ES2569723T3

ES2569723T3 - Polimerasas de DNA con actividad mejorada

Info

Publication number: ES2569723T3
Application number: ES12794881.8T
Authority: ES
Inventors: Keith Bauer; Thomas W. Myers; Shawn Suko
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2011-12-08
Filing date: 2012-12-04
Publication date: 2016-05-12
Anticipated expiration: 2032-12-04
Also published as: EP2788479B1; JP2015505674A; JP6140182B2; US9951320B2; US9428782B2; US20170029791A1; US8759063B2; CN103987844A; WO2013083263A8; US20140295500A1; WO2013083263A1; US20130149747A1; EP2788479A1; CN103987844B

Abstract

Un polimerasa de DNA que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con Id. de Sec. Nº 1 y que tiene aumentada la eficiencia de la transcriptasa inversa en comparación con una polimerasa de DNA control, en el que el aminoácido de la polimerasa de DNA correspondiente a la posición 640 de Id. de Sec. Nº 1 es F, y en el que la polimerasa de DNA control tiene la misma secuencia de aminoácidos que la polimerasa de DNA, excepto que el aminoácido de la polimerasa de DNA control correspondiente a la posición 640 de Id. de Sec. Nº 1 es I.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

15

25

35

45

55

65

secuenciación 454). En ciertas realizaciones, el método de extensión del cebador comprende una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El molde de polinucleótido puede ser de cualquier tipo de muestra biológica.

Opcionalmente, la reacción de extensión del cebador comprende un inhibidor real o potencial de la polimerasa de referencia o no modificada. El inhibidor puede inhibir la tasa de extensión del ácido nucleico y/ o la eficiencia de transcripción inversa de una polimerasa de referencia o sin modificar (control). El inhibidor puede ser hemoglobina, o un producto de degradación de la misma. Por ejemplo, el producto de degradación de la hemoglobina puede ser un producto de degradación del grupo hemo, tal como hemina, hematoporfirina o bilirrubina. El inhibidor puede ser un quelante de hierro o un pigmento de color púrpura. El inhibidor puede ser heparina o melanina. El inhibidor puede ser un colorante intercalante. El colorante intercalante puede ser [2-[N-bis-(3-dimetilaminopropil)amino]-4-[2,3dihidro-3-metil-(benzo-1,3-tiazol-2-il)metiliden]-1-fenil-quinolinio]+. El colorante intercalante puede ser [2-[N-(3dimetilaminopropil)-N-propilamino]-4-[2,3-dihidro-3-metil-(benzo-1,3-tiazol-2-il)-metiliden]-1-fenil-quinolinio]+. El colorante intercalante puede no ser [2-[N-(3-dimetilaminopropil)-N-propilamino]-4-[2,3-dihidro-3-metil-(benzo-1,3tiazol-2-il)-metiliden]-1-fenil-quinolinio]+. Las condiciones adecuadas para la extensión pueden comprender Mg++. Las condiciones adecuadas para la extensión puede comprender Mn++.

La presente invención también proporciona un equipo útil en tal método de extensión de polinucleótidos. El equipo incluye al menos un recipiente que proporciona la polimerasa de DNA mejorada de la invención. El equipo puede incluir además uno o más recipientes que proporcionen uno o más reactivos. Por ejemplo, uno o más recipientes adicionales pueden proporcionar nucleósidos trifosfato, un tampón adecuado para la extensión de polinucleótidos y/

o uno o más polinucleótidos cebadores o sonda, que se pueden hibridar, en condiciones de extensión de polinucleótidos, a un molde de polinucleótidos predeterminado. El molde de polinucleótidos puede ser de cualquier tipo de muestra biológica.

Además se proporcionan mezclas de reacción que comprenden las polimerasas de la invención. Las mezclas de reacción pueden contener también un molde de ácido nucleico (DNA y/ o RNA), uno o más polinucleótidos cebadores o sondas, nucleósidos trifosfato (incluyendo, por ejemplo, desoxirribonucleósidos trifosfato, ribonucleósidos trifosfato, nucleósidos trifosfato marcados, nucleósidos trifosfato no convencionales), tampones, sales y marcajes (por ejemplo, fluoróforos). Las mezclas de reacción pueden comprender un quelante de hierro o un colorante de color púrpura. Las mezclas de reacción pueden comprender hemoglobina o un producto de degradación de la hemoglobina. Por ejemplo, los productos de degradación de la hemoglobina pueden incluir productos de degradación del grupo hemo como hemina, hematina, hematoforina y bilirrubina. Las mezclas de reacción pueden comprender heparina o una sal de la misma. La mezcla de reacción puede comprender un colorante intercalante (lo que incluye pero que no se limita a los descritos anteriormente o en otras partes en este documento). La mezcla de reacción puede contener un molde de ácido nucleico que se ha aislado a partir de sangre. El molde de ácido nucleico puede ser RNA y la mezcla de reacción puede comprender heparina o una sal de la misma. La mezcla de reacción puede comprender además Mg2+.

La mezcla de reacción puede comprender además una segunda polimerasa de DNA termoestable. La mezcla de reacción puede comprender dos o más polimerasas. Por ejemplo, la mezcla de reacción puede comprender una polimerasa de DNA mejorada que tenga mayor eficiencia de transcripción inversa (por ejemplo, aumento de la actividad de extensión de un molde de RNA) como se describe aquí, y otra polimerasa que tenga actividad polimerasa dependiente de DNA. La mezcla de reacción puede comprender una mezcla de una polimerasa de DNA mejorada que tenga mayor eficiencia de transcripción inversa como se describe en el presente documento, y una segunda polimerasa dependiente de DNA termoestable. La segunda polimerasa dependiente de DNA termoestable puede ser una polimerasa modificada de forma reversible como se ha descrito anteriormente, de manera que la enzima está inactiva a las temperaturas adecuadas para la etapa de transcripción inversa, pero se activa en condiciones adecuadas, por ejemplo, a temperaturas elevadas de aproximadamente 90°C a 100°C durante un periodo de tiempo de hasta alrededor de 12 minutos. Se proporcionan las condiciones adecuadas para la activación de una polimerasa termoestable inactivada de forma reversible, por ejemplo, en una reacción de PCR Hot Start, como se describe en los Ejemplos. Ejemplos de segundas polimerasas dependientes de DNA termoestables adecuadas se describen en las patentes estadounidenses Nº 5.773.258 y 5.677.152, supra.

Definiciones

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la materia a la que pertenece esta invención. Aunque esencialmente cualesquier método y materiales similares a los descritos en el presente documento se pueden utilizar en la práctica o análisis de la presente invención, sólo se describen los métodos y materiales de ejemplo. Para el propósito de la presente invención, los siguientes términos se definen a continuación.

