ES2576126T3 - Modificación por tecnología genética y optimización de sistemas, métodos y composiciones enzimáticas mejorados para la manipulación de secuencias - Google Patents

Modificación por tecnología genética y optimización de sistemas, métodos y composiciones enzimáticas mejorados para la manipulación de secuencias Download PDF

Info

Publication number
ES2576126T3
ES2576126T3 ES13814364.9T ES13814364T ES2576126T3 ES 2576126 T3 ES2576126 T3 ES 2576126T3 ES 13814364 T ES13814364 T ES 13814364T ES 2576126 T3 ES2576126 T3 ES 2576126T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
sequence
crispr
cas9
enzyme
rna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES13814364.9T
Other languages
English (en)
Inventor
Feng Zhang
Fei RAN
Ophir SHALEM
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Massachusetts Institute of Technology
Broad Institute Inc
Harvard University
Original Assignee
Massachusetts Institute of Technology
Broad Institute Inc
Harvard University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49883291&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2576126(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Massachusetts Institute of Technology, Broad Institute Inc, Harvard University filed Critical Massachusetts Institute of Technology
Application granted granted Critical
Publication of ES2576126T3 publication Critical patent/ES2576126T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1082—Preparation or screening gene libraries by chromosomal integration of polynucleotide sequences, HR-, site-specific-recombination, transposons, viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/10—Vectors comprising a non-peptidic targeting moiety
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Abstract

Una composición que comprende: componentes del complejo de CRISPR, que comprenden: I. una o más secuencias de polinucleótidos del sistema de CRISPR-Cas, que comprende(n): (a) una secuencia guía modificada por ingeniería genética constituida por ARN y capaz de hibridarse a una secuencia diana en un locus del polinucleótido, (b) una secuencia de emparejamiento tracr constituida por ARN, y (c) una secuencia de tracRNA constituida por ARN, y en donde (a), (b) y (c) están dispuestas en una orientación 5' a 3', II. una proteína Cas9 de Tipo II, en donde la secuencia de emparejamiento tracr se hibrida a la secuencia tracRNA y la secuencia guía dirige la unión específica para la secuencia de un complejo de CRISPR a una secuencia diana, en donde el complejo de CRISPR comprende la proteína Cas9 de Tipo II formando complejo con (1) la secuencia guía que se hibrida a la secuencia diana, y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida la secuencia de tracrRNA, y en donde la proteína Cas9 de Tipo II es o comprende una Cas9 de Staphylococcus aureus (SaCas9).

