ES2579957T3 - Procedimiento mejorado para el cultivo de células - Google Patents

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Abstract

Procedimiento para el cultivo de células eucariotas en un reactor en suspensión en un medio de cultivo celular, en el que las células producen una proteína recombinante en el que al menos un componente del medio de cultivo celular se introduce en el cultivo celular y en el que el cultivo celular que comprende las células, la proteína recombinante y el medio de cultivo celular se hace circular sobre un filtro en un flujo sustancialmente paralelo a la superficie de dicho filtro, lo que resulta en un flujo de salida de líquido y un flujo, cuyo contenido se mantiene en o se retro-alimenta al reactor, en el que el filtro tiene un tamaño de poros adecuado para separar la proteína recombinante de sustancias que tienen un peso molecular más bajo que la proteína recombinante y en el que el flujo de salida consiste esencialmente en componentes que tienen un peso molecular menor que el de la proteína recombinante, y en el que la proteína recombinante es retenida en o retro-alimentada al reactor.

Description

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células/mL y una concentración de sustancia biológica de al menos 5 g/L, más preferiblemente al menos 10 g/L, en particular al menos 11 g/L. En principio, la concentración de la sustancia biológica puede ser tan alta como lo permita la solubilidad de la sustancia biológica. La concentración de células viables es típicamente no mayor que
200.106 células/mL y preferiblemente dentro del intervalo de 80-150.106 células/mL.
5 La densidad de células viables se puede determinar, por ejemplo, utilizando el método de exclusión con azul de tripano, por ejemplo mediante el uso de un contador de células tal como está comercialmente disponible de, por ejemplo, Innovatis (contador de células Cedex).
Con cultivo celular se quiere dar a entender el líquido que comprende medio de cultivo celular, células y sustancia biológica, líquido que es el resultado de un proceso para el cultivo de células en un reactor en un medio de cultivo
10 celular, en el que las células producen la sustancia biológica.
La invención se explicará ahora por medio de los siguientes ejemplos, sin embargo sin estar limitada a los mismos.
Descripción de las figuras
Fig. 1/9. muestra la densidad de células viables Y (106.ml-1) representada gráficamente frente al tiempo X del procedimiento (días) para el proceso A (discontinuo), B (discontinuo-alimentado) y C1 15 (procedimiento de la invención).
Fig. 2/9. muestra la concentración de IgG en el reactor Z (% en comparación con la concentración de IgG en el proceso A) frente al tiempo X del procedimiento (días) para el proceso A (discontinuo), B (discontinuo-alimentado) y C1 (procedimiento de la invención).
Fig. 3/9. muestra la densidad de células viables Y (106.ml-1) representada gráficamente frente al tiempo X 20 del procedimiento (días) para el proceso A (discontinuo), B (discontinuo-alimentado) y C2 (procedimiento de la invención).
Fig. 4/9. muestra la concentración de IgG en el reactor Z (% en comparación con la concentración de IgG en el proceso A) frente al tiempo X del procedimiento (días) para el proceso A (discontinuo), B (discontinuo-alimentado) y C2 (procedimiento de la invención).
25 Fig. 5/9. muestra la densidad de células viables Y (106.ml-1) representada gráficamente frente al tiempo X del procedimiento (días) para el proceso A (discontinuo), B (discontinuo-alimentado) y C3 (procedimiento de la invención).
Fig. 6/9. muestra la concentración de IgG en el reactor Z (% en comparación con la concentración de IgG en el proceso A3) frente al tiempo X del procedimiento (días) para los procesos A y C3.
30 Fig. 7/9. muestra el rendimiento acumulativo Q (% en comparación con el rendimiento en el proceso A, por L de volumen de reactor) representado gráficamente frente el tiempo X del procedimiento (días) para los procesos A, B y C3.
Fig. 8/9. muestra el número de células Y (106 .ml-1) representado gráficamente frente el tiempo X del procedimiento (días) para C4 (procedimiento de la invención).
35 Fig. 9/9. muestra la concentración de IgG en el reactor Z (% en comparación con la concentración máxima de IgG alcanzada frente al tiempo X del procedimiento (días) para el proceso C4 (una realización del procedimiento de la invención)
Ejemplos
Ejemplo 1: Comparación entre un proceso discontinuo, un proceso discontinuo alimentado y el procedimiento de 40 acuerdo con la invención
En este ejemplo, el rendimiento del procedimiento de acuerdo con la presente invención se comparó con los procesos discontinuo y discontinuo-alimentado.