Los términos "un", "una" y "el" incluyen los referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Un "aminoácido" se refiere a cualquier unidad monomérica que puede incorporarse en un péptido, polipéptido o proteína. Tal como se utiliza aquí, el término "aminoácido" incluye los siguientes veinte alfa aminoácidos naturales o

15

25

35

45

55

65

codificados genéticamente: alanina (Ala o A), arginina (Arg o R), asparagina (Asn o N), ácido aspártico (Asp o D), cisteína (Cys o C), glutamina (Gln o Q), ácido glutámico (Glu o E), glicina (Gly o G), histidina (His o H), isoleucina (Ile

o I), leucina (Leu o L), lisina (Lys o K), metionina (Met o M), fenilalanina (Phe o F), prolina (Pro o P), serina (Ser o S), treonina (Thr o T), triptófano (Trp o W), tirosina (Tyr o Y) y valina (Val o V). En los casos en los que los residuos "X" no están definidos, éstos deben entenderse como "cualquier aminoácido". Las estructuras de estos veinte aminoácidos naturales se muestran en, por ejemplo, Stryer et al., Biochemistry, 5ª Ed., Freeman and Company (2002). Aminoácidos adicionales, como la seleniocisteína y pirrolisina, también pueden estar codificados genéticamente (Stadtman (1996) "Selenocysteine," Annu Rev Biochem. 65:83-100 y Ibba et al (2002) "Genetic Code: introducing pyrrolysine" Curr Biol 12(13):R464-R466). El término "aminoácido" también incluye aminoácidos no naturales, los aminoácidos modificados (por ejemplo, con las cadenas laterales y/ o el esqueleto central modificados), y los análogos de aminoácidos (véase, por ejemplo, Zhang et al. (2004) "Selective incorporation of 5hydroxytryptophan into proteins in mammalian cells", Proc Natl Acad Sci USA 101 (24):8882-8887, Anderson et al (2004), "An expanded genetic code with a functional quadruplet codon", Proc Natl Acad Sci USA 101 (20):75667571, Ikeda et al (2003), "Synthesis of a novel histidine analogue and its efficient incorporation into a protein in vivo" Protein Eng Des Sel 16 (9):699-706, Chin et al (2003), "An Expanded Eukaryotic Genetic Code", Science 301(5635):964-967, James et al. (2001) "Kinetic characterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizable phenylazophenylalanine residues", Protein Eng. Des. Sel. 14(12):983-991, Kohrer et al. (2001) "Import of amber and ochre suppressor tRNAs into mammalian cells: A general approach to site-specific insertion of amino acid analogues into proteins", Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98(25):14310-14315, Bacher et al. (2001) "Selection and Characterization of Escherichia coli Variants Capable of Growth on an Otherwise Toxic Tryptophan Analogue", J. Bacteriol. 183(18):5414-5425, Hamano-Takaku et al. (2000) "A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than Tyrosine", J. Biol. Chem. 275(51):40324-40328, and Budisa et al. (2001) "Proteins with {beta}-(thienopyrrolyl)alanines as alternative chromophores and pharmaceutically active amino acids", Protein Sci. 10(7):1281-1292).

Como ilustración adicional, un aminoácido es típicamente un ácido orgánico que incluye un grupo amino sustituido o no sustituido, un grupo carboxi sustituido o no sustituido, y una o más cadenas o grupos laterales, o análogos de cualquiera de estos grupos. Las cadenas laterales de ejemplo incluyen, por ejemplo, tiol, seleno, sulfonilo, alquilo, arilo, acilo, ceto, azido, hidroxilo, hidracina, ciano, halo, hidrazida, alquenilo, alquinilo, éter, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterociclo, enona, imina, aldehído, éster, tioácido, hidroxilamina o cualquier combinación de estos grupos. Otros aminoácidos representativos incluyen, pero no se limitan a, los aminoácidos que comprenden entrecruzadores fotoactivables, los aminoácidos que unen metales, aminoácidos con spin marcado, aminoácidos fluorescentes, aminoácidos que contienen metales, aminoácidos con grupos funcionales nuevos, aminoácidos que interactuan de forma covalente o no covalente con otras moléculas, aminoácidos fotoanclados y/ o fotoisomerizables, aminoácidos radiactivos, aminoácidos que comprenden biotina o un análogo de biotina, aminoácidos glicosilados, aminoácidos modificados con otros hidratos de carbono, aminoácidos que comprenden polietilenglicol o poliéter, aminoácidos sustituidos con átomos pesados, aminoácidos químicamente escindibles y/ o fotoescindibles, aminoácidos que contienen azúcares enlazado a carbono, aminoácidos con actividad redox, aminoácidos que contienen aminotioácidos, y aminoácidos que comprenden uno o más residuos tóxicos.

El término "muestra biológica" abarca una variedad de tipos de muestras obtenidas de un organismo y se pueden utilizar en un ensayo de diagnóstico o de control. El término abarca la orina, sedimento de orina, sangre, saliva y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejidos sólidos, tales como una muestra de biopsia o cultivos de tejidos o células derivadas de los mismos y la progenie de los mismos. El término abarca las muestras que se han manipulado de cualquier forma después de su obtención, como mediante un tratamiento con reactivos, solubilización, sedimentación o enriquecimiento de ciertos componentes. El término abarca una muestra clínica y también incluye células de cultivo celular, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, fluidos biológicos y muestras de tejido.

El término "mutante", en el contexto de las polimerasas de DNA de la presente invención, significa un polipéptido, normalmente recombinante, que comprende una o más sustituciones de aminoácidos con relación a la correspondiente polimerasa de DNA funcional.

El término "forma no modificada", en el contexto de una polimerasa mutante, es un término usado en el presente documento con el propósito de definir una polimerasa de DNA mutante de la presente invención: el término "forma no modificada" se refiere a una polimerasa de DNA funcional que tiene la secuencia de aminoácidos de la polimerasa mutante, con la excepción de una o más posiciones de aminoácidos especificadas y que caracterizan la polimerasa mutante. Por lo tanto, la referencia a una polimerasa de DNA mutante en términos de (a) su forma no modificada y (b) una o más sustituciones de aminoácidos específicas significa que, con la excepción de las sustituciones de aminoácidos especificadas, la polimerasa mutante tiene el resto de secuencia de aminoácidos idéntica a la forma no modificada en el motivo especificado. La "polimerasa no modificada" (y por lo tanto también la forma modificada con aumento de la eficiencia de la transcriptasa inversa, de la tolerancia al desemparejamiento, velocidad de extensión y/ o tolerancia a los inhibidores de la TI y la polimerasa) puede contener mutaciones adicionales para proporcionar la funcionalidad deseada, por ejemplo, una mejora de la incorporación de didesoxiribonucleótidos, ribonucleótidos, análogos de ribonucleótidos, nucleótidos marcados con colorantes, modulación de la actividad nucleasa en 5', modulación de la actividad nucleasa en 3' (o autocorrección) o similares.

imagen6

15

25

35

45

55

65

posiciones de aminoácido se determinan con respecto a una región de la polimerasa que comprende uno o más motivos de Id. de Sec. Nº 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 32, 33, 34, 35, 36, 37 o 39. Cuando una secuencia de polipéptido de la polimerasa difiere de Id. de Sec. Nº 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 32, 33, 34, 35, 36, 37 o 39 (por ejemplo, por cambios de aminoácidos o por adición o deleción de aminoácidos), puede ser que una mutación particular asociada con una actividad mejorada como se describe en el presente documento no esté el mismo número de posición que en los Id. de Sec. Nº 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 32, 33, 34, 35, 36, 37 o 39. Esto se ilustra, por ejemplo, en la Tabla 1.