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
(ii) una primera secuencia de emparejamiento tracr, y
(iii) una primera secuencia de tracr, y
II. un segundo elemento regulador enlazado operativamente a una segunda secuencia de polinucelótidos de ARN quimérico (chiRNA) de un sistema de CRISPR-Cas, en donde la segunda secuencia de polinucleótidos comprende
(i)
una segunda secuencia guía capaz de hibridarse con una segunda secuencia diana en un segundo locus genómico en la célula del organismo,
(ii)
una segunda secuencia de emparejamiento tracr, y
(iii) una segunda secuencia de tracr, y
III. un tercer elemento regulador enlazado operativamente a una secuencia codificadora de enzima que codifica una primera enzima de CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de localización nuclear y está enlazada operativamente a un primer dominio funcional,
IV. un cuarto elemento regulador enlazado operativamente a una secuencia codificadora de enzima que codifica una segunda enzima de CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de localización nuclear y está enlazada operativamente a un segundo dominio funcional, en donde (i), (ii) y (iii) en I y II están dispuestos en una orientación 5' a 3', en donde los componentes I, II, III y IV se encuentran en los mismos o en diferentes vectores del sistema, en donde, cuando se transcriben, cada una de las secuencias de emparejamiento tracr se hibrida con su secuencia tracr correspondiente y la primera y segunda secuencias guía dirigen la unión específica para la secuencia del primer y segundo complejos de CRISPR a la primera y segunda secuencia diana, en donde el complejo de CRISPR comprende la enzima de CRISPR formando complejo con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana, y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida con la secuencia de tracr, y en donde la expresión de la enzima de CRISPR proporciona la manipulación de la secuencia diana, en donde la primera y segunda enzimas de CRISPR comprenden cada una dos o más mutaciones, en donde la primera y segunda enzima de CRISPR es un ortólogo Cas9 de un género que pertenece al grupo que consiste en
Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor , Mycoplasma y Campylobacter, y en donde el primer locus genómico es modulado por la actividad del primer dominio funcional y el segundo locus genómico es modulado por la actividad del segundo dominio funcional. En una realización adicional, el primer dominio funcional se selecciona del grupo que consiste en un activador transcripcional, represor transcripcional, una recombinasa, una transposasa, una remodelador de histona, una ADN metiltransferasa, un criptocromo y un dominio inducible/contro!able por la luz o un dominio inducible/contro!able químicamente. En una realización adicional, el segundo dominio funcional se selecciona del grupo que consiste en un activador transcripcional, represor transcripcional, una recombinasa, una transposasa, un remodelador de histona, una ADN metiltransferasa, un criptocromo y un dominio inducible/contro!able por la luz o un dominio inducible/contro!able químicamente. En realizaciones preferidas, la primera o segunda enzima de CRISPR es una Cas9 de Sutterella wadsworthensis, una Cas9 de Filifactor alocis, una Cas9 de Lactobacillus johnsonii, una Cas9 de Campylobacter lari, una Cas9 de Corynebacter diptheriae, una Cas9 de Parvibaculum lavamentivorans, una Cas9 de Mycoplasma gailisepticum, una Cas9 de Staphylococcus aureus subsubespecie Aureus Cas9, una Cas9 de Legionella pneumophila Paris, una Cas9 de Treponema denticola, una Cas9 de Staphylococcus pseudintermedius, una Cas9 de Neisseria cinerea.
En algunas realizaciones, la enzima de CRISPR es una enzima de CRISPR de tipo I, II o III, preferentemente una enzima CRISPR de tipo II. Esta enzima de CRISPR de tipo II puede ser cualquier enzima Cas. Una enzima Cas puede ser identificada como Cas9, ya que esto puede referirse a la clase general de enzimas que comparten homología con el mayor nucleasa con múltiples dominios nucleasa del sistema de CRISPR tipo II. Lo más preferiblemente, la enzima Cas9 es, o se deriva de SpCas9 o Staphylococcus aureus subsubespecie Aureus SaCas9. Por se deriva se entiende que la enzima derivada se basa en gran medida, en el sentido de tener un alto grado de homología de secuencia con, una enzima de tipo salvaje, pero que ha sido mutada (modificada) de alguna manera tal como se describe en esta memoria.
Se apreciará que las expresiones enzima Cas y CRISPR se utilizan en general en esta memoria de forma indistinta, a menos que de otro modo resulte evidente. Tal como se mencionó anteriormente, muchas de las numeraciones de residuos utilizadas en esta memoria se refieren a la enzima Cas9 del locus CRISPR de tipo II en Streptotoccus pyogenes. Sin embargo, se apreciará que esta invención incluye muchas más Cas9s de otras especies de microbios tales como los pertenecientes al género Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Mycoplasma o Campylobacter, tal como SpCas9, SaCas9, St1Cas9, St3Cas9 y así sucesivamente, en donde St es Streptococcus thermophilus.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Un ejemplo de una secuencia optimizada en codones, en este caso optimizada para seres humanos (es decir, optimizada para la expresión en seres humanos) se proporciona en esta memoria, ver la secuencia optimizada en codones humana SaCas9. Si bien esto se prefiere, se apreciará que son posibles otros ejemplos y se conoce la optimización de codones para una especie huésped.
Aspectos adicionales de la invención se refieren a la especificidad de escisión mejorada, la secuencia tracr optimizada, el ARN guía quimérico optimizado, la estructura co-plegada de tracrRNA y la secuencia de emparejamiento tracr, la estabilización de estructuras secundarias de tracRNA, tracrRNA con una región acortada de apareamiento de bases, tracrRNA con elementos de ARN fusionados, la clonación y el suministro simplificados, sistemas de toxicidad reducida y/o inducibles. Otro aspecto de la invención se refiere a la estabilización de ARN quimérico, y/o secuencia guía y/o una parte del mismo de complejos de CRISPR, en donde la enzima de CRISPR es un ortólogo de CRISPR, en donde el ARN quimérico y/o la secuencia guía y/o una parte del mismo se estabiliza mediante nucleótidos sintéticos o modificados químicamente (p. ej., LNA/BNA; modificación de tiol, modificación de reticulación 2’/3’-OH), se modifica para ser resistentes a la degradación/hidrólisis y al que se han añadido elementos de estabilidad estructural.
La invención comprende, además, en determinadas realizaciones un método de modificar un organismo o un organismo no humano mediante la manipulación de una secuencia diana en un locus genómico de interés, que comprende suministrar una composición que se produce de forma no natural o que se produce mediante ingeniería genética que comprende un sistema de vectores que comprende uno o más vectores que codifican operativamente una composición comentada en esta memoria para la expresión de los mismos. Preferiblemente, el vector es un vector viral, tal como vectores virales lenti-o baculo-o preferiblemente adeno-asociados, pero se conocen y se proporcionan otros medios de suministro (tales como sistemas de levadura, microvesículas, pistolas de genes/medios de fijación de vectores a nanopartículas de oro).
En esta memoria se describe diversos medios de suministro y se comentan en esta sección.
Suministro Viral: La enzima de CRISPR, por ejemplo una Cas9, y/o cualquiera de los presentes ARN, por ejemplo, un ARN guía, puede ser suministrada utilizando virus adeno-asociado (AAV), lentivirus, adenovirus u otros tipos de vectores virales, o combinaciones de los mismos. Cas9 y uno o más ARN guía pueden ser empaquetados en uno o más vectores virales. En algunas realizaciones, el vector viral es suministrado al tejido de interés, por ejemplo, mediante inyección intramuscular, mientras que otras veces el suministro viral es a través de la vía intravenosa, transdérmica, intranasal, oral, mucosal, u otros métodos de suministro. Una administración de este tipo puede ser o bien a través de una sola dosis o de múltiples dosis. Un experto en la técnica entiende que la dosis real a suministrar en esta memoria pueden variar en gran medida dependiendo de una diversidad de factores tales como el vector elegido, la célula, organismo o tejido diana, el estado general del sujeto a tratar, el grado de transformación/modificación buscado, la vía de administración, el modo de administración, el tipo de de transformación/modificación buscado, etc.
Una dosificación de este tipo puede contener, además, por ejemplo, un soporte (agua, solución salina, etanol, glicerol, lactosa, sacarosa, fosfato de calcio, gelatina, dextrano, agar, pectina, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, etc.), un diluyente, un soporte farmacéuticamente aceptable (p. ej., solución salina tamponada con fosfato), un excipiente farmacéuticamente aceptable, un adyuvante para potenciar la antigenicidad, un compuesto o molécula inmunoestimulador y/u otros compuestos conocidos en la técnica. El adyuvante en esta memoria puede contener una suspensión de minerales (alumbre, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio) sobre los que se adsorbe el antígeno, o una emulsión de agua-en-aceite en la que la disolución de antígeno se emulsiona en aceite (MF-59, adyuvante incompleto de Freund), a veces con la inclusión de micobacterias muertas (adyuvante completo de Freund) para mejorar adicionalmente la antigenicidad (inhibe la degradación del antígeno y/o provoca la afluencia de macrófagos). Los adyuvantes también incluyen moléculas inmunoestimulantes tales como citoquinas, moléculas coestimulantes y, por ejemplo, moléculas de ADN o de ARN inmunoestimulantes tales como oligonucleótidos CpG. Una formulación de dosificación de este tipo es fácilmente determinable por un experto en la técnica. La dosificación puede contener, además, una o más sales farmacéuticamente aceptables tales como, por ejemplo, una sal de ácido mineral tal como un hidrocloruro, un hidrobromuro, un fosfato, un sulfato, etc.; y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos, etc. Adicionalmente, también pueden estar presentes sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponadoras del pH, geles o materiales gelificantes, aromas, colorantes, microesferas, polímeros, agentes de suspensión, etc. Además, también pueden estar presentes uno o más de otros ingredientes farmacéuticos convencionales tales como conservantes, humectantes, agentes de suspensión, tensioactivos, antioxidantes, agentes antiapelmazantes, cargas, agentes quelantes, agentes de revestimiento, estabilizadores químicos, etc., especialmente si la forma de dosificación es una forma reconstituible. Ingredientes a modo de ejemplo adecuados incluyen celulosa microcristalina,
imagen6
5
10
15
20
25
30
35
40
45
la transcripción in vitro. Por ejemplo, ARNm de Cas9 se puede sintetizar utilizando una casete de PCR que contiene los siguientes elementos: secuencia T7_promotor-kozak (GCCACC)-Cas9-3' UTR de la cola beta globina-poliA (una cadena de 120 o más adeninas). La casete se puede utilizar para la transcripción por la T7polimerasa. ARNs guía también se pueden transcribir utilizando la transcripción in vitro a partir de una casete que contiene la secuencia T7_promotor-GG-ARN guía.
Para potenciar la expresión y reducir la toxicidad, la enzima CRISPR y/o el ARN guía se pueden modificar utilizando pseudo-U o 5-Metil-C.
ARNm de la enzima de CRISPR y ARN guía se pueden administrar simultáneamente utilizando nanopartículas o envueltas lipídicas.
Por ejemplo, Su X, Fricke I, Kavanagh DG, Irvine DJ ( "In vitro and in vivo mRNA delivey using lipid-enveloped pHresponsive polymer nanoparticles” Mol Pharm 6 de junio de 2011; 8(3):774-87 doi:10.1021/mp100390w Epub 1 de abril de 2011) describe nanopartículas de núcleo y envoltura estructuradas biodegradables con un núcleo poli (βamino éster) (PBAE) envuelto por una envoltura bicapa de fosfolípidos. Estos fueron desarrollados para el suministro in vivo de ARNm. El componente PBAE sensible al pH fue escogido para fomentar la interrupción del endosoma, mientras que la capa de la superficie de lípidos se seleccionó para minimizar la toxicidad del núcleo de policationes. Por lo tanto, éstos se prefieren para el suministro de ARN de la presente invención.
Además de ello, Michael S.D. Kormann et al. ("Expression of therapeutic proteins after delivey of chemically modified mRNA in mice: Nature Biotechnology, Volumen: 29, páginas: 154-157 (2011) publicado en línea el 9 de enero de 2011) describen el uso de envolturas de lípidos para suministrar ARN. El uso de envolturas de lípidos también se prefiere en la presente invención.
Métodos de suministro de ARNm son especialmente prometedores para suministrar actualmente al hígado.
ARNm de la enzima de CRISPR ARNguía también podrían ser suministrados por separado. ARNm de la enzima de CRISPR puede ser suministrado antes del ARN guía para dar tiempo a que la enzima de CRISPR se exprese. ARNm de la enzima de CRISPR puede ser administrada 1-12 horas (preferiblemente alrededor de 2-6 horas) antes de la administración de ARNguía.
Alternativamente, ARNm de la enzima de CRISPR y ARN guía se pueden administrar juntos. Ventajosamente, una segunda dosis de refuerzo de ARN guía se puede administrar 1 -12 horas (preferiblemente alrededor de 2-6 horas) después de la administración inicial de ARNm de la enzima de CRISPR + ARNguía.
Administraciones adicionales de ARNm de la enzima de CRISPR y/o ARN guía podrían ser útiles para alcanzar los niveles más eficientes de modificación del genoma.
Para la minimización de la toxicidad y los efectos fuera de objetivo, será importante controlar la concentración de ARNm de la enzima de CRISPR y el ARN guía suministrado. Concentraciones óptimas del ARNm de la enzima de CRISPR y ARN guía se pueden determinar mediante el ensayo de diferentes concentraciones en un modelo celular
o animal y se puede utilizar la secuenciación profunda para analizar el grado de modificación en potenciales loci genómicos fuera de objetivo. Por ejemplo, para la secuencia guía que fija como objetivo 5'-GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA-3' en el gen EMX1 del genoma humano, la secuenciación profunda se puede utilizar para evaluar el nivel de modificación en los dos loci siguientes fuera de objetivo, 1: 5'-GAGTCCTAGCAGGAGAAGAA-3' y 2: 5'-GAGTCTAAGCAGAAGAAGAA-3'. La concentración que da el mayor nivel de modificación en objetivo al tiempo que minimiza el nivel de modificación fuera de objetivo debe ser elegido para el suministro in vivo.
Alternativamente, para minimizar el nivel de toxicidad y los efectos fuera de objetivo, la enzima de CRISPR nickase ARNm (por ejemplo Cas9 de S pyogenes con la mutación D10A) puede ser suministrada con un par de ARNs guía que fijan como objetivo un sitio de interés. Los dos ARN guías tienen que estar separados de la siguiente manera. Secuencias guía en rojo (subrayado sencillo) y azul (subrayado doble), respectivamente (estos ejemplos se basan en el requisito del PAM para Cas9 de Streptococcus pyogenes).
Longitud del colgante (pb)
Diseño de ARN guía (secuencia guía y PAM codificados en color)
imagen7
imagen8
imagen9
5' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCNGNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNNN-3'
14
3' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNNNNNNNNCCNNNNNNNNNN-5'
imagen10
imagen11
imagen12
5' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNNN-3'
13
3' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNNNNNNNNCCNNNNNNNNNN-5'
imagen13
imagen14
imagen15
5' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNNN-3'
12
3' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNNNNNNNNCCNNNNNNNNNNNN-5'
imagen16
imagen17
imagen18
5' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCNNNNNNNNNNNNNnNNGCNNNNNNNNNNNN-3'
11
3' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNNNNNNNNNCCNNNNNNNNNNNN-5'
imagen19
imagen20
imagen21
5' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNNNNN-3
10
3' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNNNNNNNNNCCNNNNNNNNNNNN-5'
imagen22
imagen23
imagen24
5' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNNNNN-3'
9
3' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNNNNNNNNNCCNNNNNNNNNNNN-5'
imagen25
imagen26
imagen27
5' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNNNNN-3'
8
3' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCNNNNNNNNNNNNN-5'
Longitud del colgante (pb)
Diseño de ARN guía (secuencia guía y PAM codificados en color)
imagen28
imagen29
imagen30
5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNNNNNN3'
7
3' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNNCCNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5'
imagen31
imagen32
imagen33
5' NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCNNNNNNNNNGGNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
6
3' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5'
imagen34
imagen35
imagen36
5' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
5
3' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5'
imagen37
imagen38
imagen39
5' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
4
3' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNNNCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5'
imagen40
imagen41
imagen42
5' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNCCNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
3
3' -NNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNNNNNNCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5'
imagen43
imagen44
imagen45
5' -NNNNNNNNNNNNNNNCCNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
2
3' -NNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNNNNNNNCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5'
imagen46
imagen47
imagen48
5' -NNNNNNNNNNNNNNCCNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
1
3' -NNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNNNNNNNCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5'
Longitud del colgante (pb)
Diseño de ARN guía (secuencia guía y PAM codificados en color)
imagen49
imagen50
imagen51
5' -NNNNNNNNNNNNNNCCNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
romo
imagen52
imagen53
imagen54
imagen55
5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCNNNNNGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
1
3' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5'
imagen56
imagen57
imagen58
5' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCNNNNNNGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
2
3' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5'
imagen59
imagen60
imagen61
5' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNCCNNNNNNNGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
3
3' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5'
imagen62
imagen63
imagen64
5' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCNNNNNNNNGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
4
3' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5'
imagen65
imagen66
imagen67
5' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCNNGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
5
3' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5'
imagen68
imagen69
imagen70
5' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCNNGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
6
3' -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5'
Longitud del colgante (pb)
Diseño de ARN guía (secuencia guía y PAM codificados en color)
imagen71
imagen72
imagen73
5' -NNNNNNNNNNNCCNGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
7
3' -NNNNNNNNNNNNGGNCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5'
imagen74
imagen75
imagen76
5' -NNNNNNNNNNNCCGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
8
3' -NNNNNNNNNNNNNNNGGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5'
imagen77
5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
12
3'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5'
imagen78
imagen79
imagen80
5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
13
3'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCNGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5'
imagen81
imagen82
imagen83
5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
14
3'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCNNGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5'
imagen84
imagen85
imagen86
5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
15
3'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCNNNGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5'
imagen87
imagen88
imagen89
5'-NNNNNNNNNNNNNCGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
16
3'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCNNNNGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5'
imagen90
imagen91
imagen92
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Zhang Y, Schlachetzki F, Pardridge WM. ("Global non-viral gene transfer to the primate brain following intravenous administration" Mol Ther. enero de 2003; 7(1):11-8.) describen cómo la expresión de plásmidos que codifican informadores tales como luciferasa fueron encapsulados en el interior de un "virus artificial" constituido por inmunoliposoma 85 nm pegilado, que fue fijado como objetivo al cerebro de mono rhesus in vivo con un anticuerpo monoclonal (MAb) al receptor de la insulina huma (HIR). El HlRMAb permite que el liposoma que porta el gen exógeno se someta a transcitosis a través de la barrera sangre-cerebro y la endocitosis a través de la membrana plasmática neuronal después de la inyección intravenosa. El nivel de expresión del gen de luciferasa en el cerebro era 50 veces más alto en el mono rhesus en comparación con la rata. La expresión neuronal general del gen betagalactosidasa en el cerebro de los primates fue demostrada tanto por histoquímica como por microscopía confocal. Los autores indican que este enfoque hace factibles transgénicos adultos reversibles en 24 horas. Por consiguiente,se prefiere el uso de inmunoliposoma. Éste se puede utilizar en unión con anticuerpos para fijar como objetivo tejidos diana específicos o proteínas de la superficie celular.
También se prefieren otros medios de suministro o de ARN tales como a través de nanopartículas (Clio, S., Goldberg, M., Son, S., Xu, Q., Yang, F., Mei, Y., Bogatyrev, S., Langer, R, y Anderson, D., Lipid-like nanoparticles for small interfering RNA delivey to endotelial cells, Advanced Functional Materials, 19:3112-31 18, 2010) o exosomas (Schroeder, A., Levins, C., Cortez, C., Langer, R. y Anderson, D., Lipid-based nanotherapeutics fro siRNA delivery, Journal of Internal Medicine, 267: 9-21, 2010, PMID: 20059641). De hecho, los exozomas han demostrado ser particularmente útiles en el suministro de siRNA, un sistema con algunos paralelismos con el sistema de CRISPR. Por ejemplo, El-Andaloussi S, et al. ("Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo" Nat Protoc. diciembre de 2012;7(12):2112-26 doi: 10.1038/nprot.2012.131 Epub 15 de noviembre de 2012) describen cómo los exosomas son herramientas prometedoras para el suministro de fármacos a través de diferentes barreras biológicas y pueden ser aprovechados para el suministro de siRNA in vitro e in vivo. Su enfoque es generar exosomas fijados como objetivo a través de transfección de un vector de expresión, que comprende una proteína exosomai fusionada con un ligando de péptido. Los exosomas son entonces purificados y caracterizados a partir del sobrenadante de células transfectadas y, a continuación, el siRNA se carga en los exosomas.
Un aspecto de la manipulación de una secuencia diana también se refiere a la manipulación epigenética de una secuencia diana. Esto puede ser del estado de cromatina de una secuencia diana tal como por modificación del estado de metilación de la secuencia diana (es decir, adición o eliminación de metilación o patrones de metilación o islas CpG), modificación de histona, el aumento o la reducción de la accesibilidad a la secuencia diana, o mediante la promoción o la reducción de plegado 3D.
Un vector puede significar no sólo un sistema viral o de levadura (por ejemplo, en los casos en los que los ácidos nucleicos de interés pueden estar operativamente enlazados a y bajo el control de (en términos de expresión, tal como para proporcionar en última instancia un ARN procesado) un promotor, sino que también un suministro directo de ácidos nucleicos a una célula huésped.
La invención comprende también, en determinadas realizaciones, un método para tratar o inhibir una afección provocada por un defecto en una secuencia diana en un locus genómico de interés en un sujeto o un sujeto no humano en necesidad del mismo, que comprende la modificación del sujeto o del sujeto no humano mediante la manipulación de la secuencia diana y en el que la afección es susceptible de tratamiento o la inhibición por manipulación de la secuencia diana que comprende proporcionar un tratamiento que comprende: suministrar una composición que se produce de forma no natural o modificada por ingeniería genética que comprende un sistema de vectores que comprende uno o más vectores que comprende codificar de manera operativa una composición de la presente memoria comentada para la expresión de los mismos, en el que la secuencia diana es manipulada por la composición cuando se expresa.
En determinadas realizaciones de los métodos de esta memoria, los métodos pueden incluir la expresión de la inducción, que puede ser inducir la expresión de la enzima de CRISPR y/o inducir la expresión de las secuencias guía, tracr o de emparejamiento tracr. En determinadas realizaciones de los métodos en esta memoria, el organismo
o sujeto es un eucariota o un eucariota no humano. En determinadas realizaciones de los métodos en esta memoria, el organismo o sujeto es una planta. En determinadas realizaciones de los métodos en esta memoria, el organismo o sujeto es un mamífero o un mamífero no humano. En determinadas realizaciones de los métodos en esta memoria, el organismo o sujeto son algas.
Mientras que en los métodos de esta memoria el vector puede ser un vector viral y éste es ventajosamente un AAV, se pueden emplear otros vectores virales tal como se describen en esta memoria. Por ejemplo, se pueden utilizar baculovirus para la expresión en células de insectos. Estas células de insectos pueden, a su vez, ser útiles para
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
producir grandes cantidades de otros vectores, tales como vectores de AAV adaptados para el suministro de la presente invención.
Asimismo, se prevé un método para suministrar la presente enzima de CRISPR, que comprende suministrar a la célula un ARNm que codifican la enzima de CRISPR. Se apreciará que la enzima de CRISPR está truncada, es de un tamaño específico según se describe en esta memoria, es una nucleasa o nickase o una proteína de unión a ADN genérico, está optimizada en codones, comprende una o más mutaciones y/o comprende una enzima de CRISPR quimérica, o las otras opciones como se discuten en esta memoria.
Asimismo, se prevé un método para preparar un vector para el suministro de las composiciones o las presentes enzimas de CRISPR de la invención y para su uso en los presentes métodos.
Se prefieren los vectores virales AAV. Por lo tanto, en un aspecto adicional, se proporciona un método de preparar un vector viral AAV, que comprende transfectar un plásmido o plásmidos que contienen o que consisten esencialmente en una molécula o moléculas de ácido nucleico que codifican el AAV en células de infectadas con AAV, y suministrar AAV rep y/o cap obligatorio para la replicación y el empaquetamiento del AAV. A este respecto, se apreciará que la enzima de CRISPR está truncada, está compuesto por menos de mil aminoácidos o menos de cuatro mil aminoácidos, es una nucleasa o nickase, está optimizada en codones, comprende una o más mutaciones y/o comprende una enzima de CRISPR quimérica tal como se comenta en esta memoria. En algunas realizaciones, el AAV rep y/o cap obligatorio para la replicación y el empaquetamiento del AAV se suministra mediante la transfección de las células con plásmido o plásmidos helper (cooperadores). En algunas realizaciones, el virus helper es un virus de la viruela, adenovirus, virus herpes o baculovirus. En algunas realizaciones, el virus de la viruela es un virus vacuna. En algunas realizaciones las células son células de mamíferos. Y en algunas realizaciones las células son células de insectos y el virus helper es baculovirus.
La invención comprende además en determinadas realizaciones una enzima de CRISPR modificada. Diferencias con la enzima de CRISPR de tipo salvaje pueden comprender: la enzima de CRISPR modificada está truncada en comparación con una enzima de CRISPR de tipo salvaje, o la enzima de CRISPR es de un tamaño específico, p. ej., de al menos 500 aminoácidos, al menos 800-899 aminoácidos, al menos 900-999 aminoácidos, al menos 1000-1099 aminoácidos, al menos 1100-1199 aminoácidos, al menos 1200-1299 aminoácidos, al menos 1300-1399 aminoácidos, al menos 1400-1499 aminoácidos, al menos 1500-1599 aminoácidos, al menos 1600-1699 aminoácidos o al menos 2000 aminoácidos; y/o la enzima de CRISPR es una nucleasa que dirige la escisión de ambas cadenas en la ubicación de la secuencia diana, o la enzima de CRISPR es una nickase que dirige la escisión de una cadena en el lugar de la secuencia diana, o la enzima de CRISPR es un mutante catalítico nulo que funciona como una proteína de unión de ADN; y/o la enzima de CRISPR está optimizada en codones o está optimizada en codones para la expresión en una célula eucariota, y/o la enzima de CRISPR comprende una o más mutaciones y/o la enzima de CRISPR comprende una enzima de CRISPR quimérica y/o la enzima de CRISPR tiene uno o más de otros atributos comentados en la presente memoria. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, la enzima de CRISPR comprende una o más mutaciones en residuos catalíticos tales como spCa9 D10A, E762A, H840A, N854A, N863A o D986A o los correspondientes a ellos en otras enzimas Cas (tal como se describe en esta memoria) con referencia a la numeración de la posición de SpCas9, y/o tiene una o más mutaciones se encuentra en un dominio RuvC I, RuvC II, RuvC III, HNH u otro dominio descrito en esta memoria de la enzima de CRISPR y/o la enzima de CRISPR tiene una o más mutaciones en un dominio catalítico, en el que, cuando se transcribe, una secuencia de emparejamiento tracr se hibrida con una secuencia tracr y una secuencia guía dirige la unión específica para la secuencia de un complejo de CRISPR a una secuencia diana, y en donde la enzima comprende, además, un dominio funcional. El dominio funcional puede incluir, pero no se limita a activador transcripcional, represor transcripcional, una recombinasa, una transposasa, un remodelador de histona, una ADN metiltransferasa, un criptocromo, un dominio inducible/controlable por la luz o un dominio inducible/controlable químicamente. La enzima de CRISPR en determinadas realizaciones puede tener el dominio funcional que sea un dominio activador transcripcional, p. ej., VP64. En algunas realizaciones, un dominio represor transcripcional es KRAB. En algunas realizaciones, un dominio represor de la transcripción es SID, o concatámeros de SID (es decir SID4X). En algunas realizaciones, se proporciona una enzima modificadora epigenética.
En realizaciones preferidas, la enzima de CRISPR es una enzima Cas, p. ej., un ortólogo Cas9.
Aspectos de la invención también comprenden identificar nuevos ortólogos de enzimas de CRISPR. Los métodos para identificar nuevos ortólogos de enzimas CRISPR pueden implicar identificar secuencias tracr en los genomas de interés. La identificación de secuencias tracr puede estar relacionada con los siguientes pasos: Búsqueda de las repeticiones directas o secuencias de emparejamiento tracr en una base de datos para identificar una región
imagen93
imagen94
imagen95
imagen96
imagen97
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
% de homología cuando se realiza un alineamiento global. En consecuencia, la mayoría de los métodos de comparación de secuencias se diseñan para producir alineamientos óptimos que tienen en cuenta posibles inserciones y deleciones sin penalizar indebidamente la puntuación de homología o identidad global. Esto se consigue insertando "huecos" en el alineamiento de secuencias para intentar maximizar la homología o identidad local.
Sin embargo, estos métodos más complejos asignan "penalizaciones por hueco" a cada uno de los huecos que se produce en el alineamiento, de modo que, para el mismo número de aminoácidos idénticos, un alineamiento de la secuencia con tan pocos huecos como sea posible -lo que refleja una mayor relatividad entre las dos secuencias comparadas -puede alcanzar una puntuación más alta que con muchos huecos. Se utilizan típicamente “costos de huecos de afinidad" que cargan un coste relativamente alto para la existencia de un hueco y una penalización más pequeña para cada uno de los residuos posteriores en el hueco. Este es el sistema de puntuación de huecos más comúnmente utilizado. Penalizaciones de huecos elevadas pueden producir, por supuesto, alineamientos optimizados con menos huecos. La mayoría de los programas de alineamiento permiten modificar las penalizaciones por hueco. Sin embargo, se prefiere utilizar los valores por defecto cuando se utiliza un software de este tipo para las comparaciones de secuencias. Por ejemplo, al utilizar el paquete GCG Wisconsin Bestfit la penalización por hueco por defecto para secuencias de aminoácidos es -12 para un hueco y -4 para cada extensión,
El cálculo del % máximo de homología, por tanto, requiere primero la producción de una alineación óptima, teniendo en consideración las penalizaciones por hueco. Un programa informático adecuado para llevar a cabo dicho alineamiento es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al., 1984 Nuc. Acids Research 12 p 387). Ejemplos de otros software que pueden realizar comparaciones de secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete BLAST (véase Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4ª Ed. -Capítulo 18), FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 403-410) y el conjunto GENEWORKS de herramientas de comparación. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para la búsqueda en línea y fuera de línea (véase Ausubel et al., 1999, Short Protocols in Molecular Biology, páginas 7-58 a 7-60). Sin embargo, para algunas aplicaciones, se prefiere utilizar el programa GCG Bestfit. Una nueva herramienta, denominada BLAST 2 Sequences, está también disponible para la comparación de secuencias de proteínas y nucleótidos (véase FEMS Microbiol Lett. 1999 174(2):247-50; FEMS Microbiol Lett. 1999 177(1):187-8 y el sitio web del Centro Nacional de información sobre Biotecnología en la página web de National Institutes for Health).
Aunque el % de homología final puede medirse en términos de identidad, el proceso de alineamiento en sí no se basa típicamente en una comparación de pares de todo o nada. En su lugar, se utiliza generalmente una matriz de puntuación de similitud a escala que asigna puntuaciones a cada comparación por pares basada en la similitud química o la distancia evolutiva. Un ejemplo de una matriz de este tipo comúnmente utilizada es la matriz BLOSUM62 -la matriz por defecto para el conjunto de programas BLAST. Los programas GCG Wisconsin generalmente utilizan cualquiera de los valores por defecto públicos o una tabla de comparación de símbolos personalizada, si se suministra (véase el manual del usuario para más detalles). Para algunas aplicaciones, se prefiere utilizar los valores por defecto públicos para el paquete GCG, o en el caso de otro software, la matriz por defecto, tal como BLOSUM62.
Alternativamente, las homologías porcentuales pueden calcularse utilizando la característica de alineamiento múltiple en DNASIS™ (Hitachi Software), basado en un algoritmo, análogo a CLUSTAL (Higgins DG y Sharp PM (1988), Gene 73 (1), 237-244). Una vez que el software ha producido un alineamiento óptimo, es posible calcular el % de homología, preferentemente el % de identidad de secuencia. El software hace normalmente esto como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico.
Las secuencias también pueden tener deleciones, inserciones o sustituciones de residuos de aminoácidos que producen un cambio silencioso y resultan en una sustancia funcionalmente equivalente. Sustituciones de aminoácidos deliberadas pueden realizarse sobre la base de la similitud en las propiedades de aminoácidos (tales como polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos) y, por lo tanto, es útil para agrupar juntos aminoácidos en grupos funcionales. Los aminoácidos pueden agruparse basándose en las propiedades de sus cadenas laterales solas. Sin embargo, es más útil incluir los datos de mutación también. Los conjuntos de aminoácidos así obtenidos es probable que se conserven por razones estructurales. Estos conjuntos pueden describirse en forma de un diagrama de Venn (Livingstone CD y Barton GJ (1993) "Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation" Comput. Appl. Biosci. 9: 745756) (Taylor W.R. (1986) "The classification of amino acid conservation" J. Theor. Biol. 119; 205-218). Sustituciones conservadoras se pueden hacer, por ejemplo, de acuerdo con la tabla que figura a continuación que describe un diagrama de Venn generalmente aceptado de agrupación de aminoácidos.
5
10
15
20
25
30
35
40
Conjunto
imagen98 Sub-conjunto
Hidrofóbico
F W Y H K M I L V A G C Aromático F W Y H
imagen99
imagen100 Alifático I L V
Polar
W Y H K R E D C S T N Q Cargado H K R E D
imagen101
imagen102 Positivamente cargado H K R
imagen103
imagen104 Negativamente cargado E D
Pequeño
V C A G S P T N D Minúsculo A G S
Realizaciones de la invención incluyen secuencias (tanto de polinucleótidos o polipéptidos) que puede comprender la sustitución homóloga (sustitución y reemplazo se utilizan ambos en esta memoria para dar a entender el intercambio de un residuo de aminoácido o nucleótido existente, con un residuo o nucleótido alternativo) que puede producirse, es decir, una sustitución comparable en el caso de aminoácidos tal como básico por básico, ácido por ácido, polar por polar, etc. También puede producirse una sustitución no homóloga, es decir, de una clase de residuo a otro o, alternativamente, que implica la inclusión de aminoácidos no naturales tales como ornitina (a la que se alude en lo sucesivo como Z), ornitina del ácido diaminobutírico (a la que se alude en lo sucesivo como B), ornitina norleucina (a la que se alude en lo sucesivo como O), pirilalanina, tienilalanina, naftilalanina y fenilglicina.
Secuencias de aminoácidos variantes pueden incluir grupos espaciadores adecuados que pueden insertarse entre cualesquiera dos residuos de aminoácidos de la secuencia, incluyendo grupos alquilo tales como grupos metilo, etilo
o propilo, además de espaciadores de aminoácidos tales como residuos glicina o β-alanina. Una forma adicional de variación, que implica la presencia de uno o más residuos aminoácidos en forma peptoide, pueda ser bien comprendida por los expertos en la técnica. Para evitar dudas, "la forma peptoide" se utiliza para referirse a residuos aminoácidos variantes, en donde el grupo de sustituyentes carbono α está en átomo de nitrógeno del residuo en lugar del carbono α. Procedimientos para preparar péptidos en forma peptoide son conocidos en la técnica, por ejemplo Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 y Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134.
La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de inmunología, bioquímica, química, biología molecular, microbiología, biología celular, genómica y ADN recombinante, que están dentro de la experiencia de la técnica. Véase Sambrook, Fritsch y Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª edición (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F.
M. Ausubel, et al. comps., (1987)); la serie METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames y G.R. Taylor comps. (1995)), Harlow y Lane, comps. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, y ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, comp. (1987)).
En un aspecto, la invención proporciona vectores que se utilizan en la ingeniería y optimización de los sistemas CRISPR/Cas.
Tal como se utiliza en esta memoria, un "vector" es una herramienta que permite o facilita la transferencia de una entidad de un entorno a otro. Es un replicón, tal como un plásmido, fago, o cósmido, en el que se puede insertar otro segmento de ADN con el fin de llevar a cabo la replicación del segmento insertado. Generalmente, un vector es capaz de replicarse cuando se asocia con los elementos de control apropiados. En general, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Vectores incluyen, pero no se limitan a, moléculas de ácido nucleico que son de cadena sencilla, de cadena doble, o parcialmente de doble cadena; moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más extremos libres, sin extremos libres (p. ej., circulares); moléculas de ácido nucleico que comprenden ADN, ARN, o ambos; y otras variedades de polinucleótidos conocidos en la técnica. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN de doble cadena circular en el que se pueden insertar segmentos de ADN adicionales tal como por técnicas de clonación molecular estándares. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que las secuencias de ADN o ARN derivadas de virus están presentes en el vector para el empaquetamiento en un virus (p. ej., retrovirus, retrovirus defectuosos en la replicación, adenovirus, adenovirus defectuosos en la replicación, y virus adeno-asociados). Los vectores virales también incluyen polinucleótidos portados por un virus para la transfección en una célula huésped. Determinados vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (p. ej., vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episomales de mamífero). Otros vectores (p. ej., vectores no episomales de mamífero) se integran en el genoma de una célula huésped tras la
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
introducción en la célula huésped y, con ello, se replican junto con el genoma del huésped. Además, determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están enlazados operativamente. Tales vectores se denominan en esta memoria "vectores de expresión". Vectores de expresión comunes de utilidad en técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de plásmidos. En esta memoria se proporciona una discusión adicional de vectores.
Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen uno o más elementos reguladores, que pueden seleccionarse sobre la base de las células huésped a utilizar para la expresión, que están operativamente enlazadas a la secuencia de ácido nucleico a expresar. Dentro de un vector de expresión recombinante, "enlazada operativamente" pretende significar que la secuencia de nucleótidos de interés está enlazada al o a los elementos reguladores de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (p. ej., en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped cuando el vector se introduce en la célula huésped). Con respecto a métodos de recombinación y de clonación, se hace mención a la solicitud de patente de EE.UU. 10/815.730, publicada el 2 de septiembre de 2004 como US 2004-0171156 A1.
Aspectos y realizaciones de la invención se refieren a vectores bicistrónicos para ARN quimérico y Cas9 o un ortólogo Cas9. En algunas realizaciones, la Cas9 es impulsada por el promotor promotor CBh. En algunas realizaciones, el ARN quimérico es impulsado por un promotor U6. Preferiblemente, el CBh y U6 se utilizan juntos, en el sentido de que Cas9 es impulsada por el promotor CBh y el ARN quimérico es impulsado por un promotor U6. En algunas realizaciones, el ARN guía quimérico consiste en una secuencia guía de 20 pb (Ns) unidos a la secuencia tracr (que va desde la primera "U" de la cadena inferior al extremo del transcrito), que está truncada en diversas posiciones tal como se indica. Las secuencias guía y tracr están separadas preferiblemente por la secuencia de emparejamiento tracr. Un ejemplo preferido de una secuencia de emparejamiento tracr es GUUUUAGAGCUA. Esto es seguido preferiblemente por una secuencia de bucle. El bucle es preferiblemente GAAA, pero no se limita a esta secuencia o, de hecho, sólo es de 4 pb de longitud. De hecho, secuencias formadoras de bucle preferidas para su uso en estructuras de horquilla son de cuatro nucleótidos de longitud, y lo más preferiblemente tienen la secuencia GAAA. Sin embargo, se pueden utilizar secuencias de bucle más largas o más cortas, al igual que secuencias alternativas. Las secuencias incluyen preferiblemente un triplete de nucleótidos (por ejemplo, AAA), y un nucleótido adicional (por ejemplo C o G). Ejemplos de secuencias formadoras de bucle incluyen CAAA y AAAG. A lo largo de esta solicitud, ARN quimérico también se puede denominar ARN guía sencillo
o guía sintético (sgRNA).
Por ejemplo, tal como se describe en detalle específico en el Ejemplo 2, ARNs guía quiméricos pueden ser diseñados tal como se muestra en la Figura 8. Los loci de CRISPR en algunas de estas familias se representan en la Figura 11. Las correspondientes secuencias de ARN guía se muestran en la Figura 12. Los autores de la invención analizaron la secuencia de ADN genómico dentro ~ 2kb de las proteínas Cas9 e identificaron repeticiones directas que van desde 35 pb a 50 pb, con separadores intermedios que van desde 29 pb a 35 pb. Sobre la base de la secuencia de repetición directa, realizaron búsquedas de secuencias candidatas de tracrRNA con los siguientes criterios: fuera de la matriz de crRNA, pero que contienen un alto grado de homología con repeticiones directas (tal como se requiere para el apareamiento de bases repetición directa:tracRNA; el análisis personalizado de cálculo), fuera de las regiones codificantes de los componentes de la proteína, que contienen señales de terminación de la transcripción de ~ 60 pb-120 pb aguas abajo de la región de homología con repeticiones directas y el co-plegamiento con repetición directa para formar un dúplex, seguido de dos o más estructuras de horquilla en el extremo distal de la secuencia de tracrRNA. Sobre la base de estos criterios de predicción, los autores de la invención seleccionaron un conjunto inicial de 18 proteínas Cas9 y sus repeticiones y tracrRNAs directos asociados de forma única distribuidos a través de las cinco familias Cas9. La solicitante generó, además, un conjunto de 18 estructuras de ARN quiméricas que conservaron la secuencia y las estructuras secundarias del dúplex repetición directa:tracRNA nativo, al tiempo que acortan la región de apareamiento de bases y fusionan los dos elementos de ARN a través de un bucle artificial (Figuras 6 A-J).
La expresión "elemento regulador" pretende incluir promotores, potenciadores, sitios de entrada al ribosoma interno (IRES), y otros elementos de control de la expresión (p. ej., señales de terminación de la transcripción tales como señales de poliadenilación y secuencias poli-U). Se describen estos elementos reguladores, por ejemplo, en Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Elementos reguladores incluyen los que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huéspedes y los que dirigen la expresión directa de la secuencia de nucleótidos sólo en determinadas células huéspedes (p. ej., secuencias reguladoras específicas para el tejido). Un promotor específico para el tejido puede dirigir la expresión principalmente en un tejido deseado de interés tal como
imagen105
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
En algunas realizaciones, un vector impulsa la expresión de proteínas en células de insecto utilizando vectores de expresión de baculovirus. Vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (p. ej., células SF9) incluyen la serie pAc (Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers, 1989. Virology 170:31-39).
En algunas realizaciones, un vector es capaz de impulsar la expresión de una o más secuencias en células de mamífero utilizando un vector de expresión de mamífero. Ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen pCDM8 (Seed, 1987. Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6:187-195). Cuando se utiliza en células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión son proporcionadas típicamente por uno o más elementos reguladores. Por ejemplo, promotores comúnmente utilizados se derivan de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus, virus de simio 40, y otros descritos en esta memoria y conocidos en la técnica. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procariotas como eucariotas véanse, p ej., los Capítulos 16 y 17 de Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING:. A LABORATORY MANUAL. 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989.
En algunas realizaciones, el vector de expresión de mamífero recombinante es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo de célula particular (p. ej., elementos reguladores específicos para tejidos se utilizan para expresar el ácido nucleico). Elementos reguladores específicos para tejidos son conocidos en la técnica. Ejemplos no limitantes de promotores específicos para tejidos, adecuados, incluyen el promotor de albúmina (específico para el hígado; Pinkert, et al., 1987, Genes Dev. 1: 268-277), promotores linfoide-específicos (Calame y Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43:235-275), en particular promotores de receptores de células T (Winoto y Baltimore, 1989. EMBO J. 8:729-733) e inmunoglobulinas (Baneiji, et al., 1983. Cell 33: 729-740; Queen y Baltimore, 1983 Cell
33: 741-748), promotores específicos para neuronas (p. ej., el promotor para neurofilamentos; Byrne y Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477), promotores específicos para páncreas (Edlund, et al., 1985. Science 230:912-916) y promotores específicos para glándulas mamarias (p. ej., promotor de suero lácteo; patente de EE.UU. Nº. 4.873.316 y la Publicación de Solicitud Europea Nº 264.166.). Promotores regulados en el desarrollo también están comprendidos, p. ej., los promotores hox murinos (Kessel y Gruss, 1990. Science 249:374-379) y el promotor de α-fetoproteína (Campes y Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546). Con respecto a estos vectores procarióticos y eucarióticos, se hace mención a la patente de EE.UU. 6.750.059. Otras realizaciones de la invención pueden estar relacionadas con el uso de vectores virales, en lo que respecta a los que se hace mención en la solicitud de patente de EE.UU. 13/092.085. Elementos reguladores específicos para tejidos son conocidos en la técnica y, en este sentido, se hace mención a la patente de EE.UU. 7.776.321.
En algunas realizaciones, un elemento regulador está enlazado operativamente a uno o más elementos de un sistema de CRISPR con el fin de impulsar la expresión de los uno o más elementos del sistema de CRISPR. En general, las CISPRs (Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas), también conocidas como SPIDRs (Repeticiones Directas Intercaladas Separadas), constituyen una familia de loci de ADN que habitualmente son específicos para una especie bacteriana particular. El locus de CRISPR puede comprender una clase distinta de Repeticiones de Secuencia Corta Intercaladas (SSRs) que fueron reconocidas en E. coli (Ishino et al, J. Bacteriol., 169:5429-5433 [1987]; y Nakata et al, J. Bacteriol., 171: 3553-3556 [1989]), y genes asociados. SSRs intercaladas similares han sido identificadas en Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena y Mycobacterium tuberculosis (Véase, Groenen et al, Mol. Microbiol., 10:1057-1065 [1993]; Hoe et al., Emerg. Infect. Dis., 5:254-263 [1999]; Masepohl et al., Biochim. Biophys. Acta 1307:26-30 [1996]; y Mojica et al., Mol. Microbiol., 17:85-93 [1995]). Los loci CRISPR difieren típicamente de otros SSRs por la estructura de las repeticiones, que se han denominado repeticiones cortas regularmente espaciadas (SRSRs) (Janssen et al., OMICS J. Integ. Biol., 6:2333 [2002]; y Mojica et. al., Mol Microbiol, 36:244-246 [2000]). En general, las repeticiones son elementos cortos que se producen en grupos que están espaciados regularmente por secuencias intermedias únicas con una longitud sustancialmente constante (Mojica et al., [2000], supra). Aunque las secuencias de repetición están altamente conservadas entre las cepas, el número de repeticiones intercaladas y las secuencias de las regiones del espaciador difieren típicamente de una cepa a otra (van Embden et al., J. Bacteriol., 182:2393-2401 [2000]). Loci CRISPR han sido identificados en más de 40 procariotas (Véase, p. ej., Jansen et al, Mol. Microbiol., 43:1565-1575 [2002]; y Mojica et al., [2005]), incluyendo, pero no limitado a Aeropyrum, Pyrobaculum, Sulfolobus, Archaeoglobus, Halocarcula, Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus, Pyrococcus, Picrophilus, Thermoplasma, Corynebacterium, Mycobacterium, Streptomyces, Aquifex, Porphyromonas, Chlorobium, Thermus, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Clostridium, Thermoanaerobacter, Mycoplasma, Fusobacterium, Azarcus, Chromobacterium, Neisseria, Nitrosomonas, Desulfovibrio, Geobacter, Myxococcus, Campylobacter, Wolinella, Acinetobacter, Erwinia, Escherichia, Legionella, Methylococcus, Pasteurella, Photobacterium, Salmonella, Xanthomonas, Yersinia, Treponema y Thermotoga.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
En general, "sistema de CRISPR" se refiere colectivamente a transcritos y otros elementos implicados en la expresión de o dirigir la actividad de genes CRISPR-asociados ("Cas"), incluyendo secuencias que codifican un gen Cas, una secuencia tracr (CRISPR trans-activante) (p. ej., tracrRNA o un tracrRNA parcial activo), una secuencia de emparejamiento tracr (que abarca una "repetición directa" y una repetición directa parcial procesada por tracrRNA en el contexto de un sistema de CRISPR endógeno), una secuencia guía (a la que también se alude como un "espaciador" en el contexto de un sistema de CRISPR endógeno), u otras secuencias y transcritos de un locus CRISPR. En algunas realizaciones, uno o más elementos de un sistema de CRISPR se derivan de un sistema de CRISPR de tipo I, tipo II o de tipo III. En algunas realizaciones, uno o más elementos de un sistema de CRISPR se derivan de un organismo particular que puede comprender un sistema de CRISPR endógeno tal como Streptococcus pyogenes. En general, un sistema de CRISPR se caracteriza por elementos que fomentan la formación de un complejo de CRISPR en el sitio de una secuencia diana (al que también se alude como un protoespaciador en el contexto de un sistema de CRISPR endógeno). En el contexto de la formación de un complejo de CRISPR, "secuencia diana" se refiere a una secuencia a la que una secuencia guía está diseñada para que tenga complementariedad, en donde la hibridación entre una secuencia diana y una secuencia guía fomenta la formación de un complejo de CRISPR. Una secuencia diana puede comprender cualquier polinucleótido tal como polinucleótidos de ADN o ARN. En algunas realizaciones, una secuencia diana se encuentra en el núcleo o citoplasma de una célula.
En realizaciones preferidas de la invención, el sistema de CRISPR es un sistema de CRISPR de tipo II y la enzima Cas es Cas9, que cataliza la escisión de ADN. La acción enzimática por Cas9 derivada de Streptococcus pyogenes
o cualquier Cas9 estrechamente relacionada genera roturas de doble cadena en las secuencias del sitio diana que se hibridan a 20 nucleótidos de la secuencia guía y que tienen una secuencia del motivo adyacente al protoespaciador (PAM) NGG/NRG (por ejemplo, tal como se discute en otra parte, un PAM adecuado es 5’-NRG o 5’-NNGRR para SpCas9 o enzimas (o enzimas derivadas) SaCas9, respectivamente) después de los 20 nucleótidos de la secuencia diana. La actividad de CRISPR a través de Cas9 para el reconocimiento de ADN específico para el sitio y la escisión se definen por la secuencia guía, la secuencia tracr que se hibrida en parte a la secuencia guía y la secuencia de PAM. Se describen más aspectos del sistema de CRISPR en Karginov y Hannon. The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea, Mole Cell 2010, 15 de enero; 37(1): 7.
El locus de CRISPR de tipo II de Streptococcus pyogenes SF370 contiene un racimo de cuatro genes Cas9, Cas1, Cas2 y Csn1, así como dos elementos de ARN no codificantes, tracrRNA y una matriz característica de secuencias repetitivas (repeticiones directas) interespaciadas por tramos cortos de secuencias no repetitivas (espaciadores, aproximadamente de 30 pb cada uno). En este sistema, la rotura de doble cadena de ADN (DSB) fijada como objetivo se genera en cuatro etapas secuenciales (Figura 2A). En primer lugar, dos ARN no codificantes, la matriz pre-crRNA y tracrRNA se transcriben a partir del locus de CRISPR. En segundo lugar, tracrRNA se hibrida a las repeticiones directas de pre-crRNA, que se procesa luego en crRNA maduros que contienen secuencias de espaciador individuales. En tercer lugar, el complejo crRNA:tracrRNA maduro dirige Cas9 a la diana de ADN que consiste en el protoespaciador y el PAM correspondiente a través de la formación de heteroduplex entre la región del espaciador del crRNA y el ADN del protoespaciador. Por último, Cas9 media en la escisión del ADN diana aguas arriba del PAM para crear una DSB dentro del protoespaciador (Figura 2A). La Figura 2B muestra la ubicación nuclear de Cas9 optimizado en codones. Para fomentar la iniciación de la transcripción precisa, se seleccionó el promotor U6 basado en ARN polimerasa III para impulsar la expresión de tracrRNA (Figura 2C). De manera similar, se desarrolló una construcción basada en el promotor U6 para expresar una matriz de pre-crRNA que consiste en un único espaciador flanqueado por dos repeticiones directas (DRs, también abarcados por la expresión "secuencias de emparejamiento de tracr”; Figura 2C). El espaciador inicial se diseñó para fijar como objetivo un sitio diana de 33 pares de bases (pb) (protoespaciador de 30 pb más una secuencia del motivo de CRISPR (PAM) de 3 pb que satisface el motivo de reconocimiento de NGG de Cas9) en el locus EMX1 humano (Figura 2C), un gen clave en el desarrollo de la corteza cerebral.
La Figura 16 muestra ortólogos Cas9 y respectivos sgRNAs se utilizan para escindir dos dianas candidatas presentes en un banco basado en pUC19. La diana 1 es seguida por un PAM aleatorio que contiene 7 bases degeneradas (5’-NNNNNNN -3’), y la diana 1’, que contiene la misma secuencia diana que la diana 1, es seguida por un PAM fijo (5'-TGGAGAAT-3). El sgRNA de cada uno de los ortólogos Cas9 contiene la secuencia guía contra la diana 1 o diana 1’. Imágenes en gel muestran la escisión con éxito por 20 ortólogos Cas9, lo que indica que estos diseños de sgRNA son funcionales con sus respectivas enzimas Cas9.
En algunas realizaciones, repeticiones directas o secuencias de emparejamiento tracr se descargan de la base de datos CRISPRs o se identifican in silico mediante el rastreo de motivos repetitivos que 1. se encuentran en una ventana de 2 kb de secuencia genómica flanqueante del locus CRISPR de tipo II, 2. abarcan de 20 a 50 pb, y 3.
imagen106
imagen107
imagen108
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
puede ser visualizada la ubicación dentro de una célula, tal como en combinación con medios para detectar la ubicación del núcleo (p. ej., un colorante específico para el núcleo, tal como DAPI). Los núcleos de las células también pueden aislarse de las células, cuyos contenidos pueden luego ser analizados mediante cualquier procedimiento adecuado para la detección de proteínas, tal como inmunohistoquímica, transferencia Western o un ensayo de actividad enzimática. La acumulación en el núcleo también puede determinarse indirectamente tal como mediante un ensayo para el efecto de la formación de complejos CRISPR (p. ej., ensayo para la escisión o mutación de ADN en la secuencia diana, o ensayo para la actividad de la expresión génica alterada, afectada por la formación de complejos de CRISPR y/o actividad de la enzima de CRISPR), en comparación con un control no expuesto a la enzima o complejo CRISPR, o expuesto a una enzima de CRISPR que carece de la una o más NLSs.
En general, una secuencia guía es cualquier secuencia de polinucleótidos que tiene suficiente complementariedad con una secuencia de polinucleótidos diana para hibridarse con la secuencia diana y dirigir la unión específica para la secuencia de un complejo de CRISPR a la secuencia diana. En algunas realizaciones, el grado de complementariedad entre una secuencia guía y su secuencia diana correspondiente, cuando se alinean óptimamente utilizando un algoritmo de alineación adecuado, se trata de o más de aproximadamente 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99%, o más. Un alineamiento óptimo puede ser determinado con el uso de cualquier algoritmo adecuado para el alineamiento de secuencias, ejemplos no limitativos de los cuales incluyen el algoritmo de Smith-Waterman, el algoritmo de Needleman-Wunsch, algoritmos basados en la Transformada de Burrows-Wheeler (p. ej., el Alineador de Burrows Wheeler), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies; disponible en www.novocmft.com), ELAND (Illumina, San Diego, CA), SOAP (disponible en soap.genomics.org.cn) y Maq (disponible en maq.sourceforge.net). En algunas realizaciones, una secuencia guía está relacionada en aproximadamente o más de aproximadamente 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 o más nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, una secuencia guía es menor que aproximadamente 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, o menos nucleótidos de longitud. La capacidad de una secuencia de guía para dirigir unión específica para la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia diana se puede determinar mediante cualquier ensayo adecuado. Por ejemplo, los componentes de un sistema de CRISPR, suficientes para formar un complejo de CRISPR, incluyendo la secuencia guía a ensayar, se pueden proporcionar a una célula huésped que tiene la secuencia diana correspondiente, tal como por transfección con vectores que codifican los componentes de la secuencia CRISPR, seguido de un estudio de escisión preferencial dentro de la secuencia diana tal como el ensayo Surveyor como se describe en esta memoria. De manera similar, la escisión de una secuencia de polinucleótido diana puede ser evaluada en un tubo de ensayo proporcionando la secuencia diana, componentes de un complejo de CRISPR, que incluye la secuencia guía a ensayar y una secuencia guía de control diferente de la secuencia guía de ensayo, y comparando la unión o la tasa de escisión en la secuencia diana entre las reacciones de ensayo y de la secuencia guía de control. Son posibles otros ensayos, y se les ocurrirán a los expertos en la técnica.
Nickase multiplezda: Aspectos de optimización y las enseñanzas de Cas9 detallada en esta solicitud también se pueden utilizar para generar nickases Cas9. Nickases Cas9 se pueden utilizar ventajosamente en combinación con pares de ARNs guía para generar roturas de la doble cadena de ADN con colgantes definidos. Cuando se utilizan dos pares de ARNs guía, es posible escindir un fragmento de ADN intermedio. Si un trozo exógeno de ADN es escindido por los dos pares de ARNs guía para generar colgantes compatibles con el ADN genómico, entonces el fragmento de ADN exógeno se puede ligar en el ADN genómico para reemplazar el fragmento escindido. Por ejemplo, esto se puede utilizar para eliminar la expansión de repetición de trinucleótidos en el gen huntingtina (HIT para el tratamiento de la enfermedad de Huntington.
Cas9 y su ARN guía quimérico, o combinación de tracrRNA y crRNA, se pueden suministrar como ADN o ARN. El suministro de Cas9 y ARN guía ambos como moléculas de ARN (normal o con un contenido de bases o modificaciones de la cadena principal) se puede utilizar para reducir la cantidad de tiempo que la proteína Cas9 persiste en la célula. Esto puede reducir el nivel de la actividad de escisión fuera de objetivo en la célula diana. Dado que el suministro de Cas9 como ARNm requiere tiempo para ser traducido en proteína, podría ser ventajoso suministrar el ARN guía varias horas después del suministro de ARNm de Cas9, para maximizar el nivel de ARN guía disponible para la interacción con la proteína Cas9.
En situaciones en las que la cantidad de ARN guía es limitante, puede ser deseable introducir Cas9 como ARNm y ARN guía en forma de una casete de expresión de ADN con un promotor que impulsa la expresión del ARN guía. De esta manera la cantidad de ARN guía disponible será amplificada a través de la transcripción.
Se puede introducir una diversidad de sistemas de suministro para introducir Cas9 (ADN o ARN) y ARN guía (ADN oARN) en la célula huésped. Éstos incluyen el uso de liposomas, vectores virales, electroporación, nanopartículas, nanohilos (Shalek et al., Nano Letters, 2012), exosomas. Liposomas de caballos de Troya moleculares (Pardridge et
imagen109
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
realizaciones, un molde de recombinación está diseñado para servir como un molde en la recombinación homóloga tal como dentro o cerca de una secuencia diana mellada o escindida por una enzima de CRISPR como parte de un complejo de CRISPR. Un polinucleótido molde puede ser de cualquier longitud adecuada, tal como aproximadamente o más de aproximadamente 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000, o más nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el polinucleótido molde es complementario a una parte de un polinucleótido que puede comprender la secuencia diana. Cuando se alinean óptimamente, un polinucleótido molde podría solaparse con uno o más nucleótidos de una secuencia diana (p. ej., aproximadamente o más de aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, o más nucleótidos). En algunas realizaciones, cuando una secuencia de un molde y un polinucleótido, que comprende una secuencia diana, se alinean de manera óptima, el nucleótido más próximo del polinucleótido del molde está dentro de aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 5000, 10000, o más nucleótidos de la secuencia diana.
En algunas realizaciones, la enzima de CRISPR es parte de una proteína de fusión que comprende uno o más dominios de proteínas heterólogos (p. ej., aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más dominios, además de la enzima de CRISPR). Una proteína de fusión enzima de CRISPR puede comprender cualquier secuencia de la proteína adicional, y opcionalmente una secuencia de unión entre cualquiera de dos dominios. Ejemplos de dominios de proteínas que pueden fusionarse con una enzima de CRISPR incluyen, sin limitación, macadores de epítopos, secuencias de gen indicador y dominios de proteínas que tienen una o más de las siguientes actividades: actividad metilasa, actividad desmetilasa, actividad de activación de la transcripción, actividad de represión de la transcripción, actividad del factor de liberación de la transcripción, actividad de la modificación de histonas, actividad de escisión del ARN y actividad de unión a ácido nucleico. Ejemplos no limitantes de marcadores de epítopos incluyen marcadores de histidina (His), marcadores V5, marcadores FLAG, marcadores de hemaglutinina de la gripe (HA), marcadores Myc, marcadores VSV-G y marcadores de tiorredoxina (Trx). Ejemplos de genes informadores incluyen, pero no se limitan a, glutatión-S-transferasa (GST), peroxidasa de rábano picante (HRP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), beta-galactosidasa, beta-glucuronidasa, luciferasa, proteína fluorescente verde (GFP), HcRed, DsRed, proteína fluorescente cian (CFP), proteína amarilla fluorescente (YFP) y proteínas autofluorescentes incluyendo la proteína fluorescente azul (BFP). Una enzima de CRISPR puede fusionarse a una secuencia de gen que codifica una proteína o un fragmento de una proteína que une moléculas de ADN o une otras moléculas celulares, incluyendo pero no limitada a la proteína de unión a maltosa (MBP), S-tag, fusiones del dominio de unión a ADN (DBD) de Lex A, fusiones del dominio de unión a ADN de GAL4 y fusiones de la proteína BP16 del virus herpes simplex (HSV). Dominios adicionales que pueden formar parte de una proteína de fusión que puede comprender una enzima de CRISPR se describen en el documento US20110059502. En algunas realizaciones, se utiliza una enzima de CRISPR marcada para identificar la ubicación de una secuencia diana.
En algunas realizaciones, una enzima de CRISPR puede formar un componente de un sistema inducible. La naturaleza inducible del sistema permitiría un control de espacio-temporal de la edición gen o la expresión génica utilizando una forma de energía. La forma de energía puede incluir, pero no se limita a la radiación electromagnética, energía sonora, energía química y energía térmica. Ejemplos de sistema inducible incluyen promotores de tetraciclina inducibles (Tet-On o Tet-Off), sistemas de activaciones de transcripción de dos híbridos de moléculas pequeñas (FKBP, ABA, etc.), o sistemas inducibles por la luz (fitocromo, dominios LOV, o criptocromo). En una realización, la enzima CRISPR puede ser una parte de un Efector Transcripcional Inducible por la Luz (LITE) para dirigir cambios en la actividad transcripcional de una manera específica para la secuencia. Los componentes de una luz pueden incluir una enzima de CRISPR, un heterodímero citocromo sensible a la luz (p. ej., de Arabidopsis thaliana), y un dominio de activación/represión transcripcional.
En algunos aspectos, la invención proporciona métodos que comprenden suministrar uno o más polinucleótidos, tales como o uno o más vectores tal como se describen en esta memoria, uno o más transcritos de los mismos, y/o una o más proteínas transcritas de los mismos, a una célula huésped. En algunos aspectos, la invención proporciona, además, células producidas por tales métodos, y animales que comprenden o son producidos a partir de tales células. En algunas realizaciones, una enzima de CRISPR en combinación con (y opcionalmente formando complejo con) una secuencia guía se suministra a una célula. Métodos de transferencia génica basados en virus y no virales convencionales pueden utilizarse para introducir ácidos nucleicos en células de mamífero o tejidos diana. Tales métodos se pueden utilizar para administrar ácidos nucleicos que codifican componentes de un sistema de CRISPR para células en cultivo, o en un organismo huésped. Sistemas de suministro de vectores no virales incluyen plásmidos de ADN, ARN (p. ej., un transcrito de un vector descrito en esta memoria), ácido nucleico desnudo y ácido nucleico formando complejo con un vehículo de suministro, tal como un liposoma. Sistemas de suministro de vectores virales incluyen virus de ADN y ARN, que tienen genomas episomales o integrados después dl suministro a la célula. Para una revisión de procedimientos de terapia génica, véase Anderson, Science 256: 808-813 (1992); Nabel y Felgner, TIBTECH 11: 211-217 (1993); Mitani y Caskey, TIBTECH 11;162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357: 455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne,
imagen110
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
de una línea celular que empaqueta un vector de ácido nucleico en una partícula viral. Los vectores contienen típicamente las secuencias virales mínimas requeridas para el empaquetamiento y la posterior integración en un huésped, siendo reemplazadas otras secuencias virales por una casete de expresión para el o los polinucleótidos a expresar. Las funciones virales que faltan se suministran normalmente en trans por la línea celular de empaquetamiento. Por ejemplo, los vectores AAV utilizados en terapia génica poseen típicamente sólo secuencias ITR del genoma de AAV que se requieren para el empaquetamiento y la integración en el genoma huésped. El ADN viral se empaqueta en una línea celular, que contiene un plásmido auxiliar que codifica los otros genes AAV, a saber rep y cap, pero que carece de secuencias ITR. La línea celular también puede estar infectada con adenovirus como un helper (cooperador). El virus helper fomenta la replicación del vector AAV y la expresión de genes AAV a partir del plásmido helper. El plásmido helper no está empaquetado en cantidades significativas debido a una carencia de secuencias ITR. La contaminación con adenovirus puede reducirse mediante, p. ej., tratamiento térmico al que el adenovirus es más sensible que AAV. Métodos adicionales para el suministro de ácidos nucleicos a las células son conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, el documento US20030087817.
Por consiguiente, el AAV se considera un candidato ideal para su uso como un vector de transducción. Tales vectores de transducción AAV pueden comprender suficientes funciones que actúan en cis para replicar en presencia de adenovirus o virus herpes o virus de la viruela (p. ej., virus vacuna) funciones helper proporcionadas en trans. AAV recombinante (rAAV) puede utilizarse para transportar genes exógenos a células de una diversidad de linajes. En estos vectores, los genes cap y/o rep de AAV se eliminan del genoma viral y se reemplazan por un segmento de ADN de elección. Vectores AAV actuales pueden alojar hasta 4300 bases de ADN insertado.
Existe un cierto número de maneras de producir rAAV, y la invención proporciona rAAV y métodos para preparar rAAV. Por ejemplo, un plásmido o plásmidos que contienen o consisten esencialmente en la construcción viral deseada se transfectan en células infectadas con AAV. Además, un segundo o adicional plásmido helper se cotransfecta en estas células para proporcionar los genes cap y/o rep de AAV que son obligatorias para replicación y el empaquetamiento de la construcción viral recombinante. Bajo estas condiciones, las proteínas rep y/o cap de AAV actúan en trans para estimular la replicación y el empaquetamiento de la construcción de rAAV. Dos a tres días después de la transfección, se recoge el rAAV. Tradicionalmente el rAAV se recoge de las células junto con adenovirus. El adenovirus contaminante se inactiva luego por tratamiento térmico. En la presente invención, el rAAV se recoge ventajosamente no de las propias células, sino a partir de sobrenadante celular. Por consiguiente, en un aspecto inicial, la invención proporciona preparar rAAV, y además de lo anterior, rAAV se puede preparar por un método que comprende o consiste esencialmente en: infectar células susceptibles con un ADN exógeno que contiene rAAV, incluyendo ADN para la expresión, y virus helper (p. ej., adenovirus, virus herpes, virus de la viruela tales como el virus vacuna) en el que el rAAV carece de cap y/o rep funcionales (y el virus helper (p. ej., adenovirus, virus herpes, virus de la viruela tales como el virus vacuna) proporciona la función cap y/o rep de la que carece el rAAV); o infectar células susceptibles con un rAAV que contiene ADN exógeno incluyendo ADN para la expresión, en donde el recombinante carece de cap y/o rep funcional, y transfectar dichas células con un plásmido que suministra la función cap y/o rep de la que carece el rAAV; o infectar células susceptibles con un rAAV que contiene ADN exógeno incluyendo ADN para la expresión, en donde el recombinante carece de cap y/o rep funcional, en donde dichas células suministran la función cap y/o rep de la que carece el recombinante carece; o transfectar las células susceptibles con un AAV que carecen de cap y/o rep funcional y plásmidos para la inserción de ADN exógeno en el recombinante, de modo que el ADN exógeno se expresa por el recombinante y para suministrar las funciones rep y/o cap, con lo que la transfección resulta en un rAAV que contiene el ADN exógeno incluyendo ADN para la expresión que carece de cap y/o rep funcional.
