ES2576128T3 - Modificación por tecnología genética y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias con dominios funcionales - Google Patents

Abstract

Una composición que se produce de forma no natural o que se produce mediante ingeniería genética, que comprende: un sistema de suministro operativamente configurado para suministrar componentes de un complejo CRISPR-Cas o secuencias de polinucleótidos que comprenden o codifican dichos componentes en una célula eucariota, en donde dicho complejo CRISPR-Cas es operativo en la célula eucariota; I. una o más secuencias de polinucleótidos de complejo CRISPR-Cas que comprenden o codifican la expresión en la célula eucariota: (a) una secuencia guía capaz de hibridarse a una secuencia diana en una célula eucariota, (b) una secuencia de emparejamiento tracr, y (c) una secuencia tracr, y II. una enzima CRISPR que comprende uno o más dominios funcionales heterólogos o un polinucleótido que codifica una enzima de CRISPR que comprende uno o más dominios funcionales heterólogos para la expresión en la célula eucariota; en donde la secuencia de emparejamiento tracr se hibrida a la secuencia tracr, la secuencia guía dirige la unión específica para la secuencia de un complejo de CRISPR a la secuencia diana, el complejo de CRISPR comprende la enzima de CRISPR formando complejo con (1) la secuencia guía que se hibrida a la secuencia diana, y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida con la secuencia tracr, la enzima CRISPR comprende una o más mutaciones, de manera que la enzima tiene actividad de nucleasa alterada en comparación con la enzima de tipo salvaje, en donde los uno o más dominios funcionales heterólogos comprende una o más Señales de Localización Nuclear NLS(s).

Description

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DESCRIPCION

Modificacion por tecnologfa genetica y optimizacion de sistemas, metodos y composiciones para la manipulacion de secuencias con dominios funcionales

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invencion se refiere, en general, a la modificacion por tecnologfa genetica y la optimizacion de sistemas, metodos y composiciones utilizados para el control de la expresion genica que implican la focalizacion de la secuencia, tales como la perturbacion del genoma o la edicion de genes, que se refieren a Repeticiones Palindromicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas (CRISPR) y componentes de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Recientes progresos en las tecnicas de secuenciacion del genoma y metodos de analisis han acelerado significativamente la capacidad para catalogar y mapear factores geneticos asociados con una diversa gama de funciones biologicas y enfermedades. Se necesitan tecnologfas de focalizacion del genoma, precisas para permitir una modificacion por tecnologfa genetica inversa sistematica de las variaciones geneticas causales, permitiendo una perturbacion selectiva de elementos geneticos individuales, asf como para avanzar en la biologfa de smtesis, biotecnologica y aplicaciones medicas. Aunque las tecnicas de edicion del genoma, tales como los dedos de zinc disenadores, efectores del tipo activador de la transcripcion (TALEs), o meganucleasas migratorias estan disponibles para la produccion de perturbaciones del genoma focalizado, sigue habiendo una necesidad de nuevas tecnologfas de la ingeniena del genoma que son asequibles, faciles de instalar, expansibles y susceptibles de fijar como objetivo multiples posiciones dentro del genoma eucariota.

SUMARIO DE LA INVENCION

El CRISPR/Cas o el sistema CRISPR-cas (ambos terminos se utilizan indistintamente a lo largo de toda esta solicitud) no requieren la generacion de protemas modificadas para fijar como objetivo secuencias diana espedficas, sino mas bien una sola enzima Cas puede ser programada por una molecula de ARN corta para reconocer una diana de ADN espedfica, en otras palabras, la enzima Cas puede ser reclutada a una diana de ADN espedfica utilizando dicha molecula de ARN corta. Anadiendo el sistema CRISPR-Cas al repertorio de tecnicas de secuenciacion del genoma y metodos de analisis puede simplificar significativamente la metodologfa y acelerar la capacidad de catalogar y mapear los factores geneticos asociados con una diversa gama de funciones biologicas y enfermedades. Para utilizar el sistema CRISPR-Cas de manera efectiva para la edicion del genoma sin efectos perjudiciales, es fundamental entender aspectos de la modificacion genetica y la optimizacion de estas herramientas de modificacion genetica del genoma, que son aspectos de la presente descripcion.

De acuerdo con la presente invencion se proporciona una composicion que no se produce de forma natural o generada por tecnologfa genetica de acuerdo con la reivindicacion 1. Aspectos adicionales de la invencion se describen en las reivindicaciones dependientes. La invencion tambien proporciona metodos y usos de la composicion, asf como celulas huesped eucariotas de acuerdo con las restantes reivindicaciones independientes. Cualesquiera aspectos que caen fuera del alcance de las reivindicaciones se proporcionan como descripcion.

Existe una necesidad urgente de sistemas y tecnicas, alternativos y robustos, para la focalizacion de la secuencia de direccion con una amplia gama de aplicaciones. Aspectos de esta invencion satisfacen esta necesidad y proporcionan ventajas relacionadas. Un complejo de CRISPR a modo de ejemplo puede comprender una enzima CRISPR que forma complejo con una secuencia grna hibridada con una secuencia diana dentro del polinucleotido diana. La secuencia grna esta enlazada a una secuencia de emparejamiento tracr que, a su vez, se hibrida a una secuencia tracr.

En un aspecto, la invencion se refiere a uno o mas elementos de un sistema CRISPR que tiene una funcionalidad mejorada o modificada. El complejo CRISPR de la invencion proporciona un medio eficaz para la modificacion de un polinucleotido diana. El complejo CRISPR de la invencion tiene una amplia diversidad de utilidades, incluyendo modificar (por ejemplo, suprimir, insertar, translocar, inactivar, activar) un polinucleotido diana en una multiplicidad de tipos de celulas. Como tal, el complejo CRISPR de la invencion tiene un amplio espectro de aplicaciones, p. ej., en la edicion del gen o genoma, la terapia genica, el descubrimiento de farmacos, la deteccion de farmacos, el diagnostico de enfermedades, y el pronostico. Un complejo CRISPR a modo de ejemplo puede comprender una enzima de CRISPR que forma complejo con una secuencia grna hibridada con una secuencia diana dentro del

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polinucleotido diana. La secuencia grna esta enlazada a una secuencia de emparejamiento tracr, que a su vez se hibrida a una secuencia tracr.

En algunas realizaciones, un sistema CRISPR/Cas puede comprender: (a) un primer elemento regulador enlazado operativamente a una secuencia de emparejamiento tracr y uno o mas sitios de insercion para insertar una o mas secuencias de grna aguas arriba de la secuencia de emparejamiento tracr, en donde, cuando se expresa, la secuencia grna dirige la union espedfica para la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia diana en una celula eucariota, en donde el complejo CRISPR puede comprender una enzima de CRISPR que forma complejo con (1) la secuencia grna que se hibrida a la secuencia diana y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a la secuencia de tracr; y (b) un segundo elemento regulador enlazado de forma operativa a una secuencia codificadora de la enzima que codifica dicha enzima CRISPR que puede comprender una secuencia de localizacion nuclear; en donde los componentes (a) y (b) estan situados en el mismo o en diferentes vectores del sistema. En algunas realizaciones, el componente (a) puede comprender, ademas, la secuencia tracr aguas abajo de la secuencia de emparejamiento tracr bajo el control del primer elemento regulador. En algunas realizaciones, el componente (a) puede comprender, ademas, dos o mas secuencias grna enlazadas operativamente al primer elemento regulador, en donde, cuando se expresan, cada una de las dos o mas secuencias grna dirigen la union espedfica para la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia diana diferente en una celula eucariota. En algunas realizaciones, el sistema puede comprender la secuencia de tracr bajo el control de un tercer elemento regulador tal como un promotor de polimerasa III. En algunas realizaciones, la secuencia de tracr exhibe al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de complementariedad de la secuencia a lo largo de la longitud de la secuencia de emparejamiento tracr cuando se alinean de manera optima. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR puede comprender una o mas secuencias de localizacion nuclear de una fuerza suficiente para impulsar la acumulacion de dicha enzima CRISPR en una cantidad detectable en el nucleo de una celula eucariota. Sin desear estar limitado por la teona, se cree que una secuencia de localizacion nuclear no es necesaria para la actividad de CRISPR en eucariotas, pero que la inclusion de tales secuencias aumenta la actividad del sistema. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es una enzima del sistema CRISPR tipo II. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es una enzima Cas9. En algunas realizaciones, la enzima Cas9 es Cas9 de S. pyogenes o S. thermophilus y puede incluir Cas9 mutada, derivada de uno de estos organismos. La enzima puede ser un homologo u ortologo de Cas9. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR esta optimizada en el codon para la expresion en una celula eucariota. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR dirige la escision de una o dos cadenas en la localizacion de la secuencia diana. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR carece de la actividad de escision de la cadena de ADN. En algunas realizaciones, el primer elemento regulador es un promotor de la polimerasa III. En algunas realizaciones, el segundo elemento regulador es un promotor de la polimerasa II. En algunas realizaciones, la secuencia grna es de al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 nucleotidos, o entre 10 y 30, o entre 15 y 25, o entre 15 y 20 nucleotidos de longitud. En general, y a lo largo de esta memoria, el termino ''vector" se refiere a una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico al que esta enlazada. Vectores incluyen, pero no se limitan a moleculas de acido nucleico que son de cadena sencilla, de doble cadena, o parcialmente de doble cadena; moleculas de acido nucleico que comprenden uno o mas extremos libres, sin extremos libres (p. ej., circulares); moleculas de acido nucleico que comprenden ADN, ARN, o ambos; y otras variedades de polinucleotidos conocidas en la tecnica. Un tipo de vector es un "plasmido", que se refiere a un bucle de ADN de doble cadena circular, en el que pueden insertarse segmentos adicionales de ADN, tal como mediante tecnicas de clonacion molecular estandares. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde secuencias de ADN o de ARN derivadas de virus estan presentes en el vector para el empaquetamiento en un virus (p. ej., retrovirus, retrovirus defectuosos en la replicacion, adenovirus, adenovirus defectuosos en la replicacion y virus adeno-asociados). Los vectores virales tambien incluyen polinucleotidos portados por un virus para la transfeccion en una celula huesped. Determinados vectores son capaces de replicacion autonoma en una celula huesped en la que se introducen (p. ej., vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicacion y vectores episomales de mairnferos). Otros vectores (p. ej., vectores no episornales de mai^eras) se integran en el genoma de una celula huesped tras la introduccion en la celula huesped, y con ello se replican junto con el genoma del huesped. Ademas de ello, determinados vectores son capaces de dirigir la expresion de genes a los que estan operativamente enlazados. A vectores de este tipo se les alude en esta memoria como "vectores de expresion". Vectores de expresion comunes de utilidad en tecnicas de ADN recombinante estan a menudo en forma de plasmidos.

Los vectores de expresion recombinante pueden comprender un acido nucleico de la invencion en una forma adecuada para la expresion del acido nucleico en una celula huesped, lo que significa que los vectores de expresion recombinante incluyen uno o mas elementos reguladores, que pueden seleccionarse sobre la base de las celulas huespedes a utilizar para la expresion, que estan operativamente ligadas a la secuencia de acido nucleico a expresar. Dentro de un vector de expresion recombinante, "operativamente ligada" pretende significar que la secuencia de nucleotidos de interes esta enlazada al o a los elementos reguladores de una manera que permita la expresion de la secuencia de nucleotidos (p. ej., en un sistema de transcripcion/traduccion in vitro o en una celula huesped cuando el vector se introduce en la celula huesped).

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La expresion "elemento regulador" pretende incluir promotores, potenciadores, sitios de entrada al ribosoma interno (IRES), y otros elementos de control de la expresion (p. ej., senales de terminacion de la transcripcion tales como senales de poliadenilacion y secuencias de poli-U). Elementos reguladores de este tipo se describen, por ejemplo, en Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Los elementos reguladores incluyen aquellos que dirigen la expresion constitutiva de una secuencia de nucleotidos en muchos tipos de celulas huespedes y aquellos que dirigen la expresion de la secuencia de nucleotidos solo en ciertas celulas huespedes (p. ej., secuencias reguladoras espedficas para el tejido). Un promotor espedfico para el tejido puede dirigir la expresion principalmente en un tejido de interes deseado tal como el musculo, neurona, hueso, piel, sangre, organos espedficos (p. ej., hngado, pancreas) o tipos de celulas particulares (p. ej., linfocitos). Los elementos reguladores tambien pueden dirigir la expresion de una manera dependiente del tiempo, tal como de una manera dependiente del ciclo celular o dependiente de la fase de desarrollo, que puede o puede no ser tambien ser espedfico para el tejido o tipo de celula. En algunas realizaciones, un vector puede comprender uno o mas promotores pol III (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5 o mas promotores pol III), uno o mas promotores pol II (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5 o mas promotores pol II), uno o mas promotores pol I (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5 o mas promotores pol I), o combinaciones de los mismos. Ejemplos de promotores pol III incluyen, pero no se limitan a promotores U6 y H1. Ejemplos de promotores pol II incluyen, pero no se limitan al promotor LTR del virus del sarcoma de Rous retroviral (RSV) (opcionalmente con el potenciador RSV), el promotor de citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con el potenciador CMV) [vease, p. ej., Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)], el promotor SV40, el promotor de dihidrofolato reductasa, el promotor p-actina, el promotor fosfoglicero1 quinasa (pGk) y el promotor EFI a. Tambien se incluyen en la expresion "elemento regulador" elementos potenciadores tales como WPRE; potenciadores de CMV; el segmento R-U5' en LTR de HTLV-1 (Mol. Cell. Biol., Vol. 8(1), pags. 466-472, 1988); potenciador de SV40; y la secuencia del intron entre los exones 2 y 3 de p-globina de conejo (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 78(3), pags. 1527-31, 1981). Se apreciara por los expertos en la tecnica que el diseno del vector de expresion puede depender de factores tales como la eleccion de la celula huesped a transformar, el nivel de expresion deseado, etc. Un vector puede introducirse en celulas huesped para de ese modo producir transcritos, protemas o peptidos, incluyendo protemas o peptidos de fusion, codificados por acidos nucleicos tal como se describe en esta memoria (p. ej., transcritos de repeticiones palindromicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR), protemas, enzimas, formas mutantes de los mismos, protemas de fusion de los mismos, etc.).

Aspectos de la invencion se refieren a metodos para mejorar o modificar la especificidad de la diana de una enzima de CRISPR (preferentemente una enzima Cas9) que puede comprender: a) seleccionar la enzima de CRISPR que tiene un tamano mas pequeno para un facil empaquetamiento en vectores de suministro; o b) generar enzimas de CRISPR quimericas; o c) utilizar enzimas de CRISPR mutadas (preferiblemente Cas9). Otros aspectos de la invencion tambien se refieren a metodos y composiciones para mejorar la especificidad de la diana que implica dos enzimas de CRISPR (doble nickase), mejorando la estructura qmmica de sgRNA haciendo mejora en otros componentes aparte de la grna ARN.

La invencion comprende una composicion que no se produce de forma natural o generada por tecnologfa genetica que comprende un sistema de vectores que puede comprender uno o mas vectores que comprende I. un primer elemento regulador enlazado operativamente a una secuencia de polinucleotidos de ARN quimerico (chiRNA) del sistema CRISPR/Cas, en el que la secuencia de polinucleotidos puede comprender (a) una secuencia grna capaz de hibridarse a una secuencia diana en una celula, (b) una secuencia de emparejamiento tracr, y (c) una secuencia tracr, y II. un segundo elemento regulador enlazado operativamente a una secuencia codificadora de la enzima que codifica una enzima de CRISPR que comprende al menos una o mas secuencias de localizacion nuclear, en donde

(a), (b) y (c) estan dispuestos en una orientacion 5' a 3', en donde los componentes I y II estan situados en el mismo o en diferentes vectores del sistema, en donde, cuando se transcribe, la secuencia de emparejamiento tracr se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia grna dirige la union, espedfica para la secuencia, de un complejo CRISPR a la secuencia diana, en donde el complejo CRISPR comprende la enzima de CRISPR que forma complejo con (1) la secuencia grna que se hibrida a la secuencia diana, y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida con la secuencia tracr, en donde la enzima de CRISPR puede comprender dos o mas mutaciones, de manera que la enzima tiene una actividad nucleasa alterada en comparacion con la enzima de tipo salvaje, y en donde la secuencia codificadora de la enzima codifica, ademas, uno o mas dominios funcionales heterologos.

La invencion comprende, ademas, una composicion de sistema de enzimas CRISPR de dos componentes multiplexado, que comprende un sistema de vectores que puede comprender uno o mas vectores que comprende I. un primer elemento regulador enlazado operativamente a una secuencia de polinucleotidos de ARN quimerico (chiRNA) del sistema CRISPR/Cas, en el que la secuencia de polinucleotidos comprende (a) una secuencia grna capaz de hibridarse a una secuencia diana en una celula, (b) una secuencia de emparejamiento tracr, y (c) una secuencia tracr, y II. un segundo elemento regulador enlazado operativamente a una secuencia codificadora de la enzima que codifica una enzima de CRISPR que comprende al menos una o mas secuencias de localizacion nuclear, en donde (a), (b) y (c) estan dispuestos en una orientacion 5' a 3', en donde los componentes I y II estan

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situados en el mismo o en diferentes vectores del sistema, en donde, cuando se transcribe, la secuencia de emparejamiento tracr se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia gma dirige la union, espedfica para la secuencia, de un complejo CRISPR a la secuencia diana, en donde el complejo CRISPR comprende la enzima de CRISPR que forma complejo con (1) la secuencia gma que se hibrida a la secuencia diana, y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida con la secuencia tracr, en donde la enzima de CRISPR puede comprender dos o mas mutaciones, de manera que la enzima tiene una actividad nucleasa alterada en comparacion con la enzima de tipo salvaje, en donde la secuencia codificadora de la enzima codifica, ademas, uno o mas dominios funcionales heterologos, y en donde en la composicion del sistema multiplexado se utilizan multiples secuencias de polinucleotidos chiRNA.

La invencion comprende, ademas, una composicion que no se produce de forma natural o generada por tecnologfa genetica que comprende un sistema de vectores que puede comprender uno o mas vectores que comprende I. un primer elemento regulador enlazado operativamente a (a) una secuencia gma capaz de hibridarse a una secuencia diana en una celula, y (b) al menos una o mas secuencias de emparejamiento tracr, II. un segundo elemento regulador enlazado operativamente a una secuencia codificadora de la enzima que codifica una enzima de CRISPR y III. un tercer elemento regulador enlazado operativamente a una secuencia tracr, en donde los componentes I, II y III estan localizados en el mismo o en diferentes vectores del sistema, en el que, cuando se transcriben, la secuencia de emparejamiento tracr se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia gma dirige la union espedfica para la secuencia de un complejo de CRISPR a la secuencia diana, en el que el complejo de CRISPR comprende la enzima de CRISPR formando complejo con (1) la secuencia gma que se hibrida a la secuencia diana, y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a la secuencia de tracr, en donde la enzima de CRISPR puede comprender dos o mas mutaciones, de forma que la enzima tiene una actividad nucleasa alterada en comparacion con la enzima de tipo salvaje, y en donde la secuencia que codifica la enzima codifica, ademas, uno o mas dominios funcionales heterologos.

La invencion tambien comprende una composicion de sistema de enzimas de CRISPR de tres componentes multiplexada que comprende un sistema de vectores que puede comprender uno o mas vectores que comprende I. un primer elemento regulador enlazado operativamente a (a) una secuencia gma capaz de hibridarse a una secuencia diana en una celula y (b) al menos una o mas secuencias de emparejamiento tracr, II. un segundo elemento regulador enlazado operativamente a una secuencia codificadora de la enzima que codifica una enzima de CRISPR y III. un tercer elemento regulador enlazado operativamente a una secuencia tracr, en donde los componentes I, II y III estan localizados en el mismo o en diferentes vectores del sistema, en el que, cuando se transcriben, la secuencia de emparejamiento tracr se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia gma dirige la union espedfica para la secuencia de un complejo de CRISPR a la secuencia diana, en el que el complejo de CRISPR comprende la enzima de CRISPR formando complejo con (1) la secuencia gma que se hibrida a la secuencia diana, y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida a la secuencia de tracr, en donde la enzima de CRISPR puede comprender dos o mas mutaciones, de forma que la enzima tiene una actividad nucleasa alterada en comparacion con la enzima de tipo salvaje, y en donde la secuencia que codifica la enzima codifica, ademas, uno o mas dominios funcionales heterologos, y en donde en la composicion del sistema multiplexado se utilizan multiples secuencias gma capaces de hibridarse a las multiples secuencias diana.

En realizaciones de la invencion, la enzima de CRISPR puede comprender una o mas mutaciones en dos o mas dominios catalfticamente activos. En otra realizacion la enzima de CRISPR tiene una actividad nucleasa reducida o abolida en comparacion con la enzima de tipo salvaje. En otra realizacion, las dos mutaciones son D10A SpCas9 en un primer dominio catalfticamente activo y H840A SpCas9 en un segundo dominio catalfticamente activo o residuos correspondientes de otras enzimas de CRISPR. En otra realizacion, la enzima de CRISPR puede comprender dos o mas mutaciones en un residuo seleccionado del grupo que consiste en D10, E762, H840, N854, N863 o D986. En otra realizacion, la enzima de CRISPR puede comprender dos o mas mutaciones seleccionadas del grupo que comprende D10A, E762A, H840A, N854A, N863A o D986A. En una realizacion preferida, la enzima de CRiSpR es una protema de union a ADN que no dirige la escision de cualquiera de las cadenas en la ubicacion de la secuencia diana. En una realizacion, cada una de las dos o mas mutaciones es en un dominio catalfticamente activo de la enzima de CRISPR seleccionado del grupo que comprende el dominio RuvCI, RuvCII, RuvCIII o HNH. Se entendera que a lo largo de esta solicitud muchas referencias a residuos aminoacidos espedficos son los de la enzima SpCas9. La persona experta comprendera que la invencion es aplicable a otras enzimas Cas, incluyendo enzimas Cas9 de otras fuentes, y que en los casos en los que se hace referencia a residuos espedficos de enzimas SpCas9 se pueden hacer alteraciones y mutaciones correspondientes en esas otras enzimas Cas. Por ejemplo, la persona experta sera capaz de comparar secuencias de la SpCas9 y otras enzimas, e identificar residuos y dominios correspondientes y, por lo tanto, hacer las modificaciones adecuadas a esas enzimas.

En realizaciones adicionales, las composiciones de la invencion pueden comprender al menos dos o mas secuencias de localizacion nuclear. En un aspecto de la invencion, el dominio funcional es un dominio de activacion transcripcional, p. ej., VP64. En otro aspecto, el dominio funcional es un dominio represor transcripcional, p. ej., un

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dominio KRAB, un dominio SID o un dominio SID4X. En otra realizacion, la secuencia codificadora de la enzima codifica uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas dominios funcionales heterologos fusionados a la enzima de CRISPR. La invencion tambien comprende una o mas secuencias de enlazador entre dos dominios. Realizaciones de la invencion incluyen uno o mas dominios funcionales que tienen una o mas de las siguientes actividades: actividad metilasa, actividad desmetilasa, actividad de activacion de la transcripcion, actividad de represion de la transcripcion, actividad del factor de liberacion de la transcripcion, actividad de modificacion de histonas, actividad de escision del ARN y actividad de union a acido nucleico. En otra realizacion, el dominio funcional une el ADN y/o afecta a la transcripcion del acido nucleico diana. En aspectos de la invencion, la celula es una celula procariota o eucariota. En una realizacion preferida, la celula es una celula de mairnfero o una celula de ser humano. En algunas realizaciones, la celula de marnffero puede ser una celula de roedor (por ejemplo, raton o rata), una celula de ungulados o una celula de primates. En algunas realizaciones, la celula eucariota puede ser una celula de artropodo (p. ej., insecto) o de nematodos. En otras realizaciones la celula puede ser una celula vegetal (incluyendo algas) o una celula fungica. En realizaciones adicionales de la invencion, la enzima de CRISPR esta optimizada en codones para la expresion en una celula eucariota; la enzima de CRISPR es una enzima de CRISPR tipo II; la enzima de CRISPR es una enzima Cas9 y la enzima Cas9 es de un organismo seleccionado del grupo que comprende el genero Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium o Corynebacter. En un aspecto adicional, los vectores del sistema son vectores virales seleccionados del grupo que comprende de un vector lentiviral, un vector adenoviral o un vector de AAV.

La invencion tambien comprende metodos de modular, es decir, alterar, activar, reprimir la expresion genica en un locus genomico de interes en una celula, poniendo en contacto la celula con composiciones de la invencion.

Un aspecto de la descripcion se refiere a una composicion que puede comprender un sistema de vectores que puede comprender uno o mas vectores que pueden comprender

I. un primer elemento regulador enlazado operativamente a una secuencia de polinucleotidos de ARN quimerico (chiRNA) del sistema CRISPR/Cas, en el que la secuencia de polinucleotidos puede comprender

(a) una secuencia grna capaz de hibridarse a una secuencia diana en una celula eucariota,

(b) una secuencia de emparejamiento tracr, y

(c) una secuencia tracr, y

II. un segundo elemento regulador enlazado operativamente a una secuencia codificadora de la enzima que codifica una enzima de CRISPR que comprende al menos una o mas secuencias de localizacion nuclear,

en donde (a), (b) y (c) estan dispuestos en una orientacion 5' a 3',

en donde los componentes I y II estan situados en el mismo o en diferentes vectores del sistema,

en donde, cuando se transcribe, la secuencia de emparejamiento tracr se hibrida con la secuencia tracr y la secuencia grna dirige la union, espedfica para la secuencia, de un complejo CRISPR a la secuencia diana,

en donde el complejo CRISPR puede comprender la enzima de CRISPR que forma complejo con (1) la secuencia grna que se hibrida a la secuencia diana, y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida con la secuencia tracr, y

en donde la enzima que codifica la secuencia codificadora de la enzima de CRISPR incluye, ademas, un dominio funcional heterologo.

La secuencia codificadora puede codificar uno o mas dominios funcionales heterologas (p. ej., aproximadamente o mas de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o mas dominios, ademas de la enzima de CRISPR). Una protema de fusion de la enzima de CRISPR puede comprender cualquier secuencia de protemas adicional, y opcionalmente una secuencia de enlazador entre dos dominios. Ejemplos de dominios de protemas que pueden fusionarse con una enzima de CRISPR incluyen, sin limitacion, marcadores de epftopos, secuencias de gen informador, y dominios de protemas que tienen una o mas de las siguientes actividades: actividad metilasa, actividad desmetilasa, actividad de activacion de la transcripcion, actividad de represion de la transcripcion, actividad del factor de liberacion de la transcripcion, actividad de modificacion de histonas, actividad de escision de ARN y actividad de union a acido nucleico. Ejemplos no limitantes de marcadores de epftopos incluyen marcadores de histidina (His), marcadores V5, marcadores FLAG, marcadores de hemaglutinina de la gripe (HA), marcadores Myc, marcadores VSV-G y marcadores de tiorredoxina (Trx). Ejemplos de genes informadores incluyen, pero no se limitan a, glutation-S-transferasa (GST), peroxidasa de rabano picante (HRP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), beta- galactosidasa, beta-glucuronidasa, luciferasa, protema fluorescente verde (GFP), HcRed, DsRed, protema fluorescente cian (CFP), protema amarilla fluorescente (YFP) y protemas autofluorescentes incluyendo la protema fluorescente azul (BFP). Una enzima de CRISPR puede fusionarse a una secuencia de gen que codifica una protema o un fragmento de una protema que une moleculas de ADN o une otras moleculas celulares, incluyendo pero no limitada a la protema de union a maltosa (MBP), S-tag, fusiones del dominio de union a ADN (DBD) de Lex A, fusiones del dominio de union a ADN de GAL4 y fusiones de la protema BP16 del virus herpes simplex (HSV). Dominios adicionales que pueden formar parte de una protema de fusion que puede comprender una enzima de

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CRISPR se describen en el documento US20110059502. En algunas realizaciones, se utiliza una enzima de CRISPR marcada para identificar la ubicacion de una secuencia diana.

En un aspecto de la invencion, el dominio funcional afecta a la transcripcion del acido nucleico diana.

Ejemplos no limitantes de enzimas de CRISPR incluyen Cas1, CasIB, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (tambien conocida como Csn1 y Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, homologos de las mismas, o versiones modificadas de las mismas. Estas enzimas se conocen; por ejemplo, la secuencia de aminoacidos de la protema Cas9 de S. pyogenes se puede encontrar en la base de datos SwissProt (disponible en el sitio de web uniprot.org) bajo el numero de acceso Q99ZW2. En algunas realizaciones, la enzima es una enzima Cas9 de CRISPR. En algunas realizaciones, la enzima Cas9 es Cas9 de S. pneumoniae, S. pyogenes o S. thermophilus, y puede incluir Cas9 mutada, derivada de estos organismos. En algunas realizaciones, la enzima de CRISPR esta optimizada en codones para la expresion en una celula eucariota. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR dirige la escision de una o dos cadenas en la ubicacion de la secuencia diana. En algunas formas de realizacion, la enzima de CRISPR carece de actividad de escision de la cadena de ADN.

En algunos aspectos de la invencion, una enzima de CRISPR puede comprender una o mas mutaciones y puede utilizarse como una protema de union a ADN generico con o sin fusion a un dominio funcional. Las mutaciones pueden incluir, pero no se limitan a mutaciones cataltticos, por ejemplo, mutaciones en uno de los dominios cataltticos o mutacion de residuos cataltticos. Ejemplos preferidos de mutaciones cataltticas adecuadas son el o los residuos cataltticos en el dominio RuvC I en el extremo N de Cas9 o el o los residuos cataltticos en el dominio HNH interno. En algunas realizaciones, la Cas9 es (o se deriva de) SpCas9. En tales realizaciones, las mutaciones preferidas son en cualquiera o en todas las posiciones 10, 762, 840, 854, 863 y/o 986 de SpCas9 o posiciones correspondientes en otras Cas9s (que pueden determinarse, por ejemplo, mediante herramientas de comparacion de secuencias estandar). En particular, cualquiera o todas las siguientes mutaciones se prefieren en SpCas9: D10A, E762A, H840A, N854A, N863A y/o D986A; asf como tambien se preve la sustitucion conservadora de cualquiera de los aminoacidos de sustitucion. Tambien se prefieren las mismas (o sustituciones conservativas de estas mutaciones) en las posiciones correspondientes en otras Cas9s. Particularmente preferidas son D10 y H840 en SpCas9. Sin embargo, en otras Cas9s, tambien se prefieren los residuos correspondientes a SpCas9 D10 y H840.

En un aspecto mas ventajoso de la invencion la enzima de CRISPR mutada puede fusionarse a un dominio de activacion transcripcional. En un aspecto de la invencion, el dominio de activacion transcripcional puede ser VP64. Otros aspectos de la invencion se refieren a la enzima de CRISPR mutada que se fusiona a los dominios que incluyen pero no estan limitados a un represor de la transcripcion, una recombinasa, una transposasa, un remodelador de histona, una ADN metiltransferasa, un criptocromo, un dominio inducible/controlable por la luz o un dominio qmmicamente inducible/controlable.

En algunos aspectos de la invencion, la enzima de CRISPR se compone de menos de cuatro mil, y en algunos aspectos menos de mil aminoacidos. Enzimas de este tipo se pueden proporcionar fusionadas a un dominio funcional heterologo, o no. Cuando la enzima se fusiona a un dominio funcional heterologo, el tamano de la enzima (menos de cuatro mil, menos de mil amino acidos) se refiere a la porcion de CRISPR de la protema de fusion. En determinadas realizaciones descritas en esta memoria, la invencion o el metodo se pone en practica en un organismo o sujeto. En determinadas realizaciones, el organismo o sujeto es un eucariota o un eucariota no humano. En determinadas realizaciones, el organismo o sujeto es una planta. En determinadas realizaciones, el organismo o sujeto es un mairnfero o un mamffero no humano. En determinadas realizaciones, el organismo o sujeto son algas. En algunas realizaciones, el organismo o sujeto puede ser un roedor (por ejemplo, raton o rata), un ungulado o un primate. En algunas realizaciones, el organismo o sujeto puede ser un artropodo (p. ej., insecto) o nematodo. En otras realizaciones el organismo o sujeto puede ser una planta o un hongo.

Estas y otras realizaciones se describen o son evidentes a partir de y quedan abarcadas por la siguiente Descripcion Detallada.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

Las caractensticas nuevas de la invencion se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Una mejor comprension de las caractensticas y ventajas de la presente invencion se obtendra haciendo referencia a la siguiente descripcion detallada que recoge realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la invencion, y los dibujos adjuntos de los cuales:

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La Figura 1 muestra un esquema de nucleasa Cas9 guiada por ARN. La nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes (amarillo) fija como objetivo el ADN genomico mediante un ARN gma sintetico (SgRNA) que consiste en una secuencia gma de 20 nt (azul) y un armazon (rojo). Los pares de bases de la secuencia gma la diana de ADN (azul), directamente aguas arriba de un motivo adyacente al protoespaciador 5'-NGG requerido (PAM; magenta) y Cas9 media en una rotura de doble cadena (DSB) ~ 3 pb aguas arriba del PAM (triangulo rojo).

Las Figuras 2A-2F muestran un sistema CRISPR a modo de ejemplo, un posible mecanismo de accion, una adaptacion de ejemplo para la expresion en celulas eucariotas, y los resultados de las pruebas que evaluan la localizacion nuclear y la actividad de CRISPR.

La Figura 3A-D es un arbol filogenetico de genes Cas.

Las Figuras 4A-4F muestran el analisis filogenetico que revela cinco familias de Cas9s, incluyendo tres grupos de grandes Cas9s (~ 1400 aminoacidos) y dos de pequenas Cas9s (~ 1100 aminoacidos).

La Figura 5 muestra una construccion esquematica, en la que el dominio de activacion de la transcripcion (VP64) esta fusionado a Cas9 con dos mutaciones en los dominios cataltticos (D10 y H840).

La Figura 6 muestra una representacion grafica de la activacion transcripcional tras co- transfeccion de la Cas9- VP64 con ARN crispr quimerico generado por PCR (chiRNA) en celulas 293. La evaluacion se llevo a cabo 72 horas despues de la transfeccion utilizando RT-qPCR.

La Figura 7 muestra un cierto numero de vectores que incorporan genes Cas9 mutantes con marcadores VP64, NLSy GFP.

La Figura 8 muestra la ubicacion de construcciones Cas9-VP64-GFP en celulas 293 tal como se evaluo por un microscopio de fluorescencia 12 horas post-transfeccion.

La Figura 9 muestra la ubicacion de 16 fusiones dCas9-GFP con la misma secuencia NLS alfa importina en cualquiera de los extremos N o C mirando a cero hasta tres repeticiones en tandem. Cada una de las construcciones se transfecto en celulas HEK 293FT utilizando Lipofectame 2000 y se tomaron imagenes 24 horas post-transfeccion.

La Figura 10 muestra seis versiones de marcador 6xHis anadido a dCas9, transfectado en celulas 293 FT y tenido con un anticuerpo anti-6xHis. Tres de ellas se construyeron para la activacion transcripcional (fusiones VP64), y las otras tres eran para la represion de la transcripcion (sin dominio funcional).

La Figura 11 muestra una relacion titulada de chiRNA (Sox2.1 y Sox2.5) para Cas9 (NLS-VP64-NLS-hSpCas9-NLS- VP64-NLS), transfectada en celulas 293 y cuantificada utilizando RT-qPCR.

La Figura 12 muestra el posicionamiento de sitios diana en el locus Sox2 humano, siendo cada una de las dianas de 20 pb de largo con un motivo adyacente protoespaciador NGG (PAM) vecino.

La Figura 13 muestra la co-transfeccion de cada una de las construcciones que contienen dCas9 con plasmidos pA6 en celulas HEK 293FT utilizando Lipofectame 2000. 72 horas post-transfeccion ARN total se extrajo de las celulas. 1 ug de ARN se transcribio de forma inversa en ADNc (qScript Supermix) en una reaccion de 40 ul. Se anadieron 2 ul de producto de reaccion en una sola reaccion qPCR de ensayo TaqMan de 20 ul. Cada uno de los experimentos se realizo por triplicas biologicas y tecnicas. Ningun control RT y ninguna reaccion de control del molde mostraron amplificacion.

La Figura 14 muestra el test de construcciones (pXRP011, pXRP013, pXRP015) utilizando las mismas dianas Sox2 que la Figura 13.

Las Figuras 15A-15B muestran una lista de 31 construcciones para explorar diferentes enlazadores, dominios funcionales y fusiones en los extremos N y C y elementos cnticos.

La Figura 16 muestra la co-transfeccion de cada uno de los plasmidos represores dCas9 con dos ARNs gma dirigidos a la cadena codificadora del gen beta-catenina. Se aislo el ARN 72 horas despues de la transfeccion y la expresion de los genes se cuantifico por RT-qPCR. El gen de control endogeno era GAPDH. Se utilizaron dos

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shRNAs validados como controles positivos. Los controles negativos eran determinados plasmidos transfectados sin ARNg, estos se como "control pXRP ##".

La Figura 17 muestra una representacion grafica de la activacion transcripcional adicional a la relacion de chiRNA (Sox2.1 y Sox2.5) a Cas9 (NLs-VP64-NLS-hSpCas9-NLS-VP64-NLS) que se titula y transfecta en celulas 293. Los resultados se cuantificaron mediante Rt-qPCR.

La Figura 18 muestra datos del informador de luciferasa para el activador (panel superior) y represor (panel inferior) de Cas9. En comparacion con controles "Sin Cas9", la activacion de mas de 3 veces que se logro cuando se fijo como objetivo el promotor de Sox2. Cuando se fijo como objetivo el cuerpo del gen de beta-catenina (CTNNB1), se logro una represion de aproximadamente 3 veces.

La Figura 19 muestra la expresion genica de beta-catenina en celulas HEK 293FT 72 horas despues de la transfeccion. Construcciones del represor Cas9 fueron fijadas como objetivo al locus beta-catenina y se comparan con los ShRNA estandar dorados. Una represion similar pudo observarse con represores Cas9 y el shRNA.

La Figura 20 muestra una representacion grafica del nivel de expresion de Neurog2 de las secuencias SgRNA de 20 pb fijadas como objetivo al locus Neurog2 en celulas Neuro 2A de raton. Los niveles de ARNm de Neurog2 se midieron utilizando RT-qPCR.

La Figura 21 muestra la modulacion de la expresion genica basal de dCas9-VP64 que se midio para las dianas de genes indicadas. La cursiva representa dianas de genes de ratones testadas en celulas Neuro 2 A, todas las mayusculas representan dianas de genes humanos testadas en celulas 293FT. En cada caso, la expresion del gen en las celulas transfectadas con GFP se comparo con la expresion en celulas transfectadas con dCas9-VP64.

