ES2575902T3 - Potenciador de quimioluminiscencia - Google Patents
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Abstract
Un inmunoensayo en fase sólida que utiliza un antígeno o/y anticuerpo inmovilizado sobre portadores sólidos finos dispersables en un medio líquido, que comprende un método de quimioluminiscencia utilizado para la detección de la señal que comprende hacer reaccionar un sustrato quimioluminiscente que tiene dioxetano con fosfatasa ácida, fosfatasa alcalina, glucosidasa, glucouronidasa o esterasa como enzima de un cuerpo marcado en presencia de un potenciador de quimioluminiscencia, donde el potenciador de quimioluminiscencia es uno que se ha obtenido por tratamiento de un polímero soluble en agua representado por la siguiente fórmula general (I). donde, cada R5, R6 y R7 es un grupo alquilo no sustituido lineal o ramificado que tiene de 1 a 20 átomos de carbono; un grupo alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 20 átomos de carbono sustituido con uno o más de un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi, un grupo ariloxi, un grupo amino, un grupo amino sustituido, un grupo amido o un grupo ureido; un grupo fluoroalcano; un grupo fluoroarilo; un grupo monocicloalquilo no sustituido que tiene de 3 a 12 átomos de carbono en el anillo; un grupo monocicloalquilo sustituido que tiene de 3 a 12 átomos de carbono en el anillo sustituido con uno o más de un grupo alquilo, alcoxi o grupo benzo condensado; un grupo policicloalquilo que tiene dos o mas anillos condensados y cada uno tiene de 5 a 12 átomos de carbono, que están no sustituidos o sustituidos con uno o más de un grupo alquilo, un grupo alcoxi o un grupo arilo; un grupo arilo, un grupo alcarilo o un grupo aralquilo teniendo al menos un anillo y en total de 6 a 20 átomos de carbono, que esta no sustituido o sustituido con uno o más de un grupo alquilo, un grupo arilo, flúor o un grupo hidroxilo, o al menos dos de R5, R6 y R7 son grupos capaces de formar junto con el átomo cuaternario al que están unidos un anillo saturado o insaturado, no sustituido o sustituido que tiene de 3 a 5 átomos de carbono y 1 a 3 heteroátomos y que contiene nitrógeno, fósforo o azufre, al que puede estar condensado un anillo de benceno. Y solo o en combinación representa un contraión seleccionado de un grupo que consiste en un ión halógeno, un ión sulfato, un ión alquil sulfonato, un ión aril sulfonato, un ión aril sulfonato sustituido, un ión difenilantraceno sulfonato, un ión perclorato, un ión alcanoato, un ión aril carboxilato, un ión benceno aril heterociclico carboxilato y dianiones orgánicos, n representa un número dentro del intervalo entre 500 y 500.000 (promedio de pesos moleculares), que es medido utilizando un método de viscosidad intrínseca o un método LALLS, M es nitrógeno o fósforo, o el copolímero soluble en agua de fórmula (II):**Fórmula** donde Y, M', R5', R6' y R7' son los mismos Y, M, R5, R6 y R7 definidos anteriormente e y y z representan una fracción molar de un monómero individual que constituye el copolímero. con un agente oxidante o un agente reductor, inhibiendo de este modo la conglomeración de los portadores sólidos finos, donde el agente oxidante y el agente reductor es seleccionado de un grupo que consiste en persulfato amónico, sulfito sódico, hipoclorito sódico, peróxido de hidrógeno, metaperyodato sódico, permanganato potásico y dicromato potásico.
Description
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DESCRIPCION
Potenciador de quimioluminiscencia Campo tecnico
La presente invencion se refiere a un inmunoensayo en fase solida.
Antecedentes de la Tecnica
En el campo de la medida de componentes en trazas, particularmente en el campo de diagnostico clmico, se utilizan metodos de medicion que aplican los principios de inmunologfa e inmunoensayos que emplean portadores solidos finos como fase solida son ampliamente utilizados. Los portadores solidos finos incluyen eritrocitos, partfculas de gelatina, partfculas de latex y similares, y un analisis cuantitativo se realiza mediante absorcion de antfgenos y/o anticuerpos en la superficie de los mismos y reaccion inmunologica del anticuerpo o/y el antigeno con el antigeno y/o el anticuerpo de la muestra de prueba. Es sabido que los inmunoensayos que emplean estos portadores solidos finos son incluso comunmente tambien utilizados en campos distintos de los diagnosticos clmicos.
La medicion de quimioluminiscencia utilizando reacciones quimioluminiscentes, en las que la quimioluminiscencia es causada al permitir que una enzima como la fosfatasa alcalina actue sobre un substrato quimioluminiscente como el 1,2-dioxetano, puede medir rapida y sensiblemente la presencia o concentracion de un objeto a medir en una muestra, y ha sido ampliamente utilizada para medir virus como VIH y VHC, y trazas de otros componentes in vivo (JP 96-507694).
Es bien sabido que una reaccion de desactivacion ocurre en medio lfquido, particularmente en medio acuoso con quimioluminiscencia por descomposicion del substrato quimioluminiscente que contiene dioxetano. Muchas muestras de ensayo son muestras biologicas en general, y asf la medicion de las muestras de ensayo con este metodo se realiza generalmente en medio acuoso. Por lo tanto, la reaccion de desactivacion a veces reduce sustancialmente la quimioluminiscencia ocurrida por la descomposicion del substrato quimioluminiscente que contiene dioxetano, que es realmente observado. En los metodos de medicion de ciertas muestras de ensayo, p. ej. acidos nucleicos, un anticuerpo viral y otras protemas, en las que la deteccion a un bajo nivel es necesaria, la reduccion de la quimioluminiscencia por la reaccion de desactivacion en combinacion con las senales de fondo inevitables reduce la sensibilidad del metodo de medicion, y asf en algunos casos, la presencia a nivel extremadamente bajo, no puede ser detectada. Con el fin de mejorar estas reacciones de desactivacion, una adicion de macromoleculas solubles en agua que incluye tanto moleculas de origen natural como sinteticas (vease documento de Patente de EE.UU. no. 5,145,722), una adicion de varios potenciadores solubles en agua a muestras de ensayo (vease documento de Patente de EE. UU. no. 4,978,614), o sales de amonio cuaternarias polimerizadas solubles en agua tales como el cloruro de poli(vinilbenciltrimetilamonio) (TMQ), cloruro de poli(vinilbenciltributil amonio) (TBQ), cloruro de poli [vinilbencil(bencildimetilamonio)] (BDMQ) han sido utilizadas como sales de amonio cuaternarias polimerizadas solubles en agua (Vease documento de Patente de EE. UU. no. 5,112,960 y JP 8- 507694T).
Mientras tanto, los potenciadores de quimioluminiscencia tales como TMQ, TBQ y BDMQ descritos anteriormente, son polfmeros con elevado peso molecular. En el caso de ser utilizados para la deteccion de una senal en inmunoensayos en fase solida que emplean antfgenos y/o anticuerpos inmovilizados sobre un portador solido fino dispersable en un medio lfquido, cuando los portadores son antes anadidos ffsicamente, por ejemplo, con el fin de limpiar despues una reaccion inmune, estos polfmeros evitan que los portadores solidos finos de dispersion despues de eso, inhiban la luminiscencia causada por la reaccion enzimatica del sustrato quimioluminiscente que presenta dioxetano dependiendo de la concentracion de la substancia objeto a ser detectada, y a veces han tenido el problema de no haberse podido obtener un valor de medicion preciso.
La solicitud de patente US-A-5 094 939 describe ensayos de quimioluminiscencia utilizando derivados de dioxetano estabilizados.
La solicitud de patente GB-A-2 233 451 describe mejoras de quimioluminiscencia.
La solicitud de patente internacional WO 95/17672 A describe ensayos de transferencia de energfa quimioluminiscente.
La solicitud de patente europea EP-A-0561033 describe sales de fosfonio polimericas que proporcionan un aumento de la quimioluminiscencia de los 1,2-dioxetanos.
Descripcion de la invencion
El problema fundamental de la presente invencion se resuelve por la materia objeto en la reivindicacion independiente aneja. Las realizaciones preferidas se pueden extraer de las reivindicaciones dependientes anejas.
