ES2625066T3 - Proceso mejorado para el cultivo de células - Google Patents

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Abstract

Proceso para el cultivo de células eucariotas en un reactor en suspensión en un medio de cultivo celular, en el que las células producen una sustancia biológica deseada, seleccionada de proteínas y vacunas, que puede usarse como un principio activo en una preparación farmacéutica, en el que al menos un componente del medio de cultivo celular se alimenta al cultivo celular, y en el que el cultivo celular que comprende las células, la sustancia biológica deseada y el medio de cultivo celular se hace circular por un filtro usando un flujo tangencial, y en el que el filtro tiene un tamaño de poro caracterizado por un corte de peso molecular menor que el peso molecular de la sustancia biológica deseada para separar la sustancia biológica deseada de sustancias que tienen un peso molecular menor que la sustancia biológica deseada, en el que el flujo de salida de líquido del filtro contiene esencialmente sólo componente que tienen un peso molecular menor que el de la sustancia biológica deseada, y en el que la sustancia biológica deseada se retiene en o se retroalimenta al reactor.

Description

Proceso mejorado para el cultivo de celulas.
5 Esta invencion se refiere a un proceso para el cultivo de celulas en un reactor en suspension en un medio de cultivo celular.
Un proceso de este tipo se conoce, por ejemplo, a partir del documento WO04/099396. En el presente documento, se describe como la densidad celular del cultivo celular y el rendimiento del material biologico deseado se pueden 10 mejorar mediante la optimizacion de las condiciones de crecimiento en un proceso por lotes alimentado.
Ademas, el documento WO05/095578 desvela un proceso para el cultivo de celulas mediante el cultivo de perfusion continua de un cultivo celular que comprende un medio de cultivo celular y celulas, en el que se anade medio de cultivo celular al cultivo celular, el cultivo celular se hace circular a lo largo de un modulo de filtro que comprende 15 fibras huecas que da como resultado un flujo de salida de liquido que tiene una densidad celular mas baja que la del cultivo celular, y el flujo dentro del modulo de filtro es un flujo tangencial alterno, en el que las celulas producen una sustancia biologica. En los ejemplos del documento WO05/095578 se muestra que se producen 0,9 g/l/dia de producto, correspondiente a una concentracion de producto en el flujo de salida de aproximadamente 0,3 g/l.
20 Cuanto mayor sea el volumen de liquido que contiene la sustancia biologica, mas laboriosa se volvera la purificacion de la sustancia biologica. La concentracion de la sustancia biologica obtenida no es tan alta en los procesos como se desvela en los documentos WO04/099396 y WO05/095578. Por lo tanto, el procesamiento aguas abajo de esta sustancia biologica es engorroso, ya que la sustancia biologica necesita concentrarse antes de aplicar las etapas de purificacion adicionales o han de purificarse grandes volumenes de sustancia biologica menos concentrada. 25 Ademas, el cultivo de celulas a menores densidades celulares da como resultado una menor productividad volumetrica y, por lo tanto, requiere mayores y/o mas cantidad de recipientes de cultivo y, por lo tanto, mayores inversiones en equipos para un nivel de produccion dado.
Por lo tanto, es el objeto de la invencion proporcionar un proceso en el que el producto se obtiene a partir del cultivo 30 celular en concentraciones mas altas.
Este objeto se consigue por un proceso para el cultivo de celulas eucariotas en un reactor en suspension en un medio de cultivo celular, en el que las celulas producen una sustancia biologica, seleccionada de entre proteinas y vacunas, que puede usarse como un principio activo en una preparacion farmaceutica, en el que al menos un 35 componente del medio de cultivo celular se suministra al cultivo celular, y en el que el cultivo celular que comprende las celulas, la sustancia biologica deseada y el cultivo celular se hace circular sobre un filtro usando un flujo tangencial, y en el que el filtro tiene un tamano de poro caracterizado por un corte de peso molecular menor que el peso molecular de la sustancia biologica deseada para separar la sustancia biologica deseada de las sustancias que tienen un peso molecular menor que la sustancia biologica deseada, en el que el flujo de salida del liquido del filtro 40 contiene basicamente solo componentes que tienen un peso molecular menor que el de la sustancia biologica deseada y en el que la sustancia biologica deseada se retiene o se retroalimenta al reactor.
Por ejemplo, la invencion se refiere a un proceso para el cultivo de celulas en un reactor en un medio de cultivo celular, en el que las celulas producen una sustancia biologica, en el que los nutrientes y/o el medio de cultivo celular 45 se administra/se suministran al reactor, y en el que el cultivo celular que comprende las celulas y el medio de cultivo celular se hace circular por un filtro que tiene un tamano de poro o un corte de peso molecular de entre 5 y 500 kD.
Se ha encontrado que usando un sistema de separacion que separa la sustancia biologica de sustancias que tienen un peso molecular mas bajo que la sustancia biologica, la sustancia biologica se puede acumular en el cultivo celular 50 en mayores concentraciones.
