está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la célula o tejido del que se deriva la proteína, o está sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetiza químicamente. Puede determinarse que las preparaciones están sustancialmente libres si parecen libres de 5 impurezas fácilmente detectables según se determina mediante métodos de análisis estándar, tales como cromatografía en capa fina (TLC), electroforesis en gel y cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), usados por los expertos en la materia para evaluar dicha pureza, o están lo suficientemente puros como para que una purificación adicional no altere de manera detectable las propiedades físicas y químicas, tales como actividades enzimáticas y biológicas, de la sustancia. Los métodos para la purificación de los compuestos para producir

10 compuestos sustancialmente puros químicamente se conocen por los expertos en la materia. Un compuesto sustancialmente químicamente puro, sin embargo, puede ser una mezcla de estereoisómeros. En dichos casos, la purificación adicional puede aumentar la actividad específica del compuesto.

La expresión sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteínas en las que se separa la

15 proteína de componentes celulares de las células a partir de las cuales se aísla o produce de manera recombinante. En una realización, la expresión sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteínas enzimáticas que tienen menos de aproximadamente el 30 % (en peso seco) de proteínas no enzimáticas (también citadas en el presente documento como proteínas contaminantes), generalmente menos de aproximadamente un 20 % de proteínas no enzimáticas o un 10 % de proteínas no enzimáticas o menos de aproximadamente un 5 % de

20 proteínas no enzimáticas. Cuando la proteína enzimática se produce recombinantemente, también está sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente o el 20 %, 10 % o 5 % del volumen de la preparación de proteína enzimática.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión sustancialmente libre de precursores químicos u otros

25 agentes químicos incluye preparaciones de proteínas enzimáticas en las que se separa la proteína de los precursores químicos u otros agentes químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. La expresión incluye preparaciones de proteínas enzimáticas que tienen menos de aproximadamente el 30 % (en peso seco), 20 %; 10 %; 5 % o menos de precursores químicos o químicos o componentes no enzimáticos.

30 Tal como se usa en el presente documento, sintética, en referencia a, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico sintética o un gen sintético o un péptido sintético se refiere a una molécula de ácido nucleico o una molécula de péptido que se produce mediante métodos recombinantes y/o mediante métodos de síntesis química.

Tal como se usa en el presente documento, la producción usando métodos de ADN recombinante significa el uso de 35 los métodos bien conocidos de biología molecular para expresar proteínas codificadas por ADN clonado.

Tal como se usa en el presente documento, vector (o plásmido) se refiere a elementos discretos que se usan para introducir un ácido nucleico heterólogo en células bien para la expresión o para la replicación de los mismos. Los vectores permanecen típicamente episómicos, pero pueden diseñarse para efectuar la integración de un gen o

40 porción del mismo en n cromosoma del genoma. También se contemplan vectores que son cromosomas artificiales, tales como cromosomas artificiales de levadura y cromosomas artificiales de mamífero. La selección y el uso de dichos vehículos se conoce bien por los expertos en la materia.

Tal como se usa en el presente documento, un vector de expresión incluye vectores capaces de expresar ADN que

45 está unido operativamente con secuencias reguladoras, tales como regiones promotoras, que son capaces de efectuar la expresión de dichos fragmentos de ADN. Dichos segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y terminadoras, y pueden incluir opcionalmente uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores de selección, un potenciador, una señal de poliadenilación, y similares. Los vectores de expresión se derivan genéticamente de ADN de plásmido o vírico, o pueden contener elementos de ambos. Por lo tanto, un vector

50 de expresión se refiere a una construcción de ADN o ARN recombinante, tal como un plásmido, un vector de fago, virus recombinante u otro vector que, tras la introducción en una célula hospedadora adecuada, da como resultado la expresión del ADN clonado. Los vectores de expresión adecuados se conocen bien por los expertos en la materia e incluyen aquellos que son replicables en células eucariotas y/o células procariotas y aquellos que permanecen episómicos o aquellos que se integran en el genoma de la célula hospedadora.

55 Tal como se usa en el presente documento, un vector también incluye "vectores de virus" o "vectores víricos". Los vectores víricos son virus modificados por ingeniería genética unidos a genes exógenos para transferir (como vehículos o lanzaderas) los genes exógenos en las células.

60 Tal como se usa en el presente documento, unido operablemente o de manera operativa cuando se hace referencia a segmentos de ADN significa que los segmentos están dispuestos de tal forma que funcionan en concierto para sus fines previstos, por ejemplo, la transcripción se inicia cadena abajo del promotor y cadena arriba de cualquier secuencia traducida. El promotor es normalmente el dominio al que normalmente se une la maquinaria transcripcional para iniciar la transcripción y sigue a lo largo del segmento codificante hasta el terminador.

65

28

imagen17

imagen18

imagen19

imagen20

imagen21

imagen22

imagen23

imagen24

imagen25

imagen26

imagen27

imagen28

imagen29

Tabla 3. Polipéptidos de PH20 truncados en C-terminal ejemplares

Polipéptido: Precursor (aminoácidos) SEQ ID NO del precursor Maduro (aminoácidos) SEQ ID NO madura

SPAM1-LSAT: 492 227 457 271

SPAM1-TLSA: 491 194 456 238

SPAM1-STLS: 490 196 455 240

SPAM1-PSTL: 489 195 454 239

SPAM1-SPST: 488 228 453 272

SPAM 1-ASPS: 487 197 452 241

SPAM1-NASP: 486 229 451 273

SPAM1-YNAS: 485 198 450 242

SPAM1-FYNA: 484 199 449 243

SPAM1-IFYN: 483 46 448 48

SPAM1-QIFY: 482 3 447 4

SPAM1-PQIF: 481 45 446 5

SPAM1-EPQI: 480 44 445 6

SPAM1-EEPQ: 479 43 444 7

SPAM1-TEEP: 478 42 443 8

SPAM1-ETEE: 477 41 442 9

SPAM1-METE: 476 200 441 244

SPAM1-PMET: 475 201 440 245

SPAM1-PPME: 474 202 439 246

SPAM1-KPPM: 473 203 438 247

SPAM1-LKPP: 472 204 437 248

SPAM1-FLKP: 471 205 436 249

SPAM1-AFLK: 470 206 435 250

SPAM1-DAFL: 469 207 434 251

SPAM1-IDAF: 468 208 433 252

SPAM1-CIDA: 467 40 432 47

SPAM1-VCID: 466 209 431 253

SPAM1-GVCI: 465 200 430 254

b. rHuPH20

Un ejemplo de una forma truncada en C-terminal de la SEQ ID NO: 1 es un polipéptido del mismo que está truncado 5 después del aminoácido 482 de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1. Dicho polipéptido puede generarse a partir de una molécula de ácido nucleico que codifica los aminoácidos 1-482 (expuestos en la SEQ ID NO: 3). Dicha molécula de ácido nucleico ejemplar se expone en la SEQ ID NO: 49. El procesamiento postraduccional elimina la secuencia de señal de 35 aminoácidos, dejando una PH20 humana recombinante soluble de 447 aminoácidos (SEQ ID NO: 4). Ya que se producen en medio de cultivo existe heterogeneidad en el extremo C-terminal de tal forma que 10 el producto, denominado rHuPH20, incluye una mezcla de especies que pueden incluir una cualquiera o más de las SEQ ID NO: 4-9 en diversas abundancias. Típicamente, rHuPH20 se produce en células que facilitan la Nglucosilación correcta para retener la actividad, tales como células CHO (por ejemplo, células DG44 CHO).

3. Glucosilación de enzimas degradantes de hialuronano

15 La glucosilación, incluyendo la glucosilación unida a N o a O, de algunas enzimas degradantes de hialuronano, incluyendo hialuronidasas, pueden ser importantes por su actividad catalítica y estabilidad. Mientras que alterar el tipo de glucano que modifica una glucoproteína puede tener efectos dramáticos en la antigenicidad, plegamiento estructural, solubilidad y estabilidad de una proteína, se cree que la mayoría de las enzimas no requieren de

20 glucosilación para una actividad enzimática óptima. Para algunas hialuronidasas, la eliminación de la glucosilación unida a N puede dar como resultado una inactivación prácticamente completa de la actividad de hialuronidasa. Por lo tanto, para dichas hialuronidasas, la presencia de glucanos unidos a N es crítica para generar una enzima activa.

42

imagen30

imagen31

imagen32

imagen33

imagen34

imagen35

imagen36

imagen37

imagen38

imagen39

imagen40

imagen41

imagen42

imagen43

imagen44

imagen45

imagen46

imagen47

imagen48

imagen49

imagen50

imagen51

imagen52

imagen53

imagen54

imagen55

imagen56

imagen57

imagen58

imagen59

imagen60

imagen61

imagen62

imagen63

imagen64

imagen65

imagen66

imagen67

imagen68

imagen69

imagen70

imagen71

imagen72

imagen73

imagen74

imagen75

imagen76

imagen77

imagen78

imagen79

imagen80

imagen81

imagen82

imagen83

imagen84

imagen85

imagen86

imagen87

imagen88

imagen89

imagen90

imagen91

Tabla 15. Actividad enzimática de rHuPH20 en presencia de Humulin® o Humalog®

Muestra: Actividad enzimática de rHuPH20 (U/ml)

0 días: 1 día 2 días 3 días 7 días

Humulin®-PH20, 5 °C: 1339 1383 1329 1430 1332

Humulin®-PH20, 25 °C: 1318 1401 1325 1387 1308

Humalog®-PH20, 5 °C: 1264 1202 1172 1239 1140

Humalog®-PH20, 25 °C: 1305 966 740 763 248

Ejemplo 7

5 Efectos de los conservantes en rHuPH20

En este ejemplo, se evaluaron diversos conservantes de insulina y de análogo de insulina comunes respecto de sus efectos en la actividad y estabilidad enzimática de rHuPH20. La actividad enzimática de rHuPH20 se midió tal como se describe en el ejemplo 2 anterior. En los casos donde sea aplicable, se determinó la estabilidad de rHuPH20

10 mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) tal como se describe en el ejemplo 4 anterior.