Mas espedficamente, el problema fundamental de la presente invencion se resuelve por un inmunoensayo en fase solida que utiliza un antfgeno o/y anticuerpo inmovilizado sobre portadores solidos finos dispersables en un medio
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Kquido, que comprende un metodo quimioluminiscente usado para la detection de senales que comprende hacer reaccionar un substrato quimioluminiscente que contiene dioxetano con fosfatasa acida, fosfatasa alcalina, glucosidasa, glucuronidasa o esterasa como enzima de un cuerpo marcado en presencia de un potenciador de quimioluminiscencia, donde el potenciador de quimioluminiscencia es uno obtenido por tratamiento de un polimero soluble en agua representado por la siguiente formula general (I):
donde,
cada uno de R5, R6 y R7 es un grupo alquilo no sustituido, lineal o ramificado, que tiene de 1 a 20 atomos de carbono; un grupo alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 20 carbonos sustituido con uno o mas grupos hidroxilo; un grupo alcoxi, un grupo ariloxi, un grupo amino, un grupo amino sustituido, un grupo amida o un grupo ureido; un grupo fluoroalcano; un grupo fluoroarilo; un grupo monocicloalquilo no sustituido que tiene de 3 a 12 atomos de carbono en el anillo; un grupo monoalquilo sustituido que tiene de 3 a 12 atomos de carbono en el anillo sustituido con uno o mas de un grupo alquilo, un grupo alcoxi o un grupo benzo condensado; un grupo policicloalquilo que tiene dos o mas anillos condensados cada uno con 5 a 12 atomos de carbono, que esta no sustituido o sustituido con uno o mas de un grupo alquilo, un grupo alcoxi o un grupo arilo; un grupo arilo, un grupo alcarilo o un grupo aralquilo que tiene al menos un anillo y en total de 6 a 20 atomos de carbono, que esta no sustituido o sustituido con uno o mas de un grupo alquilo, un grupo arilo, fluor o un grupo hidroxilo, o al menos dos de R5, R6 y R7 representan grupos capaces de formar junto con un atomo cuaternario al que estan unidos un anillo saturado o insaturado, no sustituido o sustituido que tiene de 3 a 5 atomos de carbono y 1 a 3 heteroatomos y contiene nitrogeno, fosforo o azufre, al que un anillo de benceno puede ser condensado.
Y solo o en combination representa un contraion seleccionado de un grupo que consiste en un ion halogeno, ion sulfato, ion alquil sulfonato, ion aril sulfonato, ion aril sulfonato sustituido, ion difenilantraceno sulfonato, ion perclorato, ion alcanoato, ion aril carboxilato, ion benceno heteroaril carboxilato y dianiones organicos,
n representa un numero en el intervalo de 500 a 500.000 (promedio de pesos moleculares), que es medido utilizando una viscosidad intrinseca o el metodo LALLS,
M es nitrogeno o fosforo,
o el copolimero soluble en agua de formula (II):
donde,
Y, M’, R5’, R6’ y R7’ son los mismos Y, M, R5, R6 y R7 definidos anteriormente, e y y z representan una fraction molar de un monomero individual que constituye el copolimero
con un agente oxidante o un agente reductor, inhibiendo de este modo el conglomerado de los portadores solidos finos,
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donde, el agente oxidante o el agente reductor se selecciona del grupo que consiste en persulfato amonico, sulfito sodico, hipoclorito sodico, peroxido de hidrogeno, metaperyodato sodico, permanganato potasico y dicromato potasico.
En una realizacion, los portadores solidos finos son particulas.
En una realizacion, los portadores solidos finos son partfculas magneticas.
En una realizacion, el potenciador de quimioluminiscencia no comprende un componente con un peso molecular superior a 400.000 daltons medido por un metodo de ultrafiltracion.
En una realizacion, el sustrato quimioluminiscente que contiene dioxetano es un sustrato representado por la formula general:
donde R2 es un grupo arilo sustituido con un grupo X-oxi, que forma el compuesto 1,2-dioxetano que es un intermedio oxido inestable, cuando X es eliminado por un activador seleccionado de acido, base, enzima, catalizador organico o inorganico y donador de electrones para inducir una reaccion, en el que el compuesto 1,2- dioxetano inestable es descompuesto con liberacion de la energia de los electrones para producir luz y dos compuestos que contiene carbonilos de formula general,
c = o
y
Ri
r2o~
y X es un grupo que quimicamente reacciona con facilidad que es eliminado por un enzima; Ri es uno seleccionado del grupo que consiste en un grupo alquilo, un grupo alcoxi, un grupo ariloxi, un grupo dialquilamino, un grupo trialquilsililoxi, un grupo arilsililoxi, un grupo arilo y un grupo arilo que esta ligado a un grupo arilo R2 para formar un grupo arilo polidclico con sustitucion de un grupo X-oxi, que esta espiro-unido al anillo de 1,2-dioxetano; R3 y R4 son cada uno un grupo alquilo o un grupo heteroalquilo, o R3 y R4 puede estar unidos entre si para formar un grupo alquileno polidclico que esta espiro-unido al anillo de 1,2-dioxetano.
En una realizacion, los polimeros de formula (I) son seleccionados del grupo que consiste en cloruro de poli [vinilbencil(bencildimetilamonio)], cloruro de poli (vinilbenciltrimetilamonio), cloruro de poli [vinilbencil(tributilamonio)], cloruro de bencilmetilcetilamonio, cloruro de polimetacrilamidapropilenmetilamonio, cloruro de poli [vinilbencil(trietilamonio)], cloruro de poli[vinilbencil(2-bencilamino)etildimetilamonio], cloruro de poli [vinilbencil] dimetil(2-hidroxi)etilamonio, cloruro de poli [vinilbencil](trimetilfosfonio), cloruro de poli [vinilbencil(tributilfosfonio(] y cloruro de poli [vinilbencil(trioctilfosfonio)] y copolimeros de los mismos.
Como resultado de un estudio intensivo, los inventores de la presente invencion han encontrado que un potenciador de quimioluminiscencia tal como sales de amonio cuaternarias macromoleculares solubles en agua, sales de sulfonio cuaternarias o sales de fosfonio cuaternarias tratadas con un reactivo permitiendo unas propiedades de oxidacion o reduccion que mejora de forma mas estable la emision de luz causada por una reaccion enzimatica de un sustrato quimioluminiscente que contiene dioxetano en la deteccion de senales en inmunoensayos en fase solida y proporciona resultados de medida mas precisos, y han completado la invencion.
La presente invencion esta relacionada con un inmunoensayo en fase solida usando un antigeno o/y anticuerpo inmovilizado sobre portadores solidos finos dispersables en un medio liquido, que comprende un metodo de quimioluminiscencia utilizado para la deteccion de la senal, que comprende hacer reaccionar un sustrato quimioluminiscente que tiene dioxetano con fosfatasa acida, fosfatasa alcalina, glucosidasa, glucouronidasa o esterasa como enzima marcada en presencia de un potenciador de quimioluminiscencia, donde el potenciador de quimioluminiscencia es obtenido por tratamiento de un polimero soluble en agua representado por la siguiente formula general (I):
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donde,
cada R5, R6 y R7 es un grupo alquilo no sustituido lineal o ramificado que tiene de 1 a 20 atomos de carbono; un grupo alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 20 atomos de carbono sustituido con uno o mas grupos hidroxilo, un grupo alcoxi, un grupo ariloxi, un grupo amino, un grupo amino sustituido, un grupo amida o un grupo ureido; un grupo fluoroalcano; un grupo fluoroarilo; un grupo monocicloalquil no sustituido que tiene de 3 y 12 atomos de carbono en el anillo; un grupo monocicloalquilo sustituido que tiene de 3 y 12 atomos de carbono en el anillo sustituido con uno o mas de un grupo alquilo, un grupo alcoxi o un grupo benzo condensado; un grupo policicloalquilo que tiene dos o mas anillos condensados teniendo cada uno de 5 a 12 atomos de carbono, que esta no sustituido o sustituido con uno o mas de un grupo alquilo, un grupo alcoxi o un grupo arilo; un grupo arilo, un grupo alcarilo o un grupo aralquilo que tiene al menos un anillo y en total de 6 a 20 atomos de carbono, que esta no sustituido o sustituido con uno o mas de un grupo alquilo, un grupo arilo, fluor o grupo hidroxilo, o al menos dos de R5, R6 y R7 representan grupos capaces de formar junto con un atomo cuaternario al que estan unidos un anillo saturado o insaturado, no sustituido o sustituido que tiene de 3 a 5 atomos de carbono y 1 a 3 heteroatomos y que contiene nitrogeno, fosforo o azufe, al que un anillo de benceno puede ser condensado.