El rAAV puede ser de un AAV tal como se describe en esta memoria, y ventajosamente puede ser un rAAV1, rAAV2, AAV5 o rAAV que tiene un híbrido o una cápside que puede comprender AAV1, AAV2, AAV5 o cualquier combinación de los mismos. Se puede seleccionar el AAV del rAAV con respecto a las células a ser fijadas como objetivo por el rAAV; p. ej., se puede seleccionar AAV serotipos 1, 2, 5 o un híbrido o la cápside de AAV 1, AAV2, AAV5 o cualquier combinación de los mismos para fijar como objetivo células del cerebro o neuronales; y se puede seleccionar AAV4 para fijar como objetivo tejido cardíaco, AAV8 para fijar como objetivo tejido del hígado.
Además de las células 293, en la práctica de la invención se pueden utilizar otras células y la infectividad relativa de determinados serotipos de AAV in vitro en cuanto a estas células (véase Grimm, D. et al, J. Virol 82.: 5887-5911 (2008)) es la siguiente:
Línea Celular
AAV-1 AAV-2 AAV-3 AAV-4 AAV-5 AAV-6 AAV-8 AAV-9
Huh-7
13 100 2,5 0,0 0,1 10 0,7 0,0
HEK293
25 100 2,5 0,1 0,1 5 0,7 0,1
HeLa
3 100 2,0 0,1 6,7 1 0,2 0,1
HepG2
3 100 16,7 0,3 1,7 5 0,3 ND
Hep1A
20 100 0,2 1,0 0,1 1 0,2 0,0
911
17 100 11 0,2 0,1 17 0,1 ND
CHO
100 100 14 1,4 333 50 10 1,0
COS
33 100 33 3,3 5,0 14 2,0 0,5
MeWo
10 100 20 0,3 6,7 10 1,0 0,2
NIH3T3
10 100 2,9 2,9 0,3 10 0,3 ND
A549
14 100 20 ND 0,5 10 0,5 0,1
HT1180
20 100 10 0,1 0,3 33 0,5 0,1
Monocitos
1111 100 ND ND 125 1429 ND ND
DC inmadura
2500 100 ND ND 222 2857 ND ND
DC madura
2222 100 ND ND 333 3333 ND ND
La invención proporciona rAAV que contiene o consiste esencialmente en una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica un sistema de CRISPR (Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente 5 Interespaciadas), p. ej., una pluralidad de casetes que comprenden o consisten en una primera casete que comprende o consiste esencialmente en un promotor, una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína CRISPR-asociada (Cas) (proteínas nucleasa o helicasa putativas), p. ej., Cas9 y un terminador, y dos, o más, de manera ventajosa hasta el límite de tamaño de empaquetamiento del vector, p. ej., en total (incluyendo la primera casete) de cinco casetes que comprenden o consisten esencialmente en un promotor, una molécula de ácido 10 nucleico que codifica ARN guía (gRNA) y un terminador (p. ej., cada una de las casetes representada esquemáticamente como Promotor-gRNA1-terminador, Promotor-gRNA2-terminador…. Promotor-gRNA(N)terminador (en donde N es un número que puede ser insertado que se encuentra en un límite superior del límite de tamaño de empaquetamiento del vector), o dos o más rAAVs individuales, cada uno de los cuales contiene una o más de una casete de un sistema de CRISPR, p. ej., un primer rAAV que contiene la primera casete que comprende 15 o que consiste esencialmente en un promotor, una molécula de ácido nucleico que codifica Cas, p. ej., Cas9 y un terminador y un segundo rAAV que contiene una pluralidad, cuatro, casetes que comprende o consiste
imagen111
imagen112
imagen113
imagen114
imagen115
imagen116
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
específicamente las proteínas tirosina-fosforiladas están disponibles de un número de proveedores, incluyendo Invitrogen y Perkin Elmer. Anticuerpos anti-fosfotirosina son particularmente útiles en la detección de proteínas que son fosforiladas diferencialmente en sus residuos de tirosina en respuesta a un estrés ER. Tales proteínas incluyen, pero no se limitan al factor 2 alfa de iniciación de la traducción eucariótica (eIF-2α). Alternativamente, estos anticuerpos pueden generarse utilizando tecnologías de anticuerpos policlonales o monoclonales convencionales mediante la inmunización de un animal huésped o una célula productora de anticuerpos con una proteína diana que exhibe la modificación post-traduccional deseada.
En la práctica del método en cuestión, puede ser deseable discernir el patrón de expresión de una proteína asociada con una vía de señalización bioquímica en diferentes tejidos corporales, en diferentes tipos de células y/o en diferentes estructuras subcelulares. Estos estudios se pueden realizar con el uso de anticuerpos específicos para el tejido, específicos para la célula o específicos para la estructura subcelular, capaces de unirse a marcadores de proteínas que se expresan preferentemente en determinados tejidos, tipos de célula o estructuras subcelulares.
Una expresión alterada de un gen asociado con una vía de señalización bioquímica también se puede determinar examinando un cambio en la actividad del producto génico con relación a una célula de control. El ensayo para un cambio inducido por agente en la actividad de una proteína asociada con una vía de señalización bioquímica dependerá de la actividad biológica y/o la vía de transducción de señales que está bajo investigación. Por ejemplo, en los casos en los que la proteína es una quinasa, un cambio en su capacidad para fosforilar el o los sustratos aguas abajo puede ser determinado por una diversidad de ensayos conocidos en la técnica. Ensayos representativos incluyen, pero no se limitan a inmunotransferencia e inmunoprecipitación con anticuerpos tales como anticuerpos anti-fosfotirosina que reconocen las proteínas fosforiladas. Además, la actividad quinasa se puede detectar por ensayos quimioluminiscentes de alto rendimiento tales como los ensayos AlphaScrea™ (disponible de Perkin Elmer) y eTag™ (Chan-Hui, et al. (2003) Clinical Immunology 111:162-174).
En los casos en los que la proteína asociada con una vía de señalización bioquímica es parte de una cascada de señalización que conduce a una fluctuación de la condición de pH intracelular, moléculas sensibles al pH tales como colorantes de pH fluorescentes se pueden utilizar como moléculas informadoras. En otro ejemplo en el que la proteína asociada a una vía de señalización bioquímica es un canal de iones, se pueden vigilar las fluctuaciones en el potencial de membrana y/o en la concentración intracelular de iones. Un cierto número de kits comerciales y dispositivos de alto rendimiento son particularmente adecuados para un rastreo rápido y robusto para moduladores de canales de iones. Instrumentos representativos incluyen FLIPRTM (Molecular Devices, Inc.) y VIPR (Aurora Biosciences). Estos instrumentos son capaces de detectar reacciones en pocillos de más de 1000 muestras de una microplaca de forma simultánea, y proporcionan una medición en tiempo real y datos funcionales en el espacio de un segundo o incluso un milisegundo.
En la práctica de cualquiera de los métodos descritos en esta memoria, un vector adecuado se puede introducir en una célula o un embrión a través de uno o más métodos conocidos en la técnica, incluyendo, sin limitación, microinyección, eiectroporación, sonoporación, biolística, transfección mediada por fosfato de calcio, transfección catiónica, transfección de liposomas, transfección de dendrímeros, transfección de choque térmico, transfección por nucleofección, magnetofección, lipofección, impalefección, transfección óptica, captación de propiedad reforzada por el agente de ácidos nucleicos y el suministro a través de liposomas, inmunoliposomas, virosomas o viriones artificiales. En algunos métodos, el vector se introduce en un embrión mediante microinyección. El vector o los vectores se pueden microinyectar en el núcleo o en el citoplasma del embrión. En algunos métodos, el vector o los vectores se pueden introducir en una célula por nucleofección.
El polinucleótido diana de un complejo de CRISPR puede ser cualquier polinucleótido endógeno o exógeno a la célula eucariota. Por ejemplo, el polinucleótido diana puede ser un polinucleótido que reside en el núcleo de la célula eucariota. El polinucleótido diana puede ser una secuencia codificadora un producto génico (p. ej., una proteína) o una secuencia no codificadora (p. ej., un polinucleótido regulador o un ADN basura).
Ejemplos de polinucleótidos diana incluyen una secuencia asociada con una vía de señalización bioquímica, p. ej., un gen o polinucleótido asociado a la vía de señalización bioquímica. Ejemplos de polinucleótidos diana incluyen un gen o polinucleótido asociado a la enfermedad. Un gen o polinucleótido "asociado a la enfermedad" se refiere a cualquier gen o polinucleótido que está proporcionando productos de transcripción o traducción en un nivel anormal
o en una forma anormal en células derivadas de tejidos afectados por la enfermedad en comparación con los tejidos
o células de un control no enfermo . Puede ser un gen que se expresa a un nivel anormalmente alto; puede ser un gen que se expresa a un nivel anormalmente bajo, en donde la expresión alterada se correlaciona con la aparición y/o el progreso de la enfermedad. Un gen asociado a la enfermedad también se refiere a un gen que posee
imagen117
ENFERMEDAD/TRASTORNOS
GENE(S)
imagen118
(Receptor de Andrógeno); TSG101; IGF; Receptor de IGF1; Igf1 (4
imagen119
variantes); Igf2 (3 variantes); Receptor de Igf1; Receptor de Igf2;
imagen120
Bax; Bcl2; familia de caspasas (9 miembros:
imagen121
1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12); Kras; Apc
Macular relacionada con la edad
Abcr; Ccl2; Cc2; cp (ceruloplasmina); Timp3; catepsinaD;
Degeneración
Vldlr; Ccr2
Esquizofrenia
Neuregulina1 (Nrg1); Erb4 (receptor para Neuregulina);
imagen122
Complexina1 (Cplx1); Tph1 Triptofanohidroxilasa; Tph2
Triptófano
hidroxilasa 2; Neurexina 1; GSK3; GSK3a;
imagen123
GSK3b
Trastornos
5-HTT (Slc6a4); COMT; DRD (Drd1a); SLC6A3; DAOA;
imagen124
DTNBP1; Dao (Dao1)
Repetición de Trinucleótidos
HTT (Enfermedad de Huntington); SBMA/SMAX1/AR (Enfermedad de Kennedy);
Trastornos
FXN/X25 (Ataxia de Friedrich); ATX3 (Enfermedad de Machado-
imagen125
Joseph); ATXN1 and ATXN2 (ataxias espinocerebelares);
imagen126
DMPK (distrofia miotónica); Atrofins-1 y Atnl
imagen127
(Enfermedad DRPLA); CBP (Creb-BP – inestabilidad global); VLDLR
imagen128
(Alzheimer); Atxn7; Atxn10
Síndrome X Frágil
FMR2; FXR1; FXR2; mGLUR5
Relacionado con Secretasa
APH-1 (alfa y beta); Presenilina (Psen1); nicastrina
Trastornos
(Ncstn); PEN-2
ENFERMEDAD/TRASTORNOS
GENE(S)
Otros
Nos1; Parp1; Nat1; Nat2
Trastornos relacionados con Priones
Prp
ALS
SOD1; ALS2; STEX; FUS; TARDBP; VEGF (VEGF-a;
imagen129
VEGF-b; VEGF-c)
Adicción a fármacos
Prkce (alcohol); Drd2; Drd4; ABAT (alcohol); GRIA2;
imagen130
Grm5; Grin1; Htr1b; Grin2a; Drd3; Pdyn; Gria1 (alcohol)
Autismo
Mecp2; BZRAP1; MDGA2; Sema5A; Neurexina 1; Frágil X
imagen131
(FMR2 (AFF2); FXR1; FXR2; Mglur5)
Enfermedad de Alzheimer
E1; CHIP; UCH; UBB; Tau; LRP; PICALM; Clusterina; PS1;
imagen132
SORL1; CR1; Vldlr; Uba1; Uba3; CHIP28 (Aqp1,
imagen133
Aquaporina 1); Uchl1; Uchl3; APP
Inflamación
IL-10; IL-1 (IL-1a; IL-1b); IL-13; IL-17 (IL-17a(CTLA8); IL
imagen134
17b; IL-17c; IL,-17d; IL-17f); II-23; Cx3cr1; ptpn22; TNFa;
imagen135
OD2/CARD15 for IBD; IL-6; IL-12 (IL-12a; IL-12b);
imagen136
CTLA4; Cx3c11
Enfermedad de Parkinson
x-Sinucleína; DJ-1; LRRK2; Parkin; PINK1
Tabla B:
Enfermedades y trastornos de la sangre y coagulación
Anemia (CDAN1, CDA1, RPS19, DBA, PKLR, PK1, NT5C3, UMPH1, PSN1, RHAG, RH50A, NRAMP2, SPTB, ALAS2, ANH1, ASB, ABCB7, ABC7, ASAT); síndrome de linfocito desnudo (TAPBP, TPSN, TAP2, ABCB3, PSF2, RING11, MHC2TA, C2TA, RFX5, RFXAP, RFX5), Trastornos de hemorragia (TBXA2R, P2RX1, P2X1); Factor H y tipo factor H 1 (HF 1, CFH, HUS); Factor V y factor VIII (MCFD2); Deficiencia de factor VII (F7); Deficiencia de factor X (F10); Deficiencia de factor XI (F11); Deficiencia de factor XII (F 12, HAF); Deficiencia de factor XIIIA (F13A1, F13A); Deficiencia de factor XIIIB (F13B); anemia de Fanconi (FANCA, FACA, FA1, FA, FAA, FAAP95, FAAP90, FLJ34064, FANCB, FANCC, FACC, BRCA2, FANCD1, FANCD2, FANCD, FACD, FAD, FANCE, FACE, FANCF, XRCC9, FANCG, BRIP1, BACH1, FANCJ, PHF9, FANCL, FANCM, KIAA1596); Trastornos de linfohistiocitosis hemofagocítica (PRF1, HPLH2,
imagen137
UNC13D, MUNC13-4, HPLH3, HLH3, FHL3); Hemofilia A (F8, F8C, HEMA); Hemofilia B (F9, HEMB), Trastornos hemorrágicos (PI, ATT, F5); Deficiencias y trastornos de leucocitos (ITGB2, CD18, LCAMB, LAD, EIF2B1, EIF2BA, EIF2B2, EIF2B3, EIF2B5, LVWM, CACH, CLE, EIF2B4); anemia de células de Sickle (HBB); Talasemia (HBA2, HBB, HBD, LCRB, HBA1).
imagen138
imagen139
Enfermedades y trastornos de disregulación celular y oncología
Linfoma no-Hodgkin B-cel1 (BCL7A, BCL7); Leucemia (TAL1, TCL5, SCL, TAL2, FLT3, NBS1, NBS, ZNFN1A1, IK1, LYF1, HOXD4, HOX4B, BCR, CML, PHL, ALL, ARNT, KRAS2, RASK2, GMPS, AF10, ARHGEF12, LARG, KIAA0382, CALM, CLTH, CEBPA, CEBP, CHIC2, BTL, FLT3, KIT, PBT, LPP, NPM1, NUP214, D9S46E, CAN, CAIN, RUNX1, CBFA2, AML1, WHSC1L1, NSD3, FLT3, AF1Q, NPM1, NUMA1, ZNF145, PLZF, PML, MYL, STAT5B, AF10, CALM, CLTH, ARL 11, ARLTS 1, P2RX7, P2X7, BCR, CML, PHL, ALL, GRAF, NF1, VRNF, WSS, NFNS, PTPN11, PTP2C, SHP2, NS1, BCL2, CCND1, PRAD1, BCL1, TCRA, GATA1, GF1, ERYF1, NFE1, ABL1, NQO1, DIA4, NMOR1, NUP214, D9S46E, CAN, CAIN).
imagen140
imagen141
Enfermedades y trastornos relacionados con la inflamación y el sistema inmune
AIDS (KIR3DL1, NKAT3, NKB1, AMB11, KIR3DS1, IFNG, CXCL12, SDF1); Síndrome linfoproliferativo autoinmune (TNFRSF6, APT1, FAS, CD95, ALPS1A); Inmunodeficiencia combinada, (IL2RG, SCIDX1, SCIDX, IMD4); HIV-1 (CCL5, SCYA5, D17S136E, TCP228), Susceptibilidad o infección por VIH (IL10, CSIF, CMKBR2, CCR2, CMKBR5, CCCKR5 (CCR5)); Inmunodeficiencias (CD3E, CD3G, AICDA, AID, HIGM2, TNFRSF5, CD40, UNG, DGU, HIGM4, TNFSF5, CD40LG, HIGM1, IGM, FOXP3, IPEX, AIID, XPID, PIDX, TNFRSF14B, TACI); Inflamación (IL-10, IL-1 (IL-1a, IL-1b), IL-13, IL-17 (IL-17a (CTLA8), IL-17b, IL-17c, II,-17d, IL-17f), II-23, Cx3crl, ptpn22, TNFa, NOD2/CARD15 for IBD, IL-6, IL-12 (IL-12a, IL-12b), CTLA4, Cx3cl1); Inmunodeficiencias combinadas graves (SCIDs)(JAK3, JAKL, DCLRE1C, ARTEMIS, SCIDA, RAG1, RAG2, ADA, PTPRC, CD45, LCA, IL7R, CD3D, T3D, IL2RG, SCIDX1, SCIDX, IMD4).
imagen142
imagen143
Enfermedades y trastornos metabólicos, del hígado, riñon y proteínas
Neuropatía amiloide (TTR, PALB); Amiloidosis (APOA1, APP, AAA, CVAP, AD1, GSN, FGA, LYZ, TTR, PALB); Cirrosis (KRT18, KRT8, CIRH1A, NAIC, TEX292, KIAA1988); Fibrosis quística (CFTR, ABCC7, CF, MRP7); Enfermedades de almacenamiento de glucógeno (SLC2A2, GLUT2, G6PC, G6PT, G6PT1, GAA, LAMP2, LAMPB, AGL, GDE, GBE1, GYS2, PYGL, PFKM); Adenoma hepático, 142330 (TCF1, HNF1A, MODY3), Insuficiencia hepática, brote temprano y trastorno neurológico (SCOD1, SCO1), Deficiencia de lipasa hepática (LIPC), Hepatoblastoma, cáncer y carcinomas (CTNNB1, PDGFRL, PDGRL, PRLTS, AXIN1, AXIN, CTNNB1, TP53, P53, LFS1, IGF2R, MPRI, MET, CASP8, MCH5; Enfermedad de riñón quístico medular (UMOD, HNFJ, FJHN, MCKD2, ADMCKD2); fenilcetonuria (PAH, PKU1, QDPR, DHPR, PTS); Riñón poliquístico y enfermedad hepática (FCYT, PKHD 1, ARPKD, PKD 1, PKD2, PKD4, PKDTS, PRKCSH, G19P1, PCLD, SEC63).
imagen144
imagen145
Enfermedades y trastornos Musculares/ del Esqueleto
Distrofia muscular de Becker (DMD, BMD, MYF6), Distrofia muscular de Duchenne (DMD, BMD); Distrofia muscular de Emery-Dreifuss (LMNA, LMN1, EMD2, FPLD, CMD1A, HGPS, LGMD1B, LMNA, LMN1, EMD2, FPLD, CMD1A); Distrofia muscular facioescapulohumeral (FSHMD1A, FSHD1A); Distrofia muscular (FKRP, MDC1C, LGMD2I, LAMA2, LAMM, LARGE, KIAA0609, MDC1D, FCMD, TTID, MYOT, CAPN3, CANP3, DYSF, LGMD2B, SGCG, LGMD2C, DMDA1, SCG3, SGCA, ADL, DAG2, LGMD2D, DMDA2, SGCB, LGMD2E, SGCD, SGD, LGMD2F, CMD1L, TCAP, LGMD2G,
imagen146
CMD1N, TRIM32, HT2A, LGMD2H, FKRP, MDC1C, LGMD2I, TTN, CMD1G, TMD, LGMD2J, POMT 1, CAV3, LGMD1C, SEPN 1, SELN, RSMD1, PLEC1, PLTN, EBS1); Osteopetrosis (LRP5, BMND1, LRP7, LR3, OPPG, VBCH2, CLCN7, CLC7, OPTA2, OSTM1, GL, TCIRG1, TIRC7, OC116, OPTB1); Atrofia muscular (VAPB, VAPC, ALS8, SMN1, SMA1, SMA2, SMA3, SMA4, BSCL2, SPG17, GARS, SMAD1, CMT2D, HEXB, IGHMBP2, SMUBP2, CATF1, SMARD1).
imagen147
imagen148
Enfermedades y trastornos neurológicos y neuronales
ALS (SOD1, ALS2, STEX, FUS, TARDBP, VEGF (VEGF-a, VEGF-b, VEGF-c); enfermedad de Alzheimer (APP, AAA, CVAP, AD1, APOE, AD2, PSEN2, AD4, STM2, APBB2, FE65L1, NOS3, PLAU, URK, ACE, DCP 1, ACE 1, MPO, PACIP 1, PAXIP1L, PTIP, A2M, BLMH, BMH, PSEN1, AD3); Autismo (Mecp2, BZRAP1, MDGA2, Sema5A, Neurexina 1, GLO1, MECP2, RTT, PPMX, MRX16, MRX79, NLGN3, NLGN4, KIAA1260, AUTSX2); Síndrome X frágil (FMR2, FXR1, FXR2, mGLUR55); Enfermedad y trastornos tipo enfermedad de Huntington (HD, IT 15, PRNP, PRIP, JPH3, JP3, HDL2, TBP, SCA17); Enfermedad de Parkinson (NR4A2, NURR1, NOT, TINUR, SNCAIP, TBP, SCA17, SNCA, NACP, PARK1, PARK4, DJ1, PARK7, LRRK2, PARK8, PINK1, PARK6, UCHL1, PARK5, SNCA, NACP, PARK1, PARK4, PRKN, PARK2, PDJ, DBH, NDUFV2); Síndrome de Rett (MECP2, RTT, PPMX, MRX16, MRX79, CDKL5, STK9, MECP2, RTT, PPMX, MRX16, MRX79, x-Sinucleína, DJ-1); Esquizofrenia (Neuregulina1 (Nrg1), Erb4 (receptor para Neuregulina), Complexina1 (Cplx1), Tph1 Triptófano hidroxilasa, Tph2, Triptófano hidroxilasa 2, Neurexina 1, GSK3, GSK3a, GSK3b, 5-HTT (Slc6a4), COMT, DRD (Drd1a), SLC6A3, DAOA, DTNBP1, Dao (Dao1)); Trastornos relacionados con secretasa (APH-1 (alfa y beta), Presenilina (Psen1), nicastrina, (Ncstn), PEN-2, Nos1, Parp1, Nat1, Nat2); Trastornos de la repetición de trinucleótidos (HTT (Enfermedad de Huntington), SBMA/SMAX1/AR (Enfermedad de Kennedy), FXN/X25 (Ataxia de Friedrich), ATX3 (Enfermedad de Machado-Joseph), ATXN1 y ATXN2 (ataxias espinocerebelares), DMPK (distrofia miotónica), Atrofina-1 y Atn1 (DRPLA Dx), CBP (Creb-BP – inestabilidad global), VLDLR (Alzheimer), Atxn7, Atxn10).
imagen149
imagen150
Enfermedades y trastornos oculares
Degeneración macular relacionada con la edad (Abcr, Cc12, Cc2, cp (ceruloplasmina), Timp3, catepsinaD, Vldlr, Ccr2); Cataratas (CRYAA, CRYA1, CRYBB2, CRYB2, PITX3, BFSP2, CP49, CP47, CRYAA, CRYA1, PAX6, AN2, MGDA, CRYBA1, CRYB1, CRYGC, CRYG3, CCL, LIM2, MP19, CRYGD, CRYG4, BFSP2, CP49, CP47, HSF4, CTM, HSF4, CTM, MIP, AQP0, CRYAB, CRYA2, CTPP2, CRYBB1, CRYGD, CRYG4, CRYBB2, CRYB2, CRYGC, CRYG3, CCL, CRYAA, CRYA1, GJA8, CX50, CAE1, GJA3, CX46, CZP3, CAE3, CCM1, CAM, KRIT1); Opacidad y distrofia de la córnea (APOA1, TGFBI, CSD2, CDGG1, CSD, BIGH3, CDG2, TACSTD2, TROP2, M1S1, VSX1, RINX, PPCD, PPD, KTCN, COL8A2, FECD, PPCD2, PIP5K3, CFD); Córnea plana congénita (KERA, CNA2); Glaucoma (MYOC, TIGR, GLC1A, JOAG, GPOA, OPTN, GLC1E, FIP2, HYPL, NRP, CYP1B1, GLC3A, OPA1, NTG, NPG, CYP1B1, GLC3A); Amaurosis congénita del hígado (CRB1, RP 12, CRX, CORD2, CRD, RPGRIP 1, LCA6, CORD9, RPE65, RP20, AIPL1, LCA4, GUCY2D, GUC2D, LCA1, CORD6, RDH12, LCA3); Distrofia macular (ELOVL4, ADMD, STGD2, STGD3, RDS, RP7, PRPH2, PRPH, AVMD, AOFMD, VMD2).
Tabla C:
FUNCIÓN CELULAR
GENES
Señalización PI3K/AKT
PRKCE; ITGAM; ITGA5; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2;
imagen151
PTEN; EIF4E; PRKCZ; GRK6; MAPK1; TSC1; PLK1;
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen152
AKT2; IKBKB; PIK3CA; CDK8; CDKN1B; NFKB2; BCL2;
imagen153
PIK3CB; FPP2R1A; MAPK8; BCL2L1; MAPK3; TSC2;
imagen154
ITGA1; KRAS; EIF4EBP1; RELA; PRKCD; NOS3;
imagen155
IPRKAA1; MAPK9; CDK2; PPP2CA; PIM1; ITGB7;
imagen156
YWHAZ; ILK; TP53; RAF1; IKBKG; RELB; DYRK1A;
imagen157
CDKN1A; ITGB1; MAP2K2; JAK1; AKT1; JAK2; PIK3R1;
imagen158
CHUK; PDPK1; PPP2R5C; CTNNB1; MAP2K1; NFKB1;
imagen159
PAK3; ITGB3; CCND1; GSK3A; FRAP1; SFN; ITGA2;
imagen160
TTK; CSNK1A1; BRAF; GSK3B; AKT3; FOXO1; SGK;
imagen161
HSP90AA1; RPS6KB1
Señalización ERK/MAPK
PRKCE; ITGAM; ITGA5; HSPB1; IRAK1; PRKAA2;
imagen162
EIF2AK2; RAC1; RAP1A; TLN1; EIF4E; ELK1; GRK6;
imagen163
MAPK1; RAC2; PLK1; AKT2; PIK3CA; CDK8; CREB1;
imagen164
PRKCI; PTK2; FOS; RPS6KA4; PIK3CB; PPP2R1A;
imagen165
PIK3C3; MAPK8; MAPK3; ITGA1; ETS1; KRAS; MYCN;
imagen166
EIF4EBP1; PPARG; PRKCD; PRKAA1; MAPK9; SRC;
imagen167
CDK2; PPP2CA; PIM1; PIK3C2A; ITGB7; YWHAZ;
imagen168
PPP1CC; KSR1; PXN; RAF1; FYN; DYRK1A; ITGB1;
imagen169
MAP2K2; PAK4; PIK3R1; STAT3; PPP2R5C; MAP2K1;
imagen170
PAK3; ITGB3; ESR1; ITGA2; MYC; TTK; CSNK1A1;
imagen171
CRKL; BRAF; ATF4; PRKCA; SRF; STAT1; SGK
Señalización del Receptor de Glucocorticoides
RAC1; TAF4B; EP300; SMAD2; TRAF6; PCAF; ELK1;
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen172
MAPK1; SMAD3; AKT2; IKBKB; NCOR2; UBE2I;
imagen173
PIK3CA; CREB1; FOS; HSPA5; NFKB2; BCL2;
imagen174
MAP3K14; STAT5B; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; BCL2L1;
imagen175
MAPK3; TSC22D3; MAPK10; NRIP1; KRAS; MAPK13;
imagen176
RELA; STAT5A; MAPK9; NOS2A; PBX1; NR3C1;
imagen177
PIK3C2A; CDKN1C; TRAF2; SERPINA1; NCOA3;
imagen178
MAPK14; TNF; RAF1; IKBKG; MAP3K7; CREBBP;
imagen179
CDKN1A; MAP2K2; JAK1; IL8; NCOA2; AKT1; JAK2;
imagen180
PIK3R1; CHUK; STAT3; MAP2K1; NFKB1; TGFBR1;
imagen181
ESR1; SMAD4; CEBPB; JUN; AR; AKT3; CCL2; MMP1;
imagen182
STAT1; IL6; HSP90AA1
Señalización de Guía Axonal
PRKCE; ITGAM; ROCK1; ITGA5; CXCR4; ADAM12;
imagen183
IGF 1; RAC 1; RAP1A; EIF4E; PRKCZ; NRP 1; NTRK2;
imagen184
ARHGEF7; SMO; ROCK2; MAPK1; PGF; RAC2;
imagen185
PTPN11; GNAS; AKT2; PIK3CA; ERBB2; PRKCI; PTK2;
imagen186
CFL1; GNAQ; PIK3CB; CXCL12; PIK3C3; WNT11;
imagen187
PRKD1; GNB2L1; ABL1; MAPK3; ITGA1; KRAS; RHOA;
imagen188
PRKCD; PIK3C2A; ITGB7; GLI2; PXN; VASP; RAF1;
imagen189
FYN; ITGB1; MAP2K2; PAK4; ADAM17; AKT1; PIK3R1;
imagen190
GLI1; WNT5A; ADAM10; MAP2K1; PAK3; ITGB3;
imagen191
CDC42; VEGFA; ITGA2; EPHA8; CRKL; RND1; GSK3B;
imagen192
AKT3; PRKCA
FUNCIÓN CELULAR
GENES
Señalización del Receptor Efrina
PRKCE; ITGAM; ROCK1; ITGA5; CXCR4; IRAK1;
imagen193
PRKAA2; EIF2AK2; RAC1; RAP1A; GRK6; ROCK2;
imagen194
MAPK1; PGF; RAC2; PTPN11; GNAS; PLK1; AKT2;
imagen195
DOK1; CDK8; CREB1; PTK2; CFL1; GNAQ; MAP3K14;
imagen196
CXCL12; MAPK8; GNB2L1; ABL1; MAPK3; ITGA1;
imagen197
KRAS; RHOA; PRKCD; PRKAA1; MAPK9; SRC; CDK2;
imagen198
PIM1; ITGB7; PXN; RAF1; FYN; DYRK1A; ITGB1;
imagen199
MAP2K2; PAK4; AKT1; JAK2; STAT3; ADAM10;
imagen200
MAP2K1; PAK3; ITGB3; CDC42; VEGFA; ITGA2;
imagen201
EPHA8; TTK; CSNK1A1; CRKL; BRAF; PTPN13; ATF4;
imagen202
AKT3; SGK
Señalización del Citoesqueleto de Actina
ACTN4; PRKCE; ITGAM; ROCK1; ITGA5; IRAK1;
imagen203
IPRKAA2; FIF2AK2; RAC1; INS; ARHGEF7; GRK6;
imagen204
ROCK2; MAPK1; RAC2; PLK1; AKT2; PIK3CA; CDK8;
imagen205
PTK2; CFL1; PIK3CB; MYH9; DIAPH1; PIK3C3; MAPK8;
imagen206
F2R; MAPK3; SLC9A1; 1TGA1; KRAS; RHOA; PRKCD;
imagen207
PRKAA1; MAPK9; CDK2; PIM1; PIK3C2A; ITGB7;
imagen208
PPP1CC; PXN; VIL2; RAF 1; GSN; DYRK1A; ITGB 1;
imagen209
MAP2K2; PAK4; PIP5K1A; PIK3R1; MAP2K1; PAK3;
imagen210
ITGB3; CDC42; APC; ITGA2; TTK; CSNK1A1; CRKL;
imagen211
BRAF; VAV3; SGK
Señalización de la Enfermedad de Huntington
PRKCE; IGF1; EP300; RCOR1; PRKCZ; HDAC4; TGM2;
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen212
MAPK1; CAPNS1; AKT2; EGFR; NCOR2; SP1; CAPN2;
imagen213
PIK3CA; HDAC5; CREB1; PRKCI; HSPA5; REST;
imagen214
GNAQ; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; IGF1R; PRKD1;
imagen215
GNB2L1; BCL2L1; CAPN1; MAPK3; CLASP8; HDAC2;
imagen216
HDAC7A; PRKCD; HDAC11; MAPK9; HDAC9; PIK3C2A;
imagen217
HDAC3; TP53; CASP9; CREBBP; AKT1; PIK3R1;
imagen218
PDPK1; CASP1; APAF1; FRAP1; CASP2; JUN; BAX;
imagen219
ATF4; AKT3; PRKCA; CLTC; SGK; HDAC6; CASP3
Señalización de la Apoptosis
PRKCE; ROCK1; BID; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2; BAK1;
imagen220
BIRC4; GRK6; MAPK1; CAPNS1; PLK1; AKT2; IKBKB;
imagen221
CAPN2; CDK8; FAS; NFKB2; BCL2; MAP3K14; MAPK8;
imagen222
BCL2L1; CAPN1; MAPK3; CASP8; KRAS; RELA;
imagen223
PRKCD; PRKAA1; MAPK9; CDK2; PIM1; TP53; TNF;
imagen224
RAF1; IKBKG; RELB; CASP9; DYRK1A; MAP2K2;
imagen225
CHUK; APAF1; MAP2K1; NFKB1; PAK3; LMNA; CASP2;
imagen226
BIRC2; TTK; CSNK1A1; BRAF; BAX; PRKCA; SGK;
imagen227
CASP3; BIRC3; CARP1
Señalización del Receptor de Células B
RAC1; PTEN; LYN; ELK1; MAPK1; RAC2; PTPN11;
imagen228
AKT2; IKBKB; PIK3CA; CREB1; SYK; NFKB2; CAMK2A;
imagen229
IMAP3K14; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; BCL2L1; ABL1;
imagen230
MAPK3; ETS1; KRAS; MAPK13; RELA; PTPN6; MAPK9;
imagen231
EGR1; PIK3C2A; BTK; MAPK14; RAF1; IKBKG; RELB;
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen232
MAP3K7; MAP2K2; AKT1; PIK3R1; CHUK; MAP2K1;
imagen233
NFKB1; CDC42; GSK3A; FRAP1; BCL6; BCL10; JUN;
imagen234
GSK3B; ATF4; AKT3; VAV3; RPS6KB1
Señalización de la Extravasación de Leucocitos
ACTN4; CD44; PRKCE; ITGAM; ROCK1; CXCR4; CYBA;
imagen235
RAC1; RAP1A; PRKCZ; ROCK2; RAC2; PTPN11;
imagen236
MMP14; PIK3CA; PRKCI; PTK2; PIK3CB; CXCL12;
imagen237
P1K3C3; MAPK; PRKD1; ABL1; MAPK10; CYBB;
imagen238
MAPK13; RHOA; PRKCD; MAPK9; SRC; PIK3C2A; BTK;
imagen239
MAPK14; NOX1; PXN; VIL2; VASP; ITGB1; MAP2K2;
imagen240
CTNND1; PIK3R1; CTNNB1; CLDN1; CDC42; F11R; ITK;
imagen241
CRKL; VAV3; CTTN; PRKCA; MMP1; MUMP9
Señalización de Integrina
ACTN4; ITGAM; ROCK1; ITGA5; RAC1; PTEN; RAP1A;
imagen242
IRLN1; ARHGEF7; MAPK1; RAC2; CAPNS1; AKT2;
imagen243
CAPN2; PIK3CA; PTK2; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;
imagen244
CAV1; CAPN1; ABL1; MAPK3; ITGA1; KRAS; RHOA;
imagen245
SRC; PIK3C2A; ITGB7; PPP1CC; ILK; PXN; VASP;
imagen246
RAF1; FYN; ITGB1; MAP2K2; PAK4; AKT1; PIK3R1;
imagen247
TNK2; MAP2K1; PAK3; ITGB3; CDC42; RND3; ITGA2;
imagen248
CRKL; BRAF; GSK3B; AKT3
Señalización de la Respuesta de Fase Aguda
IRAK1; SOD2; MYD88; TRAF6; ELK1; MAPK1; PTPN11;
imagen249
AKT2; IKBKB; PIK3GA; FOS; NFKB2; MAP3K14;
imagen250
PIK3CB; MAPK8; RIPK1; MAPK3; IL6ST; KRAS;
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen251
MAPK13; IL6R; RELA; SOCS1; MAPK9; FTL; NR3C1;
imagen252
TRAF2; SERPINE1; MAPK14; TNF; RAF1; PDK1;
imagen253
IKBKG; RELB; MAP3K7; MAP2K2; AKT1; JAK2; PIK3R1;
imagen254
CHUK; STAT3; MAP2K1; NFKB1; FRAP1; CEBPB; JUN;
imagen255
AKT3; IL 1R1; IL6
Señalización de PTEN
ITGAM; ITGA5; RAC1; PTEN; PRKCZ; BCL2L11;
imagen256
MAPK1; RAC2; AKT2; EGFR; IKBKB; CBL; PIK3CA;
imagen257
CDKN1B; PTK2; NFKB2; BCL2; PIK3CB; BCL2L1;
imagen258
MAPK3; ITGA1; KRAS; ITGB7; ILK; PDGFRB; INSR;
imagen259
RAF1; IKBKG; CASP9; CDKN1A; ITGB1; MAP2K2;
imagen260
AKT1; PIK3R1; CHUK; PDGFRA; PDPK1; MAP2K1;
imagen261
NFKB1; ITGB3; CDC42; CCND1; GSK3A; ITGA2;
imagen262
GSK3B; AKT3; FOXO1; CLASP3; RPS6KB1
Señalización de p53
PTEN; EP300; BBC3; PCAF; FASN; BRCA1; GADD45A;
imagen263
BIRC5; AKT2; PIK3CA; CHEK1; TP53INP1; BCL2;
imagen264
PIK3CB; PIQC3C3; MAPK8; THBS1; ATR; BCL2L1; E2F1;
imagen265
PMAIP 1; CHEK2; TNFRSF10B; TP73; RB1; HDAC9;
imagen266
CDK2; PIK3C2A; MAPK14; TP53; LRDD; CDKN1A;
imagen267
HIPK2; AKT1; PIK3R1; RRM2B; APAF1; CTNNB1;
imagen268
SIRT1; CCND1; PRKDC; ATM; SFN; CDKN2A; JUN;
imagen269
SNAI2; GSK3B; BAX; AKT3
Señalización del Receptor de Aril Hidrocarbono
HSPB1; EP300; FASN; TGM2; RXRA; MAPK1; NQO1;
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen270
NCOR2; SP1; ARNT; CDKN1B; FOS; CHEK1;
imagen271
SMARCA4; NFKB2; MAPK8; ALDH1A1; ATR; E2F1;
imagen272
MAPK3; NRIP1; CHEK2; RELA; TP73; GSTP1; RB1;
imagen273
SRC; CDK2; AHR; NFE2L2; NCOA3; TP53; TNF;
imagen274
CDKN1A; NCOA2; APAF1; NFKB1; CCND1; ATM; ESR1;
imagen275
CDKN2A; MYC; JUN; ESR2; BAX; IL6; CYP1B1;
imagen276
HSP90AA1
Señalización del Metabolismo Xenobiótico
PRKCE; EP300; PRKCZ; RXRA; MAPK1; NQO1;
imagen277
NCOR2; PIK3CA; ARNT; PRKCI; NFKB2; CAMK2A;
imagen278
PIK3CB; PPP2R1A; PIK3C3; MAPK8; PRKD1;
imagen279
ALDH1A1; MAPK3; NRIP1; KRAS; MAPK13; PRKCD;
imagen280
GSTP1; MAPK9; NOS2A; ABCB1; AHR; PPP2CA; FTL;
imagen281
NFE2L2; PIK3C2A; PPARGC1A; MAPK14; TNF; RAF1;
imagen282
CREBBP; MAP2K2; PIK3R1; PPP2R5C; MAP2K1;
imagen283
NFKB 1; KEAP 1; PRKCA; EIF2AK3; IL6; CYP1B1;
imagen284
HSP94AA1
Señalización de SAPK/JNK
PRKCE; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2; RAC1; ELK1;
imagen285
GRK6; MAPK1; GADD45A; RAC2; PLK1; AKT2; PIK3CA;
imagen286
FADD; CDK8; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; RIPS1;
imagen287
GNB2L1; IRS1; MAPK3; MAPK10; DAXX; KRAS;
imagen288
PRKCD; PRKAA1; MAPK9; CDK2; PIM1; PIK3C2A;
imagen289
TRAF2; TP53; LCK; MAP3K7; DYRK1A; MAP2K2;
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen290
PIK3R1; MAP2K1; PAK3; CDC42; JUN; TTK; CSNK1A1;
imagen291
CRKL; BRAF; SGK
Señalización de PPAr/RXR
PRKAA2; EP300; INS; SMAD2; TRAF6; PPARA; FASN;
imagen292
RXRA; MAPK1; SAD3; GNAS; IKBKB; NCOR2;
imagen293
ABCA1; GNAQ; NFKB2; MAP3K14; STAT5B; MAPK8;
imagen294
IRS1; MAPK3; KRAS; RELA; PRKAA1; PPARGC1A;
imagen295
NCOA3; MAPK14; INSR; RAF1; IKBKG; RELB; MAP3K7;
imagen296
CREBBP; MAP2K2; JAK2; CHUK; MAP2K1; NFKB1;
imagen297
TGFBR1; SMAD4; JUN; IL1R1; PRKCA; IL6; HSP90AA1;
imagen298
ADIPOQ
Señalización de NF-KB
IRAK1; EIF2AK2; EP300; INS; MYD88; PRKCZ; TRAY6;
imagen299
TBKL1; AKT2; EGFR; IKBKB; PIK3CA; BTRC; NFKB2;
imagen300
MAP3K14; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; RIPK1; HDAC2;
imagen301
KRAS; RELA; PIK3C2A; TRAF2; TLR4; PDGFRB; TNF;
imagen302
INSR; LCK; IKBKG; RELB; MAP3K7; CREBBP; AKT1;
imagen303
PIK3R1; CHUK; PDGFRA; NFKB1; TLR2; BCL10;
imagen304
GSK3B; AKT3; TNFAIP3; IL 1R1
Señalización de Neuregulina
ERBB4; PRKCE; ITGAM; ITGA5; PTEN; PRKCZ; ELK1;
imagen305
MAPK1; PTPN11; AKT2; EGFR; ERBB2; PRKCI;
imagen306
CDKN1B; STAT5B; PRKD1; MAPK3; ITGA1; KRAS;
imagen307
PRKCD; STAT5A; SRC; ITGB7; RAF1; ITGB1; MAP2K2;
imagen308
ADAM17; AKT1; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1; ITGB3;
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen309
EREG; FRAP1; PSEN1; ITGA2; MYC; NRG1; CRKL;
imagen310
AKT3; PRKCA; HSP90AA1; RPS6KB1
Señalización de Wnt y Beta catenina
CD44; EP300; LRP6; DVL3; CSNK1E; GJA1; SMO;
imagen311
AKT2; PIN1; CDH1; BTRC; GNAQ; MARK2; PPP2R1A;
imagen312
WNT11; SRC; DKK1; PPP2CA; SOX6; SFRP2; ILK;
imagen313
LEF1; SOX9; TP53; MAP3K7; CREBBP; TCF7L2; AKT1;
imagen314
PPP2R5C; WNT5A; LRP5; CTNNB1; TGFBR1; CCND1;
imagen315
GSK3A; DVL1; APC; CDKN2A; MYC; CSNK1A1; GSK3B;
imagen316
AKT3; SOX2
Señalización del Receptor de Insulina
PTEN; INS; EIF4E; PTPN1; PRKCZ; MAPK1; TSC1;
imagen317
PTPN11; AKT2; CBL; PIK3CA; PRKCI; PIK3CB; PIK3C3;
imagen318
MAPK8; IRS1; MAPK3; TSC2; KRAS; EIF4EBP1;
imagen319
SLC2A4; PIK3C2A; PPP1CC; INSR; RAF1; FYN;
imagen320
AP2K2; JAK1; AKT1; JAK2; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1;
imagen321
GSK3A; FRAP1; CRKL; GSK3B; AKT3; FOXO1; SGK;
imagen322
RPS6KB1
Señalización de IL-6
HSPB1; TRAF6; MAPKAPK2; ELK1; MAPK1; PTPN11;
imagen323
IKBKB; FOS; NFKB2; MAP3K14; MAPK8; MAPK3;
imagen324
MAPK10; IL6ST; KRAS; MAPK13; IL6R; RELA; SOCS1;
imagen325
MAPK9; ABCB1; TRAF2; MAPK14; TNF; RAF1; IKBKG;
imagen326
RELB; MAP3K7; MAP2K2; IL8; JAK2; CHUK; STAT3;
imagen327
MAP2K1; NFKB1; CEBPB; JUN; IL1R1; SRF; IL6
FUNCIÓN CELULAR
GENES
Colestasis Hepática
PRKCE; IRAK1; INS; MYD88; PRKCZ; TRAF6; PPARA;
imagen328
RXRA; IKBKB; PRKCI; NFKB2; MAP3K14; MAPK8;
imagen329
PRKD1; MAPK10; RELA; PRKCD; MAPK9; ABC1;
imagen330
TRAF2; TLR4; TNF; INSR; IKBKG; RELB; MAP3K7; IL8;
imagen331
CHUK; NR1H2; TJP2; NFKB1; ESR1; SREBF1; FGFR4;
imagen332
JUN; IL1R1; PRKCA; IL6
Señalización de IGF-1
IGF1; PRKCZ; ELK1; MAPK1; PTPN11; NEDD4; AKT2;
imagen333
PIK3CA; PRKCI; PTK2; FOS; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;
imagen334
IGF1R; IRS1; MAPK3; IGFBP7; KRAS; PIK3C2A;
imagen335
YWHAZ; PXN; RAF1; CASP9; MAP2K2; AKT1; PIK3R1;
imagen336
PDPK1; MAP2K1; IGFBP2; SFN; JUN; CYR61; AKT3;
imagen337
FOXO1; SRF; CTGF; RPS6KB1
Respuesta de Estrés Oxidativo mediada por NRF2
PRKCE; EP300; SOD2; PRKCZ; MAPK1; SQSTM1;
imagen338
NQO1; PIK3CA; PRKCI; FOS; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;
imagen339
PRKD1; MAPK3; KRAS; PRKCD; GSTP1; MAPK9; FTL;
imagen340
NFE2L2; PIK3C2A; MAPK14; RAF1; MAP3K7; CREBBP;
imagen341
MAP2K2; AKT1; PIK3R1; MAP2K1; PPIB; JUN; KEAP1;
imagen342
GSK3B; ATF4; PRKCA; EIF2AK3; HSP90AA1
Fibrosis Hepática/Activación de Células Estelares
EDN1; IGF1; KDR; FLT1; SMAD2; FGFR1; MET; PGF;
imagen343
SMAD3; EGFR; FAS; CSF1; NFKB2; BCL2; MYH9;
imagen344
IGF1R; IL6R; RELA; TLR4; PDGFRB; TNF; RELB; IL8;
imagen345
PDGFRA; NFKB1; TGFBR1; SMAD4; VEGFA; BAX;
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen346
IL1R1; CCL2; HGF; MMP1; STAT1; IL6; CTGF; MMP9
Señalización de PPAR
EP300; INS; TRAF6; PPARA; RXRA; MAPK1; IKBKB;
imagen347
NCOR2; FOS; NFKB2; MAP3K14; STAT5B; MAPK3;
imagen348
NRIP1; KRAS; PPARG; RELA; STAT5A; TRAF2;
imagen349
PPARGC1A; PDGFRB; TNF; INSR; RAF1; IKBKG;
imagen350
RELB; MAP3K7; CREBBP; MAP2K2; CHUK; PDGFRA;
imagen351
MAP2K1; NFKB1; JUN; IL1R1; HSP90AA1
Señalización de Fc Epsilon RI
PRKCE; RAC1; PRKCZ; LYN; MAPK1; RAC2; PTPN11;
imagen352
AKT2; PIK3CA; SYK; PRKCI; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;
imagen353
PRKD1; MAPK3; MAPK10; KRAS; MAPK13; PRKCD;
imagen354
MAPK9; PIK3C2A; BTK; MAPK14; TNF; RAF1; FYN;
imagen355
MAP2K2; AKT1; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1; AKT3;
imagen356
VAV3; PRKCA
Señalización del Receptor Acoplado a Proteína G
PRKCE; RAP1A; RGS16; MAPK1; GNAS; AKT2; IKBKB;
imagen357
PIK3CA; CREB1; GNAQ; NFKB2; CAMK2A; PIK3CB;
imagen358
PIK3C3; MAPK3; KRAS; RELA; SRC; PIK3C2A; RAF1;
imagen359
IKBKG; REB; FYN; MAP2K2; AKT1; PIK3R1; CHUK;
imagen360
PDPK1; STAT3; MAP2K1; NFKB1; BRAF; ATF4; AKT3;
imagen361
PRKCA
Metabolismo de Inositol Fosfato
PRKCE; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2; PTEN; GRK6;
imagen362
MAPK8; PLK1; AKT2; PIK3CA; CDK8; PIK3CB; PIK3C3;
MAPK8
MAPK8; MAPK3; PRKCD; PRKAA1; MAPK9; CDK2;
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen363
PIM1; PIK3G2A; DYRK1A; MAP2K2; PIP5KlA; PIK3R1;
imagen364
MAP2K1; PAK3; ATM; TTK; CSNK1A1; BRAF; SGK
Señalización de PDGF
EIF2AK2; ELK1; ABL2; MAPK1; PIK3CA; FOS; PIK3CB;
imagen365
PIK3C3; MAPK8; CAV1; ABL1; MAPK3; KRAS; SRC;
imagen366
PIK3C2A; PDGFRB; RAF1; MAP2K2; JAK1; JAK2;
imagen367
PIK3R1; PDGFRA; STAT3; SPHK1; MAP2K1; MYC;
imagen368
JUN; CRKL; PRKCA; SRF; STAT1; SPHK2
Señalización de VEGF
ACTN4; ROCK1; KDR; FLT1; ROCK2; MAPK1; PGF;
imagen369
AKT2; PIK3CA; ARNT; PTK2; BCL2; PIK3CB; PIK3C3;
imagen370
BCL2L1; MAPK3; KRAS; HIF1A; NOS3; PIK3C2A; PXN;
imagen371
RAF1; MAP2K2; ELAVL1; AKT1; PIK3R1; MAP2K1; SFN;
imagen372
VEGFA; AKT3; FOXO1; PRKCA
Señalización de Células Asesinas Naturales
PRKCE; RAC1; PRKCZ; MAPK1; RAC2; PTPN11;
imagen373
KIR2DL3; AKT2; PIK3CA; SYK; PRKCI; PIK3CB;
imagen374
PIK3C3; PRKD1; MAPK3; KRAS; PRKCD; PTPN6;
imagen375
P1K3C2A; LCK; RAF1; FYN; MAP2K2; PAK4; AKT1;
imagen376
PIK3R1; MAP2K1; PAK3; AKT3; VAV3; PRKCA
Ciclo Celular: GI/S
HDAC4; SMAD3; SUV39H1; HDAC5; CDKN1B; BTRC;
Regulación del punto de verificación
ATR; ABL1; E2F1; HDAC2; HDAC7A; RB1; HDAC11;
imagen377
HDAC9; CDK2; E2F2; HDAC3; TP53; CDKN1A; CCND1;
imagen378
E2F4; ATM; RBL2; SMAD4; CDKN2A; MYC; NRG1;
imagen379
IGSK3B; RBL1; HDAC6
FUNCIÓN CELULAR
GENES
Señalización del Receptor de Células T
RAC1; ELK1; MAPK1; IKBKB; CBL; PIK3CA; FOS;
imagen380
NFKB2; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; MAPK3; KRAS;
imagen381
RELA; PIK3C2A; BTK; LCK; RAF1; IKBKG; RELB; FYN;
imagen382
MAP2K2; PIK3R1; CHUK; MAP2K1; NFKB1; ITK; BCL10;
imagen383
JUN; VAV3
Señalización del Receptor de Muerte
CRADD; HSPB1; BID; BIRC4; TBK1; IKBKB; FADD;
imagen384
FAS; NFKB2; BCL2; MAP3K14; MAPK8; RIPS1; CASP8;
imagen385
DAXX; TNFRSF10B; RELA; TRAF2; TNF; IKBKG; RELB;
imagen386
CASP9; CHUK; APAF1; NFKB1; CASP2; BIRC2; CASP3;
imagen387
BIRC3
Señalización de FGF
RAC1; FGFR1; MET; MAPKAPK2; MAPK1; PTPN11;
imagen388
AKT2; PIK3CA; CREB1; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;
imagen389
MAPK3; MAPK13; PTPN6; PIK3C2A; MAPK14; RAF1;
imagen390
AKT1; PIK3R1; STAT3; MAP2K1; FGFR4; CRKL; ATF4;
imagen391
AKT3; PRKCA; HGF
Señalización de GM-GSF
LYN; ELK1; MAPK1; PTPN11; AKT2; PIK3CA; CAMK2A;
imagen392
STAT5B; PIK3CB; PIK3C3; GNB2L1; BCL2L1; MAPK3;
imagen393
ETS1; KRAS; RUNX1; PIM1; PIK3C2A; RAF1; MAP2K2;
imagen394
AKT1; JAK2; PIK3R1; STAT3; MAP2K1; CCND1; AKT3;
imagen395
STAT1
Señalización de la Esclerosis Lateral Amiotrófica
BID; IGF1; RAC1; BIRC4; PGF; CAPNS1; CAPN2;
imagen396
PIK3CA; BCL2; PIK3CB; PIK3C3; BCL2L1; CAPN1;
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen397
PIK3C2A; TP53; CASP9; PIK3R1; RAB5A; CASP1;
imagen398
APAF1; VEGF; BIRC2; BAX; AKT3; CASP3; BIRC3
Señalización de JAK/Stat
PTPN1; MAPK1; PTPN11; AKT2; PIK3CA; STAT5B;
imagen399
PIK3CB; PIK3C3; MAPK3; KRAS; SOCS1; STAT5A;
imagen400
PTPN6; PIK3C2A; RAF1; CDKN1A; MAP2K2; JAK1;
imagen401
AKT1; JAK2; PIK3R1; STAT3; MAP2K1; FRAP1; AKT3;
imagen402
STAT1
Metabolismo de Nicotinato y Nicotinamida
PRKCE; IRAK; PRKAA2; EIF2AK2; GRK6; MAPK1;
imagen403
PLK1; AKT2; CDK8; MAPK8; MAPK3; PRKCD; PRKAA1;
imagen404
PBEF1; MAPK9; CDK2; PIM1; DYRK1A; MAP2K2;
imagen405
MAF2K1; PAK3; NT5E; TTK; CSNK1A1; BRAF; SGK
Señalización de Quimioquinas
CXCR4; ROCK2; MAPS1; PTK2; FOS; CFL1; GNAQ;
imagen406
CAMK2A; CXCL12; MAPK8; MAPK3; KRAS; MAPK13;
imagen407
RHOA; CCR3; SRC; PPP1CC; MAPK14; NOX1; RAF1;
imagen408
MAP2K2; MAP2K1; JUN; CCL2; PRKCA
Señalización de IL-2
ELK1; MAPK1; PTPN11; AKT2; PIK3CA; SYK; FOS;
imagen409
STAT5B; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; MAPK3; KRAS;
imagen410
SOCS1; STAT5A; PIK3C2A; LCK; RAF1; MAP2K2;
imagen411
JAK1; AKT1; PIK3R1; MAP2K1; JUN; AKT3
Depresión Sináptica a Largo Plazo
PRKCE; IGF1; PRKCZ; PRDX6; LYN; MAPK1; GNAS;
imagen412
PRKCI; GNAQ; PPP2R1A; IGF1R; PRKD1; MAPK3;
imagen413
KRAS; GRN; PRKCD; NOS3; NOS2A; PPP2CA;
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen414
YWHAZ; RAF1; MAP2K2; PPP2R5C; MAP2K1; PRKCA
Señalización del Receptor de Estrógenos
TAF4B; EP300; CARM1; PCAF; MAPK1; NCOR2;
imagen415
SMARCA4; MAPK3; NRIP1; KRAS; SRC; NR3C1;
imagen416
HDAC3; PPARGC1A; RBM9; NCOA3; RAF1; CREBBP;
imagen417
MAP2K2; NCOA2; MAP2K1; PRKDC; ESR1; ESR2
Vía de la Ubiquitinación de Proteínas
TRAF6; SMURF1; BIRC4; BRCA1; UCHL1; NEDD4;
imagen418
CBL; UBE2I; BTRC; HSPA5; USP7; USP10; FBXW7;
imagen419
USP9X; STUB1; USP22; B2M; BIRC2; PARK2; USP8;
imagen420
USP1; VHL; HSP90AA1; BIRC3
Señalización de IL-10
TRAF6; CCR1; ELK1; IKBKB; SP1; FOS; NFKB2;
imagen421
MAP3K14; MAPK8; MAPK13; RELA; MAPK14; TNF;
imagen422
IKBKG; RELB; MAP3K7; JAK1; CHUK; STAT3; NFKB1;
imagen423
JUN; IL1R1; IL6
Activación de VDR/RXR
PRKCE; EP300; PRKCZ; RXRA; GADD45A; HES1;
imagen424
NCOR2; SP1; PRKCI; CDKN1B; PRKD1; PRKCD;
imagen425
RUNX2; KLF4; YY1; NCOA3; CDKN1A; NCOA2; SPP1;
imagen426
LRP5; CEBPB; FOXO1; PRKCA
Señalización de TGF-beta
EP300; SMAD2; SMURF1; MAPK1; SMAD3; SMAD1;
imagen427
FOS; MAPK8; MAPK3; KRAS; MAPK9; RUNX2;
imagen428
SERPINE1; RAF1; MAP3K7; CREBBP; MAP2K2;
imagen429
MAP2K1; TGEBR1; SMAD4; JUN; SMAD5
Señalización del Receptor de tipo Toll
IRAK1; EIF2AK2; MYD88; TRAF6; PPARA; ELK1;
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen430
IKBKB; FOS; NFKB2; MAP3K14; MAPK8; MAPK13;
imagen431
RELA; TLR4; MAPK14; IKBKG; RELB; MAP3K7; CHUK;
imagen432
NFKB1; TLR2; JUN
Señalización de p38 MAPK
HSPB1; IRAK1; TRAF6; MAPKAPK2; ELK1; FADD; FAS;
imagen433
CREB1; DDIT3; RPS6KA4; DAXX; MAPK13; TRAF2;
imagen434
MAPK14; TNF; MAP3K.7; TGFBR1; MYC; ATF4; IL 1R1;
imagen435
SRF; STAT1
Señalización de Neurotrofina/TRK
NTRK2; MAPK1; PTPN11; PIK3CA; CREB1; FOS;
imagen436
PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; MAPK3; KRAS; PIK3C2A;
imagen437
RAF1; MAP2K2; AKT1; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1;
imagen438
CDC42; JUN; ATF4
Activación de FXR/RXR
INS; PPARA; FASN; RXRA; AKT2; SDC1; MAPK8;
imagen439
APOB; MAPK10; PPARG; MTTP; MAPK9; PPARGC1A;
imagen440
TNF; CREBBP; AKT1; SREBF1; FGFR4; AKT3; FOXO1
Potenciación Sináptica a Largo Plazo
PRKCE; RAP1A; EP300; PRKCZ; MAPK1; CREB1;
imagen441
PRKCI; GNAQ; CAMK2A; PRKD1; MAPK3; KRAS;
imagen442
PRKCD; PPP1CC; RAF1; CREBBP; MAP2K2; MAP2K1;
imagen443
ATF4; PRKCA
Señalización de Calcio
RAP1A; EP300; HDAC4; MAPK1; HDAC5; CREB1;
imagen444
CAMK2A; MYH9; MAPK3; HDAC2; HDAC7A; HDAC11;
imagen445
HDAC9; HDAC3; CREBBP; CALR; CAMKK2; ATF4;
imagen446
HDAC6
FUNCIÓN CELULAR
GENES
Señalización de EGF
ELK1; MAPK1; EGFR; PIK3CA; FOS; PIK3CB; PIK3C3;
imagen447
MAPK8; MAPK3; PIK3C2A; RAF1; JAK1; PIK3R1;
imagen448
STAT3; MAP2K1; JUN; PRKCA; SRF; STAT1
Señalización de Hipoxia en el
EDN1; PTEN; EP300; NQO1; UBE2I; CREB1; ARNT;
Sistema Cardiovascular
HIF1A; SLC2A4; NOS3; TP53; LDHA; AKT1; ATM;
imagen449
VEGFA; JUN; ATF4; VHL; HSP90AA1
Inhibición Mediada por LPS/IL-1
IRAK1; MYD88; TRAF6; PPARA; RXRA; ABCA1;
de la Función RXR
MAPK8; ALDH1A1; GSTP1; MAPK9; ABCB1; TRAF2;
imagen450
TLR4; TNF; MAP3K7; NR1H2; SREBF1; JUN; IL1R1
Activación de LXR/RXR
FASN; RXRA; NCOR2; ABCA1; NFKB2; IRF3; RELA;
imagen451
NOS2A; TLR4; TNF; RELB; LDLR; NR1H2; NFKB1;
imagen452
SREBF1; IL1R1; CCL2; IL6; MMP9
Procesamiento Amiloide
PRKCE; CSNK1E; MAPK1; CAPNS1; AKT2; CAPN2;
imagen453
CAPN1; MAPK3; MAPK13; MAPT; MAPK14; AKT1;
imagen454
PSEN1; CSNK1A1; GSK3B; AKT3; APP
Señalización de IL-4
AKT2; PIK3CA; PIK3CB; PIK3C3; IRS1; KRAS; SOCS1;
imagen455
PTPN6; NR3C1; PIK3C2A; JAK1; AKT1; JAK2; PIK3R1;
imagen456
FRAP1; AKT3; RPS6KB1
Ciclo Celular: G2/M Regulación del Punto
EP300; PCAF; BRCA1; GADD45A; PLK1; BTRC;
de Verificación de Daño a ADN
CHEK1; ATR; CHEK2; YWHAZ; TP53; CDKN1A;
imagen457
PRKDC; ATM; SFN; CDKN2A
Señalización de Óxido Nítrico en el
KDR; FLT1; PGF; AKT2; PIK3CA; PIK3CB; PIK3C3;
FUNCIÓN CELULAR
GENES
Sistema Cardiovascular
CAV1; PRKCD; NOS3; PIK3C2A; AKT1; PIK3R1;
imagen458
VEGFA; AKT3; HSP90AA1
Metabolismo de Purina
NME2; SMARCA4; MYH9; RRM2; ADAR; EIF2AK4;
imagen459
PKM2; ENTPD 1; RAD51; RRM2B; TJP2; RAD51C;
imagen460
NT5E; POLD1; NME1
Señalización mediada por cAMP
RAP1A; MAPK1; GNAS; CREB1; CAMK2A; MAPK3;
imagen461
SRC; RAF1; MAP2K2; STAT3; MAP2K1; BRAF; ATF4
Disfunción Mitocondrial
SOD2; MAPK8; CASP8; MAPK10; MAPK9; CASP9;
imagen462
PARK7; PSEN1; PARK2; APP; CASP3
Señalización de Notch
HES1; JAG1; NUMB; NOTCH4; ADAM17; NOTCH2;
imagen463
PSEN1; NOTCH3; NOTCH1; DLL4
Vía del Estrés del Retículo Endoplásmico
HSPA5; MAPK8; XBP1; TRAF2; ATF6; CASP9; ATF4;
imagen464
EIF2AK3; CASP3
Metabolismo de Pirimidina
NME2; AICDA; RRM2; EIF2AK4; ENTPD1; RRM2B;
imagen465
NT5E; POLD1; NME1
Señalización de Parkinson
UCHL1; MAPK8; MAPK13; MAPK14; CASP9; PARK7;
imagen466
PARK2; CASP3
Señalización Cardiaca y Beta Adrenérgica
GNAS; GNAQ; PPP2R1A; GNB2L1; PPP2CA; PPP1CC;
imagen467
PPP2R5C
Glicolisis/Gluconeogénesis
HK2; GCK; GPI; ALDH1A1; PKM2; LDHA; HK1
Señalización de Interferón
IRF1; SOCS1; JAK1; JAK2; IFITM1; STAT1; IFIT3
Señalización Sonic Hedgehog
ARRB2; SMO; GL12; DYRK1A; GLI1; GSK3B; DYRK1B
FUNCIÓN CELULAR
imagen468 GENES
Metabolismo de Glicerofosfolípidos
imagen469 PLD1; GRN; GPAM; YWHAZ; SPHK1; SPHK2
imagen470
imagen471 imagen472
Degradación de Fosfolípidos
imagen473 PRDX6; PLD1; GRN; YWHAZ; SPHK1; SPHK2
Metabolismo de triptófano
imagen474 SIAH2; PRMT5; NEDD4; ALDH1A1; CYP1B1; SIAH1
Degradación de Lisina
imagen475 SUV39H1; EHMT2; NSD1; SETD7; PPP2R5C
Vía de la Reparación de la Escisión Nucleótidos
de ERCC5; ERCC4; XPA; XPC; ERCC1
imagen476
imagen477 imagen478
Metabolismo de Almidón y Sacarosa
imagen479 UCHL1; HK2; GCK; GPI; HK1
imagen480
imagen481 imagen482
Metabolismo de Aminoazúcares
imagen483 NQO1; HK2; GCK; HK1
Metabolismo del Ácido Araquidónico
imagen484 PRDX6; GRN; YWHAZ; CYP1B1
imagen485
imagen486 imagen487
Señalización del Ritmo Circadiano
imagen488 CSNK1E; CREB1; ATF4; NR1D1
Sistema de Coagulación
imagen489 BDKRB1; F2R; SERPINE1; F3
Señalización del Receptor de Dopamina
imagen490 PPP2R1A; PPP2CA; PPP1CC; PPP2R5C
imagen491
imagen492 imagen493
Metabolismo de Glutation
imagen494 IDH2; GSTP1; ANPEP; IDH1
Metabolismo de Glicerolípidos
imagen495 ALDH1A1; GPAM; SPHK1; SPHK2
Metabolismo del Ácido Linoleico
imagen496 PRDX6; GRN; YWHAZ; CYP1B1
Metabolismo de Metionina
imagen497 DNMT1; DNMT3B; AHCY; DNMT3A
Metabolismo de Piruvato
imagen498 GLO1; ALDH1A1; PKM2; LDHA
FUNCIÓN CELULAR
GENES
Metabolismo de Arginina y Prolina
ALDH1A1; NOS3; NOS2A
imagen499
imagen500
Señalización de Eicosanoides
PRDX6; GRN; YWHAZ
Metabolismo de Fructosa y Manosa
HK2; GCK; HK1
imagen501
imagen502
Metabolismo de Galactosa
HK2; GCK; HK1
Biosíntesis de Estilbeno, Coumarina y
PRDX6; PRDX1; TYR
Lignina
imagen503
Vía de la Presentación de Antígenos
CALR; B2M
imagen504
imagen505
Biosíntesis de Esteroides
NQO1; DHCR7
Metabolismo de Butanoato
ALDH1A1; NLGN1
Ciclo del Citrato
IDH2; IDH1
Metabolismo de Ácidos Grasos
ALDH1A1; CYP1B1
Metabolismo de Glicerofosfolípidos
PRDX6; CHKA
imagen506
imagen507
Metabolismo de Histidina
PRMT5; ALDH1A1
Metabolismo de Inositol
ERO1L; APEX1
Metabolismo de Xenobióticos
GSTP1; CYP1B1
por el Citocromo p450
imagen508
Metabolismo del Metano
PRDX6; PRDX1
Metabolismo de Fenilalanina
PRDX6; PRDX1
FUNCIÓN CELULAR
GENES
Metabolismo de Propanoato
LDH1A1; LDHA
Metabolismo de Selenoaminoácido
PRMT5; AHCY
imagen509
imagen510
Metabolismo de Esfingolípidos
SPHK1; SPHK2
Metabolismo de Aminofosfonato
PRMT5
imagen511
imagen512
Metabolismo de Andrógenos y Estrógenos
PRMT5
imagen513
imagen514
Metabolismo de Ascorbato y Aldarato
ALDH1A1
imagen515
imagen516
Biosíntesis de Ácidos Biliares
ALDH1A1
Metabolismo de Cisteína
LDHA
Biosíntesis de Ácidos Grasos
FASN
Señalización del Receptor de Glutamato
GNB2L1
imagen517
imagen518
Respuesta al Estrés Oxidativo medida por NRF2
PRDX1
imagen519
imagen520
Vía del Fosfato de Pentosa
GPI
imagen521
imagen522
Interconversiones de Pentosa y Glucuronato
UCHL1
imagen523
imagen524
Metabolism de Retinol
ALDH1A1
FUNCIÓN CELULAR
GENES
Metabolismo de Riboflavina
TYR
Metabolismo de Tirosina
PRMT5, TYR
Biosíntesis de Ubiquinona
PRMT5
Degradación de Valina, Leucina e
ALDH1A1
Isoleucina
imagen525
Metabolismo de Glicina, Serina y
CHKA
Treonina
imagen526
Degradación de Lisina
ALDH1A1
Dolor/Sabor
TRPM5; TRPA1
Dolor
TRPM7; TRPC5; TRPC6; TRPC1; Cnr1; cnr2; Grk2;
imagen527
Trpa1; Pomc; Cgrp; Crf; Pka; Era; Nr2b; TRPM5; Prkaca;
imagen528
Prkacb; Prkar1a; Prkar2a
Función Mitocondrial
AIF; CytC; SMAC (Diablo); Aifm-1; Aifm-2
Neurología del desarrollo
BMP-4; Cordina (Chrd); Nogina (Nog); WNT (Wnt2;
imagen529
Wnt2b; Wnt3a; Wnt4; Wnt5a; Wnt6; Wnt7b; Wnt8b;
imagen530
Wnt9a; Wnt9b; Wnt10a; Wnt10b; Wnt16); beta-catenina;
imagen531
Dkk-1; Proteínas relacionadas con Frizzled; Otx-2; Gbx2; FGF8;
imagen532
Reelina; Dab1; unc-86 (Pou4f1 o Brn3a); Numb; Reln
Realizaciones de la invención también se refieren a métodos y composiciones relacionados con la inactivación de genes, la amplificación de genes y la reparación de mutaciones particulares asociadas con la inestabilidad en la repetición de ADN y trastornos neurológicos (Robert D. Wells, Tetsuo Ashizawa, Genetic Instabilities and Neurological Diseases, Segunda Edición, Academic Press 13 de oct. de 2011 -Medical). Se ha encontrado que 5 aspectos específicos de secuencias repetidas en tándem son los responsables de más de una veintena de enfermedades humanas (New insights into repeat instability: role of RNA•DNA hybrids. McIvor EI, Polak U, Napierala
M. RNA Biol. 2010 Sep.-Oct.;7(5):551-8). El sistema de CRISPR-Cas puede ser aprovechado para corregir estos defectos de la inestabilidad genómica.
imagen533
imagen534
Ejemplos adicionales de afecciones preferidas tratables con el presente sistema se pueden seleccionar de: Síndrome de Aicardi-Goutieres; Enfermedad de Alexander; Síndrome de Allan-Herndon-Dudley; Trastornos Relacionados con POLG; Alfa-Manosidosis (Tipos I y III); Síndrome de Alström; Síndrome de Angelman; Ataxia-Telangiectasia; Lipofuscinosis Ceroide Neuronal; Beta-Talasemia; Atrofia Óptica Bilateral y Atrofia Óptica (Infantil) 5 Tipo 1; Retinoblastoma (bilateral); Enfermedad de Canavan; Síndrome Cerebro-oculofacioesquelético 1 [COFS1]; Xantomatosis Cerebrotendinosa: Síndrome de Cornelia de Lange; Trastornos Relacionados con MAPT; Enfermedades Priónicas Genéticas; Síndrome de Dravet; Enfermedad de Alzheimer Familiar de Aparición Temprana; Ataxia de Friedreich [FRDA]; Síndrome de Fryns; Fucosidosis; Distrofia Muscular Congénita de Fukuyama; Galactosialidosis; Enfermedad de Gaucher; Acidemias Orgánicas; Linfohistiocitosis Hemofagocítica; 10 Síndrome de Progeria de Hutchinson-Gilford; Mucolipidosis II; Enfermedad de Almacenamiento de Ácido Siálico Libre Infantil; Neurodegeneración Asociada a PLA2G6; Síndrome de Jervell y Lange-Nielsen; Epidermolisis Bullosa de la Unión; Enfermedad de Huntington; Enfermedad de Krabbe (Infantil); Síndrome de Leigh y NARP asociado a ADN mitocondrial; Síndrome de Lesch-Nyhan; Lisencefalia Asociada a LIS1; Síndrome de Lowe; Enfermedad de la Orina de Jarabe de Arce; Síndrome de Duplicación de MECP2; Trastornos de Transporte de Cobre Relacionados 15 con ATP7A; Distrofia Muscular Relacionada con LAMA2; Deficiencia de Arilsulfatasa A; Mucopolisacaridosis Tipos I, II o III; Trastornos de la Biogénesis de Peroxisomas, Espectro del Síndrome de Zellweger; Neurodegeneración con Trastornos de Acumulación de Hierro en el Cerebro; Deficiencia de Esfingomielinasa Ácida; Enfermedad de Niemann-Pick Tipo C; Encefalopatía de Glicina; Trastornos Relacionados con ARX; Trastornos del Ciclo de la Urea; Osteogénesis Imperfecta Relacionada con COL1A1/2; Síndromes Mitocondriales de Deleción de ADN; Trastornos 20 relacionados con PLP1; Síndrome de Perry; Síndrome de Phelan-McDermid; Enfermedad del Almacenamiento de Glucógeno Tipo II (Enfermedad de Pompe) (Infantil); Trastornos Relacionados con MAPT; Trastornos Relacionados con MECP2; Condrodisplasia Punctata Rizomélica Tipo 1; Síndrome de Roberts; Enfermedad de Sandhoff; Enfermedad de Schindler -Tipo 1; Deficiencia de Adenosina Desaminasa; Síndrome de Smith-Lemli-Opitz; Atrofia Muscular Espinal; Ataxia Espinocerebelosa de Brote Infantil; Deficiencia de Hexosaminidasa A; Displasia
25 Tanatofórica Tipo 1; Trastornos Relacionados con Colágeno Tipo VI; Síndrome de Usher Tipo I; Distrofia Muscular Congénita; Síndrome de Wolf-Hirschhorn; Deficiencia Lisosomal de Lipasa Ácida; y Xenoderma Pigmentosum.
Como resultará evidente, se prevé que el presente sistema se pueda utilizar para fijar como objetivo a cualquier secuencia de polinucleótidos de interés. Algunos ejemplos de afecciones o enfermedades que podrían ser tratadas útilmente utilizando el presente sistema se incluyen en las Tablas anteriores y también se proporcionan allí ejemplos
30 de genes asociados actualmente con esas afecciones. Sin embargo, los genes ejemplificados no son exhaustivos.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se dan con el propósito de ilustrar diversas realizaciones de la invención.
Ejemplo 1: Mejora del sistema Cas9 para la aplicación in vivo
Las solicitantes llevarón a cabo una búsqueda metagenómica para una Cas9 con pequeño peso molecular. La
35 mayoría de los homólogos de Cas9 son bastante grandes. Muchos homólogos de Cas9 conocidos son grandes y contienen más de 1300 amino ácidos. Por ejemplo, la SpCas9 es de alrededor de 1368aa de larga, que es demasiado grande para ser empaquetada fácilmente en vectores virales para el suministro. En la Figura 6 se muestra un gráfico que representa la distribución de longitud de homólogos de Cas9: El gráfico se genera a partir de secuencias depositadas en GenBank. Algunas de las secuencias pueden haber sido anotadas erróneamente y, por
40 lo tanto, la frecuencia exacta para cada uno de los tramos no tiene que ser necesariamente fiable. No obstante, proporciona un esbozo de la distribución de proteínas Cas9 y sugiere que existen homólogos de Cas9 más cortos.
A través de análisis computacional, la solicitante encontró que en la cepa bacteriana Campylobacter existen dos proteínas Cas9 con menos de 1000 aminoácidos. La secuencia para una Cas9 de Campylobacter jejuni se presenta a continuación. En esta longitud, CjCas9 puede empaquetarse fácilmente en AAV, lentivirus, adenovirus y otros
45 vectores virales para el suministro sólido en células primarias y en modelos animales in vivo. En una realización preferida de la invención, se utiliza la proteína Cas9 de S. aureus.
Cas9 de Campylobacter jejuni (CjCas9)
imagen535
En algunas realizaciones, las secuencias de emparejamiento tracr o las repeticiones directas se descargan ya sea desde la base de datos CRISPRs o se identifican in silico mediante el rastreo de motivos repetitivos que 1. se encuentran en una ventana de 2 kb de secuencia genómica flanqueante del locus de CRISPR de tipo II, 2. abarcan de 20 a 50 pb, y 3. están separados por 20 a 50 pb. En algunas realizaciones, se pueden utilizar 2 de estos criterios, 5 por ejemplo, 1 y 2, 2 y 3, ó 1 y 3. En algunas realizaciones, se pueden utilizar los 3 criterios. En algunas realizaciones tracrRNA candidatas son predichas posteriormente predichas por 1. homología de la secuencia con repeticiones directas (rastreo de motivos en Geneious con hasta apareamientos erróneos de hasta 18 pb), 2. presencia de un terminador transcripcional independiente de Rho predicho en la dirección de la transcripción y 3. la estructura secundaria de horquilla estable entre tracrRNA y la repetición directa. En algunas realizaciones, se
10 pueden utilizar 2 de estos criterios, por ejemplo 1 y 2, 2 y 3, ó 1 y 3. En algunas realizaciones, se pueden utilizar los 3 criterios. En algunas realizaciones, diseños de ARNs quiméricos guía sintéticos (sgRNAs) incorporan al menos 12 pb de la estructura dúplex entre la repetición directa y tracrRNA.
La lista de las secuencias de ortólogos Cas9 humanas, optimizadas en codones, a emparejarse con los ARNs quiméricos proporcionados en las Figuras 8 A-J se proporciona en las Figuras 9 A-O. La solicitante también ha 15 demostrado que los ortólogos Cas9 pueden escindir sus dianas en ensayos de escisión in vitro (Figura 16). Los loci de CRISPR en algunas de estas familias se representa en la Figura 11. Las secuencias de ARN guía correspondientes se muestran en la Figura 12. La solicitante analizó sistemáticamente la secuencia de ADN genómico dentro de ~ 2 kb de las proteínas Cas9 utilizando el código de análisis computacional habitual e identificó repeticiones directas que oscilaban entre 35 pb y 50 pb, con espaciadores intermedios que oscilaban entre 29 pb y 20 35 pb. Sobre la base de la secuencia de repetición directa, la solicitante rastreó de forma computacional secuencias candidatas tracrRNA con los siguientes criterios: fuera de la matriz de crRNA, pero que contienen un alto grado de homología con repeticiones directas (tal como se requiere para el apareamiento de bases repetición directa:tracRNA; análisis computacional habitual), fuera de las regiones codificadoras de los componentes de proteínas, que contienen señales de terminación de la transcripción Rho-independientes, ~ 60 pb-120 pb aguas 25 abajo de la región de homología de repeticiones directas, y co-plegamiento con repeticiones directas para formar un dúplex, seguido por dos o más estructuras de horquilla en el extremo distal de la secuencia de tracrRNA. Sobre la base de estos criterios de predicción, la solicitante seleccionó un conjunto inicial de 18 proteínas Cas9 y sus repeticiones directas asociadas de forma única y tracrRNAs distribuidos en todas las cinco familias Cas9. La solicitante generó, además, un conjunto de 18 estructuras de ARN quimérico que conservaron la secuencia y
30 estructuras secundarias del dúplex repetición directa nativa:tracrRNA al tiempo que acortaron la región de apareamiento de bases y fusionaron los dos elementos de ARN a través de un bucle artificial (Figuras 8A-J).
Ejemplo 3: Ortólogos Cas9
La solicitante ha generado ortólogos Cas9 optimizados en codones para progresar en la expresión en células eucariotas.
35 Un ejemplo de una secuencia humana optimizada en codones (es decir, optimizada para la expresión en seres humanos.) : SaCas9: se proporciona a continuación
imagen536
imagen537
recombinación homóloga. Además de ello, SpCas9 con estas mutaciones reduce (individualmente) el nivel de ruptura de la doble cadena. Ortólogos Cas9 comparten todos la organización general de los dominios 3-4 RuvC y un dominio HNH (Figura 19). El dominio RuvC más próximo a 5’ escinde la cadena no complementaria y el dominio HNH escinde la cadena complementaria. Todas las notaciones son en referencia a la secuencia guía.
5 El residuo catalítico en el dominio 5' RuvC se identifica a través de la comparación de homología de la Cas9 de interés con otros ortólogos Cas9 (de locus de CRISPR tipo 11 de S. pyogenes, locus 1 de CRISPR de S. thermophilus, locus 3 de CRISPR de S. thermophilus y el locus de CRISPR tipo II de Franciscilla novicida), y el residuo Asp conservado está mutado a alanina para convertir Cas9 en una enzima que produce mella de la cadena complementaria. DE manera similar, los residuos His y Asn conservados en los dominios HNH están mutados a
10 alanina para convertir Cas9 en una enzima que produce mella de cadena no complementaria.
Ejemplo 5: Optimización funcional de Cas9
Para la función mejorada o para desarrollar nuevas funciones, la solicitante genera proteínas quiméricas Cas9 mediante la combinación de fragmentos de diferentes ortólogos Cas9.
Por ejemplo, la solicitante fusiona el extremo N de St1Cas9 (el fragmento de esta proteína está en negrita) con 15 extremo C de SpCas9 (el fragmento de esta proteína está subrayado).
> Sti(N)Sp(C)Cas9
imagen538
> Sp(N)St1(C)Cas9
imagen539
Mientras que determinados vectores AAV actuales pueden alojar hasta 4300 bases de ADN insertado, como un límite superior o un límite de empaquetamiento, el AAV puede tener ADN insertado de 4,5 o 4,75 KB. Esto significa que el ADN que codifica una enzima Cas9 así como un promotor y terminador de la transcripción tiene que encajar todos en el mismo vector viral. Construcciones mayores que 4,5 o 4,75 KB conducirá a una producción de virus
5 significativamente reducida. SpCas9 es bastante grande, el gen por sí es de más de 4,1 kb, lo que hace que sea difícil de empaquetar en un AAV. Por lo tanto, realizaciones de la invención incluyen utilizar ortólogos de Cas9 que sean más cortos. Por ejemplo:
Especie Tamaño de Cas9 Corynebacter diphtheria 3252 Fubacterium ventriosum 3321 Streptococcus pasteurianus 3390 Lactobacillus farciminis 3378 Sphaerochaeta globus 3537 Azospirillum B510 3504 Gluconacetobacter diazotrophicus 3150 Neisseria cinerea 3246 Roseburia intestinalis 3420 Parvibaculum lavamentivorans 3111 Staphylococcus aureus 3159 Nitratifractor salsuginis DSM 16511 3396 Campylobacter lari CF89-12 3009 Streptococcus thermophilus LMD-9 3396
La Figura 3 proporciona representaciones esquemáticas de vectores de AAV que se pueden utilizar en los métodos y composiciones de la invención. El empaquetamiento se comentó anteriormente.
10 Ejemplo 7: Modificación por Ingeniería Genética de Microalgas utilizando Cas9
Métodos de suministrar Cas9
Método 1: La solicitante suministra Cas9 y ARN guía utilizando un vector que expresa Cas9 bajo el control de un promotor constitutivo tal como Hsp70A-Rbc S2 o beta2-tubulina.
Método 2: La solicitante proporciona Cas9 y T7 polimerasa utilizando vectores que expresan Cas9 y T7 polimerasa
15 bajo el control de un promotor constitutivo tal como Hsp70A-Rbc S2 o beta2-tubulina. ARN guía será suministrada utilizando un promotor T7 que contiene vector que impulsa el ARN guía.
imagen540
imagen541
imagen542
imagen543
imagen544
Secuencia de un casete que impulsa la expresión de T7 polimerasa bajo el control del promotor beta-2 tubulina, seguido por la 3' UTR de Cop1:
imagen545
imagen546
imagen547
imagen548
imagen549
imagen550
imagen551
imagen552
Sumario de la Eficiencia de Escisión del Genoma y otras Estadísticas en Todas las Dianas Testadas
imagen553
Los resultados del ensayo de PAM se muestran en las Figs. 22-27. Un ensayo completo de más de 100 dianas 5 identificó que el PAM para SaCas9 podría describirse como NNGRR (pero no NNGRRT como se indicó anteriormente).
Sumario del Ensayo de PAM: (1) NNGRR para SaCas9 PAM general – de ayuda para el diseño de nuevas dianas,
(2) Testado de doble nickase con nuevas dianas, (3) NNGRG puede ser un PAM más potente. Referencias:
10 1. Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013)
2. Mali, P. et al. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013).
imagen554
22.
Bobis-Wozowicz, S., Osiak, A., Rahman, S.H. y Cathomen, T. Targeted genome editing in pluripotent stem cells using zinc-finger nucleases. Methods 53, 339-346 (2011).
23.
Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F. y Marraffini, L.A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nat Biotechnol 31, 233-239 (2013).
24.
Qi, L.S. et al. Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression. Cell 152, 1173-1183 (2013).
25.
Michaelis, L.M., Maud "Die kinetik der invertinwirkung.". Biochem. z (1913).
26.
Mahfouz, M.M. et al. De novo-engineered transcription activator-like effector (TALE) hybrid nuclease with novel DNA. binding specificity creates double-strand breaks. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 2623-2628 (2011).
27.
Wilson, E.B. Probable inference, the law of succession, and statistical inference. J Am Stat Assoc 22, 209-212 (1927).
28.
Ding, Q. et al. A TALEN genome-editing system for generating human stem cell-based disease models. Cell Stem Cell 12, 238-251 (2013).
29.
Soldner, F. et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations. Cell 146, 318-331 (2011).
30.
Carlson, D.F. et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proc Natl Acad Sci U S A 109, 1738217387 (2012).
31.
Geurts, A.M. et al. Knockout Rats via Embryo Microinjection of Zinc-Finger Nucleases. Science 325, 433-433 (2009).
32.
Takasu, Y. et al. Targeted mutagenesis in the silkworm Bombyx mori using zinc finger nuclease mRNA injection. Insect Biochem Molec 40, 759-765 (2010).
33.
Watanabe, T. et al. Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases. Nat Commun 3 (2012).
34.
Reyon, D. et al. FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing. Nat Biotechnol 30, 460-465 (2012).
35.
Boch, J. et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science 326, 1509-1512 (2009).
36.
Moscou, M.J. y Bogdanove, A.J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science 326,1501 (2009).
37.
Deveau, H., Garneau, J.E. y Moineau, S. CRISPR/Cas system and its role in phage-bacteria interactions. Annu Rev Microbiol 64,475-493 (2010).
38.
Horvath, P. y Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science 327, 167-170 (2010).
39.
Makarova, K.S. et al. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nat Rev Microbiol 9, 467-477 (2011).
40.
Bhaya, D., Davison, M. y Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annu Rev Genet 45, 273-297 (2011).
imagen555
imagen556
en donde, en (A) o (B), la enzima CRISPR es un ortólogo Cas9 de un género que pertenece al grupo que consiste en Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Fiaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Mycoplasma y Campylobacter.
Cláusula 2. Una enzima de CRISPR modificada, en donde la enzima es un ortólogo Cas9 de un género perteneciente al grupo que consiste en Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Fiaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Mycoplasma y Campylobacter, y en donde diferencias de la correspondiente enzima de CRISPR de tipo salvaje comprenden:
la enzima de CRISPR modificada está truncada en comparación con una enzima de CRISPR de tipo salvaje, o
la enzima de CRISPR tiene una longitud de al menos 500 aminoácidos, al menos 800-899 aminoácidos, al menos 900-999 aminoácidos, al menos 1000-1099 aminoácidos, al menos 1100-1199 aminoácidos, al menos 12001299 aminoácidos, al menos 1300-1399 aminoácidos, al menos 1400-1499 aminoácidos, al menos 1500-1599 aminoácidos, al menos 1600-1699 aminoácidos o al menos 2000 aminoácidos, y/o
la enzima de CRISPR es una nucleasa que dirige la escisión de las dos cadenas en la localización de la secuencia diana, o la enzima de CRISPR es una nickase que dirige la escisión de una cadena en la localización de la secuencia diana, y/o
la enzima de CRISPR está optimizada en codones o está optimizada en codones para la expresión en una célula eucariota, y/o
la enzima de CRISPR comprende una o más mutaciones, y/o
la enzima de CRISPR comprende una enzima CRISPR quimérica.
Cláusula 3. La composición de acuerdo con la cláusula 1, o la enzima de acuerdo con la cláusula 2, en donde la enzima de CRISPR tiene una o más mutaciones en cualquier dominio de la enzima.
Cláusula 4. La composición o enzima de acuerdo con cualquier cláusula precedente, en donde la enzima de CRISPR tiene una o más mutaciones en un dominio catalítico.
Cláusula 5. La composición o enzima de acuerdo con la cláusula 3 ó 4, en donde la una o más mutaciones es en un dominio RuvC I, RuvC II, RuvC III o HNH de la enzima de CRISPR.
Cláusula 6. La composición o enzima de acuerdo con la cláusula 4 ó 5, en donde la enzima de CRISPR comprende una o más mutaciones correspondientes a la numeración de posición de SpCas9 en las posiciones D10A, E762A, H840A, N854A, N863A o D986A.
Cláusula 7. La composición o enzima de acuerdo con cualquier cláusula precedente, en donde la enzima comprende, además, un dominio funcional.
Cláusula 8. La composición o enzima de acuerdo con la cláusula 7, en donde el dominio funcional es un dominio activador transcripcional.
Cláusula 9. La composición o enzima de acuerdo con la cláusula 8, en donde el dominio activador transcripcional es VP64.
Cláusula 10. La composición o enzima de acuerdo con las cláusulas 7 a 9, en donde el dominio funcional es un dominio represor transcripcional.
Cláusula 11. La composición o enzima de acuerdo con la cláusula 10, en donde el dominio represor transcripcional es KRAB, SID o SID4X.
Cláusula 12. Un método para modificar un organismo o un organismo no humano mediante la manipulación de una secuencia diana en un locus genómico de interés, que comprende
suministrar una composición que se produce de forma no natural o modificada por ingeniería genética que comprende un sistema de vectores que codifica operativamente una composición de cualquier cláusula precedente para la expresión de la misma.
Cláusula 13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el suministro es a través de uno o más vectores virales.
imagen557
IV. un cuarto elemento regulador enlazado operativamente a una secuencia codificadora de enzima que codifica una segunda enzima de CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de localización nuclear y está enlazada operativamente a un segundo dominio funcional,
en donde (i), (ii) y (iii) en I y II están dispuestos en una orientación 5' a 3',
en donde los componentes I, II, III y IV se encuentran en el mismo o en diferentes vectores del sistema,
en donde, cuando se transcriben, cada una de las secuencias de emparejamiento tracr se hibrida con su secuencia tracr correspondiente y la primera y segunda secuencias guía dirigen la unión específica para la secuencia del primer y segundo complejos de CRISPR a la primera y segunda secuencia diana,
en donde el complejo de CRISPR comprende la enzima de CRISPR formando complejo con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana, y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida con la secuencia de tracr, y en donde la expresión de la enzima de CRISPR proporciona la manipulación de la secuencia diana,
en donde la primera y segunda enzimas de CRISPR comprenden cada una dos o más mutaciones,
en donde la primera y segunda enzima de CRISPR es un ortólogo Cas9 de un género que pertenece al grupo que consiste en Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor , Mycoplasma y Campylobacter, y
en donde el primer locus genómico es modulado por la actividad del primer dominio funcional y el segundo locus genómico es modulado por la actividad del segundo dominio funcional.
Cláusula 16. La composición de acuerdo con la cláusula 14, o el método de acuerdo con la cláusula 15, en donde el primer dominio funcional se selecciona del grupo que consiste en un activador transcripcional, un represor transcripcional, una recombinasa, una transposasa, un remodelador de histona, una ADN metiltransferasa, un criptocromo y un dominio inducible/controlable por la luz o un dominio inducible y/o controlable químicamente.
Cláusula 17. La composición de acuerdo con la cláusula 14 ó 16, o el método de acuerdo con la cláusula 15 ó 16, en donde el segundo dominio funcional se selecciona del grupo que consiste en un activador transcripcional, un represor transcripcional, una recombinasa, una transposasa, un remodelador de histona, una ADN metiltransferasa, un criptocromo y un dominio inducible/controlable por la luz o un dominio inducible y/o controlable químicamente.
Cláusula 18. La composición o el método de acuerdo con la cláusula 16 ó 17, en donde el primer o segundo dominio funcional es un dominio activador transcripcional.
Cláusula 19. La composición o el método de acuerdo con la cláusula 47, en donde el dominio activador transcripcional es VP64.
Cláusula 20. La composición o el método de acuerdo con la cláusula 16 ó 17, en donde el primer o segundo dominio funcional es un dominio represor transcripcional.
Cláusula 21. La composición o el método de acuerdo con la cláusula 20, en donde el dominio represor transcripcional es KRAB, SID o SID4X.
Cláusula 22. La composición o el método de acuerdo con cualquiera de las cláusulas 14 a 21, en donde la primera o segunda enzima de CRISPR es una Cas9 de Sutterella wadsworthensis.
Cláusula 23. La composición o el método de acuerdo con cualquiera de las cláusulas 14 a 21, en donde la primera o segunda enzima de CRISPR es una Cas9 de Filifactor alocis.
Cláusula 24. La composición o el método de acuerdo con cualquiera de las cláusulas 14 a 21, en donde la primera o segunda enzima de CRISPR es una Cas9 de Lactobacillus johnsonii.
Cláusula 25. La composición o el método de acuerdo con cualquiera de las cláusulas 14 a 21, en donde la primera o segunda enzima de CRISPR es una Cas9 de Campylobacter lari.
Cláusula 26. La composición o el método de acuerdo con cualquiera de las cláusulas 14 a 21, en donde la primera o segunda enzima de CRISPR es una Cas9 de Corynebacter diptheriae.
Cláusula 27. La composición o el método de acuerdo con cualquiera de las cláusulas 14 a 21, en donde la primera o segunda enzima de CRISPR es una Cas9 de Parvibaculum lavamentivorans.
imagen558
imagen559
A) -I. una secuencia de polinucleótidos de ARN quimérico (chiRNA) de un sistema de CRISPR-Cas, en donde la secuencia de polinucleótidos comprende:
(a)
una secuencia guía capaz de hibridarse con una secuencia diana en una célula eucariota,
(b)
una secuencia de emparejamiento de tracr, y
(c)
una secuencia de tracr, y
II. una secuencia de polinucleótidos que codifica una enzima de CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de localización nuclear,
en donde (a), (b) y (c) están dispuestas en una orientación 5' a 3',
en donde, cuando se transcribe, la secuencia de emparejamiento tracr se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica para la secuencia de un complejo de CRISPR a la secuencia diana, y
en donde el complejo de CRISPR comprende la enzima de CRISPR formando complejo con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana, y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida con la secuencia de tracr, y la secuencia de polinucleótidos que codifica una enzima de CRISPR es ADN o ARN,
o
(B) I. polinucleótidos que comprenden:
(a)
una secuencia guía capaz de hibridarse con una secuencia diana en una célula procariota, y
(b)
al menos una o más secuencias de emparejamiento tracr,
II. una secuencia de polinucleótido que codifica una enzima de CRISPR, y
III. una secuencia de polinucleótidos que comprende una secuencia tracr, en donde cuando se transcribe, la secuencia de emparejamiento tracr se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica para la secuencia de un complejo de CRISPR a la secuencia diana, y
en donde el complejo de CRISPR comprende la enzima CRISPR formando complejo con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana, y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida con la secuencia tracr, y la secuencia de polinucleótido que codifica una enzima de CRISPR es ADN o ARN, y
en donde la enzima de CRISPR es un ortólogo Cas9 de un género que pertenece al grupo que consiste en Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Fiaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Mycoplasma y Campylobacter.
Cláusula 63. Un método de modificar un organismo o un organismo no humano mediante manipulación de una secuencia diana en un locus genómico de interés, que comprende suministrar una composición que se produce de forma no natural o modificada por ingeniería genética, que comprende:
A) -I. una secuencia de polinucleótidos de ARN quimérico (chiRNA) de un sistema de CRISPR-Cas, en donde la secuencia de polinucleótidos comprende:
(a)
una secuencia guía capaz de hibridarse con una secuencia diana en una célula eucariota,
(b)
una secuencia de emparejamiento de tracr, y
(c)
una secuencia de tracr, y
II. una secuencia de polinucleótidos que codifica una enzima de CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de localización nuclear,
en donde (a), (b) y (c) están dispuestas en una orientación 5' a 3',
en donde, cuando se transcribe, la secuencia de emparejamiento tracr se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica para la secuencia de un complejo de CRISPR a la secuencia diana, y
en donde el complejo de CRISPR comprende la enzima de CRISPR formando complejo con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana, y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida con la secuencia de tracr, y la secuencia de polinucleótidos que codifica una enzima de CRISPR es ADN o ARN,
o
(B) I. polinucleótidos que comprenden:
(a)
una secuencia guía capaz de hibridarse con una secuencia diana en una célula procariota, y
(b)
al menos una o más secuencias de emparejamiento tracr,
II. una secuencia de polinucleótido que codifica una enzima de CRISPR, y
III. una secuencia de polinucleótidos que comprende una secuencia tracr, en donde cuando se transcribe, la secuencia de emparejamiento tracr se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica para la secuencia de un complejo de CRISPR a la secuencia diana, y
en donde el complejo de CRISPR comprende la enzima CRISPR formando complejo con (1) la secuencia guía que se hibrida con la secuencia diana, y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida con la secuencia tracr, y la secuencia de polinucleótido que codifica una enzima de CRISPR es ADN o ARN, y
en donde la enzima de CRISPR es un ortólogo Cas9 de un género que pertenece al grupo que consiste en Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Fiaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Mycoplasma y Campylobacter.
imagen560

Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
ES13814364.9T 2012-12-12 2013-12-12 Modificación por tecnología genética y optimización de sistemas, métodos y composiciones enzimáticas mejorados para la manipulación de secuencias Active ES2576126T3 (es)

Applications Claiming Priority (25)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261736527P 2012-12-12 2012-12-12
US201261736527P 2012-12-12
US201361748427P 2013-01-02 2013-01-02
US201361748427P 2013-01-02
US201361758468P 2013-01-30 2013-01-30
US201361758468P 2013-01-30
US201361769046P 2013-02-25 2013-02-25
US201361769046P 2013-02-25
US201361791409P 2013-03-15 2013-03-15
US201361802174P 2013-03-15 2013-03-15
US201361802174P 2013-03-15
US201361791409P 2013-03-15
US201361806375P 2013-03-28 2013-03-28
US201361806375P 2013-03-28
US201361814263P 2013-04-20 2013-04-20
US201361814263P 2013-04-20
US201361819803P 2013-05-06 2013-05-06
US201361819803P 2013-05-06
US201361828130P 2013-05-28 2013-05-28
US201361828130P 2013-05-28
US201361836101P 2013-06-17 2013-06-17
US201361835931P 2013-06-17 2013-06-17
US201361835931P 2013-06-17
US201361836101P 2013-06-17
PCT/US2013/074691 WO2014093635A1 (en) 2012-12-12 2013-12-12 Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2576126T3 true ES2576126T3 (es) 2016-07-05

