ES2573977T3

ES2573977T3 - Lípidos novedosos que contienen azufre para su uso como complemento alimenticio o como medicamento

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Publication number: ES2573977T3
Application number: ES09798181.5T
Authority: ES
Inventors: Anne Kristin Holmeide; Ragnar Hovland; Morten Braendvang
Original assignee: Pronova Biopharma Norge AS
Current assignee: Pronova Biopharma Norge AS
Priority date: 2008-07-15
Filing date: 2009-07-13
Publication date: 2016-06-13
Anticipated expiration: 2029-07-13
Also published as: WO2010008299A1; EA022593B1; MA33083B1; EP2313090A1; NZ590645A; ZA201100666B; SG192525A1; BRPI0916456B8; EA201170193A1; HK1161078A1; IL210673A0; NZ601501A; PH12011500113A1; KR20110031497A; HRP20160557T1; IL210673A; IN2011CH01039A; HUE029195T2; AU2009271791A2; AU2009271791A1

Abstract

Compuesto lipídico de fórmula (I):**Fórmula** en la que * R1 se selecciona de un alquenilo C10-C22 con 3-6 dobles enlaces metileno interrumpidos en configuración Z, y un alquinilo C10-C22 que tiene 1-6 triples enlaces; * R2 y R3 son iguales o diferentes y pueden seleccionarse de un grupo de sustituyentes que consiste en un átomo de hidrógeno y un grupo alquilo, siempre que R2 y R3 no sean ambos un átomo de hidrógeno; o * R2 y R3 pueden estar conectados para formar un cicloalcano como ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano o ciclohexano; * Y se selecciona de azufre, sulfóxido y sulfona; * X representa un ácido carboxílico o una carboxamida seleccionada del grupo que consiste en Nmetilcarboxamida, N,N-dimetilcarboxamida, N-etilcarboxamida y N,N-dietilcarboxamida; o una sal, solvato o solvato de tal sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, con la condición de que el compuesto de fórmula (I) no sea: ácido 2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-icosa-5,8,11,14,17-pentaeniltio)butanoico.

Description

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ácido 2-etil-2-((3Z,6Z,9Z,12Z)-pentadeca-3,6,9,12-tetraeniltio)butanoico (8) R1 = C15H23, R2 = R3= etilo, Y = S y X = COOH

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ácido 2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-icosa-5,8,11,14,17-pentaeniltio)propanoico (9) R1 = C20H31, R2 = metilo, R3 = un átomo de hidrógeno, Y = S y X = COOH

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ácido 2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-icosa-5,8,11,14,17-pentaeniltio)butanoico (10) R1 = C20H31, R2 = etilo, R3 = un átomo de hidrógeno, Y = S y X = COOH

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ácido 2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-icosa-5,8,11,14,17-pentaeniltio)-2-metilpropanoico (11) R1 = C20H31, R2 = metilo, R3 = metilo, Y = S y X = COOH

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ácido 2-etil-2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-icosa-5,8,11,14,17-pentaeniltio)butanoico (12) 15 R1= C20H31, R2= R3= etilo,Y = S yX = COOH

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ácido 1-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-icosa-5,8,11,14,17-pentaeniltio)ciclobutanocarboxílico (13) R1 = C20H31, R2 y R3 se combinan para formar un anillo de ciclobutano, Y = S y X = COOH

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20 ácido 2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-docosa-4,7,10,13,16,19-hexaeniltio)butanoico (16)

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ácido 2-((3Z,6Z,9Z,12Z)-pentadeca-3,6,9,12-tetraenilsulfonil)butanoico (25) R1 = C15H23, R2 = etilo, R3 = un átomo de hidrógeno, Y = SO2 y X = COOH

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ácido 2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-icosa-5,8,11,14,17-pentaenilsulfinil)butanoico (26) R1 = C20H31, R2 = etilo, R3 = un átomo de hidrógeno, Y = SO y X = COOH

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ácido 2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-icosa-5,8,11,14,17-pentaenilsulfonil)butanoico (27) R1 = C20H31, R2 = etilo, R3 = un átomo de hidrógeno, Y = SO2 y X = COOH