Y solo o en combination representa un contraion seleccionado del grupo que consiste un ion halogeno, ion sulfato, ion alquil sulfonato, ion aril sulfonato, ion aril sulfonato sustituido, ion difenilantraceno sulfonato, ion perclorato, ion alcanoato, ion aril carboxilato, ion benceno heteroaril carboxilato y dianiones organicos,
n representa un numero dentro de un intervalo de 500 a 500.000 (promedio de pesos moleculares), que son medido usando un metodo de viscosidad intrinseca o un metodo de LALLS,
M es nitrogeno o fosforo,
o el copolimero soluble en agua de formula (II):
donde Y, M’, R5’, R6’ y R7’ son los mismos definidos anteriormente Y, R5, R6 y R7 y y y z representan una fraction molar de un monomero individual que constituye un copolimero con un agente oxidante o un agente reductor inhibiendo de este modo el conglomerado de los portadores solidos finos,
donde el agente oxidante o el agente reductor es seleccionado de un grupo que consiste en persulfato amonico, sulfito sodico, hipoclorito sodico, peroxido de hidrogeno, metaperiodato sodico, permanganato potasico y dicromato potasico.
Tambien se describe el potenciador de quimioluminiscencia utilizado para detection de senales en inmunoensayos en fase solida que utilizan antigenos o/y anticuerpos inmovilizados sobre portadores solidos finos dispersables en un medio liquido, que consiste en una sal de amonio cuaternaria macromolecular soluble en agua, una sal de sulfonio cuaternaria o una sal de fosfonio cuaternaria con el fin de mejorar la emision de luz causada por la reaction enzimatica de un sustrato quimioluminiscente que contiene dioxetano, donde al potenciador quimioluminiscente se le da un tratamiento para la inhibition de la conglomeration de los portadores solidos finos por tratamiento con un agente oxidante o un agente reductor, y un metodo de quimiluminiscenica y un equipo de reactivos que utilizan el potenciador de quimioluminiscencia.
En una realization el potenciador es un potenciador de quimioluminiscencia que no contiene significativamente un componente de peso molecular mayor que aproximadamente 400.000 Daltons en peso molecular separado por un metodo de ultrafiltracion.
El mejor modo de realizar la invention 2
Como se describe anteriormente el potenciador de quimioluminiscencia del inmunoensayo reivindicado es una sal de amonio cuaternaria, sal de sulfonio cuaternaria o sal de fosfonio cuaternaria macromolecular soluble en agua, o similar, que son tratadas con un reactivo que presenta propiedades de oxidation o reduction, y esta representado por la siguiente formula general (I):
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En la formula general (I), cada uno de R5, R6 y R7 puede ser un grupo alquilo no sustituido lineal o ramificado, que presenta de 1 a 20 atomos de carbono (p. ej. grupo metilo, grupo etilo, grupo n-butilo, grupo t-butilo o grupo hexilo o similares); un grupo alquilo lineal o ramificado que contiene de 1 a 20 atomos de carbono sustituido con uno o mas de un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi, (p. ej. metoxi, etoxi, benciloxi o un grupo polioxietiletoxi), un grupo ariloxi (p. ej. un grupo fenoxi), un grupo amino, un grupo amino sustituido (p. ej. metilamino), un grupo amido (p. ej. un grupo acetamido) o un grupo ureido (p. ej. un grupo fenilureido); un grupo fluoroalcano; un grupo fluoroarilo (p. ej. un grupo heptafluoro butilo); un grupo monocicloalquilo no sustituido que tiene un anillo de 3 a 12 atomos de carbono (p. ej. un grupo ciclohexilo o ciclooctilo); un grupo monocicloalquilo sustituido que tiene un anillo de 3 a 12 atomos de carbono sustituido con uno o mas de un grupo alquilo, un grupo alcoxi o un grupo benzo condensado (p. ej. un grupo metoxiciclohexilo o un grupo 1,2,3,4-tetrahidronaftilo); un grupo policicloalquilo que presenta dos o mas anillos condensados cada uno de ellos de 5 a 12 atomos de carbono, que estan no sustituidos o sustituidos con uno o mas de un grupo alquilo, un grupo alcoxi, o un grupo arilo (p. ej. un grupo 1-adamantilo o un grupo 3-fenil-1-adamantilo); un grupo arilo, un grupo alcarilo o un grupo aralquilo que tiene al menos un anillo y en total entre 6 y 20 atomos de carbono, que estan no sustituidos o sustituidos con uno o mas de un grupo alquilo, un grupo arilo, fluor o un grupo hidroxilo (p. ej. un grupo fenilo, un grupo naftilo, un grupo pentafluorfenilo, un grupo etilfenilo, un grupo bencilo, un grupo hidroxibencilo, un grupo fenilbencilo o un grupo deshidroabietilo); al menos dos de R5, R6 y R7 representan grupos capaces de formar junto con el atomo cuaternario al que estan unidos, un anillo saturado o insaturado, no sustituido o sustituido que tiene de 3 a 5 atomos de carbono y de 1 a 3 heteroatomos y que contiene nitrogeno, fosforo o azufre, al que un anillo de benceno puede ser condensado (p. ej. 1 -piridinio, 1-(3-alquil)imidazolio, 1-(3- aralquil)imidazolio, morfolina, alquil morfolinio, alquil piperidinio, N-acil piperidinio, piperidina, acil piperidinio, benzoxazolio, benzotiazolio o benzamidazolio).
Un simbolo Y en la formula general (I) solo o en combination representa un contraion capaz de incluir restos tales como ion halogeno, es decir, ion fluor, ion cloro, ion bromo y ion yodo, ion sulfato, ion alquil sulfonato (p. ej. ion metil sulfonato), ion aril sulfonato (p. ej. ion p-toluen sulfonato), ion aril sulfonato sustituido (p. ej. ion anilinonaftaleno sulfonato y varios isomeros de estos), ion difenilantraceno sulfonato, ion perclorato, ion alcanoato (p. ej. ion acetato), ion aril carboxilato (p. ej. fluoresceina o derivados de fluoresceina), ion aril heterociclo carboxilato (p. ej. ion 7- dietilamino-4-cianocumarin-3-carboxilato). Dianiones organicos tales como el ion p-tereftalato pueden ser representados por Y.
Asimismo, un simbolo n representa un numero dentro del intervalo de aproximadamente 500 a aproximadamente 500.000 (promedio de pesos moleculares), preferentemente de 20.000 a 70.000 cuando el peso molecular de tales sales cuaternarias de poli(vinilbencilo) es medido utilizando un metodo de viscosidad intrinseca o un metodo LALLS. Los metodos de preparation de estos polimeros donde M es nitrogeno, copolimeros relacionados y materiales de partida relacionados estan descritos en Jones, G. D., Journal of Polymer Science, Vol 25:201, 1958; patentes de EE. UU. nums. No. 2,780,064, No. 3,178,396, No. 3,770,439, No. 4,308,335, No. 4,340,522, No. 4,424,326 y Patente alemana publicada No. 2,447,611. Un simbolo M puede ser fosforo o azufre, y aqui, los correspondientes polimeros de fosfonio o sulfonio estan descritos en patentes anteriores (patentes de EE. UU. nums. No. 3,236,820 y No. 3,065,272).
Como potenciador de quimioluminiscencia que tiene una estructura indicada por la formula general (I), los seleccionados de cloruro de poli[vinilbencil(bencildimetilamonio)] (BMDQ), cloruro de poli(vinilbenciltrimetil amonio) (TMQ), cloruro de poli[vinilbencil(tributil amonio)] (TBQ), cloruro de bencilmetilcetil amonio (BDMCAC), cloruro de polimetacrilamidopropilenmetil amonio (poli MAPTAC), cloruro de poli([vinilbencil(trietil amonio)] (TEQ), cloruro de poli[vinilbencil(2-bencilamino)etildimetil amonio] (BAEDM), cloruro de poli[vinilbencildimetil(2-hidoxi)etil amonio] (DME(OH)B), cloruro de poli[vinilbencil(trimetil fosfonio)] (TM), cloruro de poli[vinilbencil(tributil fosfonio)] (TB) y cloruro de poli[vinilbencil(trioctil fosfonio)] (TO) y copolimeros de estos, son adecuados.