La Fig. 1/9 muestra la densidad de células viables Y (106.ml-1) representada gráficamente frente al tiempo X del procedimiento (días) para el proceso A (discontinuo), B (discontinuo-alimentado) y C1 (procedimiento de la
45 invención).
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40
45
La Fig. 2/9 muestra la concentración de IgG en el reactor Z (% en comparación con la concentración de IgG en el proceso A) frente al tiempo X del procedimiento (días) para el proceso A (discontinuo), B (discontinuo-alimentado) y C1 (procedimiento de la invención).
Todas las fermentaciones se realizaron utilizando un controlador Sartorius Biostat B para controlar la temperatura a 36,5ºC, el pH entre 7,2 y 6,8 y la DO a una saturación del aire de 50% y a 200 rpm. Se utilizó en todos los experimentos la misma línea células PER.C6 productora de IgG (véase el documento WO 2004/099396).
Proceso discontinuo A
El proceso discontinuo se ejecutó a un volumen de trabajo de 4 L en un recipiente Sartorius B5. Las células se inocularon a razón de 3x10e5 células/mL en medio VPRO (SAFC) suplementado con L-glutamina 6 mM y subsiguientemente se cultivaron durante 17 días.
Proceso discontinuo-alimentado B
El proceso discontinuo-alimentado se ejecutó a un volumen de trabajo de 4 L en un recipiente Sartorius B5. Las células se inocularon a razón de 3x10e5 células/mL en medio VPRO (SAFC) suplementado con L-glutamina 6 mM. Durante el cultivo se añadieron glucosa y glutamina para mantener la concentración por encima de, respectivamente, 15 mM y 1 mM. Los aminoácidos y péptidos se añadieron a partir del día 5 para reponer los aminoácidos consumidos.
Procedimiento de la invención C1
El procedimiento de la invención se llevó a cabo en un recipiente Applikon de 2 L. Se utilizó una membrana de fibra hueca con un corte de peso molecular (MWCO) de 100 kDa obtenida de General Electric (GE) hecha funcionar en modo de flujo ATF con un sistema ATF-2 (Refine Technology) para retener las células y el producto de IgG. El cultivo se inició con 3x10e5 células/mL en medio VPRO (SAFC) suplementado con L-glutamina 6 mM. Medio de cultivo VPRO (SAFC) suplementado con L-glutamina 6 mM se perfundió a través del cultivo celular en suspensión utilizando una tasa de flujo específica (SFR) entre 0,05 y 0,2 nL/célula/día. La concentración de producto más elevada obtenida fue de 1,4 g/L.
El procedimiento de la invención dio como resultado densidades de células viables incrementadas y concentraciones de productos incrementadas en comparación con los modos de cultivo mencionados en menos tiempo, como puede verse de la Fig. 1 y la Fig. 2 que figuran a continuación.
Ejemplo 2: Comparación entre un proceso discontinuo, un proceso discontinuo alimentado y el procedimiento de acuerdo con la invención
En este ejemplo, el procedimiento de acuerdo con la presente invención se compara de nuevo con los procesos discontinuo y discontinuo-alimentado; en el proceso C2 se controla la presión de CO2 y se utilizó un sistema de separación de 50 kDa.
La Fig. 3/9 muestra la densidad de células viables Y (106.ml-1) representada gráficamente frente al tiempo X del procedimiento (días) para el proceso A (discontinuo), B (discontinuo-alimentado) y C2 (procedimiento de la invención).
La Fig. 4/9 muestra la concentración de IgG en el reactor Z (% en comparación con la concentración de IgG en el proceso A) frente al tiempo X del procedimiento (días) para el proceso A (discontinuo), B (discontinuo-alimentado) y C2 (procedimiento de la invención).
Todas las fermentaciones se realizaron utilizando un controlador Sartorius Biostat B para controlar la temperatura a 36,5ºC, pH entre 7,2 y 6,8 y la DO a una saturación del aire de 50% y a 200 rpm. Se utilizó en todos los experimentos la misma línea células PER.C6 productora de IgG (de aproximadamente 150 kDa) (véase el documento WO 2004/099396).