Por lo tanto, la presente invencion difiere del cultivo de celulas descrito en la tecnica anterior, debido a que permite la acumulacion del material biologico deseado junto con la masa celular.
55 En una realizacion preferida de la presente invencion, parte de las sustancias de menor peso molecular se eliminan continuamente del cultivo celular.
Una ventaja adicional del proceso de la presente invencion es que se puede alcanzar una mayor concentracion de celulas viables en comparacion, por ejemplo, con los procesos por lotes o por lotes alimentados. Ademas, el tiempo
de produccion - el perfodo durante el cual las celulas producen la sustancia biologica - se puede ampliar en comparacion con los procesos por lotes o por lotes alimentados. Ademas, en comparacion con un proceso por lotes o por lotes alimentado, es posible utilizar un reactor mas pequeno. El uso de reactores mas pequenos es ventajoso, ya que esto reduce las inversiones en equipos e instalaciones relacionadas.
5
Ademas, se pueden obtener concentraciones mas altas de la sustancia biologica en tiempos mas cortos.
Se encontro que era posible obtener altas concentraciones de sustancia biologica dentro del reactor sin disminuir bruscamente la viabilidad celular y, por lo tanto, sin limitar el tiempo de produccion. El experto en la tecnica hubiera 10 esperado que se produjera la inhibicion del producto, es decir, la inhibicion de la produccion de la sustancia biologica por la propia sustancia biologica o la inhibicion por otras macromoleculas producidas por la celula (tales como, por ejemplo, protefnas de celulas huesped, enzimas o desechos celulares). Ademas, se encontro que la acumulacion del material biologico deseado no afecta a la funcion del sistema de separacion.
15 El proceso de la presente invencion proporciona una ventaja considerable en cuando a la densidad celular, concentracion de producto en el cultivo celular y periodo de cultivo prolongado en comparacion con los procesos de acuerdo con los documentos WO05/095578 y WO04/099396. Como resultado, el presente proceso da como resultado una produccion mejorada del material biologica deseado.
20 Las celulas que pueden usarse para producir la sustancia biologica son, en principio, todas las celulas conocidas por el experto en la tecnica, que tienen la capacidad de proporcionar un producto biologico. Las celulas pueden ser eucariotas, por ejemplo, hongos filamentosos, por ejemplo, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Penicillium chrysogenum, levaduras, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Phaffia rhodozyma, levadura del genero Pichia, por ejemplo, Pichia pastoris, o procariotas, por ejemplo, Escherichia coli, 25 Bacillus sp, por ejemplo, B. licheniformis, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. alkalophilus, Streptomyces sp., Corynebacterium glutamicum, Pseudomonas sp. Los ejemplos de celulas eucariotas se describen tambien, por ejemplo, en Chu, L., Robinson, D. K., (2001) Curr. Opinion Biotechn., vol. 12, pag. 180-187. Preferiblemente, las celulas que se utilizan en el proceso de la presente invencion son celulas animales, en particular, celulas de mamffero. Los ejemplos de celulas de mamffero incluyen celulas CHO (ovario de hamster chino), hibridomas, celulas 30 BHK (rinon de hamster recien nacido), celulas de mieloma, celulas humanas, por ejemplo, celulas HEK-293, celulas linfoblastoides humanas, celulas HER inmortalizadas por E1, celulas de raton, por ejemplo, celulas NS0. Mas preferiblemente, se utilizan celulas HER inmortalizadas por E1, mucho mas preferiblemente celulas PER.C6.
Las celulas de retina embrionaria humana (HER) primarias pueden aislarse de fetos (Byrd P, Brown KW, Gallimore 35 PH. 1982. Malignant transformation of human embryo retinoblasts by cloned adenovirus 12 DNA. Nature 298: 69-71, Byrd PJ, Grand RJA, Gallimore PH. 1988. Differential transformation of primary human embryo retinal cells by adenovirus E1 regions and combinations of E1A + ras. Oncogene 2: 477-484). Las celulas primarias moriran en cultivo durante varios pases. Las celulas HER inmortalizadas por E1 para el fin de la presente invencion se derivan de las celulas HER primarias mediante la expresion de ADN que codifica las protefnas adenovirales E1A y E1B en la 40 misma, para obtener celulas inmortalizadas. Dichas celulas inmortalizadas pueden cultivarse durante mas de 100 pases. Los metodos para obtener celulas HER inmortalizadas por E1 se han descrito, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos 5.994.128, en Byrd P, Brown KW, Gallimore Ph. 1982. Malignant transformation of human embryo retinoblasts by cloned adenovirus 12 DNA. Nature 298: 69-71, en Byrd PJ, Grand RJA, Gallimore PH. 1988. Differential transformation of primary human embryo retinal cells by adenovirus E1 regions and combinations of E1A 45 + ras. Oncogene 2: 477-484, y en Gallimore, P.H., Grand, R.J.A. y Byrd, P.J. (1986). Transformation of human embryo retinoblasts with simian virus 40, adenovirus and ras oncogenes. AntiCancer Res. 6, pag. 499-508. Por ejemplo, las celulas HER inmortalizadas, incluyendo celulas PER.C1, PER.C3, PER.C4, PER.C5, PER.C6, PER.C8 y PER.C9, se generaron por transfeccion de celulas HER primarias utilizando un plasmido que contenfa las secuencias codificantes de (Ad5) E1A y E1B de adenovirus serotipo 5 (nucleotidos Ad5 459-3510) bajo el control del 50 promotor de fosfoglicerato cinasa ("PGK") humana (vease la patente de Estados Unidos 5.994.128).