Los potenciadores de quimioluminiscencia de formula general (I) que son particularmente preferibles en la invention son aquellos seleccionados de cloruro de poli[vinilbencil(bencildimetil amonio)] (BDMQ), cloruro de
poli(vinilbenciltrimetilamonio) (TMQ), cloruro de poli[vinilbencil(tributil amonio)] (TBQ), cloruro de poli[vinilbencil(trietil amonio)] (TEQ), cloruro de poli[vinilbencil(trimetil fosfonio)] (TM), cloruro de poli[vinilbencil(tributil fosfonio)] (TB) y cloruro de poli[vinilbencil(trioctil fosfonio)] (TO) y copolimeros de estos, mas preferiblemente aquellos seleccionados entre cloruro de poli(vinilbenciltrimetilamonio) (TMQ), cloruro de poli[vinilbencil(tributil amonio)] (TBQ) y cloruro de poli[vinilbencil(bencildimetil amonio)] (BDMQ), cloruro de poli[vinilbencil(trietil amonio)] (TEQ) y copolimeros de estos, y mas preferiblemente cloruro de poli[vinilbencil(tributil amonio)] (TBQ) y el cloruro de
poli[vinilbencil(bencildimetil amonio)] (BDMQ).
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Como se describe en la siguiente formula general (II), un copoKmero que tiene dos o mas diferentes cadenas laterales onio puede ser tambien utilizado en la invencion expuesta aqd. Los s^bolos Y, M’, R5’, R6’ y R7’ son los mismos Y, M, R5, R6 y R7 definidos anteriormente. Los sfmbolos y y z representan una fraccion molar de un monomero individual que constituye el copolfmero. Por lo tanto, la suma de los sfmbolos y y z siempre es igual a 1, y cada uno de ellos puede variar de 0,01 a 0,99. Como resto adecuado, M es nitrogeno o fosforo, y R5 a R7 son cada uno independientemente un alquilo, cicloalquilo, policicloalquilo (p. ej. grupo adamantano), grupo aralquilo o arilo de 1 a 20 atomos de carbono no sustituido o sustituido ademas con un grupo hidroxilo, amino, amido o grupo ureido, o juntos forman un grupo onio heterociclo (en algunos casos, aromatico o alifatico o mezcla incluyendo otros heteroatomos tales como nitrogeno, azufre u oxfgeno) vfa un espiro enlace con un atomo M.
La reaccion de quimioluminiscencia en sf en la que se usa el potenciador de quimioluminiscencia del inmunoensayo reivindicado es conocida. Las enzimas para llevar a cabo la reaccion de quimioluminiscencia pueden ser fosfatasa acida, fosfatasa alcalina, galactosidasa, glucosidasa, glucouronidasa o esterasa, y ejemplos preferibles pueden incluir fosfatasa acida, fosfatasa alcalina, glucosidasa, galactosidasa y esterasa. La mas preferible es la fosfatasa alcalina. Estas enzimas pueden ser purificadas a partir de animales, plantas, bacterias y similares por metodos conocidos publicamente, y estan tambien disponibles en casas comerciales. Preferentemente tambien se pueden utilizar artfculos disponibles en casas comerciales. Estas enzimas pueden estar en estado libre o unidas a otras sustancias tales como un antfgeno, un anticuerpo y un hapteno.
El sustrato de la reaccion de quimioluminiscencia utilizado aqu puede incluir un derivado de dioxetano representado por la siguiente formula general (III):
O — O
donde R2 es un grupo arilo sustituido con un grupo X-oxi, que forma un compuesto 1,2-dioxetano que es un oxido intermedio inestable donde X es eliminado por un activador seleccionado de un acido, base, sal, enzima, catalizador organico o inorganico y un electrodonador para inducir una reaccion, y el compuesto inestable 1,2-dioxetano es descompuesto con la liberacion de la energfa de electrones para producir luz y compuestos que contienen dos carbonilos, ademas, X es un grupo qdmico facilmente reactivo que es eliminado por una enzima; R1 es seleccionado de un grupo que consiste en un grupo alquilo, un grupo alcoxi, un grupo ariloxi, un grupo dialquilamino, un grupo trialquilsililoxi, un grupo arilsililoxi, un grupo arilo, y un grupo arilo que forma un grupo arilo polidclico de sustituyente X-oxi espiro unido al anillo de 1,2-dioxetano mediante la union a un grupo arilo R2; R3 y R4 son cada uno de ellos un grupo alquilo o heteroalquilo y R3 y R4 pueden estar unidos entre sf para formar un grupo alquileno polidclico espiro unido al anillo de 1,2-dioxetano.
En la formula general (III), cuando R1 no esta unido a R2, este R1 es un grupo alquilo, alcoxi, ariloxi, dialquilamino, trialquilsililoxi, arilsililoxi o arilo como se describe anteriormente, y preferiblemente un grupo alquilo o alcoxi inferior que tiene de 1 a 8 atomos de carbono. R1 puede ser tambien un grupo arilo, ariloxi o arilsililoxi que tiene de 6 a 20 atomos de carbono. Cuando R1 esta unido a R2 que es un grupo arilo para formar un grupo arilo polidclico espiro unido al anillo de 1,2-dioxetano, es preferible que el grupo arilo polidclico tenga mas de 30 atomos de carbono. El grupo arilo polidclico en este caso puede ser uno en el que un atomo de oxfgeno este incluido en lugar de un atomo de carbono como en el grupo xantenilo, y fluorenilo o xantenilo donde es preferible el grupo arilo polidclico espiro unido esta espiro unido al anillo de 1,2-dioxetano en la posicion C9 del grupo.
R2 es un grupo arilo sustituido con un grupo X-oxi (grupo OX), y el grupo que incluye el grupo arilo puede ser un grupo fenilo, bifenilo, fenilo unido u otro grupo arilo, que incluye de 6 a 30 atomos de carbono, e incluye otro sustituyente. X es un grupo eliminado del dioxetano por el activador para descomponer una estructura de dioxetano estable y producir quimioluminiscencia (senal). Es preferible que el grupo OX sea seleccionado entre un grupo hidroxilo, alquilsililoxi, arilsililoxi, una sal inorganica oxi acida (particularmente, sal fosfato o sal sulfato), oxfgeno piranosido, un grupo arilcarboxilester o alquilcarboxilester. Cuando el grupo OX es un grupo hidroxi, un atomo de hidrogeno del grupo es facilmente reactivo con una base organica tal como t-butoxido potasico o una base
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inorganica tal como el hidroxido potasico, y puede ser descompuesto por la base para producir la quimioluminiscencia. Cuando el activador es una enzima utilizada con frecuencia como una etiqueta para inmunoensayos o deteccion de sondas de ADN, podna seleccionarse adecuadamente el grupo OX que tiene un X que reacciona facilmente con la enzima. Por ejemplo, cuando el activador es una fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, aril o acetilcolina esterasa, o similares comunmente empleados como detectores de un sustrato colorimetrico o un sustrato fluorescente en el inmunoensayo o la deteccion de la sonda de ADN, una sal de fosfato, oxfgeno piranosido o un grupo ester acetato pueden ser seleccionados como grupo OX.
R3 o R4 es cada uno un grupo alquilo o un grupo heteroalquilo, y pueden estar unidos uno al otro para formar una estructura de anillo y formar un grupo alquileno polidclico. El grupo alquileno polidclico puede incluir de 6 a 30 atomos de carbono, e incluir heteroatomos (nitrogeno, oxfgeno, azufre o fosforo). El grupo alquileno polidclico preferible es un grupo adamantilo. R3 y R4 confieren estabilidad a la estructura de dioxetano, y pueden tener un sustituyente siempre y cuando el sustituyente no debilite la estabilidad.
En los compuestos que tienen la estructura de dioxetano indicada anteriormente, los sustratos quimioluminiscentes adecuados son el acido 3-(4-metoxispiro[1,2-dioxetano-3,2'-triciclo[3.3.137]decano]-4-il)fenilfosforico y particularmente la sal disodica de este (AMPPD), y el acido 3-(4-metoxispiro[1,2-dioxetano-3,2'-(5- cloro)triciclo[3.3.137]decano]-4-il)fenilfosforico y particularmente la sal disodica de este (CSPD) ( Vease documento de Patente de EE. UU. No. 4,962, 162 y la patente japonesa No. 2552413).