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ácido 2-etil-2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-icosa-5,8,11,14,17-pentaenilsulfinil)butanoico (28) R1 = C20H31, R2 = R3= etilo, Y = SO y X = COOH

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ácido 2-etil-2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-icosa-5,8,11,14,17-pentaenilsulfonil)butanoico (29) 15 R1= C20H31, R2= R3= etilo,Y = SO2yX = COOH Los compuestos de las categorías C-E anteriores, en los que R2 y R3 son diferentes, pueden existir en formas

estereoisómericas, es decir se abarcan todos los isómeros ópticos de los compuestos y mezclas de los mismos. Por lo tanto, dichos compuestos pueden estar presentes como diastereómeros, racematos y enantiómeros. Métodos de síntesis generales para los compuestos descritos en el presente documento

20 Los compuestos de fórmula general (I) pueden prepararse por los procedimientos generales siguientes: Método I

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Método II

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Los alcoholes descritos en los métodos I y II pueden prepararse directamente a partir de los ésteres carboxílicos de,

5 por ejemplo, ácidos grasos que se producen de manera natural; por ejemplo ácido alfa-linolénico, ácido linolénico conjugado, ácido eicosapentaenoico (EPA), etc. mediante reducción con un agente reductor como hidruro de litio y aluminio o hidruro de diisobultilaluminio a de -10 a 0ºC. Los alcoholes pueden también prepararse mediante degradación de los ácidos grasos poliinsaturados EPA y DHA, tal como se describe por Holmeide et al. (J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 2000, 2271). En este caso puede comenzarse con EPA o DHA, pero también es posible

10 comenzar con aceite de pescado que contiene mezcla de EPA y DHA.

Los compuestos de fórmula (X) y (XI) están disponibles comercialmente, o se conocen en la bibliografía, o se prepararan mediante procedimientos convencionales conocidos en la técnica. El grupo saliente (LG) presente en los compuestos de fórmula (XI) puede ser, por ejemplo, mesilato, tosilato o un halógeno adecuado, tal como bromo.

Usando el método I, los alcoholes resultantes pueden convertirse, usando la interconversión de grupos funcionales,

15 mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica (etapa I), en compuestos en los que el grupo hidroxilo terminal se ha transformado en un grupo saliente (LG) adecuado. Los grupos salientes adecuados incluyen bromo, mesilato y tosilato. Estos compuestos pueden reaccionar además (etapa II) en una reacción de sustitución con los derivados de ácido tioacético sustituidos apropiadamente (X), en presencia de una base.

Usando el método II, los alcoholes pueden convertirse en los tioles correspondientes (etapa IV) mediante métodos

20 conocidos para los expertos en la técnica. Los tioles pueden reaccionar entonces adicionalmente (etapa V) en una reacción de sustitución con compuestos de fórmula (XI), en presencia de una base en un sistema de disolventes apropiado.

Los sulfóxidos y sulfonas correspondientes (Y = SO o SO2) pueden prepararse mediante oxidación de los tioéteres (Y = S) con un agente de oxidación adecuado (etapa III). Ejemplos de agentes de oxidación son ácido m-cloro25 perbenzoico (MCPBA), peróxido de hidrógeno (H2O2) y Oxone (peroximonosulfato de potasio). Usando 1 equivalente

o menos del agente de oxidación, el producto principal será el sulfóxido. Usando un exceso de agente de oxidación, el producto principal será la sulfona.

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Si los derivados de ácido usados son ésteres carboxílicos, puede llevarse a cabo una hidrólisis para obtener los ácidos grasos libres. Puede eliminarse un grupo esterificante tal como un metilo de un grupo etilo, por ejemplo, mediante hidrólisis alcalina usando una base tal como un hidróxido de metal alcalino, por ejemplo LiOH, NaOH o KOH o usando una base orgánica, por ejemplo Et3N junto con una sal inorgánica, por ejemplo LiCl en un sistema de disolventes apropiado. Puede eliminarse un grupo terc-butilo, por ejemplo, mediante el tratamiento con un ácido, por ejemplo un ácido orgánico tal como ácido trifluoroacético o ácido fórmico en un sistema de disolventes apropiado. Puede eliminarse un grupo arilmetilo tal como un grupo bencilo, por ejemplo, mediante hidrogenación sobre un catalizador tal como paladio sobre carbono en un sistema de disolventes apropiado.

