ES2569343T3 - Procedimiento para extraer albúmina sérica humana a partir de grano de arroz transgénico - Google Patents

Procedimiento para extraer albúmina sérica humana a partir de grano de arroz transgénico Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para extraer albúmina sérica humana recombinante a partir de grano de arroz transgénico, que comprende las etapas de: 1) retirar la cáscara del arroz con cáscara transgénico que contiene albúmina sérica humana recombinante, moler el grano de arroz descascarillado, seguido de la mezcla del grano de arroz transgénico molido con un buffer de extracción que comprende buffer fosfato 10∼30 mM, acetato de sodio 10∼20 mM, sulfato de amonio 15∼30 mM y caprilato de sodio 5∼20 mM y un pH de 6,5∼8, y la extracción mediante agitación para obtener la mezcla I; 2) ajustar el pH de la mezcla I de la etapa 1) a 4,0∼4,5 y precipitarla durante 1∼12 horas para obtener la mezcla II; 3) filtrar la mezcla II de la etapa 2) y recoger el filtrado para obtener una solución que contenga una alta concentración de albúmina sérica humana recombinante.

Description

DESCRIPCION
Procedimiento para extraer albumina serica humana a partir de grano de arroz transgenico.
5 CAMPO DE LA INVENCION
La presente invencion se refiere al campo de la biotecnologfa, y mas particularmente a un procedimiento para extraer albumina serica humana recombinante (rHSA) a partir de grano de arroz transgenico.
10 ANTECEDENTES DE LA INVENCION
La albumina serica humana (HSA) es una protema no glicosilada de cadena simple que consiste en 585 aminoacidos, que tienen un peso molecular de 66,5 kD y un punto isoelectrico entre 4,7~4,9. Es la protema mas abundante en el plasma sangumeo humano, constituyendo el 60% aproximadamente de las protemas plasmaticas 15 totales. Hay 40 g aproximadamente de HSA por litro de sangre humana. Ademas de estar presente en el plasma, la HSA tambien se encuentra en tejidos y secreciones corporales, pieles y cavidades linfaticas. Bajo condiciones fisiologicas normales, la HSA tiene un efecto de mantener la presion coloidosmotica del plasma, nutrir, acelerar la concrescencia de heridas, y como vehmulo, participar en el transporte de muchas moleculas biologicas hidrofobicas como hormonas, sustancias biologicas activas y farmacos en la sangre. Por lo tanto, la HSA es una protema medica 20 importante que se usa principalmente de manera clmica para el tratamiento de la hipoproteinemia causada por la perdida de sangre, quemadura, escaldadura, cirugfa plastica y lesion cerebral, asf como para el tratamiento de la cirrosis hepatica, la hidronefrosis, etcetera.
En la actualidad, la HSA para el uso clmico se prepara principalmente mediante la extraccion y el aislamiento de 25 plasma humano. Sin embargo, este planteamiento de preparacion tiene las siguientes desventajas: por un lado, la fuente de plasma es insuficiente, es decir el suministro de sangre limitado es incapaz de satisfacer las demandas de produccion de HSA y las preparaciones relevantes de la misma; por otro lado, la propia sangre puede ser potencialmente un factor de riesgo, por ejemplo puede contener patogenos infecciosos peligrosos como el virus de la hepatitis, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), etcetera, lo cual causa enormemente preocupaciones 30 acerca de la aplicacion de HSA extrafda de plasma. Por lo tanto, es urgente desarrollar un proceso alternativo para producir HSA.