En una realizacion preferida, las celulas en el proceso de la presente invencion son celulas HER inmortalizadas por E1, mas preferiblemente celulas PER.C6 (vease la Patente de Estados Unidos 5.994.128). Las celulas PER.C6 se ilustran por celulas segun se depositan bajo ECACC n.° 96022940 (vease, por ejemplo, la Patente de Estados 55 Unidos 5.994.128, documento EP 0833934 B1).
En el proceso de la invencion, las celulas pueden cultivarse en suspension en cualquier forma, por ejemplo, en forma de celulas inmovilizadas, celulas individuales o en grupos de celulas o en forma de una combinacion de las mismas. Preferiblemente, las celulas se cultivan como celulas individuales y/o grupos de celulas pequenos de no mas de 100
celulas, mas preferiblemente de no mas de 20 celulas. Las celulas pueden inmovilizarse, por ejemplo, sobre microsoportes, tal como estan comercialmente disponibles en, por ejemplo, GE Healthcare (Cytodex).
Un reactor como se define en el presente documento, es un sistema que comprende el cultivo celular, cultivo celular 5 que a su vez comprende celulas y un medio de cultivo celular. Se proporcionan preferiblemente barreras esteriles, tales como filtros de aire, para evitar que otras celulas contaminen las celulas deseadas y mantiene preferiblemente un entorno favorable para las celulas, proporcionando las condiciones de cultivo adecuadas, tales como mezcla, temperatura, pH, concentracion de oxfgeno, etc.
10 El reactor puede ser, por ejemplo, de una naturaleza mas permanente, por ejemplo, el reactor puede ser de acero inoxidable o vidrio o puede ser, por ejemplo, de naturaleza desechable, por ejemplo, el reactor puede ser un matraz o bolsa de plastico. Los ejemplos de reactores adecuados para su uso en la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, los recipientes de tanque agitado, recipientes neumaticos y bolsas desechables que se pueden mezclar por balanceo, movimiento por sacudida o agitacion. Se utilizan (bio)reactores preferiblemente desechables, ya que son 15 favorables porque requieren costes de inversion relativamente bajos, tienen una gran flexibilidad operativa, cortos tiempos de respuesta, y son facilmente configurables para el proceso. Los (bio)reactores desechables estan disponibles en el mercado, por ejemplo, en Hyclone, Sartorius, Applikon o Wave.
La expresion "sistema de separacion" se define en el marco de la invencion como un sistema capaz de separar en 20 base al peso molecular. El sistema de separacion utilizado en el proceso de la invencion es capaz de separar la sustancia biologica de sustancias que tienen un peso molecular mas bajo que la sustancia biologica. En otras palabras, el corte del peso molecular se elige de tal forma que el corte del peso molecular (MWCO) es menor de, mas preferiblemente, al menos un factor de 2, mucho mas preferiblemente al menos un factor de 3 menor que el peso molecular de la sustancia biologica. Tfpicamente, pero por supuesto dependiendo del peso molecular de la 25 sustancia biologica producida en el proceso de la presente invencion, el MWCO del sistema de separacion es preferiblemente al menos 5, mas preferiblemente al menos 10, mucho mas preferiblemente al menos 30 kDa y preferiblemente como mucho 500 kDa, mas preferiblemente como mucho 300 kDa, mucho mas preferiblemente a lo sumo 100 kDa. Por ejemplo, para una IgG con un peso molecular de 150 kDa, es el mas preferido un sistema de separacion que tenga un MWCO de como mucho 50 kDa.
30
Los ejemplos de sistemas de separacion incluyen, pero no se limitan a, filtros, centrffugas y sistemas de extraccion bifasica acuosos.