La preparación de compuestos de fórmula I, según el método I o II, puede dar como resultado mezclas de estereoisómeros. Si se requiere, estos isómeros pueden separarse por medio de agentes de resolución quiral y/o mediante cromatografía en columna quiral a través de métodos conocidos para el experto en la técnica.

Preparación, caracterización y pruebas biológicas de derivados de ácidos grasos específicos de fórmula (I)

La invención se describirá ahora adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitativos, en los que pueden usarse cuando sea apropiado técnicas convencionales conocidas para los químicos expertos y técnicas análogas a las descritas en estos ejemplos. A menos que se establezca lo contrario:

•: las evaporaciones se llevaron a cabo por una evaporación rotativa en vacío;

•: todas las reacciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente, normalmente en el intervalo de entre 18-25ºC con disolventes de calidad para HPLC en condiciones anhidras;

•: la cromatografía en columna se llevó a cabo mediante el procedimiento ultrarrápido sobre gel de sílice de 40-63 m (Merck) o mediante un instrumento Armen Spotflash usando las columnas de gel de sílice preempaquetadas “MiniVarioFlash”, “SuperVarioFlash”, “SuperVarioPrep” o “EasyVarioPrep” (Merck);

•: se proporcionan los rendimientos sólo a modo de ilustración y no son necesariamente los máximos que pueden obtenerse;

•: se registraron los valores de desplazamiento de resonancia magnética nuclear (RMN) en un instrumento Bruker Avance DPX 200 ó 300, y se muestran las multiplicidades de pico tal como sigue: s, singlete; d, doblete; dd, doblete doble; t, triplete; q, cuartete; p, pentete; m, multiplete; a, ancho;

•: se registraron los espectros de masas en un espectrómetro de CL/EM. Se realizó la separación usando un módulo de la serie Agilent 1100 en una columna Eclipse XDB-C18 2,1 x 150 mm con elución en gradiente. Se usaron como eluyente un gradiente del 5-95% de acetonitrilo en tampones que contenían ácido trifluoroacético al 0,01% o formiato de sodio al 0,005%. Se registraron los espectros de masas en un espectrómetro de masas G 1956 A (electrospray, 3000 V) cambiando entre el modo de ionización positivo y negativo.

Preparación de productos intermedios

Ejemplo 1:

Preparación de etanotioato de S-(3Z,6Z,9Z,12Z)-pentadeca-3,6,9,12-tetraenilo.

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Se disolvió trifenilfosfina (PPh3) (41,7 g, 159 mmol) en tetrahidrofurano seco (THF) (250 ml) a 0ºC bajo atmósfera inerte y se añadió azodicarboxilato de diisopropilo (DIAD) (30,8 ml, 159 mmol). Se agitó la mezcla a 0ºC durante 40 minutos y después se añadió gota a gota una disolución de (todo Z)-3,6,9,12-pentadecatetraenol (17,5 g, 79,4 mmol) y ácido tioacético (11,4 ml, 159 mmol) en THF seco (150 ml). Se agitó la mezcla turbia resultante a 0ºC durante 40 minutos, después a temperatura ambiental durante dos horas. Se añadió heptano (300 ml), se agitó la mezcla durante diez minutos y se retiró el sólido blanco precipitado por filtración. Se repitió este procedimiento dos veces y finalmente se agitó el residuo tras la concentración en heptano (100 ml) durante 16 horas. La filtración y purificación del residuo por cromatografía ultrarrápida (EtOAc al 1% en heptano) proporcionaron 13,7 g (rendimiento del 62%) del compuesto del título como un aceite.

1H-RMN (200 MHz, CDCl3):  0,96 (t, 3H), 2,05 (m, 2H), 2,31 (s+m, 5H), 2,76-2,92 (m, 8H), 5,32-5,45 (m, 8H).

Ejemplo 2:

Preparación de (3Z,6Z,9Z,12Z)-pentadeca-3,6,9,12-tetraeno-1-tiol.