Con el desarrollo de tecnicas modernas de ADN recombinante y de smtesis, los investigadores toman un profundo interes en la produccion y la aplicacion de albumina serica humana recombinante (rHSA). Hasta ahora, se han 35 estado usando experimentalmente diversos sistemas de expresion para la produccion en masa de rHSA. Por ejemplo, procariotas como el colibacilo (Latta, M. y col., Bio/Technology, 5:1309-1314, (1987)), el bacillus subtilis (Saunders, C. W. y col., J. Bacteriol. 169: 2917-2925, (1987)), eucariotas como levaduras (WO-00/44772, EP0683233A2, US-5612196) y tambien el cultivo de celulas animales se han estado usando para la produccion de rHSA. Sin embargo, tales planteamientos antes mencionados no son adecuados para la produccion industrializada 40 debido al bajo nivel de expresion o bien al alto coste de produccion.
La solicitud de patente china num. 200510019084 de los presentes inventores da a conocer un procedimiento para producir rHSA usando celulas del endospermo del arroz como biorreactor, que comprende: usar promotores y peptidos senal expresados espedficamente en el endospermo del arroz para actuar de mediadores en la entrada de 45 rHSA en el sistema de endomembranas de las celulas del endospermo del arroz y almacenar la rHSA en los cuerpos proteicos del endospermo del arroz, permitiendose de ese modo que se acumule rHSA extensivamente en la semilla de arroz y alcance un nivel de expresion mas alto finalmente. El nivel de expresion de la rHSA obtenida es al menos superior al 0,3% en base al peso de la semilla de arroz. El procedimiento tiene las ventajas del alto nivel de expresion y el bajo coste, por lo que proporciona la posibilidad de desarrollar una estrategia novedosa para la 50 produccion de farmacos proteicos.
En la actualidad, no hay un proceso de produccion desarrollado para extraer rHSA a partir de grano de arroz transgenico. Establecer un procedimiento y un proceso para extraer protemas a partir de grano de arroz transgenico, mejorar la eficiencia de extraccion de protemas objetivo y reducir el rendimiento de extraccion de protemas no 55 objetivo son elementos cnticos de la investigacion y el desarrollo de la tecnologfa. La presente invencion establece una tecnologfa y un proceso para la extraccion de alta eficiencia de rHSA a partir de grano de arroz transgenico a gran escala.
RESUMEN DE LA INVENCION
El objeto de la invencion es proporcionar un procedimiento para extraer albumina serica humana recombinante (rHSA) a partir de grano de arroz transgenico.
5 Para conseguir el objeto anterior, la presente invencion proporciona la siguiente solucion tecnica:
Un procedimiento para extraer albumina serica humana recombinante a partir de grano de arroz transgenico, que comprende las etapas de:
10 1) retirar la cascara del arroz con cascara transgenico que contiene albumina serica humana recombinante, moler el grano de arroz descascarillado, seguido de la mezcla del grano de arroz transgenico molido con un buffer de extraccion y la extraccion mediante agitacion para obtener la mezcla I.
2) ajustar el pH de la mezcla I de la etapa 1) a 4,0~4,5 y precipitarla durante 1~12 horas para obtener la mezcla II;
15
3) filtrar la mezcla II de la etapa 2) y recoger el filtrado para obtener una solucion que contenga una alta concentracion de albumina serica humana recombinante.
Espedficamente, en la etapa 1), ya que la albumina serica humana recombinante se presenta entre los granulos de 20 almidon en las celulas del endospermo del arroz, con el fin de reducir el rendimiento de extraccion de protemas no objetivo, el grano de arroz transgenico que contiene rHSA es descascarillado y el grano de arroz descascarillado se muele hasta obtener arroz en polvo o arroz molido con una finura de tamano de malla de 80~120 para aumentar el rendimiento de extraccion de albumina serica humana recombinante.
25 El buffer de extraccion comprende buffer fosfato (PBS) 10~30 mM, acetato de sodio 10~20 mM, sulfato de amonio 10~50 mM y caprilato de sodio 5~40 mM, y el buffer de extraccion tiene un pH de 6,5~8.
En el buffer de extraccion, dicho sulfato de amonio preferentemente tiene una concentracion de 10~30 mM, mas preferentemente 15~30 mM, y mas preferentemente 20~30 mM.