El termino "filtro", como se utiliza en el presente documento, pretende incluir todos los dispositivos con la capacidad 35 de separar las partfculas en funcion de su tamano o peso molecular. En principio, en el proceso de la presente invencion, se puede utilizar cualquier filtro siempre y cuando el tamano de poro o el MWCO se elijan de tal forma que la sustancia biologica se separe de sustancias que tengan un peso molecular mas bajo que la sustancia biologica, tfpicamente este sera una tamano de poro o un MWCO de entre 5 y 500 kDa. Los ejemplos de filtros adecuados para su uso en la presente invencion incluyen filtros de membrana, filtros de material ceramico y filtros metalicos. El 40 filtro puede usarse en cualquier forma; el filtro puede ser, por ejemplo, enrollado en espiral o tubular o puede utilizarse en la forma de una hoja. Preferiblemente, en el proceso de la invencion, el filtro utilizado es un filtro de membrana, preferiblemente un filtro de fibra hueca. Con la expresion "fibra hueca" se refiere a una membrana tubular. El diametro interno del tubo es de al menos 0,1 mm, mas preferiblemente al menos 0,5 mm, mucho mas preferiblemente al menos 0,75 mm y preferiblemente el diametro interno del tubo es como mucho de 10 mm, mas 45 preferiblemente como mucho de 6 mm, mucho mas preferiblemente como mucho de 1 mm. Los modulos de filtro que comprenden fibras huecas estan disponibles en el mercado, por ejemplo, en General Electric (GE, anteriormente Amersham).
Haciendo circular el cultivo celular que comprende la sustancia biologica, las celulas y el medio de cultivo celular por 50 un sistema de separacion, la sustancia biologica y las celulas quedan retenidas en el reactor y, por lo tanto, el flujo de salida de lfquido tiene una menor concentracion de sustancia biologica y una densidad celular inferior que el cultivo celular. Habitualmente, en el proceso de la invencion, el flujo de salida de lfquido no contiene o apenas contiene cualquier sustancia biologica y celulas. Normalmente, el flujo de salida de lfquido contendra basicamente solo componentes que tienen un peso molecular menor que el de la sustancia biologica. Esencialmente todas las 55 celulas y esencialmente toda sustancia biologica quedan, por lo tanto, normalmente retenidas en el reactor.
El tamano de poro o el MWCO del filtro se elige de tal forma que el tamano de los poros o el MWCO del filtro es menor que, preferiblemente al menos un factor de 2, mas preferiblemente al menos un factor de 3 menor que el diametro o el peso molecular del producto, asegurando una alta retencion de producto. Tfpicamente, pero, por
supuesto, dependiendo del tamano o del peso molecular del producto, es decir, la sustancia biologica producida en el proceso de la presente invencion, el tamano de poro o MWCO del filtro es preferiblemente al menos 5, mas preferiblemente al menos 10, mucho mas preferiblemente al menos 30 kDa, y/o el tamano de poro o el MWCO del filtro/membrana es preferiblemente a lo sumo 500 kDa, mas preferiblemente a lo sumo 300 kDa, mucho mas 5 preferiblemente a lo sumo 100 kDa.
Con el corte del peso molecular (MWCO) se refiere al peso molecular por encima del cual al menos el 90 % de las partfculas quedan retenidas por el sistema de separacion.
10 Haciendo circular el cultivo celular por un sistema de separacion, por ejemplo un filtro, significa que el cultivo celular se hace pasar a traves de un sistema de separacion, por ejemplo un filtro que da como resultado un flujo de salida de lfquido y un flujo, cuyo contenido se mantiene en o se retroalimenta al reactor. El flujo, cuyo contenido se mantiene en o se retroalimenta al reactor, contendra normalmente en esencia solo componentes que tienen un peso molecular al menos igual al de la sustancia biologica o superior y, por lo tanto, dicho flujo comprendera mas 15 sustancia biologica que el flujo de salida de lfquido.
En principio, no es crftico cuando se inicie la circulacion del cultivo celular por el sistema de separacion durante el proceso de la invencion. La circulacion del cultivo celular puede iniciarse, por ejemplo, directamente desde el inicio del proceso o cuando la densidad de celulas viables de las celulas ha alcanzado un cierto nivel.
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La circulacion del cultivo celular por un filtro puede ser un flujo sustancialmente perpendicular con respecto a la superficie del filtro, tambien conocido como flujo de extremo muerto, o un flujo sustancialmente paralelo a la superficie del filtro, tambien conocido como flujo tangencial, por ejemplo flujo tangencial unidireccional (TFF) o flujo transversal. Un ejemplo preferido de flujo transversal es un flujo tangencial alterno (ATF), ya que con un ATF se 25 encontro que no se produce (rapidamente) la obstruccion del filtro, incluso a densidades celulares muy altas. Es de conocimiento general comun que en la filtracion de profundidad, el filtro final de poros pequenos necesita ser protegido de la obstruccion por prefiltros gruesos. Esta practica se basa en el conocimiento general comun de que filtros con poros mas pequenos o con un MWCO menor se obstruyen mas facilmente, limitando asf el tiempo de produccion. Si se utiliza un ATF, el uso de un prefiltro se convierte en superfluo.
30
El flujo puede ser dirigido moviendo el cultivo celular, moviendo el filtro, o ambos. El filtro puede moverse, por ejemplo, por rotacion (filtro rotatorio) o vibracion (filtro vibratorio). Como alternativa, si el flujo se dirige moviendo el cultivo celular solamente, el filtro es estatico y el cultivo celular puede moverse, por ejemplo, por medio de bombas o presion.