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Se suspendió LiAlH4 (2,05 g, 54,1 mmol) en dietil éter seco (100 ml) a 0ºC bajo atmósfera inerte. A esta suspensión se le añadió gota a gota una disolución de etanotioato de S-(3Z,6Z,9Z,12Z)-pentadeca-3,6,9,12-tetraenilo (13,7 g, 49,2 mmol) en dietil éter seco (50 ml) y se agitó la mezcla gris resultante a 0ºC durante diez minutos y después a temperatura ambiental durante 30 minutos. Se enfrió la mezcla hasta 5ºC, se añadió HCL 1 M hasta pH=2 y se filtró a través de un lecho corto de Celite. El lecho se lavó con agua y dietil éter, se separaron las fases y se extrajo la fase acuosa dos veces con dietil éter (100 ml cada vez). Se secaron los extractos orgánicos combinados (Na2SO4), se filtraron y se concentraron a presión reducida para dar 7,8 g (rendimiento del 67%) del compuesto del título como un aceite.

1H-RMN (200 MHz, CDCl3):  0,96 (t, 3H), 2,06 (m, 2H), 2,39 (m, 2H), 2,51 (m, 2H), 2,81 (m, 6H), 5,28-5,54 (m, 8H); EM (ESI): 235 [M-H]-.

Ejemplo 3:

Preparación de etanotioato de S-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-icosa-5,8,11,14,17-pentaenilo.

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Se disolvió trifenilfosfina (21,0 g, 80 mmol) en THF seco (170 ml) a 0ºC bajo atmósfera inerte y se añadió DIAD (15,8 ml, 80 mmol) gota a gota. Después de 40 minutos a 0ºC se añadió gota a gota la suspensión blanca a una disolución de (5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-icosa-5,8,11,14,17-pentaen-1-ol (11,5 g, 40 mmol) y ácido tioacético (5,7 ml, 80 mmol) en THF seco (50 ml) durante 15 minutos. Se agitó la mezcla turbia resultante a 0ºC durante 30 minutos, seguido por temperatura ambiental durante 1,5 horas. Se añadió heptano (200 ml), se agitó la mezcla durante diez minutos y se retiró el sólido blanco precipitado por filtración y se aclaró con heptano (150 ml). Se concentró el residuo para eliminar la mayor parte del THF y se agitó a temperatura ambiental durante 18 horas. Se filtró la mezcla, se concentró y se añadió heptano (200 ml). Se agitó la mezcla resultante durante 2 horas, se filtró y se evaporó. Se purificó el residuo por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice, usando EtOAc:heptano (2:98), seguido por EtOAc:heptano (4:96) y finalmente EtOAc:heptano (5:95). La concentración de las fracciones apropiadas proporcionó 11,0 g (rendimiento del 79%) del compuesto del título como un aceite.

1H-RMN (300 MHz, CDCl3):  0,95 (t, 3H, J=7,5 Hz), 1,40 (m, 2H), 1,58 (m, 2H), 2,06 (m, 4H), 2,29 (s, 3H), 2,77 2,87 (m, 10H), 5,25 -5,42 (m, 10H); EM (Cl (CH4)): 387 [M+C3H5]+, 375 [M+C2H5]+, 347 [M+H]+, 333 [M-CH2]+, 305 [R-SH]+.

Ejemplo 4:

Preparación de (5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-icosa-5,8,11,14,17-pentaeno-1-tiol.

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Se disolvió etanotioato de S-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-icosa-5,8,11,14,17-pentaenilo (7,00 g, 20,2 mmol) en Me-OH (100 ml) agitando 10 minutos hasta que se disolvieron las gotas de aceite, antes de que se añadiera carbonato de potasio anhidro, K2CO3 (2,79 g, 20,2 mmol) en una porción. Se agitó la mezcla durante 1 hora y 20 minutos a temperatura ambiental y se extinguió por la adición de HCl 1 M (50 ml) y agua (150 ml). A la mezcla blanca enturbiada se le añadió Et2O (250 ml) y se separaron las fases. Se extrajo la fase acuosa con Et2O (2x250 ml). Se lavaron las fases orgánicas combinadas con salmuera (250 ml) y se secaron (MgSO4). La filtración y evaporación dio el compuesto del título como un aceite (5,99 g, rendimiento del 97%), que se usó sin purificación adicional.