"Recombinante", como se usa aquí, se refiere a una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos que ha sido modificada intencionadamente mediante métodos recombinantes. Por el término "ácido nucleico recombinante" se entiende en el presente documento un ácido nucleico, obtenido originalmente in vitro, en general, mediante la manipulación de un ácido nucleico con endonucleasas de restricción, en una forma que no se encuentra normalmente en la naturaleza. Así, el ácido nucleico aislado de una polimerasa de DNA mutante, en forma lineal, o un vector de expresión obtenido in vitro mediante la ligación de moléculas de DNA que normalmente no se unen, se consideran ambos recombinantes para los fines de esta invención. Se entiende que una vez que se obtiene un ácido nucleico recombinante y se vuelve a introducir en una célula huésped, se replicará de forma no recombinante, es decir, usando la maquinaria celular in vivo de la célula huésped, en lugar de manipulaciones in vitro; sin embargo, tales ácidos nucleicos, una vez producidos de forma recombinante, aunque posteriormente se repliquen de forma no recombinante, todavía se consideran recombinantes para el propósito de la invención. Una "proteína recombinante" es una proteína producida usando técnicas recombinantes, es decir, a través de la expresión de un ácido nucleico recombinante como se ha indicado anteriormente.

Un ácido nucleico está "unido de forma operativa" cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador está unido de forma operativa a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está unido de forma operativa a una secuencia codificante si está colocado de manera que facilita la traducción.

El término "célula huésped" se refiere tanto a organismos procariotas como eucariotas unicelulares (por ejemplo, bacterias, levaduras y actinomicetos) y a las células individuales de las plantas de orden superior o animales cuando se cultivan en cultivo celular.

El término "vector" se refiere a un trozo de DNA, normalmente de doble cadena, en el que puede haber insertado un segmento de DNA extraño. El vector puede ser, por ejemplo, de origen plasmídico. Los vectores contienen secuencias de polinucleótidos de tipo "replicón" que facilitan la replicación autónoma del vector en una célula huésped. El DNA foráneo se define como DNA heterólogo, que es DNA no se encuentra naturalmente en la célula huésped, y que por ejemplo, replica la molécula vector, codifica un marcador seleccionable o cribable, o codifica un transgén. El vector se utiliza para transportar el DNA extraño o heterólogo a una célula huésped adecuada. Una vez en la célula huésped, el vector puede replicarse de forma independiente o coincidente con el DNA cromosómico del huésped, y pueden generarse varias copias del vector y de su DNA insertado. Además, el vector también puede contener los elementos necesarios que permiten la transcripción del DNA insertado en una molécula de mRNA o bien provocan la replicación del DNA insertado en múltiples copias de RNA. Algunos vectores de expresión contienen, además, elementos de secuencia contiguos al DNA insertado que aumentan la vida media del mRNA expresado y/ o permiten la traducción del mRNA en una molécula de proteína. De este modo se pueden sintetizar rápidamente muchas moléculas de mRNA y polipéptidos codificados por el DNA insertado.

El término "nucleótido", además de hacer referencia a los monómeros de ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos de origen natural, en este documento se entiende que se refiere a las variantes estructurales relacionadas, incluidos los derivados y análogos, que son funcionalmente equivalentes con respecto al contexto particular en el que se está utilizando el nucleótido (por ejemplo, la hibridación a una base complementaria), a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

El término "ácido nucleico" o "polinucleótido" se refiere a un polímero que puede corresponderse con un polímero de ácido nucleico de ribosa (RNA) o ácido nucleico de desoxirribosa (DNA), o un análogo de los mismos. Esto incluye polímeros de nucleótidos, tales como RNA y DNA, así como las formas sintéticas, formas modificadas (por ejemplo, modificadas de forma química o bioquímica) de los mismos, y polímeros mixtos (por ejemplo, incluyendo subunidades tanto de RNA como de DNA). Modificaciones de ejemplo incluyen la metilación, sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales con un análogo, modificaciones internucleótido tales como enlazantes no cargados (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos y similares), porciones colgantes (por ejemplo, polipéptidos), intercalantes (por ejemplo, acridina, psoraleno y similares), quelantes, alquilantes y enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos y similares). También se incluyen las moléculas sintéticas que imitan a los polinucleótidos en su capacidad de unirse a una secuencia designada a través de enlaces de hidrógeno y otras interacciones químicas. Típicamente, los monómeros de nucleótidos están unidos a través de enlaces fosfodiéster, aunque las formas sintéticas de los ácidos nucleicos pueden comprender otros enlaces (por ejemplo, los ácidos nucleicos peptídicos como se describe en Nielsen et al (Science 254:1497-1500, 1991). Un ácido nucleico puede ser o puede incluir, por ejemplo, un cromosoma o segmento de cromosoma, un vector (por ejemplo, un vector de expresión), un casete de expresión, un polímero de DNA o RNA desnudo, el producto de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), un oligonucleótido, una sonda y un cebador. Un ácido nucleico puede ser, por

imagen7

imagen8

imagen9

imagen10

15

25

35

45

55

65

emite la energía transferida en forma de radiación de una luz con longitud de onda diferente. Cuando el aceptor es un bloqueador "oscuro", éste disipa la energía transferida en una forma distinta a la luz. Que un fluoróforo particular actúe como un donante o un aceptor depende de las propiedades del otro miembro del par de FRET. Los pares donante-aceptor de uso general incluyen el par FAM-TAMRA. Son comúnmente utilizados los bloqueadores DABCYL y TAMRA. Los bloqueadores oscuros de uso general incluyen los BlackHole Quenchers™ (BHQ), (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.), Iowa Black™ (Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa), y BlackBerry™ Quencher 650 (BBQ-650) (Berry & Assoc., Dexter, Mich.).

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 representa una alineación de la secuencia de aminoácidos de una región del dominio de la polimerasa de las polimerasas de DNA de varias especies de bacterias: Thermus especies Z05 (Z05) (Id. de Sec. Nº 12), Thermus aquaticus (Taq) (Id. de Sec. Nº: 13), Thermus filiformus (Tfi) (Id. de Sec. Nº 14), Thermus flavus (Tfl) (Id. de Sec. Nº 15), Thermus especie sps17 (Sps17) (Id. de Sec. Nº 16), Thermus thermophilus (Tth) (Id. de Sec. Nº 17), Thermus caldophilus (Tca) (Id. de Sec. Nº 18), Thermotoga maritima (Tma) (Id. de Sec. Nº 19), Thermotoga neopolitana (Tne) (Id. de Sec. Nº 20), Thermosipho africanus (Taf) (Id. de Sec. Nº 21), Deinococcus radiodurans (Dra) (Id. de Sec. Nº 23), Bacillus stearothermophilus (Bst) (Id. de Sec. Nº 24), y Bacillus caldotenax (Bca) (Id. de Sec. Nº 25). Además, las regiones de polipéptidos mostrados comprenden el motivo de aminoácidos X1-X2-X3-F-X4-X5-X6-X7-D-X8-HT-X9TA-X10-X11 (Id. de Sec. Nº: 26), las posiciones variables de la que se definen adicionalmente en este documento. Este motivo se resalta en negrita para cada secuencia de la polimerasa. Las posiciones de los aminoácidos susceptibles de mutación se indican con un asterisco (*). Las huecos en las alineaciones se indican con un punto (.).