A. Actividad enzimática de rHuPH20

En este ejemplo, se evaluaron los conservantes de insulina común y del análogo de insulina, fenol, m-cresol y

15 metilparabeno respecto de sus efectos en la actividad enzimática de rHuPH20 a diversas concentraciones, temperaturas y tiempo. Se añadió cada conservante (para una concentración final indicada en la tabla 16 a continuación), a formulaciones de insulina/rHuPH20 que contenían 3,7 mg/ml de insulina (se usó insulina Organon API [Insulina humana recombinante SIHR 143] en polvo para preparar la solución madre tal como se detalla en el ejemplo 1), y 20 μg/ml de rHuPH20 en 20 mM de Tris/HCl, pH 7,1 y 140 mM de NaCl y se incubaron las muestras a

20 la temperatura indicada durante un periodo de tiempo predeterminado.

Los resultados se muestran en la tabla 16 a continuación, que expone los conservantes y su concentración, el tiempo de incubación y la temperatura, y la actividad enzimática de rHuPH20. Los resultados son dependientes de la temperatura. La actividad enzimática de rHuPH20 se redujo significativamente después de una semana de

25 incubación a 35 °C cuando el nivel general de conservante era relativamente elevado (> 0,2 %). Por el contrario, a temperatura ambiente (25 °C) y menores concentraciones de conservante, rHuPH20 mantiene su actividad relativa durante al menos un mes. En general, a medida que el nivel de conservantes aumenta, se reduce la actividad enzimática de rHuPH20. Además, parece que entre los tres conservantes, m-cresol es el más perjudicial para rHuPH20 seguido de fenol y de metilparabeno.

30

Tabla 16. Efecto de las especies y concentración de conservante en la actividad de rHuPH20 a temperaturas elevadas

Conservante: Concentración (%) Actividad enzimática (U/ml)

1 mes, 25 °C: 1 semana, 35 °C 2 semanas, 35 °C

Fenol: 0,05 2103 2128 1996

Fenol: 0,1 1980 2094 1997

Fenol: 0,2 2128 1995 1822

Fenol: 0,4 1910 835 447

m-cresol: 0,05 2103 2019 1955

m-cresol: 0,1 2188 2147 2069

m-cresol: 0,2 2013 466 185

m-cresol: 0,4 <LDD <LDD <LDD

metilparabeno: 0,05 2061 10582 10182

metilparabeno: 0,1 1919 2085 1968

metilparabeno: 0,2 2196 1927 1590

metilparabeno: 0,31 2049 730 447

Sin conservante: 0,0 2006 1984 1994

LOD, nivel de detección; El metilparabeno no es soluble al 0,4 %; Estos números fueron inesperadamente bajos y se trataron como "valores anómalos".

105

B. Temperatura de fusión aparente (Tm) de rHuPH20

En este ejemplo, se determinó la temperatura de fusión (Tm) de rHuPH20 en presencia y ausencia de m-cresol, propil parabeno o fenoxietanol midiendo el radio hidrodinámico de las partículas usando dispersión de luz dinámica.

5 El aumento del tamaño de partícula se debe probablemente a la desnaturalización y posterior agregación de rHuPH20. A medida que aumenta la temperatura, las proteínas se desplegarán, lo que dará lugar a la formación de agregados.

En resumen, se diluyó rHuPH20 (Lote HuB, solución madre a 10 mg/ml) a 1 mg/ml en 25 mM de Tris-HCl, pH 7,5. Se

10 añadieron los conservantes indicados en las muestras de PH20 a partir de una solución madre al 100 %. El tamaño medio de partícula Z se midió mediante dispersión de luz dinámica usando un medidor Nano-ZS de Malven Zeta como función del aumento de la temperatura. Se efectuaron un total de 3 mediciones a cada temperatura en una cubeta de cuarzo de bajo volumen (Helma, 3,00 mm). La temperatura comenzó a 20 °C, con una escala de 2 °C, hasta una temperatura final de 66 °C, con un periodo de equilibrado de 5 minutos a cada temperatura. La intensidad

15 de dispersión de la luz se midió con un detector de retrodispersión de 173° equipado con el instrumento y se calcularon los datos de Z medio de partícula acumulativos con el programa informático DTS (programa informático de tecnología de dispersión) usando un índice refractivo de 1,45 para las muestras de proteína, y usando un índice refractivo de 1,33 para el agua como dispersante. El punto de inflexión en el eje de temperatura en el que hay un aumento significativo en el tamaño de partícula se considera la Tm (temperatura de fusión) aparente en donde la

20 proteína se desnaturaliza y comienza a agregarse.

Los resultados se muestran en la tabla 17 a continuación, que expone el tamaño medio de partícula a diversas temperaturas para 5 formulaciones de PH20 diferentes, tal como se muestra en la tabla 17 a continuación. Los datos en la tabla 17 es una media de 3 mediciones por punto, a incrementos de temperatura de 2 °C, con un punto de

25 equilibrado de 5 minutos. Los resultados demuestran que la Tm de rHuPH20 se redujo desde más de 40 °C sin ningún conservante hasta 26 °C en presencia de m-cresol al 0,25 %. Se observó una tendencia similar usando calorimetría de barrido diferencial (DSC) para medir la Tm de rHuPH20 con y sin m-cresol, aunque sin embargo la Tm se redujo solo aproximadamente 2 °C en presencia de m-cresol al 0,25 %.

Tabla 17. Tamaño medio de partícula de rHuPH20, con y sin diversos conservantes, medido mediante dispersión de luz dinámica

Temp. (°C): rHuPH20 rHuPH20+ mcresol al 0,25 % rHuPH20+ propilparaben o al 0,2 % rHuPH20 + fenoxietanol al 1,0 % rHuPH20 + fenoxietanol al 0,5 %

20: 9,48 8,86 9,66 10,51 8,95

22: 9,19 11,30 11,40 10,89 9,48

24: 9,89 12,49 13,58 10,72 9,95

26: 9,96 23,29 28,10 11,54 9,41

28: 9,27 113,50 124,57 12,63 9,57

30: 8,94 150,93 188,03 13,28 9,40

32: 8,96 159,37 237,27 12,97 9,52

34: 9,42 158,57 242,13 12,56 9,68

36: 9,28 163,27 260,77 14,47 10,13

38: 8,91 -- 266,43 29,75 11,03

40: 9,39 -- 277,43 40,18 12,71

42: 9,72 -- -- 52,28 24,31

44: 11,36 -- -- 93,99 28,43

46: 13,08 -- -- 159,13 35,87

48: 21,35 -- -- 238,33 45,08

50: 22,74 -- -- 314,00 63,67

52: 28,50 -- -- 653,13 94,19

54: 32,95 -- -- 834,30 139,47

56: 37,01 -- -- 1060,73 ---

Tm estimada: 44 °C 26 °C 26 °C 38 °C 42 °C

30

C. Afinidad de unión para rHuPH20

106

imagen92

imagen93

imagen94

imagen95

imagen96

imagen97

Tabla 29. Solubilidad de insulina Lispro a 2-8 °C

Form. n.º: pH NaCl % de recuperación de insulina (meses)

0: 0,25 0,5 1 3 5 9 12

F16: 7,0 50 96,41 95,91 95,12 93,26 81,51 88,84 72,51 58,91

F12: 7,0 80 96,36 64,78 40,76 35,90 33,47 32,72 29,34 26,22

F8: 7,0 110 96,35 31,18 19,52 18,50 15,05 14,72 14,23 13,63

F4: 7,0 140 95,78 21,70 15,04 13,80 11,11 11,14 11,13 10,08

F15: 7,2 50 96,68 95,95 95,80 95,42 95,64 96,28 98,59 91,50

F11: 7,2 80 96,50 96,06 95,81 86,34 60,90 61,48 50,74 47,02

F7: 7,2 110 96,45 66,09 39,64 32,94 58,68 28,02 23,68 21,88

F3: 7,2 140 95,82 37,37 25,12 23,62 19,03 17,15 15,99 15,90

F14: 7,4 50 96,74 96,44 96,36 95,89 95,90 96,58 98,78 95,82

F10: 7,4 80 96,34 96,51 96,49 96,64 96,05 96,25 98,62 95,61

F6: 7,4 110 96,69 96,86 93,50 74,63 63,68 68,64 43,83 38,80

F2: 7,4 140 95,73 83,13 50,31 39,27 37,45 34,80 27,30 24,01

F13: 7,6 50 95,66 96,72 97,02 96,38 96,21 96,71 98,74 96,11

F9: 7,6 80 95,48 95,96 96,22 96,34 95,43 96,17 96,91 92,06

F5: 7,6 110 95,47 96,74 96,40 96,35 95,89 95,50 84,82 91,38

F1: 7,6 140 95,73 95,53 94,46 87,46 64,62 67,99 46,20 41,61

Tabla 30. Efecto de la sal y el pH en la actividad enzimática de rHuPH20 a 35 °C, 30 °C y 25 °C

Form. n.º: NaCl (mM) pH t = 0 Actividad enzimática (U/ml)

35 °C: 30 °C 25 °C

1 W
1 W: 2 W 1 W 2 W 1M

F1: 140 7,6 588 * 244 133 545 528 461

F2: 140 7,4 593 15 322 238 557 494 496

F3: 140 7,2 583 31 370 300 585 530 514

F4: 140 7,0 576 84 418 387 579 507 513

F5: 110 7,6 577 - 163 73 525 496 412

F6: 110 7,4 574 - 256 159 541 489 449

F7: 110 7,2 581 14 327 257 565 501 505

F8: 110 7,0 580 49 376 304 576 512 512

F9: 80 7,6 599 9 152 82 498 430 385

F10: 80 7,4 574 - 91 17 451 401 290

F11: 80 7,2 544 - 230 133 522 444 416

F12: 80 7,0 549 - 283 199 518 448 435

F13: 50 7,6 526 - 38 - 361 296 178

F14: 50 7,4 535 - 47 5 426 329 265

F15: 50 7,2 529 14 115 51 481 371 324

F16: 50 7,0 522 - 172 87 507 405 339

W = semana, M = mes * Por debajo del límite de detección.