30
En el buffer de extraccion, dicho caprilato de sodio preferentemente tiene una concentracion de 5~30 mM, mas preferentemente 5~20 mM, y mas preferentemente 10~20 mM.
Por ejemplo, en una forma de realizacion, el buffer de extraccion comprende buffer fosfato (PBS) 10~30 mM, acetato 35 de sodio 10~20 mM, sulfato de amonio 15~30 mM y caprilato de sodio 5~20 mM; y el buffer de extraccion tiene un pH de 6,5~8.
En una forma de realizacion preferida, el buffer de extraccion comprende buffer fosfato 25 mM, acetato de sodio 20 mM, sulfato de amonio 20 mM y caprilato de sodio 20 mM, y tiene un pH de 7,5.
40
Con el fin de obtener el mayor rendimiento de extraccion de albumina serica humana recombinante y equilibrar la relacion entre el volumen de extraccion y la eficiencia de extraccion, el arroz en polvo se mezcla con el buffer de extraccion en una relacion de p/v (kg/L, peso del arroz molido/volumen del buffer de extraccion) de 1:5 a 1:10, despues se extrae con remocion a 60 revoluciones por minuto (rpm) durante 1~3 horas. Se muestra por los 45 experimentos que la relacion que oscila entre 1:5 y 1:10 no tiene ninguna influencia obvia sobre la eficiencia de extraccion de la albumina serica humana recombinante. Con el fin de reducir el coste y el volumen de extraccion, el arroz transgenico molido se mezcla preferentemente con el buffer de extraccion en una relacion de p/v (kg/L) de 1:5, y el tiempo de extraccion es preferentemente de 1~1,5 horas.
50 Con el fin de extraer albumina serica humana recombinante a partir de grano de arroz molido con una eficiencia maxima, de acuerdo con el rasgo caractenstico de que la albumina serica humana es estable a 60°C, un incremento de la temperatura de extraccion obviamente aumenta los rendimientos de extraccion de protemas totales y albumina serica humana recombinante siempre y cuando la HSA no se desnaturalice a la temperatura. Por lo tanto, se emplea tratamiento de calor en la presente invencion para incrementar de forma efectiva el rendimiento de extraccion de la 55 albumina serica humana recombinante. Dicha temperatura de extraccion es de 45~60°C, y preferentemente de 55~60°C.
Ya que ambas extracciones de la albumina serica humana recombinante y protemas no objetivo se aumentan bajo las condiciones de calentamiento y pH elevado, la retirada de las protemas no objetivo adicionales del proceso antes
mencionado se podna realizar precipitando protemas de reserva del endospermo del arroz en el punto isoelectrico de la albumina serica humana. El proceso de precipitacion en la etapa 2) de acuerdo con la presente invencion se lleva a cabo a un pH bajo. Despues de la extraccion, la mezcla ex^da se ajusta a pH 4,0~4,5, despues la mezcla se precipita a temperatura ambiente durante al menos 1 hora para eliminar los efectos negativos del exceso de 5 protemas no objetivo producido por el proceso de extraccion bajo calentamiento y pH elevado. En una forma de realizacion, se usa acido acetico para ajustar el pH a 4,0~4,5, preferentemente a 4,5; el tiempo de precipitacion es de 1~12 horas, preferentemente de 3~l2 horas, y mas preferentemente de 6 horas.
De acuerdo con las diferentes caractensticas ffsicas entre los granulos de almidon existentes en el arroz molido y la 10 porcion lfquida, las tecnicas y equipos de rutina se pueden usar para separar sustancias indeseables de la extraccion de protemas. La mezcla extrafda obtenida del proceso de precipitacion en la etapa 2) se somete a una separacion de solido-lfquido a traves de la filtracion a presion u otros equipos equivalentes, consiguiendose el proposito de separar el almidon residual de la protema objetivo de forma efectiva a gran escala. La invencion proporciona un procedimiento simple, rapido y de bajo coste para obtener una solucion que contenga una alta 15 concentracion de albumina serica humana recombinante finalmente.