La Figura 22 muestra los cambios en el nivel de expresion de los genes indicados cuando las muestras fueron transfectadas con la construccion dCas9-VP64, pero sin un sgRNA.

La Figura 23A-G muestra a, La nucleasa Cas9 guiada por ARN del sistema CRISPR/Cas de Streptococcus pyogenes de tipo II puede ser convertida en una protema de union a ADN guiada por ARN nucleoltticamente inactiva (Cas9**) mediante la introduccion de dos sustituciones de alanina (D10A y H840A). Se muestra esquematicamente que un ARN grna sintetico (sgRNA) puede dirigir la fusion Cas9**- efector a un locus espedfico en el genoma humano. El sgRNA contiene una secuencia grna de 20 pb en el extremo 5 'que especifica la secuencia diana. En el ADN genomico diana, el sitio diana de 20 pb necesita ser seguido por un motivo 5'-NGG PAM, b, c, Esquemas que muestran los sitios diana de sgRNA en los loci humanos KLF4 y SOX2, respectivamente. Cada uno de los sitios diana se indica por la barra azul y la secuencia de PAM correspondiente se indica por la barra de magenta. d, e, Esquemas del activador de la transcripcion Cas9**-VP64 y las construcciones del represor de la transcripcion SID4X-Cas9**, f, g, Activacion de kLf4 mediada por Cas9**-VP64 y SID4X-Cas9** y represion de SOX2, respectivamente. Todos los niveles de ARNm fueron medidos con relacion a celulas 293FT transfectadas de forma simulada (media ± s.e.m.; n = 3 replicas biologicas).

La Figura 24 muestra la secuencia de activador Cas9.

La Figura 25 muestra la secuencia de represor Cas9.

La Figura 26 muestra la representacion grafica del nivel de activacion de diferentes genes fijados como objetivo por el activador de Cas9 (pXRP57) y el ARN grna.

La Figura 27 muestra la representacion grafica del nivel de represion del gen hSox2 fijado como objetivo por el activador de Cas9 (pXRP57) y el ARN grna.

La Figura 28 muestra un mapa del plasmido pAAV-EF1a-dCas9-GS-CIB1 (mNLS d318-334)_ WPRE_hGHpoliA.

La Figura 29 muestra un mapa del plasmido pAAV-EF1a-dCas9-GS-NLS-cib1-WPRE-hGHpA.

La Figura 30 muestra un mapa del plasmido pAAV-EF1a-dCas9-GS-NLS-NLS-cib1-WPRE-hGHpA.

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La Figura 31 muestra una representacion grafica de construcciones CasLITE que exhiben diferentes niveles de activacion de la transcripcion inducible por la luz.

La Figura 32 muestra la validacion de celulas madre embrionarias de raton Cas9 inactivado Rosa26 Cre- dependiente.

La Figura 33 muestra una imagen de gel que indica los resultados de genotipado para ratones Cas9.

La Figura 34 muestra el silenciamiento de ARN mediado por CRISPR/Cmr. Las protemas Cmr forman un complejo con crRNA maduro para fijar espedficamente como objetivo y escindir ARN. crRNAs maduros de P. furiosus existen en dos formas de diferentes longitudes, larga (45 nt) y corta (39 nt), que consiste en un 5' mango y una secuencia grna. Se requiere el 5' mango para que el crRNA se incluya en el complejo Cmr. La secuencia de grna programa el sitio diana y pueden ser larga (37 nt) o corta (31 nt). La escision de ARN se produce 14 nucleotidos del extremo 3' del crRNA. Esta plataforma puede ser reutilizada para fijar como objetivo genes de marnffero expresados a partir de un locus genomico con solo cambiar la secuencia grna.

La Figura 35A-B muestra que protemas Cmr se expresan en celulas de mairnferos. Seis genes Cmr (Cmr 1-6) y un gen Cas (Cas6) de P. furiosus fueron clonados en vectores de expresion de marnfferos y fueron transfectados en celulas HEK 293FT. Se tomaron imagenes de fluorescencia 72 horas despues de la transfeccion y se prepararon lisados de protemas. A) se observa fuertemente una expresion de EGFP, lo que sugiere que las protemas exogenas se expresan robustamente. B) Imagenes de transferencia Western muestran bandas de protemas ubicadas en el tamano esperado. La segunda banda dentro de cada una de las pistas es ~ 30 kDa mayor en cada caso y es probablemente el resultado de una secuencia de P2A no escindida.

La Figura 36 muestra vectores de expresion CRISPR/Cmr.

Las figuras en esta memoria son solo para fines ilustrativos y no estan necesariamente dibujadas a escala. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

La invencion se refiere a la modificacion por tecnologfa genetica y la optimizacion de sistemas, metodos y composiciones utilizados para el control de la expresion genica que implican la focalizacion de la secuencia, tales como la perturbacion del genoma o la edicion de genes, que se refieren al sistema CRISPR/Cas y componentes de los mismos. En realizaciones ventajosas, la enzima Cas es Cas9; por ejemplo, Cas9 de S .pyogenes o S. termophilus.

Los terminos y expresiones "polinucleotido", "nucleotido", "secuencia de nucleotidos", "acido nucleico" y "oligonucleotido" se utilizan indistintamente. Se refieren a una forma polimerica de nucleotidos de cualquier longitud, ya sean desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos, o analogos de los mismos. Los polinucleotidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y pueden realizar cualquier funcion, conocida o desconocida. Los siguientes son ejemplos no limitativos de polinucleotidos: regiones codificadoras o no codificadoras de un gen o fragmento de gen, loci (locus) definidos a partir de analisis de ligamiento, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosomal, ARN de interferencia corto (siRNA), ARN de horquilla corto (shRNA), micro-ARN (miRNA), ribozimas, ADNc, polinucleotidos recombinantes, polinucleotidos ramificados, plasmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de acido nucleico y cebadores. El termino tambien abarca estructuras de tipo acido nucleico con cadenas principales sinteticas, vease, p. ej., Eckstein, 1991: Baserga et al., 1992; Miiligan, 1993; documentos WO97/03211; WO 96/39154; Mata, 1997; Strauss-Soukup, 1997; y Samstag, 1996. Un polinucleotido puede comprender uno o mas nucleotidos modificados tales como nucleotidos metilados y analogos de nucleotidos. Si estan presentes, modificaciones en la estructura de nucleotidos se pueden impartir antes o despues del ensamblaje del polfmero. La secuencia de nucleotidos puede estar interrumpida por componentes no nucleotidos. Un polinucleotido puede modificarse adicionalmente despues de la polimerizacion tal como por conjugacion con un componente de marcaje.

En aspectos de la invencion, las expresiones "ARN quimerico", "ARN grna quimerico", "ARN grna", "ARN grna sencillo" y "ARN grna sintetico" se utilizan indistintamente y se refieren a la secuencia de polinucleotidos que comprende la secuencia grna, la secuencia tracr y la secuencia de emparejamiento tracr. La expresion "secuencia grna" se refiere a la secuencia de aproximadamente 20 pb dentro del aRn grna que especifica el sitio diana y puede utilizarse indistintamente con los terminos "grna" o "espaciador". La expresion "secuencia de emparejamiento tracr" tambien se puede utilizar de forma indistinta con el termino "repeticion o repeticiones directas".

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Tal como se utiliza en esta memoria, la expresion “tipo salvaje" es un termino de la tecnica entendido por las personas expertas y significa la forma tipica de un organismo, cepa, gen o caractenstica tal como se produce en la naturaleza que se distingue de las formas mutantes o variantes. Por ejemplo, "StCas9 de tipo salvaje" se refiere a Cas9 de tipo salvaje de S thermophilus, cuya secuencia de protema se da en la base de datos SwissProt con el numero de acceso G3ECR1. De manera similar, S pyogenes Cas9 esta incluida en SwissProt con el numero de acceso Q99ZW2.

Tal como se utiliza en esta memoria, el termino "variante" se deben tomar en el sentido de la exhibicion de cualidades que tienen un patron que se desvfa de lo que ocurre en la naturaleza.

Las expresiones "que se produce de forma no natural" o "modificado por ingeniena genetica" se utilizan indistintamente e indican la implicacion de la mano del hombre. Las expresiones, cuando se refieren a moleculas de acidos nucleicos o polipeptidos significan que la molecula de acido nucleico o el polipeptido esta al menos sustancialmente libre de al menos otro componente con el que estan asociados de forma natural en la naturaleza y como se encuentra en la naturaleza.

"Complementariedad" se refiere a la capacidad de un acido nucleico de formar enlace(s) hidrogeno con otra secuencia de acido nucleico por apareamiento de bases de Watson-Crick tradicional u otros tipos no tradicionales. A porcentaje de complementariedad indica el porcentaje de residuos en una molecula de acido nucleico que puede formar enlaces hidrogeno (p. ej., apareamiento de bases de Watson-Crick) con una segunda secuencia de acido nucleico (p. ej., siendo 5, 6, 7, 8, 9, 10 de 10 50%, 60%, 70%, 80%, 90% y 100% complementarias). "Perfectamente complementarios" significa que todos los residuos contiguos de una secuencia de acidos nucleicos se enlazara por hidrogeno con el mismo numero de residuos contiguos en una segunda secuencia de acido nucleico.

"Sustancialmente complementarios", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un grado de

complementariedad que es al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o 100% sobre

una region de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o mas

nucleotidos, o se refiere a dos acidos nucleicos que se hibridan en condiciones rigurosas.

Tal como se utiliza en esta memoria, "condiciones rigurosas" para la hibridacion se refieren a condiciones en las que un acido nucleico que tiene complementariedad con una secuencia diana se hibrida predominantemente con la secuencia diana, y sustancialmente no se hibrida con secuencias no diana. Las condiciones rigurosas son generalmente dependientes de la secuencia, y vanan dependiendo de un cierto numero de factores. En general, cuanto mayor sea la secuencia, mas alta sera la temperatura a la que la secuencia se hibrida espedficamente con su secuencia diana. Ejemplos no limitantes de las condiciones restrictivas se describen en detalle en Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Parte I, Segundo Capftulo "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", Elsevier, N.Y.

"Hibridacion" se refiere a una reaccion en la que uno o mas polinucleotidos reaccionan para formar un complejo que se estabiliza a traves de enlaces hidrogeno entre las bases de los residuos de nucleotidos. El enlace hidrogeno se puede producir por apareamiento de bases de Watson Crick, la union Hoogstein, o en cualquier otra forma espedfica para la secuencia. El complejo puede comprender dos cadenas que forman una estructura duplex, tres o mas cadenas que forman un complejo multi-cadena, una sola cadena auto-hibridante, o cualquier combinacion de estas. Una reaccion de hibridacion puede constituir una etapa de un proceso mas extenso tal como el inicio de la PCR, o la escision de un polinucleotido por una enzima. A una secuencia capaz de hibridarse con una secuencia dada se la alude como el "complemento" de la secuencia dada.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresion "locus genomico" o "locus" (plural loci) es la ubicacion espedfica de un gen o secuencia de ADN en un cromosoma. Un "gen" se refiere a tramos de ADN o ARN que codifican un polipeptido o una cadena de ARN que tiene que jugar un papel funcional en un organismo y, por lo tanto, es la unidad molecular hereditaria en los organismos vivos. Para los fines de esta invencion, se puede considerar que los genes incluyen regiones que regulan la produccion del producto genico, esten o no estas secuencias reguladoras adyacentes a las secuencias codificadoras y/o transcritas. Por consiguiente, un gen incluye, pero no se limita necesariamente a secuencias de promotor, terminadores, secuencias reguladoras de la traduccion tales como sitios de union a ribosomas y sitios de entrada al ribosoma interno, potenciadores, silenciadores, aisladores, elementos de borde, ongenes de replicacion, sitios de union a la matriz y regiones de control del locus.

Tal como se utiliza en esta memoria, "expresion de un locus genomico" o "expresion genica" es el proceso por el cual la informacion de un gen se utiliza en la smtesis de un producto genico funcional. Los productos de la expresion genica son a menudo protemas, pero en genes no codificadores de protemas tales como genes de ARNr o genes de ARNt, el producto es ARN funcional. El proceso de la expresion genica se utiliza por todos los eucariotas vivos

conocidos (incluyendo organismos multicelulares), procariotas (bacterias y arqueas) y virus para generar productos funcionales para sobrevivir. Tal como se utiliza en esta memoria, "expresion" de un gen o acido nucleico abarca no solo la expresion del gen celular, sino tambien la transcripcion y la traduccion de acido o acidos nucleicos en los sistemas de clonacion y en cualquier otro contexto. Tal como se utiliza en esta memoria, "expresion" tambien se 5 refiere al proceso mediante el cual un polinucleotido se transcribe a partir de un molde de ADN (como en y ARNm u otro transcrito de ARN) y/o el proceso mediante el cual un ARNm transcrito se traduce posteriormente en peptidos, polipeptidos o protemas. A transcritos y polipeptidos codificados se les puede aludir selectivamente como "producto genico". Si el polinucleotido se deriva de ADN genomico, la expresion puede incluir el corte y empalme de ARNm en una celula eucariota.

10 Los terminos "polipeptido", "peptido" y "protema" se utilizan indistintamente en esta memoria para referirse a polfmeros de aminoacidos de cualquier longitud. El polfmero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoacidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoacidos. Los terminos tambien abarcan un polfmero de aminoacidos que ha sido modificado; por ejemplo, formacion de enlaces disulfuro, glicosilacion, lipidacion, acetilacion, fosforilacion o cualquier otra manipulacion tal como conjugacion con un componente de 15 marcaje. Tal como se utiliza en esta memoria, el termino "aminoacido" incluye aminoacidos naturales y/o no naturales o sinteticos, incluyendo glicina y tanto los isomeros opticos D o L y analogos de aminoacidos y peptidomirneticos.

Tal como se utiliza en esta memoria, el termino "dominio" o la expresion "dominio de protema" se refiere a una parte de una secuencia de protema que pueden existir y funcionar independientemente del resto de la cadena de protema.

20 Tal como se describe en aspectos de la invencion, la identidad de secuencia esta relacionada con la homologfa de secuencia. Las comparaciones de homologfa pueden realizarse a simple vista, o mas habitualmente, con la ayuda de programas de comparacion de secuencias facilmente disponibles. Estos programas informaticos disponibles comercialmente pueden calcular el porcentaje (%) de homologfa entre dos o mas secuencias y tambien pueden calcular la identidad de secuencia compartida por dos o mas secuencias de aminoacidos o de acido nucleico. Las 25 homologfas de secuencia pueden generarse mediante cualquiera de un cierto numero de programas de ordenador conocidos en la tecnica, por ejemplo BLAST o FASTA, etc. Un programa informatico adecuado para llevar a cabo dicha alineacion es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Universidad de Wisconsin, EE.UU.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Ejemplos de otros software que pueden realizar comparaciones de secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete BLAST (vease Ausubel et al., 1999 ibid. - Capftulo 18), FASTA (Atschul et 30 al., 1990, J. Mol. Biol, 403-410) y el conjunto GeNeWORKS de herramientas de comparacion. Tanto BLAST como FASTA estan disponibles para la busqueda fuera de lmea y en lmea (vease Ausubel et al., 1999 ibid, paginas 7-58 a 7-60). Sin embargo, se prefiere utilizar el programa GCG Bestfit.

El % de homologfa puede calcularse sobre secuencias contiguas, es decir, una secuencia se alinea con la otra secuencia y cada uno de los aminoacidos o nucleotidos en una secuencia se compara directamente con el 35 aminoacido o nucleotido correspondiente en la otra secuencia, un residuo cada vez. Esto se denomina alineamiento "sin huecos". Tfpicamente, estos alineamientos sin huecos se realizan solo sobre un numero relativamente corto de residuos.

Aunque este es un metodo muy simple y consistente, no tiene en consideracion que, por ejemplo, en un par de secuencias de otro modo identicas, una insercion o delecion puede provocar que los siguientes restos de 40 aminoacidos se coloquen fuera de alineamiento, por lo tanto, resultando potencialmente en una gran reduccion en el % de homologfa cuando se realiza un alineamiento global. En consecuencia, la mayona de los metodos de comparacion de secuencias se disenan para producir alineamientos optimos que tienen en cuenta posibles inserciones y deleciones sin penalizar indebidamente la puntuacion de homologfa o identidad global. Esto se consigue insertando "huecos" en el alineamiento de secuencias para intentar maximizar la homologfa o identidad 45 local.

Sin embargo, estos metodos mas complejos asignan "penalizaciones por hueco" a cada uno de los huecos que se produce en el alineamiento, de modo que, para el mismo numero de aminoacidos identicos, un alineamiento de la secuencia con tan pocos huecos como sea posible - lo que refleja una mayor relatividad entre las dos secuencias comparadas - puede alcanzar una puntuacion mas alta que con muchos huecos. Se utilizan tfpicamente “costos de 50 huecos de afinidad" que cargan un coste relativamente alto para la existencia de un hueco y una penalizacion mas pequena para cada uno de los residuos posteriores en el hueco. Este es el sistema de puntuacion de huecos mas comunmente utilizado. Penalizaciones de huecos elevadas pueden producir, por supuesto, alineamientos optimizados con menos huecos. La mayona de los programas de alineamiento permiten modificar las penalizaciones por hueco. Sin embargo, se prefiere utilizar los valores por defecto cuando se utiliza un software de este tipo para las

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comparaciones de secuencias. Por ejemplo, al utilizar el paquete GCG Wisconsin Bestfit la penalizacion por hueco por defecto para secuencias de aminoacidos es -12 para un hueco y -4 para cada extension,

El calculo del % maximo de homologfa, portanto, requiere primero la produccion de una alineacion optima, teniendo en consideracion las penalizaciones por hueco. Un programa informatico adecuado para llevar a cabo dicho alineamiento es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al., 1984 Nuc. Acids Research 12 p 387). Ejemplos de otros software que pueden realizar comparaciones de secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete BLAST (vease Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4a Ed. - Capftulo 18), FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 403-410) y el conjunto GENEWORKS de herramientas de comparacion. Tanto BLAST como FASTA estan disponibles para la busqueda en lmea y fuera de lmea (vease Ausubel et al., 1999, Short Protocols in Molecular Biology, paginas 7-58 a 7-60). Sin embargo, para algunas aplicaciones, se prefiere utilizar el programa GCG Bestfit. Una nueva herramienta, denominada BLAST 2 Sequences, esta tambien disponible para la comparacion de secuencias de protemas y nucleotidos (vease FEMS Microbiol Lett. 1999 174(2):247-50; FEMS Microbiol Lett. 1999 177(1):187-8 y el sitio web del Centro Nacional de informacion sobre Biotecnologfa en la pagina web de National Institutes for Health).

Aunque el % de homologfa final puede medirse en terminos de identidad, el proceso de alineamiento en sf no se basa tfpicamente en una comparacion de pares de todo o nada. En su lugar, se utiliza generalmente una matriz de puntuacion de similitud a escala que asigna puntuaciones a cada comparacion por pares basada en la similitud qrnmica o la distancia evolutiva. Un ejemplo de una matriz de este tipo comunmente utilizada es la matriz BLOSUM62 - la matriz por defecto para el conjunto de programas BLAST. Los programas GCG Wisconsin generalmente utilizan cualquiera de los valores por defecto publicos o una tabla de comparacion de sfmbolos personalizada, si se suministra (vease el manual del usuario para mas detalles). Para algunas aplicaciones, se prefiere utilizar los valores por defecto publicos para el paquete GCG, o en el caso de otro software, la matriz por defecto, tal como BLOSUM62.

Alternativamente, las homologfas porcentuales pueden calcularse utilizando la caractenstica de alineamiento multiple en DNASIS™ (Hitachi Software), basado en un algoritmo, analogo a CLUSTAL (Higgins DG y Sharp PM (1988), Gene 73 (1), 237-244). Una vez que el software ha producido un alineamiento optimo, es posible calcular el % de homologfa, preferentemente el % de identidad de secuencia. El software hace normalmente esto como parte de la comparacion de secuencias y genera un resultado numerico.

Las secuencias tambien pueden tener deleciones, inserciones o sustituciones de residuos de aminoacidos que producen un cambio silencioso y resultan en una sustancia funcionalmente equivalente. Sustituciones de aminoacidos deliberadas pueden realizarse sobre la base de la similitud en las propiedades de aminoacidos (tales como polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipatica de los residuos) y, por lo tanto, es util para agrupar juntos aminoacidos en grupos funcionales. Los aminoacidos pueden agruparse basandose en las propiedades de sus cadenas laterales solas. Sin embargo, es mas util incluir los datos de mutacion tambien. Los conjuntos de aminoacidos asf obtenidos es probable que se conserven por razones estructurales. Estos conjuntos pueden describirse en forma de un diagrama de Venn (Livingstone CD y Barton GJ (1993) "Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation" Comput. Appl. Biosci. 9: 745756) (Taylor W.R. (1986) "The classification of amino acid conservation" J. Theor. Biol. 119; 205-218). Sustituciones conservadoras se pueden hacer, por ejemplo, de acuerdo con la tabla que figura a continuacion que describe un diagrama de Venn generalmente aceptado de agrupacion de aminoacidos.

Conjunto

Sub-conjunto

Hidrofobico

F W Y H K M I L V A G C Aromatico F W Y H

Alifatico

I L V

Polar

W Y H K R E D C S T N Q Cargado H K R E D

Positivamente cargado H K R

Negativamente cargado E D

Pequeno

V C A G S P T N D Minusculo A G S

Realizaciones de la invencion incluyen secuencias (tanto de polinucleotidos o polipeptidos) que puede comprender la sustitucion homologa (sustitucion y reemplazo se utilizan ambos en esta memoria para dar a entender el intercambio de un residuo de aminoacido o nucleotido existente, con un residuo o nucleotido alternativo) que puede producirse, es decir, una sustitucion comparable en el caso de aminoacidos tal como basico por basico, acido por acido, polar por polar, etc. Tambien puede producirse una sustitucion no homologa, es decir, de una clase de

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residuo a otro o, alternativamente, que implica la inclusion de aminoacidos no naturales tales como ornitina (a la que se alude en lo sucesivo como Z), ornitina del acido diaminobutrnco (a la que se alude en lo sucesivo como B), ornitina norleucina (a la que se alude en lo sucesivo como O), pirilalanina, tienilalanina, naftilalanina y fenilglicina.

Secuencias de aminoacidos variantes pueden incluir grupos espaciadores adecuados que pueden insertarse entre cualesquiera dos residuos de aminoacidos de la secuencia, incluyendo grupos alquilo tales como grupos metilo, etilo o propilo, ademas de espaciadores de aminoacidos tales como residuos glicina o p-alanina. Una forma adicional de variacion, que implica la presencia de uno o mas residuos aminoacidos en forma peptoide, pueda ser bien comprendida por los expertos en la tecnica. Para evitar dudas, "la forma peptoide" se utiliza para referirse a residuos aminoacidos variantes, en donde el grupo de sustituyentes carbono a esta en atomo de nitrogeno del residuo en lugar del carbono a. Procedimientos para preparar peptidos en forma peptoide son conocidos en la tecnica, por ejemplo Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 y Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134.

La practica de la presente invencion emplea, a menos que se indique lo contrario, tecnicas convencionales de inmunologfa, bioqmmica, qmmica, biologfa molecular, microbiologfa, biologfa celular, genomica y ADN recombinante, que estan dentro de la experiencia de la tecnica. Vease Sambrook, Fritsch y Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a edicion (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. comps., (1987)); la serie METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames y G.R. Taylor comps. (1995)), Harlow y Lane, comps. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, y ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, comp. (1987)).

En un aspecto, la invencion proporciona vectores que se utilizan en la ingeniena y optimizacion de los sistemas CRISPR/Cas.

Tal como se utiliza en esta memoria, un "vector" es una herramienta que permite o facilita la transferencia de una entidad de un entorno a otro. Es un replicon, tal como un plasmido, fago, o cosmido, en el que se puede insertar otro segmento de ADN con el fin de llevar a cabo la replicacion del segmento insertado. Generalmente, un vector es capaz de replicarse cuando se asocia con los elementos de control apropiados. En general, el termino "vector" se refiere a una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico al que se ha unido. Vectores incluyen, pero no se limitan a, moleculas de acido nucleico que son de cadena sencilla, de cadena doble, o parcialmente de doble cadena; moleculas de acido nucleico que comprenden uno o mas extremos libres, sin extremos libres (p. ej., circulares); moleculas de acido nucleico que comprenden ADN, ARN, o ambos; y otras variedades de polinucleotidos conocidos en la tecnica. Un tipo de vector es un "plasmido", que se refiere a un bucle de ADN de doble cadena circular en el que se pueden insertar segmentos de aDn adicionales tal como por tecnicas de clonacion molecular estandares. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que las secuencias de ADN o ARN derivadas de virus estan presentes en el vector para el empaquetamiento en un virus (p. ej., retrovirus, retrovirus defectuosos en la replicacion, adenovirus, adenovirus defectuosos en la replicacion, y virus adeno-asociados). Los vectores virales tambien incluyen polinucleotidos portados por un virus para la transfeccion en una celula huesped. Determinados vectores son capaces de replicacion autonoma en una celula huesped en la que se introducen (p. ej., vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicacion y vectores episomales de mairnfero). Otros vectores (p. ej., vectores no episomales de mamffero) se integran en el genoma de una celula huesped tras la introduccion en la celula huesped y, con ello, se replican junto con el genoma del huesped. Ademas, determinados vectores son capaces de dirigir la expresion de genes a los que estan enlazados operativamente. Tales vectores se denominan en esta memoria "vectores de expresion". Vectores de expresion comunes de utilidad en tecnicas de ADN recombinante estan a menudo en forma de plasmidos.

Los vectores de expresion recombinantes pueden comprender un acido nucleico de la invencion en una forma adecuada para la expresion del acido nucleico en una celula huesped, lo que significa que los vectores de expresion recombinantes incluyen uno o mas elementos reguladores, que pueden seleccionarse sobre la base de las celulas huesped a utilizar para la expresion, que estan operativamente enlazadas a la secuencia de acido nucleico a expresar. Dentro de un vector de expresion recombinante, "enlazada operativamente" pretende significar que la secuencia de nucleotidos de interes esta enlazada al o a los elementos reguladores de una manera que permite la expresion de la secuencia de nucleotidos (p. ej., en un sistema de transcripcion/traduccion in vitro o en una celula huesped cuando el vector se introduce en la celula huesped). Con respecto a metodos de recombinacion y de clonacion, se hace mencion a la publicacion de la solicitud de patente de EE.UU. 2004-0171156 A1.

Aspectos de la invencion se refieren a vectores bicistronicos para ARN quimerico y Cas9. Se prefieren vectores de expresion bicistronicos para ARN quimerico y Cas9. En general, y en particular en esta forma de realizacion, Cas9 es impulsado preferiblemente por el promotor CBh. El ARN quimerico puede ser impulsado preferentemente por un promotor U6. De manera ideal los dos se combinan. El ARN grna quimerico consiste tfpicamente en una secuencia grna de 20 pb (Ns) y esto puede estar unido a la secuencia tracr (que va desde la primera "U" de la cadena inferior al

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extremo del transcrito). La secuencia tracr se puede estar truncada en varias posiciones tal como se indica. Las secuencias gma y tracr estan separadas por la secuencia de emparejamiento tracr, que puede ser GUUUUAGAGCUA. Esto puede ser seguido por la secuencia de bucle GAAA tal como se muestra. Ambas son ejemplos preferidos. La solicitante ha demostrado indeles mediados por Cas9 en los loci EMX1 y PVALB humanos mediante ensayos SURVEYOR. Los ChiRNAs se indican por su designacion “+n", y crRNA se refiere a un ARN tnbrido en el que las secuencias gma y tracr se expresan como transcritos separados. A lo largo de esta solicitud, el ARN quimerico tambien se puede denominar gma unica, o ARN gma sintetico (sgRNA). El bucle es preferiblemente GAAA, pero no se limita a esta secuencia o, de hecho, a ser solo de 4 pb de longitud. De hecho, secuencias formadoras de bucle preferidas para su uso en estructuras de horquilla son de cuatro nucleotidos de longitud, y lo mas preferiblemente tienen la secuencia GAAA. Sin embargo, se pueden utilizar secuencias de bucle mas largas o mas cortas, al igual que secuencias alternativas. Las secuencias incluyen preferiblemente un triplete de nucleotidos (por ejemplo, AAA), y un nucleotido adicional (por ejemplo C o G). Ejemplos de secuencias formadoras de bucle incluyen CAAA y AAAG.

La expresion "elemento regulador" pretende incluir promotores, potenciadores, sitios de entrada al ribosoma interno (IRES), y otros elementos de control de la expresion (p. ej., senales de terminacion de la transcripcion tales como senales de poliadenilacion y secuencias poli-U). Se describen estos elementos reguladores, por ejemplo, en Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Elementos reguladores incluyen los que dirigen la expresion constitutiva de una secuencia de nucleotidos en muchos tipos de celulas huespedes y los que dirigen la expresion directa de la secuencia de nucleotidos solo en determinadas celulas huespedes (p. ej., secuencias reguladoras espedficas para el tejido). Un promotor espedfico para el tejido puede dirigir la expresion principalmente en un tejido deseado de interes tal como el musculo, neurona, hueso, piel, sangre, organos espedficos (p. ej., tngado, pancreas), o tipos de celulas particulares (p. ej., linfocitos). Los elementos reguladores tambien pueden dirigir la expresion de una manera

dependiente del tiempo tal como de una manera dependiente del ciclo celular o dependiente de la fase de desarrollo,

que puede o puede no ser tambien espedfico para el tejido o tipo de celula. En algunas realizaciones, un vector puede comprender uno o mas promotores pol III (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5 o mas promotores pol III), uno o mas promotores pol II (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5 o mas promotores pol II), uno o mas promotores pol I (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5 o mas promotores pol I), o combinaciones de los mismos. Ejemplos de promotores pol III incluyen, pero no se limitan a promotores U6 y H1. Ejemplos de promotores pol II incluyen, pero no se limitan al promotor del virus del sarcoma de Rous retroviral (RSV) LTR (opcionalmente con el potenciador RSV), el promotor de citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con el potenciador CMV) [vease, p. ej., Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)], el promotor SV40, el promotor de

dihidrofolato reductasa, el promotor p-actina, el promotor fosfoglicerol quinasa (pGk) y el promotor EF1a. Tambien

quedan abarcados por la expresion "elemento regulador" elementos potenciadores tales como WPRE; potenciadores de CMV; el segmento R-U5' en LTR de HTLV-I (Mol. Cell. Biol., Vol 8(1), pags. 466-472, 1988); el potenciador SV40; y la secuencia de intron entre los exones 2 y 3 de p-globina de conejo (Proc. Natl, Acad. Sci. USA, Vol, 78(3), pags. 1527-31, 1981). Se apreciara por los expertos en la tecnica que el diseno del vector de expresion puede depender de factores tales como la eleccion de la celula huesped a transformar, el nivel de expresion deseado, etc. Un vector puede ser introducido en celulas huespedes para con ello producir transcritos, protemas o peptidos, incluyendo protemas o peptidos de fusion, codificados por acidos nucleicos tal como se describe en esta memoria (p. ej., repeticiones palindromicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR), transcritos, protemas, enzimas, formas mutantes de los mismos, protemas de fusion de los mismos, etc.). Con respecto a secuencias reguladoras, se hace mencion de la publicacion de la solicitud de patente de EE.UU. 2004-0242517 A1. Con respecto a los promotores, se hace mencion a la publicacion PCT WO 2011/028929 y la publicacion de la solicitud de patente de EE.UU. 2011-0027239 A1.

Los vectores pueden ser disenados para la expresion de transcritos de CRISPR (p. ej., transcritos de acidos nucleicos, protemas o enzimas) en celulas procariotas o eucariotas. Por ejemplo, los transcritos de CRISPR pueden expresarse en celulas bacterianas tales como Escherichia coli, celulas de insectos (utilizando vectores de expresion de baculovirus), celulas de levaduras o celulas de mairnfero. Celulas huespedes adecuadas se discuten en Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, California (1990). Alternativamente, el vector de expresion recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo utilizando secuencias reguladoras del promotor T7 y T7 polimerasa.

Los vectores se pueden introducir y propagar en una celula procariota o procariotica. En algunas realizaciones, se utiliza un procariota para amplificar copias de un vector que se ha de introducir en una celula eucariota o como un vector intermedio en la produccion de un vector a ser introducido en una celula eucariota (por ejemplo, una ampliacion de un plasmido como parte de un sistema de empaquetado de un vector viral). En algunas realizaciones, se utiliza un procariota para amplificar copias de un vector y expresar uno o mas acidos nucleicos tal como para proporcionar una fuente de una o mas protemas para el suministro a una celula huesped u organismo huesped. La expresion de protemas en procariotas se lleva a cabo mas a menudo en Escherichia coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresion de protemas de fusion o de no fusion. Los vectores de

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fusion anaden un cierto numero de aminoacidos a una protema codificada en el mismo tal como al extremo amino de la protema recombinante. Tales vectores de fusion pueden cumplir uno o mas fines tales como: (i) aumentar la expresion de la protema recombinante; (ii) aumentar la solubilidad de la protema recombinante; y (iii) ayudar en la purificacion de la protema recombinante, actuando como un ligando en purificacion por afinidad. A menudo, en vectores de expresion de fusion, un sitio de escision proteolftica se introduce en la union del resto de fusion y la protema recombinante para permitir la separacion de la protema recombinante del resto de fusion despues de la purificacion de la protema de fusion. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento relacionadas, incluyen Factor Xa, trombina y enteroquinasa. Ejemplos de vectores de expresion de fusion incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith y Johnson, 1988. Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) y pRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.) que fusionan la glutation S transferasa (GST), protema de union a maltosa, o protema A, respectivamente, a la protema recombinante diana.

Ejemplos de vectores de expresion de E. coli sin fusion inducibles adecuados incluyen pTrc (Amrann et al., (1988) Gene 69: 301-315) y pET 11d (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZIMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89).

En algunas realizaciones, un vector es un vector de expresion de levadura. Ejemplos de vectores para la expresion en la levadura Saccharomyces cerevisiae incluyen pYepSecl (Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kuijan y Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1987. Gene 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.) y picZ (Invitrogen Corp, San Diego, Calif).

En algunas realizaciones, un vector impulsa la expresion de protemas en celulas de insecto utilizando vectores de expresion de baculovirus. Vectores de baculovirus disponibles para la expresion de protemas en celulas de insecto cultivadas (p. ej., celulas SF9) incluyen la serie pAc (Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers, 1989. Virology 170:31-39).

En algunas realizaciones, un vector es capaz de impulsar la expresion de una o mas secuencias en celulas de mairnfero utilizando un vector de expresion de mairnfero. Ejemplos de vectores de expresion de mamffero incluyen pCDM8 (Seed, 1987. Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6:187-195). Cuando se utiliza en celulas de marnffero, las funciones de control del vector de expresion son proporcionadas tfpicamente por uno o mas elementos reguladores. Por ejemplo, promotores comunmente utilizados se derivan de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus, virus de simio 40, y otros descritos en esta memoria y conocidos en la tecnica. Para otros sistemas de expresion adecuados tanto para celulas procariotas como eucariotas veanse, p ej., los Capftulos 16 y 17 de Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING:. A LABORATORY MANUAL. 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989.

En algunas realizaciones, el vector de expresion de mairnfero recombinante es capaz de dirigir la expresion del acido nucleico preferentemente en un tipo de celula particular (p. ej., elementos reguladores espedficos para tejidos se utilizan para expresar el acido nucleico). Elementos reguladores espedficos para tejidos son conocidos en la tecnica. Ejemplos no limitantes de promotores espedficos para tejidos, adecuados, incluyen el promotor de albumina (espedfico para el hngado; Pinkert, et al., 1987, Genes Dev. 1: 268-277), promotores linfoide-espedficos (Calame y Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43:235-275), en particular promotores de receptores de celulas T (Winoto y Baltimore, 1989. EMBO J. 8:729-733) e inmunoglobulinas (Baneiji, et al., 1983. Cell 33: 729-740; Queen y Baltimore, 1983 Cell 33: 741-748), promotores espedficos para neuronas (p. ej., el promotor para neurofilamentos; Byrne y Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477), promotores espedficos para pancreas (Edlund, et al., 1985. Science 230:912-916) y promotores espedficos para glandulas mamarias (p. ej., promotor de suero lacteo; patente de EE.UU. N°. 4.873.316 y la Publicacion de Solicitud Europea N° 264.166.). Promotores regulados en el desarrollo tambien estan comprendidos, p. ej., los promotores hox murinos (Kessel y Gruss, 1990. Science 249:374-379) y el promotor de a-fetoprotema (Campes y Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546). Con respecto a estos vectores procarioticos y eucarioticos, se hace mencion a la patente de EE.UU. 6.750.059. Otras realizaciones de la invencion pueden estar relacionadas con el uso de vectores virales, en lo que respecta a los que se hace mencion en la publicacion de la solicitud de patente de EE.UU. 2012-0003201 A1. Elementos reguladores espedficos para tejidos son conocidos en la tecnica y, en este sentido, se hace mencion a la patente de EE.UU. 7.776.321.

En algunas realizaciones, un elemento regulador esta enlazado operativamente a uno o mas elementos de un sistema CRISPR con el fin de impulsar la expresion de los uno o mas elementos del sistema de CRISPR. En general, los CISPRs (Repeticiones Palindromicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas), tambien conocidos como SPIDRs (Repeticiones Directas Intercaladas Separadas), constituyen una familia de loci de ADN que habitualmente son espedficos para una especie bacteriana particular. El locus CRISPR puede comprender una clase distinta de Repeticiones de Secuencia Corta Intercaladas (SSRs) que fueron reconocidas en E. coli (Ishino et al, J. Bacteriol., 169:5429-5433 [1987]; y Nakata et al, J. Bacteriol., 171: 3553-3556 [1989]), y genes asociados.

