ES2569718T3 - Nuevos compuestos que modulan la actividad de FXR (NR1H4) - Google Patents

Abstract

Un compuesto de acuerdo con la Fórmula (1), un enantiómero, diastereómero, tautómero, o sal farmacéuticamente aceptable del mismo**Fórmula** en la que R se selecciona del grupo que consiste de COOR6, CONR7R8, tetrazolilo, SO2NR7R8, alquilo C1-6, SO2-alquilo C1- 6 y H, en el que R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste de H o alquilo C1-6, y R7 y R8 seleccionados independientemente entre sí del grupo que consiste de H, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, alquilen C1- 6 -R9, SO2-alquilo C1-6, en el que R9 está seleccionado del grupo que consiste en COOH, OH y SO3H; A se selecciona del grupo que consiste de fenilo, piridilo, pirimidilo, pirazolilo, indolilo, tienilo, benzotienilo, indazolilo, bencisoxazolilo, benzofuranilo, benzotriazolilo, furanilo, benzotiazolilo, tiazolilo, oxadiazolilo, cada uno opcionalmente sustituido con uno o dos grupos seleccionados independientemente del grupo que consiste en OH, O-alquilo C1-6, O-haloalquilo C1-6, alquilo, haloalquilo C1-6, cicloalquilo C3-6 y halógeno; Q se selecciona del grupo que consiste de fenilo, piridilo, tiazolilo, tiofenilo, pirimidilo, cada uno opcionalmente sustituido con uno o dos grupos seleccionados independientemente del grupo que consiste de alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, halógeno y CF3; Y se selecciona de N o CH; Z se selecciona de**Fórmula** en las que X >= CH, N, NO; R1 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo C1-3, cicloalquilo C3-6, alquilcicloalquilo C4-5, en en el que alquilo C1-3 está opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, hidroxi o alcoxi C1-6; R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo C1-3, haloalquilo C1- 3, alcoxi C1-3, haloalcoxi C1-3 y halógeno.

Description

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reducción del peso corporal en los ratones sobrealimentados con una dieta elevada en lípidos (C. Lihong y col., American Diabetes Association (ADA) 66a sesiones científicas anuales, junio de 2006, resumen número 856-P). Este efecto de pérdida de peso puede ser el resultado de la inducción de FGF-19 del FXR, un factor de crecimiento fibroblástico que es conocido por conducir a la pérdida de peso y fenotipo de atleta (J. Holt y col., Genes Dev. 2003, 17, 1581; E. Tomlinson y col., Endocrinology 2002, 143, 1741). En solicitudes de patente recientes, se demostró el efecto del agonista de FXR sobre la reducción del peso corporal (WO 2004/087076; WO 2003/080803).

Tomados en conjunto, estos efectos farmacológicos de los agonistas de FXR pueden aprovecharse de diferentes formas terapéuticas: se cree que los compuestos de unión de FXR son buenos candidatos para el tratamiento de la diabetes de Tipo II debido a su sensibilidad a la insulina y efectos glicogenogénicos y de disminución de lípidos.

En una realización, los compuestos de acuerdo con la invención y las composiciones farmacéuticas que comprenden dichos compuestos se utilizan en la profilaxis y/o el tratamiento de la diabetes de Tipo II que puede ser superada mediante la regulación positiva mediada por FXR, de la sensibilidad sistémica a la insulina y la señalización intracelular a la insulina en el hígado, el incremento en la utilización y la metabolización de glucosa periférica, el incremento del almacenamiento de glicógeno en el hígado, la disminución de la producción de glucosa en suero a partir de la gluconeogénesis originada en el hígado.

En una realización adicional, dichos compuestos y composiciones farmacéuticas se utilizan para la profilaxis y/o el tratamiento de trastornos intrahepáticos crónicos, tal como cirrosis biliar primaria (PBC), colangitis esclerosante primaria (PSC), colestasis familiar progresiva (PFIC), cirrosis inducida por alcohol y colestasis asociada, y algunas formas de trastornos extrahepáticos colestáticos, o fibrosis hepática resultante de trastornos colestáticos crónicos o trastornos colestáticos intrahepáticos agudos tal como colestasis inducida por estrógenos o fármacos.

La invención también se refiere a un compuesto de la Fórmula (I) o a la composición farmacéutica que comprende dicho compuesto para la profilaxis y/o el tratamiento de dolencias gastrointestinales con un consumo reducido de grasa dietaria y vitaminas dietarias solubles en grasa que pueden superarse por incremento de los niveles intestinales de los ácidos biliares y fosfolípidos.

En una realización adicional, dicho compuesto o composición farmacéutica se utiliza para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste de trastornos de lípidos y lipoproteínas tales como hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, y ateroesclerosis como una condición clínicamente manifiesta que puede mejorarse mediante el efecto beneficioso del FXR sobre la disminución del colesterol plasmático total, reduciendo los triglicéridos séricos, aumentando la conversión de colesterol hepático a ácidos biliares e incrementando la eliminación y la conversión metabólica de VLDL y otras lipoproteínas en el hígado.

En una realización adicional, dicho compuesto y composición farmacéutica se utilizan para la profilaxis y/o el tratamiento de enfermedades donde la combinación de la disminución de lípidos, los efectos anticolestáticos y antifibróticos de los medicamentos dirigidos a FXR se puede explotar para el tratamiento de esteatosis hepática y síndromes asociados tales como esteatohepatitis no alcohólica (“NASH”) o para el tratamiento de los efectos colestáticos y fibróticos que se asocian a la cirrosis inducida por alcohol, o con formas de hepatitis originadas por virus.

Junto con los efectos hipolipidémicos, también se demostró que la pérdida de FXR funcional conduce a un incremento en ateroesclerosis en ratones knock-out ApoE (E. A. Hanniman y col., J. Lipid Res. 2005, 46, 2595). Por consiguiente, los agonistas de FXR podrían tener utilidad clínica como fármacos anti-ateroescleróticas y cardioprotectoras. La regulación negativa de Endotelina-1 en las Células del Músculo Liso Vascular también podría contribuir a dichos efectos terapéuticos beneficiosos (F. He y col., Circ. Res. 2006, 98, 192).