En una forma de realizacion, dicha filtracion comprende las etapas de filtrar por filtracion a presion con un filtro prensa de placas y marcos de tipo tela filtrante, seguido del filtrado por microfiltracion con una membrana de fibras huecas. Dicha membrana de fibras huecas esta hecha de una membrana de fibras huecas de polietersulfona, que 20 tiene un tamano de poro de 0,20 pm~0,45 pm de diametro, y preferentemente de 0,22 pm.
En la solucion que contiene albumina serica humana recombinante preparada de acuerdo con el procedimiento de la presente invencion, la concentracion de la albumina serica humana recombinante es de 0,65~0,66 mg/mL; la concentracion inicial de protemas totales es de 6,90~7,05 mg/mL y se reduce a 2,8 mg/mL aproximadamente 25 despues de la etapa de precipitacion; el contenido de protemas no objetivo se reduce sustancialmente.
La solucion tecnica de la presente invencion tiene las siguientes ventajas:
1. La eficiencia de extraccion de albumina serica humana recombinante se aumenta por la combinacion de 30 diferentes pH y diferentes concentraciones de sal. Los datos mostraron que la concentracion de albumina serica
humana recombinante en el extracto obtenido de acuerdo con la presente invencion es de 0,65~0,66 mg/mL, mientras que la concentracion obtenida por la tecnica previa es de solo 0,30~0,315 mg/mL. De ese modo, aplicando el procedimiento mejorado de la presente invencion, la cantidad de extraccion de albumina serica humana recombinante a partir del mismo peso de arroz molido se incrementa en 1,15 veces.
35
2. La eficiencia de extraccion de protema no objetivo se reduce. La concentracion de protemas totales en el extracto inicial de acuerdo con la presente invencion es de 6,90~7,05 mg/mL y el contenido de protema total es de 2,8 mg/mL despues de la etapa de precipitacion, lo cual se reduce en 2,46 veces.
40 3. El efecto aseptico o el efecto de esterilizacion se aumenta debido a la mejora de la etapa de microfiltracion, que elimina la contaminacion microbiana que se puede introducir en la etapa de purificacion posterior y reduce la cantidad de endotoxinas bacterianas que se puedan producir en el proceso de produccion.
DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
45
La Fig. 1 es una grafica que muestra los efectos de combinar las diferentes temperaturas y tiempos de extraccion sobre el rendimiento de extraccion de protemas totales a partir de grano de arroz transgenico molido.
La Fig. 2 es una grafica que muestra los efectos de combinar las diferentes temperaturas y tiempos de extraccion 50 sobre el rendimiento de extraccion de rHSA a partir de grano de arroz transgenico molido.
La Fig. 3 es una imagen de SDS-PAGE de muestras obtenidas por combinaciones ortogonales de diferentes temperaturas y tiempos de extraccion.
55 La Fig. 4 es una grafica que muestra los efectos de combinar diferentes pH y concentraciones de sal de sulfato de amonio sobre el rendimiento de extraccion de protemas totales a partir de grano de arroz transgenico molido.
La Fig. 5 es una grafica que muestra los efectos de combinar diferentes pH y concentraciones de sal de sulfato de amonio sobre el rendimiento de extraccion de rHSA a partir de grano de arroz transgenico molido.
La Fig. 6 es una imagen de SDS-PAGE de muestras obtenidas por combinaciones ortogonales de diferentes pH y concentraciones de sal de sulfato de amonio.
5 La Fig. 7 es una grafica que muestra los efectos de diferentes concentraciones de caprilato de sodio y tiempos de precipitacion sobre el rendimiento de extraccion de protemas totales.
La Fig. 8 es una imagen de SDS-PAGE de las muestras de extraccion obtenidas en diferentes concentraciones de caprilato de sodio y tiempos de precipitacion.