Tabla 31. Efecto de la sal y el pH en la actividad enzimática de rHuPH20 a 5 °C

Form. n.º: NaCl (mM) pH t = 0 Actividad enzimática (U/ml)

2 W: 1M 5M 9M 12M

F1: 140 7,6 588 613 597 595 524 539

F2: 140 7,4 593 572 594 586 542 551

F3: 140 7,2 583 563 592 586 537 546

F4: 140 7,0 576 569 586 582 555 559

F5: 110 7,6 577 569 582 582 532 552

F6: 110 7,4 574 655 592 618 560 580

F7: 110 7,2 581 574 581 593 553 553

F8: 110 7,0 580 564 588 615 551 576

F9: 80 7,6 599 540 584 546 515 534

113

imagen98

imagen99

imagen100

imagen101

imagen102

imagen103

imagen104

imagen105

Tabla 44. Efecto de PS80, PS20 y F68 en la oxidación de rHuPH20

n.º: Tensioactivo, conc (% p/v) Tampón % de pico de oxidación

Agitado 3 días: Agitado 10 días

9: F68, 0,001 % histidina 50 mM 3,79 4,31

10: PS80, 0,1 % fosfato 50 mM 5,41 12,40

11: PS80, 0,01 % fosfato 50 mM 3,83 5,01

12: PS80, 0,001 % fosfato 50 mM 3,41 4,62

13: PS20, 0,1 % fosfato 50 mM 43,79 65,34

14: PS20, 0,01 % fosfato 50 mM 10,32 12,48

15: PS20, 0,001 % fosfato 50 mM 4,25 5,15

16: F68, 0,1 % fosfato 50 mM 6,11 6,29

17: F68, 0,01 % fosfato 50 mM 3,80 4,72

18: F68, 0,001 % fosfato 50 mM 3,61 4,21

Tabla 45. Análisis estadísticos

Resumen del ajuste

Rcuadrado: 0,975911

Ajuste de Rcuadrado: 0,959852

Error cuadrático medio: 3,423151

Media de respuesta: 11,91222

Observaciones (o sumas ponderadas) 36

Análisis de la varianza

Fuente: DF Suma de cuadrados Media cuadrada Relación F

Modelo: 14 9969,264 712,090 60,7691

Error: 21 246,077 11,718 Prob. > F

C. Total: 35 10215,341 < 0,0001*

Pruebas de efecto

Fuente: Nparm DF Suma de cuadrados Relación F Prob. > F

tensioactivo: 2 2 909,4801 38,8071 < 0,0001*

tampón: 1 1 0,1152 0,0098 0,9220

conc.: 1 1 741,1067 63,2454 < 0,0001*

Tiempo: 1 1 214,5248 18,3074 0,0003*

tensioactivo*tampón: 2 2 20,3784 0,8695 0,4337

tensioactivo*conc.: 2 2 3557,3392 151,7900 < 0,0001*

tensioactivo*tiempo: 2 2 114,0738 4,8675 0,0183*

tampón*conc.: 1 1 14,8438 1,2668 0,2731

tampón*tiempo: 1 1 10,4329 0,8903 0,3561

conc.*tiempo: 1 1 248,4121 21,1993 0,0002*

*significativo

B. Metionina

5 1. Efecto de la metionina para prevenir la oxidación de rHuPH20

rHuPH20 tiene dos sitios potenciales de oxidación: Met458 y Met35. El pico "ox-1" corresponde a Met458 y es el pico principal de oxidación cuando se ensaya mediante RP-HPLC. El pico "ox-2" contiene ambas oxidaciones de metionina. La oxidación de la metionina puede evitarse mediante la adición de metionina libre como secuestrante

10 para reaccionar con potenciales compuestos oxidativos.

a. Formulaciones de rHuPH20

En este estudio, se evaluó el efecto de la adición de metionina libre en la oxidación de rHuPH20 en presencia de

15 polisorbato 20, polisorbato 80 y/o poloxamer 188. Cada formulación contenía 5 μg/ml de rHuPH20, un 0,02 % del tensioactivo indicado, fosfato 50 mM, pH 6,5, NaCl 150 mM y metionina (de 0 a 50 mM). Las muestras se incubaron a 30 °C durante 72 horas y se examinaron mediante RP-HPLC tal como se expone en el ejemplo 3 anterior. Los resultados se exponen en la tabla 46 a continuación. Los análisis estadísticos se exponen en la tabla 47 a continuación. Los resultados indicaron que la metionina previene la oxidación de rHuPH20 a una concentración de 2

20 mM.

122

imagen106

Tabla 48. Efectos de la metionina, NaCl y pH en la actividad de rHuPH20 en las formulaciones de insulina-PH20

Met (mM): NaCl (mM) pH Actividad de rHuPH20 (U/ml)

30 °C, 4 W: 35 °C, 5 D

40: 110 7,4 559 462

60: 110 7,2 558 518

60: 90 7,4 551 432

40: 90 7,2 539 459

60: 90 7,4 530 418

80: 110 7,4 556 475

40: 70 7,4 456 303

40: 90 7,6 508 349

60: 110 7,6 552 430

60: 70 7,6 444 258

60: 90 7,4 522 415

60: 90 7,4 525 426

60: 70 7,2 455 414

80: 90 7,6 467 326

80: 90 7,2 503 428

80: 70 7,4 452 341

60: 90 7,4 500 401

Tabla 49. Actividad de respuesta de HuPH20 medida después de almacenarla a 30 °C durante 2 semanas

Resumen del ajuste

Rcuadrado: 0,91826

Ajuste de Rcuadrado: 0,813165

Error cuadrático medio: 17,88843

Media de respuesta: 510,4541

Observaciones (o sumas ponderadas): 17

Análisis de la varianza

Fuente: DF Suma de cuadrados Media cuadrada Relación F

Modelo: 9 25163,516 2795,95 8,7374

Error: 7 2239,972 320,00 Prob. > F

C. Total: 16 27403,488 0,0046*

Pruebas de efecto

Fuente: Nparm DF Suma de cuadrados Relación F Prob. > F

Met: 1 1 884,795 2,7650 0,1403

NaCl: 1 1 21696,424 67,8022 < 0,0001*

pH: 1 1 882,210 2,7569 0,1408

Met*Met: 1 1 349,423 1,0920 0,3308

Met*NaCl: 1 1 0,936 0,0029 0,9584

NaCl*NaCl: 1 1 487,419 1,5232 0,2570

Met*pH: 1 1 6,812 0,0213 0,8881

NaCl*pH: 1 1 7,784 0,0243 0,8805

pH*pH: 1 1 674,368 2,1074 0,1899

*Significativo

Tabla 50. Actividad de respuesta de HuPH20 medida después de almacenarla a 35 °C durante 5 días

Resumen del ajuste

Rcuadrado: 0,970969

Ajuste de Rcuadrado: 0,933643

Error cuadrático medio: 17,2642

Media de respuesta: 403,3303

Observaciones (o sumas ponderadas): 17

Análisis de la varianza

Fuente: DF Suma de cuadrados Media cuadrada Relación F

Modelo: 9 69779,522 7753,28 26,0131

Error: 7 2086,367 298,05 Prob. > F

124

C. Total: 16 71865,889 0,0001*

Pruebas de efecto

Fuente: Nparm DF Suma de cuadrados Relación F Prob. > F

Met: 1 1 1,347 0,0045 0,9483

NaCl: 1 1 40555,093 136,0670 < 0,0001*

pH: 1 1 25833,100 86,6730 < 0,0001*

Met*Met: 1 1 1473,541 4,9439 0,0616

Met*NaCl: 1 1 146,858 0,4927 0,5054

NaCl*NaCl: 1 1 84,069 0,2821 0,6118

Met*pH: 1 1 14,175 0,0476 0,8336

NaCl*pH: 1 1 1176,764 3,9482 0,0873

pH*pH: 1 1 345,281 1,1585 0,3175

*Significativo

C. Exploración de estabilizantes potenciales para las formulaciones de rHuPH20/insulina

Se exploraron diversos compuestos respecto de su capacidad para actuar como estabilizantes de proteínas en las

5 formulaciones de rHuPH20/insulina. Los excipientes incluyeron aminoácidos y sus derivados, aminas, polioles, sales y tampones y otros compuestos (véase la tabla 51 a continuación). Cada compuesto se exploró, típicamente a dos concentraciones, respecto de su efecto en la actividad enzimática de rHuPH20 y la solubilidad de la insulina. La formulación básica contenía típicamente 100 U/ml de insulina/análogo de insulina, 5 μg/ml de rHuPH20, Tris/HCl 20 mM, m-cresol al 0,15 % y fenol al 0,2 % a un pH de 7,3 ± 0,1. Las formulaciones que contenían 100-140 mM de

10 NaCl se usaron como formulaciones de referencia y los estabilizantes potenciales reemplazaron la totalidad o parte del NaCl en las formulaciones. La actividad enzimática se midió tal como se describe en el ejemplo 2 anterior en muestras incubadas a 30 °C durante aproximadamente una semana. La solubilidad de la insulina se evaluó mediante RP-HPLC (véase el ejemplo 3 anterior) en muestras almacenadas a 5 °C.