Los portadores solidos finos utilizados en la invencion incluyen eritrocitos animales, partfculas de gelatina, partfculas de latex, partfculas magneticas, y similares. La partfcula de gelatina recogida aqrn se refiere a una partfcula compuesta por polisacaridos solubles en agua, metafosfato sodico y un aldeddo como agente de entrecruzamiento en adicion a la gelatina (vease documento de Patente JP 93-306113 A y documento de Patente JP 88-48021 B), la partdula de latex indica una padcula compuesta de una resina sintetica como un poliestireno y una resina acnlica que es una macromolecula organica, y esta tambien disponible en casas comerciales. Preferiblemente es tambien posible utilizar adculos comercialmente disponibles.
Los portadores solidos finos utilizados en la invencion comprenden portadores procesados para tener magnetismo como padculas magneticas cuyo nucleo es una macromolecula organica y la superficie tiene una capa de recubrimiento de oxido ferrico tipo ferrita. Las padculas magneticas pueden eficazmente realizar una separacion B/F utilizando una fuerza magnetica (vease documento de Patente Japonesa No. 3192149 y No. 2979414). En particular, preferiblemente las padculas magneticas utilizadas incluyen, por ejemplo, padculas donde el nucleo es magnetita y esta recubierto de silano (vease documento de Patente JP 80-141670 A y documento de Patente JP 75-122997 A), padculas donde el nucleo es un oxido metalico magnetico y esta recubierto de silano (vease documento de Patente JP 85-1564 A), padculas magneticas donde el nucleo es un compuesto macromolecular organico, que tiene una capa de recubrimiento de oxido ferrico tipo ferrita (vease documento de Patente japonesa No. 2979414), y ademas padculas que contienen gelatina en una superficie de padculas magneticas donde el nucleo es un compuesto macromolecular organico (vease documento de Patente japonesa No. 3192149).
Los portadores solidos finos no estan particularmente limitados a estos, y portadores apropiados son seleccionados dependiendo del objeto de cada medicion y la constitucion del equipo de reactivos utilizado. Mientras el portador se utilice en el inmunoensayo en fase solida, los efectos de la invencion son ejercidos por el potenciador de quimioluminiscencia.
El potenciador de quimioluminiscencia del inmunoensayo reivindicado puede ser preparado por un tratamiento que utiliza un reactivo que presenta propiedades de oxidacion o reduccion. Un agente de oxidacion o un agente de reduccion utilizado aqrn incluye persulfato amonico, periodato sodico, sulfito sodico, hipoclorito sodico, peroxido de hidrogeno, metaperyodato sodico, permanganato potasico, dicromato potasico y similares. El agente oxidante o agente reductor particularmente preferible incluye persulfato amonico, sulfito sodico, hipoclorito sodico, y metaperyodato sodico, y mas preferiblemente puede incluir sulfito sodico e hipoclorito sodico.
Cuando se prepara el potenciador de quimioluminiscencia del inmunoensayo reivindicado, un potenciador de quimioluminiscencia de la formula general (I) y (II) anteriormente indicada, preparado por metodos conocidos, o el potenciador de quimioluminiscencia de un adculo disponible en casas comerciales es tratado con el agente oxidante o reductor anteriormente indicado bajo condiciones apropiadas. Como condiciones de tratamiento, teniendo en cuenta la especie qdmica, peso molecular, concentracion y similares del potenciador de luminiscencia, es posible seleccionar apropiadamente la concentracion del reactivo, el tiempo de reaccion, la temperatura de reaccion, el sistema de disolvente utilizado y similares del agente oxidante o del agente reductor. Las condiciones no estan particularmente limitadas, y por ejemplo, cuando el potenciador de quimioluminiscencia esta en una cantidad de aproximadamente desde varios gramos hasta cientos de gramos, el potenciador de quimioluminiscencia de acuerdo con la invencion puede ser obtenido por tratamiento con sulfito sodico 5mM a temperatura ambiente durante una hora, o hipoclorito sodico al 0,1% a temperatura ambiente durante dos horas, o persulfato amonico 1mM y metaperyodato sodico 1mM a 60 °C durante dos horas, o peroxido de hidrogeno al 15% a temperatura ambiente durante 17 horas, o permanganato potasico 1 mM y dicromato potasico 1mM a 80 °C durante dos horas. Es sabido que el sulfito sodico presenta propiedades de oxidacion o propiedades de reduccion dependiendo de las condiciones.
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Como se indica en los siguientes ejemplos, es deseable que el potenciador de quimioluminiscencia del inmunoensayo reivindicado sea purificado utilizando una membrana de dialisis que corta a pesos moleculares por debajo de 14.000 despues del tratamiento con hipoclorito sodico. Se ha mostrado que muchos de los potenciadores de quimioluminiscencia no tratados no pueden pasar a traves del filtro en una ultrafiltracion con corte en 300.000 de peso molecular mientras que el potenciador de luminiscencia del inmunoensayo reivindicado puede pasar a traves de el. Ademas, se ha encontrado que incluso en los potenciadores de quimiluminiscencia cuya permeabilidad a traves del filtro sea baja dependiendo de las condiciones de oxidacion/reduccion, la permeabilidad del potenciador de quimioluminiscencia del inmunoensayo reivindicado se puede mejorar cambiando las condiciones de la solucion de dialisis.
Como se indica en los siguientes ejemplos, se ha demostrado que cuando el potenciador de quimioluminiscencia del inmunoensayo reivindicado es anadido a los portadores solidos finos, i. e., por ejemplo, un sistema de dispersion de partfculas magneticas, la dispersabilidad es mejorada, en comparacion con la adicion de un potenciador de quimioluminiscencia no tratado. Se cree que la capacidad de dispersion favorable de tales portadores solidos finos conlleva mejoras y la estabilizacion de la luminiscencia (senal) por reaccion enzimatica del substrato quimioluminiscente que tiene dioxetano.
Ejemplos 2
[0040] En lo sucesivo, la invencion como se define en las reivindicaciones es explicada concretamente en los ejemplos. Sin embargo, la invencion como se define en las reivindicaciones no esta limitada a los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1-1: Efecto de TBQ no tratado y TBQ oxidado/reducido sobre la medicion de la quimioluminiscencia
[0041] A 2 ml de solucion de TBQ (35,2 mg/ml), 2 ml de solucion de sulfito sodico 2mM, 0,015% (concentracion efectiva de cloro) de solucion de hipoclorito sodico, se anadio metaperyodato sodico 2mM o persulfato amonico 2mM, mezclo y posteriormente se trato a 60 °C durante 4 horas. Este TBQ tratado fue distribuido en una membrana de dialisis (corte de peso molecular entre 12.000 y 14.000, suministrada por Sanko Junyaku Co., Ltd.), y luego dializado usando agua MilliQ (agua ultrapura) como una solucion externa para producir TBQ tratado. Despues, 0,4 mg/ml de una solucion de AMPPD (dietanolamina 0,2M (DEA), cloruro magnesico 1 mM (MgCh), azida sodica al 0,05% (NaN3), pH 10,0) conteniendo 0,8 mg/ml de TBQ no tratado o TBQ tratado en preparacion (solucion sustrato). Partfculas magneticas (200 jl) unidas a fosfatasa alcalina al 0,015% (ALP) fueron suministradas a un reactor, y las partfculas fueron atrafdas por un iman poniendo el iman cerca de las partfculas para eliminar el sobrenadante y los lavados. A este reactor, 200 jl de la solucion sustrato indicada anteriormente fueron anadidos y mezclados, se hicieron reaccionar a 37 °C durante 5 min, posteriormente la emision de luz (senal) fue contada por un contador de fotones ( suministrado por Hamamatsu Photonics K. K. ), y se calculo un valor integrado para 2 segundos. La reaccion de las partfculas magneticas indicadas anteriormente con el sustrato fue realizada cinco veces. Este resultado se muestra en la tabla 1. Comparando el TBQ no tratado, con el grupo de TBQ tratado, en todas las condiciones, la senal fue incrementada y la repetibilidad (valor de CV) fue tambien mejorada.
