ES2553782T3 - Ingeniería de sistemas, métodos y composiciones de guía optimizadas para manipulación de secuencias - Google Patents

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ES2553782T3 ES15154539.9T ES15154539T ES2553782T3 ES 2553782 T3 ES2553782 T3 ES 2553782T3 ES 15154539 T ES15154539 T ES 15154539T ES 2553782 T3 ES2553782 T3 ES 2553782T3
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Le Cong
Patrick Hsu
Fei RAN
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Massachusetts Institute of Technology
Broad Institute Inc
Harvard University
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Abstract

Un sistema vector relacionado con Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas (CRISPR)-CRISPR asociado a (Cas) (CRISPR-Cas) de ingeniería, que no está presente en la naturaleza, que comprende uno o más vectores que comprenden: a) un primer elemento regulador unido de manera operable a una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de polinucleótidos del sistema CRISPR-Cas que comprende una secuencia guía, un ARNtracr y una secuencia de emparejamiento tracr, en la que la secuencia guía se hibrida con una o más secuencias objetivo en los sitios de los polinucleótidos en una célula eucariota, b) un segundo elemento regulador unido de manera operable a la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cas9 de Tipo II, c) una plantilla de recombinación en el que los componentes (a), (b) y (c) están situados en los mismos vectores o diferentes vectores del sistema, en el que el sistema comprende además una o más señales de localización nuclear (las NLS) expresadas con la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Cas9, según lo cual la secuencia guía fija como objetivo uno o más sitios de polinucleótidos en una célula eucariota y la proteína Cas9 escinde uno o más sitios de polinucleótidos, según lo cual se modifica la secuencia de uno o más sitios de polinucleótidos.

Description

imagen1
DESCRIPCIÓN
Ingeniería de sistemas, métodos y composiciones de guía optimizadas para manipulación de secuencias.
APLICACIONES RELACIONADAS E INCORPORACIÓN POR REFERENCIA
Campo de la invención
5 La presente invención se refiere en general a sistemas, métodos y composiciones usados para el control de la expresión de genes que implica fijar como objetivo una secuencia, tal como perturbación del genoma o edición de genes, que pueden usar sistemas vector relacionados con Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas (CRISPR, por sus siglas en inglés) y componentes de los mismos.
Informe en cuanto a investigación patrocinada federalmente
10 Esta invención se realizó con soporte del gobierno otorgado por el Pioneer Award del NIH, Institutos Nacionales de Salud, DP1MH100706. El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.
Antecedentes de la invención
Los recientes avances en las técnicas de secuenciación del genoma y métodos de análisis han acelerado significativamente la capacidad para catalogar y cartografiar factores genéticos asociados a un diverso intervalo de 15 funciones biológicas y enfermedades. Se requieren tecnologías precisas para fijar como objetivo genoma para permitir la ingeniería inversa sistemática de variaciones genéticas causales permitiendo la perturbación selectiva de elementos genéticos individuales, así como avanzar las aplicaciones de la biología sintética, biotecnológicas y médicas. Aunque están disponibles técnicas de edición de genoma tales como dedos de cinc diseñadores, efectores del tipo activador de la transcripción (los TALE, por sus siglas en inglés) o meganucleasas de migración para
20 producir perturbaciones del genoma fijado como objetivo, sigue existiendo la necesidad de nuevas tecnologías de ingeniería del genoma que tengan un precio asequible, fáciles de montar, escalables y susceptibles de fijar como objetivo múltiples posiciones dentro del genoma eucariota.
Sumario de la descripción
Existe una necesidad apremiante de sistemas y técnicas alternativos y robustos para fijar como objetivo secuencias
25 con una amplia serie de aplicaciones. Esta invención estudia esta necesidad y proporciona ventajas relacionadas. El CRISPR/Cas o el sistema CRISPR-Cas (ambos términos se usan de manera intercambiable por toda esta solicitud) no requiere la generación de proteínas personalizadas para secuencias específicas fijadas como objetivo sino más bien se puede programar una enzima Cas única mediante una molécula de ARN corta para reconocer un objetivo de ADN específico, en otras palabras la enzima Cas se puede reclutar para un objetivo de ADN específico usando
30 dicha molécula de ARN corta. Añadir el sistema CRISPR-Cas al repertorio de técnicas de secuenciación del genoma y métodos de análisis puede simplificar de manera significativa la metodología y acelerar la capacidad para catalogar y cartografiar factores genéticos asociados a un diverso intervalo de funciones biológicas y enfermedades. Para utilizar el sistema CRISPR-Cas de manera eficaz para editar genoma sin efectos perjudiciales, es crítico comprender aspectos de ingeniería y optimización de estas herramientas de ingeniería del genoma, que son
35 aspectos de la presente descripción.
De acuerdo con la presente invención, se proporciona un sistema vector de CRISPR-Cas de ingeniería, que no está presente en la naturaleza de acuerdo con la reivindicación 1. En las reivindicaciones dependientes se describen aspectos adicionales de la invención. La invención también proporciona los usos del sistema de acuerdo con las reivindicaciones 19 y 20.
40 En un aspecto, la descripción proporciona un sistema vector que comprende uno o más vectores. En algunas realizaciones, el sistema comprende: (a) un primer elemento regulador ligado de manera operable a una secuencia de emparejado tracr y uno o más sitios de inserción para insertar una o más secuencias guía aguas arriba de la secuencia de emparejado tracr, en la que cuando se expresa, la secuencia guía se dirige a unión específica de secuencias de un complejo CRISPR a una secuencia fijada como objetivo en una célula, por ejemplo, célula
45 eucariota, en la que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida a la secuencia fijada como objetivo y (2) la secuencia de emparejado tracr que se hibrida a la secuencia tracr y (b) un segundo elemento regulador ligado de manera operable a una secuencia codificadora de enzimas que codifica dicha enzima CRISPR que comprende una secuencia de localización nuclear; en el que los componentes
(a) y (b) están situados en los mismos vectores o diferentes del sistema. En algunas realizaciones, el componente
50 (a) comprende además la secuencia tracr aguas abajo de la secuencia de emparejamiento tracr bajo el control del primer elemento regulador. En algunas realizaciones, el componente (a) comprende además dos o más secuencias guía ligadas de manera operable al primer elemento regulador, en el que cuando se expresan, cada una de las dos
o más secuencias guía dirige unión específica de la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia objetivo diferente en una célula eucariota. En algunas realizaciones, el sistema comprende la secuencia tracr bajo el control
55 de un tercer elemento regulador, tal como un activador de polimerasa III. En algunas realizaciones, la secuencia tracr presenta al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de complementariedad de secuencias a lo largo de
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la longitud de la secuencia de emparejado tracr cuando se alinean de manera óptima. En algunas realizaciones, el complejo CRISPR comprende una o más secuencias de localización nuclear de suficiente fortaleza para conducir la acumulación de dicho complejo CRISPR en una cantidad detectable en el núcleo de una célula eucariota. Sin desear estar ligados por la teoría, se cree que una secuencia de localización nuclear no es necesariamente para actividad 5 del complejo CRISPR en eucariotas, sino que incluyendo tales secuencias se mejora la actividad del sistema, especialmente en cuanto a moléculas de ácido nucleico fijadas como objetivo en el núcleo. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es una enzima del sistema CRISPR de tipo II. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es una enzima Cas9. En algunas realizaciones, la enzima Cas9 es Cas9 S. pneumoniae, S. pyogenes o S. thermophilus y puede incluir Cas9 mutada derivada de estos organismos. La enzima puede ser un homólogo u ortólogo de Cas9. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es codón-optimizada para expresión en una célula eucariota. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR dirige la escisión de una o dos hebras en la posición de la secuencia objetivo. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR carece de actividad de escisión de la cadena de ADN. En algunas realizaciones, el primer elemento regulador es un activador de la polimerasa III. En algunas realizaciones, el segundo elemento regulador es un activador de la polimerasa II. En algunas realizaciones, la 15 secuencia guía tiene al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 nucleótidos o entre 10-30 o entre 15-25 o entre 15-20 nucleótidos de longitud. En general y por toda esta memoria descriptiva, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Los vectores incluyen, pero no se limitan a, moléculas de ácido nucleico que son monocatenarias, bicatenarias o parcialmente bicatenarias; moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más extremos libres, ningún extremo libre (por ejemplo, circular); moléculas de ácido nucleico que comprenden ADN, ARN o ambos y otras variedades de polinucleótidos conocidos en la técnica. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN de doble cadena circular en que se pueden insertar segmentos de ADN adicionales, tal como por técnicas de clonación molecular clásicas. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que están presentes secuencias de ADN o ARN derivadas víricamente en el vector para empaquetamiento en un virus (por ejemplo, retrovirus, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus,
25 adenovirus de replicación defectuosa y virus adenoasociados). Los vectores víricos también incluyen polinucleótidos soportados por un virus para transfección a una célula huésped. Algunos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos con un origen bacteriano de replicación y vectores de mamífero episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamíferos no episomales) se integran en el genoma de una célula huésped en la introducción en la célula huésped y se replican de ese modo junto con el genoma huésped. Por otra parte, algunos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que están unidos de manera operativa. Dichos vectores se refieren en la presente memoria como "vectores de expresión". Los vectores de expresión comunes de utilidad en técnicas de ADN recombinante están con frecuencia en la forma de plásmidos.
Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender un ácido nucleico de la descripción en una forma
35 adecuada para expresión del ácido nucleico en una célula huésped, que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen uno o más elementos reguladores, que se pueden seleccionar sobre la base de las células huésped que se tienen que usar para expresión, que están unidos de manera operativa a la secuencia de ácidos nucleicos que se tiene que expresar. En un vector de expresión recombinante, "unido de manera operable" significa que la secuencia de nucleótidos de interés está unida al elemento o a los elementos reguladores de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped cuando el vector se introduce en la célula huésped).
Se pretende que el término "elemento regulador" incluya activadores, potenciadores, sitios de entrada de ribosomas internos (IRES, por sus siglas en inglés) y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de terminación de la transcripción, tales como señales de poliadenilación y secuencias poli-U). Tales elementos 45 reguladores se describen, por ejemplo, en Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1.990). Los elementos reguladores incluyen aquellos que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de célula huésped y aquellos que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos sólo en ciertas células huésped (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas del tejido). Un activador específico del tejido puede dirigir la expresión principalmente en un tejido deseado de interés, tal como músculo, neurona, hueso, piel, sangre, órganos específicos (por ejemplo, hígado, páncreas) o tipos de células particulares (por ej., linfocitos). Los elementos reguladores también pueden dirigir la expresión de una manera dependiente temporal, tal como de una manera dependiente del ciclo celular o dependiente de la fase de desarrollo, que puede ser o no también específica del tejido o del tipo de célula. En algunas realizaciones, un vector comprende uno o más activadores de pol III (por ej., 1, 2, 3, 4, 5 o más activadores 55 de pol III), uno o más activadores de pol II (por ej., 1, 2, 3, 4, 5 o más activadores de pol II), uno o más activadores de pol I (por ej., 1, 2, 3, 4, 5 o más activadores de pol I) o combinaciones de los mismos. Ejemplos de activadores de pol III incluyen, pero no se limitan a, activadores U6 y H1. Ejemplos de activadores de pol II incluyen, pero no se limitan a, el activador LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV, por sus siglas en inglés) retrovírico (opcionalmente con el potenciador de RSV), el activador de citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con el estimulador de CMV) [véase, por ej., Boshart et al, Cell, 41: 521-530 (1.985)], el activador de SV40, el activador de dihidrofolato reductasa, el activador de β-actina, el activador de fosfoglicerol kinasa (PGK, por sus siglas en inglés) y el activador de EF1α. También están incluidos en el término "elemento regulador" los elementos estimuladores, tales como WPRE; estimuladores de CMV; el segmento R-U5' en LTR de HTLV-1 (Mol. Cell. Biol., Vol. 8 (1), pág. 466-472, 1.988); estimulador de SV40 y la secuencia del intrón entre los exones 2 y 3 de β-globina de conejo (Proc. Natl. Acad. Sci.
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USA., Vol. 78 (3), pág. 1.527-31, 1.981). Se apreciará por los expertos en la materia que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que se tiene que transformar, el nivel de expresión deseado, etc. Se puede introducir un vector en células huésped para producir de ese modo transcritos, proteínas o péptidos, incluyendo proteínas o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como
5 se describe en la presente memoria (por ejemplo, transcritos de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR), proteínas, enzimas, formas mutantes de los mismos, proteínas de fusión de los mismos, etc.).
Vectores ventajosos incluyen lentivirus y virus adenoasociados y también se pueden seleccionar tipos de tales vectores para fijar como objetivo tipos particulares de células.
10 En un aspecto, la descripción proporciona un vector que comprende un elemento regulador unido de manera operable a una secuencia codificadora de enzimas que codifica una enzima CRISPR que comprende una o más secuencias de localización nucleares. En algunas realizaciones, dicho elemento regulador conduce la transcripción de la enzima CRISPR en una célula eucariota de manera que dicha enzima CRISPR se acumula en una cantidad detectable en el núcleo de la célula eucariota. En algunas realizaciones, el elemento regulador es un activador de la
15 polimerasa II. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es una enzima del sistema CRISPR de tipo II. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es una enzima Cas9. En algunas realizaciones, la enzima Cas9 es Cas9 de S. pneumoniae, S. pyogenes o S. thermophilus y puede incluir Cas9 mutada procedente de estos organismos. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es codón-optimizada para expresión en una célula eucariota. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR dirige la escisión de una o dos hebras en la posición de la secuencia objetivo. En
20 algunas realizaciones, la enzima CRISPR carece de actividad de escisión de la cadena de ADN.
En un aspecto, la descripción proporciona una enzima CRISPR que comprende una o más secuencias de localización nuclear de suficiente fortaleza para conducir la acumulación de dicha enzima CRISPR en una cantidad detectable en el núcleo de una célula eucariota. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es una enzima del sistema CRISPR de tipo II. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es una enzima Cas9. En algunas
25 realizaciones, la enzima Cas9 es Cas9 de S. pneumoniae, S. pyogenes o S. thermophilus y puede incluir Cas9 mutada procedente de estos organismos. La enzima pueden ser un homólogo u ortólogo de Cas9. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR carece de capacidad para escindir una o más hebras de una secuencia objetivo a la que se une.
En un aspecto, la descripción proporciona una célula eucariota huésped que comprende: (a) un primer elemento
30 regulador unido de manera operable a una secuencia de emparejamiento tracr y uno o más sitios de inserción para insertar una o más secuencias guía aguas arriba de la secuencia de emparejamiento tracr, en la que cuando se expresa, la secuencia guía dirige la unión específica de la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia objetivo en una célula eucariota, en la que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida a la secuencia objetivo y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a
35 la secuencia tracr y/o (b) un segundo elemento regulador unido de manera operable a una secuencia codificadora de enzima que codifica a dicha enzima CRISPR que comprende una secuencia de localización nuclear. En algunas realizaciones, la célula huésped comprende los componentes (a) y (b). En algunas realizaciones, el componente (a), el componente (b) o los componentes (a) y (b) están integrados de manera estable en un genoma de la célula eucariota huésped. En algunas realizaciones, el componente (a) comprende además la secuencia tracr aguas abajo
40 de la secuencia de emparejamiento tracr bajo el control del primer elemento regulador. En algunas realizaciones, el componente (a) comprende además dos o más secuencias guía unidas de manera operable al primer elemento regulador, en el que cuando se expresan, cada una de las dos o más secuencias guía dirige la unión específica de la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia objetivo diferente en una célula eucariota. En algunas realizaciones, la célula huésped eucariota comprende además un tercer elemento regulador, tal como un activador
45 de la polimerasa III, unido de manera operable a una dicha secuencia tracr. En algunas realizaciones, la secuencia tracr presenta al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de complementariedad de secuencias a lo largo de la longitud de la secuencia de emparejamiento tracr cuando se alinean de manera óptima. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR comprende una o más secuencias de localización nuclear de suficiente fortaleza para conducir la acumulación de dicha enzima CRISPR en una cantidad detectable en el núcleo de una célula eucariota. En algunas
50 realizaciones, la enzima CRISPR es una enzima del sistema CRISPR de tipo II. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es una enzima Cas9. En algunas realizaciones, la enzima Cas9 es Cas9 de S. pneumoniae, S. pyogenes o
S. thermophilus y puede incluir Cas9 mutada procedente de estos organismos. La enzima puede ser un homólogo u ortólogo de Cas9. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es codón-optimizada para expresión en una célula eucariota. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR dirige la escisión de una o dos hebras en la posición de la 55 secuencia objetivo. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR carece de actividad de escisión de la hebra de ADN. En algunas realizaciones, el primer elemento regulador es un activador de la polimerasa III. En algunas realizaciones, el segundo elemento regulador es un activador de la polimerasa II. En algunas realizaciones, la secuencia guía es al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 nucleótidos o entre 10-30 o entre 15-25 o entre 15-20 nucleótidos de longitud. En un aspecto, la descripción proporciona un organismo eucariota no humano;
60 preferiblemente un organismo eucariota multicelular, que comprende una célula eucariota huésped según cualquiera de las realizaciones descritas. En otros aspectos, la descripción proporciona un organismo eucariota; preferiblemente un organismo eucariota multicelular, que comprende una célula eucariota huésped según cualquiera de las realizaciones descritas. El organismo en algunas realizaciones de estos aspectos puede ser un animal; por ejemplo un mamífero. También, el organismo puede ser un artrópodo tal como un insecto. El organismo puede también ser una planta. Además, el organismo puede ser un hongo.
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En un aspecto, la descripción proporciona un estuche que comprende uno o más de los componentes descritos en la
5 presente memoria. En algunas realizaciones, el estuche comprende un sistema vector e instrucciones para usar el estuche. En algunas realizaciones, el sistema vector comprende: (a) un primer elemento regulador unido de manera operable a una secuencia de emparejamiento tracr y uno o más sitios de inserción para insertar una o más secuencias guía aguas arriba de la secuencia de emparejamiento tracr, en el que cuando se expresan, la secuencia guía dirige la unión específica de la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia fijada como objetivo en una
10 célula eucariota, en la que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida a la secuencia objetivo y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a la secuencia tracr y/o (b) un segundo elemento regulador unido de manera operable a una secuencia codificadora de enzima que codifica dicha enzima CRISPR que comprende una secuencia de localización nuclear. En algunas realizaciones, el estuche comprende los componentes (a) y (b) situados en los mismos vectores del sistema o diferentes. En algunas
15 realizaciones, el componente (a) comprende además la secuencia tracr aguas abajo de la secuencia de emparejamiento tracr bajo el control del primer elemento regulador. En algunas realizaciones, el componente (a) comprende además dos o más secuencias guía unidas de manera operable al primer elemento regulador, en el que cuando se expresan, cada una de las dos o más secuencias guía dirige la unión específica de la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia objetivo diferente en una célula eucariota. En algunas realizaciones, el sistema
20 comprende además un tercer elemento regulador, tal como un activador de la polimerasa III, unido de manera operable a dicha secuencia tracr. En algunas realizaciones, la secuencia tracr presenta al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de complementariedad de secuencias a lo largo de la longitud de la secuencia de emparejamiento tracr cuando se alinea de manera óptima. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR comprende una o más secuencias de localización nuclear de suficiente fortaleza para conducir la acumulación de dicha enzima
25 CRISPR en una cantidad detectable en el núcleo de una célula eucariota. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es una enzima del sistema CRISPR de tipo II. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es una enzima Cas9. En algunas realizaciones, la enzima Cas9 es Cas9 de S. pneumoniae, S. pyogenes o S. thermophilus y puede incluir Cas9 mutada procedente de estos organismos. La enzima puede ser un homólogo u ortólogo de Cas9. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es codón-optimizada para expresión en una célula eucariota. En algunas
30 realizaciones, la enzima CRISPR dirige la escisión de una o dos hebras en la posición de la secuencia objetivo. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR carece de actividad de escisión de la hebra de ADN. En algunas realizaciones, el primer elemento regulador es un activador de la polimerasa III. En algunas realizaciones, el segundo elemento regulador es un activador de la polimerasa II. En algunas realizaciones, la secuencia guía es al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 nucleótidos o entre 10-30 o entre 15-25 o entre 15-20 nucleótidos de longitud.
35 En un aspecto, la descripción proporciona un método para modificar un polinucleótido objetivo en una célula eucariota. En algunas realizaciones, el método comprende permitir que se una un complejo CRISPR al polinucleótido objetivo para efectuar la escisión de dicho polinucleótido objetivo modificando de ese modo el polinucleótido objetivo, en el que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia guía se transcribe a una secuencia fijada como objetivo dentro de dicho polinucleótido objetivo, en el que
40 dicha secuencia guía está ligada a una secuencia de emparejamiento tracr que a su vez se transcribe a una secuencia tracr. En algunas realizaciones, dicha escisión comprende escindir una o dos hebras en la posición de la secuencia objetivo mediante dicha enzima CRISPR. En algunas realizaciones, dicha escisión da como resultado la transcripción disminuida de un gen objetivo. En algunas realizaciones, el método comprende además reparar dicho polinucleótido objetivo escindido por recombinación homóloga con un polinucleótido exógeno de plantilla, en el que
45 dicha reparación da como resultado una mutación que comprende una inserción, supresión o sustitución de uno o más nucleótidos de dicho polinucleótido objetivo. En algunas realizaciones, dicha mutación da como resultado uno o más cambios de aminoácido en una proteína expresada de un gen que comprende la secuencia objetivo. En algunas realizaciones, el método comprende además suministrar uno o más vectores a dicha célula eucariota, en el que uno o más vectores conducen la expresión de uno o más de: la enzima CRISPR, la secuencia guía ligada a la
50 secuencia de emparejamiento tracr y la secuencia tracr. En algunas realizaciones, dichos vectores se suministran a la célula eucariota en un individuo. En algunas realizaciones, dicha modificación tiene lugar en dicha célula eucariota en un cultivo celular. En algunas realizaciones, el método comprende además aislar dicha célula eucariota de un individuo antes de dicha modificación. En algunas realizaciones, el método comprende además devolver dicha célula y/o células eucariotas procedentes de ahí a dicho individuo.
55 En un aspecto, la descripción proporciona un método para modificar la expresión de un polinucleótido en una célula eucariota. En algunas realizaciones, el método comprende permitir que un complejo CRISPR se una al polinucleótido de manera que dicha unión dé como resultado la expresión aumentada o disminuida de dicho polinucleótido; en el que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia guía se transcribe a una secuencia fijada como objetivo dentro de dicho polinucleótido, en el que dicha secuencia guía
60 está ligada a una secuencia de emparejamiento tracr que a su vez se transcribe a una secuencia tracr. En algunas realizaciones, el método comprende además suministrar uno o más vectores a dichas células eucariotas, en el que uno o más vectores conducen la expresión de una o más de: la enzima CRISPR, la secuencia guía ligada a la secuencia de emparejamiento tracr y la secuencia tracr.
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En un aspecto, la descripción proporciona un método para generar una célula eucariota modelo que comprende un gen mutado de la enfermedad. En algunas realizaciones, un gen de la enfermedad es cualquier gen asociado a un aumento del riesgo de tener o desarrollar una enfermedad. En algunas realizaciones, el método comprende (a) introducir uno o más vectores en una célula eucariota, en la que uno o más vectores conducen la expresión de uno o 5 más de: una enzima CRISPR, una secuencia guía ligada a una secuencia de emparejamiento tracr y una secuencia tracr y (b) permitir que un complejo CRISPR se una a un polinucleótido objetivo para efectuar la escisión del polinucleótido objetivo dentro de dicho gen de la enfermedad, en el que el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida a la secuencia objetivo dentro del polinucleótido objetivo y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a la secuencia tracr, generando de ese modo una célula eucariota modelo que comprende un gen mutado de la enfermedad. En algunas realizaciones, dicha escisión comprende escindir una o dos hebras en la posición de la secuencia objetivo mediante dicha enzima CRISPR. En algunas realizaciones, dicha escisión da como resultado la transcripción disminuida de un gen objetivo. En algunas realizaciones, el método comprende además reparar dicho polinucleótido objetivo escindido por recombinación homóloga con un polinucleótido exógeno de plantilla, en el que dicha reparación da como resultado una mutación
15 que comprende una inserción, supresión o sustitución de uno o más nucleótidos de dicho polinucleótido objetivo. En algunas realizaciones, dicha mutación da como resultado uno o más cambios de aminoácido en una expresión de proteína de un gen que comprende la secuencia objetivo.
En un aspecto, la descripción proporciona un método para desarrollar un agente biológicamente activo que module un caso de señalización celular asociado a un gen de la enfermedad. En algunas realizaciones, un gen de la enfermedad es cualquier gen asociado a un aumento del riesgo de tener o desarrollar una enfermedad. En algunas realizaciones, el método comprende (a) poner en contacto un compuesto de ensayo con una célula modelo de una cualquiera de las realizaciones descritas y (b) detectar un cambio en una lectura que sea indicativo de una reducción
o un aumento del caso de señalización celular asociado a dicha mutación en dicho gen de la enfermedad,
desarrollando de ese modo dicho agente biológicamente activo que module dicho caso de señalización celular 25 asociado a dicho gen de la enfermedad.
En un aspecto, la descripción proporciona un polinucleótido recombinante que comprende una secuencia guía aguas arriba de una secuencia de emparejamiento tracr, en el que la secuencia guía cuando se expresa dirige la unión específica de la secuencia de un complejo CRISPR a una correspondiente secuencia objetivo presente en una célula eucariota. En algunas realizaciones, la secuencia objetivo es una secuencia vírica presente en una célula eucariota. En algunas realizaciones, la secuencia objetivo es un proto-oncogén o un oncogén.
En un aspecto, la descripción proporciona un método para seleccionar una o más células procariotas por introducción de una o más mutaciones en un gen en una o más células procariotas, comprendiendo el método: introducir uno o más vectores en la célula o las células procariotas, en las que uno o más vectores conducen la expresión de uno o más de: una enzima CRISPR, una secuencia guía ligada a una secuencia de emparejamiento 35 tracr, una secuencia tracr y una plantilla de edición; en la que la plantilla de edición comprende una o más mutaciones que anula la escisión de la enzima CRISPR; permitir la recombinación homóloga de la plantilla de edición con el polinucleótido objetivo en la célula o las células que se tienen que seleccionar; permitir que un complejo CRISPR se una a un polinucleótido objetivo para efectuar la escisión del polinucleótido objetivo dentro de dicho gen, en el que el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida a la secuencia objetivo dentro del polinucleótido objetivo y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a la secuencia tracr, en la que la unión del complejo CRISPR al polinucleótido objetivo induce la muerte celular, permitiendo de ese modo que se seleccione una o más células procariotas en que se han introducido una o más mutaciones. En una realización preferida, la enzima CRISPR es Cas9. En otro aspecto de la descripción, la célula que se tiene que seleccionar puede ser una célula eucariota. Los aspectos de la descripción permiten la
45 selección de células específicas sin que se requiera un marcador de selección o un procedimiento de dos etapas que pueda incluir un sistema de contraselección.
En algunos aspectos, la descripción proporciona una composición que no se encuentra en la naturaleza o de ingeniería que comprende una secuencia de polinucleótidos de ARN quimérico (ARNqui) del sistema CRISPR-Cas, en el que la secuencia de polinucleótidos comprende: (a) una secuencia guía capaz de hibridizar una secuencia fijada como objetivo en una célula eucariota, (b) una secuencia de emparejamiento tracr y (c) una secuencia tracr en la que (a), (b) y (c) se disponen en una orientación 5' a 3', en la que cuando se transcribe, la secuencia de emparejamiento tracr se hibrida a la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica de la secuencia de un complejo CRISPR a la secuencia objetivo, en la que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida a la secuencia objetivo y (2) la secuencia de emparejamiento 55 tracr que se hibrida a la secuencia tracr o un sistema de enzima CRISPR, en el que el sistema está codificado por un sistema vector que comprende uno o más vectores que comprenden I. un primer elemento regulador unido de manera operable a una secuencia de polinucleótidos de ARN quimérico (ARNqui) del sistema CRISPR-Cas, en el que la secuencia de polinucleótidos comprende (a) una o más secuencias guía capaces de hibridar una o más secuencias objetivo en una célula eucariota, (b) una secuencia de emparejamiento tracr y (c) una o más secuencias tracr y II. un segundo elemento regulador unido de manera operable a una secuencia codificadora de enzima que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de localización nuclear, en la que (a),
(b) y (c) se disponen en una orientación 5’ a 3’, en la que los componentes I y II se sitúan en los mismos vectores del
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sistema o diferentes, en la que cuando se transcribe, la secuencia de emparejamiento tracr se hibrida a la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica de la secuencia de un complejo CRISPR a la secuencia objetivo, en la que el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida a la secuencia objetivo y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a la secuencia tracr o un sistema de enzima CRISPR multiplexado, en la que el sistema se codifica mediante un sistema vector que comprende uno o más vectores que comprenden I. un primer elemento regulador unido de manera operable a (a) una o más secuencias guía capaces de hibridar una secuencia objetivo en una célula y (b) al menos una o más secuencias de emparejamiento tracr, II. un segundo elemento regulador unido de manera operable a una secuencia codificadora de enzima que codifica una enzima CRISPR y III. un tercer elemento regulador unido de manera operable a una secuencia tracr , en la que los componentes I, II y III se sitúan en los mismos vectores del sistema o diferentes, en la que cuando se transcribe, la secuencia de emparejamiento tracr se hibrida a la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica de la secuencia de un complejo CRISPR a la secuencia objetivo, en la que el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida a la secuencia objetivo y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a la secuencia tracr y en la que en el sistema multiplexado se usan múltiples secuencias guía y una secuencia tracr única y en la que se modifica una o más de las secuencias guía, tracr y de emparejamiento tracr, para mejorar la estabilidad.
En aspectos de la descripción, la modificación comprende una estructura secundaria de ingeniería. Por ejemplo, la modificación puede comprender una reducción en la región de hibridación entre la secuencia de emparejamiento tracr y la secuencia tracr. Por ejemplo, la modificación también puede comprender fusionar la secuencia de emparejamiento tracr y la secuencia tracr por un bucle artificial. La modificación puede comprender la secuencia tracr que tiene una longitud entre 40 y 120 pb. En las realizaciones de la descripción, la secuencia tracr tiene entre 40 pb y la longitud total de la secuencia tracr. En algunas realizaciones, la longitud de ARNtracr incluye al menos 167 nucleótidos y en algunas realizaciones al menos 1-85 nucleótidos del ARNtracr de tipo natural. En algunas realizaciones, se pueden usar al menos los nucleótidos que corresponden a los nucleótidos 1-67 o 1-85 de ARNtracr de Cas9 de S. pyogenes de tipo natural. En el caso de que el sistema CRISPR use enzimas distintas de Cas9 o distintas de SpCas9, entonces pueden estar presentes los correspondientes nucleótidos en el ARNtracr de tipo natural relevante. En algunas realizaciones, la longitud de ARNtracr incluye no más de los nucleótidos 1-67 o 1-85 de ARNtracr de tipo natural. La modificación puede comprender optimización de la secuencia. En algunos aspectos, la optimización de secuencias puede comprender reducir la incidencia de secuencias poliT en la secuencia tracr y/o de emparejamiento tracr. La optimización de secuencias se puede combinar con la reducción en la región de hibridación entre la secuencia de emparejamiento tracr y la secuencia tracr; por ejemplo, una secuencia tracr de longitud reducida.
En un aspecto, la descripción proporciona el sistema CRISPR-Cas o el sistema de enzima CRISPR en el que la modificación comprende la reducción de secuencias poliT en la secuencia tracr y/o de emparejamiento tracr. En algunos aspectos de la descripción, una o más T presentes en una secuencia poli-T de la secuencia de tipo natural relevante (esto es, una extensión de más de 3, 4, 5, 6 o más bases T contiguas; en algunas realizaciones, un tramo de no más de 10, 9, 8, 7, 6 bases T contiguas) puede ser sustituido con un nucleótido no T, por ej. una A, de manera que se rompa la cadena en tramos más pequeños de T teniendo cada tramo 4 o menos de 4 (por ejemplo 3 ó 2) T contiguos. Las bases distintas de A se pueden usar para sustitución, por ejemplo C o G o nucleótidos que no se encuentran en la naturaleza o nucleótidos modificados. Si la cadena de T está implicada en la formación de una horquilla (o tallo-lazo), entonces es ventajoso que la base complementaria para la base no T cambie para complementar el nucleótido no T. Por ejemplo, si la base no T es una A, entonces un complemento se puede cambiar a una T, por ejemplo para conservar o ayudar a la conservación de estructura secundaria. Por ejemplo, se puede modificar 5'-TTTTT para convertirlo en 5'-TTTAT y se puede cambiar el 5'-AAAAA complementario a 5'-ATAAA.
En un aspecto, la descripción proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la modificación comprende añadir una secuencia terminadora poliT. En un aspecto, la descripción proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la modificación comprende añadir una secuencia terminadora poliT en secuencias tracr y/o de emparejamiento tracr. En un aspecto, la descripción proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en la que la modificación comprende añadir una secuencia terminadora poliT en la secuencia guía. La secuencia terminadora poliT puede comprender 5 bases T contiguas o más de 5.