La invención también se refiere a un compuesto de acuerdo con la Fórmula (1) o una composición farmacéutica que comprende dicho compuesto para tratamiento preventivo y postraumático de trastornos cardiovasculares tales como infarto agudo del miocardio, accidente cerebrovascular grave, o trombosis que ocurre como culminación de aterosclerosis obstructiva crónica.

Además de controlar la formación de pólipos intestinales y colónicos, el FXR parece expresarse en el tejido y las líneas celulares del cáncer de mama pero no en el tejido sano de mama y parece interactuar con el receptor de estrógeno en las células de cáncer de mama ER positivo (K. E. Swales y col., Cancer Res. 2006, 66, 10120 y F. Journe y col., Breast Cancer Res. Treat. 2009, 115, 523).

Esto permitiría considerar al FXR también como una diana potencial para el tratamiento de enfermedades proliferativas, especialmente formas de cáncer metastásico que expresan una forma de FXR que responde a moléculas pequeñas.

En una realización adicional, dichos compuestos y composiciones farmacéuticas se utilizan para la profilaxis y/o el tratamiento de trastornos hiperproliferativos malignos tales como diferentes formas de cáncer, específicamente ciertas formas de cáncer de mama, hígado o colon, donde la interferencia con un ligando de FXR tendrá un impacto beneficioso.

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Finalmente, el FXR también parece estar involucrado en el control de las defensas antibacterianas en el intestino (T. Inagaki y col., PNAS. 2006, 103, 3920) aunque no se proporciona un mecanismo exacto. Sin embargo, a partir de estos datos publicados, se puede concluir que el tratamiento con agonistas de FXR podría tener un impacto beneficioso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias intestinales (IBD), en particular aquellas formas donde la parte superior (ileal) del intestino es afectada (por ejemplo, enfermedad ileal de Crohn) ya que esta parece ser el sitio de acción del control de FXR sobre el crecimiento bacteriano. En las IBD, la desensibilización de la respuesta inmune adaptativa es de alguna forma perjudicada en el sistema inmune intestinal. El sobrecrecimiento bacteriano podría ser, entonces, el detonante causal del establecimiento de una respuesta inflamatoria crónica. Así, la reducción del crecimiento bacteriano por mecanismos originados por FXR podría ser un mecanismo clave para prevenir episodios inflamatorios agudos.

Por lo tanto, la invención también se refiere a un compuesto de acuerdo con la Fórmula (I) o una composición farmacéutica que comprende dicho compuesto para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad relacionada con enfermedades inflamatorias intestinales tales como enfermedad de Crohn o Colitis ulcerosa. Se cree que la restauración mediada por FXR de la función de la barrera intestinal y la reducción en la carga bacteriana no comensal son útiles para la reducción de la exposición de antígenos bacterianos al sistema inmune intestinal y puede, por lo tanto, reducir las respuestas inflamatorias.

La invención se refiere además a un compuesto o una composición farmacéutica para la profilaxis y/o el tratamiento de la obesidad y trastornos relacionados tales como síndromes metabólicos (dolencias combinados de dislipidemias, diabetes e índices de masa corporal anormalmente elevados) que pueden superarse por la disminución mediada por FXR de triglicéridos séricos, glucosa en sangre e incremento de la sensibilidad de insulina y la pérdida de peso mediada por FXR.

En una realización adicional, los compuestos o la composición farmacéutica de la presente invención son útiles en la prevención y/o el tratamiento de complicaciones clínicas de la diabetes de Tipo I y Tipo II. Son ejemplos de dichas complicaciones la nefropatía diabética, la retinopatía diabética, la neuropatía diabética, o la enfermedad vascular periférica oclusiva (PAOD). La presente invención también abarca otras complicaciones clínicas de la diabetes.

Asimismo, también se pueden evitar y/o tratar las dolencias y enfermedades que sean resultado de la degeneración crónica de grasas y fibrótica de órganos debido a la acumulación forzosa de lípidos y específicamente triglicéridos y subsiguiente activación de las rutas profibróticas mediante la aplicación de los compuestos o composición farmacéutica de la presente invención. Dichas dolencias y enfermedades abarcan esteatohepatitis no alcohólica (NASH) y dolencias colestáticas crónicas en el hígado, glomeruloesclerosis y nefropatía diabética en el riñón, degeneración macular y retinopatía diabética del ojo y enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Alzheimer en el cerebro, o neuropatías diabéticas en el sistema nervioso periférico.

En uso práctico, los compuestos de la presente invención pueden combinarse como principio activo en mezcla completa con un transportador farmacéutico de acuerdo con técnicas de formulación farmacéutica convencionales. El transportador puede tener una amplia variedad de formas dependiendo de la forma de preparación deseada para la administración, por ejemplo, oral o parenteral (incluyendo intravenosa). En la preparación de composiciones para forma de dosificación oral, puede emplearse cualquiera de los medios farmacéuticos usuales, tales como, por ejemplo, agua, glicoles, aceites, alcoholes, agentes saborizantes, preservantes, agentes colorantes y lo similar en el caso de preparaciones orales líquidas, tales como, por ejemplo, suspensiones, elíxires y soluciones; o portadores tales como almidones, azúcares, celulosa microcristalina, diluyentes, agentes granulantes, lubricantes, aglutinantes, agentes desintegrantes y lo similar en el caso de preparaciones sólidas tales como, por ejemplo, polvos, cápsulas y tabletas duras y blandas, siendo las preparaciones orales sólidas preferidas sobre las preparaciones líquidas.