10
La Fig. 9 es una imagen de SDS-PAGE de las muestras de extraccion obtenidas a diferentes pH y tiempos de precipitacion.
La Fig. 10 es un esquema que muestra los porcentajes de rHSA en las protemas totales de la solucion extrafda 15 antes y despues de la filtracion con diferente tamano de poro de las membranas.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
Las caractensticas y ventajas de la presente invencion se pueden entender mas aun por los siguientes ejemplos. 20 Los ejemplos son solo ilustrativos y no debenan interpretarse como que limitan la invencion de ningun modo.
Ejemplo 1: Extraccion de rHSA de acuerdo con el procedimiento mejorado de la presente invencion
El arroz transgenico se podna preparar de acuerdo con el procedimiento dado a conocer en la solicitud de patente 25 china num. 200510019084 de los presentes inventores. El arroz con cascara se descascaro para obtener arroz semipulido y se molio para obtener arroz molido con una finura de malla de 80~100. El arroz molido se mezclo con un buffer de extraccion en una relacion de 1:5 (p/v, kg/L), y se extrajo durante 1,5 horas a 60°C. Los componentes del buffer de extraccion son: buffer fosfato 25 mM, acetato de sodio 20 mM, sulfato de amonio 10 mM, caprilato de sodio 10 mM; pH 7,5. La mezcla resultante se regulo a pH 4,5 con acido acetico y se deposito durante al menos 3 30 horas para precipitar protemas no objetivo. Despues la mezcla resultante se sometio secuencialmente a filtracion a presion usando un filtro prensa de placas y marcos (tipo de tela filtrante) y a microfiltracion por una columna de fibras huecas con un tamano de poro de 0,22 pm, para obtener sobrenadantes que contuviesen rHSA. La concentracion de rHSA fue de 0,66 mg/mL aproximadamente.
35 Ejemplo 2: Extraccion de rHSA de acuerdo con el procedimiento previo en la tecnica
El arroz transgenico se puede preparar de acuerdo con el procedimiento dado a conocer en la solicitud de patente china num. 200510019084 de los presentes inventores. El arroz con cascara se descascaro para obtener arroz no pulido y se molio para obtener arroz molido con una finura de malla de 80~100. El arroz molido se mezclo con un 40 buffer de extraccion en una relacion de 1:5 (p/v, kg/L), y se extrajo al menos durante 1 hora a temperatura ambiente. Los componentes del buffer de extraccion son: buffer fosfato 25 mM y acetato de sodio 20 mM; pH 6,5. La mezcla resultante se regulo a pH 4,5 con acido acetico y se deposito durante 1 hora para producir la precipitacion. Despues la mezcla resultante se sometio secuencialmente a filtracion a presion usando un filtro prensa de placas y marcos (tipo de tela filtrante) y a microfiltracion por una columna de fibras huecas con un tamano de poro de 0,45 pm, para 45 obtener sobrenadantes que contuviesen rHSA. La concentracion de rHSA fue de 0,314 mg/mL aproximadamente. En comparacion con los resultados de acuerdo con el procedimiento mejorado de la presente invencion, el contenido de protemas totales fue solo del 45,5%, y el contenido de rHSA fue del 47,7% (Figs. 1 a 3).
Ejemplo 3: Efectos de la temperatura y el tiempo de extraccion sobre el rendimiento de extraccion de rHSA
50
Este ejemplo empleo un buffer de extraccion constante y llevo a cabo una combinacion ortogonal en diferentes temperaturas (45°C, 50°C, 55°C, 60°C, respectivamente) y diferentes tiempos de extraccion (20 min, 40 min, 60 min, 80 min, respectivamente) para obtener diferentes muestras de extracto. El procedimiento BCA se uso para determinar la concentracion de protemas totales en cada muestra y ELISA se uso para determinar la concentracion 55 de rHSA en cada muestra. Los resultados se mostraron en las Figs. 1 y 2, respectivamente. Cada muestra se sometio a SDS-PAGE y la fotograffa de electroforesis se mostro en la Fig. 3.