La Figura 2 proporciona identidades de secuencia entre las siguientes enzimas polimerasa I de DNA: polimerasa de DNA de Thermus sp. Z05 (Z05); polimerasa de DNA de Thermus aquaticus (Taq); polimerasa de DNA de Thermus filiformis (Tfi); polimerasa de DNA de Thermus flavus (Tfl); polimerasa de DNA de Thermus sp. sps17 (Sps17); polimerasa de DNA de Thermus thermophilus (Tth); polimerasa de DNA de Thermus caldophilus (Tca); polimerasa de DNA de Deinococcus radiodurans (Dra); polimerasa de DNA de Thermotoga maritima (Tma); polimerasa de DNA de Thermotoga neopolitana (TNE); polimerasa de DNA de Thermosipho africanus (TAF); polimerasa de DNA de Bacillus stearothermophilus (Bst); y polimerasa de DNA de Bacillus caldotenax (Bca). (A) Identidades de secuencia en toda la enzima de la polimerasa I (correspondiente a los aminoácidos 1-834 de Z05); e (B) identidades de secuencia sobre el subdominio de la polimerasa correspondiente a los aminoácidos 420 a 834 de Z05.

La Figura 3 proporciona identidades de secuencia entre varias enzimas polimerasa I de DNA de Thermus sp diferentes: polimerasa de DNA de Thermus sp. Z05 (Z05); polimerasa de DNA de Thermus aquaticus (Taq); polimerasa de DNA de Thermus filiformis (Tfi); polimerasa de DNA de Thermus flavus (Tfl); polimerasa de DNA de Thermus sp. sps17 (Sps17); polimerasa de DNA de Thermus thermophilus (Tth); y la polimerasa de DNA de Thermus caldophilus (TCA). (A) Identidades de secuencia en toda la enzima de la polimerasa I (correspondiente a los aminoácidos 1-834 de Z05); e (B) identidades de secuencia sobre el subdominio de la polimerasa correspondiente a los aminoácidos 420 a 834 de Z05.

Descripción detallada

La presente invención proporciona polimerasas de DNA mejoradas en el que uno o más aminoácidos en el dominio de la polimerasa han sido mutados en relación con una polimerasa de DNA funcional. Las polimerasa de DNA de la invención son enzimas activas que tienen una mayor eficiencia de transcriptasa inversa (por ejemplo, en presencia de cationes divalentes Mn2+ y Mg2+) con relación a la forma no modificada de la polimerasa. Pueden tener una mayor tolerancia al desemparejamiento, tasa de extensión y tolerancia de la TI e inhibidores de la polimerasa. Las polimerasas de DNA mutantes se pueden usar a concentraciones más bajas para un rendimiento superior o equivalente, como las enzimas parentales. Las polimerasas de DNA mutantes pueden haber aumentado la eficiencia de la transcriptasa inversa al tiempo que conservan sustancialmente la misma actividad de la polimerasa dependiente de DNA con respecto a una polimerasa no modificada o control. La invención se expone en las reivindicaciones adjuntas a esta descripción. Las polimerasas de DNA que realizan de manera más eficiente la transcripción inversa son útiles, por ejemplo, en una variedad de aplicaciones que incluyen ensayos que emplean RT-PCR para detectar y/o cuantificar dianas de RNA. Las polimerasas de DNA son por lo tanto útiles en una variedad de aplicaciones que implican la extensión de polinucleótidos, así como la transcripción inversa o amplificación de moldes de polinucleótidos, incluyendo, por ejemplo, las aplicaciones en los estudios de DNA recombinante y diagnóstico médico de la enfermedad. Las polimerasas de DNA mutantes también son particularmente útiles, debido a su tolerancia a los desemparejamientos, para la detección de dianas que posiblemente tienen secuencias variables (por ejemplo, dinas virales, o cáncer y otros marcadores genéticos de la enfermedad).

Las polimerasas de DNA se pueden caracterizar por tener el siguiente motivo:

X1-X2-X3-Phe-X4-X5-X6-X7-Asp-X8-His-Thr-X9-Thr-Ala-X10-X11 (también denominado en la presente memoria en el código de una letra como X1-X2-X3-F-X4-X5-X6-X7-D-X8-H-T-X9-TA-X10-X11 (Id. de Sec. Nº: 8); en el que:

imagen11

15

25

35

45

55

65

publicado en la publicación de patente internacional PCT nº WO 92/06200. La secuencia para la polimerasa de DNA de Thermus flavus (Id. de Sec. Nº 4) ha sido publicada en Akhmetzjanov y Vakhitov (Nucleic Acids Research 20: 5839, 1992). La secuencia de la polimerasa de DNA termoestable de Thermus caldophilus (Id. de Sec. Nº 7) se encuentra en EMBL/GenBank Nº de acceso U62584. La secuencia de la polimerasa de DNA termoestable de Thermus filiformis se puede recuperar de depósito de la ATCC Nº 42380 usando, por ejemplo, los métodos proporcionados en la patente de EE.UU. Nº 4.889.818, así como la información de secuencia proporcionada en la Tabla 1. La secuencia de la polimerasa de DNA de Thermotoga neapolitana (Id. de Sec. Nº 35) es de la base de datos de Patentes de GeneSeq nº de acceso R98144 y PCT WO 97/09451. La secuencia de la polimerasa de DNA termoestable de Bacillus caldotenax (Id. de Sec. Nº 37) se describe en, por ejemplo, Uemori et al. (J Biochem (Tokyo) 113 (3): 401-410, 1993; véase también, la base de datos Swiss-Prot Nº de acceso Q04957 y GenBank números de acceso D12982 y BAA02361). Ejemplos de formas no modificadas de las polimerasas de DNA que pueden ser modificadas como se describe en el presente documento también se describen en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nº 6.228.628; 6.346.379; 7.030.220; 6.881.559; 6.468.775; y las patentes de Estados Unidos nº 7.148.049; 7.179.590; 7.410.782; 7378262. Las secuencias representativas de la polimerasa de longitud completa también están dentro de la lista de secuencias.

También son susceptibles a las mutaciones descritas en este documento las polimerasas de DNA funcionales que se han modificado previamente (por ejemplo, por sustitución, adición, o supresión de aminoácidos). Tales polimerasas modificadas funcionales pueden retener el motivo de aminoácidos de Id. de Sec. Nº 8 (o un motivo de la Id. de Sec. Nº 9, 10 o 11), y, opcionalmente, el motivo de aminoácidos de Id. de Sec. Nº 38. Por lo tanto, las polimerasas de DNA no modificadas adecuadas incluyen también variantes funcionales de tipo salvaje o las polimerasas de origen natural. Tales variantes tendrán normalmente una identidad o similitud de secuencia sustancial con la polimerasa de tipo salvaje o de origen natural, típicamente al menos un 80% de identidad de secuencia y más típicamente al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia.