Debido a su fácil administración, los comprimidos y las cápsulas representan la forma de dosificación unitaria oral más ventajosa en cuyo caso obviamente se utilizan transportadores farmacéuticos sólidos. Si se desea, los comprimidos se pueden recubrir mediante técnicas usuales acuosas o no acuosas. Dichas composiciones y preparaciones deben contener al menos 0,1 por ciento de principio activo. El porcentaje de principio activo en estas composiciones puede, desde luego, ser variado y puede estar convenientemente entre aproximadamente 2 por ciento a aproximadamente 60 por ciento de peso de la unidad. La cantidad de compuesto activo en dichas composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtendrá una dosificación efectiva. Los principios activos también pueden administrarse intranasalmente como, por ejemplo, gotas líquidas o aerosol.

Los comprimidos, píldoras, cápsulas, y similares también pueden contener un aglutinante tal como goma tragacanto, acacia, almidón de maíz o gelatina; excipientes tales como fosfato de dicalcio; un agente desintegrante tal como almidón de maíz, almidón de papa, ácido algínico; un lubricante tal como estearato de magnesio; y un agente endulzante tal como sacarosa, lactosa o sacarina. Cuando una forma de dosificación unitaria es una cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo que antecede, un transportador líquido tal como un aceite graso.

Otros muchos materiales pueden estar presentes como recubrimientos o para modificar la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, los comprimidos pueden recubrirse con goma laca, azúcar o ambos. Un jarabe o elixir puede contener, además del principio activo, sacarosa como un agente endulzante, metil y propilparabenos como preservantes, un colorante y un saborizante tal como sabor a cereza o naranja.

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A continuación se muestra una ilustración de la preparación de los compuestos de la presente invención. A menos que se indique lo contrario en los Esquemas, las variables tienen el mismo significado que el descrito anteriormente. Los Ejemplos presentados a continuación están dirigidos a ilustrar realizaciones particulares de la invención. Los materiales de partida, los bloques de construcción y los reactivos adecuados empleados en la síntesis como se describe a continuación se encuentran disponibles comercialmente en Sigma-Aldrich o Acros Organics, por ejemplo,

o pueden ser preparados rutinariamente mediante los procedimientos descritos en la literatura, por ejemplo en "March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, y Structure", 5ª edición; John Wiley & Sons o T. Eicher, S. Hauptmann "The Chemistry de Heterocíclicos; Structures, Reactions, Synthesis y Application", 2da edición, Wiley-VCH 2003; Fieser y col. “Fiesers´ Reagents for Organic Synthesis” John Wiley & Sons 2000.

Ejemplos

Ejemplo 1: 3-((1s,3s)-3-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3-(2,6-diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)-3hidroxiciclobutil)benzoato de metilo (1)

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Etapa 1: 4-((4-Bromo-3-clorofenoxi)metil)-5-ciclopropil-3-(2,6-diclorofenil)-isoxazol (1a)

A una solución de (5-ciclopropil-3-(2,6-diclorofenil)isoxazol-4-il)metanol (13 g, 45,8 mmol) en CH2Cl2 (DCM) (200 ml) se añadió gota a gota SOCl2 (40 ml, 336 mmol). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 h y se retiraron los disolventes bajo presión reducida. Se disolvió el residuo en N,N-dimetilformamida (DMF) (200 ml) y se añadieron 4-bromo-3-clorofenol (9,7 g, 47 mmol), K2CO3 (40 g, 290 mmol) y NaI (12 g, 80 mmol) a esta solución. Se agitó la mezcla a 60 ºC durante la noche, a continuación se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con agua (1000 ml) y se extrajo con acetato de etilo (EA) (500 ml × 3). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (500 ml × 3), se secaron con Na2SO4 y se concentraron al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía instantánea sobre gel de sílice (CC) para proporcionar el compuesto 1a del título (19 g, 88 %) como un sólido blanco.

Etapa 1: 3-(2,2-dicloro-3-oxociclobutil)benzoato de metilo (1b)

En un matraz de tres bocas de fondo redondo, bajo atmósfera de nitrógeno, provisto de un condensador, un cabezal agitador y embudo de adición con compensación de presión, se disolvió 3-vinilbenzoato de metilo (5 g, 31 mmol) en Et2O anhidro (150 ml). A este matraz se añadió polvo de zinc (6 g, 3 eq) y la reacción se sometió a ultrasonidos durante 30 min. Después de este tiempo se añadió gota a gota una solución de cloruro de tricloroacetilo (8,7 ml, 2,5 eq) en Et2O anhidro (50 ml) mientras continuaba la sonicación durante los siguientes 30 min. Durante el procedimiento la mezcla de reacción se calentó a 35 ºC. Se continuó la sonicación durante 2,5 h a temperatura de reflujo y la reacción pareció estar completa por análisis de RMN 1H. Se dejó enfriar la reacción a temperatura ambiente y se inactivó con agua (~50 ml). Esto se hizo de gota a gota intermitente varias veces durante unos pocos minutos ya que ocurrió una reacción exotérmica demorada. Después de 20 min de agitar en agua, la mezcla de reacción se filtró a través de un lecho de celite y se enjuagó con Et2O. La capa orgánica se lavó con porciones de agua (2 x 250 ml), solución saturada de bicarbonato de sodio (2 x 250 ml) y salmuera (1 x 250 ml), se secó con sulfato de sodio, se filtró y se concentró bajo presión reducida para proporcionar el producto bruto 1b como un aceite espeso amarillo oscuro. (crudo 8,7 g).

Etapa 2: 3-(3-oxociclobutil)benzoato de metilo (1c)

El compuesto crudo 1b (8,7 g) se disolvió en ácido acético glacial (55 ml) en un matraz de fondo redondo bajo una atmósfera de nitrógeno. A este matraz se le añadió polvo de zinc (4,6 g, 2,2 eq) y la reacción se agitó y se calentó a 120 ºC durante 3 h. Después de enfriar a temperatura ambiente, se filtró a través de un lecho de celite, que se lavó con porciones de EA. La solución combinada se concentró bajo presión reducida antes de disolverse en EA (500 ml), se lavó con salmuera (150 ml x 2) y luego se secó con sulfato de sodio, se filtró y se concentró nuevamente. La mezcla cruda se agitó durante 5 min en cloroformo (250 ml) y se filtró a través de un embudo sinterizado. El filtrado se concentró para proporcionar el producto bruto como un aceite amarillo pálido. El producto bruto se purificó mediante CC en (PE/EA = 9:1, PE = éter de petróleo) para proporcionar el producto deseado 1c (2,5 g, 38% por 2 etapas) como un aceite amarillo pálido.