Proceso discontinuo A
El proceso discontinuo se ejecutó a un volumen de trabajo de 4 L en un recipiente Sartorius B5. Las células se inocularon a razón de 3x105 células.mL-1 en medio VPRO (SAFC) suplementado con L-glutamina 6 mM y subsiguientemente se cultivaron durante 17 días.
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Proceso discontinuo-alimentado B
El proceso discontinuo-alimentado se ejecutó a un volumen de trabajo de 4 L en un recipiente Sartorius B5. Las células se inocularon a razón de 3x105 células.mL-1 en medio VPRO (SAFC) suplementado con L-glutamina 6 mM. Durante el cultivo se añadieron glucosa y glutamina para mantener la concentración por encima de, respectivamente, 15 mM y 1 mM. Los aminoácidos y péptidos se añadieron a partir del día 5 para reponer los aminoácidos consumidos.
Procedimiento de la invención C2
El procedimiento de la invención se llevó a cabo en un recipiente Applikon de 2 L. Se utilizó una membrana de fibra hueca (GE) con un corte de peso molecular (MWCO) de 50 kDa hecha funcionar en modo de flujo ATF con un sistema ATF-2 (Refine Technology) para retener las células y el producto de IgG. El cultivo se inició con 3x10e5 células/mL en medio VPRO (SAFC) suplementado con L-glutamina 6 mM. Medio de cultivo VPRO (SAFC) suplementado con L-glutamina 6 mM se perfunde a través del cultivo celular en suspensión utilizando una SFR entre 0,05 y 0,2 nL.célula-1.día-1. La presión de CO2 se controló por debajo de 15%.
Resultado
Como puede verse en la Fig. 3/9 y en la Fig. 4/9, el procedimiento de acuerdo con la invención resulta en densidades de células viables significativamente incrementadas y concentraciones de producto incrementadas (2415% x rendimiento discontinuo; 690% x rendimiento discontinuo-alimentado) en tiempo igual o inferior (tiempo discontinuo 100%; tiempo discontinuo-alimentado 81%).
El aumento de la productividad global en g.L-1.día-1 del procedimiento de la invención es 23,9 veces la productividad discontinua en g.L-1.día-1 y 8,5 veces la productividad discontinua-alimentada en g.L-1.día-1. En el procedimiento de la invención C2, se produjeron 11,1 g de producto/L. La obstrucción del dispositivo de retención no se produjo durante 17 días, incluso con muy alta densidad celular.
Ejemplo 3: Comparación entre un proceso discontinuo, un proceso discontinuo-alimentado y el procedimiento de acuerdo con la invención.
En este ejemplo, el comportamiento del procedimiento de acuerdo con la presente invención con separación del cultivo celular se compara de nuevo con los procesos discontinuo y discontinuo-alimentado; en el proceso C3 se ha separado el cultivo celular.
La Fig. 5/9 muestra la densidad de células viables Y (106.ml-1) representada gráficamente frente al tiempo X del procedimiento (días) para el proceso A (discontinuo), B (discontinuo-alimentado) y C3 (procedimiento de la invención).
La Fig. 6/9 muestra la concentración de IgG en el reactor Z (% en comparación con la concentración de IgG en el proceso A3) frente al tiempo X del procedimiento (días) para los procesos A y C3.
La Fig. 7/9 muestra el rendimiento acumulativo Q (% en comparación con el rendimiento en el proceso A, por L de volumen de reactor) representado gráficamente frente el tiempo X del procedimiento (días) para los procesos A, B y C3.
Todas las fermentaciones se realizaron utilizando un controlador Sartorius Biostat B para controlar la temperatura a 36,5ºC, pH entre 7,2 y 6,8 y la DO a una saturación del aire de 50% y a 200 rpm. Se utilizó en todos los experimentos la misma línea células PER.C6 productora de IgG (de aproximadamente 150 kDa) (véase el documento WO 2004/099396).
Proceso discontinuo A
El proceso discontinuo se ejecutó a un volumen de trabajo de 4 L en un recipiente Sartorius B5. Las células se inocularon a razón de 3.105 células.mL-1 en medio VPRO (SAFC) suplementado con L-glutamina 6 mM y subsiguientemente se cultivaron durante 17 días.