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Con "flujo tangencial alterno" se refiere a que existe un flujo en la misma direccion que (es decir, tangencial a) la o las superficies del filtro, flujo que va hacia atras y adelante, y que existe otro flujo en una direccion sustancialmente perpendicular a dicha superficie de filtro. El flujo tangencial alterno se puede lograr de acuerdo con metodos conocidos por el experto en la tecnica (por ejemplo como se describe en el documento US 6.544.424).
40
Durante el cultivo de las celulas, al menos un componente del medio de cultivo celular, por ejemplo, uno o mas nutrientes y/o medio de cultivo celular se puede suministrar a las celulas. En el procedimiento de acuerdo con la invencion, es ventajoso complementar en parte, o preferiblemente en su totalidad, al menos uno de los nutrientes agotados por medio de una alimentacion de este nutriente o estos nutrientes al reactor. Por ejemplo, se puede 45 alimentar al reactor medio de cultivo celular completo, lo cual es ventajoso ya que entonces no se necesita preparar por separado una alimentacion separada. El medio de cultivo celular tambien se puede, por ejemplo, alimentar a las celulas en una forma mas concentrada; esto es ventajoso, ya que volumenes mas pequenos son mas faciles de manejar. Tambien uno o mas nutrientes pueden ser alimentados al reactor. Por ejemplo, hidratos de carbono, por ejemplo, glucosa o fructosa; aminoacidos, tales como glutamina y/o peptidos, pueden ser ventajosamente 50 alimentados al reactor.
En una realizacion preferida de la invencion, las condiciones del cultivo celular se eligen de tal forma que no este limitada la tasa de crecimiento celular y/o la productividad especffica de las celulas, y mas preferiblemente, de tal forma que la concentracion de al menos uno de los componentes del medio de cultivo celular siga siendo 55 esencialmente constante. Los ejemplos de condiciones de cultivo celular limitantes son limitaciones de nutrientes y la formacion de metabolitos inhibidores tales como amoniaco, dioxido de carbono y lactato. Por ejemplo, las condiciones de cultivo celular tales como la alimentacion, se pueden elegir de tal forma que la tasa de crecimiento celular no este limitada, por ejemplo, mediante el suministro de nutrientes suficientes como para compensar el agotamiento y/o para evitar la produccion de metabolitos inhibidores tales como lactato o amoniaco. Por ejemplo, las
condiciones de aireacion pueden elegirse de tal forma que la formacion de dioxido de carbono no limite la tasa de crecimiento celular. El cultivo de la celula en condiciones no limitantes es muy ventajoso desde un punto de vista de las Buenas Practicas de Fabricacion (BPF), ya que 1) esto puede dar un entorno de cultivo celular constante que en muchos casos tambien da una calidad del producto constante y buena y, 2) esto puede conducir a una viabilidad 5 celular alta, en algunos casos a una viabilidad celular de mas del 98 %. La viabilidad celular alta reduce la liberacion de contaminantes celulares relacionados, tales como protefnas de la celula huesped, lo que facilita la purificacion del producto. Ademas, el cultivo de las celulas a una tasa de crecimiento celular ilimitada y/o una productividad especffica ilimitada tiene la ventaja comercial de que es posible producir mas sustancia biologica en un tiempo incluso mas corto dado que se alcanzara antes una mayor densidad celular en el proceso.
10
"Productividad especffica" de las celulas es la cantidad de una sustancia biologica dada producida por celula por unidad de tiempo y, por lo general, se expresa en pg.celula-1dfa-1.
La tasa de adicion de al menos un componente del medio de cultivo celular, por ejemplo, nutrientes y/o medio de 15 cultivo celular al cultivo celular (la tasa de entrada o tasa de perfusion), influye sobre la viabilidad y la densidad de las celulas. En el proceso de la invencion, el componente o componentes del medio de cultivo celular, tales como nutrientes y/o medio de cultivo celular, pueden ser alimentados, por ejemplo, en un flujo continuo, un flujo semi- continuo, por ejemplo de flujo por etapas o flujo escalonado. Preferiblemente, el componente o componentes del medio de cultivo celular, por ejemplo, nutrientes y/o medio de cultivo celular, se anaden en un flujo continuo.
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El componente o componentes del medio de cultivo celular, tales como medio de cultivo celular completo y/o nutrientes, pueden alimentarse al reactor, en principio, en cualquier momento durante el proceso. Preferiblemente, la alimentacion se inicia antes de que los sustratos, tales como glutamina y glucosa, hayan alcanzado niveles tan bajos como para provocar el crecimiento de las celulas a cesar o antes de que los metabolitos inhibitorios, por ejemplo, 25 lactato o amoniaco, alcancen niveles tan altos que cesen el crecimiento. Desde este punto en adelante, el componente o componentes del medio de cultivo celular, tales como nutrientes y/o medio de cultivo celular completo, se alimentan preferiblemente al reactor a una velocidad tal que se satisface la demanda de sustrato.