Una polimerasa, que posee un dominio de la polimerasa que comprende los Id. de Sec. Nº: 8, 9, 10, o 11 también puede comprender un dominio de nucleasa (por ejemplo, que corresponde a las posiciones 1 a 291 de Z05)

Una polimerasa puede ser una polimerasa quimérica, es decir, que comprende las regiones de polipéptidos de dos o más enzimas. Ejemplos de tales polimerasas de DNA quiméricas se describen en, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 6.228.628. Particularmente adecuadas son las polimerasas de DNA quiméricas de la familia CS, que incluyen las polimerasas CS5 (Id. de Sec. Nº 27) y CS6 (Id. de Sec. Nº 28) y variantes de las mismas que tienen una identidad sustancial de la secuencia de aminoácidos o similar a Id. de Sec. Nº 27 o Id. de Sec. Nº 28 (típicamente al menos un 80% de identidad de secuencia de aminoácidos y más típicamente al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de ácido amino) y por lo tanto pueden ser modificadas para contener el Id. de Sec. Nº 8. Las polimerasas de DNA CS5 y CS6 son enzimas quiméricas derivadas de las polimerasas de DNA de Thermus sp. Z05 y Thermotoga maritima (Tma). Estas comprenden el dominio N-terminal de la nucleasa 5' de la enzima Thermus y los dominios exonucleasa 3'-5' C-terminal y polimerasa de la enzima Tma. Estas enzimas tienen actividad de transcriptasa inversa eficiente, pueden extender cebadores que contienen análogos de nucleótidos, y pueden incorporar dNTP alfa-fosforotioato, dUTP, dITP, y también dNTP marcados con los marcadores de la familia fluoresceína y cianina. Las polimerasas CS5 y CS6 son también enzimas de PCR activados de forma eficiente por Mg2+. Las polimerasas quiméricas CS5 y CS6 se describen adicionalmente en, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 7.148.049.

Las sustituciones de aminoácidos pueden ser sustituciones individuales de aminoácidos. Las polimerasas de DNA proporcionadas en el presente documento pueden comprender una o más sustituciones de aminoácidos en el sitio activo con respecto a la polimerasa no modificada. La sustitución de aminoácidos puede comprender al menos la posición X8 del motivo expuesto en Id. de Sec. Nº 8 (o un motivo de Id. de Sec. Nº 9, 10 o 11). La sustitución de aminoácidos en esta posición confiere una mayor eficiencia de la transcriptasa inversa, la tolerancia a los desemparejamientos, velocidad de extensión y/o la tolerancia de los inhibidores de TI y de la polimerasa, produciendo una polimerasa de DNA mutante con una mayor eficiencia de la transcriptasa inversa, la tolerancia a los desemparejamientos, velocidad de extensión y/o la tolerancia de los inhibidores de TI y de la polimerasa con respecto a la polimerasa no modificada. Típicamente, el aminoácido en la posición X8 está sustituido con un aminoácido que no se corresponde con la secuencia nativa en el motivo expuesto en Id. de Sec. Nº 8 (o un motivo de Id. de Sec. Nº 9, 10 o 11). Por lo tanto, típicamente, el aminoácido en la posición X8, si está sustituido, no es Ile (I)

o Val (V), ya que I o V aparecen en esta posición en las polimerasas de origen natural (véase, por ejemplo, la Figura 1). En ciertas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos incluyen G, A, W, P, S, T, F, Y, C, N, Q, D, E, K, R, L, M, o H en la posición X8. Las sustituciones de aminoácidos pueden incluir fenilalanina (F) en la posición X8. Las sustituciones de otros aminoácidos adecuados en uno o más de los sitios identificados se puede determinar usando, por ejemplo, los métodos conocidos de mutagénesis y determinación del rendimiento de la extensión de polinucleótidos en ensayos de localización dirigida descritos en más detalle en el presente documento o conocidos de otra manera por los expertos en la materia.

Una polimerasa puede comprender el Id. de Sec. Nº 8, 9, 10, o 11 y comprende además uno o más cambios de aminoácidos (por ejemplo, por sustitución, adición, o supresión de aminoácidos) en comparación con una polimerasa

imagen12

imagen13

15

25

35

45

55

65

correspondiente a la posición 741 de Id. de Sec. Nº 1 puede ser Ser (S). El aminoácido correspondiente a la posición 741 de Id. de Sec. Nº 1 no puede ser Gly (G). El aminoácido correspondiente a la posición 775 de Id. de Sec. Nº 1 puede ser Arg (R). El aminoácido correspondiente a la posición 775 de Id. de Sec. Nº 1 no puede ser Gly (G). El aminoácido correspondiente a la posición 791 de Id. de Sec. Nº 1 puede ser Leu (L). El aminoácido correspondiente a la posición 789 de Id. de Sec. Nº 1 no puede ser Phe (F).

Las sustituciones en el aminoácido correspondiente a la posición 709 de Id. de Sec. Nº 1 descrito anteriormente puede resultar en polimerasas de DNA que tienen mejorada (es decir, aumentada) la eficacia de la transcripción inversa, aumentada la actividad RT-PCR (por ejemplo, amplificación más eficiente de un molde de RNA sin comprometer la eficiencia de la PCR en un molde de DNA), aumentada la eficiencia de RT-PCR en presencia de Mg2+, aumentada la actividad de la transcriptasa inversa en presencia de inhibidores (por ejemplo, productos de degradación de la hemoglobina, tales como hemina, y/o heparina), aumentada la tasa de extensión y una mejor tolerancia al desemparejamiento en 3' en comparación con una polimerasa de control (véase la solicitud de patente de Estados Unidos No. 61/474.160). Por lo tanto, se espera que las polimerasas mejoradas que comprenden sustituciones en el aminoácido correspondiente a la posición 709 de Id. de Sec. Nº 1 descritas en este documento también tendrán las propiedades mejoradas descritas anteriormente.

Además de las mutaciones y sustituciones descritas en el presente documento, las polimerasas de DNA también pueden incluir otras modificaciones, no sustitutivas. Tales modificaciones pueden incluir, por ejemplo, las modificaciones covalentes conocidas en la técnica para conferir una ventaja adicional en las aplicaciones que comprenden la extensión de polinucleótidos. Por ejemplo, una de tales modificaciones es una modificación covalente térmicamente reversible que inactiva la enzima, pero que se invierte para activar la enzima tras la incubación a una temperatura elevada, tal como la temperatura usada típicamente para la extensión de polinucleótidos. Ejemplos de reactivos para tales modificaciones térmicamente reversibles se describen en la patente de EE.UU. Nº 5.773.258 y

5.677.152.

Las polimerasas de DNA pueden construirse mediante la mutación de las secuencias de DNA que codifican la correspondiente polimerasa no modificada (por ejemplo, una polimerasa de tipo salvaje o una variante correspondiente a partir de la cual deriva la polimerasa), tal como mediante el uso de técnicas comúnmente referidas como mutagénesis dirigida al sitio. Las moléculas de ácido nucleico que codifican la forma no modificada de la polimerasa pueden mutarse mediante una serie de técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) bien conocidas por un experto en la técnica (véase, por ejemplo, PCR Strategies (M.A. Innis, D.H. Gelfand, y J.J. Sninsky eds, 1995, Academic Press, San Diego, CA) en el capítulo 14; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications

(M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky, y T.J. White eds., Academic Press, Nueva York, 1990)).