En un aspecto, la descripción proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la modificación comprende modificar lazos y/u horquillas. En un aspecto, la descripción proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la modificación comprende proporcionar un mínimo de dos horquillas en la secuencia guía. En un aspecto, la descripción proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la modificación comprende proporcionar una horquilla formada por complementación entre la secuencia tracr y de emparejamiento tracr (repetición directa). En un aspecto, la descripción proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la modificación comprende proporcionar una o más horquillas adicionales en o hacia el extremo 3' de la secuencia ARNtracr. Por ejemplo, se puede formar una horquilla proporcionando secuencias autocomplementarias dentro de la secuencia de ARNtracr unida por un lazo de manera que se forma una horquilla en autoplegado. En un aspecto, la descripción proporciona el sistema CRISPR-Cas o
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sistema de enzima CRISPR en el que la modificación comprende proporcionar horquillas adicionales añadidas a la 3' de la secuencia guía. En un aspecto, la descripción proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la modificación comprende extender el extremo 5' de la secuencia guía. En un aspecto, la descripción proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la modificación comprende proporcionar una o más horquillas en el extremo 5' de la secuencia guía. En un aspecto, la descripción proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la modificación comprende agregar la secuencia (5'-AGGACGAAGTCCTAA) al extremo 5' de la secuencia guía. Otras secuencias adecuadas para formar horquillas serán conocidas para el experto y se pueden usar en ciertos aspectos de la descripción. En algunos aspectos de la descripción, se proporcionan al menos 2, 3, 4, 5 o más horquillas adicionales. En algunos aspectos de la descripción se proporcionan no más de 10, 9, 8, 7, 6 horquillas adicionales. En un aspecto, la descripción proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la modificación comprende dos horquillas. En un aspecto, la descripción proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la modificación comprende tres horquillas. En un aspecto, la descripción proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la modificación comprende a lo sumo cinco horquillas.
En un aspecto, la descripción proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la modificación comprende proporcionar unión cruzada o proporcionar uno o más nucleótidos modificados en la secuencia de polinucleótidos. Los nucleótidos modificados y/o ligados cruzados se pueden proporcionar en cualquiera o en todas las secuencias tracr, de acoplamiento tracr y/o guía y/o en la secuencia codificadora de enzimas y/o en secuencias de vectores. Las modificaciones pueden incluir la inclusión de al menos un nucleótido que no se encuentra la naturaleza o un nucleótido modificado o análogos de los mismos. Se puede modificar nucleótidos modificados en el resto ribosa, fosfato y/o base. Los nucleótidos modificados pueden incluir 2'-O-metilanálogos, 2'-desoxi-análogos o 2'-fluoro-análogos. La cadena principal de ácidos nucleicos se puede modificar, por ejemplo, se puede usar una cadena principal de fosforotioato. El uso de ácidos nucleicos bloqueados (LNA, por sus siglas en inglés) o ácidos nucleicos de puente (BNA, por sus siglas en inglés) también puede ser posible. Más ejemplos de bases modificadas incluyen, pero no se limitan a, 2-aminopurina, 5-bromo-uridina, pseudouridina, inosina, 7-metilguanosina.
Se entenderá que cualquiera o todas las modificaciones anteriores se pueden proporcionar en aislamiento o en combinación en un sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR determinado. Dicho sistema puede incluir una, dos, tres, cuatro, cinco o más de dichas modificaciones.
En un aspecto, la invención proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la enzima CRISPR es una enzima del sistema CRISPR de tipo II, por ej., una enzima Cas9. En un aspecto, la descripción proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la enzima CRISPR está constituida por menos de mil aminoácidos, o menos de cuatro mil aminoácidos. En un aspecto, la descripción proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la enzima Cas9 es StCas9 o StlCas9 o la enzima Cas9 es una enzima Cas9 de un organismo seleccionado del grupo que consiste en el género Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium o Corynebacter. En un aspecto, la descripción proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la enzima CRISPR es una nucleasa que dirige la escisión de ambas cadenas en la posición de la secuencia objetivo.
En un aspecto, la descripción proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que el primer elemento regulador es un activador de la polimerasa III. En un aspecto, la descripción proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que el segundo elemento regulador es un activador de la polimerasa II.
En un aspecto, la descripción proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la secuencia guía comprende al menos quince nucleótidos.
En un aspecto, la descripción proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la modificación comprende ARN de secuencia tracr optimizada y/o de secuencia guía optimizada y/o estructura coplegada de secuencia tracr y/o secuencia o secuencias de acoplamiento tracr y/o estructuras secundarias estabilizantes de secuencia tracr y/o secuencia tracr con una región reducida de emparejamiento de bases y/o elementos de ARN condensados de secuencia tracr y/o en el sistema multiplexado hay dos ARN que comprenden un trazador y que comprenden una pluralidad de guías o ARN que comprende una pluralidad de quimeras.
En aspectos de la descripción, la arquitectura de ARN quimérico se optimiza además según los resultados de estudios de mutagénesis. En ARN quimérico con dos o más horquillas, las mutaciones en la repetición directa proximal para estabilizar la horquilla pueden dar como resultado ablación de la actividad del complejo CRISPR. Las mutaciones en la repetición directa distal para acortar o estabilizar la horquilla pueden no tener efecto sobre la actividad del complejo CRISPR. La aleatorización de secuencias en la región de la protuberancia entre las repeticiones proximal y distal puede reducir de manera significativa la actividad del complejo CRISPR. Los cambios en los pares de bases únicos o aleatorización de secuencias en la región ligadora entre horquillas pueden dar como resultado la pérdida completa de actividad del complejo CRISPR. La estabilización de horquillas de las horquillas distales que siguen a la primera horquilla después de la secuencia guía puede dar como resultado el mantenimiento
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o la mejora de la actividad del complejo CRISPR. De acuerdo con esto, en realizaciones preferidas de la descripción, la arquitectura de ARN quimérico se puede optimizar además por generación de un ARN quimérico más pequeño que puede ser beneficioso para opciones de suministro terapéutico y otros usos y esto se puede conseguir modificando la repetición directa distal de manera que se acorte o estabilice la horquilla. En realizaciones preferidas adicionales de la descripción la arquitectura de ARN quimérico se puede optimizar además por estabilización de una
o más horquillas distales. La estabilización de horquillas puede incluir modificar secuencias adecuadas para formar horquillas. En algunos aspectos de la descripción, se proporcionan al menos 2, 3, 4, 5 o más horquillas adicionales. En algunos aspectos de la descripción, se proporcionan no más de 10, 9, 8, 7, 6 horquillas adicionales. En algunos aspectos de la descripción, la estabilización puede ser unión cruzada u otras modificaciones. Las modificaciones pueden incluir la inclusión de al menos un nucleótido que no se encuentre en la naturaleza o un nucleótido modificado o análogos de los mismos. Los nucleótidos modificados se pueden modificar en el resto ribosa, fosfato y/o base. Los nucleótidos modificados pueden incluir 2'-O-metil-análogos, 2'-desoxi-análogos o 2'-fluoro-análogos. Se puede modificar la cadena principal de ácidos nucleicos, por ejemplo, se puede usar una cadena principal de fosforotioato. El uso de ácidos nucleicos bloqueados (LNA) o ácidos nucleicos de puente (BNA) también puede ser posible. Más ejemplos de bases modificadas incluyen, pero no se limitan a, 2-aminopurina, 5-bromo-uridina, pseudouridina, inosina, 7-metilguanosina.
En un aspecto, la descripción proporciona el sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR en el que la enzima CRISPR es codón-optimizada para expresión en una célula eucariota.
De acuerdo con esto, en algunos aspectos de la descripción, no se requiere necesariamente que sea fijada la longitud del ARNtracr requerida en una construcción de la descripción, por ejemplo, una construcción quimérica, y en algunos aspectos puede tener entre 40 y 120 pb y en algunos aspectos de la descripción hasta la longitud total de la tracr, por ejemplo, en algunos aspectos de la descripción hasta el extremo 3’ de tracr como se marca por la señal de terminación de la transcripción en el genoma bacteriano. En algunas realizaciones, la longitud del ARNtracr incluye al menos 1-67 nucleótidos y en algunas realizaciones al menos 1-85 nucleótidos del ARNtracr de tipo natural. En algunas realizaciones, se pueden usar al menos los nucleótidos que corresponden a los nucleótidos 1-67
o 1-85 de ARNtracr de Cas9 de S. pyogenes de tipo natural. En el caso de que el sistema CRISPR use enzimas distintas de Cas9 u otras distintas de SpCas9, entonces pueden estar presentes los nucleótidos correspondientes en el ARNtracr de tipo natural relevante. En algunas realizaciones, la longitud del ARNtracr incluye no más de 1-67 o 185 nucleótidos del ARNtracr de tipo natural. Con respecto a la optimización de secuencias (por ejemplo, reducción en las secuencias poli-T), por ejemplo en cuanto a las cadenas de Ts internas a la secuencia de emparejamiento tracr (repetición directa) o al ARNtracr, en algunos aspectos de la descripción, uno o más Ts presentes en una secuencia poli-T de la secuencia de tipo natural relevante (esto es, un segmento de más de 3, 4, 5, 6 o más bases T contiguas; en algunas realizaciones, un segmento de no más de 10, 9, 8, 7, 6 bases T contiguas) pueden ser sustituidos con un nucleótido no T, por ejemplo, una A, de manera que la cadena se rompa en fragmentos más pequeños de T teniendo cada fragmento 4, o menos de 4 (por ejemplo, 3 o 2) T contiguas. Si la cadena de T está implicada en la formación de una horquilla (o tallo-lazo), entonces es ventajoso que la base complementaria para la base no T se cambie a complemento del nucleótido no T. Por ejemplo, si la base no T es una A, entonces su complemento se puede cambiar a una T, por ejemplo, para conservar o ayudar a la conservación de estructura secundaria. Por ejemplo, se puede modificar 5’-TTTTT para que se convierta en 5’-TTTAT y se puede cambiar la 5’-AAAAA complementaria a 5’-ATAAA. En cuanto a la presencia de secuencias terminadoras poli-T en transcrito de tracr + emparejamiento tracr, por ejemplo, un terminador poli-T (TTTTT o más), en algunos aspectos de la descripción es ventajoso que se añada al extremo del transcrito, si está en forma de dos ARN (tracr y emparejamiento de tracr) o único ARN guía. Con respecto a los lazos y horquillas en los transcritos tracr y de emparejamiento tracr, en algunos aspectos de la descripción es ventajoso que esté presente un mínimo de dos horquillas en el ARN guía quimérico. Una primera horquilla puede ser la horquilla formada por complementación entre la secuencia tracr y la secuencia de emparejamiento tracr (repetición directa). Una segunda horquilla puede estar en el extremo 3’ de la secuencia ARNtracr y esto puede proporcionar estructura secundaria para interacción con Cas9. Se pueden añadir horquillas adicionales al 3’ del ARN guía, por ejemplo, en algunos aspectos de la descripción para aumentar la estabilidad del ARN guía. Adicionalmente, el extremo 5’ del ARN guía, en algunos aspectos de la descripción, se puede extender. En algunos aspectos de la descripción, se puede considerar 20 pb en el extremo 5’ como una secuencia guía. Se puede extender la porción 5’. Se puede proporcionar una o más horquillas en la porción 5’, por ejemplo, en algunos aspectos de la descripción, esto también puede mejorar la estabilidad del ARN guía. En algunos aspectos de la descripción, se puede proporcionar la horquilla específica adjuntando la secuencia (5’-AGGACGAAGTCCTAA) al extremo 5’ de la secuencia guía y, en algunos aspectos de la descripción, esto puede ayudar a mejorar la estabilidad. Otras secuencias adecuadas para formar horquillas serán conocidas para el experto y se pueden usar en ciertos aspectos de la descripción. En algunos aspectos de la descripción, se proporcionan al menos 2, 3, 4, 5 o más horquillas adicionales. En algunos aspectos de la descripción se proporcionan no más de 10, 9, 8, 7, 6 horquillas adicionales. Lo anterior también proporciona aspectos de la descripción que implican estructura secundaria en secuencias guía. En algunos aspectos de la descripción puede haber unión cruzada y otras modificaciones, por ejemplo, para mejorar la estabilidad. Las modificaciones pueden incluir inclusiones de al menos un nucleótido que no se encuentre en la naturaleza o un nucleótido modificado o análogos de los mismos. Los nucleótidos modificados se pueden modificar en el resto ribosa, fosfato y/o base. Los nucleótidos modificados pueden incluir 2'-O-metil-análogos, 2'-desoxi-análogos o 2'-fluoro-análogos. Se puede modificar la cadena principal del ácido nucleico, por ejemplo, se puede usar una cadena principal de fosforotioato. El uso de ácidos nucleicos bloqueados (LNA) o ácidos nucleicos de puente (BNA) también puede ser posible. Más ejemplos de bases modificadas incluyen, pero no se limitan a, 2-aminopurina, 5-bromo-uridina, pseudouridina, inosina, 7-metilguanosina. Dichas modificaciones o unión cruzada pueden estar presentes en la secuencia guía u otras secuencias adyacentes a la secuencia guía.
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Breve descripción de los dibujos
Las características novedosas de esta descripción se explican particularmente en las reivindicaciones que la acompañan. Se tendrá un mejor entendimiento de las características y ventajas de la presente descripción por referencia a la siguiente descripción detallada que explica realizaciones ilustrativas, en que se utilizan los principios de la descripción, y los dibujos adjuntos de los que:
La Figura 1 muestra un modelo esquemático del sistema CRISPR. La nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes (amarillo) se fija como objetivo para ADN genómico por un ARN guía sintético (ARNsg) que consiste en una secuencia guía de 20-nt (azul) y un andamio (rojo). Los pares de bases de la secuencia guía con el ADN objetivo (azul), directamente aguas arriba de una unidad adyacente protoespaciadora (PAM, por sus siglas en inglés; magenta) 5'-NGG requisito y Cas9 media una doble rotura de cadena (DSB, por sus siglas en inglés) ~3 pb aguas arriba de la PAM (triángulo rojo).
La Figura 2A-F ilustra un sistema CRISPR ejemplar, un posible mecanismo de acción, una adaptación de ejemplo para la expresión en células eucariotas y los resultados de los ensayos que evalúan la localización nuclear y la actividad de CRISPR.
La Figura 3A-C ilustra una casete de expresión ejemplar para expresión de elementos del sistema CRISPR en células eucariotas, estructuras previstas de secuencias guía de ejemplo y actividad del sistema CRISPR cuando se mide en células eucariotas y procariotas.
La Figura 4A-D ilustra los resultados de una evaluación de especificidad de SpCas9 para un objetivo de ejemplo.
La Figura 5A-G ilustra un sistema de vectores ejemplar y los resultados para su uso en dirigir recombinación homóloga en células eucariotas.
La Figura 6A-C ilustra una comparación de diferentes transcritos de ARNtracr para fijar como objetivo genes mediados por Cas9.
La Figura 7A-D ilustra un sistema CRISPR ejemplar, una adaptación de ejemplo para expresión en células eucariotas y los resultados de los ensayos que evalúan la actividad de CRISPR.
La Figura 8A-C ilustra manipulaciones ejemplares de un sistema CRISPR para fijar como objetivo sitios genómicos en células de mamíferos.
La Figura 9A-B ilustra los resultados de un análisis por el método Northern de tratamiento de ARNcr en células de mamífero.
La Figura 10A-C ilustra una representación esquemática de ARN quiméricos y los resultados de ensayos SURVEYOR para actividad del sistema CRISPR en células eucariotas.
La Figura 11A-B ilustra una representación gráfica de los resultados de ensayos SURVEYOR para actividad del sistema CRISPR en células eucariotas.
La Figura 12 ilustra estructuras secundarias previstas para ARN quiméricos ejemplares que comprenden una secuencia guía, secuencia de acoplamiento tracr y secuencia tracr.
La Figura 13 es un árbol filogenético de genes Cas.
La Figura 14A-F muestra el análisis filogenético que revelan cinco familias de Cas9s, incluyendo tres grupos de Cas9s grandes (~1.400 aminoácidos) y dos de Cas9s pequeños (~1.100 aminoácidos).
La Figura 15 muestra un gráfico que representa la función de diferentes ARN guía optimizados.
La Figura 16 muestra la secuencia y estructura de diferentes ARN quiméricos guía.
La Figura 17 muestra la estructura co-plegada del ARNtracr y repetición dirigida.
La Figura 18 A y B muestra datos de la optimización de ARN guía quimérico de St1Cas9 in vitro.
La Figura 19A-B muestra la escisión de objetivos no metilados o metilados mediante lisado de células de SpCas9.
La Figura 20A-G muestra la optimización de la arquitectura de ARN guía para edición de genomas de mamífero mediada por SpCas9. (a) Esquema de vector de expresión bicistrónico (PX330) para ARN guía único conducido por
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activador U6 (ARNsg) y Cas9 de Streptococcus pyogenes codón-optimizada humana conducida por activador CBh (hSpCas9) usada para todos los experimentos posteriores. El ARNsg consta de una secuencia guía de 20-nt (azul) y andamio (rojo), truncados en diversas posiciones como se indica. (b) Ensayo SURVEYOR para inserciones o supresiones mediadas por SpCas9 en los sitios EMX1 y PVALB humanos. Las flechas indican los fragmentos 5 SURVEYOR esperados (n = 3). (c) Análisis por el método Northern para las cuatro arquitecturas de truncado de ARNsg, con U1 como control de carga. (d) Ambos mutantes de tipo natural (wt, por sus siglas en inglés) o nickase (D10A) de inserción activada por SpCas9 de un sitio HindIII en el gen EMX1 humano. Se usaron oligonucleótidos monocatenarios (los ssODN, por sus siglas en inglés) orientados en la dirección sentido o antisentido en relación a la secuencia genómica, como plantillas de recombinación homólogas. (e) Esquema del sitio SERPINB5 humano. Se indican los ARNsg y las PAM mediante barras coloreadas por encima de las secuencias; se resaltan metilcitosina (Me) (rosa) y se enumeran en relación al sitio de inicio de transcripción (TSS, +1). (f) Estado de metilación de SERPINB5 ensayado mediante secuenciación de bisulfito de 16 clones. Círculos rellenos, CpG metilado; círculos abiertos, CpG no metilado. (g) Eficacia de modificación por tres ARNsg fijando como objetivo la región metilada de SERPINB5, ensayada por secuenciación profunda (n = 2). Las barras de error indican intervalos de Wilson (Métodos
15 Online).
La Figura 21A-B muestra la optimización adicional de la arquitectura de ARNsg de CRISPR-Cas. (a) Esquema de cuatro arquitecturas adicionales de ARNsg, I-IV. Cada una consta de una secuencia guía de 20-nt (azul) unida a la repetición directa (RD, gris), que hibrida a la ARNtracr (rojo). El híbrido RD-ARNtracr es truncado en +12 o +22, como se indicaron con un tallo-lazo GAAA artificial. Las posiciones de truncado de ARNtracr se enumeran de acuerdo con el sitio de inicio de la transcripción indicado previamente para ARNtracr. Las arquitecturas de ARNsg II y IV soportan mutaciones dentro de sus tractos poli-U, que podían servir como terminadores de transcripción prematura. (b) Ensayo SURVEYOR para inserciones o supresiones mediadas por SpCas9 en el sitio EMX1 humano para los sitios 1-3 objetivo. Las flechas indican los fragmentos SURVEYOR expresados (n = 3).
La Figura 22 ilustra la visualización de algunos sitios objetivo en el genoma humano.
25 La Figura 23A-B muestra (A) un esquema del ARNsg y (B) el análisis SURVEYOR para cinco variantes de ARNsg para SaCas9 para una arquitectura truncada óptima con la mayor eficacia de escisión.
Las figuras en la presente memoria son sólo para fines ilustrativos y no están necesariamente dibujadas a escala.
Descripción detallada de la invención
Los términos "polinucleótido", "nucleótido", "secuencia de nucleótidos", "ácido nucleico" y "oligonucleótido" se usan de forma intercambiable. Se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos o análogos de los mismos. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. Los siguientes no son ejemplos limitantes de los polinucleótidos: regiones codificadoras o no codificadoras de un gen o fragmento de gen, sitios (sitio) definidos a partir de análisis de unión, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia,
35 ARN ribosómico, ARN de interferencia corta (ARNsi), ARN de horquilla corta (ARNsh), micro-ARN (ARNmi), ribozimas, y ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácidos nucleicos y cebadores. Un polinucleótido puede comprender uno o más nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos. Si hay, se pueden impartir modificaciones a la estructura del nucleótido antes o después del ensamblado del polímero. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes no nucleótidos. Un polinucleótido puede ser modificado además después de polimerización, tal como por conjugación con un componente etiquetado.
En aspectos de la invención, los términos "ARN quimérico", "ARN guía quimérico", "ARN guía", "ARN guía único" y "ARN guía sintético" se usan de forma intercambiable y se refieren a la secuencia de polinucleótidos que comprende
45 la secuencia guía, la secuencia tracr y la secuencia de emparejamiento tracr. El término "secuencia guía" se refiere a la secuencia de aproximadamente 20 pb dentro del ARN guía que especifica el sitio objetivo y se puede usar de manera intercambiable con los términos "guía" o "espaciador". El término "secuencia de emparejamiento tracr" también se puede usar de forma intercambiable con el término "repetición o repeticiones directas".
Como se usa en la presente memoria el término "de tipo natural" es un término de la técnica entendido por los expertos y significa la forma típica de un organismo, cepa, gen o característica como se encuentra en la naturaleza como se distingue de formas mutantes o variantes.
Como se usa en la presente memoria el término "variante" se debería considerar que significa la exhibición de cualidades que presentan un patrón que se desvía de lo que ocurre en la naturaleza.
Los términos "que no se encuentra en la naturaleza " o "de ingeniería " se usan de forma intercambiable e indican la
55 implicación de la mano del hombre. Los términos, cuando se refieren a moléculas de ácido nucleico o polipéptidos significan que la molécula de ácido nucleico o el polipéptido está al menos sustancialmente exento de al menos otro componente con el que se asocian de manera natural en la naturaleza y como se encuentran en la naturaleza.
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"Complementariedad" se refiere a la capacidad de un ácido nucleico para formar el enlace o enlaces de hidrógeno con otra secuencia de ácidos nucleicos por emparejamiento de bases de Watson-Crick tradicional u otros tipos no tradicionales. Un porcentaje de complementariedad indica el porcentaje de restos en una molécula de ácido nucleico que puede formar enlaces de hidrógeno (por ej., emparejamiento de bases de Watson-Crick) con una segunda 5 secuencia de ácidos nucleicos (por ej., 5, 6, 7, 8, 9, 10 de un total de 10 siendo la complementariedad del 50%, 60%, 70%, 80%, 90% y 100%). "Perfectamente complementario" significa que todos los restos contiguos de una secuencia de ácidos nucleicos formarán un enlace de hidrógeno con el mismo número de restos contiguos en una segunda secuencia de ácidos nucleicos. " Sustancialmente complementario" como se usa en la presente memoria se refiere a un grado de complementariedad que es al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%,
10 98%, 99% o 100% por una región de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos o se refiere a dos ácidos nucleicos que se hibridan en condiciones rigurosas.
Como se usa en la presente memoria, "condiciones rigurosas" para hibridación se refiere a las condiciones en las cuales un ácido nucleico que tiene complementariedad a una secuencia objetivo se hibrida predominantemente con la secuencia objetivo y sustancialmente no se hibrida a las secuencias no objetivo. Las condiciones rigurosas son en
15 general dependientes de la secuencia, y varían dependiendo de una serie de factores. En general, cuanto más larga la secuencia, mayor la temperatura a la que se hibrida de manera específica la secuencia a su secuencia objetivo. Se describen con detalle ejemplos no limitantes de condiciones rigurosas en Tijssen (1.993), Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I, Segundo Capítulo "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", Elsevier, N.Y.
20 "Hibridación" se refiere a una reacción en que uno o más polinucleótidos reaccionan para formar un complejo que se estabiliza vía enlace de hidrógeno entre las bases de los restos de nucleótido. El enlace de hidrógeno puede tener lugar por apareamiento de bases de Watson Crick, unión de Hoogstein o de cualquier otra manera específica de la secuencia. El complejo puede comprender dos hebras que forman una estructura dúplex, tres o más hebras que forman un complejo multicatenario, una sola hebra que se autohibrida o cualquier combinación de éstas. Una
25 reacción de hibridación puede constituir una etapa en un procedimiento más extenso, tal como la iniciación de PCR
o la escisión de un polinucleótido mediante una enzima. Una secuencia capaz de hibridación con una secuencia determinada se refiere como el “complemento” de la secuencia determinada.
Como se usa en la presente memoria, "estabilización" o "estabilidad aumentada" con respecto a componentes del sistema CRISPR se refieren a asegurar o estabilizar la estructura de la molécula. Esto se puede llevar a cabo por 30 introducción de una o más mutaciones, incluyendo cambios de pares de base únicos o múltiples, aumentando el número de horquillas, unión cruzada, rompiendo tramos particulares de nucleótidos y otras modificaciones. Las modificaciones pueden incluir la inclusión de al menos un nucleótido que no se encuentra en la naturaleza o un nucleótido modificado o análogos de los mismos. Se pueden modificar nucleótidos modificados en el resto ribosa, fosfato y/o base. Los nucleótidos modificados pueden incluir 2'-O-metil-análogos, 2'-desoxi-análogos o 2'-fluoro35 análogos. La cadena principal de ácidos nucleicos se puede modificar, por ejemplo, se puede usar una cadena principal de fosforotioato. El uso de ácidos nucleicos bloqueados (LNA, por sus siglas en inglés) o ácidos nucleicos de puente (BNA, por sus siglas en inglés) también puede ser posible. Más ejemplos de bases modificadas incluyen, pero no se limitan a, 2-aminopurina, 5-bromo-uridina, pseudouridina, inosina, 7-metilguanosina. Estas modificaciones se pueden aplicar a cualquier componente del sistema CRSIPR. En una realización preferida estas
40 modificaciones se realizan a los componentes de ARN, por ejemplo, el ARN guía o secuencia de polinucleótidos quiméricos.
Como se usa en la presente memoria, "expresión" se refiere al procedimiento por el que un polinucleótido se transcribe de una plantilla de ADN (tal como en ARNm u otro transcrito de ARN) y/o el procedimiento por el que se traduce con posterioridad un ARNm transcrito en péptidos, polipéptidos o proteínas. Los transcritos y polipéptidos
45 codificados se pueden referir de manera colectiva como “producto génico”. Si el polinucleótido procede de ADN genómico, la expresión puede incluir proceso de corte y empalme del ARNm en una célula eucariota.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan de forma intercambiable en la presente memoria para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado y puede comprender aminoácidos modificados y puede ser interrumpido por no aminoácidos. Los términos también incluyen
50 un polímero de aminoácidos que ha sido modificado; por ejemplo, formación de enlace disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación, tal como conjugación con un componente etiquetado. Como se usa en la presente memoria el término “aminoácido” incluye aminoácidos naturales y/o no naturales o sintéticos, incluyendo glicina y los dos isómeros ópticos D o L y análogos de aminoácido y peptidomiméticos.
55 Los términos " individuo," "individual" y "paciente" se usan de forma intercambiable en la presente memoria para referirse a un vertebrado, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano. Los mamíferos incluyen, pero no están limitados a, murinos, simios, seres humanos, animales de granja, animales deportivos y mascotas. Los tejidos, las células y su progenie de una entidad biológica obtenida in vivo o cultivada in vitro también se incluyen. En algunas realizaciones, un individuo puede ser un animal invertebrado, por ejemplo, un insecto o un
60 nematodo; mientras que en otros, un individuo puede ser una planta o un hongo.
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Los términos "agente terapéutico", "agente terapéutico capaz" o "agente de tratamiento" se usan de forma intercambiable y se refieren a una molécula o compuesto que confiere algún efecto beneficioso en la administración a un individuo. El efecto beneficioso incluye permitir determinaciones de diagnóstico; alivio de una enfermedad, síntoma, trastorno o afección patológica; reducir o prevenir el comienzo de una enfermedad, síntoma, trastorno o afección y en general contrarrestar una enfermedad, síntoma, trastorno o afección patológica.
Como se usa en la presente memoria, "tratamiento" o " tratar," o "paliar" o "aliviar" se usan de forma intercambiable. Estos términos se refieren a una propuesta para obtener resultados beneficiosos o deseados incluyendo pero no limitándose a un beneficio terapéutico y/o un beneficio profiláctico. Por beneficio terapéutico se quiere decir cualquier mejora terapéuticamente relevante en, o efecto sobre, una o más enfermedades, afecciones o síntomas bajo tratamiento. Para beneficio profiláctico, las composiciones se pueden administrar a un individuo con riesgo de desarrollar una enfermedad particular, afección o síntoma o a un individuo que indica uno o más de los síntomas fisiológicos de una enfermedad, incluso aunque la enfermedad, afección o síntoma pueda no haberse manifestado aún.
El término "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de un agente que es suficiente para efectuar resultados beneficiosos o deseados. La cantidad terapéuticamente eficaz puede variar dependiendo de uno o más de: el individuo y la enfermedad que se está tratando, el peso y la edad del individuo, la gravedad de la enfermedad, la manera de administración y similares, que se puede determinar fácilmente por un experto en la materia. El término también se aplica a una dosis que proporcionará una imagen para detección por uno cualquiera de los métodos de formación de imagen descritos en la presente memoria. La dosis específica puede variar dependiendo de uno o más de: el agente particular elegido, el régimen de dosificación que se tenga que seguir, si se administra en asociación con otros compuestos, la sincronización de la administración, el tejido que se tiene que someter a formación de imagen y el sistema de suministro físico en el cual esté soportado.
La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique de otro modo, técnicas convencionales de inmunología, bioquímica, química, biología molecular, microbiología, biología celular, ADN genómico y recombinante, que están dentro de la destreza de la técnica. Véase Sambrook, Fritsch y Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª edición (1.989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F.
M. Ausubel, et al. eds., (1.987)); las series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames y G. R. Taylor eds. (1.995)), Harlow and Lane, eds.
(1.988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL AND ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1.987)).
Varios aspectos de la invención se refieren a sistemas vector que comprenden uno o más vectores o vectores como tales. Se pueden diseñar vectores para expresión de transcritos CRISPR (por ejemplo, transcritos de ácidos nucleicos, proteínas o enzimas) en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, se pueden expresar transcritos de CRISPR en células bacterianas tales como Escherichia coli, células de insecto (usando vectores de expresión de baculovirus), células de levaduras o células de mamíferos. Las células huésped adecuadas se discuten además en Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego; Calif. (1.990). Como alternativa, el vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo usando secuencias reguladoras de activador T7 y polimerasa T7.
Se pueden introducir vectores y propagar en una procariota. En algunas realizaciones, se usó una procariota para multiplicar copias de un vector que se tiene que introducir en una célula eucariota o como un vector intermedio en la producción de un vector que se tiene que introducir en una célula eucariota (por ej., multiplicando un plásmido como parte de un sistema de empaquetamiento de vector vírico). En algunas realizaciones, se usa una procariota para multiplicar copias de un vector y expresar uno o más ácidos nucleicos, tal como para proporcionar una fuente de una
o más proteínas para suministro a una célula huésped u organismo huésped. La expresión de proteínas en procariotas se lleva a cabo lo más frecuentemente en Escherichia coli con vectores que contienen activadores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas de fusión o de no fusión. Los vectores de fusión añaden una serie de aminoácidos a una proteína codificada allí, tal como al término amino de la proteína recombinante. Dichos vectores de fusión pueden servir para uno o más fines, tales como: (i) para aumentar la expresión de proteína recombinante; (ii) para aumentar la solubilidad de la proteína recombinante y (iii) para ayudar en la purificación de la proteína recombinante actuando como un ligando de purificación de afinidad. Con frecuencia, en vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítico en la unión del resto de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante del resto de fusión posterior a la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento o de origen similar, incluyen Factor Xa, trombina y enterocinasa. Vectores de expresión de fusión de ejemplo incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1.988. Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N. J.) que condensan glutationa S-transferasa (GST), proteína de unión maltosa E o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante objetivo.
Ejemplos de vectores de expresión E. coli no de fusión, inducibles, adecuados, incluyen pTrc (Amrann et al., (1.988) Gene 69: 301-315) y pET 11d (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calf. (1.990) 60-89).
En algunas realizaciones, un vector es un vector de expresión de levadura. Ejemplos de vectores para expresión en
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levadura Saccharomyces cerivisae incluyen pYepSec1 (Baldari, et al., 1.987. EMBO J. 6: 229-234), pMFa (Kuijan and Herskowitz, 1.982. Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1.987. Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.) y picZ (InVitrogen Corp, San Diego, Calif.).
En algunas realizaciones, un vector conduce la expresión de proteínas en células de insecto usando vectores de expresión de baculovirus. Los vectores baculovirus disponibles para expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (por ej., células SF9) incluyen la serie pAc (Smith, et al., 1.983. Mol. Cell. Biol. 3: 2.156-2.165) y la serie pVL (Lucklow and Summers, 1.989. Virology 170: 31-39).