En una realizacion de la invencion, se anade medio de cultivo celular a una tasa de alimentacion de acuerdo con la 30 formula (1):
T asa de alimentacion = SFR x (volumen total de cultivo celular) x (densidad de celulas viables) (1)
en la que la tasa de alimentacion se expresa en litros por dfa, en la que la SFR es la tasa de alimentacion especffica, 35 es decir, la tasa a la que el medio de cultivo celular se alimenta al cultivo celular, expresada como el volumen del medio anadido por celula viable por unidad de tiempo, y en la que la densidad de celulas viables es el numero de celulas viables por unidad de volumen. El numero de celulas viables puede ser determinado por el experto en la tecnica, por ejemplo, a traves del metodo de exclusion con azul de tripano. La tasa de alimentacion especffica se elige preferiblemente entre 0,01 y 0,3 nl/celula/dfa, mas preferiblemente entre 0,01 y 0,2 nl/celula/dfa.
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Puede ser ventajoso tener en cuenta parametros adicionales cuando se ajusta la velocidad de alimentacion, por ejemplo, la cantidad de glucosa que se ha de alimentar al cultivo y/o la tasa de absorcion de oxfgeno. Por ejemplo, para PER.C6, la tasa de alimentacion del medio de cultivo celular y/o los nutrientes se elige preferiblemente de tal forma que la concentracion de glucosa se mantiene entre 3 y 20 mmol/l, mas preferiblemente entre 5 y 15 mmol/l. 45 Preferiblemente, la concentracion de glucosa es de al menos 3 mmol/l, mas preferiblemente al menos 5 mmol/l y preferiblemente a lo sumo 20 mmol/l, mas preferiblemente a lo sumo 15 mmol/l.
En una realizacion especial de la invencion, el cultivo celular (que comprende celulas, sustancia biologica y medio de cultivo celular) se retira al menos una vez del reactor y el lfquido, por ejemplo, el medio de cultivo celular o una 50 alimentacion de nutrientes se anade al reactor para compensar la retirada del cultivo celular. La retirada de cultivo celular puede conducir a tiempos de proceso mas largos a altas densidades celulares en combinacion con altas viabilidades celulares lo que da como resultado una mayor productividad. El cultivo celular se puede retirar de forma continua o por etapas.
55 En una realizacion preferida de la invencion, el cultivo celular (que comprende celulas, medio de cultivo celular y sustancia biologica) se retira del reactor tan pronto como se alcance la densidad celular deseada, por ejemplo, una densidad celular de al menos 10.106 celulas viables/ml, preferiblemente de al menos 20.106 celulas viables/ml, mas preferiblemente de al menos 30.106 celulas viables/ml, por ejemplo una densidad celular de a lo sumo 200. 106 celulas viables/ml, y se anade lfquido, por ejemplo, medio de cultivo celular o alimentacion de nutrientes, al
reactor para compensar la retirada de cultivo celular. Preferiblemente, el cultivo celular se retira a tal velocidad que la densidad celular se mantiene en el intervalo de densidades celulares deseado. Esta realizacion de la invencion es muy ventajosa en comparacion con un proceso por lotes o por lotes alimentado convencional, ya que combina las ventajas del proceso de la invencion con alta viabilidad que se puede mantener mas tiempo, haciendo posible 5 realizar una aun mayor productividad volumetrica global. Con "productividad volumetrica" se refiere a la cantidad de sustancia biologica producida por unidad de volumen de reactor por unidad de tiempo y habitualmente se expresa en g.M.dfa'1. En comparacion con un proceso de perfusion convencional, esta realizacion de la invencion tambien es muy ventajosa, ya que combina las ventajas del proceso de la invencion con una corriente de eliminacion de cultivo celular que tiene una alta concentracion de sustancia biologica. La alta concentracion de sustancia biologica en la 10 corriente de eliminacion de cultivo celular hace que sea comercialmente interesante para recolectar la sustancia biologica de la misma. En un proceso de perfusion convencional, en el que se elimina cultivo celular, la corriente de eliminacion de cultivo celular no contiene suficiente sustancia biologica como para hacerla comercialmente interesante para recolectar la sustancia biologica, y la corriente de separacion de cultivo celular se considera, por lo tanto, habitualmente como un desecho. Por lo tanto, en esta realizacion de la invencion, en teorfa toda sustancia 15 biologica producida se puede recolectar de una manera directa, economicamente viable y sencilla.
En una realizacion particularmente preferida de la invencion, las condiciones de cultivo celular se eligen de tal forma que la tasa de crecimiento celular y/o la productividad especffica de las celulas no se limita y, mas preferiblemente, de tal forma que tambien la concentracion de al menos uno de los componentes del medio del cultivo celular, tal 20 como glucosa o glutamina, permanezca constante y el cultivo celular se elimina al menos una vez del reactor tan pronto como se alcanza la densidad celular deseada, y se anade lfquido, por ejemplo, medio de cultivo celular, al reactor para compensar la eliminacion de cultivo celular.