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filtró y se concentró para proporcionar un aceite pardo (2,2 g). La purificación mediante CC (6×13 cm, preadsorción con CH2Cl2, tolueno/EA 3:1) proporcionó la ciclobutanona 7b (115,5 mg, 31 %) como un aceite amarillo. RMN 1H (DMSO-d6) δ: 6,81 (s, 1H), 4,58 (sept, J = 6,5 Hz, 1H), 3,78 (s, 3H), 3,85-3,73 (m, 1H), 3,59-3,45 (m, 2H), 3,37-3,24 (m, 2H, parcialmente superpuesta por la señal de agua), 1,39 (d, J = 6,6 Hz, 6H). C12H16N2O3 (236,27). CL-EM (IEN): 237 [M+H]+.

Etapa 3: 5-3-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3-(2,6-diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)-3-hidroxiciclobutil)-1-isopropil-1Hpirazol-3-carboxilato de metilo (7 – ambos isómeros)

Se enfrió a –78 ºC una solución del bromuro 1a (368 mg, 0,78 mmol) en THF anhidro (6 ml) y se añadió gota a gota una solución 1,6 M de n-butilitio en hexanos (0,48 ml, 0,76 mmol). Se agitó la mezcla a –78 ºC durante 20 min y se añadió gota a gota una solución de la ciclobutanona 7b (164 mg, 0,69 mmol) en THF anhidro (4 ml). La mezcla se agitó a –78 ºC durante 2,5 h y se añadió gota a gota solución acuosa saturada de NH4Cl (1 ml) a esta temperatura. Se retiró el baño de enfriamiento y la mezcla se dejó entibiar a temperatura ambiente y se agitó a temperatura ambiente durante 0,5 h. Se añadió luego la mezcla a una solución diluida acuosa de NH4Cl y se extrajo tres veces con EA. La capa orgánica combinada se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró para dar 516 mg de un aceite casi incoloro. La purificación mediante CC (4,5×23 cm, preadsorción con CH2Cl2, eluyente hexano/acetona = 2:1) proporcionó la ciclobutanona 7b recuperada (31,3 mg, 19 %, aceite levemente amarillo) y producto impuro (333 mg). La repurificación mediante CC (4×22 cm, hexano/EA = 1:1) o TLC preparativa proporcionó el producto puro 7 (isómero principal) (210 mg, 48 %) como una espuma blanca y el producto 7 (isómero secundario) (5,1 mg, 1 %) como un sólido blancuzco. 7 (isómero secundario) RMN 1H (DMSO-d6) δ: 7,83 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,62 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,23 (tipo t dd, J = 8,1 Hz, 1H), 6,94 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 6,93-6,87 (m, 1H), 6,79 (dd, J = 8,4 Hz, 2,0, 1H), 6,69 (s, 1H), 5,80 (s, 1H), 4,91 (tipo q m, J = 17,3, 8,3 Hz, 2H), 4,43 (tipo quint m, J = 6,6 Hz, 1H), 3,79 (s, 3H), 3,272,95 (m, 3H, parcialmente superpuesto por la señal de agua), 2,60-2,35 (m, 3H, parcialmente superpuesto por la señal de DMSO), 1,33 (d, J = 6,6 Hz, 6H), 1,29-1,08 (m, 4H). C31H30Cl3N3O5 (630,95). CL-EM (IEN): 630, 632 [M+H]+. 7 (isómero principal) RMN 1H (DMSO-d6) δ: 7,65 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,62 (s, 1H), 7,59-7,48 (m, 2H), 6,92 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 8,6, 2,6 Hz, 1H), 6,66 (s, 1H), 5,49 (s, 1H), 4,92 (s, 2H), 4,42 (tipo quint m, J = 6,5 Hz, 1H), 3,78 (s, 3H), 3,24-3,11 (m, 2H, parcialmente superpuesto por la señal de agua), 3,04-2,90 (m, 1H), 2,54-2,33 (m, 3H, parcialmente superpuesto por la señal de DMSO), 1,32 (d, J = 6,5 Hz, 6H), 1,26-1,08 (m, 4H). C31H30Cl3N3O5 (630,95). CL-EM (IEN): 630, 632 [M+H]+.

Ejemplo 8: Acido 5-3-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3-(2,6-diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)-3hidroxiciclobutil)-1-isopropil-1H-pirazol-3-carboxílico (8)

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Se disolvió el éster 7 (isómero principal) (98,3 mg, 0,156 mmol) en una mezcla de THF (7,5 ml), MeOH (2,5 ml) y agua (2,5 ml) y se añadió LiOH·H2O (65 mg, 1,56 mmol) a temperatura ambiente. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 18 h. La mezcla se repartió entre una solución acuosa diluida de NH4Cl y EA y la capa orgánica se lavó una vez con agua. La capa acuosa combinada se extrajo dos veces con EA. La capa orgánica combinada se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró para proporcionar 103 mg de un sólido casi blanco. El producto se purificó mediante CC (3×3,5 cm, EA/EtOH = 10:1 a 1:4) para proporcionar 8 (94,8 mg, 99 %) como un sólido blanco. RMN 1H (DMSO-d6) δ: 7,66-7,60 (m, 1H), 7,62 (s, 1H), 7,59-7,49 (m, 2H), 6,91 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 8,6, 2,4 Hz, 1H), 6,38 (s, 1H), 5,51 (s, 1H, intercambiable con D2O), 4,92 (s, 2H), 4,31 (tipo quint m, J = 6,5 Hz, 1H), 3,253,08 (m, 2H, parcialmente superpuesto por la señal de agua), 2,93-2,77 (m, 1H), 2,57-2,43 (m, 1H, oculto por la señal de DMSO), 2,43-2,29 (m, 2H, parcialmente superpuesto por la señal de DMSO), 1,29 (d, J = 6,5 Hz, 6H), 1,261,08 (m, 4H). La señal de CO2H no aparece en el espectro. C30H28Cl3N3O5 (616,92). CL-EM (IEN): 616, 618 [M+H]+.