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SSRs intercaladas similares han sido identificadas en Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena y Mycobacterium tuberculosis (Vease, Groenen et al, Mol. Microbiol., 10:1057-1065 [1993]; Hoe et al., Emerg. Infect. Dis., 5:254-263 [1999]; Masepohl et al., Biochim. Biophys. Acta 1307:26-30 [1996]; y Mojica et al., Mol. Microbiol., 17:85-93 [1995]). Los loci CRISPR difieren tipicamente de otros SSRs por la estructura de las repeticiones, que se han denominado repeticiones cortas regularmente espaciadas (SRSRs) (Janssen et al., OMICS J. Integ. Biol., 6:2333 [2002]; y Mojica et. al., Mol Microbiol, 36:244-246 [2000]). En general, las repeticiones son elementos cortos que se producen en grupos que estan espaciados regularmente por secuencias intermedias unicas con una longitud sustancialmente constante (Mojica et al., [2000], supra). Aunque las secuencias de repeticion estan altamente conservadas entre las cepas, el numero de repeticiones intercaladas y las secuencias de las regiones del espaciador difieren tipicamente de una cepa a otra (van Embden et al., J. Bacteriol., 182:2393-2401 [2000]). Loci CRlSpR han sido identificados en mas de 40 procariotas (Vease, p. ej., Jansen et al, Mol. Microbiol., 43:1565-1575 [2002]; y Mojica et al., [2005]), incluyendo, pero no limitado a Aeropyrum, Pyrobaculum, Sulfolobus, Archaeoglobus, Halocarcula, Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus, Pyrococcus, Picrophilus, Thermoplasma, Corynebacterium, Mycobacterium, Streptomyces, Aquifex, Porphyromonas, Chlorobium, Thermus, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Clostridium, Thermoanaerobacter, Mycoplasma, Fusobacterium, Azarcus, Chromobacterium, Neisseria, Nitrosomonas, Desulfovibrio, Geobacter, Myxococcus, Campylobacter, Wolinella, Acinetobacter, Erwinia, Escherichia, Legionella, Methylococcus, Pasteurella, Photobacterium, Salmonella, Xanthomonas, Yersinia, Treponema y Thermotoga.

En general, "sistema de CRISPR" se refiere colectivamente a transcritos y otros elementos implicados en la expresion de o dirigir la actividad de CRISPR-asociado ( "Cas") genes, incluyendo secuencias que codifican un gen Cas, una secuencia tracr (CRISPR trans-activante) (p. ej., tracrRNA o un tracrRNA parcial activo), una secuencia tracr-emparejamiento (que abarca una "repeticion directa" y una repeticion directa parcial procesada por tracrRNA en el contexto de un sistema de CRISPR endogeno), una secuencia grna(a la que tambien se alude como un "espaciador" en el contexto de un sistema de CRISPR endogeno), u otras secuencias y transcritos de un locus CRISPR. En realizaciones de la invencion, las expresiones secuencia grna y ARN grna se utilizan indistintamente. En algunas realizaciones, uno o mas elementos de un sistema de CRISPR se derivan de un sistema de CRISPR de tipo I, tipo II o de tipo III. En algunas realizaciones, uno o mas elementos de un sistema de CRISPR se derivan de un organismo particular que puede comprender un sistema de CRISPR endogeno tal como Streptococcus pyogenes. En general, un sistema de CRISPR se caracteriza por elementos que fomentan la formacion de un complejo de CRISPR en el sitio de una secuencia diana (al que tambien se alude como un protoespaciador en el contexto de un sistema de CRISPR endogeno). En el contexto de la formacion de un complejo de CRISPR, "secuencia diana" se refiere a una secuencia a la que una secuencia grna esta disenada para que tenga complementariedad, en donde la hibridacion entre una secuencia diana y una secuencia grna fomenta la formacion de un complejo de CRISPR. Una secuencia diana puede comprender cualquier polinucleotido tal como polinucleotidos de ADN o ARN. En algunas realizaciones, una secuencia diana se encuentra en el nucleo o citoplasma de una celula.

En realizaciones preferidas de la invencion, el sistema de CRISPR es un sistema de CRISPR de tipo II y la enzima Cas es Cas9, que cataliza la escision de ADN. La accion enzimatica por Cas9 derivada de Streptococcus pyogenes o cualquier Cas9 estrechamente relacionada genera roturas de doble cadena en las secuencias del sitio diana que se hibridan a 20 nucleotidos de la secuencia grna y que tienen una secuencia NGG del motivo adyacente al protoespaciador (PAM) despues de los 20 nucleotidos de la secuencia diana. La actividad de CRISPR a traves de Cas9 para el reconocimiento de ADN espedfico para el sitio y la escision se definen por la secuencia grna, la secuencia tracr que se hibrida en parte a la secuencia grna y la secuencia de PAM. Se describen mas aspectos del sistema de CRISPR en Karginov y Hannon. The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea, Mole Cell 2010, 15 de enero; 37(1): 7.

El locus de CRISPR de tipo II de Streptococcus pyogenes SF370 contiene un racimo de cuatro genes Cas9, Cas1, Cas2 y Csn1, asf como dos elementos de ARN no codificantes, tracrRNA y una matriz caractenstica de secuencias repetitivas (repeticiones directas) interespaciadas por tramos cortos de secuencias no repetitivas (espaciadores, aproximadamente de 30 pb cada uno). En este sistema, la rotura de doble cadena de ADN (DSB) fijada como objetivo se genera en cuatro etapas secuenciales (Figura 2A). En primer lugar, dos ARN no codificantes, la matriz pre-crRNA y tracrRNA se transcriben a partir del locus de CRISPR. En segundo lugar, tracrRNA se hibrida a las repeticiones directas de pre-crRNA, que se procesa luego en crRNAs maduros que contienen secuencias de espaciador individuales. En tercer lugar, el complejo crRNA:tracrRNA maduro dirige Cas9 a la diana de ADN que consiste en el protoespaciador y el PAM correspondiente a traves de la formacion de heteroduplex entre la region del espaciador del crRNA y el ADN del protoespaciador. Por ultimo, Cas9 media en la escision del ADN diana aguas arriba del PAM para crear una DSB dentro del protoespaciador (Figura 2A). La Figura 2B muestra la ubicacion nuclear de Cas9 optimizado en codones. Para fomentar la iniciacion de la transcripcion precisa, se selecciono el promotor U6 basado en ARN polimerasa III para impulsar la expresion de tracrRNA (Figura 2C). De manera similar, se desarrollo una construccion basada en el promotor U6 para expresar una matriz de pre-crRNA que consiste en un unico espaciador flanqueado por dos repeticiones directas (DRs, tambien abarcados por la expresion "secuencias de

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emparejamiento de tracr”; Figura 2C). El espaciador inicial se diseno para fijar como objetivo un sitio diana de 33 pares de bases (pb) (protoespaciador de 30 pb mas una secuencia del motivo de CRISPR (PAM) de 3 pb que satisface el motivo de reconocimiento de NGG de Cas9) en el locus EMX1 humano (Figura 2C), un gen clave en el desarrollo de la corteza cerebral.

Tfpicamente, en el contexto de un sistema de CRISPR endogeno, la formacion de un complejo de CRISPR (que puede comprender una secuencia grna hibridada a una secuencia diana y formando complejo con una o mas protemas Cas) resulta en la escision de una o las dos cadenas en o cerca de (p. ej., dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, o mas pares de bases) de la secuencia diana. Sin desear estar limitados por la teona, la secuencia tracr, que puede comprender o consistir en la totalidad o una porcion de una secuencia tracr de tipo salvaje (p. ej., aproximadamente o mas de aproximadamente 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85, o mas nucleotidos de una secuencia tracr de tipo salvaje), tambien pueden formar parte de un complejo de CRISPR, tal como mediante la hibridacion a lo largo de al menos una porcion de la secuencia de tracr a la totalidad o una parte de una secuencia de emparejamiento tracr que esta enlazada operativamente a la secuencia grna. En algunas realizaciones, uno o mas vectores que impulsan la expresion de uno o mas elementos de un sistema de CRISPR se introducen en una celula huesped de manera que la expresion de los elementos del sistema de CRISPR dirigen la formacion de un complejo de CRISPR en uno o mas sitios diana. Por ejemplo, una enzima Cas, una secuencia grna enlazada a una secuencia tracr-emparejamiento, y una secuencia de tracr podnan ser unidas operativamente en cada caso para separar elementos reguladores en vectores separados. Alternativamente, dos o mas de los elementos expresados a partir de los mismos o diferentes elementos reguladores, se pueden combinar en un solo vector, con uno o mas vectores adicionales que proporcionan cualesquiera componentes del sistema de CRISPR no incluidos en el primer vector. Elementos del sistema de CRISPR que se combinan en un unico vector pueden estar dispuestos en cualquier orientacion adecuada, tal como un elemento situado en 5' con respecto a ("aguas arriba" de) o 3' con respecto a ("aguas abajo" de) un segundo elemento. La secuencia codificadora de un elemento puede estar situada en la misma o en una cadena diferente de la secuencia codificadora de un segundo elemento, y estar orientada en la misma o en direccion opuesta. En algunas realizaciones, un unico promotor dirige la expresion de un transcrito que codifica una enzima de CRISPR y una o mas de la secuencia grna, secuencia de emparejamiento tracr (opcionalmente enlazada operativamente a la secuencia de grna) y una secuencia de tracr incrustada dentro de una o mas secuencias de intrones (p. ej., cada una en un intron diferente, dos o mas en al menos un intron, o todas en un solo intron). En algunas realizaciones, la enzima de CRISPR, la secuencia grna, la secuencia de emparejamiento tracr y la secuencia tracr estan enlazadas operativamente a y son expresada a partir del mismo promotor.

En algunas realizaciones, un vector puede comprender uno o mas sitios de insercion, tales como una secuencia de reconocimiento de endonucleasa de restriccion (al que tambien se alude como un "sitio de clonacion"). En algunas realizaciones, uno o mas sitios de insercion (p. ej., aproximadamente o mas de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o mas sitios de insercion) estan situados aguas arriba y/o aguas abajo de uno o mas elementos de secuencia de uno o mas vectores. En algunas realizaciones, un vector puede comprender un sitio de insercion aguas arriba de una secuencia de emparejamiento tracr y, opcionalmente, aguas abajo de un elemento regulador enlazado operativamente a la secuencia de emparejamiento tracr, de tal manera que despues de la insercion de una secuencia grna en el sitio de insercion y tras la expresion de la secuencia grna dirige la union espedfica para la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia diana en una celula eucariota. En algunas realizaciones, un vector puede comprender dos o mas sitios de insercion, estando situado cada uno de los sitios de insercion entre dos secuencias de emparejamiento tracr con el fin de permitir la insercion de una secuencia grna en cada uno de los sitios. En una disposicion de este tipo, las dos o mas secuencias grna pueden comprender dos o mas copias de una unica secuencia grna, dos o mas secuencias grna diferentes, o combinaciones de estas. Cuando se utilizan multiples secuencias grna diferentes, se puede utilizar una unica construccion de expresion para fijar como objetivo la actividad de CRISPR a multiples secuencias diana diferentes, correspondiente, dentro de una celula. Por ejemplo, un unico vector puede comprender aproximadamente o mas de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, o mas secuencias grna. En algunas realizaciones, pueden proporcionarse aproximadamente o mas de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas de dichos vectores que contienen la secuencia grna, y opcionalmente suministrarse a una celula.

En algunas realizaciones, un vector puede comprender un elemento regulador enlazado operativamente a una secuencia codificadora de la enzima que codifica una enzima de CRISPR tal como una protema Cas. Ejemplos no limitantes de protemas Cas incluyen Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (tambien conocida como Csn1 y Csx12), Cas 10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, homologfas de las mismas, o versiones modificadas de las mismas. En algunas realizaciones, la enzima de CRISPR no modificada tiene actividad de escision de ADN, tal como Cas9. En algunas realizaciones, la enzima de CRISPR dirige la escision de una o ambas cadenas en la ubicacion de una secuencia diana, tal como dentro de la secuencia diana y/o dentro del complemento de la secuencia diana. En algunas realizaciones, la enzima de CRISPR dirige la escision de una o ambas cadenas dentro de aproximadamente

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1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, o mas pares de bases desde el primer o el ultimo nucleotidos de una secuencia diana. En algunas realizaciones, un vector codifica una enzima de CRISPR que esta mutada con respecto a una enzima de tipo salvaje correspondiente, de tal manera que la enzima de CRISPR mutada carece de la capacidad de escindir una o ambas cadenas de un polinucleotido diana que contiene una secuencia diana. Por ejemplo, una sustitucion-aspartato-a alanina (D10A) en el dominio catalftico RuvC I de Cas9 de S. pyogenes convierte Cas9 de una nucleasa que escinde ambas hebras en una nicasa (escinde una sola cadena). Otros ejemplos de mutaciones que hacen de Cas9 una nicasa incluyen, sin limitacion, H840A, N854A y N863A. Como ejemplo adicional, dos o mas dominios catalfticos de Cas9 (RuvC I, RuvC II, y RuvC III o el dominio HNH) pueden mutarse para producir una Cas9 mutada que carece sustancialmente de toda la actividad de escision de ADN. En algunas realizaciones, una mutacion D10A se combina con uno o mas mutaciones de H840A, N854A o N863A para producir una enzima Cas9 que carece sustancialmente de toda la actividad de escision de ADN. En algunas realizaciones, una enzima de CRISPR se considera que carece sustancialmente de toda la actividad de escision de ADN cuando la actividad de escision de ADN de la enzima mutada es menor que aproximadamente 25%, 10%, 5%, 1%, 0,1%, 0,01%, o mas baja con respecto a su forma no mutada. En los casos en los que la enzima no es SpCas9, las mutaciones se pueden realizar en cualquiera o en todos los residuos correspondientes a las posiciones 10, 762, 840, 854, 863 y/o 986 de SpCas9 (que puede determinarse, por ejemplo, mediante herramientas de comparacion de secuencias estandar. En particular, cualquiera o todas de las siguientes mutaciones se prefieren en SpCas9: D10A, E762A, H840A, N854A, N863A y/o D986A; asf como tambien esta prevista la sustitucion conservadora para cualquiera de los aminoacidos de reemplazo. Tambien se prefieren las mismas (o sustituciones conservativas de estas mutaciones) en posiciones correspondientes en otras Cas9s. Son particularmente preferidas D10 y H840 en SpCas9. Sin embargo, en otros Cas9s, tambien se prefieren los residuos correspondientes a SpCas9 D10 y H840.

Una sustitucion aspartato-a-alanina (D10A) en el dominio catalftico RuvC I de SpCas9 fue disenado para convertir la nucleasa en una nicasa (SpCas9n) (vease, p. ej., Sapranauskas et al., 2011, Nucleic Acid Research, 39: 9275; Gasiunas et al., 2012, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109:E2579), de manera que el ADN genomico mellado sufre la reparacion dirigida a homologfa de alta fidelidad (HDR). El ensayo Surveyor confirmo que SpCas9n no genera indeles en la diana protoespaciador EMX1. La co-expresion de crRNA quimerico que fija como objetivo EMX1 (que tiene asimismo el componente tracrRNA) con SpCas9 produjo indeles en el sitio diana, mientras que la co-expresion con SpCas9n no lo hizo (n = 3). Ademas de ello, la secuenciacion de 327 amplicones no detecto indeles inducidos por SpCas9n. El mismo locus fue seleccionado para testar HR mediada por CRISPR mediante co-transfeccion de celulas HEK 293FTcon el ARN quimerico que fija como objetivo EMX1, hSpCas9 o hSpCas9n, asf como un molde de HR para introducir un par de sitios de restriccion (HindIII y NheI) cerca del protoespaciador.

En esta memoria se describen ortologos preferidos. Una enzima Cas puede ser identificada Cas9, ya que esta puede referirse a la clase general de enzimas que comparten homologfa con la mayor nucleasa con multiples dominios nucleasa del sistema de CRISPR tipo II. Lo mas preferiblemente, la enzima Cas9 es, o se deriva de spCas9 o saCas9. Por derivarse, la solicitante quieren dar a entender que la enzima derivada se basa ampliamente, en el sentido de tener un alto grado de homologfa de secuencia con una enzima de tipo salvaje, pero que ha sido mutada (modificada) de alguna manera tal como se describe en esta memoria.

En algunas realizaciones, una secuencia codificadora de la enzima que codifica una enzima CRISPR esta optimizada en codones para la expresion en celulas particulares, tales como celulas eucariotas. Las celulas eucariotas pueden ser las de o derivadas de un organismo particular, tal como un mairftfero, incluyendo, pero no limitado a, ser humano, raton, rata, conejo, perro o primate no humano. En general, la optimizacion de codones se refiere a un proceso de modificar una secuencia de acido nucleico para la expresion potenciada en las celulas huespedes de interes mediante el reemplazo de al menos un codon (p. ej., aproximadamente o mas de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15,20, 25, 50, o mas codones) de la secuencia nativa con codones que son con mas frecuencia o lo mas frecuentemente utilizados en los genes de esa celula huesped, al tiempo que se mantiene la secuencia de aminoacidos nativa. Diversas especies exhiben una desviacion particular para ciertos codones de un aminoacido particular. Desviacion del codon (diferencias en el uso de codones entre organismos) se correlaciona a menudo con la eficacia de la traduccion de ARN mensajero (ARNm) que, es a su vez, se cree que depende, entre otros, de las propiedades de los codones que estan siendo traducidos y la disponibilidad de moleculas de ARN de transferencia (ARNt) particulares. El predominio de los ARNt seleccionados en una celula es, por lo general, un reflejo de los codones mas frecuentemente utilizados en la smtesis de peptidos. Por consiguiente, los genes pueden adaptarse para la expresion genica optima en un organismo dado sobre la base de la optimizacion de codones. Tablas de uso de codones estan facilmente disponibles, por ejemplo, en la base de datos "Codon Usage Database", disponible en
www.kazusa.orip/codon/fvisitada el 9 de julio de 2002), y estas tablas pueden ser adaptados en un cierto numero de maneras. Vease Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence database status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000). Tambien estan disponibles algoritmos informaticos para la optimizacion de codones de una secuencia particular para la expresion en una celula huesped particular, tal como Gene Forge (Aptagen; Jacobus, PA). En algunas realizaciones, uno o mas codones (p. ej., 1,2,

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3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, o mas, o todos los codones) en una secuencia que codifica una enzima de CRISPR corresponden al codon utilizado con mayor frecuencia para un aminoacido particular.

En algunas realizaciones, un vector codifica una enzima de CRISPR que puede comprender una o mas secuencias de localizacion nuclear (NLSs), tal como aproximadamente o mas de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas NLSs. En algunas realizaciones, la enzima de CRISPR puede comprender aproximadamente o mas de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o mas NLSs en o cerca del extremo amino, aproximadamente o mas de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o mas NLSs en o cerca del extremo carboxi, o una combinacion de estas (p. ej., una o mas NLS en el extremo amino y una o mas NLS en el extremo carboxi). Cuando esta presente mas de una NLS, cada una se puede seleccionar independientemente de las otras, de manera que una sola NLS puede estar presente en mas de una copia y/o en combinacion con una o mas de otras NLSs presentes en una o mas copias. En una realizacion preferida de la invencion, la enzima de CRISPR puede comprender como a lo sumo 6 NLSs. En algunas realizaciones, una NLS se considera cerca del extremo No C cuando el aminoacido mas cercano de la NLS esta dentro de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 o mas aminoacidos a lo largo de la cadena de polipeptido desde el extremo No C. Ejemplos no limitantes de NLSs incluyen una secuencia NLS derivada de: la NLS del antigeno T grande del virus SV40, que tiene la secuencia de aminoacidos PKKKRKV; la NLS del nucleoplasma (p. ej., la NLS bipartita nucleoplasmina con la secuencia KRPAATKKAGQAKKKK); las NLS c- myc que tienen la secuencia de aminoacidos PAaKrVKLD o RQRRNELKRSP; la NLS hRNPAl M9 que tiene la secuencia NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY; la secuencia

RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV del dominio IBB de importina-alfa; las secuencias VSRKRPRP y PPKKARED de la protema T mioma; la secuencia POPKKKPL de p53 humana; la secuencia SALIKKKKKMAP de raton c-abl IV; las secuencias DRLRR y PQKKRK del virus NS1 de la gripe; la secuencia RKLKKKIKKL del antfgeno delta del virus de la hepatitis; la secuencia REKKKFLKRR de la protema Mx1 de raton; la secuencia KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK de la poli(ADP-ribosa)polimerasa humana; y la secuencia RKCLQAGMNLEARKTKK del glucocorticoide de los receptores de hormonas esteroides (humanas).

En general, la una o mas NLSs son de una fuerza suficiente para impulsar la acumulacion de la enzima de CRISPR en una cantidad detectable en el nucleo de una celula eucariota. En general, la fuerza de la actividad de localizacion nuclear puede derivar del numero de NLSs en la enzima de CRISPR, la o las NLSs particulares utilizadas, o una combinacion de estos factores. La deteccion de la acumulacion en el nucleo puede ser realizada por cualquier tecnica adecuada. Por ejemplo, un marcador detectable puede estar fusionado a la enzima CRISPR, de manera que puede ser visualizada la ubicacion dentro de una celula, tal como en combinacion con medios para detectar la ubicacion del nucleo (p. ej., un colorante espedfico para el nucleo, tal como DAPI). Los nucleos de las celulas tambien pueden aislarse de las celulas, cuyos contenidos pueden luego ser analizados mediante cualquier procedimiento adecuado para la deteccion de protemas, tal como inmunohistoqmmica, transferencia Western o un ensayo de actividad enzimatica. La acumulacion en el nucleo tambien puede determinarse indirectamente tal como mediante un ensayo para el efecto de la formacion de complejos CRISPR (p. ej., ensayo para la escision o mutacion de ADN en la secuencia diana, o ensayo para la actividad de la expresion genica alterada, afectada por la formacion de complejos de CRISPR y/o actividad de la enzima de CRISPR), en comparacion con un control no expuesto a la enzima o complejo CRISPR, o expuesto a una enzima de CRISPR que carece de la una o mas NLSs.

En general, una secuencia grna es cualquier secuencia de polinucleotidos que tiene suficiente complementariedad con una secuencia de polinucleotidos diana para hibridarse con la secuencia diana y dirigir la union espedfica para la secuencia de un complejo de CRISPR a la secuencia diana. En algunas realizaciones, el grado de complementariedad entre una secuencia grna y su secuencia diana correspondiente, cuando se alinean optimamente utilizando un algoritmo de alineacion adecuado, se trata de o mas de aproximadamente 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99%, o mas. Un alineamiento optimo puede ser determinado con el uso de cualquier algoritmo adecuado para el alineamiento de secuencias, ejemplos no limitativos de los cuales incluyen el algoritmo de Smith-Waterman, el algoritmo de Needleman-Wunsch, algoritmos basados en la Transformada de Burrows-Wheeler (p. ej., el Alineador de Burrows Wheeler), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies; disponible en
www.novocraft.com), ELAND (Illumina, San Diego, CA), SOAP (disponible en soap.genomics.org.cn) y Maq (disponible en maq.sourceforge.net). En algunas realizaciones, una secuencia grna esta relacionada en aproximadamente o mas de aproximadamente 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 o mas nucleotidos de longitud. En algunas realizaciones, una secuencia grna es menor que aproximadamente 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, o menos nucleotidos de longitud. La capacidad de una secuencia de grna para dirigir union espedfica para la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia diana se puede determinar mediante cualquier ensayo adecuado. Por ejemplo, los componentes de un sistema de CRISPR, suficientes para formar un complejo de CRISPR, incluyendo la secuencia grna a ensayar, se pueden proporcionar a una celula huesped que tiene la secuencia diana correspondiente, tal como por transfeccion con vectores que codifican los componentes de la secuencia CRISPR, seguido de un estudio de escision preferencial dentro de la secuencia diana tal como el ensayo Surveyor como se describe en esta memoria. De manera similar, la escision de una secuencia de polinucleotido diana puede ser evaluada en un tubo de

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ensayo proporcionando la secuencia diana, componentes de un complejo de CRISPR, que incluye la secuencia gma a ensayar y una secuencia gma de control diferente de la secuencia gma de ensayo, y comparando la union o la tasa de escision en la secuencia diana entre las reacciones de ensayo y de la secuencia gma de control. Son posibles otros ensayos, y se les ocurriran a los expertos en la tecnica.

Una secuencia gma se puede seleccionar para fijar como objetivo cualquier secuencia diana. En algunas realizaciones, la secuencia diana es una secuencia dentro de un genoma de una celula. Secuencias diana a modo de ejemplo incluyen las que son unicas en el genoma diana. Por ejemplo, para la Cas9 de S. pyogenes, una secuencia diana unica en un genoma puede incluir un sitio diana Cas9 de la forma MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG, en que NNNNNNNNNNNNXGG (N es A, G, T, o C; y X puede ser cualquier cosa) tiene una sola aparicion en el genoma. Una secuencia diana unica en un genoma puede incluir un sitio diana Cas9 de S. pyogenes de la forma MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGG, en que NNNNNNNNNNNXGG (N es A, G, T, o C; y X puede ser cualquier cosa) tiene una sola aparicion en el genoma. Para la Cas9 de CRISPR1 de S. thermophilus, una secuencia diana unica en un genoma puede incluir un sitio diana Cas9 de la forma MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXXAGAAW, en que 'NNNNNNNNNNNNXXAGAAW (N es A. G, T, o C; X puede ser cualquier cosa, y W es A o T) tiene una sola aparicion en el genoma. Una secuencia diana unica en un genoma puede incluir un sitio diana Cas9 de CRISPR1 de S. thermophilus de la forma

MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXXAGAAW, en que NNNNNNNNNNNXXAGAAW (N es A, G, T, o C; X puede ser cualquier cosa, y W es A o T) tiene una sola aparicion en el genoma. Para la Cas9 de S. pyogenes, una secuencia diana unica en un genoma puede incluir un sitio diana Cas9 de la forma MMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGGXG, en que NNNNNNNNNNNNXGGXG (N es A, G, T, o C; y X puede ser cualquier cosa) tiene una sola aparicion en el genoma. Una secuencia diana unica en un genoma puede incluir un sitio diana Cas9 de S. pyogenes de la forma MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGGXG, en que NNNNNNNNNNNXGGXG (N es A, G, T, o C; y X puede ser cualquier cosa) tiene una sola aparicion en el genoma. En cada una de estas secuencias "M" puede ser A, G, T o C, y no necesita ser considerada en la identificacion de una secuencia como la unica.

En algunas realizaciones, se selecciona una secuencia gma para reducir el grado de estructura secundaria dentro de la secuencia gma. En algunas realizaciones, aproximadamente de o menos de aproximadamente 75%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, o menos de los nucleotidos de la secuencia gma participa en el apareamiento de bases auto-complementario cuando se pliega de manera optima. El plegamiento optimo puede ser determinado por cualquier algoritmo de plegamiento de polinucleotidos adecuado. Algunos programas se basan en el calculo de la energfa libre minima de Gibbs. Un ejemplo de un algoritmo de este tipo es mFold, tal como se describe por Zuker y Stiegler (Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133-148). Otro ejemplo de algoritmo de plegamiento esta en el servidor web en lmea RNAfold, desarrollado en el Instituto de Qmmica Teorica de la Universidad de Viena, utilizando el algoritmo de prediccion de estructura centroide (vease, p. ej., A.R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 2324, y PA Carr y GM Church 2009, Nature Biotechnology 27(12):1151-62).

En general, una secuencia de emparejamiento tracr incluye cualquier secuencia que tiene una suficiente complementariedad con una secuencia tracr para fomentar uno o mas de: (1) la escision de una secuencia gma flanqueada por secuencias de emparejamiento tracr en una celula que contiene la secuencia tracr correspondiente; y (2) la formacion de un complejo de CRISPR en una secuencia diana, en donde el complejo CRISPR puede comprender la secuencia de emparejamiento tracr hibridada a la secuencia de tracr. En general, el grado de complementariedad es con referencia al alineamiento optimo de la secuencia de emparejamiento tracr y la secuencia tracr, a lo largo de la longitud de la mas corta de las dos secuencias. El alineamiento optimo puede ser determinado por cualquier algoritmo de alineamiento adecuado, y puede representar, ademas, estructuras secundarias tales como la auto-complementariedad dentro de la secuencia de tracr o la secuencia de emparejamiento tracr. En algunas realizaciones, el grado de complementariedad entre la secuencia tracr y la secuencia de emparejamiento tracr a lo largo de la longitud de la mas corta de las dos cuando se alinean optimamente es de aproximadamente o mas de aproximadamente 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97,5%, 99%, o superior. En algunas realizaciones, la secuencia de tracr es aproximadamente o mas de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, o mas nucleotidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia tracr y la secuencia de emparejamiento tracr estan contenidas dentro de un unico transcrito, de modo que la hibridacion entre los dos produce un transcrito que tiene una estructura secundaria, tal como una horquilla. En una realizacion de la invencion, el transcrito o secuencia de polinucleotido transcrita tiene al menos dos o mas horquillas. En realizaciones preferidas, el transcrito tiene dos, tres, cuatro o cinco horquillas. En una realizacion adicional de la invencion, el transcrito tiene a lo sumo cinco horquillas. En una estructura de horquilla, la parte de la secuencia 5' del final "N" y aguas arriba del bucle corresponde a la secuencia de emparejamiento de tracr, y la parte de la secuencia 3' del bucle corresponde a la secuencia de tracr. Ejemplos no limitantes adicionales de polinucleotidos sencillos que pueden comprender una secuencia gma, una secuencia de emparejamiento de tracr y una secuencia de tracr son como sigue (listados de 5' a 3'), en donde "N" representa una base de una secuencia gma, el primer bloque de letras en minuscula representa la secuencia de

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emparejamiento de tracr y el segundo bloque de letras en minuscula representa la secuencia tracr, y la secuencia poli-T final representa el terminador de la transcripcion:

(1)

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaagatttaGAAAtaaatcttgcagaagctacaaagataaggctt

catgccgaaatcaacaccctgteattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT; (2)

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatca

acaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT; (3)

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatca acaccctgtcattttatggcagggtgtTTTTTT; (4)

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaa agtggcaccgagtcggtgcTTTTTT; (5)

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaa aaagtgTTTTTTT;

y '(6)

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctagAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaTTTTT TTT. En algunas realizaciones, las secuencias (1) a (3) se utilizan en combinacion con Cas9 de S. thermophilius CRISPR1. En algunas realizaciones, las secuencias (4) a (6) se utilizan en combinacion con Cas9 de S. pyogenes. En algunas realizaciones, la secuencia de tracr es un transcrito separado de un transcrito que puede comprender la secuencia de emparejamiento de tracr.

En algunas realizaciones, tambien se proporciona un molde de recombinacion. Un molde de recombinacion puede ser un componente de otro vector tal como se describe en esta memoria, contenido en un vector separado, o proporcionado como un polinucleotido separado. En algunas realizaciones, un molde de recombinacion esta disenado para servir como un molde en la recombinacion homologa tal como dentro o cerca de una secuencia diana mellada o escindida por una enzima de CRISPR como parte de un complejo de CRISPR. Un polinucleotido molde puede ser de cualquier longitud adecuada, tal como aproximadamente o mas de aproximadamente 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000, o mas nucleotidos de longitud. En algunas realizaciones, el polinucleotido molde es complementario a una parte de un polinucleotido que puede comprender la secuencia diana. Cuando se alinean optimamente, un polinucleotido molde podna solaparse con uno o mas nucleotidos de una secuencia diana (p. ej., aproximadamente o mas de aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, o mas nucleotidos). En algunas realizaciones, cuando una secuencia de un molde y un polinucleotido, que puede comprender una secuencia diana, se alinean de manera optima, el nucleotido mas proximo del polinucleotido del molde esta dentro de aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 5000, 10000, o mas nucleotidos de la secuencia diana.

En algunas realizaciones, la enzima de CRISPR es parte de una protema de fusion que puede comprender uno o mas dominios de protemas heterologos (p. ej., aproximadamente o mas de aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o mas dominios, ademas de la enzima de CRISPR). Una protema de fusion enzima de CRISPR puede comprender cualquier secuencia de la protema adicional, y opcionalmente una secuencia de union entre cualquiera de dos dominios. Ejemplos de dominios de protemas que pueden fusionarse con una enzima de CRISPR incluyen, sin limitacion, macadores de epttopos, secuencias de gen indicador y dominios de protemas que tienen una o mas de las siguientes actividades: actividad metilasa, actividad desmetilasa, actividad de activacion de la transcripcion, actividad de represion de la transcripcion, actividad del factor de liberacion de la transcripcion, actividad de la modificacion de histonas, actividad de escision del ARN y actividad de union a acido nucleico. Ejemplos no limitantes de marcadores de epttopos incluyen marcadores de histidina (His), marcadores V5, marcadores FLAG, marcadores de hemaglutinina de la gripe (Ha), marcadores Myc, marcadores VSV-G y marcadores de tiorredoxina (Trx). Ejemplos de genes informadores incluyen, pero no se limitan a, glutation-S-transferasa (GST), peroxidasa de rabano picante (HRP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), beta-galactosidasa, beta-glucuronidasa, luciferasa, protema fluorescente verde (GFP), HcRed, DsRed, protema fluorescente cian (CFP), protema amarilla fluorescente (YFP) y protemas autofluorescentes incluyendo la protema fluorescente azul (BFP). Una enzima de CRISPR puede fusionarse a una secuencia de gen que codifica una protema o un fragmento de una protema que une moleculas de ADN o une otras moleculas celulares, incluyendo pero no limitada a la protema de union a maltosa (MBP), S-tag, fusiones del dominio de union a ADN (DBD) de Lex A, fusiones del dominio de union a ADN de GAL4 y fusiones de la protema BP16 del virus herpes simplex (HSV). Dominios adicionales que pueden formar parte de una protema de

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fusion que puede comprender una enzima de CRISPR se describen en el documento US20110059502. En algunas realizaciones, se utiliza una enzima de CRISPR marcada para identificar la ubicacion de una secuencia diana.

En algunos aspectos, la invencion proporciona metodos que pueden comprender suministrar uno o mas polinucleotidos, tales como o uno o mas vectores tal como se describen en esta memoria, uno o mas transcritos de los mismos, y/o una o mas protemas transcritas de los mismos, a una celula huesped. En algunos aspectos, la invencion proporciona, ademas, celulas producidas por tales metodos, y animales que pueden comprender o producidos a partir de tales celulas. En algunas realizaciones, una enzima de CRISPR en combinacion con (y opcionalmente formando complejo con) una secuencia grna se suministra a una celula. Metodos de transferencia genica basados en virus y no virales convencionales pueden utilizarse para introducir acidos nucleicos en celulas de mairnfero o tejidos diana. Tales metodos se pueden utilizar para administrar acidos nucleicos que codifican componentes de un sistema de CRISPR para celulas en cultivo, o en un organismo huesped. Sistemas de suministro de vectores no virales incluyen plasmidos de ADN, ARN (p. ej., un transcrito de un vector descrito en esta memoria), acido nucleico desnudo y acido nucleico formando complejo con un vehmulo de suministro, tal como un liposoma. Sistemas de suministro de vectores virales incluyen virus de ADN y ARN, que tienen genomas episomales o integrados despues dl suministro a la celula. Para una revision de procedimientos de terapia genica, vease Anderson, Science 256: 808-813 (1992); Nabel y Felgner, TIBTECH 11: 211-217 (1993); Mitani y Caskey, TIBTECH 11;162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357: 455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer y Perricaudet. British Medical Bulletin 51(1 ):31-44 (1995); Haddada et al., en Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler y Bohm (comps.) (1995); y Yu et al, Gene Therapy 1:13-26 (1994).

Metodos de suministro no viral de acidos nucleicos incluyen lipofeccion, microinyeccion, biolfstica, virosomas, liposomas, inmunoliposomas, polication o conjugados de lfpido:acido nucleico, ADN desnudo, viriones artificiales y absorcion potenciada por agente de ADN. La lipofeccion se describe, p. ej., en las patente de EE.UU. N°s. 5.049.386, 4.946.787; y 4.897.355) y reactivos de lipofeccion se venden comercialmente (p. ej., Transfectam™ y Lipofectin™). Lfpidos cationicos y neutros que son adecuados para una lipofeccion de reconocimiento de receptores eficiente de polinucleotidos incluyen los de Felgner, documento WO 91/17424; documento WO 91/16024. El suministro puede ser a celulas (p. ej., administracion in vitro o ex vivo) o tejidos diana (p. ej., la administracion in vivo).

La preparacion de complejos de lfpido:acido nucleico, incluyendo liposomas fijados como objetivo tales como complejos de inmunolfpidos, es bien conocida para un experto en la tecnica (vease, p. ej., Crystal, Science 270: 404410 (1995); Blaese et al , Cancer Gene Ther. 2: 291-297 (1995); Behr et al, Bioconjugate Chem. 5: 382-389 (1994); Remy et al, Bioconjugate Chem 5: 647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52: 4817-4820 (1992); patentes de EE.UU. N°s 4.186.183, 4.217.344, 4.235.871, 4.261.975, 4.485.054, 4.501.728, 4.774.085, 4.837.028 y 4.946.787).

El uso de sistemas basados en virus de ARN o ADN para el suministro de acidos nucleicos aprovecha los procesos altamente evolucionados para fijar como objetivo un virus a celulas espedficas en el cuerpo y el trafico de la carga util viral al nucleo. Vectores virales pueden administrarse directamente a los pacientes (in vivo) o pueden utilizarse para tratar celulas in vitro y las celulas modificadas se pueden opcionalmente administrar a pacientes (ex vivo). Sistemas basados en virus convencionales podnan incluir vectores retroviral, de lentivirus, de virus adeno-asociados y de virus del herpes simplex para la transferencia de genes. La integracion en el genoma huesped es posible con metodos de transferencia de genes de retrovirus, lentivirus y virus adeno-asociados, a menudo resulta en la expresion a largo plazo del transgen insertado. Adicionalmente, las elevadas eficiencias de la transduccion se han observado en muchos tipos de celulas y tejidos diana diferentes.

El tropismo de un retrovirus puede alterarse por incorporacion de protemas de la envoltura extrana y expansion de la poblacion diana potencial de celulas diana. Los vectores lentivirales son vectores retrovirales que son capaces de transducir o infectar celulas que no se dividen y que producen tipicamente altos tftulos virales. Por lo tanto, la seleccion de un sistema de transferencia de genes retroviral dependena del tejido diana. Los vectores retrovirales se componen de repeticiones cis-terminales de larga accion con capacidad de empaquetamiento para hasta 6-10 kb de secuencia extrana. LTRs que actuan en cis mmimos son suficientes para la replicacion y el empaquetamiento de los vectores, que se utilizan luego para integrar el gen terapeutico en la celula objetivo para proporcionar una expresion del transgen permanente. Vectores retrovirales ampliamente utilizados incluyen los basados en virus de la leucemia murina (MuLV), virus de la leucemia del mono gibon (GaLV), virus de la inmunodeficiencia de simios (SIV), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y combinaciones de los mismos (vease, p. ej., Buchscher et al., J. Virol. 66:27312739 (1992); Johann et al, J. Virol. 66: 1635-1640 (1992); Sommnerfelt et al, Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63: 2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); documento PCT/US94/05700).