Tabla 1
- TBQ no tratado
- TBQ tratado
- Sulfito sodico hipoclorito sodico metaperyodato sodico persulfato amonico
- Recuento
- 1.188.601 1.795.546 1.900.953 1.882.699 1.887.294
- 1.144.091 1.803.082 1.893.218 1.880.734 1.853.619
- 1.159.564 1.760.605 1.859.213 1.864.943 1.855.904
- 1.100.897 1.774.889 1.881.518 1.859.709 1.852.409
- 1.164.963 1.768.074 1.864.585 1.845.497 1.837.743
- Promedio
- 1.151.623 1.780.439 1.879.897 1.866.716 1.857.394
- CV
- 28% 1,0% 1,0% 0,8% 1,0%
Ejemplo 1-2: Efecto del TBQ no tratado y TBQ oxidado/reducido sobre la dispersion de partfculas
Una solucion de DEA (0,1M, pH 10,0) que tiene 0,8 mg/ml de TBQ no tratado o TBQ tratado se preparo. Despues, 100 jl de partfculas magneticas al 0,03% fueron suministradas al reactor, y las partfculas fueron atrafdas por un iman poniendo el iman cerca de las partfculas y el sobrenadante fue eliminado. Se anadio la solucion de DEA (200 jl) que incluye el TBQ anterior y se agito durante 30 segundos. Quince segundos despues de agitar, 150 jl se
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cogieron de la superficie de la solucion con una pipetman (suministrada por Gilson, una micropipeta), se distribuyo en la celula para el espectrofotometro, y despues de 10 segundos, una turbidez (OD500) se midio con el espectrofotometro ( UV-1.200), suministrado por Shimadzu Corporation). Este resultado se muestra en la tabla 2. Comparando TBQ no tratado con el grupo TBQ tratado, la turbidez es mas alta y la dispersion de las partfculas fue mejorada.
Tabla 2
- TBQ tratado
- TBQ no tratado
- Sulfito sodico hipoclorito sodico metaperyodato sodico persulfato amonico
- Turbidez 0,035
- 0,261 0,368 0,430 0,487
Ejemplo 2-1: Efecto del TBQ no tratado y TBQ oxidado/reducido sobre la medicion de la quimioluminiscencia
A 2 mL de una solucion de TBQ 35,2 mg/ml, se anadieron 2 ml de una solucion que tiene 0,005%, 0,05% o 0,5% de hipoclonto sodico como concentracion efectiva de cloro fue anadido, se mezclo y posteriormente se dejo a 25 °C durante 24 horas. Despues, la mezcla es distribuida en la membrana de dialisis (corte de peso molecular de 12.000 a 14.000, suministrada por Sanko Junyaku Co., Ltd.), y a continuacion se realizo la dialisis usando agua MilliQ como una solucion externa para preparar el TBQ tratado. Despues, se preparo 0,2 mg/ml de una solucion de AMPPD (DEA 0,1M, MgCl2 1mM, NaN3 al 0,05%, pH 10,0) que contiene 0,8 mg/mL de TBQ no tratado o TBQ tratado (solucion sustrato). Luego 200 pl de ALP-unido a partfculas magneticas al 0,015% fueron suministrados al reactor, y las partfculas fueron atrafdas por un iman poniendo el iman cerca de las partfculas, para eliminar el sobrenadante y los lavados. Despues, se anadio y mezclo 200 pl de la solucion sustrato anterior y se hizo reaccionar a 37 °C durante 5 min, posteriormente la emision de luz (senal) fue contada por un contador de fotones ( suministrado por Hamamatsu Photonics K. K. ), y se calculo un valor integrado para dos segundos. Este resultado se muestra en la tabla 3. Comparando el TBQ no tratado, con el grupo de TBQ tratado, en todas las condiciones, la senal fue incrementada y la repetibilidad (valor de CV) fue tambien mejorada.
Tabla 3
TBQ no tratado
tratado con 0,005%
TBQ tratado con hipoclorito sodico
tratado con 0,05% tratado con 0,5%
Recuento 1.243.067
1.138.533 1.185.676 1.213.137 1.046.363 1.198.577
1.939.907 1
1.951.098 1
1.958.058 1
1.958.925 1
1.944.462 1
1.931.453 1
- 874.673
- 1.742.837
- 904.467
- 1.747.014
- 896.528
- 1.742.927
- 928.099
- 1.749.573
- 889.804
- 1.753.686
- 879.883
- 1.738.024
Promedio 1.170.892 1.947.317 1.895.576 1.745.677
CV________________6,0%_____________0,6%_________________1,0%___________________0,3%
Ejemplo 2-2 Efecto del TBQ no tratado y TBQ oxidado/reducido sobre la dispersion de las partfculas
Un TBQ tratado fue obtenido por el metodo descrito en el ejemplo 2-1. Se preparo una solucion de DEA (0,1M, pH 10,0) que contiene 0,8 mg/ml de TBQ no tratado o TBQ tratado fue preparada. Luego, 100 pl de partfcuias magneticas al 0,03% se suministraron al reactor, y las partfculas fueron atrafdas por un iman poniendo el iman cerca de las partfculas y el sobrenadante fue eliminado. Se anadio la solucion de DEA (200 pl) que incluye el TBQ y se agito durante 30 segundos. Quince segundos despues de agitar, se cogieron 150 pl de la superficie de la solucion con una pipetman (suministrada por Gilson, una micropipeta), se distribuyo en la celula para el espectrofotometro, y despues de 10 segundos, una turbidez (OD500) se midio con el espectrofotometro ( UV-1.200), suministrado por Shimadzu Corporation). Este resultado se muestra en la tabla 4. Comparando TBQ no tratado con el grupo TBQ tratado, la turbidez es mas alta y la dispersion de las partfculas fue mejorada.
Tabla 4
- TBQ no tratado tratado con 0,005% TBQ Tratado hipoclorito sodico tratado con 0,05% tratado con 0,5%
- Turbidez
- 0,035 0,314 0,385 0,510
Ejemplo 3: Permeabilidad a traves de filtro de ultrafiltracion del TBQ no tratado y TBQ oxidado/reducido
El TBQ no tratado y el TBQ tratado fueron diluidos a 1 mg/ml o menos con cloruro sodico (NaCl) 0,1M o 1M. Esta 5 solucion fue ultrafiltrada a traves de un filtro de ultrafiltracion con un corte de peso molecular de 300.000 (suministrado por Millipore), la absorbancia (OD268) del filtrado fue medida, y la permeabilidad fue calculada. El resultado se muestra en la tabla 5. Comparado con el TBQ no tratado, la permeabilidad en el filtro del TBQ tratado fue incrementada. Para el TBQ tratado con hipoclorito sodico al 0,005% cuya permeabilidad fue baja en una solucion de NaCl 0,1M, cuando se disolvio en una solucion de NaCl 1M, su permeabilidad del filtro fue mejorada.
10 Tabla 5
- TBQ no tratado TBQ tratado con hipoclorito sodico
- tratado con 0,005% tratado con 0,05% tratado con 0,5%
- Permeabilidad en el
- solucion NaCl 0,1M 3% 31% 94% 95%
- filtro
- solucion NaCl 1M 7% 96%
Ejemplo 4: Efecto del TBQ no tratado y del TBQ oxidado/reducido en el inmunoensayo de quimioluminiscencia (1)
A 2 ml de TBQ 35,2 mg/ml, se anadieron 2 ml de una solucion de sulfito sodico 2M, mezclo y despues se trato a 60 °C durante 4 horas. Despues, esta fue distribuida en una membrana de dialisis (corte de pesos moleculares entre 15 12.000 y 14.000, suministrada por Sanko Junyaku Co., Ltd.), y la dialisis fue realizada utilizando agua MilliQ como
una solucion externa para hacer el TBQ tratado. Despues, se preparo una solucion de AMPPD 0,02 mg/ml (DEA 0,1M, MgCh 1mM, NaN3 al 0,05%, pH 10,0) que contiene 0,8 mg/ml de TBQ no tratado o TBQ tratado (solucion sustrato). Muestras de ensayo conteniendo 0, 10, 100, 800 y 2000 ng/ml de a-fetoproteina (AFP) fueron diluidas hasta 20 veces con una solucion de BSA. Cada muestra medida (20 jl) fue anadida al reactor en el que se pusieron 20 50 jl de anti-AFP al 0,03% anticuerpo-unida a partfculas magneticas se mezclaron y se dejaron reaccionar a 37 °C
durante 8 min.