Family

ID=49883291

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES13814364.9T Active ES2576126T3 (es) 2012-12-12 2013-12-12 Modificación por tecnología genética y optimización de sistemas, métodos y composiciones enzimáticas mejorados para la manipulación de secuencias
ES16151694T Active ES2786193T3 (es) 2012-12-12 2013-12-12 Modificación por tecnología genética y optimización de sistemas, métodos y composiciones enzimáticas mejorados para la manipulación de secuencias

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16151694T Active ES2786193T3 (es) 2012-12-12 2013-12-12 Modificación por tecnología genética y optimización de sistemas, métodos y composiciones enzimáticas mejorados para la manipulación de secuencias

Country Status (15)

Country Link
US (6) US20140186919A1 (es)
EP (1) EP2898075B1 (es)
JP (6) JP6552965B2 (es)
KR (1) KR20150105634A (es)
CN (2) CN113355357B (es)
AU (4) AU2013359212B2 (es)
CA (1) CA2894684A1 (es)
DK (2) DK2898075T3 (es)
ES (2) ES2576126T3 (es)
IL (2) IL300461A (es)
PL (1) PL2898075T3 (es)
PT (1) PT2898075E (es)
SG (3) SG11201504519TA (es)
WO (1) WO2014093635A1 (es)
ZA (1) ZA201504081B (es)