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En aplicaciones en las que se prefiere la expresion transitoria, se pueden utilizar sistemas basados en adenovirus. Los vectores basados en adenovirus son capaces de una muy alta eficiencia de transduccion en muchos tipos de celulas y no requieren la division celular. Con este tipo de vectores se han obtenido un titulo y niveles de expresion altos. Este vector puede producirse en grandes cantidades en un sistema relativamente simple. Vectores de virus adeno-asociados ("AAV") tambien pueden utilizarse para transducir celulas con acidos nucleicos diana, p. ej., en la produccion in vitro de acidos nucleicos y peptidos, y para procedimientos de terapia genica in vivo y ex vivo (vease, p. ej., West et al., Virology 160:38-47 (1987); patente de EE.UU. N°. 4.797.368; documento WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994). La construccion de vectores AAV recombinantes se describe en un cierto numero de publicaciones, incluyendo la patente de EE.UU. N°. 5,173,414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat y Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); y Samulski et al., J. Virol. 63: 03822-3828 (1989).

Celulas de empaquetamiento se utilizan tipicamente para formar partmulas de virus que son capaces de infectar una celula huesped. Tales celulas incluyen celulas 293, que empaquetan adenovirus, y celulas ^2 o celulas PA317, que empaquetan retrovirus. Los vectores virales utilizados en terapia genica se generan habitualmente por el productor de una lmea celular que empaqueta un vector de acido nucleico en una partmula viral. Los vectores contienen tipicamente las secuencias virales mmimas requeridas para el empaquetamiento y la posterior integracion en un huesped, siendo reemplazadas otras secuencias virales por una casete de expresion para el o los polinucleotidos a expresar. Las funciones virales que faltan se suministran normalmente en trans por la lmea celular de empaquetamiento. Por ejemplo, los vectores AAV utilizados en terapia genica poseen tipicamente solo secuencias ITR del genoma de AAV que se requieren para el empaquetamiento y la integracion en el genoma huesped. El ADN viral se empaqueta en una lmea celular, que contiene un plasmido auxiliar que codifica los otros genes AAV, a saber rep y cap, pero que carece de secuencias ITR. La lmea celular tambien puede estar infectada con adenovirus como un helper (cooperador). El virus helper fomenta la replicacion del vector AAV y la expresion de genes AAV a partir del plasmido helper. El plasmido helper no esta empaquetado en cantidades significativas debido a una carencia de secuencias ITR. La contaminacion con adenovirus puede reducirse mediante, p. ej., tratamiento termico al que el adenovirus es mas sensible que AAV. Metodos adicionales para el suministro de acidos nucleicos a las celulas son conocidos por los expertos en la tecnica. Vease, por ejemplo, el documento US20030087817.

En algunas realizaciones, una celula huesped es transfectada de forma transitoria o no transitoria con uno o mas vectores descritos en esta memoria. En algunas realizaciones, una celula se transfecta tal como se produce de forma natural en un sujeto. En algunas realizaciones, una celula que se transfecta se toma de un sujeto. En algunas realizaciones, la celula se deriva de celulas tomadas de un sujeto tal como una lmea celular. En la tecnica se conoce una amplia diversidad de lmeas celulares para el cultivo de tejidos. Ejemplos de lmeas celulares incluyen, pero no se limitan a, C8161 CCRF-CEM, MOLT, mIMCD-3, NHDF, HeLa-S3, Huh1, Huh4, Huh7, HUVEC, HASMC, HEKn, HEKa, MiaPaCelI, Panc1, PC-3, TF1, CTLL-2, C1R, Rat6, CV1, RPTE, A10, T24, J82, A375, ARH-77, Calu1, SW480, SW620, SKOV3, SK-UT, CaCo2, P388D1, SEM-K2, WEHI-231, HB56, TIB55, Jurkat, J45.01, LRMB, Bcl-1, BC-3, IC21, DLD2, Raw264.7, NRK, NRK-52E, MRC5, MEF, Hep G2, HeLa B, HeLa T4, COS, COS-1, COS-6, COS- M6A, BS-C-1 epitelial del rinon de mono, fibroblastos de embrion de raton BALB/ 3T3, 3T3 Swiss, 3T3-L1, fibroblastos fetales humanos 132-d5; fibroblastos de raton 10.1, 293-T, 3T3, 721, 9L, A2780, A2780ADR, A2780cis, A172, A20, A253, A431, A-549, ALC, B16, B35, celulas BCP-1, BEAS-2B, bEnd.3, BHK-21, BR 293, BxPC3, C3H- 10T1/2, C6/36, Cal-27, CHO, CHO-7, CHO-IR, CHO-K1, CHO-K2, CHO-T, CHO Dhfr -/-, COR-L23, COR-L23/CPR, COR-L23/5010, COR-L23/R23, COS-7, COV-434, CML T1, CMT, CT26, D17, DH82, DU145, DuCaP, EL4, EM2, EM3, EMT6/AR1, EMT6/AR10.0, FM3, H1299, H69, HB54, HB55, HCA2, HEK-293, HeLa, Hepa1c1c7, HL-60, HMEC, HT-29, Jurkat, celulas JY, celulas K562, Ku812, KCL22, KG1, KEYO1, LNCap, Ma-Mel 1-48, MC-38, MCF-7, MCF-10A, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-435, MDCK II, MDCK II, MOR/0.2R, MONO-MAC 6, MTD-1A, MyEnd, NCI-H69/CPR, NCI-H69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI-H69/LX4, NIH-3T3, NALM-1, NW-145, OPCN / OPCT cell lines, Peer, PNT-1A / PNT 2, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, celulas Saos-2, Sf-9, SkBr3, T2, T-47D, T84, lmea celular THP1, U373, U87, U937, VCaP, celulas Vero, WM39, WT-49, X63, YAC-1, YAR, y variedades transgenicas de las mismas. Las lmeas celulares estan disponibles de una diversidad de fuentes conocidas por los expertos en la tecnica (vease, p. ej., American Type Culture Collection (ATCC) (Manassus, Va.)). En algunas realizaciones, una celula transfectada con uno o mas vectores descritos en esta memoria se utiliza para establecer una nueva lmea celular que puede comprender una o mas secuencias derivadas del vector. En algunas realizaciones, una celula transfectadas transitoriamente con los componentes de un sistema de CRISPR, tal como se describe en esta memoria (por ejemplo, por transfeccion transitoria de uno o mas vectores, o la transfeccion con ARN), y modificadas a traves de la actividad de un complejo de CRISPR, se utiliza para establecer una nueva lmea celular que puede comprender celulas que contienen la modificacion, pero que carecen de cualquier otra secuencia exogena. En algunas realizaciones, las celulas transfectadas de forma transitoria o no transitoria con uno o mas vectores descritos en esta memoria, o lmeas celulares derivadas de estas celulas se utilizan en la evaluacion de uno o mas compuestos de ensayo.

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En algunas realizaciones, uno o mas vectores descritos en esta memoria se utilizan para producir un animal transgenico no humano o planta transgenica. En algunas realizaciones, el animal transgenico es un mairnfero, tal como un raton, rata o conejo. Metodos para producir plantas y animales transgenicos son conocidos en la tecnica, y generalmente comienzan con un metodo de transfeccion celular tal como se describe en esta memoria.

Con los recientes progresos en genomica de cultivos, la capacidad de utilizar los sistemas de CRISPR-Cas para llevar a cabo la edicion y la manipulacion de genes eficiente y rentable permitira la rapida seleccion y la comparacion de manipulaciones geneticas individuales y multiplexadas para transformar dichos genomas para una produccion mejorada y rasgos potenciados. A este respecto se hace referencia a las patentes y publicaciones de EE.UU. Patente de EE.UU. N° 6.603.061 - Agrobacterium-Mediated Plant Transformation Method; patente de EE.UU. N°. 7.868.149 - Plant Genome Sequences and Uses Thereof y de EE.UU. 2009/0100536 - Transgenic Plants with Enhanced Agronomic Traits. En la practica de la invencion tambien se mencionan el contenidos y la descripcion de Morrell et al "Crop genomics:advances and applications" Nat Rev Genet. 29 dic. 2011;13(2):85-96 En una forma de realizacion ventajosa de la invencion, el sistema CRISPR/Cas9 se utiliza para modificar geneticamente microalgas. Por consiguiente, referencia en esta memoria a celulas animales tambien se puede aplicar, mutatis mutandis, a celulas vegetales, a menos que de otro modo resulte evidente.

En plantas, los patogenos son a menudo espedficos para el huesped. Por ejemplo, Fusarium oxysporum f. sp.lycopersici provoca el marchitamiento del tomate, pero ataca solo al tomate, y F. oxysporum f. dianthii Puccinia graminis f. sp. tritici ataca solamente al trigo. Las plantas tienen defensas existentes e inducidas para resistir frente a la mayona de los patogenos. Mutaciones y eventos de recombinacion a traves de generaciones de plantas conducen a la variabilidad genetica que da lugar a la susceptibilidad, especialmente ya que los patogenos se reproducen con mas frecuencia que las plantas. En las plantas puede no haber resistencia al huesped, p. ej., el huesped y el patogeno son incompatibles. Tambien puede haber Resistencia Horizontal, p. ej., la resistencia parcial contra todas las razas de un patogeno, tfpicamente controladas por muchos genes, y la Resistencia Vertical, p. ej., resistencia completa a algunas razas de un patogeno pero no a otras razas, tfpicamente controlada por unos pocos genes. En un nivel de Gen-a-Gen, las plantas y los patogenos evolucionan juntos, y los cambios geneticos en un equilibrio cambian a otro. En consecuencia, utilizando la Variabilidad Natural, los criadores combinan los genes mas utiles para el Rendimiento, la Calidad, Uniformidad, Dureza, Resistencia. Las fuentes de genes de resistencia incluyen Variedades nativas o extranas, variedades de Reliquia, Parientes de Plantas Silvestres y Mutaciones Inducidas, p. ej. tratando el material vegetal con agentes mutagenicos. Utilizando la presente invencion, los criadores de plantas estan provistos de una nueva herramienta para inducir mutaciones. Por consiguiente, un experto en la tecnica puede analizar el genoma de fuentes de genes de resistencia, y en las Variedades que tengan caractensticas o rasgos deseados, emplear la presente invencion para inducir el aumento de genes de resistencia, con mas precision que los agentes mutagenicos anteriores y, por lo tanto, para acelerar y mejorar los programas de cultivo.

En un aspecto, la invencion proporciona metodos de modificar un polinucleotido diana en una celula eucariota, que puede ser in vivo, ex vivo o in vitro. En algunas realizaciones, el metodo comprende el muestreo de una celula o poblacion de celulas de un animal humano o no humano o planta (incluyendo micro-algas), y la modificacion de la celula o celulas. El cultivo puede producirse en cualquier fase ex vivo. La celula o las celulas pueden incluso ser re- introducidos en el animal no humano o la planta (incluyendo micro-algas). Para las celulas reintroducidas se prefiere particularmente que las celulas sean celulas madre.

En un aspecto, la invencion proporciona metodos de modificar un polinucleotido diana en una celula eucariota. En algunas realizaciones, el metodo puede comprender permitir que un complejo de CRISPR se una al polinucleotido diana para efectuar la escision de dicho polinucleotido diana, modificando asf el polinucleotido diana, en el que el complejo de CRISPR puede comprender una enzima de CRISPR formando complejo con una secuencia grna hibridada a una secuencia diana dentro de dicho polinucleotido diana, en el que dicha secuencia grna esta unida a una secuencia de emparejamiento tracr que a su vez se hibrida a una secuencia de tracr.

En un aspecto, la invencion proporciona un metodo de modificar la expresion de un polinucleotido en una celula eucariota. En algunas realizaciones, el metodo puede comprender permitir que un complejo de CRISPR se una al polinucleotido de manera que dicha union resulte en una expresion incrementada o reducida de dicho polinucleotido; en el que el complejo de CRISPR puede comprender una enzima de CRISPR formando complejo con una secuencia grna hibridada a una secuencia diana dentro de dicho polinucleotido, en el que dicha secuencia grna esta enlazada a una secuencia de emparejamiento tracr que a su vez se hibrida a una secuencia de tracr.

En un aspecto, la invencion proporciona kits que contienen uno o mas de los elementos descritos en los metodos y las composiciones anteriores. Los elementos pueden proporcionarse individualmente o en combinaciones, y se

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pueden proporcionar en cualquier recipiente adecuado, tal como un vial, una botella, o un tubo. En algunas realizaciones, el kit incluye instrucciones en uno o mas idiomas, por ejemplo, en mas de un idioma.

En algunas realizaciones, un kit puede comprender uno o mas reactivos para su uso en un proceso que utiliza uno o mas de los elementos descritos en esta memoria. Los reactivos pueden proporcionarse en cualquier recipiente adecuado. Por ejemplo, un kit puede proporcionar uno o mas tampones de reaccion o de almacenamiento. Los reactivos se pueden proporcionar en una forma que sea utilizable en un ensayo particular, o en una forma que requiere la adicion de uno o mas de otros componentes antes de su uso (p. ej., en forma de concentrado o liofilizada). Un tampon puede ser cualquier tampon, incluyendo, pero no limitado a un tampon carbonato de sodio, un tampon bicarbonato de sodio, un tampon borato, un tampon Tris, un tampon MOPS, un tampon HEPES, y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el tampon es alcalino. En algunas realizaciones, el tampon tiene un pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 10. En algunas realizaciones, el kit puede comprender uno o mas oligonucleotidos correspondientes a una secuencia grna para la insercion en un vector con el fin de enlazar operativamente la secuencia grna y un elemento regulador. En algunas realizaciones, el kit puede comprender un polinucleotido molde de recombinacion homologa.

En un aspecto, la invencion proporciona metodos para usar uno o mas elementos de un sistema de CRISPR. El complejo de CRISPR de la invencion proporciona un medio eficaz para la modificacion de un polinucleotido diana. El complejo de CRISPR de la invencion tiene una amplia variedad de utilidad, incluyendo modificar (por ejemplo, suprimir, insertar, translocar, inactivar, activar) un polinucleotido diana en una multiplicidad de tipos de celulas. Como tal, el complejo de CRISPR de la invencion tiene un amplio espectro de aplicaciones en, p. ej., la terapia genica, el rastreo de farmacos, el diagnostico de enfermedades y el pronostico. Un complejo de CRISPR a modo de ejemplo puede comprender una enzima de CRISPR formando complejo con una secuencia grna hibridada a una secuencia diana dentro del polinucleotido diana. La secuencia grna esta enlazada a una secuencia de emparejamiento tracr que, a su vez, se hibrida a una secuencia de tracr.

En una realizacion, esta invencion proporciona un metodo para escindir un polinucleotido diana. El metodo puede comprender modificar un polinucleotido diana utilizando un complejo de CRISPR que se une al polinucleotido diana y efectua la escision de dicho polinucleotido diana. Tfpicamente, el complejo de CRISPR de la invencion, cuando se introduce en una celula, crea una ruptura (p. ej., una rotura de la cadena sencilla o doble) en la secuencia del genoma. Por ejemplo, el metodo puede utilizarse para escindir un gen de la enfermedad en una celula.

La ruptura creada por el complejo de CRISPR puede ser reparada por unos procesos de reparacion tales como la via de union de extremos no homologos (NHEJ) propensa a errores o la reparacion dirigida a la homologfa de alta fidelidad (HDR). Durante estos procesos de reparacion, un molde de polinucleotido exogeno puede ser introducido en la secuencia del genoma. En algunos metodos, el proceso de hDr se utiliza para modificar la secuencia del genoma. Por ejemplo, un molde de polinucleotido exogeno que puede comprender una secuencia que se ha de integrar flanqueada por una secuencia aguas arriba y una secuencia aguas abajo se introduce en una celula. Las secuencias aguas arriba y aguas abajo comparten similitud de secuencia con cualquiera de los lados del sitio de integracion en el cromosoma.

Cuando se desee, un polinucleotido donante puede ser ADN, p. ej., un plasmido de ADN, un cromosoma bacteriano artificial (BAC), un cromosoma artificial de levadura (YAC), un vector viral, un trozo lineal de ADN, un fragmento de la PCR, un acido nucleico desnudo, o un acido nucleico formando complejo con un vetnculo de suministro tal como un liposoma o poloxamero.

El molde de polinucleotido exogeno puede comprender una secuencia para ser integrada (p. ej., un gen mutado). La secuencia de integracion puede ser una secuencia endogena o exogena a la celula. Ejemplos de una secuencia a ser integrada incluyen polinucleotidos que codifican una protema o un ARN no codificante (p. ej., un microARN). Por lo tanto, la secuencia de la integracion puede estar operativamente enlazada a una secuencia o secuencias de control apropiadas. Alternativamente, la secuencia a ser integrada puede proporcionar una funcion reguladora.

Las secuencias de aguas arriba y aguas abajo del molde de polinucleotido exogeno se seleccionan para fomentar la recombinacion entre la secuencia cromosomica de interes y el polinucleotido donante. La secuencia de aguas arriba es una secuencia de acido nucleico que comparte similitud de secuencia con la secuencia del genoma de aguas arriba del sitio diana para la integracion. De manera similar, la secuencia de aguas abajo es una secuencia de acido nucleico que comparte similitud de secuencia con la secuencia cromosomica aguas abajo del sitio diana de la integracion. Las secuencias aguas arriba y aguas abajo en el molde de polinucleotido exogeno puede tener 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia del genoma de destino. Preferiblemente, las secuencias de aguas arriba y aguas abajo en la plantilla de polinucleotido exogeno tienen aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia del genoma fijada como objetivo. En

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algunos metodos, las secuencias de aguas arriba y aguas abajo en el molde de polinucleotido exogeno tienen aproximadamente el 99% o el 100% de identidad de la secuencia con la secuencia del genoma fijada como objetivo.

Una secuencia de aguas arriba o aguas abajo puede comprender de aproximadamente 20 pb a aproximadamente 2500 pb, por ejemplo, aproximadamente 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400 o 2500 pb. En algunos metodos, la secuencia aguas arriba o aguas abajo a modo de ejemplo tiene aproximadamente 200 pb a aproximadamente 2000 pb, aproximadamente 600 pb a aproximadamente 1000 pb, o mas particularmente aproximadamente 700 pb a aproximadamente 1000 pb.

En algunos metodos, el molde de polinucleotido exogeno puede comprender, ademas, un marcador. Este marcador puede hacer mas facil rastrear integraciones fijadas como objetivo. Ejemplos de marcadores adecuados incluyen sitios de restriccion, protemas fluorescentes o marcadores seleccionables. El molde de polinucleotido exogeno de la invencion puede construirse utilizando tecnicas recombinantes (vease, por ejemplo, Sambrook et al., 2001 y Ausubel et al., 1996).

En un metodo a modo de ejemplo, para la modificacion de un polinucleotido diana mediante la integracion de un molde de polinucleotido exogeno, se introduce en la secuencia del genoma una rotura de la cadena doble por el complejo de CRISPR, la ruptura se repara mediante recombinacion homologa de un molde de polinucleotido exogeno de tal forma que el molde se integra en el genoma. La presencia de una rotura de cadena doble facilita la integracion del molde.

En otras realizaciones, esta invencion proporciona un metodo para modificar la expresion de un polinucleotido en una celula eucariota. El metodo puede comprender aumentar o disminuir la expresion de un polinucleotido diana utilizando un complejo de CRISPR que se une al polinucleotido,

En algunos metodos, un polinucleotido diana puede ser inactivado para efectuar la modificacion de la expresion en una celula. Por ejemplo, tras la union de un complejo de CRISPR a una secuencia diana en una celula, el polinucleotido diana se inactiva de manera que la secuencia no se transcribe, la protema codificada no se produce o la secuencia no funciona como la secuencia de tipo salvaje. Por ejemplo, una protema o secuencia codificadora de microARN puede inactivarse de manera que no se produzca la protema.

En algunos metodos, una secuencia de control puede ser inactivada de manera que ya no funcione como una secuencia de control. Tal como se utiliza en esta memoria, "secuencia de control" se refiere a cualquier secuencia de acido nucleico que efectua la transcripcion, traduccion o la accesibilidad de una secuencia de acido nucleico. Ejemplos de una secuencia de control incluyen un promotor, un terminador de la transcripcion, y un promotor son secuencias de control.

La secuencia diana inactivada puede incluir una mutacion por delecion (es decir, la delecion de uno o mas nucleotidos), una mutacion por insercion (es decir, la insercion de uno o mas nucleotidos), o una mutacion sin sentido (es decir, la sustitucion de un unico nucleotido con otro nucleotido de modo que se introduce un codon de parada). En algunos metodos, la inactivacion de una secuencia diana da como resultado la "inactivacion" de la secuencia diana.

Un metodo de la invencion puede utilizarse para crear una planta, un animal o una celula que puede ser usado como un modelo de enfermedad. Tal como se utiliza en esta memoria, "enfermedad" se refiere a una enfermedad, trastorno o indicacion en un sujeto. Por ejemplo, un metodo de la invencion puede utilizarse para crear un animal o celula que puede comprender una modificacion en una o mas secuencias de acido nucleico asociadas con una enfermedad, o un animal o celula en el que se altera la expresion de una o mas secuencias de acido nucleico asociada con una enfermedad. Una secuencia de acido nucleico de este tipo puede codificar una secuencia de protema asociada a la enfermedad o puede ser una secuencia de control asociada a la enfermedad.

En algunos metodos, el modelo de la enfermedad se puede utilizar para estudiar los efectos de las mutaciones en el animal o la celula y el desarrollo y/o progreso de la enfermedad utilizando medidas de uso comun en el estudio de la enfermedad. Alternativamente, un modelo de enfermedad de este tipo es util para estudiar el efecto de un compuesto farmaceuticamente activo en la enfermedad.

En algunos metodos, el modelo de la enfermedad se puede utilizar para evaluar la eficacia de una potencial estrategia de terapia genica. Es decir, un gen o polinucleotido asociado a la enfermedad puede ser modificado de manera que se inhiba o se reduzca el desarrollo y/o el progreso de la enfermedad. En particular, el metodo puede

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comprender modificar un gen asociado a la enfermedad o polinucleotido de modo que se produzca una protema alterada y, como resultado, el animal o celula tiene una respuesta alterada. Por consiguiente, en algunos metodos, un animal modificado geneticamente puede ser comparado con un animal predispuesto al desarrollo de la enfermedad de manera que puede evaluarse el efecto del evento terapia genica.

En otra realizacion, esta invencion proporciona un metodo de desarrollar un agente biologicamente activo que modula un evento de senalizacion celular asociado con un gen de la enfermedad. El metodo puede comprender poner en contacto un compuesto de ensayo con una celula que puede comprender uno o mas vectores que impulsan la expresion de una o mas de una enzima de CRISPR, una secuencia gma enlazada a una secuencia de emparejamiento tracr y una secuencia de tracr; y detectar un cambio en una lectura que es indicativo de una reduccion o un aumento de un evento de senalizacion celular asociada con, p. ej., una mutacion en un gen de la enfermedad contenido en la celula.

Un modelo de celula o modelo animal se puede construir en combinacion con el metodo de la invencion para el rastreo de un cambio de la funcion celular. Un modelo de este tipo se puede utilizar para estudiar los efectos de una secuencia del genoma modificada por el complejo de CRISPR de la invencion en una funcion celular de interes. Por ejemplo, un modelo de la funcion celular se puede utilizar para estudiar el efecto de una secuencia de genoma modificado en la senalizacion intracelular o la senalizacion extracelular. Alternativamente, un modelo de la funcion celular se puede utilizar para estudiar los efectos de una secuencia del genoma modificado en la percepcion sensorial. En algunos de este tipo de modelos, se modifican las una o mas secuencias del genoma asociadas con una via bioqmmica de senalizacion en el modelo.

Una expresion alterada de una o mas secuencias del genoma asociadas con una via de senalizacion bioqmmica puede ser determinada por ensayo de una diferencia en los niveles de ARNm de los genes correspondientes entre la celula modelo de ensayo y una celula control, cuando estan en contacto con un agente candidato. Alternativamente, la expresion diferencial de las secuencias asociadas con una via de senalizacion bioqmmica se determina mediante la deteccion de una diferencia en el nivel del producto genico o polipeptido codificado.

Para ensayar para una alteracion inducida por el agente en el nivel de transcritos de ARNm o polinucleotidos correspondientes, acido nucleico contenido en una muestra se extrae primero de acuerdo con metodos estandares en la tecnica. Por ejemplo, el ARNm puede aislarse utilizando diversas enzimas ltticas o disoluciones qmmicas de acuerdo con los procedimientos establecidos en Sambrook et al. (1989), o puede extraerse mediante resinas de union a acido nucleico siguiendo las instrucciones adjuntas proporcionadas por los fabricantes. El ARNm contenido en la muestra de acido nucleico extrafdo se detecta a continuacion mediante procedimientos de amplificacion o ensayos de hibridacion convencionales (p. ej., analisis de transferencia Northern) de acuerdo con metodos ampliamente conocidos en la tecnica o en base a los metodos ejemplificados en el presente documento.

Para los fines de esta invencion, amplificacion significa cualquier metodo que emplea un cebador y una polimerasa capaz de replicar una secuencia diana con fidelidad razonable. La amplificacion puede ser portada por el ADN- polimerasas naturales o recombinantes tales como TaqGold™, T7 ADN polimerasa, el fragmento Klenow de la ADN polimerasa de E. coli y transcriptasa inversa. Un metodo de amplificacion preferido es la PCR. En particular, el ARN aislado se puede someter a un ensayo de transcripcion inversa que esta acoplado con una reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa (RT-PCR) con el fin de cuantificar el nivel de expresion de una secuencia asociada con una via de senalizacion bioqmmica.

La deteccion del nivel de expresion genica puede llevarse a cabo en tiempo real en un ensayo de amplificacion. En un aspecto, los productos amplificados pueden ser directamente visualizados con agentes de union a ADN fluorescentes, incluyendo, pero no limitados a, intercaladores de ADN y aglomerantes de de la muesca de ADN. Debido a que la cantidad de los intercaladores incorporados en las moleculas de ADN de doble cadena es tfpicamente proporcional a la cantidad de los productos de ADN amplificados, se puede determinar convenientemente la cantidad de los productos amplificados mediante la cuantificacion de la fluorescencia del colorante intercalado utilizando sistemas opticos convencionales en la tecnica. Colorante de union a ADN adecuado para esta aplicacion incluyen verde SYBR, azul SYBR, DAPI, yoduro de propidio, Hoeste, oro SYBR, bromuro de etidio, acridinas, proflavina, naranja de acridina, acriflavina, fluorcoumanina, elipticina, daunomicina, cloroquina, distamicina D, cromomicina, homidio, mitramicina, polipiridilos rutenio, antramicina, y similares.

En otro aspecto, otros marcadores fluorescentes tales como sondas espedficas para la secuencia se pueden emplear en la reaccion de amplificacion para facilitar la deteccion y cuantificacion de los productos amplificados. La amplificacion cuantitativa basada en la sonda se basa en la deteccion espedfica para la secuencia de un producto amplificado deseado. Utiliza, sondas espedficas para la diana, fluorescentes (p. ej., sondas TaqMan®) resultando

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en una mayor especificidad y sensibilidad. Metodos para realizar la amplificacion cuantitativa basada en la sonda estan bien establecidos en la tecnica y se ensena en la Patente de EE.UU. N° 5.210.015.

Todav^a en otro aspecto, se pueden realizar ensayos de hibridacion convencionales utilizando sondas de hibridacion que comparten homolog^a de secuencia con las secuencias asociadas con una via de senalizacion bioqmmica. ^picamente, se deja que las sondas formen complejos estables con las secuencias asociadas con una via de senalizacion bioqmmica contenida dentro de la muestra biologica derivada del sujeto de ensayo en una reaccion de hibridacion. Se apreciara por un experto en la tecnica que, cuando se utilice antisentido como el acido nucleico sonda, los polinucleotidos diana proporcionados en la muestra se eligen para que sean complementarios a las secuencias de los acidos nucleicos antisentido. En cambio, cuando la sonda de nucleotidos es un acido nucleico sentido, el polinucleotido diana se selecciona para que sea complementario a las secuencias del acido nucleico sentido.

La hibridacion puede realizarse en condiciones de diferentes rigurosidad. Condiciones de hibridacion adecuadas para la practica de la presente invencion son tales que la interaccion de reconocimiento entre la sonda y secuencias asociadas con una via de senalizacion bioqmmica es a la vez lo suficientemente espedfica y lo suficientemente estable. Condiciones que aumentan la rigurosidad de una reaccion de hibridacion son ampliamente conocidas y estan publicadas en la tecnica. Vease, por ejemplo, Sambrook, et al., (1989).; Nonradioactive In Situ Hybridization Application Manual, Boehringer Mannheim, segunda edicion. El ensayo de hibridacion se puede formar utilizando sondas inmovilizadas sobre cualquier soporte solido, incluyendo, pero no limitadas a nitrocelulosa, vidrio, silicio, y una diversidad de matrices de genes. Un ensayo de hibridacion preferido se lleva a cabo en chips de genes de alta densidad tal como se describe en la Patente de EE.UU. N° 5.445.934.

Para una deteccion conveniente de los complejos de sonda-diana que se forman durante el ensayo de hibridacion, las sondas de nucleotidos se conjugan a un marcador detectable. Marcadores detectables adecuados para su uso en la presente invencion incluyen cualquier composicion detectable por medios fotoqmmicos, bioqmmicos, espectroscopicos, inmunoqmmicos, electricos, opticos o qmmicos. Una amplia variedad de marcadores detectables adecuados son conocidos en la tecnica, que incluyen marcadores fluorescentes o quimioluminiscentes, marcadores de isotopos radiactivos, enzimaticos u otros ligandos. En realizaciones preferidas, probablemente se deseara emplear un marcador fluorescente o una etiqueta de enzima tal como digoxigenina, p-galactosidasa, ureasa, fosfatasa alcalina o peroxidasa, complejo de avidina/biotina.

Los metodos de deteccion utilizados para detectar o cuantificar la intensidad de hibridacion dependeran tfpicamente del marcador arriba seleccionado. Por ejemplo, los marcadores radiactivos se pueden detectar utilizando una pelmula fotografica o un phosphoimager. Los marcadores fluorescentes pueden ser detectados y cuantificados utilizando un fotodetector para detectar la luz emitida. Los marcadores enzimaticos se detectan tfpicamente proveyendo a la enzima de un sustrato y midiendo el producto de reaccion producido por la accion de la enzima sobre el sustrato; y finalmente marcadores colorimetricos son detectadas simplemente visualizando el marcador coloreado.

Un cambio inducido por agente en la expresion de secuencias asociadas con una via de senalizacion bioqmmica tambien se puede determinar mediante el examen de los productos genicos correspondientes. La determinacion del nivel de protema implica tfpicamente a) poner en contacto la protema contenida en una muestra biologica con un agente que se une espedficamente a una protema asociada con una via bioqmmica de senalizacion; y (b) identificar cualquier complejo de agente:protema asf formado. En un aspecto de esta realizacion, el agente que une espedficamente una protema asociada con una via de senalizacion bioqmmica es un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal.

La reaccion se lleva a cabo poniendo en contacto el agente con una muestra de las protemas asociadas con una via de senalizacion bioqmmica derivada de las muestras de ensayo en condiciones que permitan que se forme un complejo entre el agente y las protemas asociadas con una via de senalizacion bioqmmica. La formacion del complejo se puede detectar directa o indirectamente de acuerdo con procedimientos estandares en la tecnica. En el metodo de deteccion directo, los agentes se suministran con un marcador detectable y agentes que no han reaccionado pueden separarse del complejo; la cantidad de marcador restante indicando con ello la cantidad de complejo formado. Para un metodo de este tipo, es preferible seleccionar los marcadores que permanecer unidos a los agentes, incluso durante condiciones de lavado rigurosas. Es preferible que el marcador no interfiera con la reaccion de union. En la alternativa, un procedimiento de deteccion indirecta puede utilizar un agente que contiene un marcador introducido qmmica o eiizimaticamente. Un marcador deseable no interfiere generalmente con la union o la estabilidad del complejo agente:polipeptido resultante. Sin embargo, el marcador se disena tfpicamente para que sea accesible a un anticuerpo para una union eficaz y, por lo tanto, para generar una senal detectable.

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Una amplia diversidad de marcadores adecuados para la deteccion de los niveles de protema son conocidos en la tecnica. Ejemplos no limitantes incluyen radioisotopos, enzimas, metales coloidales, compuestos fluorescentes, compuestos bioluminiscentes y compuestos quimioluminiscentes.

La cantidad de complejos agente:polipeptido formados durante la reaccion de union se puede cuantificar mediante ensayos cuantitativos estandares. Tal como se ilustra anteriormente, la formacion de complejo agente:polipeptido se puede medir directamente por la cantidad de marcador permanecio en el sitio de union. En una alternativa, la protema asociada con una via de senalizacion bioqmmica se testa en cuanto a su capacidad para competir con un analogo marcado para sitios de union en el agente espedfico. En este ensayo competitivo, la cantidad de marcador capturado es inversamente proporcional a la cantidad de secuencias de protemas asociadas con una via de senalizacion bioqmmica presente en una muestra de ensayo.

En la tecnica esta disponible un cierto numero de tecnicas para el analisis de protemas sobre la base de los principios generales esbozados anteriormente. Estos incluyen, pero no se limitan a radioinmunensayos, ELISA (ensayos inmunorradiometricos ligados a enzima), inmunoensayos "sandwich", ensayos inmunorradiometricos, inmunoensayos in situ (utilizando, p. ej., oro coloidal, enzimas o radioisotopos etiquetas), analisis de transferencia Western, ensayos de inmunoprecipitacion, ensayos de inmunofluorescencia y SDS-PAGE.

Anticuerpos que reconocen espedficamente o se unen a protemas relacionadas con una via de senalizacion bioqmmica son preferibles para la realizacion de los analisis de protemas mencionados anteriormente. En los casos en los que se desee, se pueden utilizar los anticuerpos que reconocen un tipo espedfico de modificaciones post- traduccionales (p. ej., modificaciones inducibles en la via bioqmmica de senalizacion). Modificaciones post- traduccionales incluyen, pero no se limitan a glicosilacion, lipidacion, acetilacion y fosforilacion. Estos anticuerpos pueden adquirirse de proveedores comerciales. Por ejemplo, los anticuerpos anti-fosfotirosina que reconocen espedficamente las protemas tirosina-fosforiladas estan disponibles de un numero de proveedores, incluyendo Invitrogen y Perkin Elmer. Anticuerpos anti-fosfotirosina son particularmente utiles en la deteccion de protemas que son fosforiladas diferencialmente en sus residuos de tirosina en respuesta a un estres ER. Tales protemas incluyen, pero no se limitan al factor 2 alfa de iniciacion de la traduccion eucariotica (eIF-2a). Alternativamente, estos anticuerpos pueden generarse utilizando tecnologfas de anticuerpos policlonales o monoclonales convencionales mediante la inmunizacion de un animal huesped o una celula productora de anticuerpos con una protema diana que exhibe la modificacion post-traduccional deseada.

En la practica del metodo en cuestion, puede ser deseable discernir el patron de expresion de una protema asociada con una via de senalizacion bioqmmica en diferentes tejidos corporales, en diferentes tipos de celulas y/o en diferentes estructuras subcelulares. Estos estudios se pueden realizar con el uso de anticuerpos espedficos para el tejido, espedficos para la celula o espedficos para la estructura subcelular, capaces de unirse a marcadores de protemas que se expresan preferentemente en determinados tejidos, tipos de celula o estructuras subcelulares.

Una expresion alterada de un gen asociado con una via de senalizacion bioqmmica tambien se puede determinar examinando un cambio en la actividad del producto genico con relacion a una celula de control. El ensayo para un cambio inducido por agente en la actividad de una protema asociada con una via de senalizacion bioqmmica dependera de la actividad biologica y/o la via de transduccion de senales que esta bajo investigacion. Por ejemplo, en los casos en los que la protema es una quinasa, un cambio en su capacidad para fosforilar el o los sustratos aguas abajo puede ser determinado por una diversidad de ensayos conocidos en la tecnica. Ensayos representativos incluyen, pero no se limitan a inmunotransferencia e inmunoprecipitacion con anticuerpos tales como anticuerpos anti-fosfotirosina que reconocen las protemas fosforiladas. Ademas, la actividad quinasa se puede detectar por ensayos quimioluminiscentes de alto rendimiento tales como los ensayos AlphaScreen™ (disponible de Perkin Elmer) y eTag™ (Chan-Hui, et al. (2003) Clinical Immunology 111:162-174).

En los casos en los que la protema asociada con una via de senalizacion bioqmmica es parte de una cascada de senalizacion que conduce a una fluctuacion de la condicion de pH intracelular, moleculas sensibles al pH tales como colorantes de pH fluorescentes se pueden utilizar como moleculas informadoras. En otro ejemplo en el que la protema asociada a una via de senalizacion bioqmmica es un canal de iones, se pueden vigilar las fluctuaciones en el potencial de membrana y/o en la concentracion intracelular de iones. Un cierto numero de kits comerciales y dispositivos de alto rendimiento son particularmente adecuados para un rastreo rapido y robusto para moduladores de canales de iones. Instrumentos representativos incluyen FLlPRTM (Molecular Devices, Inc.) y VIPR (Aurora Biosciences). Estos instrumentos son capaces de detectar reacciones en pocillos de mas de 1000 muestras de una microplaca de forma simultanea, y proporcionan una medicion en tiempo real y datos funcionales en el espacio de un segundo o incluso un milisegundo.

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En la practica de cualquiera de los metodos descritos en esta memoria, un vector adecuado se puede introducir en una celula o un embrion a traves de uno o mas metodos conocidos en la tecnica, incluyendo, sin limitacion, microinyeccion, eiectroporacion, sonoporacion, bioKstica, transfeccion mediada por fosfato de calcio, transfeccion cationica, transfeccion de liposomas, transfeccion de dendnmeros, transfeccion de choque termico, transfeccion por nucleofeccion, magnetofeccion, lipofeccion, impalefeccion, transfeccion optica, captacion de propiedad reforzada por el agente de acidos nucleicos y el suministro a traves de liposomas, inmunoliposomas, virosomas o viriones artificiales. En algunos metodos, el vector se introduce en un embrion mediante microinyeccion. El vector o los vectores se pueden microinyectar en el nucleo o en el citoplasma del embrion. En algunos metodos, el vector o los vectores se pueden introducir en una celula por nucleofeccion.

El polinucleotido diana de un complejo de CRISPR puede ser cualquier polinucleotido endogeno o exogeno a la celula eucariota. Por ejemplo, el polinucleotido diana puede ser un polinucleotido que reside en el nucleo de la celula eucariota. El polinucleotido diana puede ser una secuencia codificadora un producto genico (p. ej., una protema) o una secuencia no codificadora (p. ej., un polinucleotido regulador o un ADN basura).