Despues, las partfculas fueron atrafdas por un iman poniendo el iman cerca del reactor para eliminar el sobrenadante y los lavados. Luego, se anadieron 50 jl de una solucion 0,1 jg/ml de ALP conjugado con anticuerpo anti-AFP, se mezclo y se dejo reaccionar a 37 °C durante 8 min. Despues de la reaccion, las partfculas fueron 25 atrafdas por un iman poniendo el iman cerca del reactor, el sobrenadante fue eliminado y lavado. La solucion de sustrato anterior (200 jl) se anadio a estas partfculas, se mezclo y se dejo reaccionar a 37 °C durante 4 min. Despues, la emision de la luz (senal) fue contada por un contador de fotones (suministrado por Hamamatsu Photonics K. K.), y se calculo un valor integrado para dos segundo. El resultado se muestra en la tabla 6. Comparando los casos de TBQ no tratado, la repetibilidad (valor CV) usando TBQ tratado con sulfito sodico fue 30 mejorada.
[Tabla 6]
Tabla 6
TBQ no tratado
Concentracion AFP (ng/ml)
- 0 10 100 800 2000
- Cuentas
- 737 22.413 190.157 1.204.985 2.201.469
- 689 25.275 205.970 874.704 1.396.455
- 822 30.756 199.645 932.275 2.335.765
- 824 30.605 205.809 816.211 2.214.843
- 859 33.443 189.985 946.657 1.430.978
- 853 22.297 196.053 1.064.297 1.374.801
- Promedio
- 797 27.465 197.937 973.188 1.825.719
- CV
- 8,6% 17,3% 3,6% 14,4% 25,6%
- TBQ tratado con sulfito sodico
- Concentracion AFP (ng/ml)
- 0 10 100 800 2000
- Cuentas
- 354 17.298 165.651 1.230.392 2.391.362
- 380 17.595 166.482 1.236.687 2.514.891
- 370 17.634 167.006 1.245.664 2.397.218
- 385 17.515 167.636 1.192.276 2.515.427
- 381 17.557 166.714 1.191.075 2.442.702
- 371 16.806 164.900 1.216.407 2.540.877
- Promedio
- 374 17.401 166.398 1.218.750 2.467.080
- CV
- 3,0% 1,8% 0,6% 1,9% 2,6%
Ejemplo 5: Efecto del TBQ no tratado y del TBQ oxidado/reducido en el inmunoensayo de quimioluminiscencia (2)
A 300 ml de una solucion de TBQ 35,2 mg/ml, se anadio 15 ml de una solucion de sulfito-HCl sodico 1M (pH 6,0), se mezclo y se dejo reaccionar a 25 °C durante 24 horas. Despues, esta fue distribuida en una membrana de dialisis 5 (corte de pesos moleculares entre 12.000 y 14.000, suministrada por Sanko Junyaku Co., Ltd.), y la dialisis fue realizada usando agua MilliQ como solucion externa para hacer el TBQ tratado. Despues, se preparo una solucion de AMPPD 0,2 mg/ml (DEA 0,1M, MgCh 1mM, 0,05% NaN3, pH 10,0) que contiene 0,8 mg/ml de TBQ no tratado o TBQ tratado (solucion sustrato). Como en el ejemplo 4 anterior, usando a-fetoproteina como una muestra de ensayo, se realizo un inmunoensayo, y la quimioluminiscencia (senal) se conto para realizar una medicion. El 10 resultado se muestra en la tabla 7. Comparado los casos de TBQ no tratado, la repetibilidad (valor CV) usando TBQ tratada con sulfito sodico fue mejorada.
Tabla 7
- TBQ no tratado
- Concentracion AFP (ng/ml)
- 0 10 100 800 2000
- Cuentas
- 549 37.542 188.792 1.064.676 1.714.369
- 560 38.510 219.614 908.606 1.985371
- 609 41.285 212.975 958.981 1.866.508
- 551 38.169 207.767 1.051.242 1.464.529
- 505 41.844 232.717 983.756 1.498.278
- 472 27.779 211.984 1.054.501 1.684.947
- Promedio
- 541 37.522 212.308 1.003.627 1.702.334
- CV
- 8,8% 13,5% 6,8% 6,3% 11,9%
- TBQ tratado con sulfito sodico
- Concentracion AFP (ng/ml)
- 0 10 100 800 2000
- Cuentas
- 374 27.079 234.281 1.140.508 2.163.595
- 380 25.361 233.081 1.160.725 1.925.163
- 362 27.141 220.616 1.153.611 2.031.717
- 363 25.705 228.368 1.117.495 2.060.136
- 426 27.389 221.167 1.104.866 1.978.776
- 399 24.851 227.564 1.130.180 2.036.848
- Promedio
- 384 26.254 227.513 1.134.564 2.032.706
- CV
- 6,4% 4,1% 2,5% 1,9% 4,0%
Ejemplo 6: Efecto del BDMQ no tratado y el BDMQ oxidado/reducido en el inmunoensayo de quimioluminiscencia
5
10
15
20
25
30
35
A 10 ml de una solucion de BDMQ (25,4 mg/ml), se anadio 0,5 ml de una solucion de sulfito sodico-HCl 1M (pH 6,0) se mezclo y se dejo reaccionar a 25 °C durante 24 horas. Despues, esta fue distribuida en una membrana de dialisis (corte de pesos moleculares entre 12.000 y 14.000, suministrada por Sanko Junyaku Co., Ltd.), y se realizo la dialisis usando agua MilliQ como una solucion externa para hacer un BDMQ tratado.
Despues, se preparo una solucion de AMPPD 0,2 mg/ml [dietanolamina (DEA) 0,1M, cloruro magnesico (MgCl2) 1mM, 0,05% de azida sodica (NaN3), pH 10,0] conteniendo 0,4 mg/ml de BDMQ no tratado o BDMQ tratado (solucion sustrato).
Muestras de ensayo conteniendo 0, 10, 100, 800 y 2000 ng/ml de a-fetoproteina (AFP) fueron diluidos hasta 10 veces con una solucion de BSA. Cada ensayo medido (20 jl) fue suministrado al reactor en el cual 250 jl de 0,015% anticuerpos anti-AFP-unido a partfculas magneticas, fueron colocados, mezclados y reaccionaron a 37 °C durante 10 min. Despues, las partfculas fueron atrafdas por un iman colocando el iman cerca del reactor para eliminar el sobrenadante y lavar. Despues, se anadieron 250 jl de 0,1 jg/ml de ALP conjugado con anticuerpo anti-AFP se mezclo y se dejo reaccionar a 37 °C durante 10 min. Despues de la reaccion, las partfculas fueron atrafdas por un iman colocando el iman cerca del reactor, el sobrenadante fue eliminado y lavado. La solucion de sustrato anterior (200 jl) se anadio a estas partfculas, se mezclo y se dejo reaccionar a 37 °C durante 5 min. Despues, la quimioluminiscencia (senal) fue contada con un contador de fotones (suministrado por Hamamatsu Photonics K. K.), y se calculo un valor integrado para dos segundos. El resultado se muestra en la tabla 8. Comparado los casos de BDMQ no tratado, la repetibilidad (valor CV) usando BDMQ tratado con sulfito sodico fue mejorada.
Tabla 8
- BDMQ no tratado
- Concentracion AFP (ng/ml)
- 0 10 100 800 2000
- Cuentas
- 235 29.915 200.489 860.407 1.600.060
- 242 30.126 203.080 904.037 1.735.060
- 222 29.949 198.255 891.405 1.759.976
- 242 29.466 208.122 935.003 1.512.594
- Promedio
- 235 29.864 202.487 897.713 1.651.923
- CV
- 4,00% 0,90% 2,10% 3,40% 7,10%
- BDMQ tratado con sulfito sodico
- Concentracion AFP (ng/ml)
- 0 10 100 800 2000
- Cuentas
- 201 24.969 198.765 1.212.549 2.354.980
- 212 25.586 195.978 1.210.283 2.371.754
- 207 25.043 196.434 1.213.840 2.339.963
- 184 25.086 195.111 1.219.413 2.371.016
- Promedio
- 201 29.864 202.487 897.713 1.651.923
- CV
- 6,10% 0,90% 0,80% 0,40% 0,90%
Ejemplo 7: Efecto del BDMQ no tratado y BDMQ oxidado/reducido sobre la dispersion de partfculas
A 10 ml de un solucion de BDQM (25,4 mg/ml) se anadio 0,5 ml de una solucion de sulfito sodico-HCl, se mezclo y se dejo reaccionar a 25 °C durante 24 horas. Despues, esta fue distribuida en una membrana de dialisis (corte de pesos moleculares entre 12.000 y 14.000, suministrada por Sanko Junyaku Co., Ltd.), y la dialisis fue realizada usando agua MilliQ como una solucion externa para hacer el BDMQ tratado.