1H-RMN (300 MHz, CDCl3):  0,96 (t, 3H, J=7,5 Hz), 1,31 (t, 1 H, J=7,8 Hz), 1,44 (m, 2H), 1,61 (m, 2H), 2,06 (m, 4H), 2,51 (m, 2H), 2,77 -2,85 (m, 8H), 5,28 -5,41 (m, 10H); EM (Cl (CH4)): 345 [M+C3H5]+, 333 [M+C2H5]+, 305 [M+H]+, 271 [M-SH]+.

Ejemplo 5:

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a esta temperatura durante diez minutos. Se añadió bromobutirato de etilo (6,39 ml, 43,5 mmol) y se agitó la mezcla a temperatura ambiental durante 30 minutos. Se repartió la mezcla entre NH4Cl saturado (150 ml) y heptano (150 ml). Se extrajo la fase acuosa dos veces con heptano (100 ml cada vez) y se lavó el extracto combinado orgánico con agua (100 ml) y salmuera (100 ml). Se secó la fase orgánica (Na2SO4), se filtró y se concentró. Se purificó el residuo por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (heptano : EtOAc 99:1 después 95:5). La concentración de las fracciones apropiadas proporcionó 14,1 g (rendimiento del 97%) del compuesto del título como un aceite.

1H-RMN (200 MHz, CDCl3):  0,92-1,01 (2 x t, 6H), 1,27 (t, 3H), 1,60-1,80 (m, 1H), 1,80-1,95 (m, 1H), 2,00-2,15 (m, 2H) 2,25-2,45 (m, 2H), 2,60-2,75 (m, 2H), 2,80 (m, 6H), 3,15 (t, 1 H), 4,17 (q, 2H), 5,31-5,43 (m, 8H); EM (ESI): 373 [M+Na]+.

Ejemplo 8:

Preparación de 2-((3Z,6Z,9Z,12Z)-pentadeca-3,6,9,12-tetraenilsulfonil)butanoato de etilo (31).

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Se disolvió 2-((3Z,6Z,9Z,12Z)-pentadeca-3,6,9,12-tetraeniltio)butanoato de etilo (2,7 g, 7,7 mmol) en CHCl3 seco (40 ml) y se enfrió la disolución hasta -20ºC bajo atmósfera inerte. Se añadió gota a gota ácido metacloroperoxibenzoico (mCPBA) (77%, 4,0 g, 18 mmol) disuelto en CHCl3 seco (10 ml) y agitó la disolución resultante se a -20ºC durante 30 minutos, se dejó que alcanzara lentamente la temperatura ambiente y después se agitó durante la noche. Se evaporaron los disolventes a vacío, al residuo se le añadió heptano (30 ml) y se retiró el precipitado blanco resultante por filtración. Se concentró el filtrado a vacío y al residuo se le añadió heptano (10 ml). Se retiró el precipitado blanco resultante por filtración otra vez. Se concentró el filtrado a vacío y se purificó el residuo por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (heptano : EtOAc 4:1). La concentración de las fracciones apropiadas proporcionó 0,37 g (rendimiento del 13%) del compuesto del título como un aceite.

1H-RMN (300 MHz, CDCl3):  0,96 (t, 3H), 1,03 (t, 3H), 1,31 (t, 3H), 2,02-2,15 (m, 4H), 2,62 (m, 2H), 2,82 (m, 6H), 3,05 (m, 1 H), 3,20 (m, 1 H), 3,70 (dd, J=10,3 Hz, J=4,7 Hz, 1 H), 4,28 (q, 2H), 5,26-5,41 (m, 7H), 5,46-5,52 (m, 1 H); EM (electrospray): 405,2 [M+Na]+

Preparación de moléculas objetivo

Ejemplo 9:

Preparación de ácido 2-((3Z,6Z,9Z,12Z)-pentadeca-3,6,9,12-tetraeniltio)butanoico (7).