Ejemplos de polinucleotidos diana incluyen una secuencia asociada con una via de senalizacion bioqmmica, p. ej., un gen o polinucleotido asociado a la via de senalizacion bioqmmica. Ejemplos de polinucleotidos diana incluyen un gen o polinucleotido asociado a la enfermedad. Un gen o polinucleotido "asociado a la enfermedad" se refiere a cualquier gen o polinucleotido que esta proporcionando productos de transcripcion o traduccion en un nivel anormal o en una forma anormal en celulas derivadas de tejidos afectados por la enfermedad en comparacion con los tejidos o celulas de un control no enfermo . Puede ser un gen que se expresa a un nivel anormalmente alto; puede ser un gen que se expresa a un nivel anormalmente bajo, en donde la expresion alterada se correlaciona con la aparicion y/o el progreso de la enfermedad. Un gen asociado a la enfermedad tambien se refiere a un gen que posee mutacion o mutaciones o una variacion genetica que es directamente responsable o esta en desequilibrio de enlace con un gen o genes que es responsable de la etiologfa de una enfermedad. Los productos transcritos o traducidos pueden ser conocidos o desconocidos, y pueden estar en un nivel normal o anormal.

El polinucleotido diana de un complejo de CRISPR puede ser cualquier polinucleotido endogeno o exogeno a la celula eucariota. Por ejemplo, el polinucleotido diana puede ser un polinucleotido que reside en el nucleo de la celula eucariota. El polinucleotido diana puede ser una secuencia codificadora de un producto genico (p. ej., una protema) o una secuencia no codificadora (p. ej., un polinucleotido regulador o un ADN basura). Sin desear estar limitados por la teona, se cree que la secuencia diana debena estar asociada con un PAM (motivo adyacente al protoespaciador); es decir, una secuencia corta reconocida por el complejo de CRISPR. Los requisitos de secuencia y longitud precisas para el PAM difieren dependiendo de la enzima utilizada en el CRISPR, pero PAMs son tfpicamente de 2-5 secuencias de pares de bases adyacentes al protoespaciador (es decir, la secuencia diana). Ejemplos de secuencias de PAM se dan en la seccion de ejemplos que figura mas adelante, y la persona experta sera capaz de identificar secuencias adicionales de PAM para su uso con una enzima de CRISPR dada.

Ejemplos de polinucleotidos diana incluyen una secuencia asociada con una via de senalizacion bioqmmica, p. ej., un gen o polinucleotido asociado a la via de senalizacion bioqmmica. Ejemplos de polinucleotidos diana incluyen un gen o polinucleotido asociado a la enfermedad. Un gen o polinucleotido “asociado a la enfermedad” se refiere a cualquier gen o polinucleotido que esta proporcionando productos de la transcripcion o traduccion en un nivel anormal o en una forma anormal a celulas derivadas de tejidos afectados por la enfermedad en comparacion con los tejidos o celulas de un control no enfermo. Puede ser un gen que se expresa a un nivel anormalmente alto; puede ser un gen que se expresa a un nivel anormalmente bajo, en donde la expresion alterada se correlaciona con la aparicion y/o progreso de la enfermedad. Un gen asociado a la enfermedad tambien se refiere a un gen que posee la o las mutaciones o variacion genetica que es directamente responsable o esta en desequilibrio de enlace con un gen o genes que son responsables de la etiologfa de una enfermedad. Los productos transcritos o traducidos pueden ser conocidos o desconocidos, y pueden estar en un nivel normal o anormal.

El polinucleotido diana de un complejo de CRISPR puede incluir un cierto numero de genes asociados a la enfermedad y polinucleotidos, asf como genes y polinucleotidos asociados a la via de senalizacion bioqmmica tal como se enumeran en las solicitudes de patente de EE.UU. provisionales 61/736.527 y 61/748.427, ambas tituladas SISTEMAS, METODOS Y COMPOSICIONES PARA LA MANIPULACION DE SECUENCIAS presentadas el 12 de diciembre de 2012 y el 2 de enero de 2013 , respectivamente.

Ejemplos de polinucleotidos diana incluyen una secuencia asociada con una via de senalizacion bioqmmica, p. ej., un gen o polinucleotido asociado a la via de senalizacion bioqmmica. Ejemplos de polinucleotidos diana incluyen un gen o polinucleotido asociado a la enfermedad. Un "gen o polinucleotido asociado a la enfermedad" se refiere a cualquier gen o polinucleotido que esta proporcionando productos de transcripcion o traduccion en un nivel anormal o en una forma anormal en celulas derivadas de tejidos afectados por la enfermedad en comparacion con tejidos o

celulas de un control no enfermo. Puede ser un gen que se expresa a un nivel anormalmente alto; puede ser un gen que se expresa a un nivel anormalmente bajo, en donde la expresion alterada se correlaciona con la aparicion y/o el progreso de la enfermedad. Un gen asociado a la enfermedad tambien se refiere a un gen que posee mutacion o mutaciones o una variacion genetica que es directamente responsable o esta en desequilibrio de enlace con un gen 5 o genes que son responsables de la etiologfa de una enfermedad. Los productos transcritos o traducidos pueden ser conocidos o desconocidos, y pueden estar en un nivel normal o anormal.

Ejemplos de genes y polinucleotidos asociados a una enfermedad estan disponibles en McKusick-Nathans Institute for Genetic Medicine, Universidad Johns Hopkins (Baltimore, Md.) y el Centro Nacional de Informacion sobre Biotecnologfa, Biblioteca Nacional de Medicina (Bethesda, Md.), disponible en la World Wide Web.

10 Ejemplos de genes y polinucleotidos asociados con la enfermedad se enumeran en las Tablas A y B. Informacion espedfica de la enfermedad esta disponible en McKusick-Nathans Institute for Genetic Medicine, Universidad Johns Hopkins (Baltimore, Md.) y el Centro Nacional de Informacion sobre Biotecnologfa, Biblioteca Nacional de Medicina (Bethesda, Md.), disponible en la World Wide Web. Ejemplos de senalizacion de genes y polinucleotidos asociados a la via de senalizacion bioqmmica se enumeran en la Tabla C.

15 Mutaciones en estos genes y estas vfas pueden resultar en la produccion de protemas inadecuadas o protemas en cantidades inadecuadas que afectan a la funcion. Genes, protemas y vfas de este tipo pueden ser el polinucleotido diana de un complejo de CRISPR.

Tabla A

ENFERMEDAD/TRASTORNOS

GENE(S)

Neoplasia

PTEN; ATM; ATR; EGFR; ERBB2; ERBB3; ERBB4;

Notchl; Notch2; Notch3; Notch4; AKT; AKT2; AKT3; HIF;

HIFIa; HIF3a; Met; HRG; Bcl2; PPAR alfa; PPAR

gamma; WT1 (Tumor de Wilms); miembros de la Familia de receptors FGF

(5 miembros: 1, 2, 3, 4, 5); CDKN2a; APC; RB

(retinoblastoma); MEN1; VHL; BRCA1; BRCA2; AR

(Receptor de Androgeno); TSG101; IGF; Receptor de IGF; Igf1 (4

variantes); Igf2 (3 variantes); Receptor de Igf1; Receptor de Igf2;

Bax; Bcl2; familia de caspasas (9 miembros:

1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12); Kras; Apc

Macular relacionada con la edad

Abcr; Ccl2; Cc2; cp (ceruloplasmina); Timp3; catepsinaD;

Degeneracion

Vldlr; Ccr2

Esquizofrenia

Neuregulina1 (Nrg1); Erb4 (receptor para Neuregulina);

ENFERMEDAD/TRASTORNOS

GENE(S)

Complexinal (Cplxl); Tph1 Triptofanohidroxilasa; Tph2

Triptofano hidroxilasa 2; Neurexina 1; GSK3; GSK3a;

GSK3b

Trastornos

5-HTT (Slc6a4); COMT; DRD (Drdla); SLC6A3; DAOA;

DTNBP1; Dao (Dao1)

Repeticion de Trinucleotidos

HTT (Enfermedad de Huntington); SBMA/SMAX1/AR (Enfermedad de Kennedy);

Trastornos

FXN/X25 (Ataxia de Friedrich); ATX3 (Enfermedad de Machado-

Joseph); ATXN1 and ATXN2 (ataxias espinocerebelares);

DMPK (distrofia miotonica); Atrofins-1 y Atn1

(Enfermedad DRPLA); CBP (Creb-BP - inestabilidad global); VLDLR

(Alzheimer); Atxn7; Atxn10

Smdrome X Fragil

FMR2; FXR1; FXR2; mGLUR5

Relacionado con Secretasa

APH-1 (alfa y beta); Presenilina (Psenl); nicastrina

Trastornos

(Ncstn); PEN-2

Otros

Nos1; Parpl; Natl; Nat2

Trastornos relacionados con Priones

Prp

ALS

SOD1; ALS2; STEX; FUS; TARDBP; VEGF (VEGF-a;

VEGF-b; VEGF-c)

Adiccion a farmacos

Prkce (alcohol); Drd2; Drd4; ABAT (alcohol); GRIA2;

Grm5; Grinl; Htrlb; Grin2a; Drd3; Pdyn; Grial (alcohol)

Autismo

Mecp2; BZRAP1; MDGA2; Sema5A; Neurexina 1; Fragil X

(FMR2 (AFF2); FXR1; FXR2; Mglur5)

ENFERMEDAD/TRASTORNOS

GENE(S)

Enfermedad de Alzheimer

E1; CHIP; UCH; UBB; Tau; LRP; PICALM; Clusterina; PS1;

SORL1; CR1; Vldlr; Uba1; Uba3; CHIP28 (Aqp1,

Aquaporina 1); Uchl1; Uchl3; APP

Inflamacion

IL-10; IL-1 (IL-1a; IL-1b); IL-13; IL-17 (IL-17a(CTLA8); IL-

17b; IL-17c; IL,-17d; IL-17f); II-23; Cx3cr1; ptpn22; TNFa;

NOD2/CARD15 for IBD; IL-6; IL-12 (IL-12a; IL-12b);

CTLA4; Cx3c11

Enfermedad de Parkinson

x-Sinuclema; DJ-1; LRRK2; Parkin; PINK1

Tabla B:

Enfermedades y trastornos de la sangre y coagulacion

Anemia (CDAN1, CDA1, RPS19, DBA, PKLR, PK1, NT5C3, UMPH1, PSN1, RHAG, RH50A, NRAMP2, SPTB, ALAS2, ANH1, ASB, ABCB7, ABC7, ASAT); smdrome de linfocito desnudo (TAPBP, TPSN, TAP2, ABCB3, PSF2, RING11, MHC2TA, C2TA, RFX5, RFXAP, RFX5), Trastornos de hemorragia (TBXA2R, P2RX1, P2X1); Factor H y tipo factor H 1 (HF 1, CFH, HUS); Factor V y factor VIII (MCFD2); Deficiencia de factor VII (F7); Deficiencia de factor X (F10); Deficiencia de factor XI (F11); Deficiencia de factor XII (F 12, HAF); Deficiencia de factor XIIIA (F13A1, F13A); Deficiencia de factor XIIIB (F13B); anemia de Fanconi (FANCA, FACA, FA1, FA, FAA, FAAP95, FAAP90, FLJ34064, FANCB, FANCC, FACC, BRCA2, FANCD1, FANCD2, FANCD, FACD, FAD, FANCE, FACE, FANCF, XRCC9, FANCG, BRIP1, BACH1, FANCJ, PHF9, FANCL, FANCM, KIAA1596); Trastornos de linfohistiocitosis hemofagocftica (PRF1, HPLH2, UNC13D, MUNC13-4, HPLH3, HLH3, FHL3); Hemofilia A (F8, F8C, HEMA); Hemofilia B (F9, HEMB), Trastornos hemorragicos (PI, ATT, F5); Deficiencias y trastornos de leucocitos (ITGB2, CD18, LCAMB, LAD, EIF2B1, EIF2BA, EIF2B2, EIF2B3, EIF2B5, LVWM, CACH, CLE, EIF2B4); anemia de celulas de Sickle (HBB); Talasemia (HBA2, HBB, HBD, LCRB, HBA1).

Enfermedades y trastornos de disregulacion celular y oncologfa

Linfoma no-Hodgkin B-cel1 (BCL7A, BCL7); Leucemia (TAL1, TCL5, SCL, TAL2, FLT3, NBS1, NBS, ZNFN1A1, IK1, LYF1, HOXD4, HOX4B, BCR, CML, PHL, ALL, ARNT, KRAS2, RASK2, GMPS, AF10, ARHGEF12, LARG, KIAA0382, CALM, CLTH, CEBPA, CEBP, CHIC2, BTL, FLT3, KIT, PBT, LPP, NPM1, NUP214, D9S46E, CAN, CAIN, RUNX1, CBFA2, AML1, WHSC1L1, NSD3, FLT3, AF1Q, NPM1, NUMA1, ZNF145, PLZF, PML, MYL, STAT5B, AF10, CALM, CLTH, ARL 11, ARLTS 1, P2RX7, P2X7, BCR, CML, PHL, ALL, GRAF, NF1, VRNF, WSS, NFNS, PTPN11, PTP2C, SHP2, NS1, BCL2, CCND1, PRAD1, BCL1, TCRA, GATA1, GF1, ERYF1, NFE1, ABL1, NQO1, DIA4, NMOR1, NUP214, D9S46E, CAN, CAIN).

Enfermedades y trastornos relacionados

AIDS (KIR3DL1, NKAT3, NKB1, AMB11, KIR3DS1, IFNG, CXCL12, SDF1); Smdrome linfoproliferativo autoinmune (TNFRSF6, APT1, FAS, CD95, ALPS1A); Inmunodeficiencia

con la inflamacion y el sistema inmune

combinada, (IL2RG, SCIDX1, SCIDX, IMD4); HIV-1 (CCL5, SCYA5, D17S136E, TCP228), Susceptibilidad o infeccion por VIH (IL10, CSIF, CMKBR2, CCR2, CMKBR5, CCCKR5 (CCR5)); Inmunodeficiencias (CD3E, CD3G, AICDA, AID, HIGM2, TNFRSF5, CD40, UNG, DGU, HIGM4, TNFSF5, CD40LG, HIGM1, IGM, FOXP3, IPEX, AIID, XPID, PIDX, TNFRSF14B, TACI); Inflamacion (IL-10, IL-1 (IL-1a, IL-1b), IL-13, IL-17 (IL-17a (CTLA8), IL-17b, IL-17c, II,-17d, IL-17f), II-23, Cx3crl, ptpn22, TNFa, NOD2/CARD15 for IBD, IL-6, IL-12 (IL- 12a, IL-12b), CTLA4, Cx3cl1); Inmunodeficiencias combinadas graves (SCIDs)(JAK3, JAKL, DCLRE1C, ARTEMIS, SCIDA, RAG1, RAG2, ADA, PTPRC, CD45, LCA, IL7R, CD3D, T3D, IL2RG, SCIDX1, SCIDX, IMD4).

Enfermedades y trastornos metabolicos, del hngado, rinon y protemas

Neuropatia amiloide (TTR, PALB); Amiloidosis (APOA1, APP, AAA, CVAP, AD1, GSN, FGA, LYZ, TTR, PALB); Cirrosis (KRT18, KRT8, CIRH1A, NAIC, TEX292, KIAA1988); Fibrosis qmstica (CFTR, ABCC7, CF, MRP7); Enfermedades de almacenamiento de glucogeno (SLC2A2, GLUT2, G6PC, G6PT, G6PT1, GAA, LAMP2, LAMPB, AGL, GDE, GBE1, GYS2, PYGL, PFKM); Adenoma hepatico, 142330 (TCF1, HNF1A, MODY3), Insuficiencia hepatica, brote temprano y trastorno neurologico (SCOD1, SCO1), Deficiencia de lipasa hepatica (LIPC), Hepatoblastoma, cancer y carcinomas (CTNNB1, PDGFRL, PDGRL, PRLTS, AXIN1, AXIN, CTNNB1, TP53, P53, LFS1, IGF2R, MPRI, MET, CASP8, MCH5; Enfermedad de rinon qrnstico medular (UMOD, HNFJ, FJHN, MCKD2, ADMCKD2); fenilcetonuria (PAH, PKU1, QDPR, DHPR, PTS); Rinon poliqufstico y enfermedad hepatica (FCYT, PKHD 1, ARPKD, PKD 1, PKD2, PKD4, PKDTS, PRKCSH, G19P1, PCLD, SEC63).

Enfermedades y trastornos Musculares/ del Esqueleto

Distrofia muscular de Becker (DMD, BMD, MYF6), Distrofia muscular de Duchenne (DMD, BMD); Distrofia muscular de Emery-Dreifuss (LMNA, LMN1, EMD2, FPLD, CMD1A, HGPS, LGMD1B, LMNA, LMN1, EMD2, FPLD, CMD1A); Distrofia muscular facioescapulohumeral (FSHMD1A, FSHD1A); Distrofia muscular (FKRP, MDC1C, LGMD2I, LAMA2, LAMM, LARGE, KIAA0609, MDC1D, FCMD, TTID, MYOT, CAPN3, CANP3, DYSF, LGMD2B, SGCG, LGMD2C, DMDA1, SCG3, SGCA, ADL, DAG2, LGMD2D, DMDA2, SGCB, LGMD2E, SGCD, SGD, LGMD2F, CMD1L, TCAP, LGMD2G, CMD1N, TRIM32, HT2A, LGMD2H, FKRP, MDC1C, LGMD2I, TTN, CMD1G, TMD, LGMD2J, POMT 1, CAV3, LGMD1C, SEPN 1, SELN, RSMD1, PLEC1, PLTN, EBS1); Osteopetrosis (LRP5, BMND1, LRP7, LR3, OPPG, VBCH2, CLCN7, CLC7, OPTA2, OSTM1, GL, TCIRG1, TIRC7, OC116, OPTB1); Atrofia muscular (VAPB, VAPC, ALS8, SMN1, SMA1, SMA2, SMA3, SMA4, BSCL2, SPG17, GARS, SMAD1, CMT2D, HEXB, IGHMBP2, SMUBP2, CATF1, SMARD1).

Enfermedades y trastornos neurologicos y neuronales

ALS (SOD1, ALS2, STEX, FUS, TARDBP, VEGF (VEGF-a, VEGF-b, VEGF-c); enfermedad de Alzheimer (APP, AAA, CVAP, AD1, APOE, AD2, PSEN2, AD4, STM2, APBB2, FE65L1, NOS3, PLAU, URK, ACE, DCP 1, ACE 1, MPO, PACIP 1, PAXIP1L, PTIP, A2M, BLMH, BMH, PSEN1, AD3); Autismo (Mecp2, BZRAP1, MDGA2, Sema5A, Neurexina 1, GLO1, MECP2, RTT, PPMX, MRX16, MRX79, NLGN3, NLGN4, KIAA1260, AUTSX2); Smdrome X fragil (FMR2, FXR1, FXR2, mGLUR55); Enfermedad y trastornos tipo enfermedad de Huntington (HD, IT 15, PRNP, PRIP, JPH3, JP3, HDL2, TBP, SCA17); Enfermedad de Parkinson (NR4A2, NURR1, NOT, TINUR, SNCAIP, TBP, SCA17, SNCA, NACP, PARK1, PARK4, DJ1, PARK7, LRRK2, PARK8, PINK1, PARK6, UCHL1, PARK5, SNCA, NACP, PARK1, PARK4, PRKN, PARK2, PDJ, DBH, NDUFV2); Smdrome de Rett (MECP2, RTT, PPMX, MRX16, MRX79, CDKL5, STK9, MECP2, RTT, PPMX, MRX16, MRX79, x-Sinuclema, DJ-1); Esquizofrenia (Neuregulina1 (Nrg1), Erb4 (receptor para Neuregulina), Complexina1 (Cplx1), Tph1 Triptofano hidroxilasa, Tph2, Triptofano hidroxilasa 2, Neurexina 1, GSk3, GSK3a, GSK3b, 5-HTT (Slc6a4), COMT, DRD (Drd1a), SLC6A3, DAOA, DTNBP1, Dao (Dao1)); Trastornos relacionados con secretasa (APH-1 (alfa y beta), Presenilina (Psen1), nicastrina, (Ncstn), PEN-2, Nos1,

Parpl, Natl, Nat2); Trastornos de la repeticion de trinucleotidos (HTT (Enfermedad de Huntington), SBMA/SMAX1/AR (Enfermedad de Kennedy), FXN/X25 (Ataxia de Friedrich), ATX3 (Enfermedad de Machado-Joseph), AtXn1 y ATXN2 (ataxias espinocerebelares), DMPK (distrofia miotonica), Atrofina-1 y Atn1 (DRPLA Dx), CBP (Creb-BP - inestabilidad global), VLDLR (Alzheimer), Atxn7, Atxn10).

Enfermedades y trastornos oculares

Degeneracion macular relacionada con la edad (Abcr, Cc12, Cc2, cp (ceruloplasmina), Timp3, catepsinaD, Vldlr, Ccr2); Cataratas (CRYAA, CRYA1, CRYBB2, CRYB2, PITX3, BFSP2, CP49, CP47, CRYAA, CRYA1, PAX6, AN2, MGDA, CRYBA1, CRYB1, CRYGC, CRYG3, CCL, LIM2, MP19, CRYGD, CRYG4, BFSP2, CP49, CP47, HSF4, CTM, HSF4, CTM, MIP, AQP0, CRYAB, CRYA2, CTPP2, CRYBB1, CRYGD, CRYG4, CRYBB2, CRYB2, CRYGC, CRYG3, CCL, CRYAA, CRYA1, GJA8, CX50, CAE1, GJA3, CX46, CZP3, CAE3, CCM1, CAM, KRIT1); Opacidad y distrofia de la cornea (APOA1, TGFBI, CSD2, CDGG1, CSD, BIGH3, CDG2, TACSTD2, TROP2, M1S1, VSX1, RINX, PPCD, PPD, KTCN, COL8A2, FECD, PPCD2, PIP5K3, CFD); Cornea plana congenita (KERA, CNA2); Glaucoma (MYOC, TIGR, GLC1A, JOAG, GPOA, OPTN, GLC1E, FIP2, HYPL, NRP, CYP1B1, GLC3A, OPA1, NTG, NPG, CYP1B1, GLC3A); Amaurosis congenita del mgado (CRB1, RP 12, CRX, CORD2, CRD, RPGRIP 1, LCA6, CORD9, RPE65, RP20, AIPL1, LCA4, GUCY2D, GUC2D, LCA1, CORD6, RDH12, LCA3); Distrofia macular (ELOVL4, ADMD, STGD2, STGD3, RDS, RP7, PRPH2, PRPH, AVMD, AOFMD, VMD2).

TablaC:

FUNCION CELULAR

GENES

Senalizacion PI3K/AKT

PRKCE; ITGAM; ITGA5; IRAKI; PRKAA2; EIF2AK2;

PTEN; EIF4E; PRKCZ; GRK6; MAPK1; TSC1; PLK1;

AKT2; IKBKB; PIK3CA; CDK8; CDKN1B; NFKB2; BCL2;

PIK3CB; PPP2R1A; MAPK8; BCL2L1; MAPK3; TSC2;

ITGA1; KRAS; EIF4EBP1; RELA; PRKCD; NOS3;

PRKAA1; MAPK9; CDK2; PPP2CA; PIM1; ITGB7;

YWHAZ; ILK; TP53; RAF1; IKBKG; RELB; DYRK1A;

CDKN1A; ITGB1; MAP2K2; JAK1; AKT1; JAK2; PIK3R1;

CHUK; PDPK1; PPP2R5C; CTNNB1; MAP2K1; NFKB1;

PAK3; ITGB3; CCND1; GSK3A; FRAP1; SFN; ITGA2;

TTK; CSNK1A1; BRAF; GSK3B; AKT3; FOXO1; SGK;

HSP90AA1; RPS6KB1

Senalizacion ERK/MAPK

PRKCE; ITGAM; ITGA5; HSPB1; IRAKI; PRKAA2;

FUNCION CELULAR

GENES

EIF2AK2; RAC1; RAP1A; TLN1; EIF4E; ELK1; GRK6;

MAPK1; RAC2; PLK1; AKT2; PIK3CA; CDK8; CREB1;

PRKCI; PTK2; FOS; RPS6KA4; PIK3CB; PPP2R1A;

PIK3C3; MAPK8; MAPK3; ITGA1; ETS1; KRAS; MYCN;

EIF4EBP1; PPARG; PRKCD; PRKAA1; MAPK9; SRC;

CDK2; PPP2CA; PIM1; PIK3C2A; ITGB7; YWHAZ;

PPP1CC; KSR1; PXN; RAF1; FYN; DYRK1A; ITGB1;

MAP2K2; PAK4; PIK3R1; STAT3; PPP2R5C; MAP2K1;

PAK3; ITGB3; ESR1; ITGA2; MYC; TTK; CSNK1A1;

CRKL; BRAF; ATF4; PRKCA; SRF; STAT1; SGK

Senalizacion del Receptor de Glucocorticoides

RAC1; TAF4B; EP300; SMAD2; TRAF6; PCAF; ELK1;

MAPK1; SMAD3; AKT2; IKBKB; NCOR2; UBE2I;

PIK3CA; CREB1; FOS; HSPA5; NFKB2; BCL2;

MAP3K14; STAT5B; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; BCL2L1;

MAPK3; TSC22D3; MAPK10; NRIP1; KRAS; MAPK13;

RELA; STAT5A; MAPK9; NOS2A; PBX1; NR3C1;

PIK3C2A; CDKN1C; TRAF2; SERPINA1; NCOA3;

MAPK14; TNF; RAF1; IKBKG; MAP3K7; CREBBP;

CDKN1A; MAP2K2; JAK1; IL8; NCOA2; AKT1; JAK2;

PIK3R1; CHUK; STAT3; MAP2K1; NFKB1; TGFBR1;

ESR1; SMAD4; CEBPB; JUN; AR; AKT3; CCL2; MMP1;

STAT1; IL6; HSP90AA1

FUNCION CELULAR

GENES

Senalizacion de Gma Axonal

PRKCE; ITGAM; ROCK1; ITGA5; CXCR4; ADAM12;

IGF 1; RAC 1; RAP1A; EIF4E; PRKCZ; NRP 1; NTRK2;

ARHGEF7; SMO; ROCK2; MAPK1; PGF; RAC2;

PTPN11; GNAS; AKT2; PIK3CA; ERBB2; PRKCI; PTK2;

CFL1; GNAQ; PIK3CB; CXCL12; PIK3C3; WNT11;

PRKD1; GNB2L1; ABL1; MAPK3; ITGA1; KRAS; RHOA;

PRKCD; PIK3C2A; ITGB7; GLI2; PXN; VASP; RAF1;

FYN; ITGB1; MAP2K2; PAK4; ADAM17; AKT1; PIK3R1;

GLI1; WNT5A; ADAM10; MAP2K1; PAK3; ITGB3;

CDC42; VEGFA; ITGA2; EPHA8; CRKL; RND1; GSK3B;

AKT3; PRKCA

Senalizacion del Receptor Efrina

PRKCE; ITGAM; ROCK1; ITGA5; CXCR4; IRAK1;

PRKAA2; EIF2AK2; RAC1; RAP1A; GRK6; ROCK2;

MAPK1; PGF; RAC2; PTPN11; GNAS; PLK1; AKT2;

DOK1; CDK8; CREB1; PTK2; CFL1; GNAQ; MAP3K14;

CXCL12; MAPK8; GNB2L1; ABL1; MAPK3; ITGA1;

KRAS; RHOA; PRKCD; PRKAA1; MAPK9; SRC; CDK2;

PIM1; ITGB7; PXN; RAF1; FYN; DYRK1A; ITGB1;

MAP2K2; PAK4; AKT1; JAK2; STAT3; ADAM10;

MAP2K1; PAK3; ITGB3; CDC42; VEGFA; ITGA2;

EPHA8; TTK; CSNK1A1; CRKL; BRAF; PTPN13; ATF4;

AKT3; SGK

FUNCION CELULAR

GENES

Senalizacion del Citoesqueleto de Actina

ACTN4; PRKCE; ITGAM; ROCK1; ITGA5; IRAKI;

PRKAA2; EIF2AK2; RAC1; INS; ARHGEF7; GRK6;

ROCK2; MAPK1; RAC2; PLK1; AKT2; PIK3CA; CDK8;

PTK2; CFL1; PIK3CB; MYH9; DIAPH1; PIK3C3; MAPK8;

F2R; MAPK3; SLC9A1; ITGA1; KRAS; RHOA; PRKCD;

PRKAA1; MAPK9; CDK2; PIM1; PIK3C2A; ITGB7;

PPP1CC; PXN; VIL2; RAF 1; GSN; DYRK1A; ITGB 1;

MAP2K2; PAK4; PIP5K1A; PIK3R1; MAP2K1; PAK3;

ITGB3; CDC42; APC; ITGA2; TTK; CSNK1A1; CRKL;

BRAF; VAV3; SGK

Senalizacion de la Enfermedad de Huntington

PRKCE; IGF1; EP300; RCOR1; PRKCZ; HDAC4; TGM2;

MAPK1; CAPNS1; AKT2; EGFR; NCOR2; SP1; CAPN2;

PIK3CA; HDAC5; CREB1; PRKCI; HSPA5; REST;

GNAQ; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; IGF1R; PRKD1;

GNB2L1; BCL2L1; CAPN1; MAPK3; CASP8; HDAC2;

HDAC7A; PRKCD; HDAC11; MAPK9; HDAC9; PIK3C2A;

HDAC3; TP53; CASP9; CREBBP; AKT1; PIK3R1;

PDPK1; CASP1; APAF1; FRAP1; CASP2; JUN; BAX;

ATF4; AKT3; PRKCA; CLTC; SGK; HDAC6; CASP3

Senalizacion de la Apoptosis

PRKCE; ROCK1; BID; IRAKI; PRKAA2; EIF2AK2; BAK1;

BIRC4; GRK6; MAPK1; CAPNS1; PLK1; AKT2; IKBKB;

CAPN2; CDK8; FAS; NFKB2; BCL2; MAP3K14; MAPK8;

FUNCION CELULAR

GENES

BCL2L1; CAPN1; MAPK3; CASP8; KRAS; RELA;

PRKCD; PRKAA1; MAPK9; CDK2; PIM1; TP53; TNF;

RAF1; IKBKG; RELB; CASP9; DYRK1A; MAP2K2;

CHUK; APAF1; MAP2K1; NFKB1; PAK3; LMNA; CASP2;

BIRC2; TTK; CSNK1A1; BRAF; BAX; PRKCA; SGK;

CASP3; BIRC3; PARP1

Senalizacion del Receptor de Celulas B

RAC1; PTEN; LYN; ELK1; MAPK1; RAC2; PTPN11;

AKT2; IKBKB; PIK3CA; CREB1; SYK; NFKB2; CAMK2A;

MAP3K14; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; BCL2L1; ABL1;

MAPK3; ETS1; KRAS; MAPK13; RELA; PTPN6; MAPK9;

EGR1; PIK3C2A; BTK; MAPK14; RAF1; IKBKG; RELB;

MAP3K7; MAP2K2; AKT1; PIK3R1; CHUK; MAP2K1;

NFKB1; CDC42; GSK3A; FRAP1; BCL6; BCL10; JUN;

GSK3B; ATF4; AKT3; VAV3; RPS6KB1

Senalizacion de la Extravasacion de Leucocitos

ACTN4; CD44; PRKCE; ITGAM; ROCK1; CXCR4; CYBA;

RAC1; RAP1A; PRKCZ; ROCK2; RAC2; PTPN11;

MMP14; PIK3CA; PRKCI; PTK2; PIK3CB; CXCL12;

PIK3C3; MAPK8; PRKD1; ABL1; MAPK10; CYBB;

MAPK13; RHOA; PRKCD; MAPK9; SRC; PIK3C2A; BTK;

MAPK14; NOX1; PXN; VIL2; VASP; ITGB1; MAP2K2;

CTNND1; PIK3R1; CTNNB1; CLDN1; CDC42; F11R; ITK;

CRKL; VAV3; CTTN; PRKCA; MMP1; MMP9

FUNCION CELULAR

GENES

Senalizacion de Integrina

ACTN4; ITGAM; ROCK1; ITGA5; RAC1; PTEN; RAP1A;

TLN1; ARHGEF7; MAPK1; RAC2; CAPNS1; AKT2;

CAPN2; PIK3CA; PTK2; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;

CAV1; CAPN1; ABL1; MAPK3; ITGA1; KRAS; RHOA;

SRC; PIK3C2A; ITGB7; PPP1CC; ILK; PXN; VASP;

RAF1; FYN; ITGB1; MAP2K2; PAK4; AKT1; PIK3R1;

TNK2; MAP2K1; PAK3; ITGB3; CDC42; RND3; ITGA2;

CRKL; BRAF; GSK3B; AKT3

Senalizacion de la Respuesta de Fase Aguda

IRAKI; SOD2; MYD88; TRAF6; ELK1; MAPK1; PTPN11;

AKT2; IKBKB; PIK3CA; FOS; NFKB2; MAP3K14;

PIK3CB; MAPK8; RIPK1; MAPK3; IL6ST; KRAS;

MAPK13; IL6R; RELA; SOCS1; MAPK9; FTL; NR3C1;

TRAF2; SERPINE1; MAPK14; TNF; RAF1; PDK1;

IKBKG; RELB; MAP3K7; MAP2K2; AKT1; JAK2; PIK3R1;

CHUK; STAT3; MAP2K1; NFKB1; FRAP1; CEBPB; JUN;

AKT3; IL 1R1; IL6

Senalizacion de PTEN

ITGAM; ITGA5; RAC1; PTEN; PRKCZ; BCL2L11;

MAPK1; RAC2; AKT2; EGFR; IKBKB; CBL; PIK3CA;

CDKN1B; PTK2; NFKB2; BCL2; PIK3CB; BCL2L1;

MAPK3; ITGA1; KRAS; ITGB7; ILK; PDGFRB; INSR;

RAF1; IKBKG; CASP9; CDKN1A; ITGB1; MAP2K2;

AKT1; PIK3R1; CHUK; PDGFRA; PDPK1; MAP2K1;

FUNCION CELULAR

GENES

NFKB1; ITGB3; CDC42; CCND1; GSK3A; ITGA2;

GSK3B; AKT3; FOXO1; CASP3; RPS6KB1

Senalizacion de p53

PTEN; EP300; BBC3; PCAF; FASN; BRCA1; GADD45A;

BIRC5; AKT2; PIK3CA; CHEK1; TP53INP1; BCL2;

PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; THBS1; ATR; BCL2L1; E2F1;

PMAIP 1; CHEK2; TNFRSF10B; TP73; RB1; HDAC9;

CDK2; PIK3C2A; MAPK14; TP53; LRDD; CDKN1A;

HIPK2; AKT1; PIK3R1; RRM2B; APAF1; CTNNB1;

SIRT1; CCND1; PRKDC; ATM; SFN; CDKN2A; JUN;

SNAI2; GSK3B; BAX; AKT3

Senalizacion del Receptor de Aril Hidrocarbono

HSPB1; EP300; FASN; TGM2; RXRA; MAPK1; NQO1;

NCOR2; SP1; ARNT; CDKN1B; FOS; CHEK1;

SMARCA4; NFKB2; MAPK8; ALDH1A1; ATR; E2F1;

MAPK3; NRIP1; CHEK2; RELA; TP73; GSTP1; RB1;

SRC; CDK2; AHR; NFE2L2; NCOA3; TP53; TNF;

CDKN1A; NCOA2; APAF1; NFKB1; CCND1; ATM; ESR1;

CDKN2A; MYC; JUN; ESR2; BAX; IL6; CYP1B1;

HSP90AA1

Senalizacion del Metabolismo Xenobiotico

PRKCE; EP300; PRKCZ; RXRA; MAPK1; NQO1;

NCOR2; PIK3CA; ARNT; PRKCI; NFKB2; CAMK2A;

PIK3CB; PPP2R1A; PIK3C3; MAPK8; PRKD1;

ALDH1A1; MAPK3; NRIP1; KRAS; MAPK13; PRKCD;

FUNCION CELULAR

GENES

GSTP1; MAPK9; NOS2A; ABCB1; AHR; PPP2CA; FTL;

NFE2L2; PIK3C2A; PPARGC1A; MAPK14; TNF; RAF1;

CREBBP; MAP2K2; PIK3R1; PPP2R5C; MAP2K1;

NFKB 1; KEAP 1; PRKCA; EIF2AK3; IL6; CYP1B1;

HSP90AA1

Senalizacion de SAPK/JNK

PRKCE; IRAKI; PRKAA2; EIF2AK2; RAC1; ELK1;

GRK6; MAPK1; GADD45A; RAC2; PLK1; AKT2; PIK3CA;

FADD; CDK8; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; RIPK1;

GNB2L1; IRS1; MAPK3; MAPK10; DAXX; KRAS;

PRKCD; PRKAA1; MAPK9; CDK2; PIM1; PIK3C2A;

TRAF2; TP53; LCK; MAP3K7; DYRK1A; MAP2K2;

PIK3R1; MAP2K1; PAK3; CDC42; JUN; TTK; CSNK1A1;

CRKL; BRAF; SGK

Senalizacion de PPAr/RXR

PRKAA2; EP300; INS; SMAD2; TRAF6; PPARA; FASN;

RXRA; MAPK1; SMAD3; GNAS; IKBKB; NCOR2;

ABCA1; GNAQ; NFKB2; MAP3K14; STAT5B; MAPK8;

IRS1; MAPK3; KRAS; RELA; PRKAA1; PPARGC1A;

NCOA3; MAPK14; INSR; RAF1; IKBKG; RELB; MAP3K7;

CREBBP; MAP2K2; JAK2; CHUK; MAP2K1; NFKB1;

TGFBR1; SMAD4; JUN; IL1R1; PRKCA; IL6; HSP90AA1;

ADIPOQ

Senalizacion de NF-KB

IRAK1; EIF2AK2; EP300; INS; MYD88; PRKCZ; TRAF6;

FUNCION CELULAR

GENES

TBK1; AKT2; EGFR; IKBKB; PIK3CA; BTRC; NFKB2;

MAP3K14; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; RIPK1; HDAC2;

KRAS; RELA; PIK3C2A; TRAF2; TLR4; PDGFRB; TNF;

INSR; LCK; IKBKG; RELB; MAP3K7; CREBBP; AKT1;

PIK3R1; CHUK; PDGFRA; NFKB1; TLR2; BCL10;

GSK3B; AKT3; TNFAIP3; IL 1R1

Senalizacion de Neuregulina

ERBB4; PRKCE; ITGAM; ITGA5; PTEN; PRKCZ; ELK1;