Se puede observar por las Figs. 1 y 2 que con un incremento del tiempo y la temperatura de extraccion, las concentraciones de protemas totales y rHSA en el extracto del arroz molido tienden a incrementar
proporcionalmente. La temperatura de extraccion tuvo una mayor influencia sobre la eficiencia de extraccion que el tiempo de extraccion. La mayor eficiencia de extraccion de rHSA se obtuvo cuando la extraccion se llevo a cabo a 60°C durante 60 mins. Se observo por la fotograffa de electroforesis en la Fig. 3, bajo diferentes condiciones de temperatura y de tiempo, que las bandas espectrales de las protemas extrafdas teman una diferencia significativa en 5 el area en la que el peso molecular era mayor que el de la rHSA, mientras que las bandas espectrales eran identicas en el area en la que el peso molecular era inferior al de la rHSA en diferentes condiciones de extraccion.
Ejemplo 4: Efectos del valor de pH del buffer de extraccion y de la concentracion de sal de sulfato de amonio sobre el rendimiento de extraccion de rHSA
10
Este ejemplo empleo una condicion constante para extraer a 55°C durante 60 min. La relacion entre el arroz molido y el buffer de extraccion (p/v, kg/L) era de 1:5. Se llevaron a cabo combinaciones ortogonales en diferentes concentraciones de sulfato de amonio (0, 10, 30, 50 mM, respectivamente) y pH del buffer de extraccion (pH 6,5, 7,
7.5, 8, respectivamente). El procedimiento BCA se uso para determinar la concentracion de protemas totales y 15 ELISA se uso para determinar la concentracion de rHSA en cada muestra. Los resultados se mostraron en las Figs.
4 y 5, respectivamente. El SDS-PAGE de las muestras obtenidas por combinaciones ortogonales de diferentes concentraciones de sulfato de amonio y pH del buffer de extraccion se mostro en la Fig. 6.
Se puede observar por los resultados de las Figs. 4 y 5 que con un incremento de pH del buffer de extraccion y de la 20 concentracion de sal, las concentraciones de protemas totales y rHSA en el extracto de arroz molido tendfan a incrementar proporcionalmente, con una desviacion en casos individuales. El pH del buffer de extraccion tuvo una influencia significativamente mayor sobre el rendimiento de extraccion de rHSA que la concentracion de sal del buffer de extraccion. Bajo tal condicion en la que el pH del buffer de extraccion era de 7,5 y la concentracion de sal era de 10 mM, la eficiencia de extraccion de rHSA fue la mas alta. En comparacion con diferentes tiempos y 25 temperaturas de extraccion, diferentes pH y concentraciones de sal tuvieron solo una influencia inferior sobre las bandas de las protemas extrafdas. A un pH mas alto, hubo bandas ligeramente mas pequenas por encima de la banda principal de rHSA, mientras que otras bandas principales permanecieron identicas, como se muestra en la Fig. 6.
30 Ejemplo 5: Efectos del tiempo de precipitacion y de la concentracion de caprilato de sodio sobre el rendimiento de extraccion de rHSA
Las concentraciones de caprilato de sodio se proporcionaron como 10 mM, 20 mM, 30 mM y 40 mM respectivamente para comprobar si un incremento de la concentracion de caprilato de sodio tema un mejor efecto de 35 proteccion sobre la rHSA. Despues de la extraccion, se anadio acido acetico para ajustar el pH a 4,5, y la mezcla resultante se precipito durante 0h, 1h, 2h, 3h y durante la noche respectivamente para determinar la concentracion de la protema. El efecto de diferentes tiempos de precipitacion y concentraciones de caprilato de sodio sobre el extracto de protemas totales se mostro en la Fig. 7. El patron de SDS-PAGE de las muestras obtenidas en diferentes concentraciones de caprilato de sodio y tiempos de precipitacion se mostro en la Fig. 8. El extracto de las Figs. 7 y 8 40 se refenan a las muestras de la mezcla despues de la extraccion pero antes de ajustar el pH.