En algunas realizaciones, un vector es capaz de conducir la expresión de una o más secuencias en células de mamífero usando un vector de expresión de mamífero. Ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen pCDM8 (Seed, 1.987. Nature 329: 840) y pMT2PC (Kaufman, et al., 1.987. EMBO J. 6: 187-195). Cuando se usa en células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión se proporcionan típicamente por uno o más elementos reguladores. Por ejemplo, los activadores usados comúnmente proceden de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus, virus 40 de simio y otros descritos en la presente memoria y conocidos en la técnica. Para otros sistemas de expresión adecuados para ambas células procariotas y eucariotas véanse, por ejemplo, los Capítulos 16 y 17 de Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1.989.
En algunas realizaciones, el vector de expresión de mamíferos recombinante es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo de célula particular (por ejemplo, se usan elementos reguladores específicos del tejido para expresar el ácido nucleico). Los elementos reguladores específicos del tejido son conocidos en la técnica. Ejemplos no limitantes de activadores específicos del tejido adecuados incluyen el activador de albúmina (específico del hígado; Pinkert, et al., 1.987. Genes Dev. 1: 268-277), activadores específicos linfoides (Calame and Eaton, 1.988. Adv. Immunol. 43: 235-275), en particular activadores de receptores de las células T (Winoto and Baltimore, 1.989. EMBO J. 8: 729-733) e inmunoglobulinas (Baneiji, et al., 1.983. Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore, 1.983. Cell 33: 741-748), activadores específicos de las neuronas (por ej., el activador de neurofilamentos; Byrne and Ruddle, 1.989. Proc. Natl. Acad Sci. USA 86: 5.473-5.477), activadores específicos del páncreas (Edlund, et al., 1.985. Science 230: 912-916) y activadores específicos de las glándulas mamarias (por ej., activador de suero de leche; Patente de EE.UU. Nº 4. 873. 316 y Publicación de la Solicitud de Patente Europea Nº 264.166). También se incluyen activadores regulados por el desarrollo, por ej., los activadores de hox de murina (Kessel and Gruss, 1.990. Science 249: 374-379) y el activador de α-fetoproteína (Campes and Tilghman, 1.989. Genes Dev. 3: 537-546).
En algunas realizaciones, un elemento regulador se une de manera operable a uno o más elementos de un sistema CRISPR a fin de conducir la expresión de uno o más elementos del sistema CRISPR. En general, las CRISPR (Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas), también conocidas como las SPIDR (Repeticiones Directas Intercaladas Separadas, por sus siglas en inglés), constituyen una familia de sitios de ADN que son normalmente específicos para una especie bacteriana particular. El sitio de CRISPR comprende una clase distinta de repeticiones de secuencias cortas intercaladas (las SSR) que se reconocieron en E. coli (Ishino et al., J. Bacteriol., 169: 5.429-5.433 [1.987] y Nakata et al., J. Bacteriol., 171: 3.553-3.556 [1.989]) y genes asociados. Las SSR intercaladas similares han sido identificadas en Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena y Mycobacterium tuberculosis (Véase, Groenen et al., Mol. Microbiol., 10: 1.057-1.065 [1.993]; Hoe et al., Emerg. Infect. Dis., 5: 254-263 [1.999]; Masepohl et al., Biochim. Biophys. Acta 1.307: 26-30 [1.996] y Mojica et al., Mol. Microbiol., 17: 85-93 [1.995]). El sitio de CRISPR difiere típicamente de las otras SSR por la estructura de las repeticiones, que se han denominado repeticiones espaciadas regularmente cortas (las SRSR) (Janssen et al. OMICS J. Integ. Biol., 6: 23-33 [2.002] y Mojica et al., Mol. Microbiol., 36: 244-246 [2.000]). En general, las repeticiones son elementos cortos que tienen lugar en agrupaciones que están regularmente espaciadas por secuencias de intervención únicas con una longitud sustancialmente constante (Mojica et al., [2.000], supra). Aunque las secuencias de repeticiones se conservan mucho entre cepas, el número de repeticiones intercaladas y las secuencias de las regiones espaciadoras difiere típicamente de cepa a cepa (van Embden et al., J. Bacteriol., 182: 2.393-2.401 [2.000]). Se ha identificado el sitio de CRISPR en más de 40 procariotas (Véase por ej., Jansen et al., Mol. Microbiol., 43: 1.565-1.575 [2.002] y Mojica et al., [2.005]) incluyendo, pero no limitado a Aeropyrum, Pyrobaculum, Sulfolobus, Archaeoglobus. Halocarcula, Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus, Pyrococcus, Picrophilus, Thermoplasma, Corynebacterium, Mycobacterium, Streptomyces, Aquifex, Porphyromonas, Chlorobium, Thermus, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Clostridium, Thermoanaerobacter, Mycoplasma, Fusobacterium, Azarcus, Chromobacterium, Neisseria, Nitrosomonas, Desulfovibrio, Geobacter, Myxococcus, Campylobacter, Wolinella. Acinetobacter, Erwinia, Escherichia, Legionella, Methylococcus, Pastaurella, Photobacterium, Salmonella, Xanthomonas, Yersinia, Treponema y Thermotoga.
En general, "sistema CRISPR" se refiere colectivamente a transcritos y otros elementos implicados en la expresión de o dirigidos a la actividad de genes asociados a CRISPR ("Cas"), incluyendo secuencias que codifican un gen Cas, una secuencia tracr (CRISPR trans-activante) (por ej., ARNtracr o un ARNtracr parcial activo), una secuencia de emparejamiento tracr (incluyendo una "repetición dirigida" y una repetición directa parcial tratada por ARNtracr en el contexto de un sistema CRISPR endógeno), una secuencia guía (también referida como un "espaciador" en el contexto de un sistema CRISPR endógeno) u otras secuencias y transcritos de un sitio CRISPR. En algunas realizaciones, uno o más elementos de un sistema CRISPR procede de un sistema CRISPR tipo I, tipo II o tipo III.
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En algunas realizaciones, uno o más elementos de un sistema CRISPR procede de un organismo particular que comprende un sistema CRISPR endógeno, tal como Streptococcus pyogenes. En general, un sistema CRISPR se caracteriza por elementos que activan la formación de un complejo CRISPR en el sitio de una secuencia objetivo (también referido como un protoespaciador en el contexto de un sistema CRISPR endógeno). En el contexto de 5 formación de un complejo CRISPR, "secuencia objetivo" se refiere a una secuencia para la que se diseña que una secuencia guía presente complementariedad, donde la hibridación entre una secuencia objetivo y una secuencia guía active la formación de un complejo CRISPR. No se requiere necesariamente complementariedad completa, siempre que haya suficiente complementariedad para producir hibridación y activar la formación de un complejo CRISPR. Una secuencia objetivo puede comprender cualquier polinucleótido, tal como polinucleótido de ADN o 10 ARN. En algunas realizaciones, se sitúa una secuencia objetivo en el núcleo o citoplasma de una célula. En algunas realizaciones, la secuencia objetivo puede estar dentro de un organelo de una célula eucariota, por ejemplo, mitocondria o cloroplasto. Una secuencia o plantilla que se puede usar para recombinación en el sitio fijado como objetivo que comprende las secuencias objetivo se refiere como “ plantilla de edición” o “polinucleótido de edición” o “secuencia de edición”. En aspectos de la invención, un polinucleótido de plantilla exógeno se puede referir como
15 una plantilla de edición. En un aspecto de la invención la recombinación es recombinación homóloga.
Típicamente, en el contexto de un sistema CRISPR endógeno, la formación de un complejo CRISPR (que comprende una secuencia guía hibridada a una secuencia objetivo y complejada con una o más proteínas Cas) da como resultado la escisión de una o más hebras en o cerca de (por ej., dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 o más pares de bases de) la secuencia objetivo. Sin desear estar limitados por la teoría, la secuencia tracr, que puede 20 comprender o constar de toda o una porción de una secuencia tracr de tipo natural (por ej., aproximadamente o más de aproximadamente 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85 o más nucleótidos de una secuencia tracr de tipo natural), también puede formar parte de un complejo CRISPR, tal como por hibridación a lo largo de al menos una porción de la secuencia tracr a toda o una porción de una secuencia de emparejamiento tracr que esté ligada de manera operable a la secuencia guía. En algunas realizaciones, la secuencia tracr presenta suficiente complementariedad a 25 una secuencia de emparejamiento tracr para hibridar y participar en la formación de un complejo CRISPR. Como con la secuencia objetivo, se cree que no es necesaria la complementariedad completa, siempre que haya suficiente para que sea funcional. En algunas realizaciones, la secuencia tracr presenta al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de complementariedad de secuencias a lo largo de la longitud de la secuencia de emparejamiento tracr cuando se alinea de manera óptima. En algunas realizaciones, uno o más vectores que conducen la expresión de 30 uno o más elementos de un sistema CRISPR se introducen en una célula huésped de manera que la expresión de los elementos del sistema CRISPR dirija la formación de un complejo CRISPR en uno o más sitios objetivo. Por ejemplo, una enzima Cas, una secuencia guía ligada a una secuencia de emparejamiento tracr y una secuencia tracr podían estar unidas cada una de manera operable a elementos reguladores separados en vectores separados. Como alternativa, dos o más de los elementos expresados de los mismos o diferentes elementos reguladores, se 35 pueden combinar en un vector único, proporcionando uno o más vectores adicionales cualquier componente del sistema CRISPR no incluido en el primer vector. Los elementos del sistema CRISPR que se combinan en un único vector se pueden disponer en cualquier orientación adecuada, tal como un elemento situado en 5' con respecto a ("aguas arriba" de) o 3' con respecto a ("aguas abajo" de) un segundo elemento. La secuencia codificadora de un elemento puede estar situada en la misma hebra u opuesta de la secuencia codificadora de un segundo elemento y 40 orientada en la misma dirección u opuesta. En algunas realizaciones, un activador único conduce la expresión de una transcripción que codifica una enzima CRISPR y una o más de la secuencia guía, la secuencia de emparejamiento tracr (opcionalmente unida de manera operable a la secuencia guía) y una secuencia tracr embebida dentro de una o más secuencias intrón (por ej., cada una en un intrón diferente, dos o más en al menos un intrón o todas en un solo intrón). En algunas realizaciones, la enzima CRISPR, secuencia guía, secuencia de
45 emparejamiento tracr y secuencia tracr se unen de manera operable a y se expresan a partir del mismo activador.
En algunas realizaciones, un vector comprende uno o más sitios de inserción, tal como una secuencia de reconocimiento de endonucleasa de restricción (también referido como un “sitio de clonación”). En algunas realizaciones, uno o más sitios de inserción (por ej., aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sitios de inserción) están situados aguas arriba y/o aguas abajo de uno o más elementos de 50 secuencia de uno o más vectores. En algunas realizaciones, un vector comprende un sitio de inserción aguas arriba de una secuencia de emparejamiento tracr y opcionalmente aguas abajo de un elemento regulador unido de manera operable a la secuencia de emparejamiento tracr, de manera que después de la inserción de una secuencia guía en el sitio de inserción y en la expresión de la secuencia guía dirija la unión específica de la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia objetivo en una célula eucariota. En algunas realizaciones, un vector comprende dos o 55 más sitios de inserción, estando situado cada sitio de inserción entre dos secuencias de emparejamiento tracr de manera que se permita la inserción de una secuencia guía en cada sitio. En dicha disposición, dos o más secuencias guía pueden comprender dos o más copias de una secuencia guía única, dos o más secuencias guía diferentes o combinaciones de éstas. Cuando se usan múltiples secuencias guía diferentes, se puede usar una construcción de expresión única para fijar como objetivo la actividad de CRISPR a múltiples secuencias objetivo 60 correspondientes, diferentes, dentro de una célula. Por ejemplo, un solo vector puede comprender aproximadamente
o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o más secuencias guía. En algunas realizaciones, se pueden proporcionar aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de tales vectores que contienen secuencia guía y se suministran opcionalmente a una célula.
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En algunas realizaciones, un vector comprende un elemento regulador unido de manera operable a una secuencia codificadora de enzima que codifica una enzima CRISPR, tal como una proteína Cas. Ejemplos no limitantes de proteínas Cas incluyen Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (también conocidas como Csn1 y Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, homólogos de las mismas o versiones modificadas de las mismas. Estas enzimas son conocidas; por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de proteína Cas9 de S. pyogenes se puede encontrar en la base de datos SwissProt con el número de acceso Q99ZW2. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR no modificada presenta actividad de escisión de ADN, tal como Cas9. En algunas realizaciones la enzima CRISPR es Cas9 y puede ser Cas9 de S. pyogenes o S. pneumoniae. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR dirige la escisión de una o ambas hebras en la posición de una secuencia objetivo, tal como dentro de la secuencia objetivo y/o dentro del complemento de la secuencia objetivo. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR dirige la escisión de una o ambas hebras dentro de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 o más pares de bases del primer o el último nucleótido de una secuencia objetivo. En algunas realizaciones, un vector codifica una enzima CRISPR que muta con respecto a una enzima de tipo natural correspondiente de manera que la enzima CRISPR mutada carece de la capacidad para escindir una o ambas hebras de un polinucleótido objetivo que contiene una secuencia objetivo. Por ejemplo, una sustitución de aspartato a alanina (D10A) en el dominio catalítico RuvC I de Cas9 de S. pyogenes convierte Cas9 de una nucleasa que escinde ambas hebras a una nickasa (escinde una única hebra). Otros ejemplos de mutaciones que hacen Cas9 una nickasa incluyen, sin limitación, H840A, N854A y N863A. En algunas realizaciones, se puede usar una nickasa de Cas9 junto con secuencia o secuencias guía, por ejemplo, dos secuencias guía, que fijan como objetivo hebras transcrita y complementaria respectivamente del objetivo de ADN. Esta combinación permite que ambas hebras sean nickeadas y usadas para inducir NHEJ. Los solicitantes han demostrado (datos no mostrados) la eficacia de dos objetivos de nickasa (es decir, los ARNsg fijados como objetivo en la misma posición pero para diferentes hebras de ADN) en la inducción de NHEJ mutagénico. Una única nickasa (Cas9-D10A con un único ARNsg) es incapaz de inducir NHEJ y crear inserciones o supresiones pero los Solicitantes han demostrado en la nickasa doble (Cas9-D10A y dos ARNsg fijados como objetivo a diferentes hebras en la misma posición) lo puede hacer en células madre embrionarias humanas (las hESC). La eficacia es aproximadamente 50% de nucleasa (es decir, Cas9 regular sin mutación D10) en las hESC.
Como un ejemplo más, dos o más dominios catalíticos de Cas9 (RuvC I, RuvC II y RuvC III) pueden mutar para producir un Cas9 mutado que carece sustancialmente de toda actividad de escisión de ADN. En algunas realizaciones, una mutación de D10A se combina con una o más de las mutaciones H840A, N854A o N863A para producir una enzima Cas9 que carece sustancialmente de toda actividad de escisión de ADN. En algunas realizaciones, se considera que una enzima CRISPR carece sustancialmente de toda actividad de escisión de ADN cuando la actividad de escisión de ADN de la enzima mutada es menor que aproximadamente 25%, 10%, 5%, 1%, 0,1%, 0,01% o menor con respecto a su forma no mutada. Pueden ser útiles otras mutaciones; en el caso de que la Cas9 u otra enzima CRISPR sea de una especie distinta de S. pyogenes, se pueden realizar mutaciones en los correspondientes aminoácidos para conseguir efectos similares.
En algunas realizaciones, una secuencia codificadora de enzimas que codifica una enzima CRISPR es codón optimizada para expresión en células particulares, tales como células eucariotas. Las células eucariotas pueden ser aquéllas de, o procedentes de, un organismo particular, tal como un mamífero, incluyendo pero no limitado a, ser humano, ratón, rata, conejo, perro o primate no ser humano. En general, optimización de codón se refiere a un procedimiento para modificar una secuencia de ácidos nucleicos para mejorar la expresión en las células huésped de interés reemplazando al menos un codón (por ej., aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 o más codones) de la secuencia natural con codones que se usan más frecuentemente o lo más frecuentemente en los genes de esa célula huésped al tiempo que se mantiene la secuencia de aminoácidos natural. Diversas especies presentan sesgo particular para ciertos codones de un aminoácido particular. El sesgo de codones (diferencias en el uso de codones entre organismos) con frecuencia se correlaciona con la eficacia de traducción de ARN mensajero (ARNm), que se cree a su vez que depende de, entre otras cosas, las propiedades de los codones que se están traduciendo y la disponibilidad de moléculas de ARN de transferencia (ARNt) particulares. La predominancia de los ARNt seleccionados en una célula es en general una reflexión de los codones usados lo más frecuentemente en síntesis de péptidos. De acuerdo con esto, se pueden adaptar los genes para expresión óptima de los genes en un organismo determinado basándose en optimización de codones. Las tablas de utilización de codones están fácilmente disponibles, por ejemplo, en la “Base de Datos de Uso de Codones”, y estas tablas se pueden adaptar de una serie de maneras. Véase Nakamura Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28: 292 (2.000). También están disponibles algoritmos de ordenador para codones optimizando una secuencia particular para expresión en una célula huésped particular, tales como Gene Forge (Aptagen; Jacobus, PA). En algunas realizaciones, uno o más codones (por ej., 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 o más o todos los codones) en una secuencia codificando una enzima CRISPR corresponden al codón usado lo más frecuentemente para un aminoácido particular.
En algunas realizaciones, un vector codifica una enzima CRISPR que comprende una o más secuencias de localización nuclear (las NLS, por sus siglas en inglés), tales como aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más NLS. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR comprende aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más NLS en o cerca del amino terminal, aproximadamente o
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más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más NLS en o cerca del carboxi terminal o una combinación de estos (por ejemplo, una o más NLS en el amino terminal y una o más NLS en el carboxi terminal). Cuando está presente más de una NLS, cada una se puede seleccionar independientemente de las otras, de manera que puede estar presente una sola NLS en más de una copia y/o junto con otra u otras NLS más presentes en una o más 5 copias. En una realización preferida de la invención, la enzima CRISPR comprende a lo sumo 6 NLS. En algunas realizaciones, se considera una NLS cerca del N-o C-terminal cuando el aminoácido más cercano de la NLS está dentro de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 o más aminoácidos a lo largo de la cadena polipeptídica del N o C-terminal. Típicamente, una NLS consta de una o más secuencias cortas de lisinas o argininas cargadas positivamente expuestas en la superficie de la proteína, pero se conocen otros tipos de NLS. Ejemplos no limitantes de las NLS incluyen una secuencia de NLS procedente de: la NLS del antígeno T grande del virus SV40, que tiene la secuencia de aminoácidos PKKKRKV; la NLS de nucleoplasmina (por ej., la NLS bipartita de nucleoplasmina con la secuencia KRPAATKKAGQAKKKK); la NLS de c-myc que tiene la secuencia de aminoácidos PAAKRVKLD o RQRRNELKRSP; la NLS M9 del hRNPA1 que tiene la secuencia NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY; la secuencia
15 RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV del dominio IBB de importina-alfa; las secuencias VSRKRPRP y PPKKARED de la proteína T de mioma; la secuencia POPKKKPL de p53 humano; la secuencia SALIKKKKKMAP de c-abl IV de ratón; las secuencias DRLRR y PKQKKRK del virus de la influenza NS1; la secuencia RKLKKKIKKL del antígeno delta del virus de la Hepatitis; la secuencia REKKKFLKRR de la proteína Mx1 de ratón; la secuencia KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK de la poli(ADP-ribosa) polimerasa humana y la secuencia RKCLQAGMNLEARKTKK del glucocorticoide de receptores de hormonas esteroideas (humano).
En general, una o más NLS son de suficiente fortaleza para conducir la acumulación de la enzima CRISPR en una cantidad detectable en el núcleo de una célula eucariota. En general, la fortaleza de actividad de localización nuclear puede proceder del número de las NLS en la enzima CRISPR, la o las NLS particulares usadas o una combinación de estos factores. La detección de acumulación en el núcleo se puede realizar por cualquier técnica adecuada. Por 25 ejemplo, se puede condensar un marcador detectable a la enzima CRISPR, de manera que se pueda visualizar la localización dentro de una célula, tal como junto con un medio para detectar la localización del núcleo (por ejemplo, una mancha específica para el núcleo tal como DAPI). Ejemplos de marcadores detectables incluyen proteínas fluorescentes (tales como proteínas fluorescentes Verdes o GFP; RFP; CFP) y etiquetas de epítopos (etiqueta HA, etiqueta bandera, etiqueta SNAP). También se pueden aislar los núcleos celulares de las células, los contenidos de los cuales se pueden analizar después por cualquier procedimiento adecuado para detectar proteína, tal como immunohistoquímica, ensayo de Western o ensayo de actividad enzimática. La acumulación en el núcleo también se puede determinar de una manera indirecta, tal como por un ensayo para el efecto de la formación de complejo CRISPR (por ejemplo, ensayo para escisión de ADN o mutación en la secuencia objetivo o ensayo para actividad de expresión de genes modificada afectada por la formación de complejo CRISPR y/o actividad de la enzima CRISPR),
35 cuando se compara con un control no expuesto a la enzima o complejo CRISPR o expuesto a una enzima CRISPR que carece de una o más NLS.
En general, una secuencia guía es cualquier secuencia de polinucleótidos que tiene suficiente complementariedad con una secuencia de polinucleótidos objetivo para hibridación con la secuencia objetivo y dirigir la unión específica de la secuencia de un complejo CRISPR a la secuencia objetivo. En algunas realizaciones, el grado de complementariedad entre una secuencia guía y su correspondiente secuencia objetivo, cuando se alinean de manera óptima usando un algoritmo de alineación adecuado, es aproximadamente o más de aproximadamente 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99% o más. La alineación óptima se puede determinar con el uso de cualquier algoritmo adecuado para alinear secuencias, ejemplo no limitante de lo cual incluye el algoritmo Smith-Waterman, el algoritmo Needleman-Wunsch, los algoritmos basados en la transformación de Burrows-Wheeler (por 45 ej., el Alineador de Burrows Wheeler), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies, ELAND (Illumina, San Diego, CA), SOAP (disponible en soap.genomics.org.cn) y Maq (disponible en maq.sourceforge.net). En algunas realizaciones, una secuencia guía es aproximadamente o más de aproximadamente 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 o más nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, una secuencia guía es menor que aproximadamente 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 o menos nucleótidos de longitud. La capacidad de una secuencia guía para dirigir la unión específica de la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia objetivo se puede evaluar por cualquier ensayo adecuado. Por ejemplo, los componentes de un sistema CRISPR suficientes para formar un complejo CRISPR, incluyendo la secuencia guía que se tiene que ensayar, se puede proporcionar a una célula huésped que tenga la correspondiente secuencia objetivo, tal como por transfección con vectores que codifiquen los componentes de la secuencia CRISPR, seguido
55 por una evaluación de la escisión preferente dentro de la secuencia objetivo, tal como mediante ensayo Surveyor como se describe en la presente memoria. De manera similar, la escisión de una secuencia de polinucleótido objetivo se puede evaluar en un tubo de ensayo proporcionando la secuencia objetivo, los componentes de un complejo CRISPR, incluyendo la secuencia guía que se tiene que ensayar y una secuencia guía de control diferente de la secuencia guía de ensayo y comparando la unión o velocidad de escisión en la secuencia objetivo entre las reacciones de la secuencia guía de ensayo y de control. Son posibles otros ensayos, y tendrán lugar para los expertos en la materia.
Se puede seleccionar una secuencia guía para fijar como objetivo cualquier secuencia objetivo. En algunas realizaciones, la secuencia objetivo es una secuencia dentro de un genoma de una célula. Las secuencias objetivo
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ejemplares incluyen aquéllas que son únicas en el genoma objetivo. Por ejemplo, para la Cas9 de S. pyogenes, una secuencia objetivo única en un genoma puede incluir un sitio objetivo de Cas9 de la forma MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG donde NNNNNNNNNNNNXGG (N es A, G, T o C y X puede ser cualquiera) presenta un solo caso en el genoma. Una única secuencia objetivo en un genoma puede incluir un sitio objetivo de 5 Cas9 de S. pyogenes de la forma MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGG donde NNNNNNNNNNNXGG (N es A, G, T o C y X puede ser cualquiera) presenta un solo caso en el genoma. Para la Cas9 de CRISPR1 de S. thermophilus, una única secuencia objetivo en un genoma puede incluir un sitio objetivo de Cas9 de la forma MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXXAGAA W donde NNNNNNNNNNNNXXAGAAW (N es A, G, T o C; X puede ser cualquiera y W es A o T) presenta un solo caso en el genoma. Una única secuencia objetivo en un genoma puede incluir un sitio objetivo de Cas9 de CRISPR1 de S. thermophilus de la forma MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXXAGAAW donde NNNNNNNNNNNXXAGAAW (N es A, G, T o C; X puede ser cualquiera y W es A o T) presenta un solo caso en el genoma. Para la Cas9 de S. pyogenes, una sola secuencia objetivo en un genoma puede incluir un sitio objetivo de Cas9 de la forma MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGGXG donde NNNNNNNNNNNNXGGXG (N es A, G, T o C y X puede ser cualquiera) presenta un solo caso en el genoma.
15 Una única secuencia objetivo en un genoma puede incluir un sitio objetivo de Cas9 de S. pyogenes de la forma MMMMMMMMNMNNNNNNNNNNXGGXG donde NNNNNNNNNNNXGGXG (N es A, G, T o C y X puede ser cualquiera) presenta un único caso en el genoma. En cada una de estas secuencias "M" puede ser A, G, T o C y requiere que no se considere en la identificación de una secuencia como única.
En algunas realizaciones, una secuencia guía se selecciona para reducir el grado de estructura secundaria dentro de la secuencia guía. La estructura secundaria se puede determinar por cualquier algoritmo de plegamiento de polinucleótidos adecuado. Algunos programas se basan en calcular la energía libre mínima de Gibbs. Un ejemplo de uno de tales algoritmos es mFold, como se describe por Zuker y Stiegler (Nucleic Acid Res. 9 (1.981), 133-148). Otro algoritmo de plegamiento de ejemplo es el RNAfold webserver online, desarrollado en el Instituto para Química Teórica de la Universidad de Viena, usando el algoritmo de predicción de estructura centroide (véase por ej., A. R.
25 Gruber et al., 2.008, Cell 106 (1): 23-24 y PA Carr y GM Church, 2.009, Nature Biotechnology 27 (12): 1.151-62).
En general, una secuencia de emparejamiento tracr incluye cualquier secuencia que presente suficiente complementariedad con una secuencia tracr para activar uno o más de: (1) escisión de una secuencia guía flanqueada por secuencias de emparejamiento tracr en una célula que contiene la correspondiente secuencia tracr y
(2) formación de un complejo CRISPR en una secuencia objetivo, en la que el complejo CRISPR comprende la secuencia de emparejamiento tracr hibridada a la secuencia tracr. En general, el grado de complementariedad es con referencia al alineamiento óptimo de la secuencia de emparejamiento tracr y la secuencia tracr, junto con la longitud del acortador de las dos secuencias. El alineamiento óptimo se puede determinar por cualquier algoritmo de alineamiento adecuado y puede justificar además estructuras secundarias, tal como autocomplementareidad dentro de cualquiera la secuencia tracr o la secuencia de emparejamiento tracr. En algunas realizaciones, el grado de 35 complementariedad entre la secuencia tracr y la secuencia de emparejamiento tracr junto con la longitud del acortador de las dos cuando se alinean de manera óptima es aproximadamente o más de aproximadamente 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97,5%, 99% o mayor. Las ilustraciones de ejemplo de alineación óptima entre una secuencia tracr y una secuencia de emparejamiento tracr se proporcionan en las Figuras 12B y 13B. En algunas realizaciones, la secuencia tracr es aproximadamente o más de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50 o más nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia tracr y secuencia de emparejamiento tracr están contenidas dentro de una transcripción única, de manera que la hibridación entre las dos produce un transcripto con una estructura secundaria, tal como una horquilla. Las secuencias formadoras de lazo preferidas para uso en estructuras de horquilla tienen cuatro nucleótidos de longitud y lo más preferiblemente tienen la secuencia GAAA. Sin embargo, se pueden usar secuencias de lazo más largas o 45 más cortas, como se pueden usar secuencias alternativas. Las secuencias incluyen preferiblemente un triplete nucleótido (por ejemplo, AAA) y un nucleótido adicional (por ejemplo C o G). Ejemplos de secuencias formadoras de lazo incluyen CAAA y AAAG. En una realización de la descripción, el transcripto o secuencia de polinucleótidos transcrita presenta al menos dos o más horquillas. En realizaciones preferidas, el transcripto presenta dos, tres, cuatro o cinco horquillas. En una realización más de la descripción, el transcripto presenta a lo sumo cinco horquillas. En algunas realizaciones, el transcripto único incluye además una secuencia de terminación de la transcripción; preferiblemente esta es una secuencia poliT, por ejemplo seis nucleótidos T. Una ilustración de ejemplo de dicha estructura de horquilla se proporciona en la porción inferior de la Figura 13B, donde la porción de la secuencia 5' del "N" final y aguas arriba del lazo corresponde a la secuencia de emparejamiento tracr y la porción de la secuencia 3' del lazo corresponde a la secuencia tracr. Ejemplos no limitantes adicionales de polinucleótidos
55 únicos que comprenden una secuencia guía, una secuencia de emparejamiento tracr y una secuencia tracr son como sigue (enumerados 5' a 3'), donde "N" representa una base de una secuencia guía, el primer bloque de letras minúsculas representan la secuencia de emparejamiento tracr y el segundo bloque de letras minúsculas secuencia representa la secuencia tracr y la secuencia poli-T final representa el terminador de la transcripción: (1) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaagatttaGAAAtaaatcttgcagaagctacaaagataaggctt catgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT; (2) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatca acaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT; (3) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatca acaccctgtcattttatggcagggtgtTTTTTT; (4)
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NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaa agtggcaccgagtcggtgcTTTTTT; (5) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaa aaagtgTTTTTTT; y (6) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctagAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaTTTTT TTT. En algunas realizaciones, las secuencias (1) a (3) se usan junto con Cas9 de CRISPR1 S. thermophilus. En algunas realizaciones, las secuencias (4) a (6) se usan junto con Cas9 de S. pyogenes. En algunas realizaciones, la secuencia tracr es un transcrito separado de una transcripción que comprende la secuencia de emparejamiento tracr (tal como se ilustra en la porción superior de la Figura 13B).
En algunas realizaciones, también se proporciona una plantilla de recombinación. Una plantilla de recombinación puede ser un componente de otro vector como se describe en la presente memoria, contenido en un vector separado o proporcionado como un polinucleótido separado. En algunas realizaciones, se diseña una plantilla de recombinación para servir como una plantilla en recombinación homóloga, tal como dentro de o cerca de una secuencia objetivo nickeada o escindida por una enzima CRISPR como parte de un complejo CRISPR. Un polinucleótido de plantilla puede ser de cualquier longitud adecuada, tal como aproximadamente o más de aproximadamente 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1.000 o más nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el polinucleótido de plantilla es complementario a una porción de un polinucleótido que comprende la secuencia objetivo. Cuando se alinea de manera óptima, un polinucleótido de plantilla puede solaparse con uno o más nucleótidos de una secuencia objetivo (por ej., aproximadamente o más de aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más nucleótidos). En algunas realizaciones, cuando una secuencia de plantilla y un polinucleótido que comprende una secuencia objetivo se alinean de manera óptima, el nucleótido más cercano del polinucleótido de plantilla está dentro de aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 1.000, 5.000, 10.000 o más nucleótidos de la secuencia objetivo.
En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es parte de una proteína de fusión que comprende uno o más dominios de proteína heteróloga (por ej., aproximadamente o más de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más dominios además de la enzima CRISPR). Una proteína de fusión de enzima CRISPR puede comprender cualquier secuencia de proteínas adicional y opcionalmente una secuencia ligadora entre dos dominios cualesquiera. Ejemplos de dominios de proteínas que se pueden condensar a una enzima CRISPR incluyen, sin limitación, etiquetas de epítopos, secuencias de genes informadores y dominios de proteínas con una o más de las siguientes actividades: actividad de metilasa, actividad de desmetilasa, actividad de activación de la transcripción, actividad de represión de la transcripción, actividad del factor de liberación de la transcripción, actividad de modificación de histona, actividad de escisión de ARN y actividad de unión de ácidos nucleicos. Ejemplos no limitantes de etiquetas de epítopos incluyen etiquetas de histidina (His), etiquetas V5, etiquetas FLAG, etiquetas de hemaglutinina de la influenza (HA), etiquetas Myc, etiquetas VSV-G y etiquetas de tioredoxina (Trx). Los ejemplos de genes informadores incluyen, pero no se limitan a, glutationa-S-transferasa (GST), peroxidasa de rábano (HRP, por sus siglas en inglés), cloramfenicol acetiltransferasa (CAT, por sus siglas en inglés) beta-galactosidasa, betaglucuronidasa, luciferasa, proteína fluorescente verde (PFV), HcRed, DsRed, proteína fluorescente cian (PFC) proteína fluorescente amarilla (PFAm) y proteínas autofluorescentes incluyendo proteína fluorescente azul (PFA). Una enzima CRISPR se puede condensar a una secuencia de genes que codifique una proteína o un fragmento de una proteína que una moléculas de ADN u otras moléculas celulares, incluyendo pero no limitándose a (por sus siglas en inglés), proteína de unión de maltosa (MBP), etiqueta S, fusiones de dominios de unión de ADN Lex A (DBD), fusiones de dominios de unión de ADN GAL4 y fusiones de proteínas BP16 de virus del herpes simple (HSV). Los dominios adicionales que pueden formar parte de una proteína de fusión que comprende una enzima CRISPR se describen en la patente de EE.UU. 20110059502 incorporada a la presente por referencia. En algunas realizaciones, se usa una enzima CRISPR etiquetada para identificar la posición de una secuencia objetivo.