15 Los resultados se exponen en la tabla 51 a continuación. La evaluación fue semicuantitativa en comparación con NaCl. Una mayoría de los compuestos ensayados no tuvieron efecto en la solubilidad de insulina, provocando los restantes una disminución en la solubilidad de la insulina. Los datos anteriores (véanse los ejemplos 8-9) indicaron que el pH y la sal, dos condiciones que pueden influenciar potencialmente a la carga de la proteína en solución, influencian la solubilidad de la insulina. En la presente exploración, las moléculas o compuestos que contenían

20 cationes divalentes (Mg2+ (cloruro de magnesio) y SO42-(sulfato sódico) y Lys-Lys) provocaron una gran precipitación de la insulina. Parece que un mecanismo de repulsión de carga podría ser importante para prevenir que las moléculas de insulina interactúen entre sí. Lys-Lys, el cloruro de magnesio y los oligómeros de ácido hialurónico (HA, 4-16 meros) se identificaron como moléculas que estabilizaron a rHuPH20 más que el NaCl. Debido al hecho de que tanto Lys-Lys como cloruro de magnesio redujeron la solubilidad de la insulina, estas moléculas no se

25 consideraron estabilizantes viables a altas concentraciones. La reducción de la concentración de Lys-Lys reducirá su impacto en la solubilidad de la insulina.

Tabla 51. Resumen de la exploración del estabilizante de rHuPH20/insulina

Categoría: Nombre del compuesto Efecto en la actividad enzimática de rHuPH20 Efecto en la solubilidad de la insulina

Aminoácido, derivado y aminas: L-Arginina Similar a NaCl Solubilidad reducida significativamente; provoca una fuerte precipitación

Glutamina: Sin efecto Sin efecto

Glicina: Sin efecto Sin efecto

Lisina: Sin efecto Sin efecto

Metionina: Sin efecto Sin efecto

Prolina: Sin efecto Sin efecto

Lys-Lys: Fuerte estabilizante Solubilidad reducida

Gly-Gly: Sin efecto Sin efecto

Oxido de trimetilamina (TMAO): Sin efecto Sin efecto

Betaína: Sin efecto Sin efecto

Polioles: glicerol Sin efecto Efecto nulo/leve; puede diferir ligeramente la formación de cristal

125

Tabla 51. Resumen de la exploración del estabilizante de rHuPH20/insulina

imagen107: sorbitol Sin efecto Efecto nulo/leve; puede diferir ligeramente la formación de cristal

Manitol: Sin efecto Efecto nulo/leve; puede diferir ligeramente la formación de cristal

Inositol: Sin efecto Sin efecto

Sacarosa: Sin efecto Efecto nulo/leve; puede diferir ligeramente la formación de cristal

Trehalosa: Sin efecto Efecto nulo/leve; puede diferir ligeramente la formación de cristal

Sales y tampones: Cloruro de magnesio Estabilizante eficaz Precipitación

Sulfato de sodio: Sin efecto Precipitación aumentada en comparación con NaCl

Tris (100 mM): Sin efecto Sin efecto

Benzoato de sodio: Sin efecto Precipitación reducida en comparación con NaCl

Otros: Oligómeros de ácido hialurónico (HA) (4-16meros) Estabilizante eficaz Sin efecto

Albúmina de suero humana: Sin efecto Sin efecto

Ácido fenil butírico: Sin efecto Sin efecto

Taurocolato: Sin efecto -puede ser desestabilizante Sin efecto

PVP: No evidente Sin efecto

D. Efecto de oligómeros de HA en las formulaciones de rHuPH20/insulina

Los oligómeros de HA se examinaron adicionalmente respecto de su capacidad para estabilizar las formulaciones de

5 rHuPH20/insulina. Los oligómeros de HA son el sustrato/producto de la reacción enzimática de rHuPH20 con el hialuronano, y como tal podría unirse posiblemente al sitio enzimático activo, provocando de este modo el efecto estabilizante. Se llevó a cabo un estudio de diseño de experimento (DOE) para investigar los efectos del pH, la concentración de NaCl y la concentración de oligómero de HA en la estabilidad general de rHuPH20/insulina.

10 La formulación básica contenía 3,75 mg/ml de insulina (Insulina Organon API, insulina humana recombinante SIHR 143, la solución se preparó tal como se describe en el ejemplo 1), 5 μg/ml de rHuPH20, Tris/HCl 15 mM, ZnCl2 al 0,01 %, Poloxamer 188 al 0,01 %, 0,15 % de fenol y 0,15 % de m-cresol. Se evaluó un total de 17 muestras, con tres niveles de pH diferentes (7,1, 7,3 y 7,5), tres concentraciones de NaCl (50, 75 y 100 mM) y tres concentraciones de oligómero de HA (1, 5,5 y 10 mg/ml). La actividad enzimática de rHuPH20 se midió en muestras incubadas a 30 °C

15 durante 1 semana o en muestras almacenadas a 2-8 °C durante 9 meses. La oxidación de rHuPH20 se midió mediante RP-HPLC en muestras almacenadas a 5 °C durante 9 meses. El contenido de insulina se midió mediante RP-HPLC para muestras almacenadas a 2-8 °C durante 9 meses.

Las formulaciones y los resultados se exponen en la tabla 52 a continuación. El contenido de insulina se expresa

20 como % de recuperación respecto de un patrón de referencia USP. El porcentaje (%) del área de pico de oxidación de rHuPH20 es la suma de los picos ox-1 (principal) y ox-2 (secundario). Los análisis estadísticos se exponen en la tabla 53 a continuación. Tal como se muestra en la tabla 53, la concentración de HA y NaCl tuvieron ambas un efecto significativo en la actividad enzimática de rHuPH20 cuando se midió después de incubación a 30 °C durante 1 semana. A medida que aumentaron las concentraciones de NaCl y HA, también aumentó la actividad enzimática de

25 rHuPH20. Esto fue particularmente cierto cuando ambas concentraciones de excipiente fueron mayores, lo que indica una interacción significativa entre los dos factores (véase la tabla 53, P = 0,0150).

Tabla 52. Efecto de HA, pH y NaCl en la actividad de rHuPH20 y la solubilidad de la insulina

Ejecución n.º: pH HA, mg/ml NaCl, mM Actividad enzimática (U/ml) 30 °C, 1 semana Contenido de insulina % de área de pico de oxidación de rHuPH20 Actividad enzimática (U/ml) 2-8 °C, 9 meses

1: 7,5 1 75 254 92,08 27,09 574

2: 7,1 1 75 341 52,38 26,43 576

126

3: 7,3 10 50 267 91,58 75,03 515

4: 7,3 1 50 173 92,08 29,00 562

5: 7,3 1 100 136 45,33 30,64 531

6: 7,1 5,5 100 407 21,99 55,72 521

7: 7,3 5,5 75 273 89,07 58,19 523

8: 7,3 5,5 75 296 85,73 55,63 506

9: 7,3 5,5 75 257 87,99 58,29 504

10: 7,1 5,5 50 363 82,41 55,54 524

11: 7,5 10 75 389 91,16 70,57 495

12: 7,3 5,5 75 357 87,63 58,61 505

13: 7,3 10 100 537 43,57 72,43 521

14: 7,1 10 75 510 38,06 72,09 494

15: 7,3 5,5 75 391 86,17 56,13 510

16: 7,5 5,5 50 313 91,68 52,36 489

17: 7,5 5,5 100 424 89,91 53,63 478

Tabla 53. Análisis estadísticos del estudio DOE en el efecto de HA, pH, y NaCl en la actividad enzimática de rHuPH20 a 30 °C durante 1 semana

Resumen del ajuste

Rcuadrado: 0,869567

Ajuste de Rcuadrado: 0,768119

Error cuadrático medio: 51,19549

Media de respuesta: 334,5882

Observaciones (o sumas ponderadas): 17

Análisis de la varianza

Fuente: DF Suma de cuadrados Media cuadrada Relación F

Modelo: 7 157261,32 22465,9 8,5716

Error: 9 23588,80 2621,0 Prob. > F

C. Total: 16 180850,12 0,0023*

Pruebas de efecto

Fuente: Nparm DF Suma de cuadrados Relación F Prob. > F

pH: 1 1 7260,125 2,7700 0,1304

HA: 1 1 79800,125 30,4467 0,0004*

NaCl: 1 1 18818,000 7,1798 0,0252*

pH*pH: 1 1 26012,463 9,9247 0,0117*

HA*HA: 1 1 1667,411 0,6362 0,4456

HA*NaCl: 1 1 23562,250 8,9899 0,0150*

NaCl*NaCl: 1 1 1167,253 0,4454 0,5213

*Significativo

Se destacó que en la mayoría de todos los estudios anteriores que evalúan las formulaciones de insulina/rHuPH20 en ausencia de HA, el aumento de pH tuvo un efecto significativo y negativo en la actividad enzimática de rHuPH20,

5 especialmente en el intervalo de pH de 6,0 a 8,0. Por el contrario, en este estudio en el que se incluyó HA en las formulaciones, el pH pareció tener poco o ningún efecto en la actividad enzimática de rHuPH20. Por lo tanto, parece que la presencia de HA en la formulación de insulina/rHuPH20 reduce o niega el efecto negativo que puede tener un pH mayor en la actividad enzimática de rHuPH20.