A modo de ejemplo no limitativo, el sistema de dos cebadores, utilizado en el equipo Transformer Site-Directed Mutagenesis de Clontech, se puede emplear para la introducción de mutantes dirigidos al sitio en un polinucleótido que codifica una forma no modificada de la polimerasa. Después de la desnaturalización del plásmido diana en este sistema, dos cebadores se hibridan simultáneamente al plásmido; uno de estos cebadores contiene la mutación dirigida al sitio deseado, el otro contiene una mutación en otro punto del plásmido que resulta en la eliminación de un sitio de restricción. La síntesis de la segunda cadena se lleva a cabo a continuación, que une fuertemente estas dos mutaciones, y los plásmidos resultantes se transforma en una cepa mutS de E. coli. El DNA del plásmido se aísla de las bacterias transformadas, cortado con la enzima de restricción relevante (linearizando así los plásmidos no mutados) y, a continuación retransformado en E. coli. Este sistema permite la generación de mutaciones directamente en un plásmido de expresión, sin la necesidad de subclonación o la generación de fagémidos de cadena simple. La unión fuerte de las dos mutaciones y la posterior linearización de los plásmidos no mutados dan como resultado una alta eficiencia de mutación y permiten un cribado mínimo. Después de la síntesis del cebador inicial del sitio de restricción, este método requiere el uso de sólo un nuevo tipo de cebador por sitio de mutación. En lugar de preparar cada mutante de posición por separado, un conjunto de cebadores de oligonucleótidos "degenerados" se pueden sintetizar con el fin de introducir todas las mutaciones deseadas en un sitio determinado de forma simultánea. Los transformantes se pueden seleccionar mediante la secuenciación del DNA de plásmido a través de la región mutagenizada para identificar y escoger los clones mutantes. Cada DNA mutante puede cortarse y analizarse por electroforesis, tal como, por ejemplo, en un gel de aumento de detección de mutaciones (Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ) para confirmar que no se han producido otras alteraciones en la secuencia (por comparación de desplazamiento de banda respecto al control no mutado). Alternativamente, toda la región de DNA puede secuenciarse para confirmar que no han ocurrido eventos mutacionales adicionales fuera de la región diana.

Las polimerasas de DNA con más de un aminoácido sustituido pueden generarse de diversas maneras. En el caso de aminoácidos localizados juntos en la cadena polipeptídica, pueden mutarse simultáneamente utilizando un oligonucleótido que codifique para todas las sustituciones de aminoácidos deseadas. Sin embargo, si los aminoácidos están situados a cierta distancia unos de otros (separados por más de diez aminoácidos, por ejemplo) es más difícil generar un único oligonucleótido que codifique todos los cambios deseados. En lugar de ello, puede emplearse uno de los dos métodos alternativos. En el primer método, se genera un oligonucleótido separado para cada aminoácido a ser sustituido. Los oligonucleótidos se hibridan a continuación con el molde de DNA de una sola hebra de forma simultánea, y la segunda cadena de DNA que se sintetiza a partir del molde codificará todas las

imagen14

15

25

35

45

55

65

pBR322, pUCI8, pUCI9, pUC118, pUC119 y Bluescript M13, todos ellos se describen en las secciones 1.12-1.20 de Sambrook et al, supra . Sin embargo, también están disponibles muchos otros vectores adecuados.

Las polimerasas de DNA de la presente invención se producen típicamente mediante el cultivo de una célula huésped transformada con un vector de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica la polimerasa de DNA, en las condiciones apropiadas para inducir o causar la expresión de la polimerasa de DNA. Los métodos de cultivo de células huésped transformadas en condiciones adecuadas para la expresión de proteínas son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Supra). Las células huésped adecuadas para la producción de las polimerasas de vectores plasmídicos que contienen el promotor pL lambda incluyen la cepa de E. coli DG116 (ATCC Nº 53606) (véase la patente de EE.UU. Nº 5.079.352 y Lawyer, F.C. et al., PCR Methods and Applications 2: 275-87, 1993). Después de la expresión, la polimerasa puede recogerse y aislarse. Los métodos para purificar la polimerasa de DNA termoestable se describen en, por ejemplo, Lawyer et al., Supra. Una vez purificada, puede analizarse la capacidad de mejora de las polimerasas de DNA de la eficiencia de TI, aumento de la tolerancia al desemparejamiento, velocidad de extensión y/o la tolerancia a los inhibidores de TI y de la polimerasa (por ejemplo, como se describe en los ejemplos).

Las polimerasas de DNA mejoradas de la presente invención se pueden usar para cualquier propósito en el que tal actividad enzimática sea necesaria o deseada. Por consiguiente, se proporcionan métodos de extensión de polinucleótidos (por ejemplo, PCR), utilizando las polimerasas. Las condiciones adecuadas para la extensión de polinucleótidos son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra; véase también Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (4ª ed, John Wiley & Sons 1999). En general, un cebador se anilla, es decir, se hibrida, a un ácido nucleico diana para formar un complejo cebador-molde. El complejo cebador-molde se pone en contacto con la polimerasa de DNA y trifosfatos de nucleósidos en un ambiente adecuado para permitir la adición de uno o más nucleótidos al 3' del cebador, produciendo de esta manera un cebador extendido complementario al ácido nucleico diana. El cebador puede incluir, por ejemplo, uno o más análogo(s) de nucleótidos. Además, los trifosfatos de nucleósidos pueden ser nucleótidos convencionales, nucleótidos no convencionales (por ejemplo, ribonucleótidos o nucleótidos marcados), o una mezcla de los mismos. La reacción de extensión de polinucleótidos puede comprender la amplificación de un ácido nucleico diana. Las condiciones adecuadas para la amplificación de ácidos nucleicos utilizando una polimerasa de DNA y un par de cebadores también son conocidos en la técnica (por ejemplo, PCR amplification methods) (véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra; Ausubel et al., Supra; PCR Applications: Protocols for Functional Genomics (Innis et al. eds., Academic Press 1999). La reacción de extensión del polinucleótido puede comprender la transcripción inversa de un molde de RNA (por ejemplo, RT-PCR). La polimerasa mejorada puede encontrar uso en la secuenciación 454 (Margulies, M et al., 2005, Nature, 437, 376380).

Opcionalmente, la reacción de extensión de cebador comprende un inhibidor real o potencial de una polimerasa de referencia o no modificada. El inhibidor puede inhibir, por ejemplo, la tasa de extensión de ácido nucleico y/o la eficiencia de transcripción inversa de una polimerasa de referencia o sin modificar (control). El inhibidor puede ser hemoglobina, o un producto de degradación de la misma. Por ejemplo, el producto de degradación de la hemoglobina puede ser un producto de degradación hemo, tales como hemina, hematoporfirina, o bilirrubina. El inhibidor puede ser un quelante de hierro o un pigmento púrpura. El inhibidor puede ser heparina. El inhibidor puede ser un marcador intercalante. El inhibidor puede ser melanina, que se ha descrito como un inhibidor de la polimerasa (ver, por ejemplo, Ekhardt, et al., Biochem Biophys Res Commun. 271 (3): 726-30 (2000)).