Families Citing this family (755)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2449112A1 (en) 2009-07-01 2012-05-09 Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. Genetically modified rat models for severe combined immunodeficiency (scid)
CA2831144A1 (en) 2011-03-23 2012-09-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for producing a complex transgenic trait locus
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
GB201117313D0 (en) 2011-10-07 2011-11-16 Gt Biolog Ltd Bacterium for use in medicine
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
WO2013139861A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Luc Montagnier Methods and pharmaceutical compositions of the treatment of autistic syndrome disorders
SG11201406547YA (en) 2012-04-25 2014-11-27 Regeneron Pharma Nuclease-mediated targeting with large targeting vectors
AU2013266968B2 (en) 2012-05-25 2017-06-29 Emmanuelle CHARPENTIER Methods and compositions for RNA-directed target DNA modification and for RNA-directed modulation of transcription
EP3196301B1 (en) 2012-07-11 2018-10-17 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the treatment of monogenic diseases
US10648001B2 (en) 2012-07-11 2020-05-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Method of treating mucopolysaccharidosis type I or II
AU2013293270B2 (en) * 2012-07-25 2018-08-16 Massachusetts Institute Of Technology Inducible DNA binding proteins and genome perturbation tools and applications thereof
AU2013335451C1 (en) 2012-10-23 2024-07-04 Toolgen Incorporated Composition for cleaving a target DNA comprising a guide RNA specific for the target DNA and Cas protein-encoding nucleic acid or Cas protein, and use thereof
PL3360964T3 (pl) 2012-12-06 2020-03-31 Sigma-Aldrich Co. Llc Modyfikacja i regulacja genomu oparta na crispr
US20140186843A1 (en) 2012-12-12 2014-07-03 Massachusetts Institute Of Technology Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
EP3031921B1 (en) 2012-12-12 2025-03-12 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
CN113355357B (zh) * 2012-12-12 2024-12-03 布罗德研究所有限公司 对用于序列操纵的改进的系统、方法和酶组合物进行的工程化和优化
EP2931899A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
WO2014093655A2 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
WO2014093709A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
EP2840140B2 (en) 2012-12-12 2023-02-22 The Broad Institute, Inc. Crispr-Cas based method for mutation of prokaryotic cells
DK2931891T3 (da) 2012-12-17 2019-08-19 Harvard College Rna-styret modificering af menneskelige genomer
CA2898184A1 (en) 2013-01-16 2014-07-24 Emory University Cas9-nucleic acid complexes and uses related thereto
MX384291B (es) 2013-02-20 2025-03-14 Regeneron Pharma Modificación genética de ratas.
RU2662932C2 (ru) 2013-03-14 2018-07-31 Карибо Биосайенсиз, Инк. Композиции и способы с участием нуклеиновых кислот, нацеленных на нуклеиновые кислоты
CN112301024A (zh) 2013-03-15 2021-02-02 通用医疗公司 使用RNA引导的FokI核酸酶(RFN)提高RNA引导的基因组编辑的特异性
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
WO2014204578A1 (en) 2013-06-21 2014-12-24 The General Hospital Corporation Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing
US9234213B2 (en) 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
EP4286517A3 (en) 2013-04-04 2024-03-13 President and Fellows of Harvard College Therapeutic uses of genome editing with crispr/cas systems
GB201306536D0 (en) 2013-04-10 2013-05-22 Gt Biolog Ltd Polypeptide and immune modulation
US20160186208A1 (en) * 2013-04-16 2016-06-30 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods of Mutating, Modifying or Modulating Nucleic Acid in a Cell or Nonhuman Mammal
DK3456831T3 (da) 2013-04-16 2021-09-06 Regeneron Pharma Målrettet modifikation af rottegenom
WO2014186686A2 (en) * 2013-05-17 2014-11-20 Two Blades Foundation Targeted mutagenesis and genome engineering in plants using rna-guided cas nucleases
EP3004339B1 (en) * 2013-05-29 2021-07-07 Cellectis New compact scaffold of cas9 in the type ii crispr system
WO2014194190A1 (en) * 2013-05-30 2014-12-04 The Penn State Research Foundation Gene targeting and genetic modification of plants via rna-guided genome editing
CN105492611A (zh) 2013-06-17 2016-04-13 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的优化的crispr-cas双切口酶系统、方法以及组合物
RU2716420C2 (ru) 2013-06-17 2020-03-11 Те Брод Инститьют Инк. Доставка и применение систем crispr-cas, векторов и композиций для целенаправленного воздействия и терапии в печени
WO2014204724A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Delivery, engineering and optimization of tandem guide systems, methods and compositions for sequence manipulation
MX374532B (es) 2013-06-17 2025-03-06 Broad Inst Inc Suministro, uso y aplicaciones terapéuticas de los sistemas y composiciones crispr-cas, para actuar sobre trastornos y enfermedades utilizando componentes víricos.
EP3725885A1 (en) 2013-06-17 2020-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
EP3019595A4 (en) 2013-07-09 2016-11-30 THERAPEUTIC USES OF A GENERIC CHANGE WITH CRISPR / CAS SYSTEMS
EP3666892A1 (en) * 2013-07-10 2020-06-17 President and Fellows of Harvard College Orthogonal cas9 proteins for rna-guided gene regulation and editing
US11306328B2 (en) * 2013-07-26 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College Genome engineering
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
CN120574876A (zh) * 2013-08-22 2025-09-02 纳幕尔杜邦公司 使用向导rna/cas内切核酸酶系统的植物基因组修饰及其使用方法
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
JP7118588B2 (ja) 2013-08-29 2022-08-16 テンプル ユニヴァーシティ オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション Ｈｉｖ感染のｒｎａガイド処置のための方法および組成物
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
EP3988649B1 (en) 2013-09-18 2024-11-27 Kymab Limited Methods, cells and organisms
WO2015054507A1 (en) 2013-10-10 2015-04-16 Pronutria, Inc. Nutritive polypeptide production systems, and methods of manufacture and use thereof
WO2015065964A1 (en) 2013-10-28 2015-05-07 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, screens and applications thereof
CN106459995B (zh) 2013-11-07 2020-02-21 爱迪塔斯医药有限公司 使用统治型gRNA的CRISPR相关方法和组合物
CA2930877A1 (en) * 2013-11-18 2015-05-21 Crispr Therapeutics Ag Crispr-cas system materials and methods
US9074199B1 (en) 2013-11-19 2015-07-07 President And Fellows Of Harvard College Mutant Cas9 proteins
KR102170502B1 (ko) 2013-12-11 2020-10-28 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 게놈의 표적화된 변형을 위한 방법 및 조성물
WO2015089427A1 (en) * 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crispr-cas systems and methods for altering expression of gene products, structural information and inducible modular cas enzymes
SG10201804975PA (en) 2013-12-12 2018-07-30 Broad Inst Inc Delivery, Use and Therapeutic Applications of the Crispr-Cas Systems and Compositions for HBV and Viral Diseases and Disorders
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
JP7103750B2 (ja) 2013-12-12 2022-07-20 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド ゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系及び組成物の送達、使用及び治療適用
JP6793547B2 (ja) 2013-12-12 2020-12-02 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 最適化機能ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系による配列操作のための系、方法および組成物
EP3470089A1 (en) 2013-12-12 2019-04-17 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using particle delivery components
US20150165054A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting caspase-9 point mutations
EP3080259B1 (en) 2013-12-12 2023-02-01 The Broad Institute, Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions with new architectures for sequence manipulation
JP6712948B2 (ja) 2013-12-12 2020-06-24 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 組成物、及びヌクレオチドリピート障害におけるｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ系の使用方法
ES2918501T3 (es) 2013-12-19 2022-07-18 Novartis Ag Receptores de antígenos quiméricos de mesotelina humana y usos de los mismos
EP3690044B1 (en) 2014-02-11 2024-01-10 The Regents of the University of Colorado, a body corporate Crispr enabled multiplexed genome engineering
US10286084B2 (en) 2014-02-18 2019-05-14 Duke University Compositions for the inactivation of virus replication and methods of making and using the same
ES2898460T3 (es) 2014-02-27 2022-03-07 Monsanto Technology Llc Composiciones y procedimientos para la modificación genómica dirigida al sitio
EP3110971B1 (en) 2014-02-27 2019-05-08 The Broad Institute Inc. T cell balance gene expression and methods of use thereof
US11028388B2 (en) 2014-03-05 2021-06-08 Editas Medicine, Inc. CRISPR/Cas-related methods and compositions for treating Usher syndrome and retinitis pigmentosa
ES2745769T3 (es) 2014-03-10 2020-03-03 Editas Medicine Inc Procedimientos y composiciones relacionados con CRISPR/CAS para tratar la amaurosis congénita de Leber 10 (LCA10)
US11141493B2 (en) 2014-03-10 2021-10-12 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
US11339437B2 (en) 2014-03-10 2022-05-24 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
US20170335281A1 (en) 2014-03-15 2017-11-23 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
EP3122880B1 (en) 2014-03-26 2021-05-05 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease
WO2015153789A1 (en) * 2014-04-01 2015-10-08 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating herpes simplex virus type 1 (hsv-1)
EP3540061A1 (en) 2014-04-02 2019-09-18 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating primary open angle glaucoma
AU2015244039B2 (en) 2014-04-07 2021-10-21 Novartis Ag Treatment of cancer using anti-CD19 chimeric antigen receptor
WO2015157070A2 (en) 2014-04-09 2015-10-15 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating cystic fibrosis
WO2015161276A2 (en) * 2014-04-18 2015-10-22 Editas Medicine, Inc. Crispr-cas-related methods, compositions and components for cancer immunotherapy
WO2015184259A1 (en) 2014-05-30 2015-12-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods to treat latent viral infections
HRP20200529T1 (hr) 2014-06-06 2020-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Postupci i pripravci za modificiranje ciljnog lokusa
CN106536056B (zh) 2014-06-13 2021-07-16 儿童医学中心公司 分离线粒体的产品和方法
CN106604994B (zh) 2014-06-23 2021-12-14 通用医疗公司 通过测序评估的DSBs的全基因组无偏鉴定(GUIDE-Seq)
SI3161128T1 (sl) 2014-06-26 2019-02-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Postopki in sestavki za ciljano genetsko spremembo in postopki uporabe
US10676754B2 (en) 2014-07-11 2020-06-09 E I Du Pont De Nemours And Company Compositions and methods for producing plants resistant to glyphosate herbicide
DK3169778T5 (da) * 2014-07-14 2024-10-14 Univ Washington State Nanos-knockout, der eliminerer kimbaneceller
CN104152414B (zh) * 2014-07-18 2018-03-13 中国科学院广州生物医药与健康研究院 对细胞基因组的预定位点进行基因改造的方法
BR112017001183A2 (pt) 2014-07-21 2017-11-28 Novartis Ag tratamento de câncer usando receptor de antígeno quimérico anti-bcma humanizado
TWI719942B (zh) 2014-07-21 2021-03-01 瑞士商諾華公司 使用ｃｄ３３嵌合抗原受體治療癌症
JP2017528433A (ja) 2014-07-21 2017-09-28 ノバルティス アーゲー 低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤とＣＡＲの組み合わせ
US11542488B2 (en) 2014-07-21 2023-01-03 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
EP4205749A1 (en) 2014-07-31 2023-07-05 Novartis AG Subset-optimized chimeric antigen receptor-containing cells
EP4194557A1 (en) * 2014-08-06 2023-06-14 Institute for Basic Science Genome editing using campylobacter jejuni crispr/cas system-derived rgen
CN106714845A (zh) * 2014-08-11 2017-05-24 得克萨斯州大学系统董事会 通过crispr/cas9介导的基因编辑预防肌营养不良
AU2015301460B2 (en) 2014-08-14 2021-04-08 Novartis Ag Treatment of cancer using GFR alpha-4 chimeric antigen receptor
WO2016028682A1 (en) * 2014-08-17 2016-02-25 The Broad Institute Inc. Genome editing using cas9 nickases
MX2017002205A (es) 2014-08-19 2017-08-21 Novartis Ag Receptor quimerico de antigeno (car) anti-cd123 para uso en el tratamiento de cancer.
SG11201701245QA (en) 2014-08-27 2017-03-30 Caribou Biosciences Inc Methods for increasing cas9-mediated engineering efficiency
EP3188763B1 (en) 2014-09-02 2020-05-13 The Regents of The University of California Methods and compositions for rna-directed target dna modification
MX2017002930A (es) 2014-09-12 2017-06-06 Du Pont Generacion de sitios de integracion especifica de sitio para loci de rasgos complejos en maiz y soja, y metodos de uso.
JP6839074B2 (ja) 2014-09-17 2021-03-03 ノバルティス アーゲー 養子免疫療法のためのキメラ受容体での細胞毒性細胞のターゲティング
WO2016049163A2 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Use and production of chd8+/- transgenic animals with behavioral phenotypes characteristic of autism spectrum disorder
WO2016049024A2 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for modeling competition of multiple cancer mutations in vivo
WO2016049251A1 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for modeling mutations in leukocytes
WO2016049258A2 (en) 2014-09-25 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Functional screening with optimized functional crispr-cas systems
US10040048B1 (en) 2014-09-25 2018-08-07 Synthego Corporation Automated modular system and method for production of biopolymers
US20160090603A1 (en) * 2014-09-30 2016-03-31 Sandia Corporation Delivery platforms for the domestication of algae and plants
CN104546931B (zh) * 2014-09-30 2019-04-09 深圳华大基因科技有限公司 华德萨特氏菌在治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病中的应用
AU2015330699B2 (en) 2014-10-10 2021-12-02 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for promoting homology directed repair
CA2964234A1 (en) * 2014-10-10 2016-04-14 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Efficient delivery of therapeutic molecules in vitro and in vivo
GB201418965D0 (es) 2014-10-24 2014-12-10 Ospedale San Raffaele And Fond Telethon
EP3212788A2 (en) 2014-10-27 2017-09-06 The Broad Institute, Inc. Compositions, methods and use of synthetic lethal screening
EP3215623A4 (en) 2014-11-06 2018-09-26 President and Fellows of Harvard College Cells lacking b2m surface expression and methods for allogeneic administration of such cells
EP4464338A3 (en) 2014-11-07 2025-02-12 Editas Medicine, Inc. Systems for improving crispr/cas-mediated genome-editing
JP2017534294A (ja) * 2014-11-19 2017-11-24 インスティチュート フォー ベーシック サイエンスＩｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ 二つのベクターから発現されたｃａｓ９タンパク質を利用した遺伝子発現調節方法
WO2016080399A1 (ja) * 2014-11-20 2016-05-26 国立大学法人京都大学 哺乳動物の標的ゲノム領域にｄｎａをノックインする方法及び細胞
KR102531016B1 (ko) 2014-11-21 2023-05-10 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 쌍 형성된 가이드 rna를 사용하는 표적화된 유전자 변형을 위한 방법 및 조성물
EP3224381B1 (en) 2014-11-25 2019-09-04 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Method of identifying a person having a predisposition to or afflicted with a cardiometabolic disease
CA2969145A1 (en) 2014-11-26 2016-06-02 The Regents Of The University Of California Therapeutic compositions comprising transcription factors and methods of making and using the same
GB201421096D0 (en) 2014-11-27 2015-01-14 Imp Innovations Ltd Genome editing methods
CA2969619A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Agilent Technologies, Inc. Guide rna with chemical modifications
CN116059378A (zh) 2014-12-10 2023-05-05 明尼苏达大学董事会 用于治疗疾病的遗传修饰的细胞、组织和器官
WO2016094880A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of crispr systems and compositions for genome editing as to hematopoietic stem cells (hscs)
WO2016094872A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Dead guides for crispr transcription factors
EP3889260A1 (en) 2014-12-12 2021-10-06 The Broad Institute, Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
WO2016094874A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Escorted and functionalized guides for crispr-cas systems
CA2970683A1 (en) * 2014-12-18 2016-06-23 Integrated Dna Technologies, Inc. Crispr-based compositions and methods of use
EP3234192B1 (en) 2014-12-19 2021-07-14 The Broad Institute, Inc. Unbiased identification of double-strand breaks and genomic rearrangement by genome-wide insert capture sequencing
WO2016098078A2 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Novartis Ag Dimerization switches and uses thereof
ES2947714T3 (es) 2014-12-19 2023-08-17 Regeneron Pharma Métodos y composiciones para la modificación genética dirigida a través de múltiples direccionamientos en un solo paso
WO2016106236A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 The Broad Institute Inc. Rna-targeting system
WO2016106121A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 Syngenta Participations Ag Methods and compositions for identifying and enriching for cells comprising site specific genomic modifications
AR103260A1 (es) 2014-12-23 2017-04-26 4D Pharma Res Ltd Modulación inmunitaria
EP3400953A1 (en) 2014-12-23 2018-11-14 4D Pharma Research Limited Pirin polypeptide and immune modulation
CA2970370A1 (en) 2014-12-24 2016-06-30 Massachusetts Institute Of Technology Crispr having or associated with destabilization domains
WO2016108926A1 (en) 2014-12-30 2016-07-07 The Broad Institute Inc. Crispr mediated in vivo modeling and genetic screening of tumor growth and metastasis
EP3245232B1 (en) 2015-01-12 2021-04-21 The Regents of The University of California Heterodimeric cas9 and methods of use thereof
US9650617B2 (en) 2015-01-28 2017-05-16 Pioneer Hi-Bred International. Inc. CRISPR hybrid DNA/RNA polynucleotides and methods of use
EP3250689B1 (en) 2015-01-28 2020-11-04 The Regents of The University of California Methods and compositions for labeling a single-stranded target nucleic acid
WO2016137949A1 (en) * 2015-02-23 2016-09-01 Voyager Therapeutics, Inc. Regulatable expression using adeno-associated virus (aav)
WO2016138488A2 (en) 2015-02-26 2016-09-01 The Broad Institute Inc. T cell balance gene expression, compositions of matters and methods of use thereof
EP3265560B1 (en) 2015-03-02 2021-12-08 Sinai Health System Homologous recombination factors
KR20230156800A (ko) 2015-03-03 2023-11-14 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 변경된 PAM 특이성을 갖는 조작된 CRISPR-Cas9 뉴클레아제
BR112017017260A2 (pt) 2015-03-27 2018-04-17 Du Pont construções de dna, vetor, célula, plantas, semente, método de expressão de rna e método de modificação de local alvo
EP3748004A1 (en) * 2015-04-01 2020-12-09 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating duchenne muscular dystrophy and becker muscular dystrophy
KR102888521B1 (ko) * 2015-04-06 2025-11-19 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 Crispr/cas-매개 유전자 조절을 위한 화학적으로 변형된 가이드 rna
EP3286211A1 (en) 2015-04-23 2018-02-28 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
JP2018522249A (ja) 2015-04-24 2018-08-09 エディタス・メディシン、インコーポレイテッド Ｃａｓ９分子／ガイドｒｎａ分子複合体の評価
CN107921148A (zh) 2015-05-08 2018-04-17 哈佛学院校长同事会 通用供体干细胞和相关方法
WO2016182893A1 (en) 2015-05-08 2016-11-17 Teh Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems for saturating mutagenesis of non-coding elements, compositions, methods, libraries and applications thereof
CA2986310A1 (en) 2015-05-11 2016-11-17 Editas Medicine, Inc. Optimized crispr/cas9 systems and methods for gene editing in stem cells
US20180291372A1 (en) * 2015-05-14 2018-10-11 Massachusetts Institute Of Technology Self-targeting genome editing system
AU2016263026A1 (en) * 2015-05-15 2017-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Guide RNA/Cas endonuclease systems
EP3331582A4 (en) * 2015-05-29 2019-08-07 Agenovir Corporation METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF TRANSPLANTATION CELLS
US10117911B2 (en) 2015-05-29 2018-11-06 Agenovir Corporation Compositions and methods to treat herpes simplex virus infections
CN108025188A (zh) 2015-06-01 2018-05-11 天普大学-联邦高等教育系统 用于hiv感染的rna导向治疗的方法和组合物
EP3303585A4 (en) 2015-06-03 2018-10-31 Board of Regents of the University of Nebraska Dna editing using single-stranded dna
WO2016196655A1 (en) 2015-06-03 2016-12-08 The Regents Of The University Of California Cas9 variants and methods of use thereof
EP3302525A2 (en) 2015-06-05 2018-04-11 Novartis AG Methods and compositions for diagnosing, treating, and monitoring treatment of shank3 deficiency associated disorders
CN108026526B (zh) 2015-06-09 2023-05-12 爱迪塔斯医药公司 用于改善移植的crispr/cas相关方法和组合物
NZ737752A (en) 2015-06-15 2022-02-25 4D Pharma Res Ltd Compositions comprising bacterial strains
MA41010B1 (fr) 2015-06-15 2020-01-31 4D Pharma Res Ltd Compositions comprenant des souches bactériennes
WO2016205276A1 (en) 2015-06-15 2016-12-22 North Carolina State University Methods and compositions for efficient delivery of nucleic acids and rna-based antimicrobials
WO2016203221A1 (en) 2015-06-15 2016-12-22 4D Pharma Research Limited Compositions comprising bacterial strains
MA41060B1 (fr) 2015-06-15 2019-11-29 4D Pharma Res Ltd Compositions comprenant des souches bactériennes
SMT201900588T1 (it) 2015-06-15 2019-11-13 4D Pharma Res Limited Blautia stercoris e wexlerae per uso nel trattamento di malattie infiammatorie ed autoimmuni
JP2018518182A (ja) 2015-06-17 2018-07-12 ザ ユーエービー リサーチ ファンデーション ゲノム編集のためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９複合体
JP2018518181A (ja) 2015-06-17 2018-07-12 ザ ユーエービー リサーチ ファンデーション 血液細胞系列の細胞に機能的ポリペプチドを導入するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体
WO2016205728A1 (en) 2015-06-17 2016-12-22 Massachusetts Institute Of Technology Crispr mediated recording of cellular events
TWI906646B (zh) 2015-06-18 2025-12-01 美商博得學院股份有限公司 降低脫靶效應的ｃｒｉｓｐｒ酶突變
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
WO2016205749A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
AU2016279077A1 (en) 2015-06-18 2019-03-28 Omar O. Abudayyeh Novel CRISPR enzymes and systems
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
WO2016205745A2 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Cell sorting
WO2017004261A1 (en) 2015-06-29 2017-01-05 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modified crispr rna and modified single crispr rna and uses thereof
US10456452B2 (en) 2015-07-02 2019-10-29 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for improved encapsulation of functional proteins in polymeric vesicles
US20170000743A1 (en) * 2015-07-02 2017-01-05 Vindico NanoBio Technology Inc. Compositions and Methods for Delivery of Gene Editing Tools Using Polymeric Vesicles
GB2592821B (en) 2015-07-31 2022-01-12 Univ Minnesota Modified cells and methods of therapy
US11667691B2 (en) 2015-08-07 2023-06-06 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric CD3 receptor proteins
US9580727B1 (en) 2015-08-07 2017-02-28 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of engineered CRISPR-Cas9 systems using split-nexus Cas9-associated polynucleotides
EP4512819A3 (en) 2015-08-12 2025-08-06 The General Hospital Corporation Compositions and methods that promote hypoxia or the hypoxia response for treatment and prevention of mitochondrial dysfunction and oxidative stress disorders
CA3033909A1 (en) 2015-08-14 2017-02-23 The University Of Sydney Connexin 45 inhibition for therapy
WO2017031370A1 (en) 2015-08-18 2017-02-23 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for altering function and structure of chromatin loops and/or domains
US9512446B1 (en) 2015-08-28 2016-12-06 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
US9926546B2 (en) 2015-08-28 2018-03-27 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
JP6799586B2 (ja) 2015-08-28 2020-12-16 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 遺伝子操作ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ
IL241462A0 (en) 2015-09-10 2015-11-30 Yeda Res & Dev Heterologous engineering of betalain pigments in plants
WO2017044843A1 (en) 2015-09-11 2017-03-16 The General Hospital Corporation Full interrogation of nuclease dsbs and sequencing (find-seq)
EP3353296B1 (en) 2015-09-24 2020-11-04 Editas Medicine, Inc. Use of exonucleases to improve crispr/cas-mediated genome editing
WO2017053729A1 (en) 2015-09-25 2017-03-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Nuclease-mediated genome editing of primary cells and enrichment thereof
US20170088828A1 (en) * 2015-09-29 2017-03-30 Agenovir Corporation Compositions and methods for treatment of latent viral infections
JP2018529353A (ja) 2015-09-30 2018-10-11 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 配列決定法による切断事象の包括的生体外報告（ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ）
EP3356520B1 (en) 2015-10-02 2022-03-23 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Lentiviral protein delivery system for rna-guided genome editing
US12241053B2 (en) 2015-10-09 2025-03-04 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Modulation of novel immune checkpoint targets
CN116814590A (zh) 2015-10-22 2023-09-29 布罗德研究所有限公司 Vi-b型crispr酶和系统
IL310721B2 (en) 2015-10-23 2025-11-01 Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
WO2017070598A1 (en) 2015-10-23 2017-04-27 Caribou Biosciences, Inc. Engineered crispr class 2 cross-type nucleic-acid targeting nucleic acids
EP3368687B1 (en) 2015-10-27 2021-09-29 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for targeting cancer-specific sequence variations
US11092607B2 (en) 2015-10-28 2021-08-17 The Board Institute, Inc. Multiplex analysis of single cell constituents
WO2017075451A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses by detecting and targeting pou2af1
WO2017075478A2 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses by use of immune cell gene signatures
WO2017075294A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Board Institute Inc. Assays for massively combinatorial perturbation profiling and cellular circuit reconstruction
WO2017075465A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses by detecting and targeting gata3
EP4036228A1 (en) 2015-11-13 2022-08-03 Avellino Lab USA, Inc. Methods for the treatment of corneal dystrophies
AU2016355178B9 (en) 2015-11-19 2019-05-30 Massachusetts Institute Of Technology Lymphocyte antigen CD5-like (CD5L)-interleukin 12B (p40) heterodimers in immunity
WO2017087885A1 (en) 2015-11-19 2017-05-26 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods of identifying compounds that interfere with erg-driven misguidance of baf complexes in tmprss2-erg driven prostate cancers
GB201520497D0 (en) 2015-11-20 2016-01-06 4D Pharma Res Ltd Compositions comprising bacterial strains
CN108513545B (zh) 2015-11-20 2020-11-03 4D制药研究有限公司 包含细菌菌株的组合物
CA3005968A1 (en) 2015-11-23 2017-06-01 The Regents Of The University Of California Tracking and manipulating cellular rna via nuclear delivery of crispr/cas9
US10041079B2 (en) 2015-11-30 2018-08-07 Synthetic Genomics, Inc. Compositions and methods for expressing genes in algae
US11903974B2 (en) 2015-11-30 2024-02-20 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods and compositions relating to chondrisomes from cultured cells
WO2017093370A1 (en) * 2015-12-03 2017-06-08 Technische Universität München T-cell specific genome editing
CN108473981B (zh) 2015-12-04 2022-04-12 卡里布生物科学公司 工程化靶向核酸的核酸
US11208649B2 (en) 2015-12-07 2021-12-28 Zymergen Inc. HTP genomic engineering platform
US9988624B2 (en) 2015-12-07 2018-06-05 Zymergen Inc. Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform
BR112018011503A2 (pt) 2015-12-07 2018-12-04 Zymergen Inc promotores da corynebacterium glutamicum
US12110490B2 (en) 2015-12-18 2024-10-08 The Broad Institute, Inc. CRISPR enzymes and systems
RU2018127657A (ru) 2015-12-30 2020-01-31 Новартис Аг Виды терапии на основе иммуноэффекторных клеток с улучшенной эффективностью
WO2017120504A1 (en) 2016-01-08 2017-07-13 Durfee Paul N Osteotropic nanoparticles for prevention or treatment of bone metastases
MX2018008345A (es) 2016-01-11 2018-12-06 Univ Leland Stanford Junior Proteínas quiméricas y métodos de inmunoterapia.
IL260532B2 (en) 2016-01-11 2023-12-01 Univ Leland Stanford Junior Chimeric proteins- containing systems and uses thereof in regulating gene expression
WO2017124037A1 (en) 2016-01-15 2017-07-20 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic use of mitochondria and combined mitochondrial agents
US10876129B2 (en) 2016-02-12 2020-12-29 Ceres, Inc. Methods and materials for high throughput testing of mutagenized allele combinations
US20190249172A1 (en) 2016-02-18 2019-08-15 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for gene editing in stem cells
US20190144942A1 (en) 2016-02-22 2019-05-16 Massachusetts Institute Of Technology Methods for identifying and modulating immune phenotypes
CN105543196A (zh) * 2016-03-01 2016-05-04 中国水稻研究所 植物Cas9变体蛋白VRER及其编码基因与应用
CN105543195A (zh) * 2016-03-01 2016-05-04 中国水稻研究所 植物Cas9变体蛋白VQR及其编码基因与应用
ME03487B (me) 2016-03-04 2020-01-20 4D Pharma Plc Kompozicije koje sadrže blautia bakterijske sojeve za liječenje visceralne hipersenzitivnosti
JP2019507610A (ja) 2016-03-04 2019-03-22 インドア バイオテクノロジーズ インコーポレイテッド ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓゲノム編集に基づく、Ｆｅｌ ｄ１ノックアウト並びに関連組成物及び方法
GB201612191D0 (en) 2016-07-13 2016-08-24 4D Pharma Plc Compositions comprising bacterial strains
CN109414414A (zh) 2016-03-16 2019-03-01 戴维·格拉德斯通研究所 用于治疗肥胖症和/或糖尿病以及用于鉴定候选治疗剂的方法和组合物
EP3219799A1 (en) 2016-03-17 2017-09-20 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Conditional crispr sgrna expression
US11427861B2 (en) 2016-03-17 2022-08-30 Massachusetts Institute Of Technology Methods for identifying and modulating co-occurant cellular phenotypes
US20200291370A1 (en) * 2016-03-18 2020-09-17 President And Fellows Of Harvard College Mutant Cas Proteins
WO2017165859A1 (en) * 2016-03-24 2017-09-28 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Modified viral capsid proteins
US11597924B2 (en) 2016-03-25 2023-03-07 Editas Medicine, Inc. Genome editing systems comprising repair-modulating enzyme molecules and methods of their use
US11512311B2 (en) 2016-03-25 2022-11-29 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (A1AT) deficiency
US11236313B2 (en) 2016-04-13 2022-02-01 Editas Medicine, Inc. Cas9 fusion molecules, gene editing systems, and methods of use thereof
CN109715808A (zh) 2016-04-15 2019-05-03 诺华股份有限公司 用于选择性蛋白质表达的组合物和方法
EP3445853A1 (en) 2016-04-19 2019-02-27 The Broad Institute, Inc. Cpf1 complexes with reduced indel activity
AU2017257274B2 (en) 2016-04-19 2023-07-13 Massachusetts Institute Of Technology Novel CRISPR enzymes and systems
KR20260004568A (ko) 2016-04-19 2026-01-08 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 신규한 crispr 효소 및 시스템
CN107304435A (zh) * 2016-04-22 2017-10-31 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种Cas9/RNA系统及其应用
US11213594B2 (en) 2016-04-29 2022-01-04 Poseida Therapeutics, Inc. Poly(histidine)-based micelles for complexation and delivery of proteins and nucleic acids
US10767175B2 (en) 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
CN109642231A (zh) 2016-06-17 2019-04-16 博德研究所 Vi型crispr直向同源物和系统
AU2017280353B2 (en) 2016-06-24 2021-11-11 Inscripta, Inc. Methods for generating barcoded combinatorial libraries
WO2018005445A1 (en) 2016-06-27 2018-01-04 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for detecting and treating diabetes
US12595478B2 (en) 2016-06-29 2026-04-07 The Broad Institute, Inc. Crispr-Cas systems having destabilization domain
US10544390B2 (en) 2016-06-30 2020-01-28 Zymergen Inc. Methods for generating a bacterial hemoglobin library and uses thereof
EP3478845A4 (en) 2016-06-30 2019-07-31 Zymergen, Inc. METHOD OF GENERATING A GLUCOSE PERMEASE LIBRARY AND USES THEREOF
MA45670A (fr) 2016-07-13 2019-05-22 Vertex Pharma Procédés, compositions et kits pour augmenter l'efficacité d'édition du génome
TWI802545B (zh) 2016-07-13 2023-05-21 英商４Ｄ製藥有限公司 包含細菌菌株之組合物
SG11201900344YA (en) 2016-07-15 2019-02-27 Novartis Ag Treatment and prevention of cytokine release syndrome using a chimeric antigen receptor in combination with a kinase inhibitor
BR112019001887A2 (pt) 2016-08-02 2019-07-09 Editas Medicine Inc composições e métodos para o tratamento de doença associada a cep290
CN110214183A (zh) 2016-08-03 2019-09-06 哈佛大学的校长及成员们 腺苷核碱基编辑器及其用途
US11078481B1 (en) 2016-08-03 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for screening for cancer targets
WO2018031683A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
BR112019002779A2 (pt) * 2016-08-12 2019-05-14 Toolgen Incorporated elemento imunorregulador manipulado e imunidade alterada por este
WO2018035364A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 The Broad Institute Inc. Product and methods useful for modulating and evaluating immune responses
WO2018035387A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
EP3500967A1 (en) 2016-08-17 2019-06-26 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying class 2 crispr-cas systems
EP4485466A3 (en) 2016-08-17 2025-04-02 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
SG11201901306XA (en) * 2016-08-19 2019-03-28 Toolgen Inc Artificially engineered angiogenesis regulatory system
JP2019524149A (ja) 2016-08-20 2019-09-05 アベリノ ラボ ユーエスエー インコーポレイテッドＡｖｅｌｌｉｎｏ Ｌａｂ ＵＳＡ， Ｉｎｃ． 一本鎖ガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、及びそれらの使用方法
WO2020225754A1 (en) 2019-05-06 2020-11-12 Mcmullen Tara Crispr gene editing for autosomal dominant diseases
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US11078483B1 (en) 2016-09-02 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for measuring and improving CRISPR reagent function
US11525119B2 (en) 2016-09-06 2022-12-13 The Children's Medical Center Corporation Immune cells derived from induced pluripotent stem cell
WO2018049025A2 (en) 2016-09-07 2018-03-15 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses
ES2985812T3 (es) 2016-09-09 2024-11-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanfordjunior Univ Edición genómica de precisión de alto rendimiento
IL247752A0 (en) 2016-09-11 2016-11-30 Yeda Res & Dev Compositions and methods for modulating gene expression for site-directed mutagenesis
US20190225974A1 (en) 2016-09-23 2019-07-25 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Targeted genome optimization in plants
CN109844126A (zh) 2016-09-28 2019-06-04 诺华股份有限公司 基于多孔膜的大分子递送系统
US12499971B2 (en) 2016-09-28 2025-12-16 The Broad Institute, Inc. Systematic screening and mapping of regulatory elements in non-coding genomic regions, methods, compositions, and applications thereof
MX2019003674A (es) 2016-09-30 2021-01-08 Univ California Enzimas modificadoras de ácido nucleico guiadas por arn y métodos de uso de estas.
US10669539B2 (en) 2016-10-06 2020-06-02 Pioneer Biolabs, Llc Methods and compositions for generating CRISPR guide RNA libraries
US12447213B2 (en) 2016-10-07 2025-10-21 The Broad Institute, Inc. Modulation of novel immune checkpoint targets
KR102622411B1 (ko) 2016-10-14 2024-01-10 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵염기 에디터의 aav 전달
GB201617559D0 (en) 2016-10-17 2016-11-30 University Court Of The University Of Edinburgh The Swine comprising modified cd163 and associated methods
CN110520530A (zh) 2016-10-18 2019-11-29 明尼苏达大学董事会 肿瘤浸润性淋巴细胞和治疗方法
WO2018081531A2 (en) 2016-10-28 2018-05-03 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Methods for human t-cell activation
JP7211940B2 (ja) * 2016-10-28 2023-01-24 ジェネトン 筋緊張性ジストロフィーの治療のための組成物および方法
EP3535396A1 (en) 2016-11-01 2019-09-11 Novartis AG Methods and compositions for enhancing gene editing
US20190264218A1 (en) 2016-11-04 2019-08-29 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Novel Plant Cells, Plants, and Seeds
WO2018089386A1 (en) 2016-11-11 2018-05-17 The Broad Institute, Inc. Modulation of intestinal epithelial cell differentiation, maintenance and/or function through t cell action
US9816093B1 (en) 2016-12-06 2017-11-14 Caribou Biosciences, Inc. Engineered nucleic acid-targeting nucleic acids
US12404514B2 (en) 2016-12-09 2025-09-02 The Broad Institute, Inc. CRISPR-systems for modifying a trait of interest in a plant
US11674128B2 (en) * 2016-12-12 2023-06-13 Tsinghua University Engineering of a minimal SaCas9 CRISPR/Cas system for gene editing and transcriptional regulation optimized by enhanced guide RNA
GB201621123D0 (en) 2016-12-12 2017-01-25 4D Pharma Plc Compositions comprising bacterial strains
AU2017378427A1 (en) 2016-12-14 2019-06-20 Ligandal, Inc. Methods and compositions for nucleic acid and protein payload delivery
EP3555297A1 (en) 2016-12-19 2019-10-23 Editas Medicine, Inc. Assessing nuclease cleavage
CN110213961A (zh) 2016-12-22 2019-09-06 孟山都技术公司 基于基因组编辑的作物工程化和生产矮秆植物
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
US11859219B1 (en) 2016-12-30 2024-01-02 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of altering a target nucleotide sequence with an RNA-guided nuclease and a single guide RNA
WO2018127585A1 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Txcell Monospecific regulatory t cell population with cytotoxicity for b cells
JP7229923B2 (ja) 2017-01-06 2023-02-28 エディタス・メディシン、インコーポレイテッド ヌクレアーゼ切断を評価する方法
EP3346001A1 (en) 2017-01-06 2018-07-11 TXCell Monospecific regulatory t cell population with cytotoxicity for b cells
DK3565891T3 (da) 2017-01-09 2023-07-24 Whitehead Inst Biomedical Res Fremgangsmåder til ændring af genekspression ved forstyrrelse af transkriptionsfaktor-multimere, der strukturerer regulatoriske sløjfer
ES2912408T3 (es) 2017-01-26 2022-05-25 Novartis Ag Composiciones de CD28 y métodos para terapia con receptores quiméricos para antígenos
WO2018140899A1 (en) 2017-01-28 2018-08-02 Inari Agriculture, Inc. Novel plant cells, plants, and seeds
CN110582509A (zh) 2017-01-31 2019-12-17 诺华股份有限公司 使用具有多特异性的嵌合t细胞受体蛋白治疗癌症
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
JP2020507312A (ja) 2017-02-10 2020-03-12 ザイマージェン インコーポレイテッド 複数の宿主用の複数のｄｎａコンストラクトのアセンブリ及び編集のためのモジュラーユニバーサルプラスミド設計戦略
WO2018160731A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Novartis Ag Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy
US11344629B2 (en) 2017-03-01 2022-05-31 Charles Jeffrey Brinker Active targeting of cells by monosized protocells
CN110612353A (zh) 2017-03-03 2019-12-24 加利福尼亚大学董事会 经由抑制性tRNAs和脱氨酶对突变进行RNA靶向
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US12390514B2 (en) 2017-03-09 2025-08-19 President And Fellows Of Harvard College Cancer vaccine
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
WO2018170184A1 (en) 2017-03-14 2018-09-20 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
JP2020511141A (ja) 2017-03-15 2020-04-16 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 新規Ｃａｓ１３ｂオルソログＣＲＩＳＰＲ酵素及び系
WO2018170515A1 (en) 2017-03-17 2018-09-20 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying and modulating co-occurant cellular phenotypes
KR20240116572A (ko) 2017-03-23 2024-07-29 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵산 프로그램가능한 dna 결합 단백질을 포함하는 핵염기 편집제
WO2018175924A1 (en) 2017-03-24 2018-09-27 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for regulating innate lymphoid cell inflammatory responses
US11963966B2 (en) 2017-03-31 2024-04-23 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for treating ovarian tumors
WO2018183921A1 (en) 2017-04-01 2018-10-04 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for detecting and modulating an immunotherapy resistance gene signature in cancer
AU2018251801B2 (en) 2017-04-12 2024-11-07 Massachusetts Institute Of Technology Novel type VI CRISPR orthologs and systems
US12331319B2 (en) 2017-04-12 2025-06-17 The Broad Institute, Inc. Respiratory and sweat gland ionocytes
US12590288B2 (en) 2017-04-12 2026-03-31 The Broad Institute, Inc. Method of treating an inflammatory disease by administering an agent which binds a surface receptor on a tuft cell that induces an ILC class 2 inflammatory response
EP3610266A4 (en) 2017-04-12 2021-04-21 Massachusetts Eye and Ear Infirmary TUMOR SIGNATURE OF METASTASIS, COMPOSITIONS OF SUBSTANCES AND USES THEREOF
WO2018191750A2 (en) 2017-04-14 2018-10-18 The Broad Institute Inc. Novel delivery of large payloads
MX2019012398A (es) 2017-04-18 2020-09-25 Broad Inst Inc Composiciones para detectar secreciones y metodos de uso.
KR102746223B1 (ko) 2017-04-20 2024-12-27 이제네시스, 인크. 유전자 변형 동물의 생성 방법
US11591589B2 (en) 2017-04-21 2023-02-28 The General Hospital Corporation Variants of Cpf1 (Cas12a) with altered PAM specificity
US12208140B2 (en) 2017-04-21 2025-01-28 The Broad Institute, Inc. Targeted delivery to beta cells
US20200179511A1 (en) 2017-04-28 2020-06-11 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
EP3615055A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
US11499151B2 (en) 2017-04-28 2022-11-15 Editas Medicine, Inc. Methods and systems for analyzing guide RNA molecules
US11591601B2 (en) 2017-05-05 2023-02-28 The Broad Institute, Inc. Methods for identification and modification of lncRNA associated with target genotypes and phenotypes
JP7235391B2 (ja) * 2017-05-08 2023-03-08 ツールゲン インコーポレイテッド 人工的に操作された免疫細胞
WO2018208998A1 (en) 2017-05-10 2018-11-15 The Regents Of The University Of California Directed editing of cellular rna via nuclear delivery of crispr/cas9
EP3622070A2 (en) 2017-05-10 2020-03-18 Editas Medicine, Inc. Crispr/rna-guided nuclease systems and methods
EP3622092A4 (en) 2017-05-11 2021-06-23 The Broad Institute, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS OF USE OF CD8 + TUMOR-INFILTRATING LYMPHOCYTE SUBTYPES AND GENE SIGNATURES THEREOF
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11692184B2 (en) 2017-05-16 2023-07-04 The Regents Of The University Of California Thermostable RNA-guided endonucleases and methods of use thereof
US11866697B2 (en) 2017-05-18 2024-01-09 The Broad Institute, Inc. Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
WO2018213726A1 (en) 2017-05-18 2018-11-22 The Broad Institute, Inc. Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
DK3630136T3 (da) 2017-05-22 2021-05-25 4D Pharma Res Ltd Sammensætninger, der omfatter bakteriestammer
EP3630942B1 (en) 2017-05-24 2022-11-30 4D Pharma Research Limited Compositions comprising bacterial strain
EP3630849A4 (en) 2017-05-25 2021-01-13 The General Hospital Corporation BIPARTITE BASIC EDITOR (BBE) AND TYPE II-C-CAS9 ZINC FINGER EDITOR ARCHITECTURES
EP3630975B1 (en) * 2017-05-26 2025-11-19 North Carolina State University Altered guide rnas for modulating cas9 activity and methods of use
EP3409104A1 (en) 2017-05-31 2018-12-05 Vilmorin et Cie Tomato plant resistant to tomato yellow leaf curl virus, powdery mildew, and nematodes
WO2020249996A1 (en) 2019-06-14 2020-12-17 Vilmorin & Cie Resistance in plants of solanum lycopersicum to the tobamovirus tomato brown rugose fruit virus
EP3409106A1 (en) 2017-06-01 2018-12-05 Vilmorin et Cie Tolerance in plants of solanum lycopersicum to the tobamovirus tomato brown rugose fruit virus (tbrfv)
CA3102054A1 (en) 2017-06-05 2018-12-13 Fred Hutchinson Cancer Research Center Genomic safe harbors for genetic therapies in human stem cells and engineered nanoparticles to provide targeted genetic therapies
CA3065946A1 (en) 2017-06-05 2018-12-13 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Enhanced modified viral capsid proteins
WO2018226900A2 (en) 2017-06-06 2018-12-13 Zymergen Inc. A htp genomic engineering platform for improving fungal strains
WO2018226880A1 (en) 2017-06-06 2018-12-13 Zymergen Inc. A htp genomic engineering platform for improving escherichia coli
US20200190508A1 (en) * 2017-06-07 2020-06-18 Arc Bio, Llc Creation and use of guide nucleic acids
MX2019014640A (es) 2017-06-09 2020-10-05 Editas Medicine Inc Nucleasas de repeticiones palíndromicas agrupadas y regularmente interespaciadas de proteina asociada 9 (cas9) genomanipuladas.
IL271275B1 (en) 2017-06-13 2026-04-01 Flagship Pioneering Innovations V Inc Preparations containing croons and their uses
CA3066189A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 4D Pharma Research Limited Compositions comprising bacterial strains
WO2018232195A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods targeting complement component 3 for inhibiting tumor growth
KR102634727B1 (ko) 2017-06-14 2024-02-07 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션 변형된 가이드 rna, crispr-리보뉴클레오프로테인 복합체 및 사용 방법
SMT202000695T1 (it) 2017-06-14 2021-01-05 4D Pharma Res Limited Composizioni comprendenti ceppi batterici
SMT202000555T1 (it) 2017-06-14 2020-11-10 4D Pharma Res Limited Composizioni comprendenti un ceppo batterico del genere megaspaera e loro usi
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
KR102761791B1 (ko) 2017-06-26 2025-02-05 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 표적화된 핵산 편집을 위한 crispr/cas-아데닌 데아미나아제 기반 조성물, 시스템 및 방법
EP3645021A4 (en) 2017-06-30 2021-04-21 Intima Bioscience, Inc. ADENO-ASSOCIATED VIRAL VECTORS FOR GENE THERAPY
US20200140896A1 (en) 2017-06-30 2020-05-07 Novartis Ag Methods for the treatment of disease with gene editing systems
US11866726B2 (en) 2017-07-14 2024-01-09 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites
US12049643B2 (en) 2017-07-14 2024-07-30 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for modulating cytotoxic lymphocyte activity
US12105089B2 (en) 2017-07-17 2024-10-01 The Broad Institute, Inc. Cell atlas of the healthy and ulcerative colitis human colon
US20190316101A1 (en) 2017-07-18 2019-10-17 Howard Hughes Medical Institute Methods and compositions for genetically manipulating genes and cells
US12239646B2 (en) 2017-07-19 2025-03-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Cancer diagnostic and treatment
WO2019023291A2 (en) 2017-07-25 2019-01-31 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR PRODUCTION AND DECODING OF GUIDE RNA LIBRARIES AND USES THEREOF
CN111801345A (zh) 2017-07-28 2020-10-20 哈佛大学的校长及成员们 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物
SG11202000840YA (en) 2017-07-31 2020-02-27 Reflection Biotechnologies Ltd Cellular models of and therapies for ocular diseases
CA3073448A1 (en) 2017-08-23 2019-02-28 The General Hospital Corporation Engineered crispr-cas9 nucleases with altered pam specificity
EP3676376B1 (en) 2017-08-30 2025-01-15 President and Fellows of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
WO2019051419A1 (en) * 2017-09-08 2019-03-14 University Of North Texas Health Science Center Engineered cas9 variants
US20190076814A1 (en) 2017-09-11 2019-03-14 Synthego Corporation Biopolymer synthesis system and method
SG11202002520UA (en) 2017-09-19 2020-04-29 Univ British Columbia Anti-hla-a2 antibodies and methods of using the same
EP3684822A4 (en) 2017-09-20 2021-06-16 The University of British Columbia NEW ANTI-HLA-A2 ANTIBODIES AND USES THEREOF
IT201700105372A1 (it) * 2017-09-20 2019-03-20 Fondazione St Italiano Tecnologia Molecola di acido nucleico funzionale e relativo uso
CA3076249A1 (en) 2017-09-21 2019-03-28 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Isolation, preservation, compositions and uses of extracts from justicia plants
AU2018338318B2 (en) 2017-09-21 2022-12-22 Massachusetts Institute Of Technology Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
CA3073449A1 (en) 2017-09-25 2019-03-28 Agrospheres, Inc. Compositions and methods for scalable production and delivery of biologicals
US10933027B1 (en) 2017-09-25 2021-03-02 National Technology & Engineering Solutions Of Sandia, Llc Expanded pore particles and delivery methods thereof
WO2019070755A1 (en) 2017-10-02 2019-04-11 The Broad Institute, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR DETECTING AND MODULATING A GENETIC SIGNATURE OF IMMUNOTHERAPY RESISTANCE IN CANCER
WO2019071054A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 The Broad Institute, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODIFYING THE FUNCTION AND STRUCTURE OF BUCKLES AND / OR CHROMATIN DOMAINS
WO2019075197A1 (en) 2017-10-11 2019-04-18 The General Hospital Corporation METHODS OF DETECTION OF INDIVIDUAL SITE-SPECIFIC PARASITE GENOMIC DEAMINATION BY BASE EDITING TECHNOLOGIES
KR20250107288A (ko) 2017-10-16 2025-07-11 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 아데노신 염기 편집제의 용도
US11680296B2 (en) 2017-10-16 2023-06-20 Massachusetts Institute Of Technology Mycobacterium tuberculosis host-pathogen interaction
CA3079681A1 (en) 2017-10-20 2019-04-25 Fred Hutchinson Cancer Research Center Systems and methods to produce b cells genetically modified to express selected antibodies
WO2019135816A2 (en) 2017-10-23 2019-07-11 The Broad Institute, Inc. Novel nucleic acid modifiers
US20210179709A1 (en) 2017-10-31 2021-06-17 Novartis Ag Anti-car compositions and methods
WO2019089803A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for studying cell evolution
EP3704245A1 (en) 2017-11-01 2020-09-09 Novartis AG Synthetic rnas and methods of use
EP3710039A4 (en) 2017-11-13 2021-08-04 The Broad Institute, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF CANCER BY TARGETING THE CLEC2D-KLRB1 PATH
WO2019094955A1 (en) 2017-11-13 2019-05-16 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for targeting developmental and oncogenic programs in h3k27m gliomas
US12221720B2 (en) 2017-11-13 2025-02-11 The Broad Institute, Inc. Methods for determining spatial and temporal gene expression dynamics during adult neurogenesis in single cells
CN120310773A (zh) 2017-11-16 2025-07-15 阿斯利康(瑞典)有限公司 用于改善基于Cas9的敲入策略的有效性的组合物和方法
CR20200251A (es) 2017-11-17 2020-07-17 Iovance Biotherapeutics Inc Expansión de til de aspirados con aguja fina y biopsias por punción
EP3714041A1 (en) 2017-11-22 2020-09-30 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of peripheral blood lymphocytes (pbls) from peripheral blood
WO2019113506A1 (en) 2017-12-07 2019-06-13 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for multiplexing single cell and single nuclei sequencing
CN109912702B (zh) * 2017-12-13 2021-03-16 中国科学院遗传与发育生物学研究所 蛋白质OsARE1在调控植物抗低氮性中的应用
JP2021506251A (ja) 2017-12-14 2021-02-22 クリスパー セラピューティクス アーゲー 新規ｒｎａプログラム可能エンドヌクレアーゼ系、ならびにゲノム編集および他の適用におけるその使用
US12406749B2 (en) 2017-12-15 2025-09-02 The Broad Institute, Inc. Systems and methods for predicting repair outcomes in genetic engineering
WO2019126709A1 (en) 2017-12-22 2019-06-27 The Broad Institute, Inc. Cas12b systems, methods, and compositions for targeted dna base editing
WO2019133881A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 Rubius Therapeutics, Inc. Gene editing and targeted transcriptional modulation for enginerering erythroid cells
US11994512B2 (en) 2018-01-04 2024-05-28 Massachusetts Institute Of Technology Single-cell genomic methods to generate ex vivo cell systems that recapitulate in vivo biology with improved fidelity
AU2019207409B2 (en) 2018-01-12 2023-02-23 Basf Se Gene underlying the number of spikelets per spike qtl in wheat on chromosome 7a
MA51619A (fr) 2018-01-17 2021-04-14 Vertex Pharma Inhibiteurs de la protéine kinase dépendante de l'adn
JP7466448B2 (ja) 2018-01-17 2024-04-12 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｄｎａ－ｐｋ阻害剤
BR112020013626A2 (pt) 2018-01-17 2020-12-01 Vertex Pharmaceuticals Incorporated compostos de quinoxalinona, composições, métodos e kits para aumentar a eficiência de edição de genoma
WO2019147743A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 Massachusetts Institute Of Technology Structure-guided chemical modification of guide rna and its applications
US11926835B1 (en) 2018-01-29 2024-03-12 Inari Agriculture Technology, Inc. Methods for efficient tomato genome editing
US11497752B2 (en) 2018-01-30 2022-11-15 Foghorn Therapeutics Inc. Compounds and uses thereof
CN111699254A (zh) 2018-02-08 2020-09-22 齐默尔根公司 使用crispr在棒状杆菌属中进行基因组编辑
WO2019165168A1 (en) 2018-02-23 2019-08-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas9 orthologs
KR102907245B1 (ko) 2018-03-14 2026-01-05 에디타스 메디신, 인코포레이티드 혈색소병증 치료를 위한 시스템 및 방법
MA52074A (fr) 2018-03-19 2021-01-27 Bayer Healthcare Llc Nouveaux systèmes d'endonucléase à arn programmable et leurs utilisations
JP7522038B2 (ja) 2018-04-06 2024-07-24 ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレーション 体細胞リプログラミングおよびインプリンティングのモジュレートのための組成物および方法
AU2019250692A1 (en) 2018-04-13 2020-11-05 Sangamo Therapeutics France Chimeric antigen receptor specific for Interleukin-23 receptor
US11898203B2 (en) 2018-04-17 2024-02-13 The General Hospital Corporation Highly sensitive in vitro assays to define substrate preferences and sites of nucleic-acid binding, modifying, and cleaving agents
KR102922694B1 (ko) 2018-04-19 2026-02-03 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 유전자 편집을 위한 조성물 및 방법
WO2019204585A1 (en) 2018-04-19 2019-10-24 Massachusetts Institute Of Technology Single-stranded break detection in double-stranded dna
HUE059223T2 (hu) 2018-04-24 2022-10-28 Kws Saat Se & Co Kgaa Jobb emészthetõségû növények és marker haplotípusok
US11957695B2 (en) 2018-04-26 2024-04-16 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions targeting glucocorticoid signaling for modulating immune responses
EP3788094A2 (en) 2018-04-27 2021-03-10 Genedit Inc. Cationic polymer and use for biomolecule delivery
WO2019210153A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
WO2019210268A2 (en) 2018-04-27 2019-10-31 The Broad Institute, Inc. Sequencing-based proteomics
WO2019210131A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Iovance Biotherapeutics, Inc. Closed process for expansion and gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
WO2019213660A2 (en) 2018-05-04 2019-11-07 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for modulating cgrp signaling to regulate innate lymphoid cell inflammatory responses
EP3790974A1 (en) 2018-05-10 2021-03-17 Auxolytic Ltd Gene therapy methods and compositions using auxotrophic regulatable cells
KR20210045360A (ko) 2018-05-16 2021-04-26 신테고 코포레이션 가이드 rna 설계 및 사용을 위한 방법 및 시스템
US12157760B2 (en) 2018-05-23 2024-12-03 The Broad Institute, Inc. Base editors and uses thereof
WO2019232542A2 (en) 2018-06-01 2019-12-05 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for detecting and modulating microenvironment gene signatures from the csf of metastasis patients
US11866719B1 (en) 2018-06-04 2024-01-09 Inari Agriculture Technology, Inc. Heterologous integration of regulatory elements to alter gene expression in wheat cells and wheat plants
WO2019241315A1 (en) 2018-06-12 2019-12-19 Obsidian Therapeutics, Inc. Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy
US12227776B2 (en) 2018-06-13 2025-02-18 Caribou Biosciences, Inc. Engineered cascade components and cascade complexes
TWI890660B (zh) 2018-06-13 2025-07-21 瑞士商諾華公司 Bcma 嵌合抗原受體及其用途
US10227576B1 (en) 2018-06-13 2019-03-12 Caribou Biosciences, Inc. Engineered cascade components and cascade complexes
US12036240B2 (en) 2018-06-14 2024-07-16 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods targeting complement component 3 for inhibiting tumor growth
US11045554B1 (en) 2018-06-22 2021-06-29 National Technology & Engineering Solutions Of Sandia, Llc Lipid-coated particles for treating viral infections
EP3814519A1 (en) 2018-06-26 2021-05-05 The Broad Institute, Inc. Crispr/cas and transposase based amplification compositions, systems and methods
WO2020006036A1 (en) 2018-06-26 2020-01-02 Massachusetts Institute Of Technology Crispr effector system based amplification methods, systems, and diagnostics
EP3823633A4 (en) 2018-06-29 2023-05-03 Editas Medicine, Inc. SYNTHETIC LEAD MOLECULES, COMPOSITIONS AND METHODS RELATED THERETO
EP3814369A1 (en) 2018-06-29 2021-05-05 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut- Antoni van Leeuwenhoek Ziekenhuis Tweak-receptor agonists for use in combination with immunotherapy of a cancer
US12522807B2 (en) 2018-07-09 2026-01-13 The Broad Institute, Inc. RNA programmable epigenetic RNA modifiers and uses thereof
JP2021530212A (ja) 2018-07-13 2021-11-11 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアThe Regents Of The University Of California レトロトランスポゾンベースの送達媒体及びその使用方法
SG11202102068TA (en) 2018-07-31 2021-03-30 Broad Inst Inc Novel crispr enzymes and systems
JP2021532815A (ja) 2018-08-07 2021-12-02 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 新規Ｃａｓ１２ｂ酵素およびシステム
EP3607819A1 (en) 2018-08-10 2020-02-12 Vilmorin et Cie Resistance to xanthomonas campestris pv. campestris (xcc) in cauliflower
KR20210046006A (ko) 2018-08-10 2021-04-27 상가모 테라퓨틱스 프랑스 Tnfr2 도메인을 포함하는 신규한 car 작제물
CA3107002A1 (en) 2018-08-15 2020-04-30 Zymergen Inc. Applications of crispri in high throughput metabolic engineering
US12421507B2 (en) 2018-08-20 2025-09-23 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for optochemical control of CRISPR-CAS9
US20210324357A1 (en) 2018-08-20 2021-10-21 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Degradation domain modifications for spatio-temporal control of rna-guided nucleases
US12275964B2 (en) 2018-08-22 2025-04-15 The Regents Of The University Of California Variant type V CRISPR/Cas effector polypeptides and methods of use thereof
AU2019326408A1 (en) 2018-08-23 2021-03-11 Sangamo Therapeutics, Inc. Engineered target specific base editors
EP3844272A1 (en) 2018-08-28 2021-07-07 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Methods and compositions for modulating a genome
US11479762B1 (en) 2018-08-31 2022-10-25 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
US12545910B2 (en) 2018-08-31 2026-02-10 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
US12534743B2 (en) 2018-08-31 2026-01-27 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
WO2020051507A1 (en) 2018-09-06 2020-03-12 The Broad Institute, Inc. Nucleic acid assemblies for use in targeted delivery
CN112654702B (zh) 2018-09-07 2025-05-13 阿斯利康(瑞典)有限公司 改进的核酸酶的组合物和方法
WO2020056170A1 (en) 2018-09-12 2020-03-19 Fred Hutchinson Cancer Research Center Reducing cd33 expression to selectively protect therapeutic cells
AU2019343045A1 (en) 2018-09-18 2021-05-13 Vnv Newco Inc. ARC-based capsids and uses thereof
US12097239B2 (en) 2018-09-21 2024-09-24 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for treating diabetes, and methods for enriching MRNA coding for secreted proteins
WO2020068798A1 (en) 2018-09-24 2020-04-02 Guo Jimin Living mammalian cells modified with functional modular nanoparticles
JP7250031B2 (ja) * 2018-09-25 2023-03-31 公益財団法人微生物化学研究会 新規ウイルスベクターおよびその製造方法と使用方法
US20220411783A1 (en) 2018-10-12 2022-12-29 The Broad Institute, Inc. Method for extracting nuclei or whole cells from formalin-fixed paraffin-embedded tissues
US20210379057A1 (en) 2018-10-16 2021-12-09 Massachusetts Institute Of Technology Nutlin-3a for use in treating a mycobacterium tuberculosis infection
AU2019360270B2 (en) 2018-10-18 2025-08-07 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for expressing factor IX.
WO2020081808A1 (en) * 2018-10-18 2020-04-23 Chan Zuckerberg Biohub, Inc. Methods and compositions involving thermostable cas9 protein variants
US20210386788A1 (en) 2018-10-24 2021-12-16 Obsidian Therapeutics, Inc. Er tunable protein regulation
US12116458B2 (en) 2018-10-24 2024-10-15 Genedit Inc. Cationic polymer with alkyl side chains and use for biomolecule delivery
US11407995B1 (en) 2018-10-26 2022-08-09 Inari Agriculture Technology, Inc. RNA-guided nucleases and DNA binding proteins
WO2020092453A1 (en) 2018-10-29 2020-05-07 The Broad Institute, Inc. Nucleobase editors comprising geocas9 and uses thereof
SG11202104409YA (en) 2018-10-31 2021-05-28 Zymergen Inc Multiplexed deterministic assembly of dna libraries
US11434477B1 (en) 2018-11-02 2022-09-06 Inari Agriculture Technology, Inc. RNA-guided nucleases and DNA binding proteins
JP7854297B2 (ja) 2018-11-05 2026-05-01 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 改良された腫瘍反応性ｔ細胞の選択
MY210603A (en) 2018-11-05 2025-10-01 Iovance Biotherapeutics Inc Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
US12611427B2 (en) 2018-11-05 2026-04-28 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of NSCLC patients refractory for anti-PD-1 antibody
WO2020096927A1 (en) 2018-11-05 2020-05-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tils utilizing akt pathway inhibitors
US11739320B2 (en) 2018-11-05 2023-08-29 Wisconsin Alumni Research Foundation Gene correction of Pompe disease and other autosomal recessive disorders via RNA-guided nucleases
US12402610B2 (en) 2018-11-09 2025-09-02 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for modulating innate lymphoid cell pathogenic effectors
US12165743B2 (en) 2018-11-09 2024-12-10 The Broad Institute, Inc. Compressed sensing for screening and tissue imaging
WO2020097445A1 (en) 2018-11-09 2020-05-14 Inari Agriculture, Inc. Rna-guided nucleases and dna binding proteins
US11166996B2 (en) 2018-12-12 2021-11-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Anellovirus compositions and methods of use
WO2020123887A2 (en) 2018-12-14 2020-06-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel crispr-cas systems for genome editing
US12264323B2 (en) 2018-12-17 2025-04-01 The Broad Institute, Inc. CRISPR CPF1 direct repeat variants
CN113544266A (zh) 2018-12-17 2021-10-22 博德研究所 Crispr相关转座酶系统和其使用方法
US20220062394A1 (en) 2018-12-17 2022-03-03 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying neoantigens
CA3123392A1 (en) 2018-12-19 2020-06-25 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expanding tumor infiltrating lymphocytes using engineered cytokine receptor pairs and uses thereof
AU2019400930A1 (en) 2018-12-19 2021-07-01 King's College London Immunotherapeutic methods and compositions
KR20210149686A (ko) * 2018-12-27 2021-12-09 라이프에디트 테라퓨틱스, 인크. 유전자 편집에 유용한 폴리펩티드 및 사용 방법
CN113574386A (zh) 2019-01-03 2021-10-29 国家医疗保健研究所 用于增强癌症患者的cd8+t细胞依赖性免疫应答的方法和药物组合物
US11739156B2 (en) 2019-01-06 2023-08-29 The Broad Institute, Inc. Massachusetts Institute of Technology Methods and compositions for overcoming immunosuppression
US12351837B2 (en) 2019-01-23 2025-07-08 The Broad Institute, Inc. Supernegatively charged proteins and uses thereof
US12509453B2 (en) 2019-01-29 2025-12-30 Foghorn Therapeutics Inc. BRM/BRG1 inhibitors and uses thereof
US11946040B2 (en) 2019-02-04 2024-04-02 The General Hospital Corporation Adenine DNA base editor variants with reduced off-target RNA editing
WO2020163856A1 (en) 2019-02-10 2020-08-13 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Modified mitochondrion and methods of use thereof
US20220298494A1 (en) * 2019-02-14 2022-09-22 Metagenomi Ip Technologies, Llc Enzymes with ruvc domains
US10913941B2 (en) 2019-02-14 2021-02-09 Metagenomi Ip Technologies, Llc Enzymes with RuvC domains
CA3241703C (en) * 2019-02-14 2026-02-24 Metagenomi Therapeutics, Inc. Enzymes with ruvc domains
GB201902277D0 (en) 2019-02-19 2019-04-03 King S College London Therapeutic agents
US12208164B2 (en) 2019-02-28 2025-01-28 Unm Rainforest Innovations Modular metal-organic polyhedra superassembly compositions
WO2020180733A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes from liquid tumors and therapeutic uses thereof
MX2021010559A (es) 2019-03-07 2021-12-15 Univ California Polipéptidos efectores de crispr-cas y métodos de uso de estos.
MX2021010840A (es) 2019-03-08 2022-01-19 Obsidian Therapeutics Inc Composiciones de anhidrasa carbónica 2 (ca2) humana y métodos de regulación ajustable.
US11053515B2 (en) 2019-03-08 2021-07-06 Zymergen Inc. Pooled genome editing in microbes
CN113728106A (zh) 2019-03-08 2021-11-30 齐默尔根公司 微生物中的迭代基因组编辑
US12534714B2 (en) 2019-03-18 2026-01-27 The Broad Institute, Inc. Type VII CRISPR proteins and systems
WO2020191233A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing nucleotide sequences
WO2020206036A1 (en) 2019-04-01 2020-10-08 The Broad Institute, Inc. Novel nucleic acid modifier
GB201905360D0 (en) 2019-04-16 2019-05-29 Univ Nottingham Fungal strains, production and uses thereof
US12473543B2 (en) 2019-04-17 2025-11-18 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors with reduced off-target effects
CA3137382A1 (en) 2019-04-23 2020-10-29 Genedit Inc. Cationic polymer with alkyl side chains
EP3959320A1 (en) 2019-04-24 2022-03-02 Novartis AG Compositions and methods for selective protein degradation
SG11202112161TA (en) 2019-05-03 2021-12-30 Specific Biologics Inc Lipid-encapsulated dual-cleaving endonuclease for dna and gene editing
US11162079B2 (en) 2019-05-10 2021-11-02 The Regents Of The University Of California Blood type O Rh-hypo-immunogenic pluripotent cells
WO2020229533A1 (en) 2019-05-13 2020-11-19 KWS SAAT SE & Co. KGaA Drought tolerance in corn
WO2020232029A1 (en) 2019-05-13 2020-11-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for selecting tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
US12116583B2 (en) 2019-05-14 2024-10-15 Yield10 Bioscience, Inc. Modified plants comprising a polynucleotide comprising a non-cognate promoter operably linked to a coding sequence that encodes a transcription factor
WO2020236972A2 (en) 2019-05-20 2020-11-26 The Broad Institute, Inc. Non-class i multi-component nucleic acid targeting systems
US20220235340A1 (en) * 2019-05-20 2022-07-28 The Broad Institute, Inc. Novel crispr-cas systems and uses thereof
JP2022533713A (ja) 2019-05-21 2022-07-25 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 調節性ｔ細胞における制御された導入遺伝子発現
AR118995A1 (es) 2019-05-25 2021-11-17 Kws Saat Se & Co Kgaa Mejorador de la inducción de haploides
US20220340712A1 (en) 2019-05-28 2022-10-27 GenEdit, Inc. Polymer comprising multiple functionalized sidechains for biomolecule delivery
BR112021021149A2 (pt) 2019-05-29 2021-12-14 Monsanto Technology Llc Métodos e composições para a geração de alelos dominantes utilizando a edição de genomas
WO2020243661A1 (en) 2019-05-31 2020-12-03 The Broad Institute, Inc. Methods for treating metabolic disorders by targeting adcy5
WO2020244759A1 (en) 2019-06-05 2020-12-10 Klemm & Sohn Gmbh & Co. Kg New plants having a white foliage phenotype
WO2020254850A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Vilmorin & Cie Improvement of quality and permanence of green color of peppers at maturity and over-maturity
CN114630910A (zh) 2019-06-25 2022-06-14 伊纳瑞农业技术有限公司 改善的同源依赖修复基因组编辑
SG11202111943UA (en) 2019-07-02 2021-11-29 Hutchinson Fred Cancer Res Recombinant ad35 vectors and related gene therapy improvements
WO2021009299A1 (en) 2019-07-17 2021-01-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Bcl-xl:fkbp12 fusion proteins suitable for screening agents capable of slowing down the aging process
EP3999103A4 (en) 2019-07-19 2023-11-22 Inari Agriculture Technology, Inc. GENOMIC EDITING FOR ENHANCED HOMOLOGY-DIRECTED REPAIR
WO2021019272A1 (en) 2019-07-31 2021-02-04 Vilmorin & Cie Tolerance to tolcndv in cucumber
CN114340656B (zh) * 2019-08-02 2024-07-30 孟山都技术公司 使用huh内切核酸酶促进靶向基因组修饰的方法和组合物
WO2021026294A1 (en) 2019-08-06 2021-02-11 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions for reconstituting microglia
EP3772542A1 (en) 2019-08-07 2021-02-10 KWS SAAT SE & Co. KGaA Modifying genetic variation in crops by modulating the pachytene checkpoint protein 2
US20240175055A1 (en) * 2019-08-08 2024-05-30 Fudan University Crispr/cas9 gene editing system and application thereof
WO2021028359A1 (en) 2019-08-09 2021-02-18 Sangamo Therapeutics France Controlled expression of chimeric antigen receptors in t cells
WO2021041922A1 (en) 2019-08-30 2021-03-04 The Broad Institute, Inc. Crispr-associated mu transposase systems
WO2021046451A1 (en) 2019-09-06 2021-03-11 Obsidian Therapeutics, Inc. Compositions and methods for dhfr tunable protein regulation
US20230279373A1 (en) * 2019-09-09 2023-09-07 Beam Therapeutics Inc. Novel crispr enzymes, methods, systems and uses thereof
CN115175996A (zh) 2019-09-20 2022-10-11 博德研究所 新颖vi型crispr酶和系统
CN114729376A (zh) 2019-09-23 2022-07-08 欧米茄治疗公司 用于调节肝细胞核因子4α(HNF4α)基因表达的组合物和方法
EP4048807A1 (en) 2019-09-23 2022-08-31 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating apolipoprotein b (apob) gene expression
US11981922B2 (en) 2019-10-03 2024-05-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions for the modulation of cell interactions and signaling in the tumor microenvironment
US12435330B2 (en) 2019-10-10 2025-10-07 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing RNA
EP3808766A1 (en) 2019-10-15 2021-04-21 Sangamo Therapeutics France Chimeric antigen receptor specific for interleukin-23 receptor
AU2020368539A1 (en) 2019-10-16 2022-04-28 Massachusetts Institute Of Technology Engineered muscle targeting compositions
EP4045522A1 (en) 2019-10-17 2022-08-24 KWS SAAT SE & Co. KGaA Enhanced disease resistance of crops by downregulation of repressor genes
EP4048295A1 (en) 2019-10-25 2022-08-31 Iovance Biotherapeutics, Inc. Gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
US12521451B2 (en) 2019-11-08 2026-01-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. CRISPR and AAV strategies for x-linked juvenile retinoschisis therapy
KR20220097985A (ko) * 2019-11-13 2022-07-08 크리스퍼 테라퓨틱스 아게 Car-t 세포의 제조 방법
CN114929862A (zh) * 2019-11-13 2022-08-19 克里斯珀医疗股份公司 用于制备表达嵌合抗原受体的t细胞的生产方法
WO2021094805A1 (en) 2019-11-14 2021-05-20 Vilmorin & Cie Resistance to acidovorax valerianellae in corn salad
CA3158963A1 (en) 2019-11-22 2021-05-27 Samir Mitragotri Ionic liquids for drug delivery
AU2020395113A1 (en) 2019-12-02 2022-06-09 Shape Therapeutics Inc. Therapeutic editing
US12516291B2 (en) 2019-12-11 2026-01-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for the production of tumor infiltrating lymphocytes (TILs) and methods of using the same
EP4058032A4 (en) 2019-12-19 2024-01-10 Entrada Therapeutics, Inc. Compositions for delivery of antisense compounds
IL271656A (en) 2019-12-22 2021-06-30 Yeda Res & Dev System and methods for identifying cells that have undergone genome editing
WO2021146222A1 (en) 2020-01-13 2021-07-22 Sana Biotechnology, Inc. Modification of blood type antigens
WO2021150919A1 (en) 2020-01-23 2021-07-29 The Children's Medical Center Corporation Stroma-free t cell differentiation from human pluripotent stem cells
WO2021151073A2 (en) 2020-01-24 2021-07-29 The General Hospital Corporation Unconstrained genome targeting with near-pamless engineered crispr-cas9 variants
WO2021151085A2 (en) 2020-01-24 2021-07-29 The General Hospital Corporation Crispr-cas enzymes with enhanced on-target activity
AU2021213811A1 (en) 2020-01-29 2022-07-28 Foghorn Therapeutics Inc. Compounds and uses thereof
EP3872190A1 (en) 2020-02-26 2021-09-01 Antibodies-Online GmbH A method of using cut&run or cut&tag to validate crispr-cas targeting
KR20230053735A (ko) 2020-03-04 2023-04-21 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이아이, 엘엘씨 게놈의 조정을 위한 개선된 방법 및 조성물
CA3173528A1 (en) 2020-03-11 2021-09-16 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating forkhead box p3 (foxp3) gene expression
WO2021186056A1 (en) 2020-03-20 2021-09-23 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Chimeric antigen receptor specific for human cd45rc and uses thereof
WO2021202568A1 (en) 2020-03-31 2021-10-07 Metagenomi Ip Technologies, Llc Class ii, type ii crispr systems
US12057197B2 (en) 2020-04-03 2024-08-06 Creyon Bio, Inc. Oligonucleotide-based machine learning
US11433121B1 (en) 2020-04-03 2022-09-06 National Technology & Engineering Solutions Of Sandia, Llc Lipid composition for the delivery of therapeutic cargos
US20250263752A1 (en) 2020-04-21 2025-08-21 Aspen Neuroscience, Inc. Gene editing of gba1 in stem cells and method of use of cells differentiated therefrom
WO2021216623A1 (en) 2020-04-21 2021-10-28 Aspen Neuroscience, Inc. Gene editing of lrrk2 in stem cells and method of use of cells differentiated therefrom
WO2021217082A1 (en) 2020-04-23 2021-10-28 Genedit Inc. Polymer with cationic and hydrophobic side chains
KR20230002481A (ko) * 2020-04-24 2023-01-05 기초과학연구원 Cas9 또는 cas9 변이체를 이용한 유전체 교정
CA3176826A1 (en) 2020-05-04 2021-11-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
EP4146797A1 (en) 2020-05-06 2023-03-15 Orchard Therapeutics (Europe) Limited Treatment for neurodegenerative diseases
IL297761A (en) 2020-05-08 2022-12-01 Broad Inst Inc Methods and compositions for simultaneously editing two helices of a designated double-helix nucleotide sequence
US12383555B2 (en) 2020-05-20 2025-08-12 Foghorn Therapeutics Inc. Methods of treating cancers
CN115698335A (zh) 2020-05-22 2023-02-03 因斯特罗公司 使用机器学习模型预测疾病结果
AR122206A1 (es) 2020-05-29 2022-08-24 Kws Saat Se & Co Kgaa Inducción de haploides en plantas
WO2021245435A1 (en) 2020-06-03 2021-12-09 Vilmorin & Cie Melon plants resistant to scab disease, aphids and powdery mildew
AU2021285274A1 (en) 2020-06-05 2023-02-02 Vilmorin & Cie Resistance in plants of solanum lycopersicum to the TOBRFV
JP2023529211A (ja) 2020-06-11 2023-07-07 ノバルティス アーゲー Ｚｂｔｂ３２阻害剤及びその使用
EP4189071A1 (en) 2020-08-03 2023-06-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Population of treg cells functionally committed to exert a regulatory activity and their use for adoptive therapy
WO2022034474A1 (en) 2020-08-10 2022-02-17 Novartis Ag Treatments for retinal degenerative diseases
WO2022040444A1 (en) 2020-08-20 2022-02-24 A2 Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating egfr positive cancers
CA3188867A1 (en) 2020-08-20 2022-02-24 Xueyin Wang Compositions and methods for treating ceacam positive cancers
IL300500A (en) 2020-08-20 2023-04-01 A2 Biotherapeutics Inc Preparations and methods for the treatment of mesothelin positive cancer
EP4221492A1 (en) 2020-10-02 2023-08-09 Vilmorin & Cie Melon with extended shelf life
WO2022076606A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
JP2023546359A (ja) 2020-10-06 2023-11-02 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 腫瘍浸潤リンパ球療法によるｎｓｃｌｃ患者の治療
WO2022101286A1 (en) 2020-11-11 2022-05-19 Leibniz-Institut Für Pflanzenbiochemie Fusion protein for editing endogenous dna of a eukaryotic cell
CA3198447A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Novartis Ag Combination therapies with chimeric antigen receptor (car)-expressing cells
EP4001429A1 (en) 2020-11-16 2022-05-25 Antibodies-Online GmbH Analysis of crispr-cas binding and cleavage sites followed by high-throughput sequencing (abc-seq)
IL303102A (en) 2020-12-03 2023-07-01 Vilmorin & Cie Tomato plants resistant to TOMMV, TOMV, TMV, TOBRFV and suitable resistant genes
EP4262827A1 (en) 2020-12-17 2023-10-25 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancers with tumor infiltrating lymphocytes
AU2021401302A1 (en) 2020-12-17 2023-07-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with ctla-4 and pd-1 inhibitors
TW202235622A (zh) 2020-12-23 2022-09-16 美商旗艦先鋒創新公司 包裹rna之指環病毒(anellovirus)蛋白殼之活體外組裝
WO2022165260A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of making modified tumor infiltrating lymphocytes and their use in adoptive cell therapy
WO2022177979A1 (en) 2021-02-16 2022-08-25 A2 Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating her2 positive cancers
GB202103131D0 (en) 2021-03-05 2021-04-21 Biosystems Tech Limited Method for preparation of research organisms
US12606553B2 (en) 2021-03-09 2026-04-21 Foghorn Therapeutics Inc. Crystalline forms, compositions containing same, and methods of their use
US20240191191A1 (en) 2021-03-19 2024-06-13 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods for infiltrating lymphocyte (til) expansion related to cd39/cd69 selection and gene knockout in tils
JP2024512029A (ja) 2021-03-25 2024-03-18 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド Ｔ細胞共培養効力アッセイのための方法及び組成物、ならびに細胞療法製品との使用
EP4314016A1 (en) 2021-03-31 2024-02-07 Entrada Therapeutics, Inc. Cyclic cell penetrating peptides
WO2022208489A1 (en) 2021-04-02 2022-10-06 Vilmorin & Cie Semi-determinate or determinate growth habit trait in cucurbita
CA3215830A1 (en) 2021-04-19 2022-10-27 Rafael CUBAS Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
KR20240004618A (ko) * 2021-04-30 2024-01-11 메타지노미, 인크. Ruvc 도메인을 갖는 효소
WO2022235929A1 (en) 2021-05-05 2022-11-10 Radius Pharmaceuticals, Inc. Animal model having homologous recombination of mouse pth1 receptor
EP4337263A1 (en) 2021-05-10 2024-03-20 Entrada Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating interferon regulatory factor-5 (irf-5) activity
AU2022271873A1 (en) 2021-05-10 2024-01-04 Entrada Therapeutics, Inc. Compositions and methods for intracellular therapeutics
WO2022240760A2 (en) 2021-05-10 2022-11-17 Entrada Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING mRNA SPLICING
JP2024519029A (ja) 2021-05-17 2024-05-08 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド Ｐｄ－１遺伝子編集された腫瘍浸潤リンパ球及び免疫療法におけるその使用
EP4347818A2 (en) 2021-06-01 2024-04-10 Arbor Biotechnologies, Inc. Gene editing systems comprising a crispr nuclease and uses thereof
US20240285781A1 (en) 2021-06-11 2024-08-29 GenEdit, Inc. Biodegradable polymer comprising side chains with polyamine and polyalkylene oxide groups
AU2022298774A1 (en) 2021-06-23 2023-12-14 Entrada Therapeutics, Inc. Antisense compounds and methods for targeting cug repeats
US20240327859A1 (en) * 2021-07-02 2024-10-03 University Of Maryland, College Park Cytidine deaminases and methods of genome editing using the same
EP4367242A2 (en) 2021-07-07 2024-05-15 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating secreted frizzled receptor protein 1 (sfrp1) gene expression
EP4373270A2 (en) 2021-07-22 2024-05-29 Iovance Biotherapeutics, Inc. Method for cryopreservation of solid tumor fragments
JP2024527961A (ja) 2021-07-28 2024-07-26 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド Ｋｒａｓ阻害剤と併用した腫瘍浸潤リンパ球療法によるがん患者の治療
WO2023006933A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 KWS SAAT SE & Co. KGaA Plants with improved digestibility and marker haplotypes
MX2024001624A (es) 2021-08-06 2024-04-30 Vilmorin & Cie Resistencia a leveillula taurica en el pimiento.
AU2022335499A1 (en) 2021-08-27 2024-02-22 Metagenomi Therapeutics, Inc. Enzymes with ruvc domains
EP4396357A1 (en) 2021-09-02 2024-07-10 SESVanderHave NV Methods and compositions for ppo herbicide tolerance
JP7125727B1 (ja) 2021-09-07 2022-08-25 国立大学法人千葉大学 核酸配列改変用組成物および核酸配列の標的部位を改変する方法
AU2022343268A1 (en) * 2021-09-08 2024-03-28 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Methods and compositions for modulating a genome
JP2024534945A (ja) 2021-09-10 2024-09-26 アジレント・テクノロジーズ・インク 化学修飾を有するプライム編集のためのガイドｒｎａ
CA3232376A1 (en) 2021-09-20 2023-03-23 Maria KOKKINAKI Multitransgenic pigs comprising ten genetic modifications for xenotransplantation
EP4596696A3 (en) 2021-09-28 2025-08-27 Acrigen Biosciences Compositions and methods for nucleic acid modifications
WO2023052508A2 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Astrazeneca Ab Use of inhibitors to increase efficiency of crispr/cas insertions
WO2023060132A1 (en) * 2021-10-05 2023-04-13 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Allele specific editing to treat fus-induced neurodegeneration
EP4412587A1 (en) 2021-10-08 2024-08-14 President And Fellows Of Harvard College Ionic liquids for drug delivery
WO2023077015A2 (en) 2021-10-27 2023-05-04 Iovance Biotherapeutics, Inc. Systems and methods for coordinating manufacturing of cells for patient-specific immunotherapy
EP4426828A1 (en) 2021-11-01 2024-09-11 Tome Biosciences, Inc. Single construct platform for simultaneous delivery of gene editing machinery and nucleic acid cargo
CA3237482A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Precise genome editing using retrons
CA3237410A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Friedrich Graf Finck VON FINCKENSTEIN Methods of expansion treatment utilizing cd8 tumor infiltrating lymphocytes
EP4389902A4 (en) 2021-11-15 2025-09-10 Nat Univ Corp Tottori Univ METHOD FOR PRODUCING HUMAN ARTIFICIAL CHROMOSOMAL VECTOR IN HUMAN CELLS
AU2022396533A1 (en) 2021-11-24 2024-05-02 Metagenomi Therapeutics, Inc. Endonuclease systems
WO2023093862A1 (en) 2021-11-26 2023-06-01 Epigenic Therapeutics Inc. Method of modulating pcsk9 and uses thereof
GB202118058D0 (en) 2021-12-14 2022-01-26 Univ Warwick Methods to increase yields in crops
US20230279442A1 (en) 2021-12-15 2023-09-07 Versitech Limited Engineered cas9-nucleases and method of use thereof
US20250059239A1 (en) 2021-12-17 2025-02-20 Sana Biotechnology, Inc. Modified paramyxoviridae fusion glycoproteins
WO2023115041A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Sana Biotechnology, Inc. Modified paramyxoviridae attachment glycoproteins
AU2022420615A1 (en) 2021-12-22 2024-07-04 Tome Biosciences, Inc. Co-delivery of a gene editor construct and a donor template
JP2025501755A (ja) 2021-12-23 2025-01-23 ユニバーシティー オブ マサチューセッツ 脆弱ｘ関連障害に対する治療的処置
EP4463135A2 (en) 2022-01-10 2024-11-20 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2023141602A2 (en) 2022-01-21 2023-07-27 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
EP4469065A1 (en) 2022-01-28 2024-12-04 Iovance Biotherapeutics, Inc. Cytokine associated tumor infiltrating lymphocytes compositions and methods
EP4472646A1 (en) 2022-02-01 2024-12-11 Sana Biotechnology, Inc. Cd3-targeted lentiviral vectors and uses thereof
WO2023150647A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Sana Biotechnology, Inc. Methods of repeat dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
EP4479143A1 (en) 2022-02-18 2024-12-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Use of tcr-deficient car-tregs in combination with anti-tcr complex monoclonal antibodies for inducing durable tolerance
WO2023196877A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
EP4256950A1 (en) 2022-04-06 2023-10-11 Vilmorin et Cie Tolerance to cgmmv in cucumber
JP2025512401A (ja) 2022-04-15 2025-04-17 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 特定のサイトカインの組み合わせ及び／またはＡＫＴｉ処理を使用したＴＩＬ拡張プロセス
WO2023205744A1 (en) 2022-04-20 2023-10-26 Tome Biosciences, Inc. Programmable gene insertion compositions
WO2023215831A1 (en) 2022-05-04 2023-11-09 Tome Biosciences, Inc. Guide rna compositions for programmable gene insertion
US20250302994A1 (en) 2022-05-09 2025-10-02 Synteny Therapeutics, Inc. Erythroparvovirus with a modified genome for gene therapy
WO2023219933A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Entrada Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of nucleic acid therapeutics
EP4522201A1 (en) 2022-05-09 2025-03-19 Synteny Therapeutics, Inc. Erythroparvovirus compositions and methods for gene therapy
WO2023220040A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Synteny Therapeutics, Inc. Erythroparvovirus with a modified capsid for gene therapy
CA3251533A1 (en) 2022-05-10 2023-11-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. TREATMENT OF CANCER PATIENTS WITH TUMOR-INFILTRATING LYMPHOCYTE THERAPIES IN COMBINATION WITH AN IL-15R AGONIST
WO2023225670A2 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Tome Biosciences, Inc. Ex vivo programmable gene insertion
AU2023276757A1 (en) 2022-05-25 2024-11-21 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulation of tumor suppressors and oncogenes
US20250319115A1 (en) 2022-05-25 2025-10-16 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and Methods for Modulating Cytokines
WO2023230570A2 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulating genetic drivers
CN119563038A (zh) 2022-05-25 2025-03-04 旗舰创业创新七公司 用于调节免疫应答的组合物和方法
CA3254388A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc COMPOSITIONS AND METHODS OF MODULATING TRAFFIC FACTORS
EP4299733A1 (en) 2022-06-30 2024-01-03 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
EP4299739A1 (en) 2022-06-30 2024-01-03 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
GB2621813A (en) 2022-06-30 2024-02-28 Univ Newcastle Preventing disease recurrence in Mitochondrial replacement therapy
WO2024005863A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
WO2024005864A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
JP2025525569A (ja) 2022-07-18 2025-08-05 レナゲード セラピューティクス マネージメント インコーポレイテッド 遺伝子編集成分、システム、及び使用方法
WO2024020587A2 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Tome Biosciences, Inc. Pleiopluripotent stem cell programmable gene insertion
WO2024023734A1 (en) 2022-07-26 2024-02-01 Bit Bio Limited MULTI-gRNA GENOME EDITING
WO2024030930A2 (en) * 2022-08-01 2024-02-08 The Johns Hopkins University Compositions and methods for modifying muller glial cells
US20260055426A1 (en) 2022-08-19 2026-02-26 Generation Bio Co. CLEAVABLE CLOSED-ENDED DNA (ceDNA) AND METHODS OF USE THEREOF
US20260055146A1 (en) 2022-08-24 2026-02-26 Sana Biotechnology, Inc. Delivery of heterologous proteins
WO2024044723A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
CA3265393A1 (en) 2022-08-26 2024-02-29 KWS SAAT SE & Co. KGaA USE OF PAIRED GENES FOR HYBRID SELECTION
WO2024047587A1 (en) 2022-08-31 2024-03-07 Regel Therapeutics, Inc. Cas-phi compositions and methods of use
WO2024050544A2 (en) 2022-09-01 2024-03-07 J.R. Simplot Company Enhanced targeted knock-in frequency in host genomes through crispr exonuclease processing
WO2024047605A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 SESVanderHave NV Methods and compositions for ppo herbicide tolerance
EP4583905A1 (en) 2022-09-06 2025-07-16 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Novel dual split car-t cells for the treatment of cd38-positive hematological malignancies
WO2024064838A1 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Sana Biotechnology, Inc. Lipid particles comprising variant paramyxovirus attachment glycoproteins and uses thereof
EP4598944A2 (en) 2022-10-03 2025-08-13 The Regents of the University of California Circumventing barriers to hybrid crops from genetically distant crosses
WO2024081820A1 (en) 2022-10-13 2024-04-18 Sana Biotechnology, Inc. Viral particles targeting hematopoietic stem cells
WO2024098024A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes from liquid tumors and therapeutic uses thereof
EP4612277A1 (en) 2022-11-04 2025-09-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods for tumor infiltrating lymphocyte (til) expansion related to cd39/cd103 selection
WO2024102434A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Senda Biosciences, Inc. Rna compositions comprising lipid nanoparticles or lipid reconstructed natural messenger packs
JP2025539816A (ja) 2022-11-21 2025-12-09 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 腫瘍浸潤リンパ球の増幅のための２次元プロセス及びそれからの治療法
WO2024118836A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes with shortened rep step
WO2024119157A1 (en) 2022-12-02 2024-06-06 Sana Biotechnology, Inc. Lipid particles with cofusogens and methods of producing and using the same
WO2024138194A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 Tome Biosciences, Inc. Platforms, compositions, and methods for in vivo programmable gene insertion
CN120417757A (zh) 2022-12-29 2025-08-01 维尔莫林公司 对抗性突破型tswv毒株具有抗性的番茄植物和相应的抗性基因
EP4658061A1 (en) 2023-02-01 2025-12-10 United Beet Seeds Beet yellows virus resistance
WO2024168253A1 (en) 2023-02-10 2024-08-15 Possible Medicines Llc Delivery of an rna guided recombination system
WO2024168265A1 (en) 2023-02-10 2024-08-15 Possible Medicines Llc Aav delivery of rna guided recombination system
KR20250151430A (ko) 2023-02-15 2025-10-21 아버 바이오테크놀로지스, 인크. 스타스민 2(stmn2) 전사체에서 비정상적인 스플라이싱을 억제하는 유전자 편집 방법
US12383615B2 (en) 2023-03-23 2025-08-12 Carbon Biosciences, Inc. Protoparvovirus compositions comprising a protoparvovirus variant VP1 capsid polypeptide and related methods
US12225874B2 (en) 2023-03-27 2025-02-18 Redsea Science And Technology Inc. Tomato plant designated ‘X22-31’
EP4689155A1 (en) 2023-03-29 2026-02-11 Astrazeneca AB Use of inhibitors to increase efficiency of crispr/cas insertions
WO2024211287A1 (en) 2023-04-03 2024-10-10 Seagen Inc. Production cell lines with targeted integration sites
EP4698666A1 (en) 2023-04-18 2026-02-25 Sana Biotechnology, Inc. Universal protein g fusogens and adapter systems thereof and related lipid particles and uses
WO2024220560A1 (en) 2023-04-18 2024-10-24 Sana Biotechnology, Inc. Engineered protein g fusogens and related lipid particles and methods thereof
WO2024220598A2 (en) 2023-04-18 2024-10-24 Sana Biotechnology, Inc. Lentiviral vectors with two or more genomes
TW202449159A (zh) 2023-04-19 2024-12-16 美商旗艦先鋒創新有限責任（Ｖｉｉ）公司 用於產生文庫之組合物及方法
EP4697940A1 (en) 2023-04-21 2026-02-25 Vib Vzw Allelic combinations in crops for yield increase
WO2024223900A1 (en) 2023-04-28 2024-10-31 Vilmorin & Cie Genetic determinants conferring improved tobrfv resistance
WO2024234006A1 (en) 2023-05-11 2024-11-14 Tome Biosciences, Inc. Systems, compositions, and methods for targeting liver sinusodial endothelial cells (lsecs)
AU2024270764A1 (en) 2023-05-15 2025-12-04 Nchroma Bio, Inc. Compositions and methods for epigenetic regulation of hbv gene expression
WO2024236547A1 (en) 2023-05-18 2024-11-21 Inceptor Bio, Llc Modified phagocytic cells expressing chimeric antigen receptors comprising a herpes virus entry mediator (hvem) co-stimulatory domain and uses thereof
EP4716750A1 (en) 2023-05-23 2026-04-01 Sana Biotechnology, Inc. Tandem fusogens and related lipid particles
EP4716741A2 (en) 2023-05-23 2026-04-01 Flagship Labs 114, Inc. Compositions and methods for reducing cxcl9, cxcl10, and cxcl11 gene expression
WO2025006419A1 (en) 2023-06-26 2025-01-02 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Engineered plasmodia and related methods
EP4734755A1 (en) 2023-06-28 2026-05-06 Vilmorin & Cie Pepper resistance to meloidogyne enterolobii
CN121548346A (zh) 2023-07-24 2026-02-17 维尔莫林公司 甜瓜对cysdv的抗性
WO2025030048A2 (en) 2023-08-03 2025-02-06 J.R. Simplot Company Fusarium wilt resistance genes
WO2025046513A1 (en) 2023-08-29 2025-03-06 Inceptor Bio, Llc Methods of manufacturing myeloid-derived cells from hematopoietic stem cells and compositions and uses thereof
WO2025050069A1 (en) 2023-09-01 2025-03-06 Tome Biosciences, Inc. Programmable gene insertion using engineered integration enzymes
AU2024335327A1 (en) 2023-09-01 2026-03-26 Renagade Therapeutics Management Inc. Gene editing systems, compositions, and methods for treatment of vexas syndrome
WO2025054202A1 (en) 2023-09-05 2025-03-13 Sana Biotechnology, Inc. Method of screening a sample comprising a transgene with a unique barcode
WO2025054540A1 (en) 2023-09-08 2025-03-13 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of gene-editing using programmable nucleases
WO2025059215A1 (en) 2023-09-12 2025-03-20 Aadigen, Llc Methods and compositions for treating or preventing cancer
WO2025064408A1 (en) 2023-09-18 2025-03-27 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for treating cardiovascular disease
GB202314578D0 (en) 2023-09-22 2023-11-08 Univ Manchester Methods of producing homoplasmic modified plants or parts thereof
WO2025076141A1 (en) 2023-10-03 2025-04-10 Inari Agriculture Technology, Inc. Viral delivery of grna to the scion
AU2024357861A1 (en) 2023-10-12 2026-04-23 Renagade Therapeutics Management Inc. Nickase-retron template-based precision editing system and methods of use
WO2025101484A1 (en) 2023-11-06 2025-05-15 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of endometrial cancers with tumor infiltrating lymphocyte therapies
US20250161347A1 (en) 2023-11-22 2025-05-22 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Methods and compositions for treating non-alcoholic fatty liver disease
WO2025151838A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Sana Biotechnology, Inc. Safety switches to control in vitro and in vivo proliferation of cell therapy products
WO2025155753A2 (en) 2024-01-17 2025-07-24 Renagade Therapeutics Management Inc. Improved gene editing system, guides, and methods
WO2025168705A1 (en) 2024-02-08 2025-08-14 Vib Vzw Means and methods for the production of saponins with endosomal escape-enhancing properties
WO2025171210A1 (en) 2024-02-09 2025-08-14 Arbor Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for gene editing via homology-mediated end joining
WO2025174765A1 (en) 2024-02-12 2025-08-21 Renagade Therapeutics Management Inc. Lipid nanoparticles comprising coding rna molecules for use in gene editing and as vaccines and therapeutic agents
WO2025184529A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Sana Biotechnology, Inc. Viral particles with fusogen display and related compositions and methods
WO2025186284A1 (en) 2024-03-05 2025-09-12 Vilmorin & Cie Increased yield in cucumber
WO2025194019A1 (en) 2024-03-14 2025-09-18 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Methods for treating liver fibrosis and non-alcoholic fatty liver disease
EP4677108A1 (en) 2024-04-22 2026-01-14 Basecamp Research Ltd Method and compositions for detecting off-target editing
WO2025224182A2 (en) 2024-04-23 2025-10-30 Basecamp Research Ltd Single construct platform for simultaneous delivery of gene editing machinery and nucleic acid cargo
WO2025240947A1 (en) 2024-05-17 2025-11-20 University Of Massachusetts Therapeutic treatment for fragile x-associated disorder
WO2025245188A2 (en) 2024-05-21 2025-11-27 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Methods of treating liver steatosis and non-alcoholic fatty liver disease
US20250382627A1 (en) 2024-06-13 2025-12-18 J.R. Simplot Company Engineering remontant flowering in rosaceae
WO2026006542A2 (en) 2024-06-26 2026-01-02 Yale University Compositions and methods for crispr/cas9 based reactivation of human angelman syndrome
WO2026015832A2 (en) 2024-07-12 2026-01-15 Arbor Biotechnologies, Inc. Reverse transcriptases and gene editing systems comprising such
WO2026015829A2 (en) 2024-07-12 2026-01-15 Arbor Biotechnologies, Inc. Small reverse transcriptases and gene editing systems comprising such
WO2026017833A1 (en) 2024-07-17 2026-01-22 Vilmorin & Cie Tswv-resistant pepper
WO2026036000A1 (en) 2024-08-08 2026-02-12 Invaio Sciences, Inc. Nature-derived lipid particles for use in agriculture
WO2026047626A1 (en) 2024-08-30 2026-03-05 Inceptor Bio, Llc Compositions and methods involving immune cells engineered for binding bispecific antibodies for use in cell therapy