En algunos aspectos, la descripción proporciona métodos que comprenden suministrar uno o más polinucleótidos, tales como o uno o más vectores como se describe en la presente memoria, uno o más transcritos de los mismos y/o una o proteínas transcritas de allí, a una célula huésped. En algunos aspectos, la descripción proporciona además células producidas por tales métodos y organismos (tales como animales, plantas u hongos) que comprenden o son producidos de tales células. En algunas realizaciones, se suministra una enzima CRISPR junto con (y opcionalmente complejada con) una secuencia guía a una célula. Se pueden usar métodos de transferencia de genes con base vírica y no vírica convencionales para introducir ácidos nucleicos en células de mamífero o tejidos objetivo. Se pueden usar dichos métodos para administrar componentes que codifican ácidos nucleicos de un sistema CRISPR a células en cultivo o en un organismo huésped. Los sistemas de suministro de vectores no víricos incluyen plásmidos de ADN, ARN (por ej., un transcrito de un vector descrito en la presente memoria), ácido nucleico desnudo y ácido nucleico complejado con un vehículo de suministro, tal como un liposoma. Los sistemas de suministro de vectores víricos incluyen virus de ADN y ARN, que tienen genomas episomales o integrados después de suministro a la célula. Para una revisión de procedimientos de tratamiento de genes, véase Anderson, Science
256: 808-813 (1.992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11: 211-217 (1.993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11: 162-166 (1.993); Dillon, TIBTECH 11: 167-175 (1.993); Miller, Nature 357: 455-460 (1.992); Van Brunt, Biotechnology 6 (10): 1.149-1.154 (1.988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8: 35-36 (1.995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51 (1): 31-44 (1.995); Haddada et al., en Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Böhm (eds) (1.995) y Yu et al., Gene Therapy 1: 13-26 (1.994).
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Los métodos de suministro no vírico de ácidos nucleicos incluyen lipofección, nucleofección, microinyección, biolística, virosomas, liposomas, inmunoliposomas, conjugados de policatión o lípido:ácido nucleico, ADN desnudo, viriones artificiales y absorción de ADN aumentada por agente. La lipofeción se describe en por ej., Las Patentes de EE.UU. Nº 5.049.386, 4.946.787 y 4.897.355) y se venden comercialmente los reactivos de lipofeción (por ej., Transfectam™ y Lipofectin™). Los lípidos catiónicos y neutros que son adecuados para lipofeción de reconocimiento de receptores eficaz de polinucleótidos incluyen aquéllos de Felgner, Patente Internacional WO 91/17424; Patente Internacional WO 91/16024. El suministro puede ser a células (por ej., administración in vitro o ex vivo) o tejidos objetivo (por ej., administración in vivo).
La preparación de complejos de lípido:ácido nucleico, incluyendo liposomas fijados como objetivo tales como complejos de inmunolípidos, es conocida para un experto en la materia (véase, por ej., Crystal, Science 270: 404410 (1.995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2: 291-297 (1.995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5: 382-389 (1.994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5: 647-654 (1.994); Gao et al., Gene Therapy 2: 710-722 (1.995); Ahmad et al., Cancer Res. 52: 4.817-4.820 (1.992); Patentes de EE.UU. Nº 4.186.183; 4.217.344; 4.235.871; 4.261.975; 4.485.054; 4.501.728; 4.774.085; 4.837.028 y 4.946.787).
El uso de sistemas de base vírica de ARN o ADN para el suministro de ácidos nucleicos toma ventaja de los procedimientos altamente desarrollados para fijar como objetivo un virus a células específicas en el cuerpo y traficar la carga útil vírica al núcleo. Se pueden administrar vectores víricos directamente a pacientes (in vivo) o se pueden usar para tratar células in vitro y las células modificadas se pueden administrar opcionalmente a los pacientes (ex vivo). Los sistemas con base vírica convencionales podían incluir vectores retrovirales, de lentivirus, adenovirales, adenoasociados y del virus del herpes simple para transferencia de genes. La integración en el genoma huésped es posible con los métodos de transferencia de genes de retrovirus, lentivirus y virus adenoasociados, dando como resultado con frecuencia expresión a largo plazo del transgen insertado. Adicionalmente, se han observado altas eficacias de transducción en muchos tipos celulares diferentes y tejidos fijados como objetivo.
El tropismo de un retrovirus se puede modificar por incorporación de proteínas de sobre extrañas, expandiendo la población objetivo potencial de células objetivo. Los vectores lentivirales son vectores retrovirales que son capaces de transducir o infectar células no de división y típicamente producen títulos víricos altos. La selección de un sistema de transferencia de genes retrovirales dependería por lo tanto del tejido objetivo. Los vectores retrovirales están constituidos por repeticiones terminales largas que actúan en cis con capacidad de empaquetamiento para hasta 610 kb de secuencia extraña. Las mínimas LTR que actúan en cis son suficientes para la replicación y empaquetamiento de los vectores, que se usan después para integrar el gen terapéutico en la célula objetivo para proporcionar expresión de transgenes permanente. Los vectores retrovirales ampliamente usados incluyen los basados en virus de la leucemia murina (MuLV), virus de la leucemia del mono gibón (GaLV), virus de la inmunodeficiencia simia (VIS), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y combinaciones de los mismos (véase, por ej., Buchscher et al., J. Virol. 66: 2.731-2.739 (1.992); Johann et al., J. Virol. 66: 1.635-1.640 (1.992); Sommnerfelt et al., Virol. 176: 58-59 (1.990); Wilson et al., J. Virol. 63: 2.374-2.378 (1.989); Miller et al., J. Virol. 65: 2.220-2.224 (1991); Patente de EE.UU. PCT/US94/05700).
En aplicaciones donde se prefiere la expresión transitoria, se pueden usar sistemas a base de adenovirus. Los vectores a base de adenovirus son capaces de una eficacia de transducción muy alta en muchos tipos de células y no requieren división celular. Con tales vectores, se han obtenido altos títulos y niveles de expresión. Este vector se puede producir en grandes cantidades en un sistema relativamente simple. También se pueden usar vectores de virus adenoasociados (“AAV”, por sus siglas en inglés) para transducir células con ácidos nucleicos objetivo, por ejemplo, en la producción in vitro de ácidos nucleicos y péptidos y para procedimientos de tratamiento con genes in vivo y ex vivo (véase, por ej., West et al., Virology 160: 38-47 (1.987); la Patente de EE.UU. Nº 4.797.368; la patente internacional WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5: 793-801 (1.994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94: 1.351 (1.994). Se describe la construcción de vectores AAV recombinantes en una serie de publicaciones, incluyendo la Patente de EE.UU. Nº 5.173.414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3.251-3.260 (1.985); Tratschin, et al., Mol. Cell Biol. 4: 2.072-2.081 (1.984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81: 6.466-6.470 (1.984) y Samulski et al., J. Virol. 63: 03822-3828 (1.989).
Típicamente se usan células de empaquetamiento para formar partículas de virus que sean capaces de infectar una célula huésped. Tales células incluyen células 293, que empaquetan adenovirus, y células ψ2 o células PA317, que empaquetan retrovirus. Los vectores víricos usados en terapia génica se generan habitualmente produciendo una estirpe celular que empaqueta un vector de ácidos nucleicos en una partícula vírica. Los vectores contienen típicamente las mínimas secuencias víricas requeridas para empaquetamiento y posterior integración en un huésped, siendo reemplazadas otras secuencias víricas por una casete de expresión para el polinucleótido o los polinucleótidos que se tienen que expresar. Las funciones víricas que faltan se suministran típicamente en trans por la estirpe celular de empaquetamiento. Por ejemplo, los vectores AAV usados en terapia génica típicamente poseen sólo secuencias ITR del genoma AAV que se requieren para empaquetamiento e integración en el genoma huésped. El ADN vírico se empaqueta en una estirpe celular, que contiene un plásmido auxiliar que codifica los otros genes AAV, es decir rep y cap, pero carecen de secuencias ITR. La estirpe celular también puede infectarse con adenovirus como auxiliar. El virus auxiliar activa la replicación del vector AAV y la expresión de genes AAV del plásmido auxiliar. El plásmido auxiliar no se empaqueta en cantidades significativas debido a ausencia de secuencias ITR. La contaminación con adenovirus se puede reducir por, por ejemplo, tratamiento térmico al cual es
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más sensible el adenovirus que AAV. Los métodos adicionales para el suministro de ácidos nucleicos a células son conocidos para los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. 20030087817.
En algunas realizaciones, una célula huésped se transfecta de manera transitoria o de manera no transitoria con uno
o más vectores descritos en la presente memoria. En algunas realizaciones, una célula se transfecta como tiene lugar de manera natural en un individuo. En algunas realizaciones, una célula que se transfecta es tomada de un individuo. En algunas realizaciones, la célula procede de células tomadas de un individuo, tales como una estirpe celular. Una amplia variedad de estirpes celulares de cultivos de tejido se conocen en la técnica. Ejemplos de estirpes celulares incluyen, pero no se limitan a, C8161, CCRF-CEM, MOLT, mIMCD-3, NHDF, HeLa-S3, Huh1, Huh4, Huh7, HUVEC, HASMC, HEKn, HEKa, MiaPaCell, Panc1, PC-3, TF1, CTLL-2, C1R, Rat6, CV1, RPTE, A10, T24, J82, A375, ARH-77, Calu1, SW480, SW620, SKOV3, SK-UT, CaCo2, P388D1, SEM-K2, WEHI-231, HB56, TIB55, Jurkat, J45.01, LRMB, Bcl-1, BC-3, IC21, DLD2, Raw264.7, NRK, NRK-52E, MRC5, MEF, Hep G2, HeLa B, HeLa T4, COS, COS-1, COS-6, COS-M6A, epitelial de riñón de mono BS-C-1, fibroblasto de embrión de ratón BALB/ 3T3, 3T3 Swiss, 3T3-L1, fibroblastos fetales humanos 132-d5; fibroblastos de ratón 10.1, 293-T, 3T3, 721, 9L, A2780, A2780ADR, A2780cis, A172, A20, A253, A431, A-549, ALC, B16, B35, células BCP-1, BEAS-2B, bEnd.3, BHK-21, BR 293, BxPC3, C3H-10T1/2, C6/36, Cal-27, CHO, CHO-7, CHO-IR, CHO-K1, CHO-K2, CHO-T, CHO Dhfr -/-, COR-L23, COR-L23/CPR, COR-L23/5010, COR-L23/R23, COS-7, COV-434, CML T1, CMT, CT26, D17, DH82, DU145, DuCaP, EL4, EM2, EM3, EMT6/AR1, EMT6/AR10.0, FM3, H1299, H69, HB54, HB55, HCA2, HEK-293, HeLa, Hepa1c1c7, HL-60, HMEC, HT-29, Jurkat, células JY, células K562, Ku812, KCL22, KG1, KYO1, LNCap, Ma-Mel 1-48, MC-38, MCF-7, MCF-10A, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-435, MDCK II, MDCK II, MOR/0.2R, MONO-MAC 6, MTD-1A, MyEnd, NCI-H69/CPR, NCI-H69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI-H69/LX4, NIH-3T3, NALM-1, NW-145 estirpes celulares OPCN / OPCT, Peer, PNT-1A / PNT 2, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, células Saos-2, Sf9, SkBr3, T2, T-47D, T84, estirpe celular THP1, U373, U87, U937, VCaP, células Vero, WM39, WT-49, X63 YAC-1, YAR y variedades transgénicas de los mismos. Las estirpes celulares están disponibles de una variedad de fuentes conocidas por los expertos en la materia (véase, por ej., La Colección de Cultivos de Tipo Americano (ATCC, por sus siglas en inglés) (Manassus, Va.)). En algunas realizaciones, una célula transfectada con uno o más vectores descritos en la presente memoria se usa para establecer una nueva estirpe celular que comprende una o más secuencias procedentes de vector. En algunas realizaciones, una célula transfectada de manera transitoria con los componentes de un sistema CRISPR como se describe en la presente memoria (tal como por transfección transitoria de uno o más vectores o transfección con ARN) y modificada por la actividad de un complejo CRISPR, se usa para establecer una nueva estirpe celular que comprende células que contienen la modificación pero carecen de otra secuencia exógena. En algunas realizaciones, las células transfectadas de manera transitoria o de manera no transitoria con uno o más vectores descritos en la presente memoria o estirpes celulares procedentes de dichas células se usan en la valoración de uno o más compuestos de ensayo.
En algunas realizaciones, uno o más vectores descritos en la presente memoria se usan para producir un animal transgénico no humano o planta transgénica. En algunas realizaciones, el animal transgénico es un mamífero, tal como un ratón, rata o conejo. En algunas realizaciones, el organismo o individuo es una planta. En algunas realizaciones, el organismo o individuo o planta es un alga. Los métodos para producir plantas y animales transgénicos son conocidos en la técnica y generalmente empiezan con un método de transfección de células, tal como se describe en la presente memoria. También se proporcionan animales transgénicos como son plantas transgénicas, especialmente cultivos y algas. El animal o la planta transgénicos pueden ser útiles en aplicaciones fuera de proporcionar un modelo de enfermedad. Éstas pueden incluir producción de alimentos o de alimentación por expresión de, por ejemplo, mayores niveles de proteína, carbohidrato, nutriente o vitaminas que lo que se observaría normalmente en el tipo natural. Con respecto a esto, se prefieren las plantas transgénicas, especialmente legumbres y tubérculos y animales, especialmente los mamíferos tales como ganado (vacas, ovejas, cabras y cerdos), pero también aves de corral e insectos comestibles.
Las algas transgénicas u otras plantas tales como colza pueden ser útiles en particular en la producción de aceites vegetales o biocombustibles tales como alcoholes (especialmente metanol y etanol), por ejemplo. Estos se pueden conseguir por ingeniería para expresar o sobreexpresar altos niveles de aceite o alcoholes para uso en las industrias de aceites o biocombustibles.
En un aspecto, la descripción proporciona métodos para modificar un polinucleótido objetivo en una célula eucariota. En algunas realizaciones, el método comprende permitir que un complejo CRISPR se una al polinucleótido objetivo para efectuar la escisión de dicho polinucleótido objetivo modificando de ese modo el polinucleótido objetivo, en la que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia guía hibridada a una secuencia fijada como objetivo dentro de dicho polinucleótido objetivo, en el que dicha secuencia guía está ligada a una secuencia de emparejamiento tracr que a su vez híbrida a una secuencia tracr.
En un aspecto, la descripción proporciona un método para modificar la expresión de un polinucleótido en una célula eucariota. En algunas realizaciones, el método comprende permitir que un complejo CRISPR se una al polinucleótido de manera que dicha unión dé como resultado expresión aumentada o disminuida de dicho polinucleótido; en el que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia guía hibridada a una secuencia fijada como objetivo dentro de dicho polinucleótido, en el que dicha secuencia guía está ligada a una secuencia de emparejamiento tracr que a su vez hibrida a una secuencia tracr.
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Con los recientes avances en la genómica de cultivos, la capacidad para usar sistemas CRISPR-Cas para realizar edición de genes y manipulación eficaz y de coste eficaz permitirá la rápida selección y la comparación de manipulaciones genéticas únicas y multiplexadas para transformar dichos genomas para producción mejorada y cebos mejorados. Con respecto a esto se hace referencia a las Patentes y publicaciones de EE.UU.: Patente de EE.UU. Nº 6.603.061 -Agrobacterium-Mediated Plant Transformation Method; la Patente de EE.UU. Nº 7.868.149 -Plant Genome Sequences and Uses Thereof y la Patente de EE.UU. 2009/0100536 -Transgenic Plants with Enhanced Agronomic Traits. En la práctica de la descripción, también se hace referencia a los contenidos y la descripción de Morrell et al "Crop genomics: advances and applications" Nat Rev Genet. 29 de diciembre de 2.011; 13 (2): 85-96. En una realización ventajosa de la descripción, el sistema CRISPR/Cas9 se usa para lograr por ingeniería micro algas. De acuerdo con esto, la referencia de la presente memoria a células de animales puede aplicarse también, mutatis mutandis, a células de plantas a menos que sea evidente de otro modo.
En un aspecto, la descripción proporciona métodos para modificar un polinucleótido objetivo en una célula eucariota, que puede ser in vivo, ex vivo o in vitro. En algunas realizaciones, el método comprende muestrear una célula o población de células de un animal humano o no humano o planta (incluyendo microalgas) y modificar la célula o células. Puede tener lugar cultivo en cualquier fase ex vivo. La célula o las células pueden ser introducidas de nuevo incluso en el animal no humano o planta (incluyendo microalgas).
En un aspecto, la descripción proporciona estuches que contienen uno o más cualesquiera de los elementos descritos en los métodos y composiciones anteriores. En algunas realizaciones, el estuche comprende un sistema vector e instrucciones para usar el estuche. En algunas realizaciones, el sistema vector comprende (a) un primer elemento regulador unido de manera operable a una secuencia de emparejamiento tracr y uno o más sitios de inserción para insertar una secuencia guía aguas arriba de la secuencia de emparejamiento tracr, en el que cuando se expresa, la secuencia guía dirige la unión específica de la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia fijada como objetivo en una célula eucariota, en la que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida a la secuencia objetivo y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a la secuencia tracr y/o (b) un segundo elemento regulador unido de manera operable a una secuencia codificadora de enzima que codifica dicha enzima CRISPR que comprende una secuencia de localización nuclear. Los elementos se pueden proporcionar de manera individual o en combinaciones y se pueden proporcionar en cualquier envase adecuado, tal como un vial, un frasco o un tubo. En algunas realizaciones, el estuche incluye instrucciones en uno o más idiomas, por ejemplo en más de un idioma.
En algunas realizaciones, un estuche comprende uno o más reactivos para uso en un procedimiento utilizando uno o más de los elementos descritos en la presente memoria. Los reactivos se pueden proporcionar en cualquier envase adecuado. Por ejemplo, un estuche puede proporcionar uno o más tampones de reacción o de almacenamiento. Los reactivos se pueden proporcionar en una forma que sea utilizable en un ensayo particular o en una forma que requiera la adición de otro u otros componentes más antes de uso (por ejemplo, en forma concentrada o liofilizada). Un tampón puede ser cualquier tampón, incluyendo pero no limitándose a tampón de carbonato de sodio, un tampón de bicarbonato de sodio, un tampón de borato, un tampón de Tris, un tampón de MOPS, un tampón de HEPES y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el tampón es alcalino. En algunas realizaciones, el tampón presenta un pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 10. En algunas realizaciones, el estuche comprende uno
o más oligonucleótidos correspondientes a una secuencia guía para inserción en un vector de manera que se una de manera operable a la secuencia guía y un elemento regulador. En algunas realizaciones, el estuche comprende un polinucleótido de plantilla de recombinación homólogo.
En un aspecto, la descripción proporciona métodos para usar uno o más elementos de un sistema CRISPR. El complejo CRISPR de la descripción proporciona un medio eficaz para modificar un polinucleótido objetivo. El complejo CRISPR de la descripción presenta una amplia variedad de utilidad incluyendo modificación (por ej., supresión, inserción, traslocación, inactivación, activación) de un polinucleótido objetivo en una multiplicidad de tipos de células. Como tal el complejo CRISPR de la descripción presenta un amplio espectro de aplicaciones en, por ej., tratamiento génico, investigación de fármacos, diagnóstico de enfermedades y prognosis. Un complejo CRISPR ejemplar comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia guía hibridada a una secuencia fijada como objetivo dentro del polinucleótido objetivo. La secuencia guía está ligada a una secuencia de emparejamiento tracr, que a su vez híbrida a una secuencia tracr.
El polinucleótido objetivo de un complejo CRISPR puede ser cualquier polinucleótido endógeno o exógeno a la célula eucariota. Por ejemplo, el polinucleótido objetivo puede ser un polinucleótido que resida en el núcleo de la célula eucariota. El polinucleótido objetivo puede ser una secuencia que codifique un producto génico (por ej., una proteína) o una secuencia no codificadora (por ej., un polinucleótido regulador o un ADN basura). Sin desear estar limitados por la teoría, se cree que la secuencia objetivo debería estar asociada a un PAM (unidad adyacente protoespaciadora); esto es, una secuencia corta reconocida por el complejo CRISPR. Los requerimientos de secuencia y longitud precisos para el PAM difieren dependiendo de la enzima CRISPR usada, pero los PAM son típicamente secuencias de 2-5 pares de bases adyacentes al protoespaciador (esto es, la secuencia objetivo) Ejemplos de secuencias PAM se proporcionan en la sección de ejemplos a continuación y el experto podrá identificar secuencias PAM adicionales para uso con una enzima CRISPR determinada.
El polinucleótido objetivo de un complejo CRISPR puede incluir una serie de genes y polinucleótidos asociados a
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enfermedades así como genes y polinucleótidos asociados a ruta bioquímica de señalización.
Ejemplos de polinucleótidos objetivo incluyen una secuencia asociada a una ruta bioquímica de señalización, por ej., un gen o polinucleótido asociado a una ruta bioquímica de señalización. Ejemplos de polinucleótidos objetivo incluyen un gen o polinucleótido asociado a una enfermedad. Un gen o polinucleótido "asociado a una enfermedad" 5 se refiere a cualquier gen o polinucleótido que esté proporcionando productos de transcripción o traducción en un nivel anormal o en una forma anormal en las células procedentes de tejidos afectados por una enfermedad comparado con tejidos o células de un control no de enfermedad. Puede ser un gen que llegue a expresarse a un nivel anormalmente alto; puede ser un gen que llegue a expresarse a un nivel anormalmente bajo, donde la expresión modificada se correlaciona con la aparición y/o progresión de la enfermedad. Un gen asociado a la
10 enfermedad también se refiere a un gen que posee mutación o mutaciones o variación genética que es directamente responsable o está ligada a desequilibrio con un gen, o genes, que es responsable de la etiología de una enfermedad. Los productos transcritos o traducidos pueden ser conocidos o desconocidos y puede ser a un nivel normal o anormal.
Ejemplos de genes y polinucleótidos asociados a una enfermedad están disponibles en Instituto McKusick-Nathans
15 de Medicina Genética, Universidad de Johns Hopkins (Baltimore, Md.) y Centro Nacional para Información de Biotecnología, Biblioteca Nacional de Medicina (Betesda, Md.), disponible en la Red Informática Mundial.
Ejemplos de genes y polinucleótidos asociados a una enfermedad se enumeran en las Tablas A y B. La información específica de la enfermedad está disponible en el Instituto McKusick-Nathans de Medicina Genética, Universidad de Johns Hopkins (Baltimore, Md.) y Centro Nacional para Información de Biotecnología, Biblioteca Nacional de
20 Medicina (Betesda, Md.), disponible en la Red Informática Mundial. Ejemplos de genes y polinucleótidos asociados a una ruta bioquímica de señalización se enumeran en la Tabla C.
Las mutaciones en estos genes y rutas pueden dar como resultado la producción de proteínas inapropiadas o proteínas en cantidades inapropiadas que afecten a la función. Tales genes, proteínas y rutas pueden ser el polinucleótido objetivo de un complejo CRISPR.
25 Tabla A
ENFERMEDAD/TRASTORNOS
GEN (ES)
Neoplasia
PTEN; ATM; ATR; EGFR; ERBB2; ERBB3; ERBB4;
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Notch1; Notch2; Notch3; Notch4; AKT; AKT2; AKT3; HIF;
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HIF1a; HIF3a; Met; HRG; Bcl2; PPAR alfa; PPAR
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gamma; WT1 (Tumor Wilms ); Familia Receptor FGF
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miembros (5 miembros: 1, 2, 3, 4, 5); CDKN2a; APC; RB
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(retinoblastoma); MEN1; VHL; BRCA1; BRCA2; AR
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(Receptor Andrógenos ); TSG101; IGF; Receptor IGF; Igf1 (4
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variantes); Igf2 (3 variantes); Receptor Igf 1; Receptor Igf 2;
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Bax; Bcl2; familia caspases (9 miembros:
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1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12); Kras; Apc
Degeneración
Abcr; Cc12; Cc2; cp (ceruloplasmina); Timp3; catepsina D;
Macular relacionada con la edad
Vldlr; Ccr2
Esquizofrenia
Neuregulina1 (Nrg1); Erb4 (receptor para Neuregulina);
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Complexina1 (Cplx1); Tph1 Triptófano hidroxilasa; Tph2
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Triptófano hidroxilasa 2; Neurexina 1; GSK3; GSK3a;
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GSK3b
Trastornos
5-HTT (Slc6a4); COMT; DRD (Drd1a); SLC6A3; DAOA;
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DTNBP1; Dao (Dao1)
Repetición del trinucleótido
HTT (Huntington's Dx); SBMA/SMAX1/AR (Kennedy's
Trastornos
Dx); FXN/X25 (Friedrich's Ataxia); ATX3 (Machado
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Joseph's Dx); ATXN1 y ATXN2 (ataxia
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ENFERMEDAD/TRASTORNOS
GEN (ES)
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espinocerebelar); DMPK (distrofia miotónica); Atrophin-1 y Atn1
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(DRPLA Dx); CBP (Creb-BP -inestabilidad global); VLDLR
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(Alzheimer's); Atxn7; Atxn10
Síndrome frágil X
FMR2; FXR1; FXR2; mGLUR5
Trastornos
APH-1 (alfa y beta); Presenilina (Psen1); nicastrina
Relacionados con la secretasa
(Ncstn); PEN-2
Otros
Nos1; Parp1; Nat1; Nat2
Trastornos relacionados con priones
Prp
ALS
SOD1; ALS2; STEX; FUS; TARDBP; VEGF (VEGF-a;
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VEGF-b; VEGF-c)
Drogadicción
Prkce (alcohol); Drd2; Drd4; ABAT (alcohol); GRIA2;
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Grm5; Grin1; Htr1b; Grin2a; Drd3; Pdyn; Gria1 (alcohol)
Autismo
Mecp2; BZRAP1; MDGA2; Sema5A; Neurexina 1; Frágil X
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(FMR2 (AFF2); FXR1; FXR2; Mglur5)
enfermedad de Alzheimer
E1; CHIP; UCH; UBB; Tau; LRP; PICALM.; Clusterina; PS1;
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SORL1; CR1; Vldlr; Uba1; Uba3; CHIP28 (Aqp1,
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Aquaporina 1); Uchl1; Uchl3; APP
Inflamación
IL-10; IL-1 (IL-1a; IL-1b); IL-13; IL-17 (IL-17a (CTLA8); IL
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17b; IL-17c; IL-17d; IL-17f); II-23; Cx3cr1; ptpn22; TNFa;
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NOD2/CARD15 para IBD; IL-6; IL-12 (IL-12a; IL-12b);
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CTLA4; Cx3cl1
enfermedad de Parkinson
x-Synuclein; DJ-1; LRRK2; Parkin; PINK1
Tabla B
Enfermedades y trastornos
Anemia (CDAN1, CDA1, RPS19, DBA, PKLR, PK1, NT5C3, BUMPH1, PSN1, RHAG,
de la sangre y la coagulación
RH50A, NRAMP2, SPTB, ALAS2, ANH1, ASB, ABCB7, ABC7, ASAT); síndrome de
linfocito desnudo (TAPBP, TPSN, TAP2, ABCB3, PSF2, RING11, MHC2TA, C2TA,
RFX5, RFXAP, RFX5), Trastornos de sangrado (TBXA2R, P2RX1, P2X1); Factor H y
factor H tipo -1 (HF1, CFH, HUS); Factor V y factor VIII (MCFD2); deficiencia de
Factor VII (F7); deficiencia de Factor X (F10); deficiencia de Factor XI (F11);
deficiencia de Factor XII (F12, HAF); deficiencia de Factor XIIIA (F13A1, F13A);
deficiencia de Factor XIIIB (F13B); anemia Fanconi (FANCA, FACA, FA1, FA, FAA,
FAAP95, FAAP90, FLJ34064, FANCB, FANCC, FACC, BRCA2, FANCD1, FANCD2,
FANCD, FACD, FAD, FANCE, FACE, FANCF, XRCC9, FANCG, BRIP1, BACH1,
FANCJ, PHF9, FANCL, FANCM, KIAA1596); trastornos Linfohistiocitosis
Hemofagocítica (PRF1, HPLH2, UNC13D, MUNC13-4, HPLH3, HLH3, FHL3);
Hemofilia A (F8, F8C, HEMA); Hemofilia B (F9, HEMB), trastornos hemorrágicos (PI,
ATT, F5); deficiencias y trastornos de leucocia (ITGB2, CD18, LCAMB, LAD, EIF2B1,
EIF2BA, EIF2B2, EIF2B3, EIF2B5, LVWM, CACH, CLE, EIF2B4); anemia
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depranocítica (HBB); Talasemia (HBA2, HBB, HBD, LCRB, HBA1).
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Desregulación celular y
Linfoma no de Hodgkin de células B (BCL7A, BCL7); Leucemia (TAL1, TCL5, SCL,
enfermedades y trastornos
TAL2, FLT3, NBS1, NBS, ZNFN1A1, IK1, LYF1, HOXD4, HOX4B, BCR, CML, PHL,
oncológicos
ALL, ARNT, KRAS2, RASK2, GMPS, AF10, ARHGEF12, LARG, KIAA0382, CALM,
CLTH, CEBPA, CEBP, CHIC2, BTL, FLT3, KIT, PBT, LPP, NPM1, NUP214, D9S46E,
CAN, CAIN, RUNX1, CBFA2, AML1, WHSC1L1, NSD3, FLT3, AF1Q, NPM1, NUMA1,
ZNF 145, PLZF, PML, MYL, STAT5B, AF 10, CALM, CLTH, ARL11, ARLTS1, P2RX7,
P2X7, BCR, CML, PHL, ALL, GRAF, NF1, VRNF, WSS, NFNS, PTPN11, PTP2C,
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SHP2, NS1, BCL2, CCND1, PRAD1, BCL1, TCRA, GATA1, GF1, ERYF1, NFE1,
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ABL1, NQO1, DIA4, NMOR1, NUP214, D9S46E, CAN, CAIN).
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Inflamación y enfermedades
AIDS (KIR3DL1, NKAT3, NKB1, AMB11, KIR3DS1, IFNG, CXCL12, SDF1); síndrome
y trastornos
linfoproliferativo autoinmunitario (TNFRSF6, APT1, FAS, CD95, ALPS1A);
inmunorelacionados
immunodeficiencia combinada, (IL2RG, SCIDX1, SCIDX, IMD4); HIV-1 (CCL5,
SCYA5, D17S136E, TCP228), susceptibilidad o infección por VIH (IL10, CSIF,
CMKBR2, CCR2, CMKBR5, CCCKR5 (CCR5)); Inmunodeficiencias (CD3E, CD3G,
AICDA, AID, HIGM2, TNFRSF5, CD40, UNG, DGU, HIGM4, TNFSF5, CD40LG,
HIGM1, IGM, FOXP3, IPEX, AIID, XPID, PIDX, TNFRSF14B, TACI); Inflamación (IL
10, IL-1 (IL-1a, IL-1b), IL-13, IL-17 (IL-17a (CTLA8), IL-17b, IL-17c, IL-17d, IL-17f), II
23, Cx3cr1, ptpn22, TNFa, NOD2/CARD15 for IBD, IL-6, IL-12 (IL-12a, IL-12b),
CTLA4, Cx3cl1); inmunodeficiencias combinadas severas (SCIDs)(JAK3, JAKL,
DCLRE1C, ARTEMIS, SCIDA, RAG1, RAG2, ADA, PTPRC, CD45, LCA, IL7R, CD3D,
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T3D, IL2RG, SCIDX1, SCIDX, IMD4).
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Enfermedades y trastornos
Neuropatía amiloide (TTR, PALB); Amiloidosis (APOA1, APP, AAA, CVAP, AD1,
metabólicos, hepáticos,
GSN, FGA, LYZ, TTR, PALB); Cirrosis (KRT18, KRT8, C1RH1A, NAIC, TEX292,
renales y proteínicos
K1AA1988); fibrosis quística (CFTR, ABCC7, CF, MRP7); enfermedades de
almacenamiento de glucógeno (SLC2A2, GLUT2, G6PC, G6PT, G6PT1, GAA,
LAMP2, LAMPB, AGL, GDE, GBE1, GYS2, PYGL, PFKM); adenoma hepático,
142330 (TCF1, HNF1A, MODY3), fallo hepático, comienzo temprano y trastorno
neurológico (SCOD1, SCO1), deficiencia de lipasa hepática(LIPC), Hepatoblastoma,
cáncer y carcinomas (CTNNB1, PDGFRL, PDGRL, PRLTS, AXIN1, AXIN, CTNNB1,
TP53, P53, LFS1, IGF2R, MPRI, MET, CASP8, MCH5; enfermedad del riñón quístico
medular (UMOD, HNFJ, FJHN, MCKD2, ADMCKD2); Fenilcetonuria (PAH, PKU1,
QDPR, DHPR, PTS); enfermedad renal y hepática poliquística (FCYT, PKHD1,
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ARPKD, PKD 1, PKD2, PKD4, PKDTS, PRKCSH, G19P1, PCLD, SEC63).