Las polimerasas de DNA de la presente invención pueden utilizarse para extender los moldes en presencia de moldes de polinucleótidos aislados de muestras que comprenden inhibidores de la polimerasa, por ejemplo, como la sangre. Por ejemplo, las polimerasas de DNA de la presente invención pueden utilizarse para ampliar los moldes en presencia de hemoglobina, un componente principal de la sangre, o en presencia de un producto de degradación de la hemoglobina. La hemoglobina puede ser degradada en varios productos de degradación hemo, tales como hemina, hematina, hematoporfirina, y bilirrubina. Las polimerasas de DNA de la presente invención se pueden utilizar para extender los moldes en la presencia de productos de degradación de la hemoglobina, que incluye pero no se limita a, hemina, hematina, hematoporfirina, y bilirrubina. El producto de degradación de la hemoglobina puede ser hemina. Las polimerasas de DNA de la presente invención se pueden utilizar para extender los moldes en presencia de aproximadamente 0,5 a 20,0 m, aproximadamente de 0,5 a 10,0 m, aproximadamente de 0,5 a 5,0 m, aproximadamente de 1,0 a 10,0 m, aproximadamente de 1,0 a 5,0 M, aproximadamente de 2,0 a 5,0 M, o aproximadamente de 2,0 a 3,0 M de hemina. Las polimerasas de DNA de la presente invención se pueden utilizar para extender los moldes en presencia de al menos aproximadamente 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 4,0, 5,0, 10,0, 20,0,

o más de 20 M de hemina. Los productos de degradación de la hemoglobina incluyen quelantes de hierro y pigmentos de color púrpura. Las polimerasas de DNA de la presente invención se pueden utilizar para extender los moldes en presencia de quelantes de hierro y/o pigmentos de color púrpura. Las polimerasas de DNA de la presente invención se pueden utilizar para extender los moldes en presencia de cantidades de productos de degradación de la hemoglobina que inhibirían la extensión del mismo molde por una polimerasa de DNA de referencia o control.

Las polimerasas de DNA de la presente invención pueden utilizarse para extender los moldes en presencia de heparina. La heparina está comúnmente presente como anticoagulante en muestras aisladas de sangre. Las polimerasas de DNA de la presente invención se pueden utilizar para extender los moldes en presencia de

15

25

35

45

55

65

aproximadamente 1,0 a 400 ng/l, 1,0 a 300 ng/l, 1,0 a 200 ng/ml, 5,0 a 400 ng/l, 5,0 a 300 ng/l, 5,0 a 200 ng/l, 10,0 a 400 ng/l, 10,0 a 300 ng/l, o 10,0 a 200 ng/l de heparina. Las polimerasas de DNA de la presente invención se pueden utilizar para extender los moldes en presencia de al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 ng/l, o más de 400 ng/l de heparina. Las polimerasas de DNA de la presente invención se pueden utilizar para extender los moldes en presencia de cantidades de heparina que inhibirían la extensión del mismo molde por una polimerasa de DNA de referencia o control.

Una polimerasa mejorada de la invención se puede usar en una reacción de transcripción inversa. La reacción de transcripción inversa se puede llevar a cabo en una mezcla que contiene el molde de RNA, uno o más cebadores, y un polimerasa de DNA termoestable de la invención. La mezcla de reacción típicamente contiene los cuatro trifosfatos de desoxirribonucleósidos estándar (dNTP) y un tampón que contiene un catión divalente y un catión monovalente. Cationes ejemplares incluyen, por ejemplo, Mg2+, aunque otros cationes, tales como Mn2+ o Co2+ pueden activar las polimerasas de DNA. La reacción de transcripción inversa se puede llevar a cabo con una polimerasa de DNA termoactiva de la invención. La polimerasa mejorada de la invención puede permitir la amplificación más eficiente de los moldes de RNA sin comprometer la amplificación eficiente de un molde de DNA en presencia de Mn2+ o Mg2+, como se describe en los ejemplos.

Una polimerasa mejorada de la invención puede aumentar la eficiencia de la transcripción inversa mediante la reducción del tiempo de reacción requerido para la ampliación de un molde de RNA. Por ejemplo, una polimerasa mejorado descrita en este documento puede reducir significativamente el tiempo de reacción requerido para transcribir RNA a cDNA en comparación con una polimerasa control, aumentando así la eficiencia de la transcriptasa inversa. Sin estar limitados por la teoría, la polimerasa mejorada puede aumentar la eficiencia de la TI, por ejemplo, aumentando la actividad de la enzima sobre un molde de RNA, aumentando la velocidad de incorporación de nucleótidos y/o aumentando la capacidad de procesamiento de la polimerasa, acortando de ese modo de forma eficaz el tiempo de extensión de un molde de RNA o población de moldes de RNA. Los tiempos de reacción para la etapa inicial de TI son típicamente del orden de 30 minutos o más a 65 grados C cuando se utiliza una polimerasa no modificada o control. Una polimerasa mejorada puede ser capaz de transcribir un molde de RNA en DNAc en menos de aproximadamente 10 minutos, menos de aproximadamente 8 minutos, menos de aproximadamente 5 minutos, menos de aproximadamente 4 minutos, menos de aproximadamente 3 minutos, o menos de aproximadamente 2 minutos a 65 grados C. Una polimerasa mejorada puede ser capaz de transcribir un molde de RNA derivado del transcrito JP2-5 de la hepatitis C (VHC), que contiene las primeras 800 bases del VHC genotipo Ib NTR 5', en DNAc en menos tiempo o más rápido que una polimerasa control. Una polimerasa mejorada puede ser capaz de transcribir 240 bases del molde de RNA JP2-5 de VHC en DNAc de longitud completa en unos 15 segundos menos, 30 segundos menos, un minuto menos, dos minutos menos, 3 minutos menos, 4 minutos menos, 5 minutos menos, o unos 10 minutos de menos que una polimerasa control en condiciones de reacción idénticas. Una polimerasa mejorada puede ser capaz de transcribir 240 bases del molde de RNA JP2-5 de VHC en DNAc de longitud completa más rápido que una polimerasa control, por ejemplo, aproximadamente 5 segundos, 10 segundos, 15 segundos, 30 segundos, 45 segundos, o 60 segundos o más rápido que una polimerasa de control en condiciones de reacción idénticas. Las condiciones de reacción pueden ser las descritos en los Ejemplos. Una polimerasa mejorada descrita en el presente documento puede ponerse en contacto con un molde de RNA a 65 grados C durante 2 minutos en la mezcla de reacción descrita anteriormente. La etapa de extensión puede continuar con la amplificación por PCR del molde extendido, como se describe en los ejemplos.

La actividad TI más eficiente en las polimerasas de DNA termoestables se ha logrado usando Mn2+ como el activador de ion metálico divalente. Sin embargo, es bien sabido que cuando Mn2+ está presente en las reacciones, la fidelidad de las polimerasas de DNA es menor. A menos que se esté tratando de generar mutaciones, por lo general se intenta mantener una mayor fidelidad. Afortunadamente, la mayoría de secuenciación convencional, aplicaciones PCR y RT-PCR no requieren condiciones de alta fidelidad, porque los sistemas de detección generalmente están buscando en una población de productos. Con el advenimiento de la secuenciación de siguiente generación, PCR digital, etc., la fidelidad del producto es más importante y los métodos que permiten la síntesis de DNA de mayor fidelidad son críticos. Conseguir una actividad TI eficiente usando Mg2+ como el activador de ion metálico divalente es una excelente manera de aumentar sustancialmente la fidelidad de la polimerasa de DNA y permitir una copia más fiable del ácido nucleico diana. En consecuencia, una polimerasa mejorada puede permitir la extensión y/o la amplificación de moldes de RNA utilizando Mg2+ como el activador de ion metálico divalente eficiente, como se describe en los ejemplos.