Se puede observar por las Figs. 7 y 8 que el impacto de ajustar el pH de la solucion de extraccion a 4,5 dio como resultado bastantes rHSA precipitadas. A medida que el tiempo de precipitacion incrementa, una porcion de rHSA precipitada se volvfa a diluir. Despues de la precipitacion durante la noche, la concentracion media de protemas 45 totales fue del 78% en base al valor antes de la precipitacion y no hubo ningun fenomeno de degradacion despues de la precipitacion durante la noche. Por otro lado tambien se precipitaron en gran medida bandas degradadas y protemas no objetivo durante el proceso de precipitacion. Se mostro que 20 mM de caprilato de sodio tuvo el mejor efecto de proteccion, mientras que una mayor concentracion causa una precipitacion incrementada.
50 Ejemplo 6: Efectos del pH y del tiempo sobre la eficiencia de precipitacion
Con el fin de determinar el efecto del pH y del tiempo de precipitacion sobre la eficiencia de precipitacion, el arroz molido se mezclo con un buffer de extraccion (25 mM de buffer fosfato, 10 mM de sulfato de amonio, 10 mM de caprilato de sodio, pH 7,5) en una relacion (p/v, kg/L) de 1:5, despues se extrajo a 60°C durante 1 hora con 55 remocion. El extracto resultante del grano de arroz molido se dividio en seis partes iguales, que se ajustaron a pH
4.5, 4,4, 4,3, 4,2, 4,1, 4,0, respectivamente. Los extractos con pH ajustado se sacudieron en un banco sacudidor a temperatura ambiente durante 1 y 2 horas respectivamente, seguido del muestreo. El patron de SDS-PAGE de las muestras se mostro en la Fig. 9. El extracto de la Fig. 9 se refena a la muestra de la mezcla despues de la extraccion, pero antes de ajustar el pH.
Se puede observar por el patron de SDS-PAGE de la Fig. 9 que a medida que el pH disminma, la eficiencia de precipitacion de las protemas no objetivo se aumentaba, junto con la perdida de rHSA. La extension del tiempo de precipitacion tiene un efecto positivo sobre la eficiencia de precipitacion. A un pH por debajo de 4,1, las bandas 5 macromoleculares se precipitaron completamente. Considerando los requisitos tecnicos del sistema de proceso y minimizando la perdida de rHSA objetivo, es preferible la precipitacion a pH 4,5.
Ejemplo 7: Comparacion entre los efectos de esterilizacion usando diferentes tamanos de membrana de fibras huecas de polietersulfona (PES) en la etapa de microfiltracion
10
1. Efecto de la microfiltracion con diferentes membranas de filtro sobre la retirada de bacterias en el arroz
Las muestras de la solucion usadas en este ejemplo eran un filtrado claro de la filtracion a presion, que se obtuvo por el tratamiento del arroz transgenico molido usando el proceso mejorado de acuerdo con la presente invencion en 15 produccion a escala piloto. Las muestras se trataron mediante columnas de fibras huecas pequenas con un tamano de poro de 0,20 pm y 0,45 pm respectivamente. Se recogio tanto la solucion original antes del tratamiento como el filtrado despues del tratamiento. 0,1 ml de la solucion original o sus soluciones de dilucion se aplicaron respectivamente sobre placas LB para analizar el efecto de esterilizacion de las dos membranas de filtro. Los resultados se mostraron en la Tabla 1. Se determinaron las concentraciones de albumina serica humana 20 recombinante y protemas totales en las soluciones antes o despues del filtrado, y se calcularon los porcentajes de albumina serica humana recombinante en las protemas totales. La grafica de barras de porcentaje se mostro en la Fig. 10.