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enfermedades y trastornos
Distrofia muscular de Becker (DMD, BMD, MYF6), Distrofia muscular de Duchenne
musculares / del esqueleto
(DMD, BMD); Distrofia muscular de Emery-Dreifuss (LMNA, LMN1, EMD2, FPLD,
CMD1A, HGPS, LGMD1B, LMNA, LMN1, EMD2, FPLD, CMD1A); Distrofia muscular
de Facioscapulohumeral (FSHMD1A, FSHD1A); Distrofia muscular (FKRP, MDC1C,
LGMD2I, LAMA2, LAMM, LARGE, KIAA0609, MDC1D, FCMD, TTID, MYOT, CAPN3,
CANP3, DYSF, LGMD2B, SGCG, LGMD2C, DMDA1, SCG3, SGCA, ADL, DAG2,
LGMD2D, DMDA2, SGCB, LGMD2E, SGCD, SGD, LGMD2F, CMD1L, TCAP,
LGMD2G, CMD1N, TRIM32, HT2A, LGMD2H, FKRP, MDC1C, LGMD21, TTN,
CMD1G, TMD, LGMD2J, POMT1, CAV3, LGMD1C, SEPN1, SELN, RSMD1, PLEC1,
PLTN, EBS1); Osteopetrosis (LRP5, BMND1, LRP7, LR3, OPPG, VBCH2, CLCN7,
CLC7, OPTA2, OSTM1, GL, TCIRG1, TIRC7, OC116, OPTB1); Atrofia muscular
(VAPB, VAPC, ALS8, SMN1, SMA1, SMA2, SMA3, SMA4, BSCL2, SPG17, GARS,
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SMAD1, CMT2D, HEXB, IGHMBP2, SMUBP2, CATF1, SMARD1).
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enfermedades y trastornos
ALS (SOD1, ALS2, STEX, FUS, TARDBP, VEGF (VEGF-a, VEGF-b, VEGF-c);
neurológicos y neuronales
enfermedad de Alzheimer (APP, AAA, CVAP, AD1, APOE, AD2, PSEN2, AD4, STM2, APBB2, FE65L1, NOS3, PLAU, URK, ACE, DCP1, ACE1, MPO, PACIP1, PAXIP1L, PTIP, A2M, BLMH, BMH, PSEN1, AD3); Autismo (Mecp2, BZRAP1, MDGA2, Sema5A, Neurexina 1, GLO1, MECP2, RTT, PPMX, MRX16, MRX79, NLGN3, NLGN4, KIAA1260, AUTSX2); Síndrome frágil X (FMR2, FXR1, FXR2, mGLUR5); enfermedad de Huntington y trastornos tipo enfermedad (HD, IT15, PRNP, PRIP, JPH3, JP3, HDL2, TBP, SCA17); enfermedad de Parkinson (NR4A2, NURR1, NOT, TINUR, SNCAIP, TBP, SCA17, SNCA, NACP, PARK1, PARK4, DJ1, PARK7, LRRK2, PARK8, PINK1, PARK6, UCHL1, PARK5, SNCA, NACP, PARK1, PARK4, PRKN, PARK2, PDJ, DBH, NDUFV2); síndrome de Rett (MECP2, RTT, PPMX, MRX16, MRX79, CDKL5, STK9, MECP2, RTT, PPMX, MRX16, MRX79, x-Synuclein, DJ-1); Esquizofrenia (Neuregulin1 (Nrg1), Erb4 (receptor de Neuregulin), Complexin1 (Cplx1), Tph1 Triptófano hidroxilasa, Tph2, Triptófano hidroxilasa 2, Neurexina 1, GSK3, GSK3a, GSK3b, 5-HTT (Slc6a4), COMT, DRD (Drd1a), SLC6A3, DAOA, DTNBP1, Dao (Dao1)); Trastornos Relacionados con la secretasa (APH-1 (alfa y beta), Presenilin (Psen1), nicastrin, (Ncstn), PEN-2, Nos1, Parp1, Nat1, Nat2); Trastornos Repetición del trinucleótido (HTT (Huntington's Dx), SBMA/SMAX1/AR (Kennedy's Dx), FXN/X25 (Ataxia de Friedrich), ATX3 (Machado-Joseph's Dx), ATXN1 y ATXN2 (ataxias espinocerebelares), DMPK (distrofia miotónica), Atrofina-1 y Atn1 (DRPLA Dx), CBP (Creb-BP -inestabilidad global), VLDLR (Alzheimer's), Atxn7, Atxn10).
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enfermedades y trastornos oculares
degeneración macular relacionada con la edad (Abcr, Ccl2, Cc2, cp (ceruloplasmina), Timp3, catepsinaD, Vldlr, Ccr2); Catarata (CRYAA, CRYA1, CRYBB2, CRYB2, PITX3, BFSP2, CP49, CP47, CRYAA, CRYA1, PAX6, AN2, MGDA, CRYBA1, CRYB1, CRYGC, CRYG3, CCL, LIM2, MP19, CRYGD, CRYG4, BFSP2, CP49, CP47, HSF4, CTM, HSF4, CTM, MIP, AQP0, CRYAB, CRYA2, CTPP2, CRYBB1, CRYGD, CRYG4, CRYBB2, CRYB2, CRYGC, CRYG3, CCL, CRYAA, CRYA1, GJA8, CX50, CAE1, GJA3, CX46, CZP3, CAE3, CCM1, CAM, KRIT1); distrofia y turbidez de la córnea (APOA1, TGFBI, CSD2, CDGG1, CSD, BIGH3, CDG2, TACSTD2, TROP2, M1S1, VSX1, RINX, PPCD, PPD, KTCN, COL8A2, FECD, PPCD2, PIP5K3, CFD); Cornea plana congénita (KERA, CNA2); Glaucoma (MYOC, TIGR, GLC1A, JOAG, GPOA, OPTN, GLC1E, FIP2, HYPL, NRP, CYP1B1, GLC3A, OPA1, NTG, NPG, CYP1B1, GLC3A); amaurosis congénita de Leber (CRB1, RP12, CRX, CORD2, CRD, RPGRIP1, LCA6, CORD9, RPE65, RP20, AIPL1, LCA4, GUCY2D, GUC2D, LCA1, CORD6, RDH12, LCA3); distrofia macular (ELOVL4, ADMD, STGD2, STGD3, RDS, RP7, PRPH2, PRPH, AVMD, AOFMD, VMD2).
Tabla C
FUNCIÓN CELULAR
GENES
Señalización PI3K/AKT
PRKCE; ITGAM; ITGA5; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2;
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PTEN; EIF4E; PRKCZ; GRK6; MAPK1; TSC1; PLK1;
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AKT2; IKBKB; PIK3CA; CDK8; CDKN1B; NFKB2; BCL2;
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PIK3CB; PPP2R1A; MAPK8; BCL2L1; MAPK3; TSC2;
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ITGA1; KRAS; EIF4EBP1; RELA; PRKCD; NOS3;
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PRKAA1; MAPK9; CDK2; PPP2CA; PIM1; ITGB7;
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YWHAZ; ILK; TP53; RAF1; IKBKG; RELB; DYRK1A;
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CDKN1A; ITGB1; MAP2K2; JAK1; AKT1; JAK2; PIK3R1;
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CHUK; PDPK1; PPP2R5C; CTNNB1; MAP2K1; NFKB1;
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PAK3; ITGB3; CCND1; GSK3A; FRAP1; SFN; ITGA2;
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TTK; CSNK1A1; BRAF; GSK3B; AKT3; FOXO1; SGK;
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HSP90AA1; RPS6KB1
Señalización ERK/MAPK
PRKCE; ITGAM; ITGA5; HSPB1; IRAK1; PRKAA2;
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EIF2AK2; RAC1; RAP1A; TLN1; EIF4E; ELK1; GRK6;
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MAPK1; RAC2; PLK1; AKT2; PIK3CA; CDK8; CREB1;
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PRKCI; PTK2; FOS; RPS6KA4; PIK3CB; PPP2R1A;
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PIK3C3; MAPK8; MAPK3; ITGA1; ETS1; KRAS; MYCN;
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EIF4EBP1; PPARG; PRKCD; PRKCA1; MAPK9; SRC;
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CDK2; PPP2CA; PIM1; PIK3C2A; ITGB7; YWHAZ;
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PPP1CC; KSR1; PXN; RAF1; FYN; DYRK1A; ITGB1;
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MAP2K2; PAK4; PIK3R1; STAT3; PPP2R5C; MAP2K1;
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PAK3; ITGB3; ESR1; ITGA2; MYC; TTK; CSNK1A1;
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CRKL; BRAF; ATF4; PRKCA; SRF; STAT1; SGK
Señalización
RAC1; TAF4B; EP300; SMAD2; TRAF6; PCAF; ELK1;
Receptor Glucocorticoide
MAPK1; SMAD3; AKT2; IKBKB; NCOR2; UBE2I;
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PIK3CA; CREB1; FOS; HSPA5; NFKB2; BCL2;
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MAP3K14; STAT5B; PIK3CB; PIK3C3; MAPKB; BCL2L1;
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MAPK3; TSC22D3; MAPK10; NRIP1; KRAS; MAPK13;
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FUNCIÓN CELULAR
GENES
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RELA; STAT5A; MAPK9; NOS2A; PBX1; NR3C1;
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PIK3C2A; CDKN1C; TRAF2; SERPINE1; NCOA3;
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MAPK14; TNF; RAF1; IKBKG; MAP3K7; CREBBP;
imagen87
CDKN1A; MAP2K2; JAK1; IL8; NCOA2; AKT1; JAK2;
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PIK3R1; CHUK; STAT3; MAP2K1; NFKB1; TGFBR1;
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ESR1; SMAD4; CEBPB; JUN; AR; AKT3; CCL2; MMP1; STAT1; IL6; HSP90AA1
Señalización Guía Axonal
PRKCE; ITGAM; ROCK1; ITGA5; CXCR4; ADAM12;
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IGF1; RAC1; RAP1A; EIF4E; PRKCZ; NRP1; NTRK2;
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ARHGEF7; SMO; ROCK2; MAPK1; PGF; RAC2;
imagen92
PTPN11; GNAS; AKT2; PIK3CA; ERBB2; PRKCI; PTK2;
imagen93
CFL1; GNAQ; PIK3CB; CXCL 12; PIK3C3; WNT11;
imagen94
PRKD1; GNB2L1; ABL1; MAPK3; ITGA1; KRAS; RHOA;
imagen95
PRKCD; PIK3C2A; ITGB7; GLI2; PXN; VASP; RAF1;
imagen96
FYN; ITGB1; MAP2K2; PAK4; ADAM17; AKT1; PIK3R1;
imagen97
GLI1; WNT5A; ADAM10; MAP2K1; PAK3; ITGB3;
imagen98
CDC42; VEGFA; ITGA2; EPHA8; CRKL; RND1; GSK3B;
imagen99
AKT3; PRKCA
Señalización Receptor Ephrin
PRKCE; ITGAM; ROCK1; ITGA5; CXCR4; IRAK1;
imagen100
PRKAA2; EIF2AK2; RAC I; RAP1A; GRK6; ROCK2;
imagen101
MAPK1; PGF; RAC2; PTPN11; GNAS; PLK1; AKT2;
imagen102
DOK1; CDK8; CREB1; PTK2; CFL1; GNAQ; MAP3K14;
imagen103
CXCL12; MAPK8; GNB2L1; ABL1; MAPK3; ITGA1;
imagen104
KRAS; RHOA; PRKCD; PRKAA1; MAPK9; SRC; CDK2;
imagen105
PIM1; ITGB7; PXN; RAF1; FYN; DYRK1A; ITGB1;
imagen106
MAP2K2; PAK4; AKT1; JAK2; STAT3; ADAM10;
imagen107
MAP2K1; PAK3; ITGB3; CDC42; VEGFA; ITGA2;
imagen108
EPHA8; TTK; CSNK1A1; CRKL; BRAF; PTPN13; ATF4;
imagen109
AKT3; SGK
Señalización
ACTN4; PRKCE; ITGAM; ROCK1; ITGA5; IRAK1;
cictoesqueleto de actina
PRKAA2; EIF2AK2; RAC1; INS; ARHGEF7; GRK6;
imagen110
ROCK2; MAPK1; RAC2; PLK1; AKT2; PIK3CA; CDK8;
imagen111
PTK2; CFL1; PIK3CB; MYH9; DIAPH1; PIK3C3; MAPK8;
imagen112
F2R; MAPK3; SLC9A1; ITGA1; KRAS; RHOA; PRKCD;
imagen113
PRKAA1; MAPK9; CDK2; PIM1; PIK3C2A; ITGB7;
imagen114
PPP1CC; PXN; VIL2; RAF1; GSN; DYRK1A; ITGB1;
imagen115
MAP2K2; PAK4; PIP5K1A; PIK3R1; MAP2K1; PAK3;
imagen116
ITGB3; CDC42; APC; ITGA2; TTK; CSNK1A1; CRKL;
imagen117
BRAF; VAV3; SGK
Señalización
PRKCE; IGF1; EP300; RCOR1; PRKCZ; HDAC4; TGM2;
enfermedad de Huntington
MAPK1; CAPNS1; AKT2; EGFR; NCOR2; SP1; CAPN2;
imagen118
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen119
PIK3CA; HDAC5; CREB1; PRKCI; HSPA5; REST;
imagen120
GNAQ; PIK3CB; PIK3C3; MAPKB; IGF1R; PRKD1;
imagen121
GNB2L1; BCL2L1; CAPN1; MAPK3; CASP8; HDAC2;
imagen122
HDAC7A; PRKCD; HDAC11; MAPK9; HDAC9; PIK3C2A;
imagen123
HDAC3; TP53; CASP9; CREBBP; AKT1; PIK3R1;
imagen124
PDPK1; CASP1; APAF1; FRAP1; CASP2; JUN; BAX;
imagen125
ATF4; AKT3; PRKCA; CLTC; SGK; HDAC6; CASP3
Señalización de muerte celular programada
PRKCE; ROCK1; BID; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2; BAK1;
imagen126
BIRC4; GRK6; MAPK1; CAPNS1; PLK1; AKT2; IKBKB;
imagen127
CAPN2; CDK8; FAS; NFKB2; BCL2; MAP3K14; MAPK8;
imagen128
BCL2L1; CAPN1; MAPK3; CASP8; KRAS; RELA;
imagen129
PRKCD; PRKAA1; MAPK9; CDK2; PIM1; TP53; TNF;
imagen130
RAF1; IKBKG; RELB; CASP9; DYRK1A; MAP2K2;
imagen131
CHUK; APAF1; MAP2K1; NFKB1; PAK3; LMNA; CASP2;
imagen132
BIRC2; TTK; CSNK1A1; BRAF; BAX; PRKCA; SGK;
imagen133
CASP3; BIRC3; PARP1
Señalización de Receptor de células B
RAC1; PTEN; LYN; ELK1; MAPK1; RAC2; PTPN11;
imagen134
AKT2; IKBKB; PIK3CA; CREB1; SYK; NFKB2; CAMK2A;
imagen135
MAP3K14; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; BCL2L1; ABL1;
imagen136
MAPK3; ETS1; KRAS; MAPK13; RELA; PTPN6; MAPK9;
imagen137
EGRI; PIK3C2A; BTK; MAPK14; RAF1; IKBKG; RELB;
imagen138
MAP3K7; MAP2K2; AKT1; PIK3R1; CHUK; MAP2K1;
imagen139
NFKB1; CDC42; GSK3A; FRAP1; BCL6; BCL10; JUN;
imagen140
GSK3B; ATF4; AKT3; VAV3; RPS6KB1
Señalización de diapédesis
ACTN4; CD44; PRKCE; ITGAM; ROCK1; CXCR4; CYBA;
imagen141
RAC1; RAP1A; PRKCZ; ROCK2; RAC2; PTPN11;
imagen142
MMP14; PIK3CA; PRKCI; PTK2; PIK3CB; CXCL12;
imagen143
PIK3C3; MAPK8; PRKD1; ABL1; MAPK10; CYBB;
imagen144
MAPK13; RHOA; PRKCD; MAPK9; SRC; PIK3C2A; BTK;
imagen145
MAPK14; NOX1; PXN; VIL2; VASP; TTGB1; MAP2K2;
imagen146
CTNND1; PIK3R1; CTNNB1; CLDN1; CDC42; F11R; ITK;
imagen147
CRKL; VAV3; CTTN; PRKCA; MMP1; MMP9
Señalización de Integrina
ACTN4; ITGAM; ROCK1; ITGA5; RAC1; PTEN; RAP1A;
imagen148
TLN1; ARHGEF7; MAPK1; RAC2; CAPNS1; AKT2;
imagen149
CAPN2; PIK3CA; PTK2; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;
imagen150
CAV1; CAPN1; ABL1; MAPK3; ITGA1; KRAS; RHOA;
imagen151
SRC; PIK3C2A; ITGB7; PPP1CC; ILK; PXN; VASP;
imagen152
RAF1; FYN; ITGB1; MAP2K2; PAK4; AKT1; PIK3R1;
imagen153
TNK2; MAP2K1; PAK3; ITGB3; CDC42; RND3; ITGA2;
imagen154
CRKL; BRAF; GSK3B; AKT3
imagen155
FUNCIÓN CELULAR
GENES
Señalización
IRAK1; SOD2; MYD88; TRAF6; ELK1; MAPK1; PTPN11;
de Respuesta de fase aguda
AKT2; IKBKB; PIK3CA; FOS; NFKB2; MAP3K14;
imagen156
PIK3CB; MAPK8; RIPK1; MAPK3; IL6ST; KRAS;
imagen157
MAPK13; IL6R; RELA; SOCS1; MAPK9; FTL; NR3C1;
imagen158
TRAF2; SERPINE1; MAPK14; TNF; RAF1; PDK1;
imagen159
IKBKG; RELB; MAP3K7; MAP2K2; AKT1; JAK2; PIK3R1;
imagen160
CHUK; STAT3; MAP2K1; NFKB1; FRAP1; CEBPB; JUN;
imagen161
AKT3; IL1R1; IL6
Señalización de PTEN
ITGAM; ITGA5; RAC1; PTEN; PRKCZ; BCL2L 11;
imagen162
MAPK1; RAC2; AKT2; EGFR; IKBKB; CBL; PIK3CA;
imagen163
CDKN1B; PTK2; NFKB2; BCL2; PIK3CB; BCL2L1;
imagen164
MAPK3; ITGA1; KRAS; ITGB7; ILK; PDGFRB; INSR;
imagen165
RAF1; IKBKG; CASP9; CDKN1A; ITGB1; MAP2K2;
imagen166
AKT1; PIK3R1; CHUK; PDGFRA; PDPK1; MAP2K1;
imagen167
NFKB1; ITGB3; CDC42; CCND1; GSK3A; ITGA2;
imagen168
GSK3B; AKT3; FOXO1; CASP3; RPS6KB1
Señalización de p53
PTEN; EP300; BBC3; PCAF; FASN; BRCA1; GADD45A;
imagen169
BIRC5; AKT2; PIK3CA; CHEK1; TP53INP1; BCL2;
imagen170
PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; THBS1; ATR; BCL2L1; E2F1;
imagen171
PMAIP1; CHEK2; TNFRSF10B; TP73; RB1; HDAC9;
imagen172
CDK2; PIK3C2A; MAPK14; TP53; LRDD; CDKN1A;
imagen173
HIPK2; AKT1; PIK3R1; RRM2B; APAF1; CTNNB1;
imagen174
SIRT1; CCND1; PRKDC; ATM; SFN; CDKN2A; JUN;
imagen175
SNAI2; GSK3B; BAX; AKT3
Señalización
HSPB1; EP300; FASN; TGM2; RXRA; MAPK1; NQO1;
de Receptor Arilhidrocarbonado
NCOR2; SP1; ARNT; CDKN1B; FOS; CHEK1;
imagen176
SMARCA4; NFKB2; MAPK8; ALDH1A1; ATR; E2F1;
imagen177
MAPK3; NRIP1; CHEK2; RELA; TP73; GSTP1; RB1;
imagen178
SRC; CDK2; AHR; NFE2L2; NCOA3; TP53; TNF;
imagen179
CDKN I A; NCOA2; APAF1; NFKB1; CCND1; ATM; ESR1;
imagen180
CDKN2A; MYC; JUN; ESR2; BAX; IL6; CYP1B1;
imagen181
HSP90AA1
Señalización de
PRKCE; EP300; PRKCZ; RXRA; MAPK1; NQO1;
Metabolismo Xenobiótico
NCOR2; PIK3CA; ARNT; PRKCI; NFKB2; CAMK2A;
imagen182
PIK3CB; PPP2R1A; PIK3C3; MAPK8; PRKD1;
imagen183
ALDH1A1; MAPK3; NRIP1; KRAS; MAPK13; PRKCD;
imagen184
GSTP1; MAPK9; NOS2A; ABCB1; AHR; PPP2CA; FTL;
imagen185
NFE2L2; PIK3C2A; PPARGC1A; MAPK14; TNF; RAF1;
imagen186
CREBBP; MAP2K2; PIK3R1; PPP2R5C; MAP2K1;
imagen187
NFKB1; KEAP1; PRKCA; EIF2AK3; IL6; CYP1B1;
imagen188
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen189
HSP90AA1
Señalización de SAPK/JNK
PRKCE; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2; RAC I ; ELK1;
imagen190
GRK6; MAPK1; GADD45A; RAC2; PLK1; AKT2; PIK3CA;
imagen191
FADD; CDK8; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; R1PK1;
imagen192
GNB2L1; IRS1; MAPK3; MAPK10; DAXX; KRAS;
imagen193
PRKCD; PRKAA1; MAPK9; CDK2; PIM1; PIK3C2A;
imagen194
TRAF2; TP53; LCK; MAP3K7; DYRK1A; MAP2K2;
imagen195
PIK3R1; MAP2K1; PAK3; CDC42; JUN; TTK; CSNK1A1;
imagen196
CRKL; BRAF; SGK
Señalización de PPAr/RXR
PRKAA2; EP300; INS; SMAD2; TRAF6; PPARA; FASN;
imagen197
RXRA; MAPK1; SMAD3; GNAS; IKBKB; NCOR2;
imagen198
ABCA1; GNAQ; NFKB2; MAP3K14; STAT5B; MAPK8;
imagen199
IRS1; MAPK3; KRAS; RELA; PRKAA1; PPARGC1A;
imagen200
NCOA3; MAPK14; INSR; RAF1; IKBKG; RELB; MAP3K7;
imagen201
CREBBP; MAP2K2; JAK2; CHUK; MAP2K1; NFKB 1;
imagen202
TGFBR1; SMAD4; JUN; IL1R1; PRKCA; IL6; HSP90AA1; ADIPOQ
Señalización de NF-KB
IRAK1; EIF2AK2; EP300; INS; MYD88; PRKCZ; TRAF6;
imagen203
TBK1; AKT2; EGFR; IKBKB; PIK3CA; BTRC; NFKB2;
imagen204
MAP3K14; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; RIPK1; HDAC2;
imagen205
KRAS; RELA; PIK3C2A; TRAF2; TLR4; PDGFRB; TNF;
imagen206
INSR; LCK; IKBKG; RELB; MAP3K7; CREBBP; AKT1;
imagen207
PIK3R1; CHUK; PDGFRA; NFKB1; TLR2; BCL10;
imagen208
GSK3B; AKT3; TNFAIP3; IL1R1
Señalización de Neuregulina
ERBB4; PRKCE; ITGAM; ITGA5; PTEN; PRKCZ; ELK1;
imagen209
MAPK1; PTPN11; AKT2; EGFR; ERBB2; PRKCI;
imagen210
CDKN1B; STAT5B; PRKD1; MAPK3; ITGA1; KRAS;
imagen211
PRKCD; STAT5A; SRC; ITGB7; RAF1; ITGB1; MAP2K2;
imagen212
ADAM17; AKT1; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1; ITGB3;
imagen213
EREG; FRAP1; PSEN1; ITGA2; MYC; NRG1; CRKL;
imagen214
AKT3; PRKCA; HSP90AA1; RPS6KB1
Señalización de
CD44; EP300; LRP6; DVL3; CSNK1E; GJA1; SMO;
catenina Wnt y Beta
AKT2; PIN1; CDH1; BTRC; GNAQ; MARK2; PPP2R1A;
imagen215
WNT11; SRC; DKK1; PPP2CA; SOX6; SFRP2; ILK;
imagen216
LEF1; SOX9; TP53; MAP3K7; CREBBP; TCF7L2; AKT1;
imagen217
PPP2R5C; WNT5A; LRP5; CTNNB1; TGFBR1; CCND1;
imagen218
GSK3A; DVL1; APC; CDKN2A; MYC; CSNK1A1; GSK3B;
imagen219
AKT3; SOX2
Señalización de Receptor de Insulina
PTEN; INS; EIF4E; PTPN1; PRKCZ; MAPK1; TSC1;
imagen220
PTPN11; AKT2; CBL; PIK3CA; PRKCI; PIK3CB; PIK3C3;
imagen221
MAPK8; IRS1; MAPK3; TSC2; KRAS; EIF4EBP1;
imagen222
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen223
SLC2A4; PIK3C2A; PPP1CC; INSR; RAF1; FYN;
imagen224
MAP2K2; JAK1; AKT1; JAK2; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1;
imagen225
GSK3A; FRAP1; CRKL; GSK3B; AKT3; FOXO1; SGK;
imagen226
RPS6KB1
Señalización de IL-6
HSPB1; TRAF6; MAPKAPK2; ELK1; MAPK1; PTPN11;
imagen227
IKBKB; FOS; NFKB2; MAP3K14; MAPK8; MAPK3;
imagen228
MAPK10; IL6ST; KRAS; MAPK13; IL6R; RELA; SOCS1;
imagen229
MAPK9; ABCB1; TRAF2; MAPK14; TNF; RAF1; IKBKG;
imagen230
RELB; MAP3K7; MAP2K2; IL8; JAK2; CHUK; STAT3;
imagen231
MAP2K1; NFKB1; CEBPB; JUN; IL1R1; SRF; IL6
Colestasis Hepática
PRKCE; IRAK1; INS; MYD88; PRKCZ; TRAF6; PPARA;
imagen232
RXRA; IKBKB; PRKCI; NFKB2; MAP3K14; MAPK8;
imagen233
PRKD1; MAPK10; RELA; PRKCD; MAPK9; ABCB1;
imagen234
TRAF2; TLR4; TNF; INSR; IKBKG; RELB; MAP3K7; IL8;
imagen235
CHUK; NR1H2; TJP2; NFKB1; ESR1; SREBF1; FGFR4;
imagen236
JUN; IL1R1; PRKCA; IL6
Señalización de IGF-1
IGF 1; PRKCZ; ELK1; MAPK1; PTPN11; NEDD4; AKT2;
imagen237
PIK3CA; PRKCI; PTK2; FOS; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;
imagen238
IGF1R; IRS1; MAPK3; IGFBP7; KRAS; PIK3C2A;
imagen239
YWHAZ; PXN; RAF1; CASP9; MAP2K2; AKT1; PIK3R1;
imagen240
PDPK1; MAP2K1; IGFBP2; SFN; JUN; CYR61; AKT3;
imagen241
FOXO1; SRF; CTGF; RPS6KB1
Respuesta de Estrés
PRKCE; EP300; SOD2; PRKCZ; MAPK1; SQSTM1;
Oxidativo mediado por NRF2
NQO1; PIK3CA; PRKCI; FOS; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;
imagen242
PRKD1; MAPK3; KRAS; PRKCD; GSTP1; MAPK9; FTL;
imagen243
NFE2L2; PIK3C2A; MAPK14; RAF1; MAP3K7; CREBBP;
imagen244
MAP2K2; AKT1; PIK3R1; MAP2K1; PPIB; JUN; KEAP1;
imagen245
GSK3B; ATF4; PRKCA; EIF2AK3; HSP90AA1
Fibrosis Hepática /
EDN1; 1GF1; KDR; FLT1; SMAD2; FGFR1; MET; PGF;
Activación de células estelares hepáticas
SMAD3; EGFR; FAS; CSF1; NFKB2; BCL2; MYH9;
imagen246
IGF1R; IL6R; RELA; TLR4; PDGFRB; TNF; RELB; IL8;
imagen247
PDGFRA; NFKB1; TGFBR1; SMAD4; VEGFA; BAX;
imagen248
IL1R1; CCL2; HGF; MMP1; STAT1; IL6; CTGF; MMP9
Señalización de PPAR
EP300; INS; TRAF6; PPARA; RXRA; MAPK1; IKBKB;
imagen249
NCOR2; FOS; NFKB2; MAP3K14; STAT5B; MAPK3;
imagen250
NRIP1; KRAS; PPARG; RELA; STAT5A; TRAF2;
imagen251
PPARGC1A; PDGFRB; TNF; INSR; RAF1; IKBKG;
imagen252
RELB; MAP3K7; CREBBP; MAP2K2; CHUK; PDGFRA;
imagen253
MAP2K1; NFKB1; JUN; IL1R1; HSP90AA1
Señalización de Fc Epsilon RI
PRKCE; RAC1; PRKCZ; LYN; MAPK1; RAC2; PTPN11;
imagen254
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen255
AKT2; PIK3CA; SYK; PRKCI; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;
imagen256
PRKD1; MAPK3; MAPK10; KRAS; MAPK13; PRKCD;
imagen257
MAPK9; PIK3C2A; BTK; MAPK14; TNF; RAF1; FYN;
imagen258
MAP2K2; AKT1; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1; AKT3;
imagen259
VAV3; PRKCA
Señalización de Receptor
PRKCE; RAP1A; RGS16; MAPK1; GNAS; AKT2; IKBKB;
Acoplado a proteína G
PIK3CA; CREB1; GNAQ; NFKB2; CAMK2A; PIK3CB;
imagen260
PIK3C3; MAPK3; KRAS; RELA; SRC; PIK3C2A; RAF1;
imagen261
IKBKG; RELB; FYN; MAP2K2; AKT1; PIK3R1; CHUK;
imagen262
PDPK1; STAT3; MAP2K1; NFKB1; BRAF; ATF4; AKT3;
imagen263
PRKCA
Metabolismo de
PRKCE; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2; PTEN; GRK6;
Inositol fosfato
MAPK1; PLK1; AKT2; PIK3CA; CDK8; PIK3CB; PIK3C3;
imagen264
MAPK8; MAPK3; PRKCD; PRKAA1; MAPK9; CDK2;
imagen265
PIM1; PIK3C2A; DYRK1A; MAP2K2; PIP5K1A; PIK3R1;
imagen266
MAP2K1; PAK3; ATM; TTK; CSNK1A1; BRAF; SGK
Señalización de PDGF
EIF2AK2; ELK1; ABL2; MAPK1; PIK3CA; FOS; PIK3CB;
imagen267
PIK3C3; MAPK8; CAV1; ABL1; MAPK3; KRAS; SRC;
imagen268
PIK3C2A; PDGFRB; RAF1; MAP2K2; JAK1; JAK2;
imagen269
PIK3R1; PDGFRA; STAT3; SPHK1; MAP2K1; MYC;
imagen270
JUN; CRKL; PRKCA; SRF; STAT1; SPHK2
Señalización de VEGF
ACTN4; ROCK1; KDR; FLT1; ROCK2; MAPK1; PGF;
imagen271
AKT2; PIK3CA; ARNT; PTK2; BCL2; PIK3CB; PIK3C3;
imagen272
BCL2L1; MAPK3; KRAS; HIF1A; NOS3; PIK3C2A; PXN;
imagen273
RAF1; MAP2K2; ELAVL1; AKT1; PIK3R1; MAP2K1; SFN;
imagen274
VEGFA; AKT3; FOXO1; PRKCA
Señalización de células
PRKCE; RAC1; PRKCZ; MAPK1; RAC2; PTPN11;
aniquilantes naturales
KIR2DL3; AKT2; PIK3CA; SYK; PRKCI; PIK3CB;
imagen275
PIK3C3; PRKD1; MAPK3; KRAS; PRKCD; PTPN6;
imagen276
PIK3C2A; LCK; RAF1; FYN; MAP2K2; PAK4; AKT1;
imagen277
PIK3R1; MAP2K1; PAK3; AKT3; VAV3; PRKCA
Ciclo celular: G1/S
HDAC4; SMAD3; SUV39H1; HDAC5; CDKN1B; BTRC;
Regulación de control
ATR; ABL1; E2F1; HDAC2; HDAC7A; RB1; HDAC11;
imagen278
HDAC9; CDK2; E2F2; HDAC3; TP53; CDKN1A; CCND1;
imagen279
E2F4; ATM; RBL2; SMAD4; CDKN2A; MYC; NRG1;
imagen280
GSK3B; RBL1; HDAC6
Señalización de Receptor de células T
RAC1; ELK1; MAPK1; IKBKB; CBL; PIK3CA; FOS;
imagen281
NFKB2; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; MAPK3; KRAS;
imagen282
RELA; PIK3C2A; BTK; LCK; RAF1; IKBKG; RELB; FYN;
imagen283
MAP2K2; PIK3R1; CHUK; MAP2K1; NFKB1; ITK; BCL10;
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen284
JUN; VAV3
Señalización de Receptor de la muerte
CRADD; HSPB1; BID; BIRC4; TBK1; IKBKB; FADD;
imagen285
FAS; NFKB2; BCL2; MAP3K14; MAPK8; RIPK1; CASP8;
imagen286
DAXX; TNFRSF10B; RELA; TRAF2; TNF; IKBKG; RELB;
imagen287
CASP9; CHUK; APAF1; NFKB1; CASP2; BIRC2; CASP3;
imagen288
BIRC3
Señalización de FGF
RAC1; FGFR1; MET; MAPKAPK2; MAPK1; PTPN11;
imagen289
AKT2; PIK3CA; CREB1; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;
imagen290
MAPK3; MAPK13; PTPN6; PIK3C2A; MAPK14; RAF1;
imagen291
AKT1; PIK3R1; STAT3; MAP2K1; FGFR4; CRKL; ATF4;
imagen292
AKT3; PRKCA; HGF
Señalización de GM-CSF
LYN; ELK1; MAPK1; PTPN11; AKT2; PIK3CA; CAMK2A;
imagen293
STAT5B; PIK3CB; PIK3C3; GNB2L1; BCL2L1; MAPK3;
imagen294
ETS1; KRAS; RUNX1; PIM1; PIK3C2A; RAF1; MAP2K2;
imagen295
AKT1; JAK2; PIK3R1; STAT3; MAP2K1; CCND1; AKT3;
imagen296
STAT1
Señalización de esclerosis
BID; IGF1; RAC1; BIRC4; PGF; CAPNS1; CAPN2;
lateral amiotrófica
PIK3CA; BCL2; PIK3CB; PIK3C3; BCL2L1; CAPN1;
imagen297
PIK3C2A; TP53; CASP9; PIK3R1; RAB5A; CASP1;
imagen298
APAF1; VEGFA; BIRC2; BAX; AKT3; CASP3; BIRC3
Señalización de JAK/Stat
PTPN1; MAPK1; PTPN11; AKT2; PIK3CA; STAT5B;
imagen299
PIK3CB; PIK3C3; MAPK3; KRAS; SOCS1; STAT5A;
imagen300
PTPN6; PIK3C2A; RAF1; CDKN1A; MAP2K2; JAK1;
imagen301
AKT1; JAK2; PIK3R1; STAT3; MAP2K1; FRAP1; AKT3;
imagen302
STAT1
Metabolismo de