Ruta alternativa al Ejemplo 8(isómero principal)

Etapa 1: 1-(3-Metilenociclobutil)etanona (8a)

Se disolvió metilenciclobutano carbonitrilo (5,0 g, 53,7 mmol) en Et2O seco (25 ml), se enfrió en un baño de hielo y se añadió gota a gota MeMgBr (26,8 ml, 80,5 mmol, 3 M sol. en Et2O). Se dejó agitando la mezcla durante la noche a temperatura ambiente, se enfrió a 0 ºC, se inactivó cuidadosamente con solución acuosa de NaHSO4 al 15 % (100 ml), se agitó a temperatura ambiente durante 30 min y luego las capas fueron separadas. La fase acuosa se extrajo con pentano (50 ml) y Et2O (50 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera y se secaron con Na2SO4. Se evaporaron los disolventes cuidadosamente sin calentar y se obtuvo el producto bruto 8a (5,6 g) como

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un líquido amarillento. RMN 1H (CDCl3), δ: 4,81-4,79 (m, 2H), 3,27-3,19 (m, 1H), 2,92-2,40 (m, 4H), 2,13 (s, 3H).

Etapa 2: 4-(3-metilenciclobutil)-2,4-dioxobutanoato de etilo (8b)

Se disolvió sodio (1,15 g, 49,9 mmol) en EtOH seco (30 ml, desnaturalizado con éter al 5 %). El compuesto crudo 8a (5,5 g, 50 mmol) se disolvió en EtOH seco (45 ml) y se añadió la solución anteriormente preparada de etóxido de sodio. Esta mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 min y a continuación se añadió oxalato de dietilo (6,8 ml, 50 mmol) gota a gota. La mezcla de reacción se introdujo en un baño de aceite precalentado (a 67 ºC) y se agitó a esta temperatura durante 4,5 h. La mezcla se dejó a temperatura ambiente durante la noche y luego la mezcla de reacción se evaporó, se añadieron EA (100 ml) y HCl 1 N (70 ml) y se separó la fase orgánica y la fase acuosa se volvió a extraer con EA (50 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua, salmuera y se secaron con Na2SO4. El disolvente se eliminó bajo presión reducida y el residuo se purificó sobre sílice utilizando hexanos/MTBE

9:1 como eluyente, brindando el producto puro 8b (6,29 g, 56 % sobre dos etapas). 1H-NMR (CDCl3), δ: 6,36 (s, 1H, tautómero enol), 4,84-4,82 (m, 2H), 4,34 (q, 2H), 3,33-3,25 (m, 1H), 3,03-2,75 (m, 4H), 1,36 (t, 3H) MS: 211,2 [M+H]+.

Etapa 3: 1-isopropil-5-(3-metilenciclobutil)-1H-pirazol-3-carboxilato de etilo (8c)

Se disolvió el compuesto 8b (6,29 g, 29,9 mmol) en EtOH seco (65 ml, desnaturalizado con 5 % de MeOH) y se añadió clorhidrato de isopropil hidrazina (3,97 g, 35,9 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 3 h a temperatura ambiente. El análisis CLEM indicó la conversión completa y la presencia de aprox. 1 % del otro isómero. Se evaporó la mezcla de reacción y al residuo oleoso se añadieron EA (100 ml), agua (50 ml) y solución saturada de NaHCO3 (50 ml). Se separaron las capas y la fase acuosa se volvió a extraer con EA (50 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (70 ml) y se secaron con Na2SO4. El disolvente se evaporó en un equipo de evaporación con rotación y el residuo se secó bajo presión reducida para obtener el producto bruto 8c (7,0 g). RMN 1H (CDCl3), δ: 6,62 (s, 1H), 4,86-4,84 (m, 2H), 4,40-4,18 (m, 3H), 3,55-3,47 (m, 1H), 3,15-3,08 (m, 2H), 2,88-3,80 (m, 2H), 1,49 (d, 6H), 1,37 (t, 3H). MS: 249,5 [M+H]+.

Etapa 4: 1-isopropil-5-(3-oxociclobutil)-1H-pirazol-3-carboxilato de etilo (8d)

Se disolvió el compuesto crudo 8c (6,45 g, 26,0 mmol) en una mezcla de MeCN (77 ml) y agua (13 ml) y se enfrió en un baño de hielo. A esta solución se añadió RuCl3×H2O (0,19 g, 0,86 mmol), seguido por la adición en porciones de NaIO4 (19,4 g, 90,9 mmol). Se observó exotermia durante esta adición. La suspensión espesa obtenida se agitó a temperatura ambiente durante 45 min. Se diluyó la mezcla de reacción con solución acuosa de Na2S2O3 (10 %, 260 ml), agua (50 ml) y diclorometano (100 ml). Se separaron las fases y se extrajo la fase acuosa con diclorometano (2×70 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con solución acuosa de Na2S2O3 (10 %, 50 ml), agua (100 ml), salmuera (100 ml) y se secaron con Na2SO4. El producto bruto (6,5 g) se purificó sobre sílice, se eluyó con hexanos/MeOtBu para proporcionar el producto puro 8d (5,8 g, 78 % en dos etapas) como un aceite que solidificó con el almacenamiento en el refrigerador. 1H-NMR (DMSO-d6), δ: 6,78 (s, 1H), 4,61-4,54 (m, 1H), 4,26 (q, 2H), 3,823,73 (m, 1H), 3,55-3,45 (m, 2H), 3,35-3,26 (m, 2H), 1,39 (d, 6H), 1,28 (t, 3H). MS: 251,3 [M+H]+.