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Se disolvió 2-((3Z,6Z,9Z,12Z)-pentadeca-3,6,9,12-tetraeniltio)butanoato de etilo (14,1 g, 40,2 mmol) en etanol (200 ml) y se añadió una disolución de LiOH x H2O (13,5 g, 322 mmol) en agua (50 ml). Se agitó la disolución turbia resultante a 70ºC bajo atmósfera inerte durante 90 minutos, se enfrió, se añadió agua (100 ml) y HCl 3 M hasta pH=2. Se extrajo la mezcla tres veces con heptano (100 ml cada vez). Se secaron los extractos orgánicos combinados (Na2SO4), se filtraron y se concentraron a presión reducida para proporcionar 11,8 g (rendimiento del 91%) del compuesto del título como un aceite.

1H-RMN (200 MHz, CDCl3):  0,91-1,06 (2 x t, J=7,2 Hz, J=7,5 Hz, 6H), 1,60-1,80 (m, 1 H), 1,80-1,95 (m, 1 H), 2,05 (p, J=7,2 Hz, 2H), 2,35 (m, 2H), 2,60-2,75 (m, 2H), 2,75-2,90 (m, 6H), 3,14 (t, J=7,1 Hz, 1 H), 5,31-5,47 (m, 8H); EM (ESI): 321 [M-H]-.

Ejemplo 10:

Preparación de ácido 2-((3Z,6Z,9Z,12Z)-pentadeca-3,6,9,12-tetraenilsulfinil)butanoico (24)

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Preparación de 1-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-icosa-5,8,11,14,17-pentaeniltio)ciclobutanocarboxilato de etilo (37).

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A una disolución de (5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-icosa-5,8,11,14,17-pentaeno-1-tiol (305 mg, 1,00 mmol) en DMF seca (10 ml) a 0ºC bajo atmósfera inerte se le añadió NaH (al 60% en aceite mineral, 44 mg, 1,1 mmol). Después de quince minutos se añadió 2-bromo-ciclobutanocarboxilato de etilo (170 l, 1,05 mmol) y se agitó la mezcla durante 1,5 horas a 0ºC. Se extinguió la reacción por la adición de NH4Cl ac. sat. (20 ml). Se añadió heptano (50 ml), y se separaron las fases. Se extrajo la fase acuosa con heptano (2x25 ml). Se lavaron las fases orgánicas combinadas con agua (25 ml) y salmuera (25 ml), se secaron (MgSO4), se filtraron y se evaporaron para dar 409 mg del compuesto del título como un aceite en bruto. La purificación por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice usando elución isocrática (heptano:acetona 98:2) proporcionó 243 mg (rendimiento del 56%) del compuesto del título como un aceite.

1H-RMN (300 MHz, CDCl3):  0,95 (t, 3H), 1,27 (t, 3H), 1,42 (d, 3H), 1,54 (m, 2H), 1,84 (m, 1 H), 1,96 -2,23 (m, 7H), 2,51 (m, 2H), 2,60 (m, 2H), 2,73 -2,90 (m, 8H), 4,18 (m, 2H), 5,23 -5,43 (m, 10H); EM (Cl (CH4)): 471 [M+C3H5]+, 459 [M+C2H5]+, 431 [M+H]+, 385 [M-OEt]+, 357 [M-CO2Et]+, 303 [R-S]•+.

Ejemplo 20:

Preparación de ácido 2-etil-2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-icosa-5,8,11,14,17-pentaeniltio)butanoico (12).

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Se añadió NaOEt (al 21% en peso en EtOH, 0,37 ml, 0,98 mmol) gota a gota a una disolución de ácido 2-mercapto2-etilbutírico (0,08 g, 0,49 mmol) en EtOH seco (7 ml) mantenida a 0ºC bajo atmósfera inerte. Se agitó la mezcla resultante a 0ºC durante 30 minutos antes de que se añadiera gota a gota una disolución de (5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)icosa-5,8,11,14,17-pentaenilmetanosulfonato de etilo (0,15 g, 0,41 mmol) en EtOH seco (3 ml). Se agitó la mezcla turbia resultante a temperatura ambiente durante 24 horas, se vertió en NH4Cl (ac.) (sat.) (15 ml), se añadió HCl 3 M hasta pH ∼2 antes de que se extrajera dos veces con EtOAc (2x20 ml). Se lavaron los extractos orgánicos combinados con salmuera (10 ml), se secaron (MgSO4), se filtraron y se evaporaron a vacío. Se purificó el residuo por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice usando un gradiente de acetato de etilo al 10-25% en heptano como eluyente. La concentración de las fracciones apropiadas proporcionó 0,12 g (rendimiento del 70%) del compuesto del título como un aceite.