Debido a que las polimerasas descritas en este documento también pueden tener una mayor tolerancia a los desemparejamientos, las polimerasas encuentran uso en procedimientos en los que es probable la variación del molde diana y, aún así, se desea que el molde se amplifique independientemente de la variación en el molde diana. Un ejemplo de tales moldes puede incluir, por ejemplo, secuencias virales, bacterianas, o de otros patógenos. Puede ser deseable determinar simplemente si un individuo (humano o animal no humano) tiene una infección viral o de otro tipo, independientemente de la variante viral que ha infectado el individuo. Como ejemplo, se puede utilizar un par de cebadores para amplificar el VHC usando una polimerasa de la invención y detectar la presencia del VHC incluso si el virus particular que infecta el individuo tiene una mutación que resulta en una falta de coincidencia en el sitio de hibridación del cebador.

15

25

35

45

55

65

Los ácidos nucleicos diana pueden provenir de una fuente biológica o sintética. La diana puede ser, por ejemplo, DNA o RNA. En general, cuando se generan amplicones, los amplicones se componen de DNA, aunque también se pueden incorporar en el amplicón ribonucleótidos o nucleótidos sintéticos. Cuando se desea detectar un RNA, el proceso de amplificación típicamente implica el uso de la transcripción inversa, incluyendo, por ejemplo, PCR de transcripción inversa (RT-PCR).

Las secuencias diana específicas pueden incluir, por ejemplo, los ácidos nucleicos virales (por ejemplo, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis B (VHB), (citomegalovirus (CMV), parvovirus B19, virus Epstein-Barr, virus de la hepatitis C (VHC), virus del papiloma humano (VPH), el virus de la encefalitis japonesa (VEJ), el virus del Nilo Occidental (VNO), virus de la encefalitis St. Louis (VESL), virus de la encefalitis del Valle de Murray, y el virus Kunjin), ácidos nucleicos bacterianos (por ejemplo, S. aureus, Neisseria meningitidis, Plasmodium falciparum, Chlamydia muridarum, Chlamydia trachomatis), micobacterias, ácidos nucleicos fúngicos, o ácidos nucleicos de animales o plantas. Los ácidos nucleicos diana pueden ser, ácidos nucleicos de origen animal (por ejemplo, humano) o derivan de una muestra de un animal (por ejemplo, humano) (es decir, los ácidos nucleicos virales o de un organismo patógeno puede estar presente en una muestra de una biopsia animal, muestra de sangre, muestra de orina, muestra fecal, saliva, etc.). Los ácidos nucleicos diana pueden ser, por ejemplo, regiones genéticas humanas que pueden incluir variantes asociadas con la enfermedad (por ejemplo, cáncer, diabetes, etc.). Debido a que las polimerasas de la invención pueden tener tolerancia al desemparejamiento, tales enzimas pueden ser particularmente útiles, por ejemplo, cuando la diversidad de secuencias relacionadas podría estar en una secuencia diana. La descripción se puede utilizar para detectar patógenos virales, en la que los patógenos virales tienen suficiente variación en sus genomas para que sea difícil o imposible diseñar un solo cebador o un pequeño conjunto de cebadores que amplifiquen la mayoría o todos los posibles genomas virales o en el cáncer u otra enfermedad los marcadores genéticos en que la variación en la secuencia sea conocida o que pueda producirse.

Otros métodos para detectar productos de extensión o productos de amplificación utilizando las polimerasas mejoradas descritas en este documento incluyen el uso de colorantes de unión a nucleótidos de doble cadena fluorescentes o colorantes intercalantes de nucleótidos de doble cadena fluorescentes. Ejemplos de colorantes de unión al DNA de doble cadena fluorescentes incluyen SYBR-green (Molecular Probes). Los colorantes de unión al DNA de doble cadena se pueden utilizar en conjunción con el análisis de curva de fusión para medir los productos de extensión de cebadores y/o productos de amplificación. El análisis de la curva de fusión se puede realizar en un instrumento de PCR en tiempo real, tales como el instrumento ABI 5700/7000 (formato de 96 pocillos) o el instrumento ABI 7900 (formato de 384 pocillos) con el programa incorporado (SDS 2.1). Alternativamente, el análisis de la curva de fusión se puede realizar como un análisis de punto final. Ejemplos de métodos para el análisis de punto de fusión se describen en la publicación de patente de EE.UU. nº 2006/0172324.

Los equipos se proporcionan para su uso en los métodos de extensión de cebadores descritos en el presente documento. El equipo puede estar compartimentado para facilitar su uso y contiene al menos un recipiente que proporciona una mejora de la polimerasa de DNA de acuerdo con la presente invención. También puede incluirse uno o más contenedores adicionales que proporcionan reactivos adicionales. El equipo también puede incluir un tubo de recogida de sangre, contenedor o unidad que comprende heparina o una sal de la misma, o libera la heparina en la solución. La unidad de recogida de sangre puede ser un tubo heparinizado. Tales recipientes adicionales pueden incluir cualquier reactivo u otros elementos reconocidos por el experto en la técnica para su uso en los procedimientos de extensión de cebadores de acuerdo con los métodos descritos anteriormente, incluyendo reactivos para su uso en, por ejemplo, procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, PCR, RT-PCR), procedimientos de secuenciación de DNA, o los procedimientos de marcaje de DNA. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el equipo incluye además un recipiente que proporciona un cebador sentido 5’ hibridable, en condiciones de extensión del cebador, a un molde de polinucleótidos predeterminado, o un par de cebadores que comprende el cebador sentido 5’ y un cebador antisentido 3’ correspondiente. El equipo puede incluir uno o más recipientes que proporcionan trifosfatos de nucleósidos (convencionales y/o no convencionales). El equipo puede incluir dNTP alfafosforotioato, dUTP, dITP, y/o dNTPs marcados tales como, por ejemplo, dNTP de la familia de colorantes fluoresceína o cianina. El equipo puede incluir uno o más recipientes que proporcionan un tampón adecuado para una reacción de extensión del cebador.

Las mezclas de reacción pueden proporcionarse comprendiendo las polimerasas con una eficiencia de la transcriptasa inversa, tolerancia al desemparejamiento, velocidad de extensión y/o la tolerancia de los inhibidores de TI y de la polimerasa aumentados tal como se describe en el presente documento. Las mezclas de reacción pueden comprender además reactivos para su uso en, por ejemplo, procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, PCR, RT-PCR), procedimientos de secuenciación de DNA, o de marcaje de DNA. Por ejemplo, las mezclas de reacción pueden comprender un tampón adecuado para una reacción de extensión del cebador. Las mezclas de reacción pueden contener también un molde de ácido nucleico (DNA y/o RNA), uno o más cebadores o sondas de polinucleótidos, trifosfatos de nucleósidos (incluyendo, por ejemplo, desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos marcados, nucleótidos no convencionales), sales (por ejemplo, Mn2+, Mg2+), marcajes (por ejemplo, fluoróforos). Las mezclas de reacción pueden contener un cebador sentido 5' hibridable, en condiciones de extensión del cebador, a un molde de polinucleótido predeterminado, o un par de cebadores que comprende el cebador sentido 5’ y un cebador antisentido 3’ correspondiente. Las mezclas de reacción pueden contener alfafosforotioato dNTP, dUTP, dITP, y/o dNTP marcados tales como, por ejemplo, dNTP de la familia de colorantes

imagen15

imagen16

imagen17

imagen18

Claims

imagen1