10 Para evaluar adicionalmente la utilidad del HA como estabilizante, el contenido de insulina se evaluó mediante RP-HPLC en las muestras que se habían almacenado a 2-8 °C durante 9 meses. Los datos de contenido de insulina y los resultados del análisis estadístico se muestran en las tablas 54 y 55 a continuación. Los resultados demuestran claramente la significación del pH y la concentración de NaCl en la solubilidad de la insulina (p < 0,0001 para ambos factores). A medida que aumentó el pH, aumentó la solubilidad de la insulina. A medida que aumentó la

15 concentración de NaCl, se redujo la solubilidad de la insulina. El efecto del HA en la solubilidad/contenido de insulina no fue significativo (p = 0,2755). Por lo tanto, los oligómeros de HA pueden ser un excipiente/estabilizante para las formulaciones de rHuPH20/insulina o de rHuPH20/análogo de insulina.

127

El almacenamiento a largo plazo de las formulaciones que contenían oligómeros de HA mostró un aumento significativo en el nivel de oxidación de rHuPH20 en comparación con las formulaciones que no incluían HA añadido. El nivel de oxidación parecía estar bien correlacionado con la concentración de HA, pero fue independiente del pH o de la concentración de NaCl (véanse las tablas 55 y 56 a continuación). El HA contiene ácido glucurónico, que 5 puede ser un donante de oxígeno potencial por lo que podría necesitarse un antioxidante o secuestrante de oxígeno si el HA es un excipiente en las formulaciones finales de rHuPH20-insulina. En este estudio, algunas de las formulaciones se oxidaron fuertemente, aunque la actividad enzimática permaneció razonablemente intacta (véase la tabla 55), lo que confirmó que la rHuPH20 oxidada todavía mantiene una actividad enzimática significativa. Los análisis estadísticos multivariables indicaron que las actividad enzimáticas de rHuPH20 de estas muestras de

10 almacenamiento a baja temperatura a largo plazo se vieron afectadas significativamente por el HA (p = 0,004, actividad enzimática reducida), pero no por el pH o el NaCl (p = 0,1715 y 0,4766, respectivamente) (véase la tabla 56 a continuación).

Tabla 54. Efecto de HA, pH, y NaCl en el contenido de insulina para las muestras almacenadas a 2-8 °C durante 9 meses

Resumen del ajuste

Rcuadrado: 0,978698

Ajuste de Rcuadrado: 0,951309

Error cuadrático medio: 5,231467

Media de respuesta: 74,63647

Observaciones (o sumas ponderadas): 17

Análisis de la varianza

Fuente: DF Suma de cuadrados Media cuadrada Relación F

Modelo: 9 8801,6746 977,964 35,7335

Error: 7 191,5778 27,368 Prob. > F

C. Total: 16 8993,2524 < 0,0001*

Estimaciones de parámetro

Plazo: Estimación Error estándar Relación de t Prob. > |t|

Punto de corte: -626,7315 67,81624 -9,24 < 0,0001*

pH: 106,24375 9,248015 11,49 < 0,0001*

HA: -0,486111 0,411023 -1,18 0,2755

NaCl: -0,78475 0,073984 -10,61 < 0,0001*

(pH-7,3)*(pH-7,3): -194,2562 63,73755 -3,05 0,0186*

(pH-7,3)*(HA-5,5): 3,7222222 2,906371 1,28 0,2411

(HA-5,5)*(HA-5,5): -0,549519 0,125901 -4,36 0,0033*

(pH-7,3)*(NaCl-75): 2,9325 0,523147 5,61 0,0008*

(HA-5,5)*(NaCl-75): -0,0028 0,023251 -0,12 0,9075

(NaCl-75)*(NaCl-75): -0,01288 0,004079 -3,16 0,0160*

*Significativo

Tabla 55. Efecto de HA, pH y NaCl en la oxidación de rHuPH20 almacenado a 2-8 °C durante 9 meses

Resumen del ajuste

Rcuadrado: 0,997321

Ajuste de Rcuadrado: 0,993876

Error cuadrático medio: 1,253363

Media de respuesta: 53,37529

Observaciones (o sumas ponderadas): 17

Análisis de la varianza

Fuente: DF Suma de cuadrados Media cuadrada Relación F

Modelo: 9 4093,6132 454,846 289,5415

Error: 7 10,9964 1,571 Prob. > F

C. Total: 16 4104,6096 < 0,0001*

Estimaciones de parámetro

Plazo: Estimación Error estándar Relación de t Prob. > |t|

Punto de corte: 58,118819 16,24751 3,58 0,0090*

pH: -3,83125 2,215653 -1,73 0,1274

HA: 4,9155556 0,098473 49,92 < 0,0001

NaCl: 0,00245 0,017725 0,14 0,8940

(pH-7,3)*(pH-7,3): -72,34375 15,27033 -4,74 0,0021*

128

(pH-7,3)*(HA-5,5): -0,605556 0,696313 -0,87 0,4133

(HA-5,5)*(HA-5,5): -0,26821 0,030164 -8,89 < 0,0001

(pH-7,3)*(NaCl-75): 0,0545 0,125336 0,43 0,6768

(HA-5,5)*(NaCl-75): -0,009422 0,005571 -1,69 0,1346

(NaCl-75)*(NaCl-75): -0,000262 0,000977 -0,27 0,7964

*Significativo

Tabla 56. Efecto de HA, pH y NaCl en la actividad enzimática de rHuPH20 almacenado a 28 °C durante 9 meses

Resumen del ajuste

Rcuadrado: 0,8159

Ajuste de Rcuadrado: 0,5792

Error cuadrático medio: 18,33595

Media de respuesta: 519,2941

Observaciones (o sumas ponderadas): 17

Análisis de la varianza

Fuente: DF Suma de cuadrados Media cuadrada Relación F

Modelo: 9 10430,079 1158,90 3,4470

Error: 7 2353,450 336,21 Prob. > F

C. Total: 16 12783,529 0,0584

Estimaciones de parámetro

Plazo: Estimación Error estándar Relación de t Prob. > |t|

Punto de corte: 917,96806 237,6915 3,86 0,0062*

pH: -49,375 32,41369 -1,52 0,1715

HA: -6,055556 1,440608 -4,20 0,0040*

NaCl: -0,195 0,25931 -0,75 0,4766

(pH-7,3)*(pH-7,3): -51,25 223,3959 -0,23 0,8251

(pH-7,3)*(HA-5,5): 0,8333333 10,18664 0,08 0,9371

(HA-5,5)*(HA-5,5): 1,3432099 0,441276 3,04 0,0187*

(pH-7,3)*(NaCl-75): -0,4 1,833595 -0,22 0,8335

(HA-5,5)*(NaCl-75): 0,0822222 0,081493 1,01 0,3466

(NaCl-75)*(NaCl-75): -0,00728 0,014297 -0,51 0,6263

*Significativo

Ejemplo 11

5 Efecto de la concentración de sal, pH y concentración de tampón en rHuPH20 en presencia de metilparabeno

En este ejemplo, se usó un diseño experimental Box-Behnken para determinar el pH óptimo, la concentración de sal (NaCl) y la concentración de tampón (Hepes) para la estabilidad de rHuPH20 a temperaturas elevadas en presencia del conservante fenólico, metilparabeno. En este experimento de método de superficie de respuesta (RSM) de

10 diseño de experimento (DOE), tres factores, a saber, diversas concentraciones de tampón y sal, y pH, se examinaron respecto de sus efectos en la actividad de rHuPH20 en condiciones aceleradas, mientras que las muestras se sometieron a estreses, incluyendo elevada temperatura y agitación. Las respuestas medidas incluyeron la actividad enzimática y la pureza/contenido, medida mediante HPLC de fase inversa.