Despues, se preparo DEA 0,1M (pH 10,0) conteniendo 0,4 mg/ml de BDMQ no tratado o BDMQ tratado. Entonces 100 jl de partfculas magneticas 0,03% se suministraron a un reactor, y las partfculas fueron atrafdas por un iman poniendo el iman cerca de las partfculas, y el sobrenadante fue eliminado. La solucion DEA (200 jl) que incluye el BDMQ anterior se anadio y se agito durante 30 segundos. Quince segundos despues de la agitacion, se cogieron 150 jl de la superficie de la solucion con una Pipetman (suministrada por Gilson, una micropipeta), se distribuyo en la celula para el espectrofotometro, y despues de 10 segundos, una turbidez (OD500) se midio con el espectrofotometro ( UV-1.200), suministrado por Shimadzu Corporation). Este resultado se muestra en la tabla 9. Comparando con BDMQ no tratado en el grupo BDMQ tratado, la turbidez es mas alta y la dispersion de las partfculas fue mejorada.
Tabla 9
- BDMQ no tratado BDMQ tratado
- Turbidez
- 0,045 0,339
Efectos de la Invencion
Como se indica anteriormente, por tratamiento con un agente oxidante o un agente reductor, se ha proporcionado un 5 potenciador de quimioluminiscencia que es utilizado para la deteccion de la senal en el inmunoensayo en fase solida, utilizando el antigeno o/y el anticuerpo inmovilizado en el portador solido fino dispersable en el medio lfquido, mejorando la dispersibilidad de los portadores solidos finos comparados con los potenciadores de quimioluminiscencia convencionales, y es excelente en la mejora de la quimioluminiscencia por reaccion enzimatica del sustrato quimioluminiscente que contiene dioxetano. Asimismo, se ha descrito el metodo de quimioluminiscencia 10 y el kit utilizado por el potenciador de quimioluminiscencia. Cuando se usa el potenciador de quimioluminiscencia del inmunoensayo reivindicado, la reproducibilidad entre las series de los valores medidos es mejorada y se hace posible una cuantificacion mas precisa.
Claims (6)
- 5101520253035REIVINDICACIONES1. Un inmunoensayo en fase solida que utiliza un antfgeno o/y anticuerpo inmovilizado sobre portadores solidos finos dispersables en un medio lfquido, que comprendeun metodo de quimioluminiscencia utilizado para la detection de la senal que comprende hacer reaccionar un sustrato quimioluminiscente que tiene dioxetano con fosfatasa acida, fosfatasa alcalina, glucosidasa, glucouronidasa o esterasa como enzima de un cuerpo marcado en presencia de un potenciador de quimioluminiscencia,donde el potenciador de quimioluminiscencia es uno que se ha obtenido por tratamiento de un polfmero soluble en agua representado por la siguiente formula general (I).
imagen1 donde,cada R5, R6 y R7 es un grupo alquilo no sustituido lineal o ramificado que tiene de 1 a 20 atomos de carbono; un grupo alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 20 atomos de carbono sustituido con uno o mas de un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi, un grupo ariloxi, un grupo amino, un grupo amino sustituido, un grupo amido o un grupo ureido; un grupo fluoroalcano; un grupo fluoroarilo; un grupo monocicloalquilo no sustituido que tiene de 3 a 12 atomos de carbono en el anillo; un grupo monocicloalquilo sustituido que tiene de 3 a 12 atomos de carbono en el anillo sustituido con uno o mas de un grupo alquilo, alcoxi o grupo benzo condensado; un grupo policicloalquilo que tiene dos o mas anillos condensados y cada uno tiene de 5 a 12 atomos de carbono, que estan no sustituidos o sustituidos con uno o mas de un grupo alquilo, un grupo alcoxi o un grupo arilo; un grupo arilo, un grupo alcarilo o un grupo aralquilo teniendo al menos un anillo y en total de 6 a 20 atomos de carbono, que esta no sustituido o sustituido con uno o mas de un grupo alquilo, un grupo arilo, fluor o un grupo hidroxilo, o al menos dos de R5, R6 y R7 son grupos capaces de formar junto con el atomo cuaternario al que estan unidos un anillo saturado o insaturado, no sustituido o sustituido que tiene de 3 a 5 atomos de carbono y 1 a 3 heteroatomos y que contiene nitrogeno, fosforo o azufre, al que puede estar condensado un anillo de benceno.Y solo o en combination representa un contraion seleccionado de un grupo que consiste en un ion halogeno, un ion sulfato, un ion alquil sulfonato, un ion aril sulfonato, un ion aril sulfonato sustituido, un ion difenilantraceno sulfonato, un ion perclorato, un ion alcanoato, un ion aril carboxilato, un ion benceno aril heterociclico carboxilato y dianiones organicos,n representa un numero dentro del intervalo entre 500 y 500.000 (promedio de pesos moleculares), que es medido utilizando un metodo de viscosidad intnnseca o un metodo LALLS,M es nitrogeno o fosforo,o el copolfmero soluble en agua de formula (II):imagen2 donde Y, M’, R5’, R6’ y R7’ son los mismos Y, M, R5, R6 y R7 definidos anteriormente e y y z representan una fraction molar de un monomero individual que constituye el copolfmero1015202530con un agente oxidante o un agente reductor, inhibiendo de este modo la conglomeracion de los portadores solidos finos,donde el agente oxidante y el agente reductor es seleccionado de un grupo que consiste en persulfato amonico, sulfito sodico, hipoclorito sodico, peroxido de hidrogeno, metaperyodato sodico, permanganato potasico y dicromato potasico. - 2. El inmunoensayo en fase solida de acuerdo con la reivindicacion 1, donde los transportadores solidos finos son partfculas.
- 3. El inmunoensayo en fase solida de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, donde los transportadores solidos finos son partfculas magneticas.
- 4. El inmunoensayo en fase solida de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3, donde el potenciador de quimioluminiscencia no comprende un componente con un peso molecular mayor de 400.000 Daltons medido por un metodo de ultrafiltracion.
- 5. El inmunoensayo en fase solida de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, donde el sustrato de quimioluminiscencia que tiene dioxetano es un sustrato representado por la formula general:
imagen3 donde R2 es un grupo arilo sustituido con un grupo X-oxi, que forma el compuesto 1,2-dioxetano que es un oxido intermedio inestable donde X es eliminado por un activador seleccionado de un acido, base, enzima, catalizador organico o inorganico y donador de electrones para inducir una reaccion, en la que el compuesto 1,2-dioxetano inestable es descompuesto con liberacion de la energia electronica para producir luz y dos compuestos que contienen un grupo carbonilo de formula general:imagen4 imagen5 Y X es un grupo quimico facilmente reactivo que es eliminado por un enzima; R1 es uno seleccionado del grupo que consiste en un grupo alquilo, un grupo alcoxi, un grupo ariloxi, un grupo dialquil amino, un grupo trialquil sililoxi, un grupo aril sililoxi, un grupo arilo y un grupo arilo que esta unido a un grupo arilo R2 para formar un grupo arilo polidclico con la sustitucion de un grupo X-oxi, que esta espiro unido a un anillo de 1,2-dioxetano; R3 y R4 son cada uno un grupo alquilo o un grupo heteroalquilo, o R3 y R4 pueden estar juntos unidos para formar un grupo alquileno polidclico espirounido al anillo de 1,2-dioxetano. - 6. El inmunoensayo en fase solida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde los polimeros de formula (1) son seleccionados de un grupo que consiste en cloruro de poli[vinilbencil(bencildimetil amonio)], cloruro de poli(vinilbenciltrimetil amonio), cloruro de poli[vinilbencil(tributil amonio)], cloruro de bencilmetilcetil amonio, cloruro de polimetilacrilamidapropilenmetil amonio, cloruro de poli[vinilbencil(trietil amonio)], cloruro de poli[vinilbencil(2-bencilamino)etildimetil amonio], cloruro de poli[vinilbencildimetil(2-hidroxi)etil amonio], cloruro de poli[vinilbencil(trimetil fosfonio)], cloruro de poli[vinilbencil(tributil fosfonio)] y cloruro de poli[vinilbencil(trioctil fosfonio)] y copolimeros de estos.
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