Etapa 5: 4-((4-Bromo-3-clorofenoxi)metil)-5-ciclopropil-3-(2,6-diclorofenil)isoxazol (8e)

Se mezcló cloro-4-bromofenol (3,8 g, 18,3 mmol) con (5-ciclopropil-3-(2,6-diclorofenil)isoxazol-4-il)metanol (3,47 g, 12,2 mmol) y trifenilfosfina (6,41 g, 24,4 mmol) en tolueno (150 ml). La mezcla se enfrió en un baño de hielo-agua y se añadió DIAD (4,8 ml, 24,4 mmol) gota a gota en forma de disolución en tolueno (10 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 21 h y los disolventes se eliminaron en un equipo de evaporación con rotación dejando un residuo oleoso amarillo. Este se disolvió en DCM (200 ml), se añadió sílice (∼20 g) y la mezcla se evaporó a sequedad. Este material se cargó en la parte superior de una columna de gel de sílice y se purificó eluyendo con hexanos/MTBE 9:1. Las fracciones que contenían producto se combinaron y el disolvente se eliminó a presión reducida, dejando el producto puro 8e como un aceite incoloro, que cristalizó tras su secado al vacío durante la noche. Rendimiento: 5,07 g (88 %). RMN 1H (CDCl3), δ (ppm): 7,45-7,30 (m, 4H), 6,90 (s, 1H), 6,60-6,55 (m, 1H), 2,15-2,07 (m, 1H), 1,32-1,25 (m, 2H), 1,20-1,11 (m, 2H).

Etapa 6: 5-3-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3-(2,6-diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)-3-hidroxiciclobutil)-1-isopropil-1Hpirazol-3-carboxilato de etilo (8f)

Se disolvió LiCl (684 mg, 16,2 mmol) en THF (20 ml) a temperatura ambiente y se añadió iPrMgCl (2,0 M en THF, 8,1 ml, 16,2 mmol). La mezcla se agitó durante 10 min a temperatura ambiente, se enfrió en un baño de hielo y se añadió una solución de bromuro 1a (2,55 g, 5,38 mmol) en THF (20 ml) a lo largo de 5 min. El baño de enfriamiento se retiró y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 h. Se enfrió la mezcla a –10 ºC y se añadió rápidamente una solución del compuesto 8d (1,48 g, 5,92 mmol) en THF (16 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 90 min y a continuación se añadió NaHSO4 acuoso 0,5 M (35 ml) y EA (50 ml). La mezcla resultante se agitó durante 10 min, se separaron las capas y se extrajo la capa acuosa con EA (30 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con NaHCO3 acuoso (50 ml), salmuera (50 ml) y se secaron con Na2SO4. Purificación en columna de sílice, eluyendo con hexanos/EA 3:2 para proporcionar el producto puro 8e (1,62 g 49 %) como una espuma sólida. RMN 1H es de acuerdo con los espectros obtenidos en el Ejemplo 7. MS: 646,9 [M+H]+.

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Etapa 7: Acido 5-3-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3-(2,6-diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)-3-hidroxiciclobutil)-1isopropil-1H-pirazol-3-carboxílico (8)

Se disolvió el compuesto 8e (1,60 g, 2,48 mmol) en THF (100 ml), a continuación se añadieron secuencialmente MeOH (50 ml), agua (50 ml) y LiOH×H2O (1,04 g, 24,8 mmol). La mezcla se agitó durante 4,5 h a temperatura

5 ambiente y a continuación se colocó en un equipo de evaporación con rotación para remover MeOH y THF. Se acidificó la solución acuosa remanente mediante la adición de Una solución acuosa de HCl 1 N (24 ml) hasta alcanzar un pH de 4,05 (control de pH con electrodo). A un pH de aproximadamente 7 ya comenzó a formarse un precipitado. Se separó por filtración el sólido formado, se lavó sobre el filtro con agua y se secó bajo vacío a temperatura ambiente para proporcionar el producto 8 (1,40 g 92 %) como un polvo blanco.

10 Ejemplo 8A: 5-((1r,3r)-3-(2-Cloro-4-((5-ciclopropil-3-(2,6-diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)-3hidroxiciclobutil)-1-isopropil-1H-pirazol-3-carboxilato (8A)

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El ejemplo 8A se puede preparar sometiendo el producto bruto 8f a hidrólisis del éster como se ha descrito para 8 y aislamiento del producto 8 bruto como isómero minoritario mediante RP-HPLC preparativa. RMN 1H (CDCl3), δ

15 (ppm): 7,42-7,30 (m, 2H), 7,11 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,75-6,65 (m, 1H), 6,57 (s, 1H), 4,79 (s, 2H), 4,50-4,41 (m, 1H), 3,96-3,85 (m, 1H), 2,98-2,90 (m, 2H), 2,67-2,57 (m, 2H), 2,20-2,09 (m, 1H), 1,51 (d, J = 8,0 Hz, 6H), 1,32-1,14 (m, 4H). RMN 13C (CDCl3), δ (ppm): 172,6, 166,2, 159,2, 158,4, 147,4, 141,2, 135,7, 134,6, 132,8, 131,3, 128,1, 127,7, 127,5, 116,8, 113,5, 110,0, 105,8, 75,1, 59,8, 51,2, 41,8, 25,4, 22,6, 8,5, 7,8, EM (IEN+) m/z: 616,3 [M+1]+.