Proceso discontinuo-alimentado B
El proceso discontinuo-alimentado se ejecutó a un volumen de trabajo de 4 L en un recipiente Sartorius B5. Las células se inocularon a razón de 3.105 células.mL-1 en medio VPRO (SAFC) suplementado con L-glutamina 6 mM. Durante el cultivo se añadieron glucosa y glutamina para mantener la concentración por encima de, respectivamente, 15 mM y 1 mM. Los aminoácidos y péptidos se añadieron a partir del día 5 para reponer los aminoácidos consumidos.
Procedimiento de la invención C3
El procedimiento de la invención se llevó a cabo en un recipiente Applikon de 2 L. Se utilizó una membrana de fibra hueca (GE) con un corte de peso molecular (MWCO) de 100 kDa hecha funcionar en modo de flujo ATF con un sistema ATF-2 (Refine Technology) para retener las células y el producto de IgG. El cultivo se inició con 3x10e5 células/mL en medio VPRO (SAFC) suplementado con L-glutamina 6 mM. Medio de cultivo VPRO (SAFC) suplementado con L-glutamina 6 mM se perfunde a través del cultivo celular en suspensión utilizando una SFR entre 0,05 y 0,2 nL.célula-1.día-1. El cultivo celular se retira al 10% del volumen de trabajo por día por encima de 10.106 células.mL-1 y al 30% del volumen de trabajo por día cuando la densidad de células viables excede de 30.106 células.mL-1 y en adelante.
Resultado
Como puede verse en la Fig. 5/9 con el procedimiento de la invención se alcanzan rápidamente densidades de células viables superiores. Además de ello, la Fig. 5/9 también muestra que la viabilidad de las células se puede mantener durante más tiempo con el procedimiento de la invención, dado que el proceso C3 se mantuvo en funcionamiento a lo largo de un período de casi 40 días, porque no se produjo obstrucción del dispositivo de retención, incluso con altas densidades de células.
La Fig. 6/9 muestra que las concentraciones de producto para el procedimiento de la presente invención son mucho más altas que la concentración del producto en el proceso discontinuo. El flujo de producto que contenía el producto se recogió del proceso C3 en aproximadamente 200% a 250% veces la concentración final en el proceso discontinuo A.
La Fig. 7/9 muestra que la mayoría del producto se forma por el procedimiento de la presente invención y que el procedimiento de la invención se puede mantener más tiempo que el procedimiento discontinuo A o discontinuoalimentado B. El día 17, el rendimiento acumulativo del proceso C3 es 8,1 veces el rendimiento acumulativo del proceso discontinuo (A3) y 2,1 veces el rendimiento acumulativo del proceso discontinuo-alimentado (B). También, el día 17, finalizó el proceso discontinuo. El día 21, el rendimiento acumulativo del proceso C3 es 3,0 veces el rendimiento acumulativo del proceso discontinuo-alimentado B. El día 21, finalizó el proceso discontinuo-alimentado. Después de 39 días, el rendimiento acumulativo global del proceso C3 es 25 veces el rendimiento acumulativo del proceso discontinuo A y 6 veces el rendimiento del proceso discontinuo-alimentado B.
Se puede concluir a partir de este experimento que el rendimiento global de un material biológico deseado en el procedimiento de acuerdo con la presente invención puede mejorarse adicionalmente mediante la aplicación de una sangría del cultivo celular cuando la densidad celular excede un cierto nivel alto.
Ejemplo 4: Cultivo y producción con células CHO.
En este ejemplo el procedimiento de acuerdo con la presente invención se ha realizado con una línea celular CHO productora de IgG e incluye una caída de temperatura para disminuir el crecimiento celular.
La Fig. 8/9 muestra el número de células Y (106 .ml-1) representado gráficamente frente el tiempo X del procedimiento (días) para C4 (procedimiento de la invención).
La Fig. 9/9 muestra la concentración de IgG en el reactor Z (% en comparación con la concentración máxima de IgG alcanzada frente al tiempo X del procedimiento (días) para el proceso C4 (una realización del procedimiento de la invención)
La fermentación se realizó utilizando un controlador Sartorius Biostat B para controlar la temperatura a 36,5ºC, pH entre 7,1 y 6,9 y la DO a una saturación del aire de 40% y a 100 rpm. La temperatura se hizo descender a 32ºC el día 5.
Procedimiento de la invención C4
imagen8

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