Preferiblemente, la tasa del flujo de salida se elige de tal forma que sea sustancialmente igual a la velocidad de 25 adicion de al menos un componente de medio de cultivo, por ejemplo, nutrientes y/o medio de cultivo celular menos la tasa de la eliminacion de cultivo celular opcional.
Las celulas que producen una sustancia biologica son, por ejemplo, celulas capaces de expresar un gen que codifica la sustancia biologica. Las celulas capaces de expresar un gen que codifica la sustancia biologica se pueden 30 preparar, por ejemplo, mediante transfeccion de las celulas con un plasmido que contiene el gen que codifica la sustancia biologica y un gen que codifica un marcador de seleccion adecuado, por ejemplo un gen que codifica una resistencia a la neomicina (gen marcador Neo). Las celulas transfectadas de manera estable pueden entonces seleccionarse por la presion de seleccion, por ejemplo - en el caso de un gen marcador Neo - mediante el cultivo de las celulas transfectadas en presencia de G418 (genericina) y el cribado inmediato de las celulas en cuanto a celulas 35 que exhiban una expresion de alto nivel de la sustancia biologica. Los metodos para preparar clones de celulas HER inmortalizadas por E1 que expresan una protefna, y metodos para cultivar este tipo de celulas para producir la protefna, se conocen bien por el experto, y pueden encontrarse, por ejemplo, en el documento US 6.855.544.
Por lo tanto, las sustancias biologicas que pueden producirse por las celulas, por ejemplo, mediante la expresion de 40 un gen (recombinante) que codifican las mismas, son, por ejemplo, protefnas (recombinantes), en particular, receptores, enzimas, protefnas de fusion, protefnas de la sangre tales como protefnas de la cascada de coagulacion de la sangre, protefnas multifuncionales, tales como, por ejemplo, eritropoyetina, virus o protefnas bacterianas, por ejemplo, para su uso en vacunas; inmunoglobulinas, tales como anticuerpos, por ejemplo, IgG o IgM, y similares; preferiblemente una protefna, mas preferiblemente un anticuerpo se produce por parte de las celulas. 45 Preferiblemente, las sustancias biologicas tales como protefnas o vacunas producidas por las celulas, se pueden utilizar como un principio activo en una preparacion farmaceutica. En el contexto de la presente invencion, el termino "producto" y la expresion "sustancia biologica" son intercambiables.
En el marco de la presente invencion, con preparacion farmaceutica se refiere a cualquier preparacion, que puede 50 ser utilizada como un medicamento, en particular, como un medicamento en seres humanos. Un medicamento de este tipo, por ejemplo, puede ser utilizado para el diagnostico, o para el proposito profilactico, tal como, por ejemplo, una vacuna, y/o para fines terapeuticos, tal como, por ejemplo, una enzima o protefna para la cual un paciente es deficiente, o un anticuerpo para matar celulas indeseadas. Una preparacion farmaceutica puede contener ademas un vehfculo o excipiente farmaceuticamente aceptable, cuyos ejemplos se conocen bien por el experto en la tecnica. 55
La lfnea celular PER.C6 se puede utilizar para la produccion de sustancias biologicas, tales como adenovirus con delecion de E1 (vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 6.994.128; Nichols et al, 2002, Propagation of adenoviral vectors: use of PER.C6 cells. En: Curiel D, Douglas JT, editores. Adenoviral vectors for gene therapy. San Diego: Elsevier. pag. 129-167), otros virus (vease, por ejemplo, el documento WO 01/38362), o protefnas
recombinantes (vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 6.855.544; Yallop et al, 2005, PER.C6 cells for the manufacture of biopharmaceutical proteins, Modern Biopharmaceuticals: Design, Development and Optimization, 4 Volumenes, 779-807, Jorg Knablein (Editor)).
5 Los ejemplos de protefnas que se pueden utilizar como un principio activo en preparaciones farmaceuticas (con el nombre de la marca entre parentesis) incluyen tenecteplasa (TN Kase™), factor antihemofflico (recombinante) (ReFacto™), interferon linfoblastoide a-nl (Wellferon™), factor de coagulacion (recombinante) (NovoSeven™), etanercept, (Enbrel™), trastuzumab (Herceptin™), infliximab (Remicade™), palivizumab (Synagis™), basiliximab (Simulect™), daclizumab (Zenapaz™), rituximab (Rituxan™), factor de coagulacion (recombinante) IX (Benefix™) e 10 interferon p-1a (Avonex™).
Los ejemplos de vacunas que se pueden utilizar como un principio activo en la preparacion farmaceutica incluyen antfgenos de protefnas aislados, cuyos ejemplos incluyen, pero no se limitan a, vacuna contra el rotavirus viva, oral y tetravalente (RotaShield™), vacuna contra la rabia (RanAvert™), vacunas contra la gripe, y vacuna contra la 15 hepatitis A inactivada (VAQTA™).