PRKCE; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2; GRK6; MAPK1;
Nicotinato y
imagen303
Nicotinamida
PLK1; AKT2; CDK8; MAPK8; MAPK3; PRKCD; PRKAA1;
imagen304
PBEF1; MAPK9; CDK2; PIM1; DYRK1A; MAP2K2;
imagen305
MAP2K1; PAK3; NT5E; TTK; CSNK1A1; BRAF; SGK
Señalización de quimiocinas
CXCR4; ROCK2; MAPK1; PTK2; FOS; CFL1; GNAQ;
imagen306
CAMK2A; CXCL12; MAPK8; MAPK3; KRAS; MAPK13;
imagen307
RHOA; CCR3; SRC; PPP1CC; MAPK14; NOX1; RAF1;
imagen308
MAP2K2; MAP2K1; FLAN; CCL2; PRKCA
Señalización de IL-2
ELK1; MAPK1; PTPN11; AKT2; PIK3CA; SYK; FOS;
imagen309
STAT5B; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; MAPK3; KRAS;
imagen310
SOCS1; STAT5A; PIK3C2A; LCK; RAF1; MAP2K2;
imagen311
JAK1; AKT1; PIK3R1; MAP2K1; JUN; AKT3
Depresión sináptica
PRKCE; IGF1; PRKCZ; PRDX6; LYN; MAPK1; GNAS;
a largo lazo
PRKCI; GNAQ; PPP2R1A; IGF1R; PRKD1; MAPK3;
imagen312
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen313
KRAS; GRN; PRKCD; NOS3; NOS2A; PPP2CA;
imagen314
YWHAZ; RAF1; MAP2K2; PPP2R5C; MAP2K1; PRKCA
Señalización de
TAF4B; EP300; CARM1; PCAF; MAPK1; NCOR2;
Receptor de Estrógenos
SMARCA4; MAPK3; NRIP1; KRAS; SRC; NR3C1;
imagen315
HDAC3; PPARGC1A; RBM9; NCOA3; RAF1; CREBBP;
imagen316
MAP2K2; NCOA2; MAP2K1; PRKDC; ESR1; ESR2
Ruta de
TRAF6; SMURF1; BIRC4; BRCA1; UCHL1; NEDD4;
Ubiquitinación de proteínas
CBL; UBE2I; BTRC; HSPA5; USP7; USP10; FBXW7;
imagen317
USP9X; STUB1; USP22; B2M; BIRC2; PARK2; USP8;
imagen318
USP1; VHL; HSP90AA1; BIRC3
Señalización de IL-10
TRAF6; CCR1; ELK1; IKBKB; SP1; FOS; NFKB2;
imagen319
MAP3K14; MAPK8; MAPK13; RELA; MAPK14; TNF;
imagen320
IKBKG; RELB; MAP3K7; JAK1; CHUK; STAT3; NFKB1;
imagen321
JUN; IL1R1; IL6
Activación de VDR/RXR
PRKCE; EP300; PRKCZ; RXRA; GADD45A; HES1;
imagen322
NCOR2; SP1; PRKCI; CDKN1B; PRKD1; PRKCD;
imagen323
RUNX2; KLF4; YY1; NCOA3; CDKN1A; NCOA2; SPP1;
imagen324
LRP5; CEBPB; FOXO1; PRKCA
Señalización de TGF-beta
EP300; SMAD2; SMURF1; MAPK1; SMAD3; SMAD1;
imagen325
FOS; MAPK8; MAPK3; KRAS; MAPK9; RUNX2;
imagen326
SERPINE1; RAF1; MAP3K7; CREBBP; MAP2K2;
imagen327
MAP2K1; TGFBR1; SMAD4; JUN; SMAD5
Señalización de Receptor tipo Toll
IRAK1; EIF2AK2; MYD88; TRAF6; PPARA; ELK1;
imagen328
IKBKB; FOS; NFKB2; MAP3K14; MAPK8; MAPK13;
imagen329
RELA; TLR4; MAPK14; IKBKG; RELB; MAP3K7; CHUK;
imagen330
NFKB1; TLR2; JUN
Señalización de p38 MAPK
HSPB1; IRAK1; TRAF6; MAPKAPK2; ELK1; FADD; FAS;
imagen331
CREB1; DDIT3; RPS6KA4; DAXX; MAPK13; TRAF2;
imagen332
MAPK14; TNF; MAP3K7; TGFBR1; MYC; ATF4; IL1R1;
imagen333
SRF; STAT1
Señalización de Neurotrofina/TRK
NTRK2; MAPK1; PTPN11; PIK3CA; CREB1; FOS;
imagen334
PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; MAPK3; KRAS; PIK3C2A;
imagen335
RAF1; MAP2K2; AKT1; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1;
imagen336
CDC42; JUN; ATF4
Activación de FXR/RXR
INS; PPARA; FASN; RXRA; AKT2; SDC1; MAPK8;
imagen337
APOB; MAPK10; PPARG; MTTP; MAPK9; PPARGC1A;
imagen338
TNF; CREBBP; AKT1; SREBF1; FGFR4; AKT3; FOXO1
Potenciación sináptica
PRKCE; RAP1A; EP300; PRKCZ; MAPK1; CREB1;
a largo plazo
PRKCI; GNAQ; CAMK2A; PRKD1; MAPK3; KRAS;
imagen339
PRKCD; PPP1CC; RAF1; CREBBP; MAP2K2; MAP2K1;
imagen340
FUNCIÓN CELULAR
GENES
imagen341
ATF4; PRKCA
Señalización de calcio
RAP1A; EP300; HDAC4; MAPK1; HDAC5; CREB1;
imagen342
CAMK2A; MYH9; MAPK3; HDAC2; HDAC7A; HDAC11;
imagen343
HDAC9; HDAC3; CREBBP; CALR; CAMKK2; ATF4;
imagen344
HDAC6
Señalización de EGF
ELK1; MAPK1; EGFR; PIK3CA; FOS; PIK3CB; PIK3C3;
imagen345
MAPK8; MAPK3; PIK3C2A; RAF1; JAK1; PIK3R1;
imagen346
STAT3; MAP2K1; JUN; PRKCA; SRF; STAT1
Señalización de Hipoxia en el
EDN1; PTEN; EP300; NQO1; UBE2I; CREB1; ARNT;
Sistema Cardiovascular
HIF1A; SLC2A4; NOS3; TP53; LDHA; AKT1; ATM;
imagen347
VEGFA; JUN; ATF4; VHL; HSP90AA1
Inhibición mediada por LPS/IL-1
IRAK1; MYD88; TRAF6; PPARA; RXRA; ABCA1;
de función RXR
MAPK8; ALDH1A1; GSTP1; MAPK9; ABCB1; TRAF2;
imagen348
TLR4; TNF; MAP3K7; NR1H2; SREBF1; JUN; IL1R1
Activación de LXR/RXR
FASN; RXRA; NCOR2; ABCA1; NFKB2; IRF3; RELA;
imagen349
NOS2A; TLR4; TNF; RELB; LDLR; NR1H2; NFKB1;
imagen350
SREBF1; IL1R1; CCL2; IL6; MMP9
Proceso amiloide
PRKCE; CSNK1E; MAPK1; CAPNS 1; AKT2; CAPN2;
imagen351
CAPN1; MAPK3; MAPK13; MAPT; MAPK14; AKT1;
imagen352
PSEN1; CSNK1A1; GSK3B; AKT3; APP
Señalización de IL-4
AKT2; PIK3CA; PIK3CB; PIK3C3; IRS1; KRAS; SOCKS1;
imagen353
PTPN6; NR3C1; PIK3C2A; JAK1; AKT1; JAK2; PIK3R1;
imagen354
FRAP1; AKT3; RPS6KB1
Regulación
EP300; PCAF; BRCA1; GADD45A; PLK1; BTRC;
Control de daño
CHEK1; ATR; CHEK2; YWHAZ; TP53; CDKN1A;
Ciclo celular: ADN G2/M
PRKDC; ATM; SFN; CDKN2A
Señalización de óxido nítrico en el
KDR; FLT1; PGF; AKT2; PIK3CA; PIK3CB; PIK3C3;
Sistema Cardiovascular
CAV1; PRKCD; NOS3; PIK3C2A; AKT1; PIK3R1;
imagen355
VEGFA; AKT3; HSP90AA1
Metabolismo de Purina
NME2; SMARCA4; MYH9; RRM2; ADAR; EIF2AK4;
imagen356
PKM2; ENTPD1; RAD51; RRM2B; TJP2; RAD51C;
imagen357
NT5E; POLD1; NME1
Señalización mediada por cAMP
RAP1A; MAPK1; GNAS; CREB1; CAMK2A; MAPK3 ;
imagen358
SRC; RAF1; MAP2K2; STAT3; MAP2K1; BRAF; ATF4
Disfunción mitocondrial
SOD2; MAPK8; CASP8; MAPK10; MAPK9; CASP9;
imagen359
PARK7; PSEN1; PARK2; APP; CASP3
Señalización de Notch
HES1; JAG1; NUMB; NOTCH4; ADAM 17; NOTCH2;
imagen360
PSEN1; NOTCH3; NOTCH1; DLL4
Ruta del estrés del
HSPA5; MAPK8; XBP1; TRAF2; ATF6; CASP9; ATF4;
Retículo endoplasmático
EIF2AK3; CASP3
FUNCIÓN CELULAR
GENES
Metabolismo de pirimidina
NME2; AICDA; RRM2; EIF2AK4; ENTPD1; RRM2B;
imagen361
NT5E; POLD1; NME1
Señalización de Parkinson
UCHL1; MAPK8; MAPK13; MAPK14; CASP9; PARK7;
imagen362
PARK2; CASP3
Señalización
GNAS; GNAQ; PPP2R1A; GNB2L1; PPP2CA; PPP1CC;
Cardíaca y beta adrenérgica
PPP2R5C
Glucolisis/Gluconeogénesis
HK2; GCK; GPI; ALDH1A1; PKM2; LDHA; HK1
Señalización de interferón
IRF1; SOCS1; JAK1; JAK2; IFITM1; STAT1; IFIT3
Señalización Sonic Hedgehog
ARRB2; SMO; GLI2; DYRK1A; GLI1; GSK3B; DYRK1B
Metabolismo
PLD1; GRN; GPAM; YWHAZ; SPHK1; SPHK2
Glicerofosfolípidos
imagen363
Degradación de fosfolípidos
PRDX6; PLD1; GRN; YWHAZ; SPHK1; SPHK2
Metabolismo de triptofano
SIAH2; PRMT5; NEDD4; ALDH1A1; CYP1B1; SIAH1
Degradación de lisina
SUV39H1; EHMT2; NSD1; SETD7; PPP2R5C
Ruta
ERCC5; ERCC4; XPA; XPC; ERCC1
Reparación escisión de nucleótidos
imagen364
Metabolismo de
UCHL1; HK2; GCK; GPI; HK1
Almidón y sacarosa
imagen365
Metabolismo de aminoazúcares
NQO1; HK2; GCK; HK1
Metabolismo de
PRDX6; GRN; YWHAZ; CYP1B1
Ácido araquidónico
imagen366
Señalización de ritmo circadiano
CSNK1E; CREB1; ATF4; NR1D1
Sistema de coagulación
BDKRB1; F2R; SERPINE1; F3
Receptor de Dopamina
PPP2R1A; PPP2CA; PPP1CC; PPP2R5C
Señalización
imagen367
Metabolismo de glutationa
IDH2; GSTP1; ANPEP; IDH1
Metabolismo de glicerolípidos
ALDH1A1; GPAM; SPHK1; SPHK2
Metabolismo de ácido linoleico
PRDX6; GRN; YWHAZ; CYP1B1
Metabolismo de Metionina
DNMT1; DNMT3B; AHCY; DNMT3A
Metabolismo de piruvato
GLO1; ALDH1A1; PKM2; LDHA
Metabolismo de
ALDH1A1; NOS3; NOS2A
Arginina y Prolina
imagen368
Señalización Eicosanoide
PRDX6; GRN; YWHAZ
metabolismo de
HK2; GCK; HK I
Fructosa y Manosa
imagen369
Metabolismo de Galactosa
HK2; GCK; HK1
Biosíntesis de estilbeno,
PRDX6; PRDX1; TYR
cumarina y lignina
imagen370
Ruta de
CALR; B2M
Presentación de antígenos
imagen371
imagen372
FUNCIÓN CELULAR
GENES
Biosíntesis de esteroides
NQO1; DHCR7
Metabolismo de Butanoato
ALDH1A1; NLGN1
Ciclo del Citrato
IDH2; IDH1
Metabolismo de ácidos grasos
ALDH1A1; CYP1B1
Metabolismo de
PRDX6; CHKA
Glicerofosfolípidos
imagen373
Metabolismo de Histidina
PRMT5; ALDH1A1
Metabolismo de Inositol
ERO1L; APEX1
Metabolismo de xenobióticos
GSTP1; CYP1B1
por citocromo p450
imagen374
Metabolismo de metano
PRDX6; PRDX1
Metabolismo de fenilalanina
PRDX6; PRDX1
Metabolismo de Propanoato
ALDH1A1; LDHA
Metabolismo de
PRMT5; AHCY
Selenoaminoácido
imagen375
Metabolismo de esfingolípidos
SPHK1; SPHK2
Aminofosfonato
PRMT5
Metabolismo
imagen376
Andrógenos y estrógenos
PRMT5
Metabolismo de
imagen377
Ascorbato y Aldarato
ALDH1A1
Metabolismo de
imagen378
Biosínteis de ácidos biliares
ALDH1A1
Metabolismo de cisteína
LDHA
Biosínteis de ácidos grasos
FASN
Receptor de Glutamato
GNB2L1
Señalización de
imagen379
Respuesta de estrés
PRDX1
Oxidativa mediada por NRF2
imagen380
Ruta de
GPI
Pentosa fosfato
imagen381
Interconversiones de
UCHL1
Pentosa y Glucuronato
imagen382
Metabolismo de Retinol
ALDH1A1
Metabolismo de Riboflavina
TYR
Metabolismo de tirosina
PRMT5, TYR
Biosíntesis de Ubiquinona
PRMT5
Degradación de Valina, Leucina e
ALDH1A1
Isoleucina
imagen383
Metabolismo de Glicina, Serina y
CHKA
imagen384
FUNCIÓN CELULAR
GENES
Treonina
imagen385
Degradación de lisina
ALDH1A1
dolor/sabor
TRPM5; TRPA1
dolor
TRPM7; TRPC5; TRPC6; TRPC1; Cnr1; cnr2; Grk2;
imagen386
Trpa1; Pomc; Cgrp; Crf; Pka; Era; Nr2b; TRPM5; Prkaca;
imagen387
Prkacb; Prkar1a; Prkar2a
Función mitocondrial
AIF; CytC; SMAC (Diablo); Aifm-1; Aifm-2
Neurología de desarrollo
BMP-4; Chordin (Chrd); Noggin (Nog); WNT (Wnt2;
imagen388
Wnt2b; Wnt3a; Wnt4; Wnt5a; Wnt6; Wnt7b; Wnt8b;
imagen389
Wnt9a; Wnt9b; Wnt10a; Wnt10b; Wnt16); beta-catenin;
imagen390
Dkk-1; proteínas relacionadas con Frizzled; Otx-2; Gbx2; FGF-8;
imagen391
Reelin; Dab1; unc-86 (Pou4f1 or Brn3a); Numb; Reln
Las realizaciones de la descripción también se refieren a métodos y composiciones relacionadas con eliminación de genes, la multiplicación de genes y reparación de mutaciones particulares asociadas a la inestabilidad de repeticiones de ADN y trastornos neurológicos (Robert D. Wells, Tetsuo Ashizawa, Genetic Instabilities and
5 Neurological Diseases, Segunda Edición, Academic Press 13 de octubre de 2.011-Medical). Aspectos específicos de secuencias de repetición en tándem se han encontrado responsable de más de veinte enfermedades humanas (Nuevos conocimientos en la inestabilidad de la repetición: función de híbridos de ARN·ADN. McIvor EI, Polak U, Napierala M. RNA Biol. Sep-Oct 2.010; 7 (5): 551-8). El sistema CRISPR-Cas puede ser aprovechado para corregir estos defectos de inestabilidad genómica.
10 Un aspecto más de la descripción se refiere a la utilización del sistema CRISPR-Cas para corregir defectos en los genes EMP2A y EMP2B que se ha identificado que están asociados a la enfermedad Lafora. La enfermedad de Lafora es un trastorno autosómico recesivo que se caracteriza por epilepsia mioclónica progresiva que puede empezar como ataques epilépticos en la adolescencia. Algunos casos de la enfermedad pueden estar causados por mutaciones en genes que se tienen que identificar sin embargo. La enfermedad produce ataques, espasmos
15 musculares, dificultad para caminar, demencia y eventualmente la muerte. En la actualidad no hay tratamiento que se haya demostrado eficaz contra el progreso de la enfermedad. Otras anormalidades genéticas asociadas a la epilepsia también pueden ser fijadas como objetivo mediante el sistema CRISPR-Cas y la genética subyacente se describe además en Genetics of Epilepsy and Genetic Epilepsies, editado por Giuliano Avanzini, Jeffrey L. Noebels, Mariani Foundation Paediatric Neurology: 20; 2.009).
20 En otro aspecto más de la descripción, el sistema CRISPR-Cas puede ser usado para corregir defectos oculares que surgen de mutaciones genéticas diversas descritas además en Genetic Diseases of the Eye, Segunda Edición , editado por Elias I. Traboulsi, Oxford University Press, 2.012.
Diversos aspectos adicionales de la descripción se refiere a corregir defectos asociados a un amplio intervalo de enfermedades genéticas que se describen además en la página web del Instituto Nacional para la Salud bajo la 25 subsección tópica Trastornos Genéticos. Las enfermedades cerebrales genéticas pueden incluir pero no se limitan a, Adrenoleucodistrofia, Angenesia del Cuerpo Calloso, Síndrome de Aicardi, Enfermedad de Alper, Enfermedad de Alzheimer, Síndrome de Barth, Enfermedad de Batten, CADASIL, Degeneración Cerebelar, Enfermedad de Fabry, Enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, Enfermedad de Huntington y otros Trastornos de Triple Repetición, Enfermedad de Leigh, Síndrome de Lesch-Nyhan, Enfermedad de Menkes, Miopatías Mitocondriales y
30 Colpocefalia de NINDS (por sus siglas en inglés). Estas enfermedades se describen además en la página web del Instituto Nacional de la Salud bajo la subsección Trastornos Cerebrales Genéticos.
En algunas realizaciones, la afección puede ser neoplasia. En algunas realizaciones, donde la afección es neoplasia, los genes que se tienen que fijar como objetivo son cualquiera de los enumerados en la Tabla A (en este caso PTEN etc). En algunas realizaciones, la afección puede ser Degeneración Macular Relacionada con la Edad. 35 En algunas realizaciones, la afección puede ser un Trastorno Esquizofrénico. En algunas realizaciones, la afección puede ser un trastorno de Repetición del Trinucleótido. En algunas realizaciones, la afección puede ser Síndrome de Frágil X. En algunas realizaciones, la afección puede ser un Trastorno Relacionado con la Secretasa. En algunas realizaciones, la afección puede ser un trastorno relacionado con el Prión. En algunas realizaciones, la afección puede ser ALS (por sus siglas en inglés). En algunas realizaciones, la afección puede ser una drogadicción. En 40 algunas realizaciones, la afección puede ser Autismo. En algunas realizaciones, la afección puede ser Enfermedad de Alzheimer. En algunas realizaciones, la afección puede ser inflamación. En algunas realizaciones, la afección
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
puede ser Enfermedad de Parkinson.
Ejemplos de proteínas asociadas a la enfermedad de Parkinson incluyen pero no se limitan a α-sinucleína, DJ-1, LRRK2, PINK1, Parkin, UCHL1, Synphilin-1 y NURR1.
Ejemplos de proteínas relacionadas con la adicción pueden incluir ABAT por ejemplo.
Ejemplos de proteínas relacionadas con la inflamación pueden incluir la proteína quimioatrayente de monocitos -1 (MCP1) codificada por el gen Ccr2, el receptor de quimiocina C-C tipo 5 (CCR5) codificada por el gen Ccr5, el receptor IIB de IgG (FCGR2b, también denominado CD32) codificada por el gen Fcgr2b o la proteína de R1g Fc épsilon (FCER1g) codificada por el gen Fcer1g, por ejemplo.
Ejemplos de proteínas asociadas a enfermedades cardiovasculares pueden incluir IL1B (interleucina 1, beta), XDH (xantina deshidrogenasa), TP53 (proteína tumoral p53), PTGIS (prostaglandina I2 (prostaciclina) sintasa), MB (mioglobina), IL4 (interleucina 4), ANGPT1 (angiopoyetina 1), ABCG8 (casete de unión a ATP, sub-familia G (WHITE), miembro 8) o CTSK (catepsina K), por ejemplo.
Ejemplos de proteínas asociadas a la enfermedad de Alzheimer pueden incluir la proteína receptora de lipoproteína de densidad muy baja (VLDLR, por sus siglas en inglés) codificada por el gen VLDLR, la enzima activadora de modificador de tipo ubiquitina 1 (UBA1) codificada por el gen UBA1 o la proteína de subunidad catalítica de enzima E1 activadora de NEDD8 (UBE1C) codificada por el gen UBA3, por ejemplo.
Ejemplos de proteínas asociadas a Trastorno por Espectro Autista pueden incluir la proteína 1 asociada a receptor de benzodiazapina (periférica) (BZRAP1) codificada por el gen BZRAP1, la proteína del miembro 2 de la familia AF4/FMR2 (AFF2) codificada por el gen AFF2 (también denominado MFR2), la proteína de homólogo 1 autosómico de retraso mental frágil X (FXR1) codificada por el gen FXR1 o la proteína de homólogo 2 autosómico del retraso mental frágil X (FXR2) codificada por el gen FXR2, por ejemplo.
Los ejemplos de proteínas asociadas a Degeneración Macular pueden incluir la casete de unión de ATP, proteína del miembro 4 (ABCA4) de la sub-familia A (ABC 1) codificada por el gen ABCR, la proteína apolipoproteína E (APOE) codificada por el gen APOE o la proteína de Ligando 2 (CCL2) de quimiocina (unidad C-C) codificada por el gen CCL2, por ejemplo.
Ejemplos de proteínas asociadas a Esquizofrenia pueden incluir NRG1, ErbB4, CPLX1, TPH1, TPH2, NRXN1, GSK3A, BDNF, DISC1, GSK3B y combinaciones de las mismas.
Ejemplos de proteínas implicadas en la supresión de tumores pueden incluir ATM (ataxia telangiectasia mutada), ATR (ataxia telangiectasia y relacionada con Rad3), EGFR (receptor de factor de crecimiento epidérmico), ERBB2 (homólogo 2 de oncogén vírico de leucemia eritroblástica v-erb-b2), ERBB3 (homólogo 3 de oncogén vírico de leucemia eritroblástica v-erb-b2), ERBB4 (homólogo 4 de oncogén vírico de leucemia eritroblástica v-erb-b2), Notch 1, Notch2, Notch 3 o Notch 4, por ejemplo.
Ejemplos de proteínas asociadas a trastorno de la secretas pueden incluir PSENEN (homólogo de estimulador 2 de presenilina (C. elegans)), CTSB (catepsina B), PSEN1 (presenilina 1), APP (proteína precursora de amiloide beta (A4)), APH1B (homólogo B defectuoso 1 anterior de la faringe (C. elegans)), PSEN2 (presenilina 2 (enfermedad de Alzheimer 4)) o BACE1 (enzima 1 de escisión de APP de sitio beta), por ejemplo.
Los ejemplos de proteínas asociadas a Esclerosis Lateral Amiotrófica pueden incluir SOD1 (superóxido dismutasa 1), ALS2 (esclerosis lateral amiotrófica 2), FUS (fusionado en sarcoma), TARDBP (proteína de unión de ADN TAR), VAGFA (factor A de crecimiento endotelial vascular), VAGFB (factor B de crecimiento endotelial vascular) y VAGFC (factor C de crecimiento endotelial vascular) y cualquier combinación de los mismos.
Ejemplos de proteínas asociadas a enfermedades por priones pueden incluir SOD1 (superóxido dismutasa 1), ALS2 (esclerosis lateral amiotrófica 2), FUS (fusionado en sarcoma), TARDBP (proteína de unión de ADN TAR), VAGFA (factor A de crecimiento endotelial vascular), VAGFB (factor B de crecimiento endotelial vascular) y VAGFC (factor C de crecimiento endotelial vascular) y cualquier combinación de los mismos.
Los ejemplos de proteínas relacionadas con enfermedades neurodegenerativas en trastornos por priones pueden incluir A2M (Alfa-2-Macroglobulina), AATF (Factor de transcripción de antagonización de muerte celular programada), ACPP (fosfatasa ácida prostática), ACTA2 (Actina alfa 2 de músculo liso aorta), ADAM22 (dominio de la metalopeptidasa ADAM), ADORA3 (Receptor de adenosina A3) o ADRA1D (Receptor adrenérgico Alfa-1D para adrenoreceptor Alfa-1D), por ejemplo.
Los ejemplos de proteínas asociadas a Inmunodeficiencia pueden incluir A2M [alfa-2-macroglobulina]; AANAT [arilalquilamina N-acetiltransferasa]; ABCA1 [casete de unión a ATP, sub-familia A (ABC1), miembro 1]; ABCA2 [casete de unión a ATP, sub-familia A (ABC1), miembro 2] o ABCA3 [casete de unión a ATP, sub-familia A (ABC1), miembro 3]; por ejemplo.
Ejemplos de proteínas asociadas a Trastornos de Repetición del Trinucleótido incluyen AR (receptor de andrógeno), FMR1 (retraso mental 1 frágil X), HTT (huntingtina) o DMPK (distrofia miotónica-proteína cinasa), FXN (frataxina), ATXN2 (ataxina 2), por ejemplo.
imagen392
Ejemplos de proteínas asociadas a Trastornos de Neurotransmisión incluyen SST (somatostatina), NOS1 (óxido nítrico sintasa 1 (neuronal)), ADRA2A (receptor alfa-2A-adrenérgico), ADRA2C (receptor alfa-2C-adrenérgico), 5 TACR1 (receptor de taquicinina 1) o HTR2c (receptor 2C de 5-hidroxitriptamina (serotonina)), por ejemplo.
Ejemplos de secuencias asociadas al neurodesarrollo incluyen A2BP1 [proteína 1 de unión de ataxina 2], AADAT [aminoadipato aminotransferasa], AANAT [arilalquilamina N-acetiltransferasa], ABAT [4-aminobutirato aminotransferasa], ABCA1 [casete de unión a ATP, sub-familia A (ABC1), miembro 1] o ABCA13 [casete de unión a ATP, sub-familia A (ABC1), miembro 13], por ejemplo.
10 Más ejemplos de trastornos preferidos tratables con el presente sistema se pueden seleccionar de: Síndrome de Aicardi-Goutières; Enfermedad de Alexander; Síndrome de Allan-Herndon-Dudley; Trastornos Relacionados con POLG; Alfa-Manosidosis (Tipo II y III); Síndrome de Alström; Angelman; Síndrome; Ataxia-Telangiectasia; Lipofuscinosis Ceroide Neuronal; Beta-Talasemia; Atrofia Óptica Bilateral y Atrofia Óptica (Infantil) Tipo 1; Retinoblastoma (bilateral); Enfermedad de Canavan; Síndrome 1 Cerebroculofacioesquelético [COFS1];
15 Xantomatosis Cerebrotendinosa; Síndrome de Cornelia de Lange; Trastornos Relacionados con MAPT; Enfermedades Genéticas por Priones; Síndrome de Dravet; Enfermedad de Alzheimer Familiar de Comienzo Temprano; Ataxia de Friedreich [FRDA]; Síndrome de Fryns; Fucosidosis; Distrofia Muscular Congénita de Fukuyama; Galactosialidosis; Enfermedad de Gaucher; Acidemias Orgánicas; Linfohistiocitosis Hemofagocítica; Síndrome de Progeria de Hutchinson-Gilford; Mucolipidosis II; Enfermedad de Almacenamiento de Ácido Siálico
20 Libre Infantil; Neurodegeneración Asociada a PLA2G6; Síndrome de Jervell y Lange-Nielsen; Epidermolisis Bullosa sobre las Articulaciones; Enfermedad de Huntington; Enfermedad de Krabbe (Infantil); Síndrome de Leigh Asociado al ADN Mitocondrial y NARP; Síndrome de Lesch-Nyhan; Lisencefalia Asociada a LIS1; Síndrome de Lowe; Enfermedad Urinaria de Jarabe de Maple; Síndrome de Duplicación de MECP2; Trastornos de Transporte de Cobre Relacionado con ATP7A; Distrofia Muscular Relacionada con LAMA2; Deficiencia de Arilsulfatasa A;
25 Mucopolisacaridosis Tipos I, II o III; Trastornos de la Biogénesis del Peroxisoma, Espectro del Síndrome de Zellweger; Neurodegeneración con Trastornos de Acumulación de Hierro en el Cerebro; Deficiencia de Esfingomielinasa Ácida; Enfermedad de Niemann-Pick Tipo C; Encefalopatía por Glicina; Trastornos Relacionados con ARX; Trastornos del Ciclo de la Urea; Osteogénesis Imperfecta Relacionada con COL1A1/2; Síndrome de Supresión de ADN Mitocondrial; Trastornos Relacionados con PLP1; Síndrome de Perry; Síndrome de Phelan
30 McDermid; Enfermedad de Almacenamiento de Glucógeno Tipo II (Enfermedad de Pompe) (Infantil); Trastornos Relacionados con MAPT; Trastornos Relacionados con MECP2; Condrodisplasia Punctata Rizomélica Tipo 1; Síndrome de Roberts; Enfermedad de Sandhoff; Enfermedad de Schindler -Tipo 1; Deficiencia de Adenosina Deaminasa; Síndrome de Smith-Lemli-Opitz; Atrofia Muscular Espinal; Ataxia Espinocerebelar de Comienzo Infantil; Deficiencia de Hexosaminidasa A; Displasia Tanatofórica de Tipo 1; Trastornos Relacionados con el Colágeno Tipo
35 VI; Síndrome de Usher Tipo I; Distrofia Muscular Congénita; Síndrome de Wolf-Hirschhorn; Deficiencia de Lipasa Ácida Lisosomal y Xerodermia Pigmentosa.