La configuración transanular del isómero principal (compuesto 8) y del isómero minoritario (compuesto 8A) se

20 confirmaron mediante experimentos NOE. Los NOE detectados indicativos entre protones se indican en las siguientes imágenes mediante las flechas dobles:

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NOE detectados para el ejemplo 8, con una configuración transanular 1,3-trans de los restos aromáticos

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(continuación)

n.º Estructura Datos analíticos

RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): δ 1,13-1,20 (m, 4H), 1,31 (d, J = 6,0 Hz, 6H), 2,36-2,47 (m, 3H), 2,59-2,63 (m, 2H), 2,89-2,93 (m, 1H), 3,17-3,19 (m, 2H), 3,47-3,52 (m, 2H), 4,33-4,39 (m, 1H), 4,92 (s, 2H ), 5,51 (s, 1H), 6,50 (s, 1H), 6,76 (dd, J = 2,4 Hz, J = 8,4 Hz, 1H), 6,91 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,51-7,58 (m, 2H), 7,62-7,65 (m, 2H), 8,18-8,20 (m, 1H); MS Calculado: 744; MS Encontrado: 721 [M-Na]-.

RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): δ 1,10∼1,25 (m, 4H), 1,34 (d, J = 6,4 Hz, 6H), 3,03-2,95 (m, 1H), 2,50-2,30 (m, 3H), 3,20-3,10 (m, 2H), 4,50-4,35 (m, 1H), 4,92 (s, 2H), 5,5 (s, 1H), 6,92 (s, 1H), 6,78-6,70 (m, 2H), 7,70-7,49 (m, 4H), 11,44 (s, 1H); MS Calculado: 694; MS Encontrado: 695 [M+H]+.

El siguiente compuesto puede prepararse de la misma manera usando procedimientos similares a los descritos anteriormente:

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Ensayos

Ensayo de actividad FRET

La determinación de la interacción de péptido y cofactor mediada por ligando para cuantificar la unión del ligando al receptor nuclear FXR se realizó de la siguiente manera: Preparación de dominio de unión a ligando de FXR alfa humano: el LBD FXR alfa humano se expresó en la cepa E. coli BL21(DE3) como una proteína de fusión marcada con GST en el extremo N. El ADN que codifica el dominio de unión a ligando FXR se clonó dentro del vector pDEST15 (Invitrogen). La expresión estuvo bajo el control de un promotor T7 inducible por IPTG. Los límites de aminoácidos del dominio de unión a ligando fueron los aminoácidos 187–472 de la entrada de la base de datos NM_005123 (RefSeq). Expresión y Purificación del FXR-LBD: Un precultivo realizado durante la noche de una cepa

E. coli transformada se diluyó 1:20 en medio LB-Ampicilina y se dejó crecer a 30 ºC hasta una densidad óptica de DO600=0,4–0,6. La expresión génica se indujo a continuación mediante la adición de IPTG 0,5 mM. Se incubaron las células durante otras 6 h a 30 ºC, 180 rpm. Las células se recogieron por centrifugación (7000 x g, 7 min, temperatura ambiente). Por cada litro de cultivo celular original, las células se resuspendieron en 10 ml de tampón de lisis (50 mM de glucosa, 50 mM de Tris pH 7,9, 1 mM de EDTA y 4 mg/ml lisozima) y se dejaron en hielo durante 30 min. A continuación, las células se sometieron a ultrasonidos y se eliminaron los residuos celulares por centrifugación (22000 x g, 30 min, 4 ºC). Por cada 10 ml de sobrenadante, se añadió 0,5 ml de suspensión prelavada de Glutathione 4B sefarosa (Qiagen) y se mantuvo la suspensión manteniendo una rotación lenta durante 1 h a 4 ºC. Las cuentas de Glutathione 4B sefarosa se precipitaron por centrifugación (2000 x g, 15 s, 4 ºC) y se lavaron dos veces en tampón de lavado (25 mM Tris, 50 mM KCl, 4 mM MgCl2 y 1M NaCl). El sedimento se resuspendió en 3 ml de tampón de elución por litro de cultivo original (tampón de elución: Tris 20 mM, KCl 60 mM, MgCl2 5 mM y glutatión 80 mM agregado como polvo inmediatamente antes de utilizarlo). Se dejó a la suspensión rotando durante 15 min a 4 ºC, las cuentas se sedimentaron y se volvieron a eluir con la mitad del volumen de tampón de elución que la primera vez. Los eluatos se combinaron y se dializaron durante la noche en tampón Hepes 20 mM (pH 7,5) que contenía KCl 60 mM, MgCl2 5 mM, así como ditiotreitol 1 mM y 10 % (v/v) de glicerol. La proteína se analizó mediante SDS-PAGE.

El procedimiento mide la capacidad de los posibles ligandos para modular la interacción entre el dominio de unión a ligando (LBD) del FXR purificado expresado en bacterias y un péptido biotinilado sintético basado en los restos 676– 700 de SRC-1 (LCD2, 676–700). La secuencia del péptido utilizado fue B-CPSSHSSLTERHKILHRLLQEGSPS-COOH cuyo extremo N estaba era biotinilado (B). El dominio de unión a ligando (LBD) de FXR se expresó como una

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proteína de fusión con GST en células BL-21 utilizando el vector pDEST15. Las células se lisaron por sonicación, y las proteínas de fusión se purificaron sobre Glutathione Sepharose (Pharmacia) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Para analizar la influencia de los compuestos sobre la interacción FXR-péptido, se aplicó la tecnología LANCE de PerkinElmer. Este procedimiento se basa en la transferencia de energía dependiente de la unión desde un fluoróforo donante a un fluoróforo aceptor unido al ligando de interés. Para facilidad de manejo y para la reducción de la fluorescencia de fondo del compuesto, la tecnología LANCE utiliza etiquetas genéricas de fluoróforo y detección con resolución en tiempo. Los ensayos se realizaron en un volumen final de 25 µl en una placa de 384 pocillos, en un tampón de tipo Tris (20 mM Tris-HCl pH 7,5; 60 mM KCl, 5 mM MgCl2; 35 ng/µl BSA), que contenía 20–60 ng/pocillo de FXR-LBD fusionado a GST expresado de manera recombinante, 200–600 nM de péptidos biotinilados en su extremo N, que representan los aminoácidos SRC1 676–700, 200 ng/pocillo de conjugado de Streptavidina-xlAPC (Prozyme) y 6–10 ng/pocillo de Eu W1024 – antiGST (Perkin Elmer). El contenido de DMSO de las muestras se mantuvo a 1 %. Tras la generación de la mezcla de ensayo y de diluir los ligandos potencialmente moduladores de FXR, el ensayo se equilibró durante una hora en la oscuridad a temperatura ambiente en placas para FIA negras de 384 pocillos (Greiner). La señal LANCE se detectó mediante equipo de recuento multietiqueta Perkin Elmer VICTOR2VTM. Se visualizaron los resultados representando gráficamente la relación entre la luz emitida a 665 y a 615 nm. Se observa un nivel basal de formación de FXR-péptido en ausencia de ligando añadido. Los ligandos que fomentan la formación del complejo inducen un incremento dependiente de la concentración en la señal fluorescente resuelta en el tiempo. Sería de esperar que no se obtuviera ningún cambio en la señal con los compuestos que se unen igualmente bien tanto al FXR monomérico como al complejo FXR-péptido, mientras que sería de esperar que los ligandos que se unen preferentemente al receptor monomérico indujeran una disminución dependiente de la concentración en la señal observada.