15 El estudio se basó en el paquete informático de DOE Design-Expert® 7.1. (StatEase, Minneapolis, MN). Los intervalos y puntos medios de la concentración de Hepes, la concentración de NaCl y pH usados en el experimento se listan en la tabla 57 a continuación. Para llevar a cabo el estudio, se prepararon un total de 13 formulaciones diferentes con 5 puntos centrales repetidos, basándose en una secuencia aleatoria que generó el programa informático. Cada muestra contenía 100 μg/ml de rHuPH20 (a partir de una solución de 10 mg/ml en histidina/HCl,

20 pH 6,5, NaCl 130 mM), metilparabeno al 0,20 % (Fluka, n.º de cat. 85265) y propilparabeno al 0,025 % (American Custom Chemicals, San Diego, n.º de cat. CHEM-19713), con diversas concentraciones de Hepes (Calbiochem, n.º de cat. 391338) y NaCl (EMD, SX0418-1) y se ajustó el pH tal como se especifica en la tabla 58 a continuación usando NaOH o HCl 1,0 N. Las soluciones se repartieron en alícuotas en viales de vidrio de tipo 1 de 2 ml (Wheaton, n.º de cat. 223683) con tapones de goma (Wheaton, n.º de cat. 224100-072) y se selló con tapones de aluminio, con

25 2 viales por formulación. Las muestras se colocaron en un incubador con la temperatura ajustada a 35 °C. Un conjunto de viales se sometió a agitación usando un agitador Titer Plate (LabLine) a 600 rpm durante 3 días (35 + ag). El otro conjunto de viales se mantuvo a 35 °C durante 5 días sin agitación. Las muestras se sometieron a ensayo después del periodo de incubación.

129

Tabla 57. Intervalos y puntos medios para Hepes, NaCl y pH

Factor: Punto medio Intervalos

Concentración de Hepes: 11 mM 2-20 mM

Concentración de NaCl: 150 mM 120-180 mM

pH: 7 6-8

Tabla 58. Diseño de RSM de Box-Behnken, incluyendo respuestas

STD: Ejecuci ón n.º Factor 1 Factor 2 Factor 3 Respuesta 1 Respuesta 2 Respuesta 3 Respuesta 4

NaCl mM: Hepes mM pH Enz (35 + ag) SEC (35 + ag)* Enz (35) SEC (35)*

5: 1 120 11 6 2119 38,91 7.474 95,54

15: 2 150 11 7 6944 78,50 8.260 95,82

10: 3 150 20 6 5744 70,96 8.784 94,94

1: 4 120 2 7 5228 63,06 6.958 84,71

16: 5 150 11 7 7023 80,69 8.022 93,95

7: 6 120 11 8 2138 34,15 2.829 62,12

6: 7 180 11 6 5864 70,36 8.704 93,53

8
8: 180 11 8 5297 63,89 6.052 59,80

12: 9 150 20 8 4554 55,72 5.378 74,59

13: 10 150 11 7 5709 74,53 8.184 91,14

11
11: 150 2 8 4031 42,09 4.392 61,61

4: 12 180 20 7 6192 69,69 8.708 94,85

9: 13 150 2 6 8178 81,28 9.642 91,32

17: 14 150 11 7 7464 80,22 8.651 93,58

3: 15 120 20 7 7101 71,51 8.681 89,31

2: 16 180 2 7 7194 77,18 8.755 93,34

14: 17 150 11 7 6482 74,79 8.721 93,51

*: Porcentaje de pico principal de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) en comparación con una referencia.

La actividad enzimática se midió tal como se describe en el ejemplo 2b anterior. Se usó cromatografía de exclusión

5 por tamaño (SEC) para evaluar la pureza midiendo el porcentaje del pico principal en comparación con una muestra de referencia (véase el ejemplo 4 anterior). La SEC se llevó a cabo usando las siguientes condiciones: Suero salino tamponado con fosfato (PBS) 1X, una columna Toso BioScience G2000 SWXL, y un caudal ajustado a 1 ml/min. Los datos se recogieron tal como se describe anteriormente y se comunicaron las medias y se introdujeron en la tabla de diseño después de la secuencia de muestra proporcionada por el programa de DOE. Los resultados se muestran en

10 la tabla 58 anterior.

Para el análisis de los datos, los datos en bruto se analizaron del modo siguiente. En resumen, los datos se ajustaron a un modelo cuadrático como punto de partida. La ANOVA se llevó a cabo basándose en el modelo cuadrático, pero típicamente se necesitó reducir los parámetros para hacer que el modelo cumpliese más 15 estrechamente con todos los criterios siguientes: nivel significativo del modelo P < 0,05, valor de p para ausencia de ajuste (P>0,1), nivel de precisión adecuado > 4, y R-cuadrado predicha dentro de 0,2 de la R-cuadrado ajustada. Finalmente, se comprobaron los análisis residuales y las gráficas diagnósticas para asegurar que se cumplían las suposiciones de la ANOVA. En algunos casos, se necesitó transformar los datos para cumplir esos criterios; en esos casos, los datos en bruto se transformaron mediante una ecuación matemática adecuada seguido después del

20 análisis estadístico tal como se describió anteriormente. Los modelos de prueba ANOVA para el modelo usado para cada respuesta se exponen en la tabla 59 a continuación, que indica la respuesta, la ecuación del modelo, de si se usó una transformación y el tipo de transformación, el valor de P del modelo y el valor de P de ausencia de ajuste.

Tabla 59. Prueba ANOVA para cada modelo

Modelo*: Transformaci ón Valor de P del modelo Valor de P de ausencia de ajuste

Respuesta 1, actividad enzimática (35 °C -AG): Y=A+C+A2+C2 Ninguno Significativo P=0,009 No significativo P=0,091

Respuesta 2, pico principal de SEC (35 °C -AG): Y=A+C+A2+C2 Logit Significativo P=0,0007 No significativo P=0,109

Respuesta 3, actividad enzimática (35 °C -5D): Y=A+B+C+AB+ BC+AC+A2+B2+ C2 Ninguno Significativo P=0,0002 No significativo P=0,076

Respuesta 4, pico principal de SEC (35 °C -5D): Y=A+B+C+A2+ C2 Logit Significativo P<0,0001 No significativo P=0,147

*A -NaCl; B -Tampón Hepes; C -pH

130

imagen108

imagen109

imagen110

imagen111

imagen112

imagen113

Tabla 63. Formulaciones de insulina Glulisina/rHuPH20

n.º: pH Tampón Modificador de la tonicidad Tensioactivo Conservantes API

1: 7,3 Tris/HCl 20 mM NaCl 100 mM Metionina 20 mM Polisorbato 20 al 0,001 % Fenol al 0,15 % m-cresol al 0,172 % 600 U/ml de rHuPH20 3,5 mg/ml de Glulisina

2: 7,3 Tris/HCl 20 mM NaCl 100 mM Metionina 20 mM Polisorbato 20 al 0,001 % Fenol al 0,10 % m-cresol al 0,150 % 600 U/ml de rHuPH20 3,5 mg/ml de Glulisina

3: 7,3 Tris/HCl 20 mM NaCl 100 mM Metionina 20 mM Polisorbato 20 al 0,001 % Fenol al 0,125 % m-cresol al 0,075 % 600 U/ml de rHuPH20 3,5 mg/ml de Glulisina

4: 7,3 Tris/HCl 20 mM NaCl 140 mM Metionina 20 mM Polisorbato 20 al 0,001 % Fenol al 0,15 % m-cresol al 0,172 % 600 U/ml de rHuPH20 3,5 mg/ml de Glulisina

5: 7,3 Tris/HCl 20 mM NaCl 140 mM Metionina 0 mM Polisorbato 20 al 0,001 % Fenol al 0,15 % m-cresol al 0,172 % 600 U/ml de rHuPH20 3,5 mg/ml de Glulisina

6: 7,0 Tris/HCl 20 mM NaCl 140 mM Metionina 20 mM Polisorbato 20 al 0,001 % Fenol al 0,15 % m-cresol al 0,172 % 600 U/ml de rHuPH20 3,5 mg/ml de Glulisina

7: 7,3 Tris/HCl 20 mM NaCl 100 mM Metionina 20 mM Poloxamer 188 al 0,01 % Fenol al 0,15 % m-cresol al 0,172 % 600 U/ml de rHuPH20 3,5 mg/ml de Glulisina

Se almacenó un (1) ml de cada formulación y se incubó a diversas temperaturas, tal como se describe en el ejemplo 12 anterior en viales de vidrio de 2 ml de borosilicato de tipo 1 USP con un tapón de goma de clorobutilo y un sello de aluminio. Las mediciones de estabilidad se registraron en diversos instantes: t = 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 6 o 9 meses. 5 La estabilidad también se evaluó midiendo el pH, la apariencia, la actividad enzimática de rHuPH20, el porcentaje de pureza y el porcentaje de recuperación de rHuPH20 mediante RP-HPLC, el porcentaje de pureza y el porcentaje de recuperación de insulina Lispro mediante RP-HPLC, y el porcentaje de pureza de insulina Lispro mediante SEC no desnaturalizante y desnaturalizante (véanse los ejemplos 2-5 y el ejemplo 12). Los criterios de aceptación o la especificación diana de estabilidad para cada parámetro ensayado son los mismos a los descritos en el ejemplo 12.

10 Solo se evaluaron las muestras en un instante posterior si los resultados indicaron ≥30 % del nivel inicial.

Los resultados se resumen a continuación.