La administración crónica de terapéutica proteínica puede provocar respuestas inmunitarias inaceptables a la proteína específica. La inmunogenicidad de fármacos de proteínas puede ser atribuida a algunos epítopos de linfocitos de auxiliar T inmunodominante (HTL, por sus siglas en inglés). Reducir la afinidad de unión de MHC de 40 estos epítopos HTL contenidos dentro de estas proteínas puede generar fármacos con inmunogenicidad menor (Tangri S, et al. ("Rationally engineered therapeutic proteins with reduced immunogenicity" J Immunol. 15 de marzo de 2.005; 174( 6): 3.187-96.) En la presente descripción, la inmunogenicidad de la enzima CRISPR en particular se puede reducir siguiendo la propuesta explicada primero en Tangri et al con respecto a eritropoyetina y desarrollada con posterioridad. De acuerdo con esto, se puede usar la evolución directa o el diseño racional para reducir la
45 inmunogenicidad de la enzima CRISPR (por ejemplo una Cas9) en la especie huésped (ser humano u otras especies).
En las plantas, los patógenos son con frecuencia específicos del huésped. Por ejemplo, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici produce marchitamiento del tomate pero ataca sólo al tomate y F. oxysporum f. dianthii Puccinia graminis f sp. tritici ataca sólo al trigo. Las plantas tienen defensas existentes e inducidas para resistir a la mayoría de los 50 patógenos. Las mutaciones y casos de recombinación a lo largo de las generaciones de plantas conducen a variabilidad genética que da lugar a susceptibilidad, especialmente cuando se reproducen los patógenos con más frecuencia que las plantas. En las plantas puede haber resistencia al no huésped, por ejemplo, el huésped y el patógeno son incompatibles. También puede ser Resistencia Horizontal, por ejemplo, resistencia parcial contra todas las razas de un patógeno, controlado típicamente por muchos genes y Resistencia Vertical, por ejemplo, 55 resistencia completa a algunas razas de un patógeno pero no a las demás razas, típicamente controlado por algunos genes. En un nivel gen por gen, las plantas y los patógenos evolucionan juntos y los cambios genéticos en uno equilibran los cambios en otro. De acuerdo con esto, usando Variabilidad Natural, los criadores combinan la mayoría de los genes útiles para Rendimiento, Calidad, Uniformidad, Dureza, Resistencia. Las fuentes de genes de la resistencia incluyen Variedades naturales o extrañas, Variedades Heirloom, Mutaciones Relativas a las Plantas 60 Silvestres e Inducidas, por ej., tratando material vegetal con agentes mutagénicos. Usando la presente invención, se proporciona a los criadores de plantas una nueva herramienta para inducir mutaciones. De acuerdo con esto, un experto en la materia puede analizar el genoma de fuentes de genes de resistencia y en Variedades con
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características o rasgos deseados emplea la presente invención para inducir el aumento de genes de resistencia, con más precisión que los agentes mutagénicos previos y por lo tanto acelera y mejora los programas de cultivo.
Como será evidente, se prevé que el presente sistema se pueda usar para fijar como objetivo cualquier secuencia de polinucleótidos de interés. Algunos ejemplos de afecciones o enfermedades que se podían tratar positivamente usando el presente sistema se incluyen en las Tablas anteriores y también se proporcionan allí ejemplos de genes asociados en la actualidad a esas enfermedades. Sin embargo, los genes ejemplificados no son exhaustivos.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos de diversas realizaciones de la invención y no están destinados a limitar la presente invención de ningún modo. Los presentes ejemplos, junto con los métodos descritos en la presente memoria son representativos en el momento presente de realizaciones preferidas, son ejemplares, y no se destinan a limitar el alcance de la invención.
Ejemplo 1: Actividad del complejo CRISPR en el núcleo de una célula eucariota.
Un sistema CRISPR de ejemplo de tipo II es el sitio CRISPR de tipo II de Streptococcus pyogenes SF370, que contiene una agrupación de cuatro genes Cas9, Cas1, Cas2 y Csn1, así como dos elementos de ARN no codificante, ARNtracr y una serie característica de secuencias repetitivas (repeticiones directas) inter espaciadas por tramos cortos de secuencias no repetitivas (espaciadores, aproximadamente 30 pb cada uno). En este sistema, se genera rotura de doble cadena (RDC) de ADN fijado como objetivo en cuatro etapas secuenciales (Figura 2A). Primero, dos ARN no codificantes, la serie pre-ARNcr y ARNtracr, se transcriben del sitio CRISPR. Segundo, ARNtracr se hibrida a las repeticiones directas de pre-ARNcr, que se tratan después en ARNcr maduros que contienen secuencias espaciadoras individuales. Tercero, el complejo ARNcr:ARNtracr maduro dirige Cas9 al ADN objetivo que consiste en el protoespaciador y la correspondiente PAM vía la formación de heterodúplex entre la región espaciadora del ARNcr y el ADN protoespaciador. Finalmente, Cas9 media la escisión de ADN objetivo aguas arriba de PAM para crear una RDC dentro del protoespaciador (Figura 2A). Este ejemplo describe un procedimiento de ejemplo para adaptar este sistema de nucleasa programable de ARN para dirigir la actividad del complejo CRISPR en el núcleo de las células eucariotas.
Para mejorar la expresión de los componentes CRISPR en células de mamífero, se codón-optimizaron dos genes del sitio 1 de SF370 de Streptococcus pyogenes (S. pyogenes), Cas9 (SpCas9) y RNasa III (SpRNasa III). Para facilitar la localización nuclear, se incluyó una señal de localización nuclear en el término (N) amino o (C) carboxilo de ambas SpCas9 y SpRNasa III (Figura 2B). Para facilitar la visualización de la expresión de proteínas, también se incluyó un marcador de proteína fluorescente en el N-o C-terminal de ambas proteínas (Figura 2B). También se generó una versión de SpCas9 con un NLS unido a ambos N-y C-terminal (2xNLS-SpCas9). Se transfectaron construcciones que contenían SpCas9 NLS-fusionada y SpRNasa III en células de riñón embriónico humano (HEK, por sus siglas en inglés) 293FT y se encontró el posicionamiento relativo de la NLS a SpCas9 y SpRNasa III para afectar a su eficacia de localización nuclear. Mientras la NLS C-terminal fue suficiente para fijar como objetivo SpRNasa III para los núcleos, la unión de una sola copia de estas NLS particulares en cualquiera de los N-o Cterminal de SpCas9 no pudo conseguir la localización nuclear adecuada en este sistema. En este ejemplo, la NLS Cterminal fue la de nucleoplasmina (KRPAATKKAGQAKKKK) y la NLS C-terminal fue la del antígeno T grande SV40 (PKKKRKV). De las versiones de SpCas9 ensayadas, sólo 2xNLS-SpCas9 presentó localización nuclear (Figura 2B).
La secuencia ARNtracr del sitio CRISPR de S. pyogenes SF370 presenta dos sitios de comienzo transcripcional, dando lugar a dos transcritos de 89 nucleótidos (nt) y 171 nt que se tratan con posterioridad en ARNtracr maduros de 75 nt idénticos. Se seleccionó el ARNtracr de 89 nt más corto para expresión en células de mamífero (construcciones de expresión ilustradas en la Figura 6, con funcionalidad cuando se determina por los resultados del ensayo de Surveryor mostrado en la Figura 6B). Los sitios de comienzo de la transcripción se señalan como +1 y el terminador de la transcripción y la secuencia probada por el ensayo de northern se indican también. La expresión de ARNtracr tratado también se confirmó por ensayo de Northern. La Figura 7C muestra los resultados de un ensayo de Northern de ARN total extraído de células 293FT transfectadas con construcciones de expresión U6 que soportan ARNtracr largo o corto, así como SpCas9 y DR-EMX1(1)-DR. Los paneles izquierdo y derecho son de células 293FT transfectadas sin o con SpRNasa III, respectivamente. U6 indica control de carga representado gráficamente con una sonda que fija como objetivo ARNsn U6 humano. La transfección de la construcción de expresión de ARNtracr corto conduce a niveles abundantes de la forma tratada de ARNtracr (~75 pb). Se detectan cantidades muy bajas de ARNtracr largo en el análisis de Northern.
Para activar la iniciación precisa transcripcional, se seleccionó el activador de U6 basado en ARN polimerasa III para conducir la expresión de ARNtracr (Figura 2C). De manera similar, se desarrolló una construcción a base de activador U6 para expresar una serie pre-ARNcr que consiste en un único espaciador flanqueado por dos repeticiones directas (las RD, también incluida por el término "secuencias de emparejamiento tracr"; Figura 2C). Se diseñó el espaciador inicial para fijar como objetivo un sitio objetivo de 33 pares de bases (pb) (protoespaciador de 30 pb más una secuencia de unidad (PAM) CRISPR de 3 pb que satisface la unidad de reconocimiento NGG de Cas9) en el sitio EMX1 humano (Figura 2C), un gen clave en el desarrollo de la corteza cerebral.
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Para ensayar si la expresión heteróloga del sistema CRISPR (SpCas9, SpRNasa III, ARNtracr y pre-ARNcr) en células de mamífero puede conseguir la escisión fijada como objetivo de cromosomas de mamífero, se transfectaron células HEK 293FT con combinaciones de componentes CRISPR. Puesto que las RDC en núcleos de mamífero se reparan parcialmente por la ruta de unión de extremos no homólogos (NHEJ, por sus siglas en inglés), que conduce 5 a la formación de inserciones o supresiones, se usó el ensayo Surveyor para detectar potencial actividad de escisión en el sitio EMX1 objetivo (véase por ej., Guschin et al., 2.010, Methods Mol Biol 649: 247). La transfección conjunta de los cuatro componentes CRISPR pudo inducir una escisión hasta del 5,0% en el protoespaciador (véase la Figura 2D). La transfección conjunta de todos los componentes CRISPR menos SpRNasa III también indujo hasta 4,7% de inserción o supresión en el protoespaciador, que sugiere que puede haber Rnasas de mamífero endógenas que son capaces de ayudar a la maduración de ARNcr, tal como por ejemplo las enzimas Dicer y Drosha relacionadas. Retirar cualquiera de los tres componentes restantes anula la actividad de escisión del genoma del sistema CRISPR (Figura 2D). La secuenciación Sanger de amplicones que contiene el sitio fijado como objetivo verificó la actividad de escisión: en 43 clones secuenciados, se encontraron 5 alelos mutados (11,6%). Experimentos similares usando una variedad de secuencias guía produjeron porcentajes de inserción o supresión tan altos como 29% (véanse las
15 Figuras 4-8, 10 y 11). Estos resultados definen un sistema de tres componentes para modificación de genomas mediada por CRISPR eficaz en células de mamífero.
 EMX1 humano. La Figura 9 proporciona un análisis de Northern adicional de tratamiento de ARNcr en células de mamífero. La Figura 9A ilustra un esquema que muestra el vector de expresión para un único espaciador flanqueado por dos repeticiones directas (RD-EMX1(1)-RD). El espaciador de 30 pb que fija como objetivo el protoespaciador 1 del sitio EMX1 humano y las secuencias de repetición directa se muestran en la secuencia debajo de la Figura 9A. La línea indica la región cuya secuencia de complemento inverso se usó para generar sondas de Northern para detección de ARNcr de EMX1(1). La Figura 9B
25 muestra un análisis Northern de ARN total extraído de células 293FT transfectadas con construcciones de expresión U6 que soportan RD-EMX1(1)-RD. Los paneles izquierdo y derecho son de células 293FT transfectadas sin o con SpRNasa III respectivamente. Se trató RD-EMX1(1)-RD en ARNcr maduros sólo en presencia de SpCas9 y ARNtracr corto y no fue dependiente de la presencia de SpRNasa III. El ARNcr maduro detectado de ARN total de 293FT transfectado es ~33 pb y es más corto que el ARNcr maduro de 39-42 pb de S. pyogenes. Estos resultados demuestran que un sistema CRISPR se puede trasplantar en células eucariotas y reprogramar para facilitar la escisión de polinucleótidos objetivo de mamíferos endógenos.
La Figura 2 ilustra el sistema CRISPR bacteriano descrito en este ejemplo. La Figura 2A ilustra un esquema que muestra el sitio 1 de CRISPR de Streptococcus pyogenes SF370 y un mecanismo propuesto de escisión de ADN mediada por CRISPR por este sistema. El ARNcr maduro tratado de la serie repetición directa – espaciador dirige 35 Cas9 a objetivos genómicos que constan de protoespaciadores complementario y una unidad adyacente al protoespaciador (PAM). En el emparejamiento de base objetivo-espaciador, Cas9 media una rotura de doble cadena en el ADN objetivo. La Figura 2B ilustra el logro de Cas9 de S. pyogenes (SpCas9) y RNasa III (SpRNasa III) con señales de localización nuclear (las NLS) para permitir la importación al núcleo del mamífero. La Figura 2C ilustra la expresión de mamífero de SpCas9 y SpRNasa III conducida por el activador EF1a constitutivo y ARNtracr y la serie pre-ARNcr (RD-Espaciador-RD) conducidos por el activador U6 de ARN Pol3 para activar iniciación y terminación de transcripción precisa. Un protoespaciador del sitio EMX1 humano con una secuencia PAM satisfactoria se usa como el espaciador en la serie pre-ARNcr. La Figura 2D ilustra ensayo de la nucleasa surveyor para inserciones y supresiones minoritarias mediadas por SpCas9. SpCas9 se expresó con y sin SpRNasa III, ARNtracr y una serie pre-ARNcr que soporta el espaciador objetivo EMX1. La Figura 2E ilustra una representación esquemática de
45 emparejamiento de bases entre el sitio objetivo y ARNcr que fija como objetivo EMX1, así como un cromatograma de ejemplo que muestra una microsupresión adyacente al sitio de escisión de SpCas9. La Figura 2F ilustra alelos mutados identificados de análisis de secuenciación de 43 amplicones clonales que muestran una variedad de microinserciones y supresiones. Las líneas discontinuas indican bases suprimidas y bases no alineadas o desajustadas indican inserciones o mutaciones. Barra de escala = 10 µm.
Para simplificar además el sistema de tres componentes, se adaptó un diseño híbrido de ARNcr-ARNtracr quimérico, donde un ARNcr maduro (que comprende una secuencia guía) se fusiona a un ARNtracr parcial vía un tallo-lazo para imitar el dúplex ARNcr:ARNtracr natural (Figura 3A).
Las secuencias guía se pueden insertar entre sitios BbsI usando oligonucleótidos hibridados. Los protoespaciadores en las hebras transcrita y complementaria se indican por encima y por debajo de las secuencias de ADN,
55 respectivamente. Se consiguió una tasa de modificación de 6,3% y 0,75% para los sitios PVALB humano y Th de ratón, respectivamente, que demuestra la amplia aplicabilidad del sistema CRISPR en la modificación de diferentes sitios a través de múltiples organismos. Aunque la escisión sólo se detectó con uno de tres espaciadores para cada sitio usando las construcciones quiméricas, todas las secuencias objetivo se escindieron con eficacia de producción de inserción o supresión que alcanzó el 27% cuando se usó la disposición de pre-ARNcr expresada conjuntamente (Figuras 4 y 5).
La Figura 5 proporciona una ilustración más de que SpCas9 puede ser reprogramado para fijar como objetivo múltiples sitios genómicos en células de mamífero. La Figura 5A proporciona un esquema del sitio EMX1 humano que muestra la posición de cinco protoespaciadores, indicado por las secuencias subrayadas. La Figura 5B proporciona un esquema del complejo pre-ARNcr/ARNtrcr que muestra la hibridación entre la región de repetición directa del pre-ARNcr y ARNtracr (parte superior) y un esquema de un diseño de ARN quimérico que comprende una secuencia guía de 20 pb y secuencias de emparejamiento tracr y tracr que consisten en secuencias de
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5 repetición directa parcial y ARNtracr hibridadas según la estructura de horquilla (fondo). Los resultados de un ensayo Surveyor comparando la eficacia de escisión mediada por Cas9 en cinco protoespaciadores en el sitio EMX1 humano se ilustra en la Figura 5C. Cada protoespaciador se fija como objetivo usando complejo preARNcr/ARNtracr tratado (ARNcr) o ARN quimérico (ARNqui).
Puesto que la estructura secundaria de ARN puede ser crucial para interacciones intermoleculares, se usó un
10 conjunto de algoritmo de predicción de estructuras basado en energía libre mínima y estructura pesada de Boltzmann para comparar la estructura secundaria putativa de todas las secuencias guía usadas en nuestro experimento de fijación como objetivo de genoma (Figura 3B) (véase por ej., Gruber et al., 2.008, Nucleic Acids Research, 36: W70). El análisis reveló que en la mayoría de los casos, las secuencias guía eficaces en el contexto de ARNcr quimérico estaban sustancialmente exentas de unidades de estructura secundaria, mientras las
15 secuencias guía ineficaces era más probable que formaran estructuras secundarias internas que podían evitar el emparejamiento de bases con el ADN de protoespaciador objetivo. Así es posible que la variabilidad en la estructura secundaria del espaciador puede impactar en la eficacia de la interferencia mediada por CRISPR cuando se usa un ARNcr quimérico.
La Figura 3 ilustra vectores de expresión de ejemplo. La Figura 3A proporciona un esquema de un vector bi
20 cistrónico para conducir la expresión de una quimera ARNcr-ARNtracr sintética (ARN quimérico) así como SpCas9. El ARN guía quimérico contiene una secuencia guía de 20 pb correspondiendo al protoespaciador en el sitio objetivo genómico. La Figura 3B proporciona un esquema que muestra secuencias guía que fijan como objetivo los sitios EMX1, PVALB humano y Th de ratón, así como sus estructuras secundarias previstas. La eficacia de la modificación en cada sitio objetivo se indica debajo del dibujo de la estructura secundaria del ARN (EMX1, n = 216 lecturas de
25 secuenciación de amplicones; PVALB, n = 224 lecturas; Th, n = 265 lecturas). El algoritmo de plegamiento produjo una salida con cada base coloreada de acuerdo con su probabilidad de asumir la estructura secundaria prevista, como se indica por una escala en arco iris que se reproduce en la Figura 3B en escala de grises. Más diseños de vectores para SpCas9 se presentan en la Figura 3A, incluyendo vectores únicos de expresión que incorporan un activador U6 ligado a un sitio de inserción para un oligo guía y un activador Cbh ligado a secuencia de codificación
30 SpCas9.
Para ensayar si los espaciadores que contienen estructuras secundarias son capaces de funcionar en células procariotas en las cuales los CRISPR operan de manera natural, se ensayó interferencia de transformación de plásmidos que soportan protoespaciadores en una cepa E. coli que expresa de manera heteróloga el sitio 1 CRISPR SF370 de S. pyogenes (Figura 3C). Se clonó el sitio CRISPR en un vector de expresión E. coli de copia baja y se
35 reemplazó la serie ARNcr con un espaciador único flanqueado por un par de las RD (pCRISPR). Se transformaron cepas E. coli que albergaban diferentes plásmidos pCRISPR con plásmidos cuestionados conteniendo el correspondiente protoespaciador y secuencias PAM (Figura 3C). En el ensayo de bacterias, todos los espaciadores facilitaron interferencia de CRISPR eficaz (Figura 3C). Estos resultados sugieren que puede haber factores adicionales que afecten a la eficacia de la actividad de CRISPR en células de mamífero.
40 Para investigar la especificidad de la escisión mediada por CRISPR, se analizó el efecto de mutaciones de único nucleótido en la secuencia guía sobre la escisión del protoespaciador en el genoma de mamífero usando una serie de ARNcr quiméricos que fijan como objetivo EMX1 con mutación de puntos únicos (Figura 4A). La Figura 4B ilustra los resultados de un ensayo de nucleasa Surveyor comparando la eficacia de la escisión de Cas9 cuando se empareja con diferentes ARN quiméricos mutantes. El desajuste de bases únicas hasta 12 pb 5' de la PAM
45 sustancialmente anuló la escisión genómica por SpCas9, mientras los espaciadores con mutaciones en posiciones aguas arriba más lejos retuvieron la actividad frente al objetivo del protoespaciador original (Figura 4B). Además de la PAM, SpCas9 presenta especificidad de base única dentro de los últimos 12 pb del espaciador. Además, CRISPR es capaz de mediar la escisión genómica tan eficazmente como un par de nucleasas TALE (TALEN) fijando como objetivo el mismo protoespaciador EMX1. La Figura 4C proporciona un esquema que muestra el diseño de las
50 TALEN que fijan como objetivo EMX1 y la Figura 4D muestra un gel Surveyor comparando la eficacia de TALEN y Cas9 (n=3).
Teniendo establecida una serie de componentes para conseguir edición de genes mediada por CRISPR en células de mamífero a través del mecanismo NHEJ con predisposición a errores, se ensayó la capacidad de CRISPR para estimular la recombinación homóloga (RH), una ruta de reparación de genes de alta fidelidad para preparar 55 mediciones precisas en el genoma. SpCas9 de tipo natural es capaz de mediar las RDC específicas del sitio, que se pueden reparar a través de tanto NHEJ como RH. Además, se logró una sustitución de aspartato a alanina (D10A) en el dominio catalítico RuvC I de SpCas9 para convertir la nucleasa en una nickasa (SpCas9n; ilustrado en la Figura 5A) (véase por ej., Sapranausaks et al., 2.011, Cucleic Acis Research, 39: 9.275; Gasiunas et al., 2.012, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109: E2579), de manera que el ADN genómico nickeado experimenta la reparación dirigida por 60 homología de alta fidelidad (HDR, por sus siglas en inglés). El ensayo Surveyor confirmó que SpCas9n no generaba inserciones o supresiones en el objetivo del protoespaciador EMX1. Como se ilustra en la Figura 5B, la expresión conjunta de ARNcr quimérico que fija como objetivo EMX1 con SpCas9 produjo inserciones o supresiones en el sitio  EMX1, hSpCas9 o hSpCas9n, así como una plantilla de RH para introducir un par de sitios de 5 restricción (HindIII y NheI) cerca del protoespaciador. La Figura 5C proporciona una ilustración en esquema de la estrategia de la RH, con posiciones relativas de puntos de recombinación y secuencias de hibridación de cebadores (flechas). SpCas9 y SpCas9n por supuesto catalizaron la integración de la plantilla de RH en el sitio EMX1. La multiplicación por PCR de la región fijada como objetivo seguida por digestión de restricción con HindIII reveló productos de escisión correspondiendo a tamaños de fragmentos esperados (flechas en análisis de gel de polimorfismo de longitud del fragmento de restricción mostrado en la Figura 5D), mediando SpCas9 y SpCas9n niveles similares de eficacias de la RH. Los solicitantes verificaron además RH usando secuenciación de Sanger de amplicones genómicos (La Figura 5E). Estos resultados demuestran la utilidad de CRISPR para facilitar la inserción de genes fijados como objetivo en el genoma del mamífero. Dada la especificidad objetivo de 14 pb (12 pb del espaciador y 2 pb de la PAM) de SpCas9 de tipo natural, la disponibilidad de una nickasa puede reducir
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15 significativamente la probabilidad de modificaciones fuera de lo proyectado, puesto que las roturas de hebra única no son sustratos para la ruta NHEJ con predisposición a errores.
Las construcciones de expresión que imitan la arquitectura natural de sitios CRISPR con espaciadores formados (Figura 2A) se construyeron para ensayar la posibilidad de fijar como objetivo secuencias multiplexadas. Usando una única serie CRISPR codificando un par de espaciadores que fijan como objetivo EMX1 y PVALB, se detectó la escisión eficaz en ambos sitios (Figura 4F, que muestra tanto un diseño esquemático de la serie ARNcr como un análisis Surveyor mostrando la mediación eficaz de la escisión). La supresión fijada como objetivo de regiones genómicas mayores a través de las RDC usando espaciadores frente a dos objetivos dentro de EMX1 espaciado por 119 pb también se ensayó y se detectó una eficacia de la supresión del 1,6% (3 de un total de 182 amplicones; Figura 5G). Esto demuestra que el sistema CRISPR puede mediar la edición multiplexada dentro de un único
25 genoma.
Ejemplo 2: Modificaciones y alternativas del sistema CRISPR.
La capacidad para usar ARN para programar escisión de ADN específica de la secuencia define una nueva clase de herramientas de ingeniería del genoma para una variedad de aplicaciones de investigación e industriales. Diversos aspectos del sistema CRISPR se pueden mejorar además para aumentar la eficacia y la versatilidad de la fijación como objetivo de CRISPR. La actividad óptima de Cas9 puede depender de la disponibilidad de Mg2+ libre en niveles mayores que los presentes en el núcleo de los mamíferos (véase por ej., Jinek et al., 2.012, Science, 337: 816) y la preferencia para una unidad de NGG inmediatamente aguas abajo del protoespaciador restringe la capacidad para fijar como objetivo de promedio cada 12 pb en el genoma humano. Algunas de estas restricciones se pueden superar explorando la diversidad de los sitios CRISPR a través del metagenoma microbiano (véase por ej., 35 Makarova et al., 2.011, Nat Rev Microbiol, 9: 467). Otros sitios CRISPR pueden ser trasplantados en el medio celular de los mamíferos mediante un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 1. La eficacia de la modificación en cada sitio fijado como objetivo se indica debajo de las estructuras secundarias de ARN. El algoritmo que genera las estructuras colorea cada base de acuerdo con su probabilidad de asumir la estructura secundaria prevista. Los espaciadores 1 y 2 guía de ARN indujeron 14% y 6,4%, respectivamente. El análisis estadístico de la actividad de escisión a través de réplicas biológicas en estos dos sitios del protoespaciador se proporciona también en la Figura
7.
Ejemplo 3: Algoritmo de selección de secuencias objetivo de muestra.
Se diseña un programa informático para identificar secuencias objetivo de CRISPR candidato en ambas cadenas de una secuencia de ADN de entrada basada en longitud deseada de secuencias guía y una secuencia de unidad
45 CRISPR (PAM) para una enzima CRISPR especificada. Por ejemplo, los sitios objetivo para Cas9 de S. pyogenes, con secuencias NGG de PAM, se pueden identificar por investigación para 5'-Nx-NGG-3' ambas en la secuencia de entrada y en el complemento inverso de la entrada. Asimismo los sitios objetivo para Cas9 de CRISPR1 de S. thermophilus, con secuencia NNAGAAW de PAM, se pueden identificar por investigación para 5'-Nx-NNAGAAW-3' ambos en la secuencia de entrada y en el complemento inverso de la entrada. Asimismo, los sitios objetivo para Cas9 de CRISPR3 de S. thermophilus, con secuencia NGGNG de PAM, se pueden identificar por investigación para 5'-Nx-NGGNG-3' ambos en la secuencia de entrada y en el complemento inverso de la entrada. El valor "x" en Nx puede ser fijado por el programa o especificado por el usuario, tal como 20.
Puesto que múltiples apariciones en el genoma del sitio objetivo de ADN pueden conducir a edición de genoma no especifica, después de identificar todos los sitios potenciales, el programa filtra secuencias basadas en el número de 55 veces que aparecen en el genoma de referencia relevante. Para esas enzimas CRISPR para las cuales se determina la especificidad de secuencia mediante una secuencia "simiente", tal como la 5’ de 11-12 pb de la secuencia PAM, incluyendo la propia secuencia PAM, la etapa de filtración puede estar basada en la secuencia simiente. Así, para evitar la edición en sitios genómicos adicionales, los resultados se filtran basándose en el número de apariciones de la secuencia simiente:PAM en el genoma relevante. Se puede permitir que el usuario elija la longitud de la secuencia simiente. También se puede permitir que el usuario especifique el número de apariciones de la secuencia simiente:PAM en un genoma para fines de pase del filtro. El defecto es investigar secuencias
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únicas. El nivel de filtración se modifica cambiando tanto la longitud de la secuencia simiente como el número de apariciones de la secuencia en el genoma. El programa puede proporcionar además o como alternativa la secuencia de una secuencia guía complementaria a la secuencia o secuencias objetivo indicadas proporcionando el complemento inverso de la secuencia o secuencias objetivo identificadas.
5 Ejemplo 4: Evaluación de híbridos ARNcr-ARNtracr quiméricos múltiples.
Este ejemplo describe los resultados obtenidos para los ARN quiméricos (los ARNqui; que comprenden una secuencia guía, una secuencia de emparejamiento tracr y una secuencia tracr en un transcrito único) que tienen secuencias tracr que incorporan diferentes longitudes de secuencia ARNtracr de tipo natural. La Figura 18a ilustra un esquema de un vector bicistrónico de expresión para ARN quimérico y Cas9. Cas9 es conducido por el activador 10 CBh y el ARN quimérico es conducido por un activador U6. El ARN guía quimérico consta de una secuencia guía de 20 pb (Ns) unida a la secuencia tracr (barriendo desde la primera "U" de la hebra menor al extremo del transcrito), que se trunca en diversas posiciones como se indica. Las secuencias guía y tracr se separan mediante la secuencia de emparejamiento tracr GUUUUAGAGCUA seguido por la secuencia lazo GAAA. Los resultados de los ensayos SURVEYOR para inserciones o supresiones mediadas por Cas9 en los sitios  y PVALB humanos se ilustran 15 en la Figura 18b y 18c, respectivamente. Las flechas indican los fragmentos SURVEYOR esperados. Los ARNqui se indican por su designación "+n" y ARNcr se refiere a un ARN híbrido donde las secuencias guía y tracr se expresan como transcritos separados. La cuantificación de estos resultados, realizados por triplicado, se ilustran por histograma en las Figuras 11a y 11b, que corresponden a las Figuras 10b y 10c, respectivamente ("N. D." indica no inserciones o supresiones detectadas). Los ID del protoespaciador y su correspondiente objetivo genómico,
20 secuencia del protoespaciador, secuencia PAM y posición de la cadena se proporcionan en la Tabla D. Las secuencias guía se diseñan para que sean complementarias a la secuencia completa del protoespaciador en el caso de transcritos separados en el sistema híbrido o sólo a la porción subrayada en el caso de ARN quiméricos.
Tabla D:
imagen397
25 Cultivo celular y transfección
Se mantuvo la estirpe celular 293FT (Life Technologies) de riñón embriónico humano (HEK, por sus siglas en inglés) en Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) enriquecido con suero fetal bovino al 10% (HyClone), GlutaMAX 2 mM (Life Technologies), 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina a 37°C con incubación en CO2 al 5%. Se sembraron células 293FT en placas de 24 pozos (Corning) 24 horas previamente a transfección a una densidad
30 de 150.000 células por pozo. Se transfectaron las células usando Lipofectamine 2000 (Life Technologies) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Para cada pozo de una placa de 24 pozos, se usó un total de 500 ng de plásmido.
Ensayo SURVEYOR para modificación de genomas
Se transfectaron células 293FT con ADN de plásmido como se describió anteriormente. Se incubaron las células a
35 37°C durante 72 horas post-transfección previamente a extracción de ADN genómico. Se extrajo ADN genómico usando la solución de extracción de ADN QuickExtract (Epicentre) siguiendo el protocolo del fabricante. En resumen, se volvieron a suspender las células del botón en solución QuickExtract y se incubaron a 65 °C durante 15 minutos y 98 °C durante 10 minutos. La región genómica que flanquea el sitio objetivo de CRISPR para cada gen se multiplicó por PCR (cebadores enumerados en la Tabla E) y se purificaron los productos usando una columna de QiaQuick
40 Spin (Qiagen) siguiendo el protocolo del fabricante. Se mezclaron 400 ng totales de los productos PCR purificados con 2 µl 10X de tampón PCR ADN Taq Polimerasa (Enzymatics) y agua ultra pura a un volumen final de 20 µl y se sometieron a un procedimiento de rehibridación para permitir la formación de heteroduplex: 95°C durante 10 min, 95°C a 85°C descendiendo a -2°C/s, 85°C a 25°C a – 0,25°C/s y 25°C mantenidos durante 1 minuto. Después de rehibridación, se trataron los productos con nucleasa SURVEYOR y estimulador S SURVEYOR (Transgenomics)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante y se analizaron sobre geles de poliacrilamida Novex TBE al 420% (Life Technologies). Se tiñeron los geles con tinción de ADN SYBR Gold (Life Technologies) durante 30 minutos y se formaron imágenes con un sistema de formación de imágenes de gel Gel Doc (Bio-rad). La cuantificación estuvo basada en intensidades de banda relativas.
Tabla E:
nombre del cebador
objetivo genómico secuencia del cebador (5' a 3')
Sp-EMX1-F
EMX1 AAAACCACCCTTCTCTCTGGC
Sp-EMX1-R
EMX1 imagen398
Sp-PVALB-F
PVALB CTGGAAAGCCAATGCCTGAC
Sp-PVALB-R
PVALB GGCAGCAAACTCCTTGTCCT
Identificación computacional de sitios fijados como objetivo de CRISPR únicos
Para identificar sitios fijados como objetivo únicos para la enzima SF370 Cas9 (SpCas9) de S. pyogenes en genoma de ser humano, ratón, rata, pez cebra, mosca de la fruta y C. elegans, se desarrolló un paquete informático para escanear ambas hebras de una secuencia de ADN e identificar todos los posibles sitios objetivo de SpCas9. Para este ejemplo, cada sitio objetivo SpCas9 se definió operacionalmente como una secuencia de 20 pb seguido por una secuencia de unidad adyacente del protoespaciador (PAM) de NGG y se identificaron todas las secuencias que satisfacían esta definición de 5'-N20-NGG-3' en todos los cromosomas. Para evitar la edición de genoma no específica, después de identificar todos los sitios potenciales, se filtraron todos los sitios objetivo basándose en el número de veces que aparecían en el genoma de referencia relevante. Para sacar provecho de la especificidad de la secuencia de la actividad de Cas9 conferida por una secuencia "simiente", que puede ser, por ejemplo, secuencia 5' de aproximadamente 11-12 pb de la secuencia PAM, se seleccionaron secuencias 5'-NNNNNNNNNN-NGG-3' para que fueran únicas en el genoma relevante. Todas las secuencias genómicas se descargaron de UCSC Genome Browser (genoma humano hg19, genoma de ratón mm9, genoma de rata m5, genoma de pez cebra danRer7, genoma dm4 de D. melanogaster y genoma ce10 de C. elegans). Los resultados de la investigación completa están disponibles para navegar usando la información de UCSC Genome Browser. Una visualización de ejemplo de algunos sitios objetivo en el genoma humano se proporciona en la Figura 22.