Para evaluar el potencial inhibitorio de los compuestos, se determinaron los valores CE50 para los compuestos de ejemplo listados a continuación en la Tabla 1 (A = CE50 < 25 nM; B = 25 ≤ CE50 < 100 nM; C = CE50 ≥ 100 nM).

Tabla 1

Grupo

Ejemplo n.º

A

4, 8, 10, 13/8, 13/9, 14/1, 14/2

B

1, 2, 5, 6, 8A, 13/1, 13/3, 13/4, 13/5, 13/7

C

13/2, 13/6

Ensayo híbrido 1 mamífero (M1H)

La determinación de una transactivación dirigida por un promotor Gal4 mediada por ligando a fin de cuantificar la activación del FXR mediada por unión a ligando se llevó a cabo de la siguiente forma: La parte del ADNc que codifica el dominio de unión a ligando de FXR se clonó en el vector pCMV-BD (Stratagene) como una fusión al dominio de unión del ADN Gal4 de levadura bajo el control del promotor CMV. Los límites de aminoácidos del dominio de unión a ligando fueron los aminoácidos 187–472 de la entrada de la base de datos NM_005123 (RefSeq). El plásmido pFR-Luc (Stratagene) se utilizó como plásmido indicador, que contenía un promotor sintético con cinco repeticiones en tándem de los sitios de unión Gal4 de levadura, que estimulan la expresión del gen luciferasa de la Photinus pyralis (luciérnaga de América del Norte) como gen indicador. A fin de mejorar la precisión experimental, el plásmido pRL-CMV (Promega) se transfectó simultáneamente. pRL-CMV contiene el promotor CMV constitutivo, que controla la expresión de luciferasa de Renilla reniformis. Todos los ensayos de gen indicador de Gal4 se realizaron en células HEK293 (obtenidas de DSMZ, Braunschweig, Alemania) cultivadas en MEM con Lglutamina y BSS de Earle suplementadas con 10 % de suero fetal bovino, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio 1 mM, y 100 unidades de penicilina/estreptavidina por ml a 37 ºC en 5 % CO2. Se obtuvieron medios y suplementos de Invitrogen. Para el ensayo, se sembraron 5 x 105 células por pocillo en placas de 96 pocillos en 100 µl por pocillo de MEM sin Rojo de Fenol y L-Glutamina y con BSS de Earle suplementado con 10 % de FBS tratado con carbón activo/dextrano (HyClone, South Logan, Utah), 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, y 100 unidades de penicilina/ estreptavidina por ml, y se incubaron a 37 ºC en CO2 5 %. Al día siguiente, las células tenían >90 % de confluencia. Se eliminó el medio y las células se transfectaron transitoriamente utilizando 20 µl por pocillo de un agente de transfección basado en OptiMEMpolietilenimina (OptiMEM, Invitrogen; Polyetileneimine, Aldrich n.º Cat 40,827-7) incluyendo los tres plásmidos descritos anteriormente. Se añadió MEM con la misma composición que la utilizada para sembrar las células de 2 a 4 horas después de añadir la mezcla de transfección. A continuación se añadieron las disoluciones madre de compuestos prediluídos en MEM (la concentración del vehículo final no debe exceder 0,1 %). Se incubaron las células durante 16 horas más antes de medir las actividades de la luciferasa de luciérnaga y renilla secuencialmente en el mismo extracto celular utilizando un sistema de ensayo de doble intensidad de luciferasa (Dyer y col., Anal. Biochem. 2000, 282, 158–161). Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

A fin de evaluar la potencia agonística del FXR de los compuestos de ejemplo, se determinaron los intervalos de potencia en el ensayo M1H como se listan a continuación en la Tabla 2 (A = CE50 < 25 nM; B = 25 ≤ CE50 < 100 nM; C = CE50 ≥ 100 nM).

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(M. L. Crawley, Expert Opin. Ther. Patents 2010, 20, 1047). En consecuencia, se supone que una mejor solubilidad en medio acuoso y permeabilidad de membrana darán por resultado una mejor biodisponibilidad oral y en general una mayor adecuación de estos compuestos como fármacos, para el desarrollo clínico. (L. Huang, J. Dong, S. Karki in Evaluation of drug candidates for preclinical development (Eds. C. Han, C. B. Davis, B. Wang), Wiley & Sons, Hoboken 2010, 187-217).

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Claims (2)

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2. 17. El uso de acuerdo con la reivindicación 14 en el que la enfermedad se selecciona de trastornos hiperproliferativos no malignos y trastornos hiperproliferativos malignos, específicamente de carcinoma hepatocelular, adenoma de colon y poliposis, adenocarcinoma de colon, cáncer de mama, adenocarcinoma de páncreas, esófago de Barret u otras formas de enfermedades neoplásicas del tracto gastrointestinal y del hígado.

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