1H-RMN (300 MHz, CDCl3):  0,88-1,02 (m, 9H), 1,45-1,58 (2xm, 4H), 1,72 (m, 2H), 1,82 (m, 2H) 2,09 (m, 4H), 2,53 (t, 2H), 2,76-2,86 (m, 8H), 5,29-5,39 (m, 10H). EM (electrospray): 417,3 [M-H]-.

Pruebas biológicas

Ejemplo 22: Evaluación de la activación de PPAR in vitro

Se llevó a cabo el ensayo in vitro en tres líneas celulares indicadoras estables, PPAR, PPAR o PPAR, que expresan respectivamente una proteína quimérica que contiene el dominio de unión a ligando (LBD) de PPAR humano, PPAR humano o PPAR humano fusionado al dominio de unión a ADN de GAL4 de transactivador de levadura (DBD).

El gen indicador luciferasa (Luc) está dirigido por un pentámero de la secuencia de reconocimiento de GAL4 delante de un promotor de -globina. El uso de los receptores quiméricos GAL4-PPAR, GAL4-PPAR y GAL4-PPAR permite la eliminación de la actividad de fondo a partir de los receptores endógenos y la cuantificación de la actividad relativa a lo largo de los tres subtipos de PPAR con el mismo gen indicador.

Se sometieron a prueba dos sustancias de referencia no sustituidas, referencia 1 y 2, y cinco sustancias de prueba, (7), (10), (11), (24) y (25) en una concentración de 10 M.

A continuación se muestran las fórmulas estructurales de las sustancias sometidas a prueba:

imagen36

Se determinó la selectividad por PPAR de las sustancias mediante comparación con referencias de fármacos conocidos (GW7647 1 M para PPAR, L-165041 1 M para PPAR y BRL49653 1 M para PPAR) fijados al 100% de actividad.

5 En la figura 1 se presentan los resultados.

Ejemplo 23:

Evaluación de la activación de PPAR in vitro (datos de concentración-respuesta)

Se llevó a cabo el ensayo in vitro usando ensayos híbridos en un mamífero (M1H) que comprenden constructos de fusión de dominio de unión a ADN de GAL4-PPAR-LBD conjuntamente con constructo de indicador luciferasa de

10 Photinus pyralis dirigido por sitios 5xGAL4 en células HEK293 transfectadas de manera transitoria.

Se sometieron a prueba el compuesto (12) y el control positivo (GW7647) a diferentes concentraciones. En la tabla 1 se presentan los resultados.

PPAR

Compuesto: CE50 (nM) Eficacia (%)

GW7647: 0,45 100

(12): 286 84

Tabla 1

Ejemplo 24: Evaluación de los efectos sobre el metabolismo lipídico in vivo en un modelo dislipidémico (ratones 15 transgénicos APOE*3Leiden)

Se ha demostrado que este modelo animal es representativo de la situación en seres humanos con respecto a los niveles de lipoproteína plasmáticos, perfiles de lipoproteína, su receptividad a fármacos hipolipidémicos (como estatinas, fibratos, etc.) y nutrición. Además, dependiendo del nivel de colesterol plasmático los ratones APOE*3Leiden desarrollan lesiones ateroscleróticas en la aorta que se asemejan a las encontradas en seres

20 humanos con respecto a la composición celular y las características morfológicas e inmunohistoquímicas.

Se sometieron ratones APOE*3Leiden hembra a una dieta semisintética de tipo Western (WTD, manteca de cacao al 15%, sacarosa al 40% y colesterol al 0,25%; todo p/p). Con esta dieta el nivel de colesterol plasmático alcanzó niveles medianamente elevados de aproximadamente 12-15 mmol/l. Después de un periodo de estudio de 4 semanas los ratones se subdividieron en grupos de 10 ratones cada uno, coincidentes para el colesterol, los

25 triglicéridos plasmáticos y el peso corporal (t=0).