1. Instante de 1 meses

15

a. Insulina Lispro

Todas las formulaciones fueron transparentes e incoloras sin partículas en todos los instantes y temperaturas. Todas las formulaciones ensayadas fueron estables a 5 ± 3 °C hasta el instante de 1 meses tanto para rHuPH20 como para 20 insulina lispro. No se evaluaron las formulaciones a 15 ± 2 °C en el instante de un mes.

rHuPH20 fue estable en la mayoría de las formulaciones mantenidas a 25 ± 2 °C hasta 1 mes con la excepción de las formulaciones A1, A2, A4 y B4. Las formulaciones A1, A2, y B4 se encontraron por debajo de la especificación diana de 375 U/ml para la actividad enzimática de rHuPH20 entre 2 semanas y 1 mes y la formulación A4 se 25 encontró por debajo del nivel de especificación diana 1 y 2 semanas después de su almacenamiento a 25 °C. Estas formulaciones tenían niveles de conservante de Novolog o EP-B con un alto pH (pH 7,6), lo que desfavorece la estabilidad de rHuPH20. La formulación individual EP-B (B4) que tenía una actividad de hialuronidasa < 375 U/ml tras 1 mes a 25 °C tenían un pH de 7,6 y baja concentración de cloruro de sodio (50 mM) que en combinación se vieron desfavorecidos respecto de rHuPH20. Las otras formulaciones EP-B a pH 7,6 con mayores concentraciones

30 de cloruro de sodio (80 mM o 100 mM) permanecieron por encima del nivel diana de 375 U/ml de actividad enzimática de rHuPH20 tras 1 mes a 25 °C. Todas las demás formulaciones se encontraron por encima de la especificación diana tras 1 mes de almacenamiento a 25 °C. La insulina lispro fue estable en todas las formulaciones a 25 °C tras el instante de 1 mes, pero el porcentaje de pureza mediante RP-HPLC comenzó a reducirse ligeramente.

35 La rHuPH20 fue menos estable en todas las formulaciones mantenidas a 30 ± 2 °C en comparación con aquellas a 25 ± 2 °C. La formulación USP mantuvo una actividad aceptable de rHuPH20 durante 1 mes a 30 °C pero ninguna de las formulaciones de conservante comercial (A1-A4) o de EP-B (B1-B5) permanecieron por encima de la especificación diana tras 1 semana de almacenamiento a 30 °C. La insulina lispro permaneció estable dentro de la

40 especificación diana durante 1 mes en todas las formulaciones a 30 °C pero el porcentaje de pureza mediante RP-HPLC se reduce ligeramente.

137

imagen114

imagen115

imagen116

imagen117

imagen118

imagen119

imagen120

A. Efecto de los oligómeros de HA en la estabilidad de almacenamiento

Las formulaciones contenían diversas cantidades de HA (10, 15 o 20 mg/ml). Las formulaciones adicionales contenían 15 mg/ml de HA a varios pH y concentraciones de glicerina y sal.

5 Las formulaciones de insulina/rHuPH20 se exponen en la tabla 65 a continuación. Las formulaciones básicas contienen 3,5 mg/ml de insulina, 600 U/ml (5 μg/ml) de rHuPH20, Tris/HCl 30 mM, NaCl 80 mM, metionina 20 mM y poloxamer 188 al 0,01 % (Poloxamer 188) con fenol al 0,1 % y m-cresol al 0,15 % a pH 7,4. Las formulaciones n.º 2 n.º 4 contenían además 10, 15 y 20 mg/ml de oligómeros de HA, respectivamente. Las formulaciones n.º 1 y n.º 6

10 contenían además glicerina 50 mM, conteniendo la formulación n.º 6 15 mg/ml de oligómeros de HA. Las formulaciones n.º 5 y n.º 7 variaron respecto de la formulación n.º 3 en su pH y concentraciones de NaCl. Se evaluaron tres formulaciones adicionales (n.º 8-n.º 10) que no contenían metionina, y que contenían cada una 3,5 mg/ml de insulina, 600 U/ml de rHuPH20, 15 mg/ml de oligómeros de HA, Tris/HCl 30 mM, NaCl 80 mM y poloxamer 188 al 0,01 % con fenol al 0,1 % y m-cresol al 0,15 % a pH 7,4. La formulación n.º 8 contenía además metionina 20

15 mM y la formulación n.º 10 contenía además glicerina 50 mM.

Tabla 65. Formulaciones que contienen 600 U/ml de rHuPH20 y 3,5 mg/ml de insulina

n.º: pH Tampón Modificador de la tonicidad Estabilizante Conservantes

1: 7,4 Tris/HCl 30 mM NaCl 80 mM Glicerina 50 mM Metionina 20 mM F68 al 0,01 % Fenol al 0,1 % m-cresol al 0,15 %

2: 7,4 Tris/HCl 30 mM NaCl 80 mM 10 mg/ml HA Metionina 20 mM F68 al 0,01 % Fenol al 0,1 % m-cresol al 0,15 %

3: 7,4 Tris/HCl 30 mM NaCl 80 mM 15 mg/ml HA Metionina 20 mM F68 al 0,01 % Fenol al 0,1 % m-cresol al 0,15 %

4: 7,4 Tris/HCl 30 mM NaCl 80 mM 20 mg/ml HA Metionina 20 mM F68 al 0,01 % Fenol al 0,1 % m-cresol al 0,15 %

5: 7,2 Tris/HCl 30 mM NaCl 80 mM 15 mg/ml HA Metionina 20 mM F68 al 0,01 % Fenol al 0,1 % Tricresol al 0,15 %

6: 7,4 Tris/HCl 30 mM NaCl 80 mM Glicerina 50 mM 15 mg/ml HA Metionina 20 mM F68 al 0,01 % Fenol al 0,1 % m-cresol al 0,15 %

7: 7,4 Tris/HCl 30 mM NaCl 100 mM 15 mg/ml HA Metionina 20 mM F68 al 0,01 % Fenol al 0,1 % m-cresol al 0,15 %

8: 7,4 Tris/HCl 30 mM NaCl 80 mM 15 mg/ml HA Metionina 20 mM F68 al 0,01 % Fenol al 0,1 % m-cresol al 0,15 %

9: 7,4 Tris/HCl 30 mM NaCl 80 mM 15 mg/ml HA F68 al 0,01 % Fenol al 0,1 % m-cresol al 0,15 %

10: 7,4 Tris/HCl 30 mM NaCl 80 mM Glicerina 50 mM 15 mg/ml HA F68 al 0,01 % Fenol al 0,1 % m-cresol al 0,15 %

Se almacenó un (1) ml de cada formulación en viales de vidrio de 2 ml de borosilicato de tipo 1 USP con un tapón de goma de clorobutilo y un sello de aluminio. Cada formulación se incubó, individualmente, a 5 ± 3 °C, 25 ± 2 °C, 30 ± 20 2 °C y 35 ± 2 °C y las mediciones de estabilidad se registraron a en el instante t = 0, 2, 5, 7 y 9 días, 1 y 2 semanas, 1 mes o 2 meses. La estabilidad se evaluó midiendo el pH, la apariencia, osmolalidad, la actividad enzimática de rHuPH20, el contenido de rHuPH20 mediante RP-HPLC, el contenido de insulina mediante RP-HPLC, y el porcentaje de pureza de insulina mediante SEC no desnaturalizante (véanse los ejemplos 2-5 y el ejemplo 12). Los criterios de aceptación de estabilidad o la especificación diana para cada parámetro ensayado son los mismos a los

25 descritos en el ejemplo 12.

1. 5°C

Todas las formulaciones que contenían al menos 15 mg/ml de oligómeros de HA contenían partículas visibles tras

30 solo 1 semana a 5 °C. Las formulaciones que contenían únicamente 10 mg/ml de oligómeros de HA o sin oligómeros de HA fueron transparentes, incoloras y no contenían partículas tras 2 semanas a 5 °C, pero se observaron partículas tras 1 mes. Todas las formulaciones ensayadas fueron estables a 5 °C hasta el instante de 2 meses para rHuPH20. La insulina fue inestable en las formulaciones que contenían 20 mg/ml de oligómeros de HA (n.º 4), que tenían menor pH (n.º 5) y que contenían más sal (n.º 7), tras solo 1 mes a 5 °C.

35

2. 25 °C

Las formulaciones n.º 5 (bajo pH) y n.º 7 (alto contenido de sal) contenían partículas tras solo 1 semana a 25 °C. Las demás formulaciones fueron todas transparentes e incoloras y no contenían partículas. Todas las formulaciones

40 ensayadas fueron estables a 25 °C hasta el instante de 2 meses tanto para rHuPH20 como para insulina.

3. 30 °C

145

imagen121

imagen122

Tabla 69. Efecto del peso molecular de HA en la actividad enzimática de rHuPH20

Formulación: PM de HA, kDa Actividad (U/ml)

5 °C: 37 °C

9d: 3d 5d 7d
9d

F1: NA 600 34 2 -15 -16

F2: 6,4 645 279 145 59 27

F3: 74,0 585 211 94 30 10

F4: 234,4 575 161 52 5 -6

Ejemplo 16

5 Estabilidad de las formulaciones de insulina Aspart/rHuPH20

En este ejemplo, se evaluaron varias formulaciones de insulina Aspart/rHuPH20 respecto de su estabilidad en dos condiciones de almacenamiento, 30 °C y 37 °C, y en condiciones aceleradas (agitación a 25 °C durante 9 días). Las formulaciones de insulina/rHuPH20 ensayadas se exponen en la tabla 70 a continuación. La formulación de 10 referencia (n.º 7) contenía 3,5 mg/ml de insulina Aspart, 600 U/ml (5 μg/ml) de rHuPH20, Tris/HCl 30 mM, NaCl 80 mM, glicerina 50 mM, metionina 20 mM y poloxamer 188 al 0,01 % (Poloxamer 188) con fenol al 0,1 % y m-cresol al 0,15 % a pH 7,4. Las formulaciones n.º 1-n.º 3 se ensayaron con los niveles de conservante de fenol al 0,13 % y mcresol al 0,12 % con 3 niveles diferentes del estabilizante poloxamer 188. Las formulaciones n.º 4-n.º 6 se ensayaron con los niveles de conservante de fenol al 0,15 % y m-cresol al 0,12 % con 3 niveles diferentes del estabilizante

15 poloxamer 188. Las formulaciones n.º 8 y n.º 9 contenían además 10 mg/ml de oligómeros de HA teniendo la formulación n.º 8 un menor nivel de glicerina (20 mM). Las formulaciones n.º 10 y n.º 11 contenían un nivel menor de metionina (5 mM) y la n.º 11 contenía además 10 mg/ml de oligómeros de HA.