Family Cites Families (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4217344A (en) 1976-06-23 1980-08-12 L'oreal Compositions containing aqueous dispersions of lipid spheres
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4186183A (en) 1978-03-29 1980-01-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Liposome carriers in chemotherapy of leishmaniasis
US4261975A (en) 1979-09-19 1981-04-14 Merck & Co., Inc. Viral liposome particle
US4485054A (en) 1982-10-04 1984-11-27 Lipoderm Pharmaceuticals Limited Method of encapsulating biologically active materials in multilamellar lipid vesicles (MLV)
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US4946787A (en) 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5049386A (en) 1985-01-07 1991-09-17 Syntex (U.S.A.) Inc. N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US4774085A (en) 1985-07-09 1988-09-27 501 Board of Regents, Univ. of Texas Pharmaceutical administration systems containing a mixture of immunomodulators
DE122007000007I2 (de) 1986-04-09 2010-12-30 Genzyme Corp Genetisch transformierte Tiere, die ein gewünschtes Protein in Milch absondern
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
WO1991017424A1 (en) 1990-05-03 1991-11-14 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US7150982B2 (en) 1991-09-09 2006-12-19 Third Wave Technologies, Inc. RNA detection assays
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
AU698739B2 (en) 1995-06-06 1998-11-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5985662A (en) 1995-07-13 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of hepatitis B virus replication
US5622856A (en) * 1995-08-03 1997-04-22 Avigen High efficiency helper system for AAV vector production
US6251677B1 (en) * 1997-08-25 2001-06-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof
EP1025217B1 (en) 1997-10-24 2006-10-04 Invitrogen Corporation Recombinational cloning using nucleic acids having recombination sites
US6750059B1 (en) 1998-07-16 2004-06-15 Whatman, Inc. Archiving of vectors
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US7868149B2 (en) 1999-07-20 2011-01-11 Monsanto Technology Llc Plant genome sequence and uses thereof
US6603061B1 (en) 1999-07-29 2003-08-05 Monsanto Company Agrobacterium-mediated plant transformation method
US7776321B2 (en) 2001-09-26 2010-08-17 Mayo Foundation For Medical Education And Research Mutable vaccines
US20090100536A1 (en) 2001-12-04 2009-04-16 Monsanto Company Transgenic plants with enhanced agronomic traits
FR2862659B1 (fr) * 2003-11-21 2006-02-10 Pasteur Institut Genome de legionella pneumophila souche paris- applications diagnostiques et epidemiologiques
AU2005274948B2 (en) 2004-07-16 2011-09-22 Genvec, Inc. Vaccines against aids comprising CMV/R-nucleic acid constructs
WO2006116756A1 (en) * 2005-04-28 2006-11-02 Benitec, Limited. Multiple-rnai expression cassettes for simultaneous delivery of rnai agents related to heterozygotic expression patterns
DK2341149T3 (en) 2005-08-26 2017-02-27 Dupont Nutrition Biosci Aps Use of CRISPR-associated genes (Cas)
US9677123B2 (en) 2006-03-15 2017-06-13 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Degenerate nucleobase analogs
CN101688241B (zh) 2007-03-02 2015-01-21 杜邦营养生物科学有限公司 具有改善的噬菌体抗性的培养物
US8404658B2 (en) 2007-12-31 2013-03-26 Nanocor Therapeutics, Inc. RNA interference for the treatment of heart failure
WO2010011961A2 (en) * 2008-07-25 2010-01-28 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Prokaryotic rnai-like system and methods of use
US20100076057A1 (en) 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA
US9404098B2 (en) 2008-11-06 2016-08-02 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Method for cleaving a target RNA using a Cas6 polypeptide
KR100948767B1 (ko) * 2008-11-12 2010-03-23 한국기초과학지원연구원 생체 고분자 물질의 상호작용 검출 방법
US8586526B2 (en) 2010-05-17 2013-11-19 Sangamo Biosciences, Inc. DNA-binding proteins and uses thereof
US8927807B2 (en) 2009-09-03 2015-01-06 The Regents Of The University Of California Nitrate-responsive promoter
US8889394B2 (en) 2009-09-07 2014-11-18 Empire Technology Development Llc Multiple domain proteins
US10087431B2 (en) 2010-03-10 2018-10-02 The Regents Of The University Of California Methods of generating nucleic acid fragments
MX2012013037A (es) 2010-05-10 2013-07-29 Univ California Composiciones de endorribonucleasa y metodos de uso de las mismas.
US9405700B2 (en) 2010-11-04 2016-08-02 Sonics, Inc. Methods and apparatus for virtualization in an integrated circuit
WO2012164565A1 (en) 2011-06-01 2012-12-06 Yeda Research And Development Co. Ltd. Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
WO2013141680A1 (en) * 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
US9637739B2 (en) * 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
AU2013266968B2 (en) * 2012-05-25 2017-06-29 Emmanuelle CHARPENTIER Methods and compositions for RNA-directed target DNA modification and for RNA-directed modulation of transcription
AU2013335451C1 (en) 2012-10-23 2024-07-04 Toolgen Incorporated Composition for cleaving a target DNA comprising a guide RNA specific for the target DNA and Cas protein-encoding nucleic acid or Cas protein, and use thereof
PL3360964T3 (pl) 2012-12-06 2020-03-31 Sigma-Aldrich Co. Llc Modyfikacja i regulacja genomu oparta na crispr
WO2014093479A1 (en) 2012-12-11 2014-06-19 Montana State University Crispr (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) rna-guided control of gene regulation
US20140186843A1 (en) 2012-12-12 2014-07-03 Massachusetts Institute Of Technology Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
EP2931899A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
CN113355357B (zh) * 2012-12-12 2024-12-03 布罗德研究所有限公司 对用于序列操纵的改进的系统、方法和酶组合物进行的工程化和优化
EP3031921B1 (en) 2012-12-12 2025-03-12 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
IL239344B2 (en) 2012-12-12 2024-06-01 Broad Inst Inc Systems engineering, methods and optimal guiding components for sequence manipulation
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
WO2014093709A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
EP2840140B2 (en) 2012-12-12 2023-02-22 The Broad Institute, Inc. Crispr-Cas based method for mutation of prokaryotic cells
WO2014093655A2 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
DK2931891T3 (da) 2012-12-17 2019-08-19 Harvard College Rna-styret modificering af menneskelige genomer
CA2930877A1 (en) * 2013-11-18 2015-05-21 Crispr Therapeutics Ag Crispr-cas system materials and methods