MAPK1; PTPN11; AKT2; EGFR; ERBB2; PRKCI;

CDKN1B; STAT5B; PRKD1; MAPK3; ITGA1; KRAS;

PRKCD; STAT5A; SRC; ITGB7; RAF1; ITGB1; MAP2K2;

ADAM17; AKT1; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1; ITGB3;

EREG; FRAP1; PSEN1; ITGA2; MYC; NRG1; CRKL;

AKT3; PRKCA; HSP90AA1; RPS6KB1

Senalizacion de Wnt y Beta catenina

CD44; EP300; LRP6; DVL3; CSNK1E; GJA1; SMO;

AKT2; PIN1; CDH1; BTRC; GNAQ; MARK2; PPP2R1A;

WNT11; SRC; DKK1; PPP2CA; SOX6; SFRP2; ILK;

LEF1; SOX9; TP53; MAP3K7; CREBBP; TCF7L2; AKT1;

PPP2R5C; WNT5A; LRP5; CTNNB1; TGFBR1; CCND1;

GSK3A; DVL1; APC; CDKN2A; MYC; CSNK1A1; GSK3B;

AKT3; SOX2

Senalizacion del Receptor de Insulina

PTEN; INS; EIF4E; PTPN1; PRKCZ; MAPK1; TSC1;

PTPN11; AKT2; CBL; PIK3CA; PRKCI; PIK3CB; PIK3C3;

FUNCION CELULAR

GENES

MAPK8; IRS1; MAPK3; TSC2; KRAS; EIF4EBP1;

SLC2A4; PIK3C2A; PPP1CC; INSR; RAF1; FYN;

MAP2K2; JAK1; AKT1; JAK2; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1;

GSK3A; FRAP1; CRKL; GSK3B; AKT3; FOXO1; SGK;

RPS6KB1

Senalizacion de IL-6

HSPB1; TRAF6; MAPKAPK2; ELK1; MAPK1; PTPN11;

IKBKB; FOS; NFKB2; MAP3K14; MAPK8; MAPK3;

MAPK10; IL6ST; KRAS; MAPK13; IL6R; RELA; SOCS1;

MAPK9; ABCB1; TRAF2; MAPK14; TNF; RAF1; IKBKG;

RELB; MAP3K7; MAP2K2; IL8; JAK2; CHUK; STAT3;

MAP2K1; NFKB1; CEBPB; JUN; IL1R1; SRF; IL6

Colestasis Hepatica

PRKCE; IRAKI; INS; MYD88; PRKCZ; TRAF6; PPARA;

RXRA; IKBKB; PRKCI; NFKB2; MAP3K14; MAPK8;

PRKD1; MAPK10; RELA; PRKCD; MAPK9; ABCB1;

TRAF2; TLR4; TNF; INSR; IKBKG; RELB; MAP3K7; IL8;

CHUK; NR1H2; TJP2; NFKB1; ESR1; SREBF1; FGFR4;

JUN; IL1R1; PRKCA; IL6

Senalizacion de IGF-1

IGF1; PRKCZ; ELK1; MAPK1; PTPN11; NEDD4; AKT2;

PIK3CA; PRKCI; PTK2; FOS; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;

IGF1R; IRS1; MAPK3; IGFBP7; KRAS; PIK3C2A;

YWHAZ; PXN; RAF1; CASP9; MAP2K2; AKT1; PIK3R1;

PDPK1; MAP2K1; IGFBP2; SFN; JUN; CYR61; AKT3;

FUNCION CELULAR

GENES

FOXO1; SRF; CTGF; RPS6KB1

Respuesta de Estres Oxidativo mediada por NRF2

PRKCE; EP300; SOD2; PRKCZ; MAPK1; SQSTM1;

NQO1; PIK3CA; PRKCI; FOS; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;

PRKD1; MAPK3; KRAS; PRKCD; GSTP1; MAPK9; FTL;

NFE2L2; PIK3C2A; MAPK14; RAF1; MAP3K7; CREBBP;

MAP2K2; AKT1; PIK3R1; MAP2K1; PPIB; JUN; KEAP1;

GSK3B; ATF4; PRKCA; EIF2AK3; HSP90AA1

Fibrosis Hepatica/Activacion de Celulas Estelares

EDN1; IGF1; KDR; FLT1; SMAD2; FGFR1; MET; PGF;

SMAD3; EGFR; FAS; CSF1; NFKB2; BCL2; MYH9;

IGF1R; IL6R; RELA; TLR4; PDGFRB; TNF; RELB; IL8;

PDGFRA; NFKB1; TGFBR1; SMAD4; VEGFA; BAX;

IL1R1; CCL2; HGF; MMP1; STAT1; IL6; CTGF; MMP9

Senalizacion de PPAR

EP300; INS; TRAF6; PPARA; RXRA; MAPK1; IKBKB;

NCOR2; FOS; NFKB2; MAP3K14; STAT5B; MAPK3;

NRIP1; KRAS; PPARG; RELA; STAT5A; TRAF2;

PPARGC1A; PDGFRB; TNF; INSR; RAF1; IKBKG;

RELB; MAP3K7; CREBBP; MAP2K2; CHUK; PDGFRA;

MAP2K1; NFKB1; JUN; IL1R1; HSP90AA1

Senalizacion de Fc Epsilon RI

PRKCE; RAC1; PRKCZ; LYN; MAPK1; RAC2; PTPN11;

AKT2; PIK3CA; SYK; PRKCI; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;

PRKD1; MAPK3; MAPK10; KRAS; MAPK13; PRKCD;

MAPK9; PIK3C2A; BTK; MAPK14; TNF; RAF1; FYN;

FUNCION CELULAR

GENES

MAP2K2; AKT1; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1; AKT3;

VAV3; PRKCA

Senalizacion del Receptor Acoplado a Protema G

PRKCE; RAP1A; RGS16; MAPK1; GNAS; AKT2; IKBKB;

PIK3CA; CREB1; GNAQ; NFKB2; CAMK2A; PIK3CB;

PIK3C3; MAPK3; KRAS; RELA; SRC; PIK3C2A; RAF1;

IKBKG; RELB; FYN; MAP2K2; AKT1; PIK3R1; CHUK;

PDPK1; STAT3; MAP2K1; NFKB1; BRAF; ATF4; AKT3;

PRKCA

Metabolismo de Inositol Fosfato

PRKCE; IRAKI; PRKAA2; EIF2AK2; PTEN; GRK6;

MAPK1; PLK1; AKT2; PIK3CA; CDK8; PIK3CB; PIK3C3;

MAPK8; MAPK3; PRKCD; PRKAA1; MAPK9; CDK2;

PIM1; PIK3C2A; DYRK1A; MAP2K2; PIP5KlA; PIK3R1;

MAP2K1; PAK3; ATM; TTK; CSNK1A1; BRAF; SGK

Senalizacion de PDGF

EIF2AK2; ELK1; ABL2; MAPK1; PIK3CA; FOS; PIK3CB;

PIK3C3; MAPK8; CAV1; ABL1; MAPK3; KRAS; SRC;

PIK3C2A; PDGFRB; RAF1; MAP2K2; JAK1; JAK2;

PIK3R1; PDGFRA; STAT3; SPHK1; MAP2K1; MYC;

JUN; CRKL; PRKCA; SRF; STAT1; SPHK2

Senalizacion de VEGF

ACTN4; ROCK1; KDR; FLT1; ROCK2; MAPK1; PGF;

AKT2; PIK3CA; ARNT; PTK2; BCL2; PIK3CB; PIK3C3;

BCL2L1; MAPK3; KRAS; HIF1A; NOS3; PIK3C2A; PXN;

RAF1; MAP2K2; ELAVL1; AKT1; PIK3R1; MAP2K1; SFN;

FUNCION CELULAR

GENES

VEGFA; AKT3; FOXO1; PRKCA

Senalizacion de Celulas Asesinas Naturales

PRKCE; RAC1; PRKCZ; MAPK1; RAC2; PTPN11;

KIR2DL3; AKT2; PIK3CA; SYK; PRKCI; PIK3CB;

PIK3C3; PRKD1; MAPK3; KRAS; PRKCD; PTPN6;

PIK3C2A; LCK; RAF1; FYN; MAP2K2; PAK4; AKT1;

PIK3R1; MAP2K1; PAK3; AKT3; VAV3; PRKCA

Ciclo Celular: G1/S

HDAC4; SMAD3; SUV39H1; HDAC5; CDKN1B; BTRC;

Regulacion del punto de verificacion

ATR; ABL1; E2F1; HDAC2; HDAC7A; RB1; HDAC11;

HDAC9; CDK2; E2F2; HDAC3; TP53; CDKN1A; CCND1;

E2F4; ATM; RBL2; SMAD4; CDKN2A; MYC; NRG1;

GSK3B; RBL1; HDAC6

Senalizacion del Receptor de Celulas T

RAC1; ELK1; MAPK1; IKBKB; CBL; PIK3CA; FOS;

NFKB2; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; MAPK3; KRAS;

RELA; PIK3C2A; BTK; LCK; RAF1; IKBKG; RELB; FYN;

MAP2K2; PIK3R1; CHUK; MAP2K1; NFKB1; ITK; BCL10;

JUN; VAV3

Senalizacion del Receptor de Muerte

CRADD; HSPB1; BID; BIRC4; TBK1; IKBKB; FADD;

FAS; NFKB2; BCL2; MAP3K14; MAPK8; RIPK1; CASP8;

DAXX; TNFRSF10B; RELA; TRAF2; TNF; IKBKG; RELB;

CASP9; CHUK; APAF1; NFKB1; CASP2; BIRC2; CASP3;

BIRC3

Senalizacion de FGF

RAC1; FGFR1; MET; MAPKAPK2; MAPK1; PTPN11;

FUNCION CELULAR

GENES

AKT2; PIK3CA; CREB1; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8;

MAPK3; MAPK13; PTPN6; PIK3C2A; MAPK14; RAF1;

AKT1; PIK3R1; STAT3; MAP2K1; FGFR4; CRKL; ATF4;

AKT3; PRKCA; HGF

Senalizacion de GM-CSF

LYN; ELK1; MAPK1; PTPN11; AKT2; PIK3CA; CAMK2A;

STAT5B; PIK3CB; PIK3C3; GNB2L1; BCL2L1; MAPK3;

ETS1; KRAS; RUNX1; PIM1; PIK3C2A; RAF1; MAP2K2;

AKT1; JAK2; PIK3R1; STAT3; MAP2K1; CCND1; AKT3;

STAT1

Senalizacion de la Esclerosis Lateral Amiotrofica

BID; IGF1; RAC1; BIRC4; PGF; CAPNS1; CAPN2;

PIK3CA; BCL2; PIK3CB; PIK3C3; BCL2L1; CAPN1;

PIK3C2A; TP53; CASP9; PIK3R1; RAB5A; CASP1;

APAF1; VEGFA; BIRC2; BAX; AKT3; CASP3; BIRC3

Senalizacion de JAK/Stat

PTPN1; MAPK1; PTPN11; AKT2; PIK3CA; STAT5B;

PIK3CB; PIK3C3; MAPK3; KRAS; SOCS1; STAT5A;

PTPN6; PIK3C2A; RAF1; CDKN1A; MAP2K2; JAK1;

AKT1; JAK2; PIK3R1; STAT3; MAP2K1; FRAP1; AKT3;

STAT1

Metabolismo de Nicotinato y Nicotinamida

PRKCE; IRAKI; PRKAA2; EIF2AK2; GRK6; MAPK1;

PLK1; AKT2; CDK8; MAPK8; MAPK3; PRKCD; PRKAA1;

PBEF1; MAPK9; CDK2; PIM1; DYRK1A; MAP2K2;

MAP2K1; PAK3; NT5E; TTK; CSNK1A1; BRAF; SGK

FUNCION CELULAR

GENES

Senalizacion de Quimioquinas

CXCR4; ROCK2; MAPK1; PTK2; FOS; CFL1; GNAQ;

CAMK2A; CXCL12; MAPK8; MAPK3; KRAS; MAPK13;

RHOA; CCR3; SRC; PPP1CC; MAPK14; NOX1; RAF1;

MAP2K2; MAP2K1; JUN; CCL2; PRKCA

Senalizacion de IL-2

ELK1; MAPK1; PTPN11; AKT2; PIK3CA; SYK; FOS;

STAT5B; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; MAPK3; KRAS;

SOCS1; STAT5A; PIK3C2A; LCK; RAF1; MAP2K2;

JAK1; AKT1; PIK3R1; MAP2K1; JUN; AKT3

Depresion Sinaptica a Largo Plazo

PRKCE; IGF1; PRKCZ; PRDX6; LYN; MAPK1; GNAS;

PRKCI; GNAQ; PPP2R1A; IGF1R; PRKD1; MAPK3;

KRAS; GRN; PRKCD; NOS3; NOS2A; PPP2CA;

YWHAZ; RAF1; MAP2K2; PPP2R5C; MAP2K1; PRKCA

Senalizacion del Receptor de Estrogenos

TAF4B; EP300; CARM1; PCAF; MAPK1; NCOR2;

SMARCA4; MAPK3; NRIP1; KRAS; SRC; NR3C1;

HDAC3; PPARGC1A; RBM9; NCOA3; RAF1; CREBBP;

MAP2K2; NCOA2; MAP2K1; PRKDC; ESR1; ESR2

Via de la Ubiquitinacion de Protemas

TRAF6; SMURF1; BIRC4; BRCA1; UCHL1; NEDD4;

CBL; UBE2I; BTRC; HSPA5; USP7; USP10; FBXW7;

USP9X; STUB1; USP22; B2M; BIRC2; PARK2; USP8;

USP1; VHL; HSP90AA1; BIRC3

Senalizacion de IL-10

TRAF6; CCR1; ELK1; IKBKB; SP1; FOS; NFKB2;

MAP3K14; MAPK8; MAPK13; RELA; MAPK14; TNF;

FUNCION CELULAR

GENES

IKBKG; RELB; MAP3K7; JAK1; CHUK; STAT3; NFKB1;

JUN; IL1R1; IL6

Activacion de VDR/RXR

PRKCE; EP300; PRKCZ; RXRA; GADD45A; HES1;

NCOR2; SP1; PRKCI; CDKN1B; PRKD1; PRKCD;

RUNX2; KLF4; YY1; NCOA3; CDKN1A; NCOA2; SPP1;

LRP5; CEBPB; FOXO1; PRKCA

Senalizacion de TGF-beta

EP300; SMAD2; SMURF1; MAPK1; SMAD3; SMAD1;

FOS; MAPK8; MAPK3; KRAS; MAPK9; RUNX2;

SERPINE1; RAF1; MAP3K7; CREBBP; MAP2K2;

MAP2K1; TGFBR1; SMAD4; JUN; SMAD5

Senalizacion del Receptor de tipo Toll

IRAKI; EIF2AK2; MYD88; TRAF6; PPARA; ELK1;

IKBKB; FOS; NFKB2; MAP3K14; MAPK8; MAPK13;

RELA; TLR4; MAPK14; IKBKG; RELB; MAP3K7; CHUK;

NFKB1; TLR2; JUN

Senalizacion de p38 MAPK

HSPB1; IRAKI; TRAF6; MAPKAPK2; ELK1; FADD; FAS;

CREB1; DDIT3; RPS6KA4; DAXX; MAPK13; TRAF2;

MAPK14; TNF; MAP3K7; TGFBR1; MYC; ATF4; IL 1R1;

SRF; STAT1

Senalizacion de Neurotrofina/TRK

NTRK2; MAPK1; PTPN11; PIK3CA; CREB1; FOS;

PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; MAPK3; KRAS; PIK3C2A;

RAF1; MAP2K2; AKT1; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1;

CDC42; JUN; ATF4

FUNCION CELULAR

GENES

Activacion de FXR/RXR

INS; PPARA; FASN; RXRA; AKT2; SDC1; MAPK8;

APOB; MAPK10; PPARG; MTTP; MAPK9; PPARGC1A;

TNF; CREBBP; AKT1; SREBF1; FGFR4; AKT3; FOXO1

Potenciacion Sinaptica a Largo Plazo

PRKCE; RAP1A; EP300; PRKCZ; MAPK1; CREB1;

PRKCI; GNAQ; CAMK2A; PRKD1; MAPK3; KRAS;

PRKCD; PPP1CC; RAF1; CREBBP; MAP2K2; MAP2K1;

ATF4; PRKCA

Senalizacion de Calcio

RAP1A; EP300; HDAC4; MAPK1; HDAC5; CREB1;

CAMK2A; MYH9; MAPK3; HDAC2; HDAC7A; HDAC11;

HDAC9; HDAC3; CREBBP; CALR; CAMKK2; ATF4;

HDAC6

Senalizacion de EGF

ELK1; MAPK1; EGFR; PIK3CA; FOS; PIK3CB; PIK3C3;

MAPK8; MAPK3; PIK3C2A; RAF1; JAK1; PIK3R1;

STAT3; MAP2K1; JUN; PRKCA; SRF; STAT1

Senalizacion de Hipoxia en el

EDN1; PTEN; EP300; NQO1; UBE2I; CREB1; ARNT;

Sistema Cardiovascular

HIF1A; SLC2A4; NOS3; TP53; LDHA; AKT1; ATM;

VEGFA; JUN; ATF4; VHL; HSP90AA1

Inhibicion Mediada por LPS/IL-1

IRAKI; MYD88; TRAF6; PPARA; RXRA; ABCA1;

de la Funcion RXR

MAPK8; ALDH1A1; GSTP1; MAPK9; ABCB1; TRAF2;

TLR4; TNF; MAP3K7; NR1H2; SREBF1; JUN; IL1R1

Activacion de LXR/RXR

FASN; RXRA; NCOR2; ABCA1; NFKB2; IRF3; RELA;

NOS2A; TLR4; TNF; RELB; LDLR; NR1H2; NFKB1;

FUNCION CELULAR

GENES

SREBF1; IL1R1; CCL2; IL6; MMP9

Procesamiento Amiloide

PRKCE; CSNK1E; MAPK1; CAPNS1; AKT2; CAPN2;

CAPN1; MAPK3; MAPK13; MAPT; MAPK14; AKT1;

PSEN1; CSNK1A1; GSK3B; AKT3; APP

Senalizacion de IL-4

AKT2; PIK3CA; PIK3CB; PIK3C3; IRS1; KRAS; SOCS1;

PTPN6; NR3C1; PIK3C2A; JAK1; AKT1; JAK2; PIK3R1;

FRAP1; AKT3; RPS6KB1

Ciclo Celular: G2/M Regulacion del Punto

EP300; PCAF; BRCA1; GADD45A; PLK1; BTRC;

de Verificacion de Dano a ADN

CHEK1; ATR; CHEK2; YWHAZ; TP53; CDKN1A;

PRKDC; ATM; SFN; CDKN2A

Senalizacion de Oxido Nitrico en el

KDR; FLT1; PGF; AKT2; PIK3CA; PIK3CB; PIK3C3;

Sistema Cardiovascular

CAV1; PRKCD; NOS3; PIK3C2A; AKT1; PIK3R1;

VEGFA; AKT3; HSP90AA1

Metabolismo de Purina

NME2; SMARCA4; MYH9; RRM2; ADAR; EIF2AK4;

PKM2; ENTPD 1; RAD51; RRM2B; TJP2; RAD51C;

NT5E; POLD1; NME1

Senalizacion mediada por cAMP

RAP1A; MAPK1; GNAS; CREB1; CAMK2A; MAPK3;

SRC; RAF1; MAP2K2; STAT3; MAP2K1; BRAF; ATF4

Disfuncion Mitocondrial

SOD2; MAPK8; CASP8; MAPK10; MAPK9; CASP9;

PARK7; PSEN1; PARK2; APP; CASP3

Senalizacion de Notch

HES1; JAG1; NUMB; NOTCH4; ADAM17; NOTCH2;

PSEN1; NOTCH3; NOTCH1; DLL4

FUNCION CELULAR

GENES

Via del Estres del Retfculo Endoplasmico

HSPA5; MAPK8; XBP1; TRAF2; ATF6; CASP9; ATF4;

EIF2AK3; CASP3

Metabolismo de Pirimidina

NME2; AICDA; RRM2; EIF2AK4; ENTPD1; RRM2B;

NT5E; POLD1; NME1

Senalizacion de Parkinson

UCHL1; MAPK8; MAPK13; MAPK14; CASP9; PARK7;

PARK2; CASP3

Senalizacion Cardiaca y Beta Adrenergica

GNAS; GNAQ; PPP2R1A; GNB2L1; PPP2CA; PPP1CC;

PPP2R5C

Glicolisis/Gluconeogenesis

HK2; GCK; GPI; ALDH1A1; PKM2; LDHA; HK1

Senalizacion de Interferon

IRF1; SOCS1; JAK1; JAK2; IFITM1; STAT1; IFIT3

Senalizacion Sonic Hedgehog

ARRB2; SMO; GLI2; DYRK1A; GLI1; GSK3B; DYRK1B

Metabolismo de Glicerofosfolfpidos

PLD1; GRN; GPAM; YWHAZ; SPHK1; SPHK2

Degradacion de FosfoKpidos

PRDX6; PLD1; GRN; YWHAZ; SPHK1; SPHK2

Metabolismo de triptofano

SIAH2; PRMT5; NEDD4; ALDH1A1; CYP1B1; SIAH1

Degradacion de Lisina

SUV39H1; EHMT2; NSD1; SETD7; PPP2R5C

Via de la Reparacion de la Escision de Nucleotidos

ERCC5; ERCC4; XPA; XPC; ERCC1

Metabolismo de Almidon y Sacarosa

UCHL1; HK2; GCK; GPI; HK1

Metabolismo de Aminoazucares

NQO1; HK2; GCK; HK1

Metabolismo del Acido Araquidonico

PRDX6; GRN; YWHAZ; CYP1B1

FUNCION CELULAR

GENES

Senalizacion del Ritmo Circadiano

CSNK1E; CREB1; ATF4; NR1D1

Sistema de Coagulacion

BDKRB1; F2R; SERPINE1; F3

Senalizacion del Receptor de Dopamina

PPP2R1A; PPP2CA; PPP1CC; PPP2R5C

Metabolismo de Glutation

IDH2; GSTP1; ANPEP; IDH1

Metabolismo de Glicerolipidos

ALDH1A1; GPAM; SPHK1; SPHK2

Metabolismo del Acido Linoleico

PRDX6; GRN; YWHAZ; CYP1B1

Metabolismo de Metionina

DNMT1; DNMT3B; AHCY; DNMT3A

Metabolismo de Piruvato

GLO1; ALDH1A1; PKM2; LDHA

Metabolismo de Arginina y Prolina

ALDH1A1; NOS3; NOS2A

Senalizacion de Eicosanoides

PRDX6; GRN; YWHAZ

Metabolismo de Fructosa y Manosa

HK2; GCK; HK1

Metabolismo de Galactosa

HK2; GCK; HK1

Biosmtesis de Estilbeno, Coumarina y

PRDX6; PRDX1; TYR

Lignina

Via de la Presentacion de Antfgenos

CALR; B2M

Biosmtesis de Esteroides

NQO1; DHCR7

Metabolismo de Butanoato

ALDH1A1; NLGN1

FUNCION CELULAR

GENES

Ciclo del Citrato

IDH2; IDH1

Metabolismo de Acidos Grasos

ALDH1A1; CYP1B1

Metabolismo de GlicerofosfoUpidos

PRDX6; CHKA

Metabolismo de Histidina

PRMT5; ALDH1A1

Metabolismo de Inositol

ERO1L; APEX1

Metabolismo de Xenobioticos

GSTP1; CYP1B1

por el Citocromo p450

Metabolismo del Metano

PRDX6; PRDX1

Metabolismo de Fenilalanina

PRDX6; PRDX1

Metabolismo de Propanoato

ALDH1A1; LDHA

Metabolismo de Selenoaminoacido

PRMT5; AHCY

Metabolismo de Esfingolipidos

SPHK1; SPHK2

Metabolismo de Aminofosfonato

PRMT5

Metabolismo de Androgenos y Estrogenos

PRMT5

Metabolismo de Ascorbato y Aldarato

ALDH1A1

Biosmtesis de Acidos Biliares

ALDH1A1

Metabolismo de Cistema

LDHA

FUNCION CELULAR

GENES

Biosmtesis de Acidos Grasos

FASN

Senalizacion del Receptor de Glutamate

GNB2L1

Respuesta al Estres Oxidativo medida por NRF2

PRDX1

Via del Fosfato de Pentosa

GPI

Interconversiones de Pentosa y Glucuronato

UCHL1

Metabolism de Retinol

ALDH1A1

Metabolismo de Riboflavina

TYR

Metabolismo de Tirosina

PRMT5, TYR

Biosmtesis de Ubiquinona

PRMT5

Degradacion de Valina, Leucina e

ALDH1A1

Isoleucina

Metabolismo de Glicina, Serina y

CHKA

Treonina

Degradacion de Lisina

ALDH1A1

Dolor/Sabor

TRPM5; TRPA1

Dolor

TRPM7; TRPC5; TRPC6; TRPC1; Cnr1; cnr2; Grk2;

Trpal; Pomc; Cgrp; Crf; Pka; Era; Nr2b; TRPM5; Prkaca;

Prkacb; Prkarla; Prkar2a

5

10

15

20

25

30

35

FUNCION CELULAR

GENES

Funcion Mitocondrial

AIF; CytC; SMAC (Diablo); Aifm-1; Aifm-2

Neurologfa del desarrollo

BMP-4; Cordina (Chrd); Nogina (Nog); WNT (Wnt2;

Wnt2b; Wnt3a; Wnt4; Wnt5a; Wnt6; Wnt7b; Wnt8b;

Wnt9a; Wnt9b; Wnt10a; Wnt10b; Wnt16); beta-catenina;

Dkk-1; Protemas relacionadas con Frizzled; Otx-2; Gbx2; FGF- 8;

Reelina; Dab1; unc-86 (Pou4f1 o Brn3a); Numb; Reln

Realizaciones de la invencion tambien se refieren a metodos y composiciones relacionados con la inactivacion de genes, la amplificacion de genes y la reparacion de mutaciones particulares asociadas con la inestabilidad en la repeticion de ADN y trastornos neurologicos (Robert D. Wells, Tetsuo Ashizawa, Genetic Instabilities and Neurological Diseases, Segunda Edicion, Academic Press 13 de oct. de 2011 - Medical). Se ha encontrado que aspectos espedficos de secuencias repetidas en tandem son los responsables de mas de una veintena de enfermedades humanas (New insights into repeat instability: role of RNA^DNA hybrids. Mclvor EI, Polak U, Napierala M. RNA Biol. 2010 Sep.-Oct.;7(5):551-8). El sistema de CRISPR-Cas puede ser aprovechado para corregir estos defectos de la inestabilidad genomica.

Un aspecto adicional de la invencion se refiere a la utilizacion del sistema de CRISPR-Cas para la correccion de defectos en los genes EMP2A y EMP2B que han sido identificados que estan asociados con la enfermedad de Lafora. La enfermedad de Lafora es una afeccion autosomica recesiva que se caracteriza por la epilepsia mioclonica progresiva que puede comenzar como convulsiones epilepticas en la adolescencia. Unos pocos casos de la enfermedad pueden ser provocados por mutaciones en genes aun por identificar. La enfermedad provoca convulsiones, espasmos musculares, dificultad para caminar, demencia y, finalmente, la muerte. Actualmente no existe una terapia que haya demostrado ser eficaz contra el progreso de la enfermedad. Otras anomalfas geneticas asociadas con la epilepsia tambien pueden ser fijadas como objetivo por el sistema de CRISPR-Cas y la genetica subyacente se describe con mas detalle en Genetics of Epilepsy and Genetic Epilepsies, editado por Giuliano Avanzini, Jeffrey L. Noebels, Mariani Foundation Paediatric Neurology:20; 2009).

Todavfa en otro aspecto de la invencion, el sistema de CRISPR-Cas puede utilizarse para corregir defectos oculares que surgen de varias mutaciones geneticas descritas adicionalmente en Genetic Diseases of the Eye, Segunda Edicion, editado por Elias I. Traboulsi, Oxford University Press, 2012.

Varios aspectos adicionales de la invencion se refieren a la correccion de los defectos asociados con una amplia gama de enfermedades geneticas que se describe con mas detalle en la pagina web de National Institutes of Health, bajo la subseccion Genetic Disorders (sitio web en health.nih.gov/topic/GeneticDisorders). Las enfermedades geneticas del cerebro pueden incluir, pero no se limitan a adrenoleucodistrofia, agenesia del cuerpo calloso, smdrome de Aicardi, enfermedad de Alper, enfermedad de Alzheimer, smdrome de Barth, enfermedad de Batten, CADASIL, Degeneracion cerebelosa, enfermedad de Fabry, enfermedad de Gerstmann-Straussier-Scheinker, enfermedad de Huntington y otros trastornos de la repeticion de tripletes, enfermedad de Leigh, smdrome de Lesch- Nyhan, enfermedad de Menkes, miopatfas mitocondriales y colpocefalfa NINDS. Estas enfermedades se describen con mas detalle en la pagina web de National Institutes of Health, bajo la subseccion Genetic Brain Disorders.

En algunas realizaciones, la afeccion puede ser la neoplasia. En algunas realizaciones, en los casos en los que la afeccion es la neoplasia, los genes a ser fijados como objetivo son cualquiera de los enumerados en la Tabla A (en este caso PTEN, etcetera). En algunas realizaciones, la afeccion puede ser la degeneracion macular relacionada con la edad. En algunas realizaciones, la afeccion puede ser un trastorno esquizofrenico. En algunas realizaciones, la afeccion puede ser un trastorno de repeticiones de trinucleotidos. En algunas realizaciones, la afeccion puede ser el smdrome X fragil. En algunas realizaciones, la afeccion puede ser un trastorno relacionado con secretasa. En algunas realizaciones, la afeccion puede ser un trastorno relacionado con Priones. En algunas realizaciones, la

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afeccion puede ser ALS. En algunas realizaciones, la afeccion puede ser una adiccion a los farmacos. En algunas realizaciones, la afeccion puede ser el autismo. En algunas realizaciones, la afeccion puede ser la enfermedad de Alzheimer. En algunas realizaciones, la afeccion puede ser la inflamacion. En algunas realizaciones, la afeccion puede ser la enfermedad de Parkinson.

Ejemplos de protemas asociadas con la enfermedad de Parkinson incluyen, pero no se limitan a a-sinuclema, DJ-1, LRRK2, Pinkl, Parkin, UCHL1, Sinfilina-1 y NURR1.

Ejemplos de protemas relacionadas con la adiccion pueden incluir ABAT, por ejemplo.

Ejemplos de protemas relacionadas con la inflamacion pueden incluir la protema quimioatrayente de monocitos 1 (MCP1) codificada por el gen Ccr2, el receptor de quimioquina C-C tipo 5 (CCR5) codificado por el gen Ccr5, el receptor IIB de IgG (FCGR2b, tambien denominado CD32) codificado por el gen Fcgr2b o la protema Fc epsilon R1g (FCERIg) codificada por el gen Fcerlg, por ejemplo.

Ejemplos de protemas asociadas a enfermedades cardiovasculares pueden incluir IL1B (interleuquina 1, beta), XDH (xantina deshidrogenasa), TP53 (protema tumoral p53), PTGIS (prostaglandina I2 (prostaciclina) sintasa), MB (mioglobina), IL4 (interleuquina 4), ANGPT1 (angiopoyetina 1), ABCG8 (casete de union a ATP, subfamilia G (WHITE) miembro, 8), o CTSK (catepsina K), por ejemplo.

Ejemplos de protemas asociadas a la enfermedad de Alzheimer pueden incluir la protema receptor de lipoprotemas de muy baja densidad (VLDLR) codificada por el gen VLDLR, la enzima activante del modificador de tipo ubiquitina 1 (UBA1) codificada por el gen UBA1 o la protema de la subunidad catalttica E1 de la enzima activante de NEDD8 (UBE1C) codificada por el gen UBA3, por ejemplo.

Ejemplos de protemas asociadas al trastorno del espectro del autismo pueden incluir la protema 1 asociada al receptor de benzodiazepina (periferico) (BZRAP1) codificada por el gen BZRAP1, la protema del miembro 2 de la familia AF4/FMR2 (AFF2) codificada por el gen AFF2 (tambien denominada MFR2), la protema homologa 1 autosomica del retardo mental X fragil (FXR1) codificada por el gen FXR1 o la protema homologa 2 autosomica del retardo mental X fragil (FXR2) codificada por el gen FXR2, por ejemplo.

Ejemplos de protemas asociadas con la degeneracion macular puede incluir la protema de la casete de union a ATP, sub-familia A (ABC1) miembro 4 (ABCA4) codificada por el gen ABCR, la protema apolipoprotema E (APOE) codificada por el gen APOE o la protema quimioquina (motivo C-C) Ligando 2 (CCL2) codificada por el gen CCL2, por ejemplo.

Ejemplos de protemas asociadas con la esquizofrenia pueden incluir NRG1, ErbB4, CPLX1, TPH1, TPH2, NRXN1, GSk3a, BDNF, DISC1, GSK3B, y combinaciones de las mismas.

Ejemplos de protemas implicadas en la supresion de tumores pueden incluir ATM (ataxia telangiectasia mutada), ATR (ataxia telangiectasia y relacionada con Rad3), EGFR (receptor del factor de crecimiento epidermico), ERBB2 (homologo 2 del oncogen de la leucemia eritroblastica v-erb-b2), ERBB3 (homologo 3 del oncogen de la leucemia eritroblastica v-erb-b2), ERBB4 (homologo 4 del oncogen de la leucemia eritroblastica v-erb-b2), Notch 1, Notch2, Notch 3 o Notch 4, por ejemplo.

Ejemplos de protemas asociadas con un trastorno secretasa pueden incluir PSENEN (homologo de potenciador de presenilina 2 (C. elegans)), CTSB (catepsina B), PSEN1 (presenilina 1), APP (precursor de la protema amiloide beta (A4)), APH1B (homologo B defectuoso de la faringe anterior 1 (C. elegans)), PSEN2 (presenilina 2 (enfermedad de Alzheimer 4)) o BACE1 (enzima de escision de APP del sitio beta 1), por ejemplo.

Ejemplos de protemas asociadas con la esclerosis lateral amiotrofica pueden incluir SOD1 (superoxido dismutasa 1), ALS2 (esclerosis lateral amiotrofica 2), FUS (fusionado en sarcoma), TARDBP (protema de union a ADN TAR), VAGFA (factor de crecimiento vascular endotelial A), VAGFB (factor de crecimiento vascular endotelial B) y VAGFC (factor de crecimiento vascular endotelial C), y cualquier combinacion de las mismas.

Ejemplos de protemas asociadas con las enfermedades prionicas pueden incluir SOD1 (superoxido dismutasa 1), ALS2 (esclerosis lateral amiotrofica 2), FUS (fusionado en sarcoma), TARDBP (protema de union a ADN TAR), VAGFA (factor de crecimiento vascular endotelial A), VAGFB (factor de crecimiento vascular endotelial B) y VAGFC (factor de crecimiento vascular endotelial C), y cualquier combinacion de las mismas.

Ejemplos de protemas relacionadas con enfermedades neurodegenerativas en los trastornos por priones pueden incluir A2M (alfa-2-macroglobuIina), AATF (factor de transcripcion antagonizante de la apoptosis), ACPP (fosfatasa acida prostatica), ACTA2 (actina alfa 2 aorta musculo liso), ADAM22 (dominio de metalopeptidasa ADAM), ADORA3 (receptor de adenosina A3) o ADRA1D (receptor adrenergico alfa-1D para el adrenorreceptor alfa-1 D), por ejemplo.

5 Ejemplos de protemas asociadas con inmunodeficiencia puede incluir A2M [alfa-2- macroglobulina]; AANAT [arilalquilamina N-acetiltransferasa]; ABCA1 [casete de union a ATP, subfamilia A (ABC1), miembro 1]; ABCA2 [casete de union a ATP, subfamilia A (ABC1), miembro 2]; o ABCA3 [casete de union a ATP, subfamilia A (ABC1), miembro 3]; por ejemplo.

Ejemplos de protemas asociadas con Trastornos por Repeticion de Trinucleotidos incluyen AR (receptor de 10 androgenos), FMR1 (retardo mental X fragil 1), HTT (huntingtina) o DMPK (distrofia miotonica-protema quinasa), FXN (frataxina), ATXN2 (ataxina 2), por ejemplo.

Ejemplos de protemas asociadas con los Trastornos de Neurotransmision incluyen SST (somatostatina), NOS1 (oxido mtrico sintasa 1 (neuronal)), ADRA2A (receptor adrenergico alfa -2A), ADRA2C (receptor adrenergico alfa- 2C), TACR1 (receptor de taquiquinina 1) o HTR2C (receptor de 5-hidroxitriptamina (serotonina) 2C), por ejemplo.

15 Ejemplos de secuencias asociadas al neurodesarrollo incluyen A2BP1 [protema de union 1 ataxina 2], AADAT [aminoadipato aminotransferasa], AANAT [arilalquilamina N-acetiltransferasa], ABAT [4-aminobutirato aminotransferasa], ABCA1 [casete de union a ATP, subfamilia A (ABC1), miembro 1] o ABCA13 [casete de union a ATP, subfamilia A(ABC1), miembro 13], por ejemplo.