Tabla 70. Formulaciones que contienen 600 U/ml de rHuPH20 y 3,5 mg/ml de insulina Aspart

n.º: pH Tampón Modificador de la tonicidad Estabilizante Conservantes

1: 7,4 Tris/HCl 30 mM NaCl 80 mM Glicerina 50 mM Metionina 20 mM F68 al 0,01 % Fenol al 0,13 % m-cresol al 0,12 %

2: 7,4 Tris/HCl 30 mM NaCl 80 mM Glicerina 50 mM Metionina 20 mM F68 al 0,05 % Fenol al 0,13 % m-cresol al 0,12 %

3: 7,4 Tris/HCl 30 mM NaCl 80 mM Glicerina 50 mM Metionina 20 mM F68 al 0,1 % Fenol al 0,13 % m-cresol al 0,12 %

4: 7,4 Tris/HCl 30 mM NaCl 80 mM Glicerina 50 mM Metionina 20 mM F68 al 0,01 % Fenol al 0,15 % m-cresol al 0,12 %

5: 7,4 Tris/HCl 30 mM NaCl 80 mM Glicerina 50 mM Metionina 20 mM F68 al 0,05 % Fenol al 0,15 % m-cresol al 0,12 %

6: 7,4 Tris/HCl 30 mM NaCl 80 mM Glicerina 50 mM Metionina 20 mM F68 al 0,1 % Fenol al 0,15 % m-cresol al 0,12 %

7: 7,4 Tris/HCl 30 mM NaCl 80 mM Glicerina 50 mM Metionina 20 mM F68 al 0,01 % Fenol al 0,1 % m-cresol al 0,15 %

8: 7,4 Tris/HCl 30 mM NaCl 80 mM Glicerina 20 mM 10 mg/ml HA Metionina 20 mM F68 al 0,01 % Fenol al 0,1 % m-cresol al 0,15 %

9: 7,4 Tris/HCl 30 mM NaCl 80 mM Glicerina 50 mM 10 mg/ml HA Metionina 20 mM F68 al 0,01 % Fenol al 0,1 % m-cresol al 0,15 %

10: 7,4 Tris/HCl 30 mM NaCl 80 mM Glicerina 50 mM Metionina 5 mM F68 al 0,01 % Fenol al 0,1 % m-cresol al 0,15 %

11: 7,4 Tris/HCl 30 mM NaCl 80 mM Glicerina 50 mM 10 mg/ml HA Metionina 5 mM F68 al 0,01 % Fenol al 0,1 % m-cresol al 0,15 %

20 Se almacenó un (1) ml de cada formulación en viales de vidrio de 2 ml de borosilicato de tipo 1 USP con un tapón de goma de clorobutilo y un sello de aluminio. Cada formulación se incubó, individualmente, a 30 ± 2 °C y 37 ± 2 °C y las mediciones de estabilidad se registraron a en el instante t = 0, 2, 4, 7 y 9 días, 2 semanas, 1 mes o 1,5 meses. Para cada formulación, se sometió un conjunto de viales a agitación usando un agitador Titer Plate (LabLine) a 600 rpm durante 9 días a 25 °C. También se sometió a NovoLog® (insulina Aspart) a las mismas condiciones de

25 agitación como control.

La estabilidad se evaluó midiendo el pH, la apariencia, osmolalidad, la actividad enzimática de rHuPH20, el contenido de rHuPH20 mediante RP-HPLC y el contenido de insulina mediante RP-HPLC (véanse los ejemplos 2-5 y

148

imagen123

imagen124

imagen125

imagen126

imagen127

imagen128

imagen129

imagen130

imagen131

imagen132

imagen133

imagen134

imagen135

imagen136

imagen137

Tabla 92. Formulaciones de rHuPH20

Form.: PH20 U/ml Tampón, pH NaCl mM HSA mg/ml CaCl2 mM EDTA % PS80 % Met mM Lys-Lys mM

F4: 160 NaPO4 12,5 mM 7,0 145 0 0 0 0,02 10 0

F5: 160 NaPO4 12,5 mM 7,0 145 0 0 0 0,04 10 0

F6: 160 NaPO4 12,5 mM 7,0 145 0 0 0 0,06 10 0

F7: 160 NaPO4 12,5 mM 7,0 145 0 0 0 0,02 10 10

Todas las muestras se ensayaron respecto de la actividad de hialuronidasa, tal como se describe en el ejemplo 2. Se ensayó la presencia de partículas insolubles y solubles usando obtención de imágenes MicroFlow (MFI). Para esto, cada formulación de rHuPH20 o de control se midió con un instrumento Micro-Flow Imaging modelo 4200 (Brightwell 5 Technologies, Inc., Ottawa, Canadá). Antes de cada ejecución, se filtró tampón de blanco a través de un filtro de 0,22 micrómetros y se enjuagó a través del sistema para proporcionar un fondo limpio e iluminación optimizada. Para equilibrar el sistema, se dispensaron al menos 2 ml de muestra antes del análisis. Se ejecutaron muestras de un (1) ml a un caudal de 170 μl/min usando una bomba peristáltica. La configuración de magnificación fue 5 X para permitir la detección de partículas dentro del intervalo de 1 a 100 μm con un análisis de profundidad de campo de 100 μm.

10 Las partículas se contaron y registraron automáticamente por la máquina y se comunicaron como número de partículas/ml. El tampón y/o las formulaciones que contenían rHuPH20 pero que no se sometieron a agitación se usaron como controles. También se llevó a cabo cromatografía de exclusión por tamaño tal como se describe en el ejemplo 4. Los resultados se muestran en las tablas 93-95 a continuación.

15 1. Actividad de hialuronidasa

La tabla 93 expone la actividad de hialuronidasa en U/ml y el % de actividad en comparación con tiempo 0 (T0). Los resultados muestran que tras 8 días a 40 °C, las formulaciones que no contenían HSA (F4, F5 y F6) tenían actividad de hialuronidasa reducida en comparación con las formulaciones F1, F2 y F3 que contenían HSA. La formulación F7,

20 que contenía Lys-Lys, retuvo el mayor nivel de actividad de hialuronidasa tras 15 días a 40 °C.

Tras el estrés por agitación, las formulaciones que contenían al menos un 0,04 % de polisorbato 80 y metionina 10 mM retuvieron actividad de hialuronidasa, al igual que lo hicieron las formulaciones que contienen Lys-Lys. Las formulaciones F1-F4 tuvieron una ligera disminución en la actividad de hialuronidasa. En general, la formulación F7

25 (que contenía Lys-Lys) mostró la máxima retención en actividad enzimática de rHuPH20 tanto en la prueba de estrés térmico como en la prueba de agitación.

Tabla 93. Actividad de hialuronidasa con agitación y estrés térmico

Form.: Tiempo 0 Agitación a 25 °C, 72h U/ml ( % de t0) 40 °C, 8 días U/ml ( % de t0) 40 °C, 15 días U/ml ( % de t0)

F1: 155 146 (94) 149 (96) 139 (90)

F2: 154 144 (94) 150 (97) 134 (87)

F3: 153 142 (93) 153 (100) 132 (86)

F4: 155 148 (96) 122 (79) 100 (65)

F5: 153 158 (103) 110 (72) 105 (69)

F6: 153 157 (103) 117 (76) 107 (70)

F7: 151 153 (101) 147 (97) 147 (97)

2. Presencia de proteína agregada o de agregados insolubles

30 La tabla 94 expone los recuentos de partículas (agregados insolubles) en número de partículas/ml para cada intervalo micrométrico. Por ejemplo, los intervalos de tamaño micrométricos que se ensayaron usando MFI fueron partículas (p) mayores de 5 micrómetros (μm) pero menores de 10 μm (5 ≤ p < 10), 10 ≤ p < 25, 25 ≤ p < 50 y p ≥ 50. Se generaron formulaciones de control para F1 y F4 que no contenían rHuPH20, y formulaciones de control para las

35 muestras F2, F4 y F6 fueron las mismas formulaciones que no se agitaron.

La presencia o ausencia de HSA no afectó a las muestras de control no agitadas, teniendo cada una recuentos de partículas aproximadamente iguales. Una vez agitadas, las formulaciones que contenían HSA pero que carecían de polisorbato 80 (F1 y F2) tuvieron significativamente más partículas que todas las otras formulaciones, incluyendo F3

40 que solo difiró de F2 por la adición de polisorbato 80. La adición de más polisorbato 80 (F5 y F6 en comparación con F4) no tuvieron un efecto significativo en la reducción de formación de agregado. La formulación F7, que contenía Lys-Lys, tuvo los menores números de agregados insolubles tras la agitación.

Tabla 94. Recuentos de partículas medidos mediante MFI (número de partículas/ml)

164

Claims

imagen1

imagen2

imagen3