Inicialmente, se fijaron como objetivo tres sitios dentro del sitio de EMX1 en células HEK 293FT humanas. Se evaluó la eficacia de la modificación del genoma de cada ARNqui usando el ensayo de la nucleasa SURVEYOR, que detecta mutaciones que resultan de las roturas de la doble cadena de ADN (las RDC) y su posterior reparación por la ruta de reparación de daños de ADN de unión del extremo no homólogo (NHEJ). Las construcciones designadas ARNqui(+n) indican que hasta el nucleótido +n de ARNtracr de tipo natural se incluye en la construcción de ARN quimérico, con valores de 48, 54, 67 y 85 usados para n. Los ARN quiméricos que contienen fragmentos mayores de ARNtracr de tipo natural (ARNqui (+67) y ARNqui (+85)) mediaron la escisión de ADN en los tres sitios objetivo de EMX1, demostrando ARNqui (+85) en particular niveles significativamente mayores de escisión de ADN que los correspondientes híbridos ARNcr/ARNtracr que expresaron secuencias guía y tracr en transcritos separados (Figuras 10b y 10a). También se fijaron como objetivo dos sitios en el sitio PVALB que no proporcionaron escisión detectable usando el sistema híbrido (secuencia guía y secuencia tracr expresadas como transcritos separados) usando ARNquis. ARNqui(+67) y ARNqui(+85) fueron capaces de mediar escisión significativa en los dos protoespaciadores PVALB (Figuras 10c y 10b).
Para los cinco objetivos en los EMX1 y PVALB, se observó un incremento consistente en la eficacia de modificación del genoma con longitud creciente de la secuencia tracr. Sin desear estar limitados por ninguna teoría, la estructura secundaria formada por el extremo 3' de la ARNtracr puede desempeñar una función en la activación de la tasa de formación de complejo CRISPR. Una ilustración de las estructuras secundarias previstas para cada uno de los ARN quiméricos usados en este ejemplo se proporciona en la Figura 21. Se predijo la estructura secundaria usando ARNfold (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi) usando energía libre mínima y algoritmo de función de partición. El pseudocolor para cada base (reproducido en escala de grises) indica la probabilidad de emparejamiento. Debido a que los ARNquis con secuencias tracr más largas eran capaces de escindir objetivos que no eran escindidos por híbridos ARNcr/ARNtracr de CRISPR naturales, es posible que se pueda cargar ARN quimérico en Cas9 más eficazmente que su contrapartida híbrida natural. Para facilitar la aplicación de Cas9 para edición de genoma específica del sitio en células y organismos eucariotas, todos los sitios objetivo únicos previstos para la Cas9 de S. pyogenes se identificaron de manera computacional en los genomas del ser humano, ratón, rata, pez cebra, C. elegans y D. melanogaster. Se pueden diseñar ARN quiméricos para enzimas Cas9 de otros microbios para expandir el espacio fijado como objetivo de las nucleasas programables de ARN de CRISPR.
imagen399
Las Figuras 11 y 21 ilustran vectores de expresión bicistrónicos ejemplares para expresión de ARN quimérico incluyendo hasta el nucleótido +85 de secuencia de ARNtracr de tipo natural y SpCas9 con secuencias de 5 localización nuclear. SpCas9 se expresa a partir de un activador CBh y termina con la señal poliA bGH (bGH pA). La secuencia expandida ilustrada inmediatamente debajo del esquema corresponde a la región que rodea al sitio de inserción de la secuencia guía e incluye, desde 5' a 3', la porción 3' del activador U6 (primera región sombreada), sitios de escisión BbsI (flechas), repetición directa parcial (secuencia de emparejamiento tracr GTTTTAGAGCTA, subrayada), secuencia lazo GAAA y secuencia tracr +85 (secuencia subrayada después de la secuencia lazo). Un
10 inserto de la secuencia guía ejemplar se ilustra debajo del sitio de la inserción de la secuencia guía, con nucleótidos de la secuencia guía para un objetivo seleccionado representado por una "N".
Las secuencias descritas en los ejemplos anteriores son como sigue (las secuencias de polinucleótidos son 5’ a 3’):
ARNtracr corto U6 (Streptococcus pyogenes SF370):
imagen400
ARNtracr largo U6 (Streptococcus pyogenes SF370):
imagen401
imagen402
20 U6-DR-BbsI cadena principal-RD (Streptococcus pyogenes  
imagen403
U6-ARN quimérico-Cadena principal BbsI (Streptococcus pyogenes SF370) NLS-SpCas9-EGFP:
imagen404
imagen405
SpCas9-EGFP-NLS: NLS-SpCas9-EGFP-NLS: NLS-SpCas9-NLS:
imagen406
imagen407
imagen408
NLS-mCherry-SpRNasa3:
imagen409
SpRNasa3-mCherry-NLS: NLS-SpCas9n-NLS (la mutación de nickasa D10A es minúscula):
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imagen411
hEMX1-Plantilla RH-HindII-NheI: NLS-StCsn1-NLS:
imagen412
imagen413
imagen414
U6-St_ARNtracr(7-97):
imagen415
U6-RD-espaciador-RD(S. pyogenes SF370)
imagen416
imagen417
(subrayado minúsculas = repetición directa; N = secuencia guía; negrita = terminador)
ARN quimérico que contiene +48 ARNtracr (S. pyogenes SF370)
10 gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatat tagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaactt gaaagtatttcgafftettggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttaga gctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccg (N = secuencia guía; primer subrayado = secuencia de emparejamiento tracr; segundo subrayado = secuencia tracr; negrita = terminador)
15 ARN quimérico que contiene +54 ARNtracr (S. pyogenes SF370) gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatat tagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaactt gaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttaga gctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaTTTTTTTT (N = secuencia guía; primer subrayado = secuencia de
20 emparejamiento tracr; segundo subrayado = secuencia tracr; negrita = terminador) ARN quimérico que contiene +67 ARNtracr (S. pyogenes SF370) gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatat tagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaactt gaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttaga
imagen418
5 gctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtgTTTTTTT (N = secuencia guía; primer subrayado = secuencia de emparejamiento tracr; segundo subrayado = secuencia tracr; negrita = terminador)
ARN quimérico que contiene +85 ARNtracr (S. pyogenes SF370) gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatat tagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaactt
10 gaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttaga gctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcTTTTTTT (N = secuencia guía; primer subrayado = secuencia de emparejamiento tracr; segundo subrayado = secuencia tracr; negrita = terminador)
imagen419
imagen420
imagen421
imagen422
ARN quimérico de ejemplo para S. thermophilus LMD-9 CRISPR1 Cas9 (con PAM de NNAGAAW) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaagatttaGAAAtaaatcttgcagaagctacaaagataaggctt catgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT (N = secuencia guía; primer subrayado = secuencia
5 de emparejamiento tracr; segundo subrayado = secuencia tracr; negrita = terminador)
ARN quimérico de ejemplo para S.  LMD-9 CRISPR1 Cas9 (con PAM de NNAGAAW) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatca acaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT (N = secuencia guía; primer subrayado = secuencia de emparejamiento tracr; segundo subrayado = secuencia tracr; negrita = terminador)
10 ARN quimérico de ejemplo para S. thermophilus LMD-9 CRISPR1 Cas9 (con PAM de NNAGAAW) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatca acaccctgtcattttatggcagggtgtTTTTTT (N = secuencia guía; primer subrayado = secuencia de emparejamiento tracr; segundo subrayado = secuencia tracr; negrita = terminador)
ARN quimérico de ejemplo para S. thermophilus LMD-9 CRISPR1 Cas9 (con PAM de NNAGAAW)
15 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttattgtactctcaagatttaGAAAtaaatcttgcagaagctacaaagataaggctt catgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT (N = secuencia guía; primer subrayado = secuencia de emparejamiento tracr; segundo subrayado = secuencia tracr; negrita = terminador) 58
imagen423
ARN quimérico de ejemplo para S. thermophilus LMD-9 CRISPR1 Cas9 (con PAM de NNAGAAW) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttattgtactctcaGAAAtgcagaaectacaaagataaggcttcatgccgaaatc aacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT (N = secuencia guía; primer subrayado = secuencia de emparejamiento tracr; segundo subrayado = secuencia tracr; negrita = terminador)
5 ARN quimérico de ejemplo para S. thermophilus LMD-9 CRISPR1 Cas9 (con PAM de NNAGAAW) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttattgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatc aacaccctgtcattttatggcagggtgtTTTTTT (N = secuencia guía; primer subrayado = secuencia de emparejamiento tracr; segundo subrayado = secuencia tracr; negrita = terminador)
ARN quimérico de ejemplo para S. thermophilus LMD-9 CRISPR1 Cas9 (con PAM de NNAGAAW)
10 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttattgtactctcaagatttaGAAAtaaatcttgcagaagctacaatgataaggctt catgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT (N = secuencia guía; primer subrayado = secuencia de emparejamiento tracr; segundo subrayado = secuencia tracr; negrita = terminador)
ARN quimérico de ejemplo para S. thermophilus LMD-9 CRISPR1 Cas9 (con PAM de NNAGAAW) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttattgtactctcaGAAAtgcagaagctacaatgataaggcttcatgccgaaatca
15 acaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT (N = secuencia guía; primer subrayado = secuencia de emparejamiento tracr; segundo subrayado = secuencia tracr; negrita = terminador)
ARN quimérico de ejemplo para S. thermophilus LMD-9 CRISPR1 Cas9 (con PAM de NNAGAAW) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttattgtactctcaGAAAtgcagaagctacaatgataasscttcatgccgaaatca acaccctgtcattttatggcagggtgtTTTTTT (N = secuencia guía; primer subrayado = secuencia de emparejamiento tracr;
20 segundo subrayado = secuencia tracr; negrita = terminador)
ARN quimérico de ejemplo para S. thermophilus LMD-9 CRISPR3 Cas9 (con PAM de NGGNG) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctgtgGAAAcacagcgagttaaaataaggcttagtccgtactcaactt gaaaaggtggcaccgattcggtgtTTTTTT (N = secuencia guía; primer subrayado = secuencia de emparejamiento tracr; segundo subrayado = secuencia tracr; negrita = terminador)
25 Versión codón-optimizada de Cas9 de sitio CRISPR3 LMD-9 de S. thermophilus (con una NLS en ambos extremos
imagen424
imagen425
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Ejemplo 5: Optimización del ARN guía para Cas9 de Streptococcus pyogenes (referido como SpCas9).
5 Los solicitantes mutaron las secuencias ARNtracr y de repetición directa o mutaron el ARN guía quimérico para activar los ARN en las células.
La optimización se basa en la observación de que hay tramos de timinas (Ts) en la ARNtracr y ARN guía, que podía conducir a terminación de la transcripción temprana por el activador Pol 3. Por lo tanto los Solicitantes generaron las siguientes secuencias optimizadas. ARNtracr optimizada y la repetición directa optimizada correspondiente se
10 presentan en parejas.
ARNtracr optimizado 1 (mutación subrayada):
imagen427
GGAACCATTCAtAACAGCATAGCAAGTTAtAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAA AAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTT Repetición directa optimizada 1 (mutación subrayada): GTTaTAGAGCTATGCTGTTaTGAATGGTCCCAAAAC
5 ARNtracr optimizado 2 (mutación subrayada): GGAACCATTCAAtACAGCATAGCAAGTTAAtATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAA AAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTT Repetición directa optimizada 2 (mutación subrayada): GTaTTAGAGCTATGCTGTaTTGAATGGTCCCAAAAC
10 Los solicitantes también optimizaron el ARN guía quimérico para actividad óptima en células eucariotas. ARN guía original :
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Secuencia de ARN guía quimérico optimizado 1:
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15 Secuencia de ARN guía quimérico optimizado 2:
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Secuencia de ARN guía quimérico optimizado 3:
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Los solicitantes mostraron que el ARN guía quimérico optimizado funciona mejor como se indica en la Figura 9. El
20 experimento se realizó por co-transfección de células 293FT con Cas9 y una casete de ADN ARN guía U6 para expresar una de las cuatro formas de ARN mostradas anteriormente. El objetivo del ARN guía es el mismo sitio objetivo en el lugar Emx1 humano: "GTCACCTCCAATGACTAGGG"
Ejemplo 6: Optimización de Cas9 CRISPR1 LMD-9 de Streptococcus thermophilus (referido como StlCas9).
Los solicitantes diseñaron los ARN quiméricos guía como se muestra en la Figura 12.
25 Los ARN guía de StlCas9 pueden experimentar el mismo tipo de optimización que para los ARN guía SpCas9, por rotura de los tramos de poli timinas (Ts).
Ejemplo 7: Mejora del sistema Cas9 para aplicación in vivo
Los solicitantes realizaron una búsqueda Metagenómica para un Cas9 con un peso molecular pequeño. La mayoría de los homólogos de Cas9 fue bastante grande. Por ejemplo el SpCas9 tiene alrededor de 1368aa de largo, que es demasiado largo para ser empaquetado fácilmente en vectores víricos para suministro. Algunas de las secuencias puede que se hayan desanotado y por lo tanto la frecuencia exacta para cada longitud puede no ser necesariamente precisa. Sin embargo, proporciona un atisbo de la distribución de proteínas Cas9 y sugiere que hay homólogos de Cas9 más cortos.
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Por análisis computacional, los solicitantes encontraron que en la cepa bacteriana Campylobacter, hay dos proteínas Cas9 con menos de 1.000 aminoácidos. La secuencia para una Cas9 de Campylobacter jejuni se presenta a continuación. A esta longitud, CjCas9 se puede empaquetar fácilmente en AAV, lentivirus, Adenovirus, y otros vectores víricos para suministro robusto en células primarias e in vivo en modelos de animales.
Cas9 de Campylobacter jejuni (CjCas9)
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El elemento de ARNtracr putativo para esta CjCas9 es:
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La secuencia de repetición directa es:
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15 La estructura co-plegada del ARNtracr y repetición directa se proporciona en la Figura 6. Un ejemplo de un ARN guía quimérico para CjCas9 es:
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Los solicitantes también optimizaron ARN guía de Cas9 usando métodos in vitro. La Figura 18 muestra datos de la optimización de ARN guía quimérico St1Cas9 in vitro.
20 Aunque se han presentado realizaciones preferidas de la presente invención y se han descrito en la presente memoria, será evidente para los expertos en la materia que tales realizaciones se proporcionan como ejemplo solamente. Ahora tendrán lugar numerosas variaciones, cambios y sustituciones para los expertos en la materia sin apartarse de la invención. Se debería entender que se pueden emplear en la práctica de la invención diversas alternativas a las realizaciones de la invención descritas en la presente memoria. Se desea que las siguientes
25 reivindicaciones definan el alcance de la invención y que los métodos y las estructuras dentro del alcance de las reivindicaciones y sus equivalentes estén cubiertos de ese modo.
Ejemplo 8: Optimización de ARNsg Sa Los solicitantes diseñaron cinco variantes de ARNsg para SaCas9 para una arquitectura truncada óptima con la mayor eficacia de escisión. Además, se ensayó el sistema dúplex tracr:repetición directa natural junto a los ARNsg. Se transfectaron conjuntamente guías con longitudes indicadas con SaCas9 y se ensayaron en células HEK 293FT para la actividad. Se transfectaron conjuntamente un total de 100 ng de amplicon U6-PCR de ARNsg (o 50 ng de repetición directa y 50 ng de ARNtracr) y 400 ng de plásmido de SaCas9 en 200.000 hepatocitos de ratón Hepa1-6 y se recogió el ADN en 72 horas post -transfección para análisis SURVEYOR. Los resultados se presentan en la Fig.
imagen437
23.
REFERENCIAS
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imagen440
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Aunque se han presentado realizaciones preferidas de la presente invención y se han descrito en la presente memoria, será evidente para los expertos en la materia que tales realizaciones se proporcionan como ejemplo solamente. Ahora tendrán lugar numerosas variaciones, cambios y sustituciones para los expertos en la materia sin
5 apartarse de la invención. Se debería entender que se pueden emplear diversas alternativas a las realizaciones de la invención descritas en la presente memoria en la práctica de la invención.
Se definen aspectos adicionales de la descripción en las siguientes cláusulas numeradas.
1. Una composición que no está presente en la naturaleza o de ingeniería que comprende:
A) una secuencia de polinucleótidos de ARN quimérico (ARNqui) del sistema CRISPR-Cas, en el que la secuencia 10 de polinucleótidos comprende
(a)
una secuencia guía capaz de hibridizar una secuencia fijada como objetivo en una célula eucariota,
(b)
una secuencia de emparejamiento tracr y
(c)
una secuencia tracr
en la que (a), (b) y (c) se disponen en una orientación 5' a 3', 67
imagen442
en la que cuando se transcribe, la secuencia de emparejamiento tracr se hibrida a la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica de la secuencia de un complejo CRISPR a la secuencia objetivo,
en la que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida a la secuencia objetivo y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a la secuencia tracr,
o
B) un sistema de enzima CRISPR, en el que el sistema está codificado por un sistema vector que comprende uno o más vectores que comprenden
I. un primer elemento regulador unido de manera operable a una secuencia de polinucleótidos de ARN quimérico (ARNqui) del sistema CRISPR-Cas, en el que la secuencia de polinucleótidos comprende
(a)
una o más secuencias guía capaces de hibridar una o más secuencias objetivo en una célula eucariota,
(b)
una secuencia de emparejamiento tracr y
(c)
una o más secuencias tracr y
II. un segundo elemento regulador unido de manera operable a una secuencia codificadora de enzima que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de localización nuclear, en la que (a), (b) y (c) se disponen en una orientación 5’ a 3’,
en la que los componentes I y II se sitúan en los mismos vectores del sistema o diferentes, en la que cuando se transcribe, la secuencia de emparejamiento tracr se hibrida a la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica de la secuencia de un complejo CRISPR a la secuencia objetivo,
en la que el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida a la secuencia objetivo y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a la secuencia tracr,
o C) un sistema de enzima CRISPR multiplexado, en la que el sistema se codifica mediante un sistema vector que comprende uno o más vectores que comprenden
I. un primer elemento regulador unido de manera operable a una secuencia de polinucleótidos de ARN quimérico (ARNqui) del sistema CRISPR-Cas, en el que la secuencia de polinucleótidos comprende
(a)
una o más secuencias guía capaces de hibridar una o más secuencias objetivo en una célula eucariota,
(b)
una secuencia de emparejamiento tracr, y
(c)
una o más secuencias tracr, y
II. un segundo elemento regulador unido de manera operable a una secuencia codificadora de enzima que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de localización nuclear, en la que (a), (b) y (c) se disponen en una orientación 5’ a 3’,
en la que los componentes I y II se sitúan en los mismos vectores del sistema o diferentes, en la que cuando se transcribe, la secuencia de emparejamiento tracr se hibrida a la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica de la secuencia de un complejo CRISPR a la secuencia objetivo,
en la que el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida a la secuencia objetivo y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a la secuencia tracr, en la que se utilizan secuencias de polinucleótidos de ARNqui en el sistema multiplexado o D) un sistema de enzima CRISPR multiplexado, en la que el sistema se codifica mediante un sistema vector que comprende uno o más vectores que comprenden
I. un primer elemento regulador unido de manera operable a
(a)
una o más secuencias guía capaces de hibridar una secuencia objetivo en una célula y
(b)
al menos una o más secuencias de emparejamiento tracr,
imagen443
II. un segundo elemento regulador unido de manera operable a una secuencia codificadora de enzima que codifica una enzima CRISPR y
III. un tercer elemento regulador unido de manera operable a una secuencia tracr,
en la que los componentes I, II y III se sitúan en los mismos vectores del sistema o diferentes,
en la que cuando se transcribe, la secuencia de emparejamiento tracr se hibrida a la secuencia tracr y la secuencia guía dirige la unión específica de la secuencia de un complejo CRISPR a la secuencia objetivo,
en la que el complejo CRISPR comprende la enzima CRISPR complejada con (1) la secuencia guía que se hibrida a la secuencia objetivo y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a la secuencia tracr y
en la que en el sistema multiplexado se usan múltiples secuencias guía y una secuencia tracr única;
y
en la que, en la secuencia del polinucleótido de A), o en el sistema de B), C) o D), se modifican una o más de las secuencias guía, tracr y de emparejamiento tracr, para mejorar la estabilidad.
2.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la cláusula 1, en el que la modificación comprende una estructura secundaria de ingeniería.
3.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la cláusula 1 o la cláusula 2, en el que la modificación comprende una reducción en una región de hibridación entre la secuencia de emparejamiento tracr y la secuencia tracr.
4.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier cláusula precedente en el que la modificación comprende condensar la secuencia de emparejamiento tracr y la secuencia tracr mediante un lazo artificial.
5.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier cláusula precedente en el que la modificación comprende que la secuencia tracr tenga una longitud comprendida entre 40 y 120 pb.
6.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier cláusula precedente en el que la secuencia tracr está comprendida entre 40 pb y la longitud completa de tracr.
7.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier cláusula precedente, en el que la secuencia tracr incluye al menos los nucleótidos 1-67 del ARNtracr de tipo natural correspondiente.
8.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier cláusula precedente, en el que la secuencia tracr incluye al menos los nucleótidos 1-85 del ARNtracr de tipo natural correspondiente.
9.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier cláusula precedente, en el que la secuencia tracr comprende los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 1-67 del ARNtracr de Cas9 de S. pyogenes de tipo natural.
10.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier cláusula precedente, en el que la secuencia tracr comprende los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 1-85 del ARNtracr de Cas9 de S. pyogenes de tipo natural.
11.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la cláusula 9, en el que la secuencia tracr consiste esencialmente en los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 1-67 del ARNtracr de Cas9 de S. pyogenes de tipo natural.
12.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la cláusula 10, en el que la secuencia tracr consiste esencialmente en los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 1-85 del ARNtracr de Cas9 de S. pyogenes de tipo natural.
13.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier cláusula precedente, en el que la modificación comprende la optimización de la secuencia.
14.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la cláusula 13, en el que la modificación comprende la reducción en las secuencias de poliT en la secuencia tracr y/o de emparejamiento tracr.
15.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la cláusula 14, en el que una o más T presentes en una secuencia de poliT de la secuencia de tipo natural relevante se han sustituido con un nucleótido que no es T.
16.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la cláusula 13,14 o 15, en el que la secuencia modificada no comprende ninguna secuencia de poliT que tenga más de cuatro T contiguas.
imagen444
17 . El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier cláusula precedente, en el que la modificación comprende añadir una secuencia terminadora de poliT.
18.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la cláusula 17, en el que la modificación comprende añadir una secuencia terminadora de poliT en las secuencias tracr y/o de emparejamiento tracr.
19.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la cláusula 17 o 18, en el que la modificación comprende añadir una secuencia terminadora de poliT en la secuencia guía.
20.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier cláusula precedente, en el que la modificación comprende alterar lazos y/u horquillas.
21.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la cláusula 20, en el que la modificación comprende proporcionar como mínimo dos horquillas en la secuencia guía.
22.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la cláusula 20 o 21, en el que la modificación comprende proporcionar una horquilla formada mediante la complementación entre la secuencia tracr y de emparejamiento de tracr.
23.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la cláusula 20 o 22, donde la modificación comprende proporcionar una o más horquillas adicionales en el extremo 3’ de la secuencia de ARNtracr.
24.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la cláusula 20-23, en el que la modificación comprende proporcionar una o más horquillas adicionales añadidas a la parte 3’ de la secuencia guía.
25.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier cláusula precedente, en el que la modificación comprende extender el extremo 5’ de la secuencia guía.
26.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la cláusula 25, en el que la modificación comprende proporcionar una o más horquillas en el extremo 5’ de la secuencia guía.
27.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la cláusula 25 o 26, donde la modificación comprende unir la secuencia (5’-AGGACGAAGTCCTAA) al extremo 5’ de la secuencia guía.
28.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier cláusula precedente, en el que la modificación comprende proporcionar unión cruzada o proporcionar uno o más nucleótidos modificados en la secuencia de polinucleótidos.
29.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la reivindicación 28, en el que los nucleótidos modificados se proporcionan en cualquiera o en todas las secuencias tracr, de emparejamiento tracr y/o guía y/o en la secuencia codificadora de enzimas y/o en secuencias de vectores.
30.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la cláusula 28 o 29, en el que proporcionar nucleótidos modificados comprende la inclusión de al menos un nucleótido que no se encuentra en la naturaleza o un nucleótido modificado o análogos de los mismos.
31.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la cláusula 30, en el que los nucleótidos
modificados se modifican en el resto ribosa, fosfato y/o base.
32.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la cláusula 30, en el que el nucleótido modificado se selecciona del grupo constituido por 2'-O-metil-análogos, 2'-desoxi-análogos o 2'-fluoro-análogos.
33.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de la cláusula 30, en el que el nucleótido modificado se selecciona del grupo constituido por 2-aminopurina, 5-bromo-uridina, pseudouridina, inosina, 7metilguanosina.
34.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier cláusula precedente, en el que la modificación comprende dos horquillas.
35.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier cláusula precedente, en el que la modificación comprende tres horquillas.
36.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier cláusula precedente, en el que la modificación comprende como mucho cinco horquillas.
37.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier cláusula precedente, en el que la enzima CRISPR es una enzima del sistema CRISPR de tipo II.
38.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier cláusula precedente, en el que la enzima CRISPR es una enzima Cas9.
39.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier cláusula precedente, en el que la enzima CRISPR comprende menos de mil aminoácidos.
40.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquiera de las cláusulas 1-38, en el que la enzima CRISPR comprende menos de cuatro mil aminoácidos.
41.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier cláusula precedente en el que la enzima Cas9 es StCas9 o St1Cas9.
42.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier cláusula precedente, en el que la enzima Cas9 es una enzima Cas9 procedente de un organismo seleccionado del grupo que comprende los géneros Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus,  , Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium o Corynebacter.
43.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier cláusula precedente, en el que la enzima CRISPR es una nucleasa que dirige la escisión de ambas hebras en la posición de la secuencia objetivo.
44.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier cláusula precedente, en el que el primer elemento regulador es un activador de la polimerasa III.
45.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier cláusula precedente, en el que el segundo elemento regulador es un activador de la polimerasa II.
46.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier cláusula precedente, en el que la secuencia guía comprende al menos quince nucleótidos.
47.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquier cláusula precedente, en el que la modificación comprende ARN de secuencia tracr optimizada y/o de secuencia guía optimizada y/o estructura coplegada de secuencia tracr y/o secuencia o secuencias de emparejamiento tracr y/o estructuras secundarias estabilizantes de secuencia tracr y/o secuencia tracr con una región reducida de emparejamiento de bases y/o elementos de ARN condensados de secuencia tracr; y/o en el sistema multiplexado hay dos ARN que comprenden un trazador y que comprenden una pluralidad de guías o ARN que comprende una pluralidad de quimeras.
48.
El ARNqui del sistema CRISPR-Cas o sistema de enzima CRISPR de cualquiera de las cláusulas 1-47, en el que la enzima CRISPR es codón-optimizada para la expresión en una célula eucariota.
49.
La composición de cualquier cláusula precedente, en la que la composición comprende una secuencia de polinucleótidos del ARN quimérico (ARNqui) del sistema CRISPR-Cas.
50.
La composición de la cláusula 49, en la que la composición comprende además una secuencia de polinucleótidos que codifica una enzima CRISPR que comprende al menos una o más secuencias de localización nuclear.
51.
El sistema de enzima CRISPR de cualquier cláusula precedente.
52.
El sistema de enzima CRISPR multiplexado de cualquier cláusula precedente.
53.
El producto de la transcripción o traducción de la composición de la cláusula 49 o 50, el sistema de enzima CRISPR de la cláusula 51 o el sistema de enzima CRISPR multiplexado de la cláusula 52.
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imagen446

Claims (19)

  1. imagen1
    REIVINDICACIONES
    1. Un sistema vector relacionado con Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas (CRISPR)-CRISPR asociado a (Cas) (CRISPR-Cas) de ingeniería, que no está presente en la naturaleza, que comprende uno o más vectores que comprenden:
    a) un primer elemento regulador unido de manera operable a una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de polinucleótidos del sistema CRISPR-Cas que comprende una secuencia guía, un ARNtracr y una secuencia de emparejamiento tracr, en la que la secuencia guía se hibrida con una o más secuencias objetivo en los sitios de los polinucleótidos en una célula eucariota,
    b) un segundo elemento regulador unido de manera operable a la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cas9 de Tipo II,
    c) una plantilla de recombinación
    en el que los componentes (a), (b) y (c) están situados en los mismos vectores o diferentes vectores del sistema,
    en el que el sistema comprende además una o más señales de localización nuclear (las NLS) expresadas con la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Cas9,
    según lo cual la secuencia guía fija como objetivo uno o más sitios de polinucleótidos en una célula eucariota y la proteína Cas9 escinde uno o más sitios de polinucleótidos, según lo cual se modifica la secuencia de uno o más sitios de polinucleótidos.
  2. 2. Un sistema vector CRISPR-Cas de tipo II de ingeniería, que no está presente en la naturaleza de acuerdo con la reivindicación 1,
    en el que en el que la proteína Cas9 está mutada con respecto a la proteína Cas9 de tipo natural correspondiente de manera que la proteína mutada es una nickasa que carece de capacidad para escindir una hebra de un polinucleótido objetivo,
    según lo cual la secuencia guía fija como objetivo uno o más sitios de polinucleótidos en una célula eucariota y la proteína Cas9 solo escinde una hebra de los sitios de polinucleótidos, según lo cual se modifica la secuencia de uno
    o más sitios de polinucleótidos.
  3. 3.
    El sistema de la reivindicación 2, en el que la proteína Cas9 comprende una o más mutaciones en los dominios catalíticos RuvC I, RuvC II o RuvC III.
  4. 4.
    El sistema de la reivindicación 2, en el que la proteína Cas9 comprende una mutación seleccionada del grupo que consiste en D10A, H840A, N854A y N863A con referencia a la numeración de la posición de una proteína Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9).
  5. 5.
    El sistema de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la plantilla de recombinación (c) está contenida en un vector separado de los componentes (a) y (b).
  6. 6.
    El sistema de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la plantilla de recombinación (c) es un componente de un vector que comprende el componente (a) y/o (b).
  7. 7.
    El sistema de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que los componentes (a) y (b) son componentes del mismo vector.
  8. 8.
    El sistema de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la plantilla de recombinación es complementaria a una porción de un polinucleótido que comprende la secuencia objetivo.
  9. 9.
    El sistema de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el sistema CRISPR-Cas comprende dos o más señales de localización nuclear expresadas con la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Cas9.
  10. 10.
    El sistema de la reivindicación 9, en el que al menos una NLS está en o cerca del término amino de la proteína Cas9 y/o al menos una NLS está en o cerca del término carboxi de la proteína Cas9.
  11. 11.
    El sistema de la reivindicación 10, en el que al menos una NLS está en o cerca del término amino de Cas9 y al menos una NLS está en o cerca del término carboxi de la proteína Cas9.
  12. 12.
    El sistema de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los vectores son vectores víricos.
    188
    imagen2
  13. 13. El sistema de la reivindicación 12, en el que los vectores víricos son vectores víricos retrovíricos, lentivíricos, 5 adenovíricos, adenoasociados o de herpes simple.
  14. 14.
    El sistema de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la secuencia de polinucleótidos del sistema CRISPR-Cas comprende una secuencia guía condensada con una secuencia cr de activación trans (tracr).
  15. 15.
    El sistema de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la secuencia de polinucleótidos del
    sistema CRISPR-Cas es un ARN quimérico que comprende la secuencia guía, la secuencia tracr y una secuencia de 10 emparejamiento tracr.
  16. 16.
    El sistema de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la célula eucariota es una célula de mamífero o una célula humana.
  17. 17.
    El sistema de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína Cas9 es codón-optimizada para la expresión en una célula eucariota.
    15 18. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la guía incluye una secuencia tracr con una longitud de 50 o más nucleótidos.
  18. 19. El uso del sistema de cualquiera de las reivindicaciones 1-18 para la ingeniería de genomas, siempre que el uso no comprenda un procedimiento para modificar la identidad genética de la línea germinal de seres humanos y siempre que dicho uso no sea un método para tratamiento del cuerpo humano o de un animal por cirugía o terapia.
    20 20. El uso del sistema de cualquiera de las reivindicaciones 1-18 en la producción de un animal transgénico no humano o una planta transgénica.
  19. 21. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones 1-18 para su uso en la terapia génica o edición genómica.
    189
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