Ejemplos adicionales de afecciones preferidas tratables con el presente sistema se pueden seleccionar de: 20 Smdrome de Aicardi-Goutieres; Enfermedad de Alexander; Smdrome de Allan-Herndon-Dudley; Trastornos

Relacionados con POLG; Alfa-Manosidosis (Tipos I y III); Smdrome de Alstrom; Smdrome de Angelman; Ataxia- Telangiectasia; Lipofuscinosis Ceroide Neuronal; Beta-Talasemia; Atrofia Optica Bilateral y Atrofia Optica (Infantil) Tipo 1; Retinoblastoma (bilateral); Enfermedad de Canavan; Smdrome Cerebro-oculofacioesqueletico 1 [COFS1]; Xantomatosis Cerebrotendinosa: Smdrome de Cornelia de Lange; Trastornos Relacionados con MAPT; 25 Enfermedades Prionicas Geneticas; Smdrome de Dravet; Enfermedad de Alzheimer Familiar de Aparicion Temprana; Ataxia de Friedreich [FRDA]; Smdrome de Fryns; Fucosidosis; Distrofia Muscular Congenita de Fukuyama; Galactosialidosis; Enfermedad de Gaucher; Acidemias Organicas; Linfohistiocitosis Hemofagocftica; Smdrome de Progeria de Hutchinson-Gilford; Mucolipidosis II; Enfermedad de Almacenamiento de Acido Sialico Libre Infantil; Neurodegeneracion Asociada a PLA2G6; Smdrome de Jervell y Lange-Nielsen; Epidermolisis Bullosa 30 de la Union; Enfermedad de Huntington; Enfermedad de Krabbe (Infantil); Smdrome de Leigh y NARP asociado a ADN mitocondrial; Smdrome de Lesch-Nyhan; Lisencefalia Asociada a LIS1; Smdrome de Lowe; Enfermedad de la Orina de Jarabe de Arce; Smdrome de Duplicacion de MECP2; Trastornos de Transporte de Cobre Relacionados con ATP7A; Distrofia Muscular Relacionada con LAMA2; Deficiencia de Arilsulfatasa A; Mucopolisacaridosis Tipos I, II o III; Trastornos de la Biogenesis de Peroxisomas, Espectro del Smdrome de Zellweger; Neurodegeneracion con 35 Trastornos de Acumulacion de Hierro en el Cerebro; Deficiencia de Esfingomielinasa Acida; Enfermedad de Niemann-Pick Tipo C; Encefalopatfa de Glicina; Trastornos Relacionados con ARX; Trastornos del Ciclo de la Urea; Osteogenesis Imperfecta Relacionada con COL1A1/2; Smdromes Mitocondriales de Delecion de ADN; Trastornos relacionados con PLP1; Smdrome de Perry; Smdrome de Phelan-McDermid; Enfermedad del Almacenamiento de Glucogeno Tipo II (Enfermedad de Pompe) (Infantil); Trastornos Relacionados con MAPT; Trastornos Relacionados 40 con MECP2; Condrodisplasia Punctata Rizomelica Tipo 1; Smdrome de Roberts; Enfermedad de Sandhoff; Enfermedad de Schindler - Tipo 1; Deficiencia de Adenosina Desaminasa; Smdrome de Smith-Lemli-Opitz; Atrofia Muscular Espinal; Ataxia Espinocerebelosa de Brote Infantil; Deficiencia de Hexosaminidasa A; Displasia Tanatoforica Tipo 1; Trastornos Relacionados con Colageno Tipo VI; Smdrome de Usher Tipo I; Distrofia Muscular Congenita; Smdrome de Wolf-Hirschhorn; Deficiencia Lisosomal de Lipasa Acida; y Xenoderma Pigmentosum.

45 Como resultara evidente, se preve que el presente sistema se pueda utilizar para fijar como objetivo a cualquier secuencia de polinucleotidos de interes. Algunos ejemplos de afecciones o enfermedades que podnan ser tratadas utilmente utilizando el presente sistema se incluyen en las Tablas anteriores y tambien se proporcionan allf ejemplos de genes asociados actualmente con esas afecciones. Sin embargo, los genes ejemplificados no son exhaustivos.

EJEMPLOS

50 Los siguientes ejemplos se dan con el proposito de ilustrar diversas realizaciones de la invencion.

Ejemplo 1: Mejora del sistema Cas9 para la aplicacion in vivo

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La solicitante llevo a cabo una busqueda metagenomica para una Cas9 con pequeno peso molecular. La mayona de los homologos de Cas9 son bastante grandes. Por ejemplo, la SpCas9 es de alrededor de 1368aa de larga, que es demasiado grande para ser empaquetada facilmente en vectores virales para el suministro.

A traves de analisis computacional, la solicitante encontro que en la cepa bacteriana Campylobacter existen dos protemas Cas9 con menos de 1000 aminoacidos. La secuencia para una Cas9 de Campylobacterjejuni se presenta a continuacion. En esta longitud, CjCas9 puede empaquetarse facilmente en AAV, lentivirus, adenovirus y otros vectores virales para el suministro solido en celulas primarias y en modelos animales in vivo. En una realizacion preferida de la invencion, se utiliza la protema Cas9 de S. aureus.

>Cas9 de Campylobacter jejuni (CjCas9)

MARILAFDIGISSIGWAFSENDELKDCGVRFTKVENPKTGESLALPRRLARSARKRLARR

KARLNHLKHLTANEFKLNYEDYQSFDESLAKAYKGSLTSPYELRFRALNELLSKQDFAR

VILHIAKRRGYDDIKNSDDKEKGAILKAIKQNEEKLANYQSVGEYLYKEYFQKFKENSK

EFTNVRNKKESYERCIAQSFLKDELKLIFKKQREFGFSFSKKFEEEVLSVAFYKRALKDFS

HLVGNCSFFTDEKRAPKNSPLAFMFVALTRTTNLLNNLKNTEGTLYTKDDLNALLNEVLK

NGTLTYKQTKKLLGLSDDYEFKGEKGTYFIEFKKYKEFTKALGEHNLSQDDLNETAKDTT

LIKDEIKLKKALAKYDLNQNQIDSLSRLEFKDHLN1SFKALKLVTPLMLEGKKYDEACNE

LNLKVAINEDKKDFLPAFNETYYKDEVTNPVVLRA1KEYRKVLNALLKKYGKVHKIN1E

LAREVGKNHSQRAKJEKEQNENYKAKKDAELECEKLGLKJNSKNILKLRLFKEQKEFCA

YSGEK1KISDLQDEKMLE1DH1YPYSRSFDDSYMNKVLVFTKQNQEKLNQTPFEAFGNDS

AKWQKIEVLAKNLPTKKQKRILDKNYKDKEQKNFKDRNLNDTRYIARLVLNYTKDYL

DFLPLSDDENTKLNDTQKGSKVHVEAKSGMLTSALRHTWGFSAKDRNNHLHHAIDAVI

IAY ANNSIVKAFSDFKKEQE SN S AEL Y AKKISELD YKNKRKFFEPFSGFRQK.VLDKJDEIF

VSKPERKKPSGALHEETFRKEEEFYQSYGGKEGVLKALELGKIRKVNGKIVKNGDMFR

VDIFKHKKTNKFYAVPIYTMDFALKVLPNKAVARSKKGEIKJOWILMDENYEFCFSLYK

DSL1L1QTKDMQEPEFVYYNAFTSSTVSLJVSKHDNKFETLSKNQKJLFKMANEKEVIAKS

TGTQNLKVFEKYTVSALGEVTKAEFRQREDFKK.

El elemento tracrRNA putativo para esta CjCas9 es:

T AT AAT CT C AT AAG AA ATTT AAAAAGGGACT AAAAT AAAG AGTTT GC GGG ACTCTGCGGGGTTACAATCCCCTAAAACCGCTTTTAAAATT

La secuencia de Repeticion Directa es:

ATTTTACCATAAAGAAATTTAAAAAGGGACTAAAAC

Un ejemplo de un ARN qrna quimerico para CjCas9 es:

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGUCCCGAAAGGGACUAAAAUAAAGAGUU

UGCGGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU

Ejemplo 2: Optimizacion de Cas9

Para potenciar la funcion o para desarrollar nuevas funciones, la solicitante genera protemas quimericas Cas9 mediante la combinacion de fragmentos de diferentes homologos de Cas9. Por ejemplo, dos protemas quimericas Cas9 de ejemplo:

Por ejemplo, la solicitante fusiono el extremo N de St1Cas9 (el fragmento de esta protema esta en negrita) con el extremo C de SpCas9 (el fragmento de esta protema esta subrayado).

>St1(N)Sp(C)Cas9

MSDLVLGLDIGIGSVGVGILNKVTGEIIHKNSRIFPAAQAENNLVRRTNRQGRRLAR

RKKHRRVRLNRLFEESGLTTDFTKISINLNPYQLRVKGLTDELSNEELEIALKNMVK

HRG1SYLDDASDDGNSSVGDYAQIVKENSKQLETKTPGQIQLERYQTYGQLRGDFT

VEKDGKKHRL1NVFPTSAYRSEALR1LQTQQEFNPQ1TDEF1NRYLE1LTGKRKYYH

GPGNEKSRTDYGRYRTSGETLDNIFGILIGKCTFYPDEFRAAKASYTAQEFNLLNDL

NNL TVPTE TKKLSKE QKNQIINY VKNE K AM GP AKLFKYIAKLLS CD V ADFKG YRID

KSGKAEIHTFEAYRKMKTLETLDIEQMDRETLDKLAYVLTLNTEREGIQEALEHEF

ADGSFSQKQVDELVQFRKANSSIFGKGWHNFSVKLMMELIPELYETSEEQMTILTR

LGKQKTTSSSNKTKYIDEKLLTEEIYNPVVAKSVRQAIK1VNAAIKEYGDFDN1V1EM

ARENOTTOKGOK.N SRERMKR1EEG1KELG SOILKEHP VENTOLONEKL YLY YLON GRP

MYVDQELD1NRLSDYDVDH1VPOSFLKDDS1DNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKM

KNYWROLLNAKLITORKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKROLVETROTTKHVAOILDSR

MNTKYDENDKLTREVKV1TLKSKLVSDFRKDFOFYKVREINNYHHAHDAYLNAWGTA

LIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEOEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGE

IRKRPL1ETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPOVN1VKKTEVOTGGFSKESILPKRNS

DKL1ARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGRSKKLKSVKELLGITFV1ERSSFE

KNPIDFLEAKGYKEVKKDLTTKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVN

FLYLASHYEKLKGSPEDNEOKOLFVEOHKHYLDEIIEOISEFSKRVILADANLDKVLSAY

NKHRDKP1REQAEN1IHLFTLTNLGAPAAFRYFDTT1DRKRYTSTKEVLDATL1HQS1TGL

YETRIDL SOLGGD

>Sp1(N)St1(C)Cas9

MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETA

EATRLKRTARRRYTRRKNRiCYLOElFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPlF

GNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNS

DVDKLFIOLVOTYNOLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAOLPGEKKNGLFG

NL1ALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLOLSKDTYDDDLDNLLAOJGDOYADLFLAAKNLSD

AILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHODLTLLKALVROOLPEKYKEIFFDOSKNGY

AGYTDGGASOEEFYKFTKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKORTFDNGSTPHQIHLGEL

HA1LRROEDFYPFLKDNREKIEK1LTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEET1TPWNFEE

WDKGASAQSFTERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPA

FLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVETSGVEDRFNASLGTYHDLL

KI1KDKDFLDNEENED1LEDIVLTLTLFEDREM1EERLKTYAHLFDDKVMKOLKRRRYTG

WGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQG

DSLHEHTANLAGSPATKKGILOTVKVVDELVKVMGRHKPENIVTEMARETNEDDEKKAI

QKIQKANKDEKDAAMLKAANQYNGKAELPHSVFHGHKQLATKIRLWHQQGERC

LYTGKTISIHDLINNSNQFEVDHILPLSITFDDSLANKVLVYATANQEKGQRTPYQAL

DSMDDAWSFRELKAFVRESKTLSNKKKEYLLTEEDISKFDVRKKFIERNLVDTRYA

SRWLNALQEHFRAHKIDTKVSYARGQFTSQLRRHWGIEKTRDTYHHHAVDALIIA

ASSQLNLWKKQKNTLVSYSEDQLLDIETGELISDDEYKESVFKAPYQHFVDTLKSK

EFEDS1LFS YQ VDSKFN RKISD ATI Y AT RQAKV GKDKADET Y VLGKIKDIYT QDG YD

AFMKIYKKDKSKFLMYRHDPQTFEKVIEPILENYPNKQINEKGKEVPCNPFLKYKE

EHGYIRKYSKKGNGPEIKSLKYYDSKLGNHIDITPKDSNNKWLQSVSPWRADVYF

NKTTGKYEILGLKYADLQFEKGTGTYKISQEKYNDIKKKEGVDSDSEFKFTLYKND

LLLVKDTETKEQQLFRFLSRTMPKQKHYVELKPYDKQKFEGGEALIKVLGNVANS

GQCKKGLGKSNISIYKVRTDVLGNQHIIKNEGDKPKLDF

El beneficio de producir Cas9 quimerica incluye:

5 a, reducir la toxicidad.

b. mejorar la expresion en celulas eucariotas

c. mejorar la especificidad

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d. reducir el peso molecular de la protema, producir una protema mas pequena mediante la combinacion de los dominios mas pequenos de diferentes homologos de Cas9.

e. alterar el requisito de la secuencia PAM

Ejemplo 3: Utilizacion de Cas9 como una prote^na de union a ADN generica

La solicitante utilizo Cas9 como una protema de union a ADN generica mediante la mutacion de los dos dominios cataltticos (D10 y H840) responsables de la escision de ambas cadenas de la diana de ADN. Con el fin de regular positivamente la transcripcion de genes a un locus diana, la solicitante fusiono el dominio de activacion transcripcional (VP64) a Cas9 (Figura 5). La solicitante planteo la hipotesis de si sena importante ver una fuerte localizacion nuclear de la protema de fusion VP64-Cas9, ya que la fuerza de activacion del factor de transcripcion es una funcion del tiempo de estancia en la diana. Por lo tanto, la solicitante clono un conjunto de construcciones Cas9- VP64-GFP, las transfecto en celulas 293 y evaluo su ubicacion bajo un microscopio de fluorescencia 12 horas despues de la transfeccion (Figura 8).

Las mismas construcciones se clonaron como un 2A-GFP en lugar de una fusion directa con el fin de probar funcionalmente las construcciones sin un GFP voluminoso presente que interfiriera. La solicitante eligio fijar como objetivo el locus Sox2 con el transactivador Cas9, ya que podna ser util para la reprogramacion celular y el lugar ya ha sido validado como una diana para la activacion transcripcional mediada por TALE-TF. Para el locus Sox2, la solicitante eligio ocho dianas cerca del sitio de inicio de la transcripcion (TSS). Cada una de las dianas era de 20 pb de longitud con un motivo adyacente al protoespaciador vecino NGG (PAM) (Figura 12). Cada una de las construcciones Cas9-VP64 se co-transfecto con cada uno de los ARN crispr quimericos generados por PCR (chiRNA) en celulas 293. 72 horas despues de la transfeccion, la activacion transcripcional se evaluo mediante RT- qPCR (Figura 6).

Para optimizar adicionalmente el activador de la transcripcion, la solicitante titulo la relacion de chiRNA (Sox2.1 y Sox2.5) para Cas9 (NLS-VP64-NLS-hSpCas9-NLS-VP64-NLS), transfectado en celulas 293, y cuantifico el uso de RT-qPCR (Figura 11). Estos resultados indican que Cas9 se puede utilizar como un dominio de union a ADN generico para regular positivamente la transcripcion de genes en un locus diana.

La solicitante diseno una segunda generacion de construcciones. (Tabla 1 a continuacion).

pLenti-EF1a-GFP-2A-6xHis-NLS-VP64-NLS-hSpCsn1(D10A, H840A)-NLS

pLenti-EF 1a-GFP-2A-6xHis-NLS-VP64-NLS-hSpCsn1(D10A, H840A)

pLenti-EF1a-GFP-2A-6xHis-NLS-VP64-NLS-NLS-hSpCsn1(D10A, H840A)

pLenti-EF1a-GFP-2A-6xHis-NLS-hSpCsn1(D10A, H840A)-NLS

pLenti-EF1a-GFP-2A-6xHis-NLS-hSpCsn1(D10A, H840A)

pLenti-EF1a-GFP-2A-6xHis-NLS-NLS-hSpCsnl(D10A, H840A)

La solicitante utiliza estas construcciones para evaluar la activacion transcripcional (construcciones VP64 fusionadas) y la represion (Cas9 solamente) por RT-qPCR. La solicitante evaluar la ubicacion celular de cada una de las construcciones utilizando anticuerpo anti-His, la actividad nucleasa utilizando un ensayo de nucleasa Surveyor y la afinidad de union a ADN utilizando un ensayo de desplazamiento en gel. En una realizacion preferida de la invencion, el ensayo de desplazamiento en gel es un ensayo de desplazamiento en gel EMSA.

Ejemplo 4: Represor de Cas9

Se ha demostrado previamente que dCas9 se puede utilizar como un dominio de union a ADN generico para reprimir la expresion de genes. La solicitante informan de un diseno mejorado de dCas9, as^ como fusiones dCas9 a los dominios represores KRAB y SID4x. A partir del banco de plasmidos creado para modular la transcripcion utilizando Cas9 en la Tabla 2 que figura mas adelante, y la Figura 15, se caracterizaron funcionalmente por qPCR los 5 siguientes plasmidos represores: pXRP27, pXRP28, pXRP29, pXRP48, pXRP49, pXRP50, pXRp51, pXRP52, pXRP53, pXRP56, pXRP58, pXRP59, pXRP61 y pXRP62.

Cada uno de los plasmidos represores dCas9 fue co-transfectado con dos ARNs grna dirigidos a la cadena codificadora del gen beta-catenina (los ARNg fueron disenados por mi colaborador en el Broad, Joseph Rosenbluh). Se aislo el ARN 72 horas despues de la transfeccion y expresion de genes se cuantifico por RT-qPCR (Figura 16). El 10 gen endogeno de control era GAPDH. Dos shRNAs validados se utilizaron como controles positivos. Los controles negativos eran determinados plasmidos transfectados sin ARNg, estos se designan como " pXRP ## control " en la Figura 16. Los plasmidos pXRP28, pXRP29, pXRP48 y pXRP49 pudieron reprimir el gen de la beta-catenina cuando se utiliza la estrategia de focalizacion especificada. Estos plasmidos corresponden a dCas9 sin un dominio funcional (pXRP28 y pXRP28) y dCas9 fusionado a SlD4x (pXRP48 y pXRP49).

15 Tabla 2

pXRP024-pLenti2-EF1a-VP64-NLS-FLAG-Enlazador-dCas9-NLS-gLuc-2A-GFP-WPRE

pXRP025-pLenti2-EF1a-VP64-NLS-GGGGSaEnlazador-dCas9-NLS-gLuc-2A-GFP-WPRE

pXRP026-pLenti2-EF1a-VP64-NLS-EAAAKaEnlazador-dCas9-NLS-gLuc-2A-GFP-WPRE

pXRP027-pLenti2-EF1a-NLS-FLAG-Enlazador-dCas9-NLS-gLuc-2A-GFP-WPRE

pXRP028-pLenti2-EF1a-NLS-GGGGSaEnlazador-dCas9-NLS-gLuc-2A-GFP-WPRE

pXRP029-pLenti2-EF1a-NLS-EAAAKaEnlazador-dCas9-NLS-gLuc-2A-GFP-WPRE

pXRP030-pLenti2-pSV40-VP64-NLS-FLAG-Enlazador-dCas9-NLS-gLuc-2A-GFP-WPRE

pXRP031-pLenti2-pPGK-VP64-NLS-FLAG-Enlazador-dCas9-NLS-gLuc-2A-GFP-WPRE

pXRP032-pLenti2-LTR-VP64-NLS-FLAG-Enlazador-dCas9-NLS-gLuc-2A-GFP-WPRE

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Ejemplo 5: Modulador transcripcional de Cas9 y ubicacion nuclear

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Modulador transcripcional de Cas9. La solicitante se ha propuesto cambiar el sistema de Cas9/gRNA CRISPR en un sistema de union a ADN generalizado en la que la solicitante pueda ejecutar funciones mas alia de la escision del ADN. Con lo cual, al fusionar dominios funcionales en una Cas9 catalfticamente inactiva, dCas9, la solicitante puede impartir nuevas funciones tales como la activacion/represion transcripcional, la metilacion/desmetilacion o modificaciones de cromatina. Para lograr este objetivo, la solicitante hizo un mutante Cas9 catalfticamente inactivo cambiando dos residuos esenciales para la actividad nucleasa, D10 y H840, a alanina. Se ha demostrado previamente que mediante la mutacion de estos dos residuos se suprime la actividad nucleasa de Cas9, al tiempo que se mantiene la capacidad de unir ADN diana. Los dominios funcionales en los que la solicitante decidio centrarse para poner a prueba la hipotesis de la solicitante son el activador transcripcional VP64 y los represores transcripcionales SID y KRAB.

Ubicacion nuclear de dCas9. La solicitante planteo la hipotesis de que el modulador de la transcripcion mas eficaz dCas9 estana fuertemente localizado en el nucleo en donde tendna su mayor influencia en la transcripcion. Por otra parte, cualquier dCas9 residual en el citoplasma podna tener efectos no deseados. En trabajos anteriores, la solicitante determino que Cas9 de tipo salvaje no se localiza en el nucleo sin incluir multiples senales de localizacion nuclear (NLSs). Debido a que se requenan multiples secuencias NLS, la solicitante razono que es dificil conseguir Cas9 en el nucleo y que cualquier dominio adicional que este fusionado a Cas9 podna interrumpir la ubicacion nuclear. Por lo tanto, la solicitante construyo cinco construcciones de fusion dCas9-VP64-GFP para optimizar la posicion y el numero de secuencias de NLS. Una segunda version de cada una de las construcciones se hizo para el ensayo funcional, y estas construcciones no se fusionaron directamente a GFP. Un esquema de estos disenos se muestra en la Figura 7. Estas construcciones se clonaron en una cadena principal de plenti2 bajo la expresion del promotor EF1a humano. El elemento WPRE tambien se anadio para la expresion mas solida de protemas. Cada una de las construcciones se transfecto a celulas HEK 293FT utilizando Lipofectame 2000 y se tomaron imagenes 24 horas despues de la transfeccion (Figura 8). La Figura 8 muestra que la mejor ubicacion nuclear se obtiene cuando las protemas de fusion tienen secuencias NLS tanto en los extremos N como C termino de la protema de fusion. La ubicacion nuclear mas alta observada se produjo en la construccion con cuatro elementos NLS.

Para entender mas solidamente la influencia de elementos NLS en Cas9, la solicitante realizo 16 fusiones dCas9- GFP mediante la adicion de la misma secuencia NLS de alfa importina en cualquiera de los extremos No C mirando cero a tres repeticiones en tandem. Se utilizo la misma estrategia de clonacion que la que se explico anteriormente. Cada una de las construcciones se transfecto en celulas HEK 293FT utilizando Lipofectame 2000 y se tomaron imagenes 24 horas despues de la transfeccion (Figura 9). Cabe destacar que el numero de elementos de NLS no se correlaciona directamente con el grado de ubicacion nuclear. La adicion de una NLS al extremo C tiene una mayor influencia en la ubicacion nuclear que la adicion en el extremo N. Para aplicaciones futuras es mas favorable tener protemas mas pequenas. Por lo tanto, la arquitectura optima de NLS para dCas9 era tener una NLS en el extremo N y el extremo C (pXRPNLS006).

Un factor de confusion potencial de usar una fusion GFP para determinar la ubicacion nuclear es que el propio GFP podna tener una gran influencia en donde se localiza la protema en la celula. Por lo tanto, la solicitante determino que un buen enfoque sena incluir un marcador 6xHis a dCas9, transfectar en celulas 293FT, y luego tenir con un anticuerpo anti-6xHis. La solicitante hizo seis versiones utilizando esta idea (Figura 10). Tres de ellas fueron construidas para la activacion transcripcional (fusiones VP64), y las otras tres fueron para la represion transcripcional (sin dominio funcional). Tambien se hicieron estas construcciones de modo que la solicitante podfan purificar la protema recombinante utilizando una columna de mquel. Hay muchas aplicaciones de las construcciones 6xHis-dCas9 tales como, por ejemplo, para llevar a cabo un ensayo de desplazamiento en gel de electromovilidad para demostrar que Cas9 mutada puede de hecho unirse a su diana de ADN. Las construcciones de represion (pXRP013, pXRP014, pXRP015) se transfectaron en celulas HEK 293FT y se inmunotineron y se tomaron imagenes despues de 24 horas (Figura 11). Bajo este contexto espedfico, dCas9 requiere dos senales NLS en el extremo N a ser ubicadas en el nucleo. Curiosamente, una NLS en cada extremo no provoco que dCas9 estuviera fuertemente ubicada en el nucleo. Tomados en conjunto, lo que sugieren estos datos es que no existe una norma generalizada que se pueda hacer para decir de manera concluyente que una protema de fusion dCas9 quedara ubicada en el nucleo. La construccion de interes debe ser validada en el sistema se va a utilizar para determinar si de hecho esta ubicada en el nucleo.

Ensayo Funcional del Modulador Transcripcional de Cas9. La solicitante sometio a ensayo funcional la protema dCas9-VP64 fijando como objetivo el locus Sox2 y cuantificando la activacion transcripcional mediante RT-qPCR. Se eligieron ocho sitios diana de ADN para abarcar el promotor de Sox2 (Figura 12). Las casetes de expresion de ARNg se clonaron en un plasmido de la cadena principal pAAV-U6-gRNA/trcrRNA, pA6. El plasmido utiliza la enzima Bbsi de tipo IIs para revelar extremos adherentes para el oligo ligamiento reasociado. Asf, para cada una de las dianas todo lo que se necesita son dos oligonucleotidos complementarios con extremos adherentes apropiados.

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Cada una de las construcciones que contema dCas9 fue co-transfectada con plasmidos pA6 en celulas HEK 293FT utilizando Lipofectame 2000. 72 horas post-transfeccion, el ARN total se extrajo de las celulas. 1 ug de ARN se transcribio de forma inversa en ADNc (qScript Supermix) en una reaccion de 40 ul. 2 ul del producto de reaccion se anadio en una sola reaccion qPCR de 20 ul de ensayo TaqMan. Cada uno de los experimented se realizo por triplicado biologico y tecnico. Ninguna reaccion de control RT y de control del molde mostro amplificacion. Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 13. Las construcciones que no muestran una fuerte ubicacion nuclear, pXRP02 y pXRP04, no dan lugar a activacion alguna. Para la construccion que mostro una fuerte ubicacion nuclear, pXRP08, se observo una activacion moderada. Estadfsticamente se observo una activacion significativa en el caso de los ARNg Sox2.4 y Sox2.5. De las construcciones 6xHis-dCas9 (pXRP011, pXRP013, pXRP015) tambien se ensayaron utilizando las mismas dianas Sox2 (Figura 14). En comparacion con los controles simulados no ARNg, la solicitante pudo reprimir o activar Sox2.

Para optimizar adicionalmente el activador y represor transcripcional dCas9 la solicitante construyo 31 construcciones para explorar diferentes enlazadores, dominios funcionales y fusiones en los extremos N y C. La lista de construcciones y los elementos cnticos se muestran en la Figura 15. Se testaron tres enlazadores y el primero era un enlazador inusual que fue publicado por Shen y colegas (Shen et al. 2013, Documento de investigacion celular del laboratorio de Xingxu Huang: Ceil Research 23, 720-723 (mayo de 2013)) donde demostraron que mejoro drasticamente la ubicacion nuclear y la actividad nucleasa de Cas9. El segundo y tercer enlazadores eran enlazadores muy comunes conocidos por ser flexibles (GGGGS3) y ngidos (EAAAK3). Los dominios funcionales testados fueron VP64 para la activacion y SID4x y KRAB para la represion, Tambien se hizo dCas9 sin un dominio funcional para testar la represion. Los promotores testados eran EF1a humano, pPGK humano, SV40, y la ausencia de un promotor, en donde la expresion es impulsada por el LTR viral.

Todas las construcciones de activador transcripcional fueron fijadas como objetivo al locus Sox2 utilizando una combinacion de dos ARNg, hSox2.1 y hSox2.4. Las construcciones de activador dCas9 fueron co-transfectadas con los ARNg en celulas HEK 293FT y analizadas por qPCR despues de 72 horas (Figura 16).

Se adopto un ensayo informador de luciferasa Sox2 para simplificar los metodos asociados para la determinacion de los niveles de activacion. El ensayo funciona mediante la co-transfeccion en tres plasmidos, 1) dCas9, 2) ARNg, 3) elemento sensible a Sox2 que impulsa luciferasa. Asf el nivel de luciferasa es proporcional a la cantidad de Sox2. El plasmido sensible a Sox2 se adquirio de BioCat. El locus Sox2 fue fijado como objetivo utilizando diferentes combinaciones de ARNg y las construcciones pXRP024 y pXRP025. Se utilizo un control "Sin dCas9" para determinar el nivel basal de activacion. Los resultados mostrados en el panel superior de la Figura 11 sugieren que la activacion triple podna alcanzarse en comparacion con controles "Sin dCas9" y "Sin ARNg".

Un ensayo de luciferasa similar se adopto para testar la represion transcripcional de dCas9. El candidato de gen que eligio la solicitante para la represion era beta-catenina y las dianas estaban ubicadas cerca del extremo 5' del gen cuerpo en la cadena no codificadora. El primer experimento que utiliza este ensayo comparo el represor pXRPNLS006 con el represor "dCas9", publicado por Qi y colegas (Qi et al 2003, Documento de la celula del laboratorio de Wendell Lim:
http://www.sciencedirect.com/science/articIe/pii/S0092867413002110). Los resultados del ensayo de luciferasa (panel inferior de la Figura 11) muestran que se puede alcanzar la represion triple y que el plasmido pXRPNLS006 aqrn resenado funciona significativamente mejor que el estandar actual, "dCas9".

Ejemplo 6: Activador transcripcional de Cas9 en tfneas celulares murinas y humanas

La solicitante demostro previamente la capacidad de CRISPR/Cas9 de actuar como un activador transcripcional. En este ejemplo, la solicitante testaron adicionalmente esta capacidad en una lmea celular murina. La solicitante tambien examino la actividad basal sin grna de dCas9-VP64 (H840A D10A Cas9 doble mutante fusionada al dominio de activacion transcripcional de VP64). La solicitante suministro el sistema activador Cas9 a celulas de raton y, por separado, caracterizo los efectos no guiados de dCas9-VP64 para varios genes humanos.

Experimentos con la Lmea Celular de Ratones: La solicitante selecciono el locus para el gen de raton Neurog2 para testar la activacion transcripcional de dCas9-VP64 en celulas Neuro 2A. La solicitante tambien selecciono 7 secuencias que fijan como objetivo SgRNA de una region de 300 pb aguas arriba a 100 pb aguas abajo del sitio de inicio transcripcional de Neurog2 anotado. Estas secuencias grna se clonaron por el metodo Golden Gate en el plasmido px362 que contema el promotor U6 aguas arriba de la cadena principal de clonacion un sgRNA quimerico.

Celulas Neuro 2A se cultivaron en medio que consistfa en una relacion 1:1 de D5 (100:5:1 DMEM de alto contenido en glucosa con Glutamax y piruvato de sodio: suero bovino fetal: penicilina/estretomicina). Para la transfeccion, celulas 120K en 0,5 mL de medio de cultivo se sembraron en cada uno de los pocillos de una placa de 24 pocillos.

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35

Despues de 22 h en cultivo, cada uno de los pocillos de celulas Neuro 2A se transfectaron con 1 ug de ADN utilizando 5 uL de Lipofectamine siguiendo los pasos recomendados por el fabricante (Life Technologies). Para todas las muestras de dCas9-VP64 + sgRNA, se utilizaron 0,5 ug de plasmido dCas9-VP64 y 0,5 ug de plasmido de expresion sgRNA. Para las muestras control, las masas de plasmido reemplazaron al plasmido que expresa GFP segun fuese necesario. 4 h despues de la transfeccion, el medio se reemplazo con 1 mL de medio de cultivo. 48 h despues de la transfeccion, el ARN fue purificado utilizando el kit de ARN Macherey Nagel Nucleospin 96. La transcripcion inversa se realizo con qScript cDNA supermix de acuerdo con el protocolo del fabricante. La qPCR se realizo utilizando sondas Taqman y Taqman Fast Advanced Master Mix de Life Technologies en una maquina de PCR en tiempo real LightCycler 480 II de Roche.

Experimentos con la L^nea Celular Humana: La solicitantes selecciono 8 secuencias de sgRNA previamente disponibles para el ensayo de celulas 293FT utilizando la construccion de activador pXRP057 dCas9-VP64 de la solicitante. Secuencias grna se clonaron por el metodo Golden Gate en el plasmido px362 que contiene el promotor U6 aguas arriba de una cadena principal de clonacion de sgRNA quimerico.

Celulas 293FT se cultivaron en medio D10 (relacion 100:10:1 de DMEM de alto contenido en glucosa con Glutamax y piruvato de sodio: suero bovino fetal: disolucion 100 x HEPES). Para la transfeccion, celulas 100K en 0,5 mL de medio de cultivo se sembraron en cada uno de los pocillos de una placa de 24 pocillos. Despues de 22 h de cultivo, cada uno de los pocillos de celulas 293FT se transfecto con 1 ug de ADN utilizando 5 uL de Lipofectamine siguiendo los pasos recomendados por el fabricante (Life Technologies). Para todas las muestras de dCas9-VP64 + sgRNA, se utilizaron 0,5 ug de plasmido dCas9-VP64 y 0,5 ug de plasmido de expresion sgRNA. Para las muestras control, incluyendo las analizadas para efectos de transcripcion no guiados, las masas de plasmido fueron reemplazadas por el plasmido que expresa GFP segun fuese necesario. 4 h despues de la transfeccion, el medio se reemplazo con 1 mL de medio de cultivo. 48 h despues de la transfeccion, el ARN fue purificado utilizando el kit de ARN Macherey Nagel Nucleospin 96. La transcripcion inversa se realizo con qScript cDNA supermix de acuerdo con el protocolo del fabricante. La qPCR se realizo utilizando sondas Taqman y Taqman Fast Advanced Master Mix de Life Technologies en una maquina de PCR en tiempo real LightCycler 480 II de Roche.

Resultados experimentales para Experimentos con la Lmea Celular de Raton: Tal como se muestra en la Fig. 20, 6 de los 7 sgRNAs fijados como objetivo al locus Neurog2 de raton fueron capaces de inducir la regulacion positiva de ARNm de Neurog2, medida por qPCR. Con estos resultados, la solicitante demostro la utilidad del sistema de activador Cas9 para la modulacion genica en un modelo celular de raton. Las secuencias sgRNA 7 se enumeran a continuacion:

saRNA

SECUENCIA

SGRNA0001

TGGTTCAGTGGCTGCGTGTC

sgRNA0002

TGTTTTCTTGGTGGTATATA

sgRNA0003

ATACGATGAAAAGAATAAGC

sgRNA0004

GGGGGAGAGGGACTAAAGAA

sgRNA0005

GGGCGGGGGAAGGGTAGGTG

sgRNA0006

ATTAGATAAAGGGGGGACGG

sgRNA0007

CGGCTTTAACTGGAGTGCCT

Resultados Experimentales para Experimentos de Lmea Celular Humana: Tal como se muestra en la Fig. 21, sgRNAs fijados como objetivo a varios genes humanos (ASCL1, MYOD1, VEGFa y NTF3) indujeron con exito la regulacion positiva del ARNm deseado utilizando la construccion pXRP057 dCas9-VP64 de la solicitante (Konermann et al., Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 22 de

agosto de 2013; 500(7463):472-6). La solicitante demostro que muestras transfectadas con la construccion dCas9- VP64, pero sin un sgRNA teman cambios significativos en el nivel de expresion de varios genes y se ha de realizar una caracterizacion adicional (Fig. 22). Los recuentos de PAM (-100 a +l0o pb de TSS) se indican a continuacion:

Gen

Nivel de Cambio Basal Recuentos de NGG + NAG

Neurog2

0,60 213

VEGFA

1,25 211

NTF3

0,94 203

ASCL1

4,19 235

MYOD1

0,90 204

Ejemplo 7: Estudios adicionales sobre datos sobre el modulador-activador y represor de Cas9

5 La solicitante llevo a cabo estudios para desarrollar adicionalmente el activador (pXRP57) y el represor (pXRP48) de dCas9 (Fig. 23). La solicitante clono los plasmidos pXRP57 y pXRP48 (Konermann et al, Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 22 de agosto de 2013; 500(7463):472-6). La secuencia de activador Cas9 se indica en la Fig. 24 y la secuencia de represor de Cas9 se indica en la Fig. 25. Se recogieron datos adicionales para el activador (Fig. 26), y el represor (Fig. 27). Una lista de los ARN de grna 10 utilizados en el experimento se indica a continuacion:

Gen

ARN grna

hSox2-1

GTGGCTGGCAGGCTGGCTCT

hSox2-2

GGCCTCCCCCGCGCGGCCGG

hSox2-3

GCCCCCTTTCATGCAAAACC

hSox2-4

GACAGCCCCCGTCACATGGA

hSox2-5

GGCAGGCGAGGAGGGGGAGG

hSox2-6

GGCGGGGCCTCCCGCGCCGC

hSox2-7

GCTGCCGGGTTTTGCATGAA

hSox2-8

GGGGCTGTCAGGGAATAAAT

hKlf4-1

GAGAGAACGAACGTGTCTGC

half4-2

GAGGGTCACTCGGCGGCTCC

half4-3

GCGCGCTCCACACAACTCAC

half4-4

GGGGCTGTGGCCGGGGCGGT

Gen

ARN gma

hKlf4-5

GGCGACCGCGACAGTGGTGG

half4-6

GCAAAAATAGACAATCAGCA

half4-7

GAAGGATCTCGGCCAATTTG

half4-8

GTGGGGGCCCAGAAGGTCCT

hNanog-1

GCCACGGCCTCCCAATTTAC

hNanog-2

GGAATATGGTTCAACAGGAA

hNanog-3

GCTGCAGAGTAACCCAGACT

hNanog-4

GCCTTGGTGAGACTGGTAGA

hNanog-5

GATTAACTGAGAATTCACAA

hNanog-6

GTGTGCCCGCCAGGAGGGGT

hNanog-7

GTTGCCTGCATAATAACATG

hNanog-8

GGAGGAAAAAATTTAAGAGG

hOct4-1

GGACCGGGATTGTCCAGCCA

hOct4-2

GAGTGATAAGACACCCGCTT

hOct4-3

GCAGCTGGCCATTGTGCTTA

hOct4-4

GGAGAGGGGGTCAAGCACCT

hOct4-5

GCGGGTTGGGAGTTGAAAGT

hOct4-6

GCTCCAGCCTCCTAAGTGGC

hOct4-7

GGAGGTGGGGGGAGAAACTG

hOct4-8

GGTGAAATGAGGGCTTGCGA

Ejemplo 8: Sistema activador de CRISPR/Cas9 por la inducibilidad con luz del sistema LITE

La solicitante combino la orientacion de ARN del sistema activador de CRISP/Cas9 con la inducibilidad de la luz del sistema LITE. Un sistema de expresion inducible basado en CRISPR/ Cas9 puede hacer que la pantalla inducible de 5 muchos genes fije objetivos mucho mas rapido y mas facil que lo que antes era posible, al tiempo que tambien

proporciona la oportunidad de multiplexar facilmente objetivos diferentes mediante la combinacion de sgRNAs fijados como objetivo a dispares loci geneticos,

Materiales y metodos: El sistema CasLlTE consiste en 3 componentes: una protema de fusion dCas9-CIB1, la construccion CRY2PHR-VP64 y una secuencia gma sgRNA. La solicitante sintetizo 3 versiones diferentes de dCas9- 5 CIB1: (1) dCas9-GS-NLS-CIB1 que comprendfa dCas9 doble mutante (D10A H840A) de su plasmido pXRP057, un enlazador de glicina serina, senal de ubicacion nuclear de SV40, y CIB1 de LITE1.0. (2) dCas9-GS-NLS-NLS-CIB1 que comprende dCas9 doble mutante, el enlazador de glicina serina, 2 secuencias de SV40 NLS, y CIB1 de LITE1.0. (3) dCas9-GS-CIB1 (mNLS d318-334) que comprende la dCas9 doble mutante, enlazador de glicina serina del LITE2.0 y CIB1 de LITE2.0. Los vectores utilizados en la practica de la invencion se ilustran en las Figs. 28, 29, 10 30.