Se administraron las sustancias de prueba por vía oral como una mezcla con la dieta de tipo Western. Para facilitar el mezclado de los compuestos se añadió aceite de girasol hasta un volumen total de aceite de 10 ml/kg de dieta.

Después de tres semanas de tratamiento (t = 3 semanas) se sometieron a ayuno los ratones durante la noche (o/n) y

se tomaron muestras de sangre para medir los cuerpos cetónicos plasmáticos y los ácidos grasos libres. A t = 0 y 4 semanas se tomaron muestras de sangre después de un periodo de ayuno de 4 horas para medir el colesterol y los triglicéridos plasmáticos.

Se dosificaron dos sustancias de referencia no sustituidas, referencia 3 y 2, y tres sustancias de prueba, (7), (10) y (12), a 0,3 mmol/kg de peso corporal/día. Las fórmulas estructurales de las sustancias sometidas a prueba son tal como se muestra a continuación:

imagen37

En la figura 2 se muestran los resultados.

Pueden usarse ratones ob/ob como modelo para la diabetes tipo II. Los ratones son homocigotos para la mutación espontánea obesa (Lepob) que conduce a deficiencia de leptina. Además de la obesidad (los ratones ob/ob pueden alcanzar tres veces el peso corporal normal de los controles silvestres), los ratones ob/ob muestran un síndrome de hiperglucemia similar a una diabetes tipo II, intolerancia a la glucosa, insulina plasmática elevada, infertilidad,

15 disfunción en la cicatrización de heridas y un aumento en la producción de hormonas tanto de la hipófisis como de las glándulas suprarrenales.

Se sometieron ratones macho ob/ob a una dieta baja en grasas normal durante unas cuantas semanas para su aclimatación. Después del periodo de aclimatación los ratones se subdividieron en tres grupos de 10 ratones cada uno, emparejados según el peso corporal, la glucosa plasmática y la insulina (t=0).

20 Todos los compuestos se administraron por vía oral como una mezcla con la dieta AM II. Para facilitar el mezclado de los compuestos se añadió aceite de girasol hasta un volumen total de aceite de 10 ml/kg de dieta.

Se midieron a t=0, 2 y 4 semanas el peso corporal y la ingesta de alimento. Se tomaron muestras de sangre a t=0, 2 y 4 semanas después de un periodo de ayunas de 4 horas para medir HbA1c en sangre completa y glucosa plasmática, insulina, colesterol y triglicéridos.

25 Se usó como referencia pioglitazona (15 mg/kg de peso corporal/día). El compuesto (10) se dosificó a 0,6 mmol/kg de peso corporal/día. En las figuras 3-6 se muestran los resultados (t = 4).

Claims

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ácido 2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-icosa-5,8,11,14,17-pentaeniltio)butanoico.
52. Composición farmacéutica que comprende el compuesto lipídico

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5 ácido 2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-icosa-5,8,11,14,17-pentaeniltio)butanoico.
53.

Composición farmacéutica según la reivindicación 52, que comprende además un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable, o cualquier combinación de los mismos.
54.

Composición según cualquiera de las reivindicaciones 52 ó 53, que comprende además un antioxidante farmacéuticamente aceptable.

10 55. Compuesto según la reivindicación 50 o composición según cualquiera de las reivindicaciones 52-54, para su uso como medicamento.
56. Método para la producción de un compuesto lipídico según cualquiera de las reivindicaciones 1-19, que comprende uno de los métodos siguientes:

Método I

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en el que R1, R2, R3 y X son tal como se definieron en las reivindicaciones 1-19, y LG representa un grupo saliente tal como mesilato, tosilato o un halógeno adecuado;

Método II

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en el que R1, R2, R3 y X son tal como se definieron en las reivindicaciones 1-19.
57.

Método según la reivindicación 56, en el que la materia prima puede originarse de una fuente vegetal, microbiana y/o animal.
58.

Método según la reivindicación 57, en la que la fuente animal es un aceite marino, un aceite de pescado o un aceite de camarón antártico.

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