Tabla 1
Grado de dilucion
1,0 10"' 10"2 10"3 10"4 10"5 UFC
Muestra tras filtracion a presion
382 37 2 2 0 1 3800
Muestra tras filtracion de 0,45 pm
41 7 0 0 0 0 400-700
Muestra tras filtracion de 0,20 pm
0 0 0 0 0 0 0
25
Se puede observar por los resultados de la tabla 1 que una membrana de fibras huecas de 0,45 pm puede retirar el 50%~90% de bacterias vivas en el filtrado de la filtracion a presion, en contraste una membrana de fibras huecas de 0,20 pm puede retirar el 100% de bacterias vivas en el filtrado de la filtracion a presion, garantizando que la contaminacion microbiana no se podna introducir en la etapa de purificacion posterior a traves del filtrado, 30 reduciendose de ese modo el contenido de endotoxinas bacterianas en el proceso de produccion.
Con respecto a la Fig.10, en comparacion con las muestras filtradas de membrana de fibras huecas de 0,20 pm y 0,45 pm, cuando se filtran con membrana de 0,20 pm, la perdida de albumina serica humana recombinante es muy inferior a la de protemas totales. El extracto que se filtro con membrana de 0,20 pm tuvo una concentracion 35 relativamente mayor de albumina serica humana recombinante.

Claims (8)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para extraer albumina serica humana recombinante a partir de grano de arroz transgenico, que comprende las etapas de:
    5
    1) retirar la cascara del arroz con cascara transgenico que contiene albumina serica humana recombinante, moler el grano de arroz descascarillado, seguido de la mezcla del grano de arroz transgenico molido con un buffer de extraccion que comprende buffer fosfato 10~30 mM, acetato de sodio 10~20 mM, sulfato de amonio 15~30 mM y caprilato de sodio 5~20 mM y un pH de 6,5~8, y la extraccion mediante agitacion para obtener la mezcla I;
    10
    2) ajustar el pH de la mezcla I de la etapa 1) a 4,0~4,5 y precipitarla durante 1~12 horas para obtener la mezcla II;
    3) filtrar la mezcla II de la etapa 2) y recoger el filtrado para obtener una solucion que contenga una alta concentracion de albumina serica humana recombinante.
    15
  2. 2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que en la etapa 1) dicho grano de arroz transgenico molido tiene una finura de malla de 80~120.
  3. 3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dicho buffer de extraccion tiene un pH 20 de 7,0~7,5.
  4. 4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dicho buffer de extraccion comprende
    buffer fosfato 25 mM, acetato de sodio 20 mM, sulfato de amonio 20 mM y caprilato de sodio 20 mM, y tiene un pH
    de 7,5.
    25
  5. 5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que en la etapa 1) dicho grano de arroz transgenico molido y dicho buffer de extraccion se mezclan en una relacion de p/v (kg/L) que oscila entre 1:5 y 1:10; el tiempo de extraccion es de 1~3 horas; y la temperatura de extraccion es de 45~60°C.
    30 6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que en la etapa 1) dicho grano de arroz
    transgenico molido y dicho buffer de extraccion se mezclan en una relacion de p/v (kg/L) de 1:5; el tiempo de extraccion es de 1~1,5 horas; y la temperatura de extraccion es de 55~60°C.
  6. 7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que en la etapa 2) dicha mezcla I se ajusta
    35 a pH 4,0~4,5 y despues se precipita durante 3~12 horas a temperatura ambiente.
  7. 8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 7, en el que en la etapa 2) dicha mezcla I se ajusta a pH 4,5 y se precipita durante la noche.
    40 9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que en la etapa 3) dicha etapa de filtracion
    comprende las etapas de filtrar por filtracion a presion con un filtro prensa de placas y marcos de tipo tela filtrante, despues filtrar por microfiltracion con una membrana de fibras huecas de polietersulfona.
  8. 10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que dicha membrana de fibras huecas de
    45 polietersulfona tiene un tamano de poro de 0,20 pm~0,45 pm.
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