La solicitante selecciono secuencias de sgRNA fijadas como objetivo a ASCL1 y MYOD1, previamente validadas con un activador constitutivo dCas9-VP64, para someter a ensayo los sistemas de CasLITE en celulas humanas. Las secuencias gma se clonaron por el metodo de Golden Gate en el plasmido px362 que contiene el promotor U6 aguas arriba de la cadena principal de clonacion de un sgRNA quimerico.

15 Celulas 293FT se cultivaron en medio D10 sin HEPES (relacion 10:1 de DMEM de alto contenido en glucosa con Glutamax y piruvato de sodio: suero bovino fetal). Para la transfeccion, celulas 100K en 0,5 mL de medio de cultivo se sembraron en cada uno de los pocillos de una placa de 24 pocillos. Despues de 22 h de cultivo, cada uno de los pocillos de celulas 293FT se transfecto con 1,5 ug de ADN utilizando 7,5 uL de Lipofectamine siguiendo los pasos recomendados por el fabricante (Life Technologies). Para todas las muestras de CasLITE + sgRNA, se utilizaron 0,5 20 ug de plasmido dCas9-CIB1, 0,5 ug de plasmido CRY2PHR-VP64 (LITE1.0 o LITE2.0 para emparejarse con CIB1) y 0,5 ug de plasmido de expresion sgRNA. Los experimentos con 4 sgRNAs utilizaron masas iguales de cada uno de los 4 sgRNAs, totalizando 0,5 ug. Para las muestras control, las masas de plasmido fueron reemplazadas por el plasmido que expresa GFP segun fuese necesario. 4 h despues de la transfeccion, el medio se reemplazo con 1 mL de medio de cultivo. 48 h despues de la transfeccion, la excitacion se inicio en muestras estimuladas con luz, 25 utilizando luz azul de 5 mW/cm2 475 nm. 12 h despues de la estimulacion, se recogieron todas las muestras, incluyendo todos los controles para el ARN, utilizando el kit de ARN Macherey Nagel Nucleospin 96. La transcripcion inversa se realizo con qScript cDNA supermix de acuerdo con el protocolo del fabricante. La qPCR se realizo utilizando sondas Taqman y Taqman Fast Advanced Master Mix de Life Technologies en una maquina de PCR en tiempo real LightCycler 480 II de Roche.

30 Resultados: Las construcciones CasLITE exhibfan diferentes niveles de activacion de la transcripcion inducible por la luz (Fig. 31). Aunque la funcionalidad inicial del sistema parece ser modesto, llamando a la experimentacion repetida, estos resultados sugieren la posibilidad de la activacion transcripcional guiada por ARN e inducible por la luz.

Ejemplo 9: Modelo de raton Cas9 y validacion de la tfnea de celulas madre embrionarias de raton

35 La solicitante valido una lmea de celulas madre embrionarias de raton que se modifico para incluir la casete Cas9 Cre-dependiente (pCM2) en el locus Rosa26 (Fig. 32) y obtuvo resultados de genotipado para los fundadores transmitidos por la lmea germinal (Fig, 33).

Para validar que la casete Cas9 era funcional, la lmea mESC modificado se electropolarizo con las construcciones designadas en la Fig. 32. La lmea mESC fue utilizada para la inyeccion de blastocistos en receptores C57BL/6J 40 (realizado por la DCM en MIT). Se produjeron seis progenies quimericas y luego se retrocruzaron al fondo C57BL/6J. La transmision de la lmea germinal se identifico con exito sobre la base del color de la capa agouti. Dos de los seis quimericos produjeron cnas de transmision de la lmea germinal. ADN genomico fue extrafdo de tejido de los ratones Cas9 y se realizo una PCR de genotipado de Rosa 26 de brazo corto (Fig. 33). Una banda de 1,5 kb es el tamano correcto para los transgenes insertados correctamente en el locus Rosa26. Estos resultados demuestran 45 la transmision con exito de la lmea germinal del transgen Cas9 Cre-dependiente en el locus Rosa26.

El beneficio de la lmea de activacion de Cas9 Rosa 26 Cre-dependiente es que puede ser cruzada a cualquier lmea impulsora de Cre para permitir la expresion de Cas9. Ademas de ello, Cas9 puede ser activada por el suministro de Cre por el vector viral u otros medios de suministro. Esto permite la expresion del tipo de celula, tejido y la especificidad de desarrollo de Cas9. Un beneficio adicional es que el raton se puede utilizar para el aislamiento de 50 celulas primarias. Esto sena particularmente util en el caso de un tipo de celula primaria que no es susceptible al suministro de acidos nucleicos o que no se puede cultivar el tiempo suficiente para la utilizacion de vectores virales.

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Ejemplo 10: Plataforma basada en CRISPR fijada como objetivo de ARN para la modificacion por ingenieria genetica del epigenoma de mam^feros

La solicitante desarrolla una plataforma basada en CRISPR fijada como objetivo de ARN para la modificacion por ingeniena genetica del epigenoma de mairnferos Dos sistemas inmunes mediados por CRISPR fijados como objetivo de ARN, los loci CRISPR/Cmr, se caracterizaron recientemente de Pyrococcus furiosus y Sulfolobus solfataricus. Sobre la base de homologfa de protemas, estos loci CRISPR/Cmr son parte de una familia mucho mas grande que existe dentro de una diversidad de genomas bacterianos y arqueales. Al igual que en el ARNi y Cas9 el mecanismo de interferencia de un locus CRISPR/Cmr se basa en la homologfa de un corto tramo de nucleotidos y, por lo tanto, es susceptible a rastreo de todo el genoma. Por otra parte, la region de homologfa con el sitio diana se incrementa significativamente, haciendo mucho mayor el potencial para la especificidad.

La solicitante realizo un analisis metagenomico de la familia CRISPR/Cmr, el desarrollo de un sistema de ensayo in vitro para identificar loci funcionales, y la caracterizacion de la especificidad y la capacidad de multiplexar en celulas de marnffero. Una plataforma de ingeniena genetica en el genoma basada en CRISPR fijada como objetivo ARN (Fig. 34) puede reemplazar a muchas utilidades de ARNi y proporcionar un sistema para perturbar la biologfa del ARN que nunca antes habfa sido posible.

Trabajo preliminar con el locus CRISPR/Cmr de P. furiosus: Basado en la extensa base de conocimientos sobre el locus CRISPR/Cmr de P. furiosus, la solicitante investigo la viabilidad de expresar los genes de Cmr dentro de celulas de mamnferos. ADN genomico de P. furiosus se obtuvo de la ATCC y se utilizo como un molde de la PCR para amplificar los seis genes Cmr (Cmr 1-6). La solicitante tambien amplifico otra protema dentro del locus, Cas6. Cas6 esta involucrado en el procesamiento de crRNA en su forma madura. Aunque solo son esenciales cinco genes Cmr (Cmr1,2,3,4,6), la solicitante considero que Cas6 puede ayudar en la solucion de problemas si los cinco genes Cmr pasan a ser insuficientes en el contexto de los mamnferos.

Cmr1-6 y Cas6 se clonaron en plasmidos de expresion de mamnferos y se transfectaron en celulas HEK 293FT. Para facilitar la visualizacion, el plasmido de clonacion contema un marcador HA y una secuencia P2A-EGFP. La secuencia P2A provoca un salto ribosomal, dando como resultado dos protemas maduras del mismo transcrito. 72 horas post-transfeccion se observo fluorescencia EGFP para cada uno de los plasmidos de expresion de Cmr (Fig. 35 A), lo que sugiere que Cmr1-6 y Cas6 se expresan con exito. Para validar que las protemas son estables en el entorno de celulas de mamnferos y que tambien son de tamano correcto, la solicitante llevo a cabo una transferencia Western (Fig. 35B). Dentro de cada una de las pistas existe una banda del tamano esperado, lo que sugiere que cada una de las protemas se expresa y es estable dentro de las celulas de marnfferos. La segunda banda mas grande que aparece dentro de cada una de las pistas puede ser el resultado de la insuficiencia de la secuencia de P2A para provocar un salto ribosomal y, por lo tanto, se crea una protema de fusion y no dos productos de protema individuales. La banda situada por encima del tamano predicho es ~30 kDa mas grande que el tamano esperado, que corresponde a P2A-EGFP. La solicitante confirmara esto por inmunotincion el mismo borron de transferencia utilizando un anticuerpo anti-EGFP y debena ver dos bandas por pista, una que es el tamano de P2A-EGFP y otra banda mas grande que es el tamano de Cmr-P2A-EGFP. Los resultados de la transferencia Western tambien muestran una expresion variable para las siete protemas, mientras que, Cmr1, Cmr3 y Cmr6 tienen una baja expresion, mientras Cmr2, Cmr4 y Cmr5 tienen una alta expresion. La solicitante ha demostrado que de hecho es posible expresar protemas Cmr de P. furiosus dentro de celulas de mamfferos.

En este ejemplo, la solicitante identifica loci CRISPR/Cmr fijados como objetivo a ARN putativos y valida la expresion de protemas individuales y de correspondientes crRNAs en celulas de mamnfero. Utilizando un enfoque basado en la homologfa, la solicitante identifica loci CRISPR/Cmr fijados como objetivo a ARN putativos a traves de una diversidad de genomas de bacterias y arqueas. Protemas Cmr y crRNAs de cada uno de los locus se identifican y validan a traves de la clonacion, la transfeccion en celulas de mamfferos y la deteccion por transferencia western y transferencia Northern, respectivamente. La metodologfa es la siguiente:

1. Identificar loci CRISPR fijados como objetivo a ARN: La identificacion de loci CRISPR fijados como objetivo a ARN del trabajo publicado es el primer paso en la comprension de los componentes esenciales de un sistema CRISPR/Cmr de Tipo III-B funcional. Dos loci fijados como objetivo a ARN a partir de dos organismos diferentes se han publicado y se han caracterizado en diferentes grados.

2. Identificar loci CRISPR fijados como objetivo a ARN putativos a traves de una diversidad de especies de bacterias y arqueas: Un extenso trabajo que se ha hecho hacia la clasificacion de todos los conocidos loci CRISPR en grupos filogeneticos y, por lo tanto, se ha traducido en las bases de datos de alta confianza de protemas orologas. Utilizando las bases de datos mas extensas y manualmente conservadas la solicitante identifica loci CRISPR/Cmr putativos basados en la presencia de multiples ortologos de protemas. Se recogera un subconjunto que abarca la

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diversidad de loci CRISPR/Cmr para la caracterizacion molecular adicional en un amplio intento de probar la diversidad natural.

3. Identificar protemas Cmr y crRNAs dentro de los loci CRISPR/Cmr: loci CRISPR/Cmr estan bien estudiados y muchos genomas de bacterias y arqueas han sido ampliamente comentados, por lo que la identificacion de las protemas Cmr debena ser sencilla en estos casos. Sin embargo, en ausencia de una buena anotacion, el problema sera mas complicado. Por esta razon, la solicitante preferentemente selecciona loci CRISPR/CMR de organismos en los que estan disponibles buenas anotaciones. Si estas estrategias no proporcionan una cobertura completa de la diversidad de loci CRISPR/Cmr, la solicitante utiliza un enfoque basado en la homologfa combinado con algoritmos de prediccion ORF para identificar las protemas Cmr. Matrices de repeticion CRISPR tienen estructuras predecibles y se encuentran cerca de las protemas Cmr asociadas a CRISPR. La matriz de CRISPR consiste en una secuencia lfder que impulsa la expresion de toda la matriz de repeticiones y espaciadores, creando un transcrito primario que es ampliamente procesado para hacer ARNs de CRISPR maduros (crRNA)s. Herramientas computacionales existentes (CRISPRFinder) permitiran la identificacion de las matrices de repeticion. La prediccion de crRNA maduro de cada locus puede no ser tan sencilla y puede requerir la optimizacion. Hay caractensticas generales conocidas acerca de los crRNAs maduros de loci CRISPR/Cmr de Tipo III-B que la solicitante utiliza para predecir nuevos crRNAs. Todos los crRNAs maduros de loci CRISPR de Tipo III-B tienen un 5' mango que es parte de la secuencia de repeticion, seguido de un espaciador. Las funciones 5' mango en el reconocimiento del crRNA por el complejo Cmr y el espaciador grna el complejo Cmr al ARN diana a traves de apareamiento de bases de Watson-Crick. La solicitante disena un panel de posibles arquitecturas de crRNA que son de diferente longitud total y que tienen 5' mangos de diferente longitud, ya que es difmil predecir las caractensticas unicas espedficas de los nuevos crRNAs a priori.

4. Clonar protemas Cmr y crRNAs en vectores de expresion de marnfferos: protemas Cmr se clonan por separado en dos vectores de expresion de mamfferos diferentes (Fig. 36). El primer vector (V1.0) expresa protemas Cmr individuales utilizando un promotor CMV, la secuencia de cola de poliA de la hormona de crecimiento bovina, y un elemento WPRE para maximizar la expresion de protemas. El segundo vector (V1.2) utiliza los mismos elementos que en V1.0, pero incluira un marcador HA en el extremo N y una secuencia P2A-EGFP en el extremo C. El marcador de HA permite la deteccion y cuantificacion de protemas y P2A-EGFP permite un metodo visual sencillo para detectar la expresion en celulas de marnffero. La solicitante hace ambas versiones, porque el impacto de la adicion de un marcador HA y un peptido P2A en protemas Cmr y la forma en que influye sobre la formacion correcta del complejo Cmr es desconocido. crRNAs se expresan utilizando el promotor U6 humano, que ha sido utilizado con exito para expresar los ARN no codificadores utilizados para RNAi y CRISPR/Cas9 que fija como objetivo ADN.

5. Validar la protema Cmr y la expresion crRNA: la expresion de la protema Cmr se valida transfectando plasmidos V1.2 en celulas HEK 293FT y observando la expresion de EGFP. A fin de validar adicionalmente que la protema se expresa y el tamano correcto la solicitante prepara lisados de protemas a partir de celulas transfectadas y realiza una transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-marcador HA. Para validar la expresion de crRNA, la solicitante purifican pequenos ARN de celulas transfectadas y sonda, mediante transferencia Northern.

La solicitante demuestran la escision de ARN en un lisado de celulas de mamffero in vitro utilizando crRNAs codificados de forma natural. La solicitante desarrolla un simple lisado de celulas de mairnferos en un ensayo in vitro para validar rapidamente loci CRISPR/Cmr putativos. Los lisados celulares de celulas de marnffero transfectadas con protemas Cmr se preparan y se incuban con crRNAs codificados de forma natural y una diana de ARN correspondiente. Loci CRISPR/Cmr en funcionamiento se identifican en base a los productos de escision del tamano correcto utilizando electroforesis en gel. La metodologfa es la siguiente:

1. Expresion de protemas Cmr en celulas de mamfferos y preparacion de lisados de celulas: la solicitante transfecta plasmidos de expresion individuales para todas las protemas Cmr de una especie en celulas HEK 293FT y espera 72 horas para que se produzca la expresion solida de la protema. Las celulas se lisan, homogeneizaron y se dividen en partes almuotas para uso futuro. Aunque no todas las celulas se transfectan con cada uno de los plasmidos Cmr, una vez que se preparan los lisados, todas las protemas Cmr estaran en la misma mezcla. Este es un beneficio sobre el modelo de celulas vivas, en donde la co-transfeccion de siete componentes puede ser un reto. Por otra parte, esto dara a la solicitante un control absoluto sobre la concentracion final del crRNA y ARN diana en la reaccion.

2. Preparacion de crRNAs: para cada locus CRISPR/Cmr la solicitante hace crRNAs maduros que contienen el espaciador endogeno. Espedficamente, la solicitante utiliza la secuencia de espaciador del crRNA mas proximo al lfder. Como se discutio previamente, la solicitante experimenta con diferentes arquitecturas de crRNA con diferentes extremos 5'. Un metodo directo para la creacion de crRNA maduro de una secuencia definida es la transcripcion in vitro utilizando kits de transcripcion T7 comercialmente disponibles.

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3. Transcribir in vitro ARN que alberga secuencias diana de crRNA: plasmidos de expresion de T7 se clonan para albergar unicamente secuencias fijadas como objetivo por el espaciador endogeno de cada uno de los locus CRISPR/Cmr. Esta diana se clonara en el medio de un trozo de ARN de ~ 1 kb, de modo que los productos de escision resultantes seran facilmente visualizados en un gel de agarosa.

4. Realizar y optimizar el experimento de escision in vitro del lisado de celulas de mairnfero: una vez que todos los componentes estan preparados, la solicitante combina e incuba los lisados de celulas, crRNAs individuales y ARN diana, seguido de la visualizacion en un gel de agarosa. Sistemas de CRISPR funcionales se identifican sobre la base de productos de escision del tamano correcto. Se tienen en cuenta determinados parametros. Los parametros para la optimizacion son la identidad y la concentracion de protema Cmr, la arquitectura y la concentracion de crRNA. Parametros menos significativos para la optimizacion son el contenido y la concentracion de tampon, la estabilidad de crRNA y ARN, tiempo de reaccion y la visualizacion de ARN.

La solicitante demuestra y caracteriza el desmontaje de genes de mai^eras endogenos utilizando nuevos crRNAs. Los crRNAs estan modificados geneticamente para fijar como objetivo los genes de marnfferos endogenos y cotransfectados con plasmidos de expresion de Cmr en celulas de mamnfero. El desmontaje de ARNm y protemas se cuantifico mediante PCR cuantitativa y transferencia Western. La capacidad de multiplexacion se investiga mediante la fijacion como objetivo de multiples genes al mismo tiempo. La especificidad se caracteriza y se compara con ARNi utilizando ARN-seq. La metodologfa es la siguiente:

1. crRNAs diana de genes de mamfferos endogenos: Con loci CRISPR/Cmr fijados como objetivo a ARN funcionalmente validados, la solicitante disena nuevos crRNAs que fijan como objetivo tres genes que son dianas de ARNi terapeuticamente validadas, a saber, P53, VEGF, y CTNNB1 (Beta-catenina). La solicitante recoge ocho sitios diana dentro de cada uno de los genes para ayudar a resolver cualquier limitacion espedfica para la secuencia de la tecnologfa. Para diferentes loci CRISPR/Cmr la vista exacta de la diana puede variar en unas pocas bases debido a las caractensticas unicas requeridas de cada uno de los crRNA, pero la solicitante fija como objetivo una region constante para ayudar en las comparaciones.

2. Cuantificar y caracterizar el desmontaje de ARNm: la solicitante somete a ensayo los sistemas de CRISPR/Cmr en celulas HEK 293FT transfectando plasmidos de expresion de mamffero para componentes proteicos Cmr y crRNAs individuales. ARNm escindidos se degradan rapidamente en la celula, mientras que los fragmentos de ARN resultantes no tienen tanto un casquete 5' y una cola poliA. La solicitante cuantifica el grado de desmontaje del ARNm mediante la realizacion de una PCR cuantitativa. Cuando se observa un desmontaje de ARNm la solicitante realiza una transferencia Western para la protema fijada como objetivo.

Ademas de simples experimentos de transfeccion de crRNA, la solicitante anade multiples crRNAs que fijan como objetivo los mismos genes. Se observo previamente que otros moduladores de la transcripcion actuan de forma sinergica cuando se fijan como objetivo a multiples sitios dentro de la misma region. Esto tambien es una estrategia util para identificar sistemas de CRlSPR/CMR suboptimos que no funcionan cuando se utilizan crRNAs individuales, pero que pueden funcionar en general y solo necesitan ser optimizados por una razon u otra. La solicitante tambien suma multiples crRNAs que fijan como objetivo diferentes genes en la misma condicion para seguir considerando la multiplexacion en este sistema. Esto tiene amplias implicaciones para la modificacion por ingeniena genetica de la via y rastreos a escala del genoma.

3. Caracterizar especificidad por RNA-seq: una motivacion principal de este trabajo es el desarrollo de una plataforma de fijar como objetivo ARN con mayor especificidad que el ARNi. Inherentemente hay una mayor oportunidad para que el sistema CRISPR/Cmr tenga una mayor especificidad debido a la complementariedad extendida al sitio diana. Sin embargo, cada par de bases dentro de la grna puede no ser necesario o puede haber cierta tolerancia a apareamientos erroneos. Para entender estas caractensticas del sistema CRISPR/Cmr la solicitante utiliza una lmea celular derivada de HEK 293T que expresa una sola copia de EGFP. La solicitante fija como objetivo EGFP para el desmontaje, utilizando 24 crRNAs unicos. El uso de una lmea celular HEK/GFP hace que el analisis fuera del objetivo sea sencillo, puesto que EGFP se puede considerar una protema inocua que no tiene influencia alguna sobre los procesos celulares, por lo que es probable que cualquier transcrito alterado son efectos fuera del objetivo. Los resultados se comparan con un siRNA que fija como objetivo EGFP con efectos fuera de objetivo conocidos. Debido a la capacidad de apareamiento de bases extendida del complejo de CRISPR/Cmr, la solicitante espera que se reduzcan las dianas fuera de objetivo. La tolerancia a apareamientos erroneos tambien se explora y esto sera importante para el desarrollo futuro de la plataforma de CRISPR/Cmr.

Teniendo en cuenta que un sistema CRISPR/Cmr que fija como objetivo ARN funciona en celulas de mamffero, la solicitante persiguen inicialmente dos aplicaciones: rastreos a escala del genoma y una plataforma de union a ARN catalfticamente inactiva. Un rastreo de RNAi a escala del genoma es un poderoso metodo para sondear la biologia.

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Sin embargo, los efectos fuera de objetivo limitan seriamente el enfoque. Una plataforma con mayor especificidad podna reemplazar el rastreo genomico de RNAi o proporcionar un enfoque ortogonal que ayudana en la identificacion de los verdaderos positivos. Una plataforma de CRISPR/Cmr que fija como objetivo ARN es susceptible de rastreos genomicos, porque cada uno de los objetivos se programa por solo unos pocos nucleotidos, con lo cual se podna sintetizar y suministrar facilmente un banco complejo.

Una plataforma de union al ARN catalfticamente inactiva es una tecnologfa que permite el desarrollo de complejos de efectores que ayudan en el sondeo de ARN. La solicitante identifica los componentes con actividad catalttica del complejo Cmr y muta los residuos espedficos responsables. Esto se ha hecho con exito en un cierto numero de casos, p. ej., esto se hizo para CRISPR/Cas9 para crear un nicasa y un modulador transcripcional. Utilizando esta plataforma la solicitante desarrolla una tecnologfa para detectar y representar en imagenes transcritos de ARN dentro de la celula. Esto tiene aplicaciones para la comprension de la influencia de la ubicacion del ARN en los procesos celulares y la deteccion in vivo y la cuantificacion de ARN. Alternativamente, la solicitante anade moleculas efectoras en una plataforma de union al ARN hacia el sondeo y la comprension de las areas de la biologia del ARN que no son bien entendidas, a saber, la edicion de ARN y la epigenetica.

Aunque se han mostrado y descrito en esta memoria realizaciones preferidas de la presente invencion, resultara obvio para los expertos en la tecnica de modo que tales realizaciones se proporcionan a modo de ejemplo solamente. Numerosas variaciones, cambios y sustituciones se les ocurriran a los expertos en la tecnica sin apartarse de la invencion. Debe entenderse que diversas alternativas a las realizaciones de la invencion descrita en esta memoria se pueden emplear en la practica de la invencion.

Referencias:

Barrangou, R., Fremaux, C., Deveau, H., Richards, M., Boyaval, P., Moineau, S., Horvath, P. (2007). CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science (New York, N.Y.), 315(5819), 1709-12. doi:10.1126/science.1138140

Birmingham, A., Anderson, E. M., Reynolds, A., Ilsley-Tyree, D., Leake, D., Fedorov, Y., Khvorova, A. (2006). 3' UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets. Nature methods, 3(3), 199- 204.doi:10.1038/nmeth854

Brouns, S. J. J., Jore, M. M., Lundgren, M., Westra, E. R., Slijkhuis, R. J. H., Snijders, A. P. L., van der Oost, J. (2008). Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science (New York, N.Y.), 321(5891), 960-4. doi:10.1126/science.1159689

Burnett, J. C., Rossi, J. J., & Tiemann, K. (2011).Current progress of siRNA/shRNA therapeutics in clinical trials.Biotechnology journal, 6(9), 1130-46. doi:10.1002/biot.201100054

Cheong, C.-G., y Hall, T. M. T. (2006). Engineering RNA sequence specificity ofPumilio repeats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103(37), 13635-9. doi:10.1073/pnas.0606294103

Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Zhang, F. (2013). Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science (New York, N.Y.). doi: 10.1126/science.1231143

Elbashir, S. M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K., y Tuschl, T. (2001). Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature, 411(6836), 494-8.doi:10.1038/35078107

Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., y Mello, C. C. (1998).Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Nature, 391(6669), 806-11.doi:10.1038/35888

Hale, C., Kleppe, K., Terns, R. M., y Terns, M. P. (2008). Prokaryotic silencing (psi)RNAs in Pyrococcus furiosus. RNA (New York, N.Y.), 14(12), 2572-9. doi:10.1261/rna.1246808

Hale, C. R., Majumdar, S., Elmore, J., Pfister, N., Compton, M., Olson, S.Terns, M. P. (2012).Essential features and rational design of CRISPR RNAs that function with the Cas RAMP module complex to cleave RNAs.Molecular cell, 45(3), 292-302.doi: 10.1016/j.molcel.2011.10.023

5

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20

25

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40

Hale, C. R., Zhao, P., Olson, S., Duff, M. O., Graveley, B. R., Wells, L., Terns, M. P. (2009). RNA-guided RNA cleavage by a CRISPR RNA-Cas protein complex. Cell, 139(5), 945-956.

Hou, Z., Zhang, Y., Propson, N. E., Howden, S. E., Chu, L.-F., Sontheimer, E. J., y Thomson, J. A. (2013). Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 110(39), 15644-9. doi:10.1073/pnas.1313587110

Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M., y Nakata, A. (1987). Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of bacteriology, 169(12), 5429-33.

Jackson, A. L., Bartz, S. R., Schelter, J., Kobayashi, S. V, Burchard, J., Mao, M., Linsley, P. S. (2003). Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nature biotechnology, 21(6), 635-7.doi:10.1038/nbt831

Jackson, A. L., Burchard, J., Leake, D., Reynolds, A., Schelter, J., Guo, J., Linsley, P. S. (2006). Position-specific chemical modification of siRNAs reduces "off-target" transcript silencing. RNA (New York, N.Y.), 12(7), 1197-205. doi:10.1261/rna.30706

Jansen, R., Embden, J. D. A. van, Gaastra, W., & Schouls, L. M. (2002). Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Molecular microbiology, 43(6), 1565-75.

Konermann, S., Brigham, M. D., Trevino, A. E., Hsu, P. D., Heidenreich, M., Cong, L., Zhang, F. (2013). Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states.Nature, 500(7463), 472-

6.doi:10.1038/nature12466

Mackay, J. P., Font, J., y Segal, D. J. (2011).The prospects for designer single-stranded RNA-binding proteins.Nature structural & molecular biology, 18(3), 256-61. doi:10.1038/nsmb.2005

Makarova, K. S., Haft, D. H., Barrangou, R., Brouns, S. J. J., Charpentier, E., Horvath, P., Koonin, E. V. (2011). Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nature reviews. Microbiology, 9(6), 467-

77.doi:10.1038/nrmicro2577

Mali, P., Yang, L., Esvelt, K. M., Aach, J., Guell, M., DiCarlo, J. E., Church, G. M. (2013). RNA-guided human genome engineering via Cas9.Science (New York, N.Y.), 339(6121), 823-6. doi:10.1126/science.1232033

Marraffini, L. A., y Sontheimer, E. J. (2010). CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nature reviews. Genetics, 11(3), 181-90.doi:10.1038/nrg2749

Mojica, F. J., Diez-Villasenor, C., Soria, E., y Juez, G. (2000).Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria.Molecular microbiology, 36(1), 244-6.

Mojica, F. J. M., Diez-Villasenor, C., Garcia-Martinez, J., y Soria, E. (2005). Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. Journal of molecular evolution, 60(2), 174- 82.doi:10.1007/s00239-004-0046-3

Peabody, D. S. (1993).The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein.The EMBO journal, 12(2), 595- 600.Qi, L. S., Larson, M. H., Gilbert, L. A., Doudna, J. A., Weissman, J. S., Arkin, A. P., y Lim, W. A. (2013). Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell, 152(5), 1173-83. doi:10.1016/j.cell.2013.02.022

Sapranauskas, R., Gasiunas, G., Fremaux, C., Barrangou, R., Horvath, P., y Siksnys, V. (2011). The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli. Nucleic acids research, 39(21), 9275-82. doi:10.1093/nar/gkr606

SenGupta, D. J., Zhang, B., Kraemer, B., Pochart, P., Fields, S., y Wickens, M. (1996).A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences, 93(16), 8496-8501. doi:10.1073/pnas.93.16.8496

Valencia-Burton, M., McCullough, R. M., Cantor, C. R., y Broude, N. E. (2007).RNA visualization in live bacterial cells using fluorescent protein complementation.Nature methods, 4(5), 421-7.doi:10.1038/nmeth1023

Wang, X., McLachlan, J., Zamore, P. D., y Hall, T. M. T. (2002).Modular Recognition of RNA by a Human Pumilio- Homology Domain. Cell, 110(4), 501-512.

5 Zhang, J., Rouillon, C., Kerou, M., Reeks, J., Brugger, K., Graham, S., White, M. F. (2012). Structure and mechanism of the CMR complex for CRISPR-mediated antiviral immunity.Molecular cell, 45(3), 303-13.

doi:10.1016/j.molcel.2011.12.013.

Claims (49)

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   1. Una composicion que se produce de forma no natural o que se produce mediante ingeniena genetica, que comprende:

   un sistema de suministro operativamente configurado para suministrar componentes de un complejo CRISPR-Cas o secuencias de polinucleotidos que comprenden o codifican dichos componentes en una celula eucariota, en donde dicho complejo CRlSPR-Cas es operativo en la celula eucariota;

   I. una o mas secuencias de polinucleotidos de complejo CRISPR-Cas que comprenden o codifican la expresion en la celula eucariota:

   (a) una secuencia grna capaz de hibridarse a una secuencia diana en una celula eucariota,

   (b) una secuencia de emparejamiento tracr, y

   (c) una secuencia tracr, y

   II. una enzima CRISPR que comprende uno o mas dominios funcionales heterologos o un polinucleotido que codifica una enzima de CRISPR que comprende uno o mas dominios funcionales heterologos para la expresion en la celula eucariota;

   en donde

   la secuencia de emparejamiento tracr se hibrida a la secuencia tracr,

   la secuencia grna dirige la union espedfica para la secuencia de un complejo de CRISPR a la secuencia

   diana,

   el complejo de CRISPR comprende la enzima de CRISPR formando complejo con (1) la secuencia grna que se hibrida a la secuencia diana, y (2) la secuencia de emparejamiento tracr que se hibrida con la secuencia tracr,

   la enzima CRISPR comprende una o mas mutaciones, de manera que la enzima tiene actividad de nucleasa alterada en comparacion con la enzima de tipo salvaje,

   en donde los uno o mas dominios funcionales heterologos comprende una o mas Senales de Localizacion Nuclear NLS(s).
2. 2. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el sistema de suministro comprende un sistema de vector que comprende uno o mas vectores, y en donde el componente (I) comprende un primer elemento regulador enlazado operativamente a una secuencia de polinucleotidos que comprende la secuencia grna, la secuencia de emparejamiento tracr y la secuencia tracr, y en donde el componente (II) comprende un segundo elemento regulador enlazado operativamente a una secuencia de polinucleotidos que codifica la enzima de CRISPR.
3. 3. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el sistema de suministro comprende un sistema de vector que comprende uno o mas vectores, y en donde el componente (I) comprende un primer elemento regulador enlazado operativamente a la secuencia grna y la secuencia de emparejamiento tracr, y un tercer elemento regulador enlazado operativamente a la secuencia tracr, y en donde el componente (II) comprende un segundo elemento regulador enlazado operativamente a una secuencia de polinucleotidos que codifica la enzima de CRISPR.
4. 4. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, en donde los componentes I y II estan ubicados en el mismo o en diferentes vectores del sistema.
5. 5. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 4, en donde los componentes I y II estan ubicados en el mismo vector.
6. 6. Una composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es una composicion multiplexada que comprende multiples secuencias grna capaces de hibridarse a multiples secuencias diana.
7. 7. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en donde el uno o mas vectores comprenden uno o mas vectores virales.
8. 8. Una composicion de acuerdo con la reivindicacion 7, en donde el uno o mas vectores virales comprenden uno o mas vectores de retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus adeno-asociados o virus herpes simplex.
9. 9. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el sistema de suministro comprende un sistema de levadura, un sistema de lipofeccion, un sistema de microinyeccion, un sistema biolfstico, virosomas, liposomas, inmunoliposomas, policationes, conjugados de lfpido:acido nucleico o viriones artificiales.
10. 10. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la enzima de CRISPR comprende una o mas mutaciones en dos o mas dominios cataltticamente activos.

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11. 11. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la enzima de CRISPR tiene una actividad nucleasa reducida o suprimida en comparacion con la enzima de tipo salvaje.
12. 12. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la una o mas mutaciones comprenden una mutacion en D10 SpCas9, H840 SpCas9, N854 SpCas9 o N863 SpCas9, o residuos correspondientes de otras enzimas de CRISPR.
13. 13. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 12, en donde la una o mas mutaciones comprenden D10A, H840A, N854A o N863A.
14. 14. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13, en donde la una o mas mutaciones comprenden dos mutaciones.
15. 15. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 14, en donde la mutacion comprende D10A SpCas9 y H840A SpCas9, o residuos correspondientes de otras enzimas de CRISPR.
16. 16. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la enzima CRISPR es una protema de union a ADN que no dirige la escision de cualquier cadena en la ubicacion de la secuencia diana.
17. 17. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la una o mas mutaciones es en un dominio catalfticamente activo de la enzima de CRISPR que comprende RuvCI, RuvCII o RuvCIII.
18. 18. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la enzima CRISPR comprende dos o mas dominios funcionales heterologos.
19. 19. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende al menos dos o mas NLSs.
20. 20. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dichas al menos una o mas o al menos dos o mas secuencias de localizacion nuclear se encuentran en o proximas al extremo amino de la enzima y/o en o proximas al extremo carboxi de la enzima.
21. 21. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde un dominio funcional comprende un dominio de activacion transcripcional.
22. 22. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde un dominio funcional comprende VP64.
23. 23. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en donde un dominio funcional es un dominio represor transcripcional.
24. 24. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 23, en donde el dominio funcional comprende un dominio KRAB o un dominio SID.
25. 25. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la secuencia que codifica la enzima codifica dos o mas dominios funcionales heterologos.
26. 26. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la secuencia que codifica la enzima codifica uno o mas dominios funcionales heterologos fusionados a la enzima CRISPR.
27. 27. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la secuencia que codifica la enzima comprende una secuencia de enlazador entre cualquiera de dos dominios.
28. 28. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde uno o mas dominios funcionales tienen una o mas de las siguientes actividades: actividad metilasa, actividad desmetilasa, actividad de activacion de la transcripcion, actividad de represion de la transcripcion, actividad del factor de liberacion de la transcripcion, actividad de modificacion de histonas, actividad de escision del ARN y actividad de union a acido nucleico.

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29. 29. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde un dominio funcional se une a ADN.
30. 30. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde un dominio funcional afecta a la transcripcion del acido nucleico diana.
31. 31. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la celula eucariota comprende una celula de mairnfero.
32. 32. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 31, en donde la celula de mai^ero comprende una celula humana.
33. 33. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la enzima CRISPR esta optimizada en codones para la expresion en una celula eucariotica.
34. 34. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la enzima CRISPR es una enzima CRISPR Cas9 de tipo II.
35. 35. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la enzima Cas9 es de un organismo seleccionado del grupo que comprende el genero Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium o Corynebacter.
36. 36. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-34, en donde la Cas9 es de Staphylococcus aureus.
37. 37. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la enzima CRISPR es una enzima Cas9 que es una protema Cas9 quimerica que comprende fragmentos de diferentes homologos de Cas9.
38. 38. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la secuencia diana esta adyacente al Motivo Adyacente al Protoespaciador (PAM) reconocido por la enzima CRISPR.
39. 39. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 38, en donde dichos primer y segundo elemento reguladores comprende cada uno un promotor espedfico para tejidos.
40. 40. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 39, en donde el promotor espedfico para tejidos dirige la expresion de transcritos CRISPR en sangre.
41. 41. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la secuencia tracr es de 30 o mas nucleotidos de longitud.
42. 42. Un metodo de modular la expresion genica en un locus genomico de interes en una celula de un organismo eucariota, al poner en contacto la celula con la composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, con la condicion de que el organismo no sea un ser humano u otro animal.
43. 43. Un metodo ex vivo o in vitro de modular la expresion genica en un locus genomico de interes en una celula de un organismo eucariota, al poner en contacto la celula con la composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41; con la condicion de que dicho metodo no comprenda un proceso para modificar la identidad genetica de la lmea germinal de un ser humano.
44. 44. Uso de una composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41 en la edicion de un gen o genoma ex vivo o in vitro; con la condicion de que dicha edicion no comprenda un proceso para modificar la identidad genetica de la lmea germinal de un ser humano.
45. 45. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41, para uso como un producto terapeutico.
46. 46. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 45, en donde dicho producto terapeutico es para la edicion de un gen o genoma, o para la terapia genica.
47. 47. Una celula huesped eucariota in vitro o ex vivo, que comprende la composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41; con la condicion de que la celula huesped no sea una celula de la lmea germinal humana.
48. 48. Una celula huesped eucariota in vitro o ex vivo, que comprende el complejo de CRISPR-Cas segun se define en 5 una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41; con la condicion de que la celula huesped no sea una celula de la

    lmea germinal humana.
49. 49. Progenie de la celula huesped de la reivindicacion 47 o 48; con la condicion de que la progenie no comprenda un cuerpo humano.