Also Published As

Publication number Publication date
AU2013359212B2 (en) 2017-01-19
DK3064585T3 (da) 2020-04-27
WO2014093635A9 (en) 2014-07-24
AU2019236591B2 (en) 2022-02-24
JP2018143253A (ja) 2018-09-20
CA2894684A1 (en) 2014-06-19
US20140273234A1 (en) 2014-09-18
US8895308B1 (en) 2014-11-25
AU2022202048B2 (en) 2025-01-23
SG10201801969TA (en) 2018-04-27
CN113355357A (zh) 2021-09-07
US20140242700A1 (en) 2014-08-28
CN105209621B (zh) 2021-05-25
HK1207119A1 (zh) 2016-01-22
CN105209621A (zh) 2015-12-30
US8889418B2 (en) 2014-11-18
US20140335620A1 (en) 2014-11-13
AU2017202542B2 (en) 2019-07-11
IL239315A0 (en) 2015-07-30
IL239315B2 (en) 2023-07-01
JP2016182140A (ja) 2016-10-20
US20250236856A1 (en) 2025-07-24
JP6665230B2 (ja) 2020-03-13
ES2786193T3 (es) 2020-10-09
KR20150105634A (ko) 2015-09-17
IL300461A (en) 2023-04-01
PL2898075T3 (pl) 2016-09-30
AU2022202048A1 (en) 2022-04-14
SG11201504519TA (en) 2015-07-30
CN113355357B (zh) 2024-12-03
ZA201504081B (en) 2024-06-26
JP6552965B2 (ja) 2019-07-31
IL239315B1 (en) 2023-03-01
JP2016501532A (ja) 2016-01-21
AU2019236591A1 (en) 2019-10-17
JP2024163122A (ja) 2024-11-21
US20170198269A1 (en) 2017-07-13
EP2898075B1 (en) 2016-03-09
WO2014093635A1 (en) 2014-06-19
AU2017202542A1 (en) 2017-05-11
EP2898075A1 (en) 2015-07-29
JP2022113766A (ja) 2022-08-04
DK2898075T3 (en) 2016-06-27
JP7125440B2 (ja) 2022-08-24
US8865406B2 (en) 2014-10-21
US20140186919A1 (en) 2014-07-03
AU2013359212A1 (en) 2015-07-30
SG10201912327SA (en) 2020-02-27
PT2898075E (pt) 2016-06-16
JP6395765B2 (ja) 2018-09-26
JP2020099333A (ja) 2020-07-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2576126T3 (es) Modificación por tecnología genética y optimización de sistemas, métodos y composiciones enzimáticas mejorados para la manipulación de secuencias
US20250250577A1 (en) Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
ES2553782T3 (es) Ingeniería de sistemas, métodos y composiciones de guía optimizadas para manipulación de secuencias
EP3064585B1 (en) Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation
US12571006B2 (en) Constructs and uses thereof for efficient and specific genome editing
US20230416788A1 (en) Gene editing
CN116457462A (zh) 用于高效和特异性基因组编辑的构建体和其用途
ES2618531T3 (es) Sistemas, métodos y composiciones de componentes de CRISPR-Cas para manipulación de secuencias
HK1207119B (en) Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation
HK1209154B (en) Engineering of systems, methods and optimized guide compositions for sequence manipulation
HK1202586B (en) Engineering of systems, methods and optimized guide compositions for sequence manipulation