El pH, la temperatura, la concentracion de oxfgeno disuelto y la osmolaridad del medio de cultivo celular son, en principio, no crfticos y dependen del tipo de celula elegida. Preferiblemente, el pH, la temperatura, la concentracion de oxfgeno disuelto y la osmolaridad se eligen de tal forma que sean optimos para el crecimiento y la productividad 20 de las celulas. El experto en la tecnica sabe como encontrar el pH, la temperatura, la concentracion de oxfgeno disuelto y la osmolaridad optimos para el cultivo (vease, por ejemplo, el documento WO 2004/099396). Preferiblemente, para el proceso de la invencion cuando se utilizan celulas HER inmortalizadas por E1, el pH se elige entre 6,6 y 7,6, y/o la temperatura se elige entre 30 y 39 °C, y/o la osmolaridad se elige entre 260 y 400 mOsm/kg. Para mantener condiciones del proceso optimas se desea la automatizacion para controlar las 25 condiciones del proceso. Con el fin de optimizar las condiciones del proceso, por ejemplo, para obtener la detencion del crecimiento para una productividad celular aumentada, durante el cultivo se puede aplicar un cambio en las condiciones de cultivo. Esto se puede establecer, por ejemplo, mediante un cambio de temperatura (tal como, de 37 a 32 °C), un cambio del pH o un cambio de la osmolaridad.
30 El proceso de la presente invencion puede realizarse, en principio, en cualquier tipo de medio de cultivo celular adecuado para el cultivo de celulas. Las directrices para la eleccion de un medio de cultivo celular y condiciones del cultivo celular se conocen bien y se proporcionan, por ejemplo, en los Capftulos 8 y 9 de Freshney, R. I. Culture of animal cells (a manual of basic techniques), 4a edicion 2000, Wiley-Liss y en Doyle, A., Griffiths, J. B., Newell, D. G. Cell &Tissue culture: Laboratory Procedures 1993, John Wiley & Sons.
35
Por ejemplo, el medio de cultivo celular puede comprender, por ejemplo, como un componente del medio de cultivo celular, una fuente de hidratos de carbono, sales y/o aminoacidos y/o vitaminas y/o lfpidos y/o detergentes y/o tampones y/o factores de crecimiento y/u hormonas y/o citocinas y/u oligoelementos. Los ejemplos de fuentes de hidratos de carbono incluyen glucosa, fructosa, galactosa y piruvato. Los ejemplos de sales incluyen sales de 40 magnesio, por ejemplo, MgCl2.6H2O, MgSO4 y MgSO4.7H2O, sales de hierro, por ejemplo, FeSO4.7H2O, sales potasicas, por ejemplo, KH2PO4, KCl; sales sodicas, por ejemplo NaH2PO4, Na2HPO4, y sales calcicas, por ejemplo, CaCl2.2H2O. Los ejemplos de aminoacidos incluyen todos los aminoacidos proteinogenicos conocidos, por ejemplo histidina, glutamina, treonina, serina, metionina. Los ejemplos de vitaminas incluyen: ascorbato, biotina, colina.Cl, mio-inositol, D-pantotenato, riboflavina. Los ejemplos de lfpidos incluyen: acidos grasos, por ejemplo, acido linoleico 45 y acido oleico; los ejemplos de detergentes incluyen Tween® 80 y Pluronic® F68. Los ejemplos de tampones incluyen HEPES y Na2CO3. Los ejemplos de factores de crecimiento/hormonas/citocinas incluyen IGF (factor de crecimiento de tipo insulina), hidrocortisona e insulina (recombinante). Los ejemplos de elementos traza se conocen por el experto en la tecnica e incluyen Zn, Mg y Se. El medio de cultivo celular puede comprender, por ejemplo, tambien otros componentes del medio de cultivo celular, por ejemplo, peptona de soja o etanol amina.
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Para la produccion de sustancias biologicas de acuerdo con la invencion, en particular, si las sustancias biologicas se van a utilizar como un principio activo en preparaciones farmaceuticas, se prefiere medio libre de suero para medios que contienen una fuente de suero. La razon de esto es que los medios de fuente de suero pueden estar contaminados con virus, presentan el riesgo de infecciones prionicas, y pueden crear un obstaculo importante en el 55 procesamiento aguas abajo del producto biofarmaceutico (es decir, la purificacion adicional de la sustancia biologica del cultivo celular). Por lo tanto, el proceso de la invencion se realiza preferiblemente en un medio de cultivo celular que no comprende suero de una fuente animal, incluyendo el ser humano. Puesto que los compuestos de una fuente de mamffero tambien presentan un riesgo de infeccion, preferiblemente el medio de cultivo celular esta libre de una fuente de mamffero (es decir, el medio de cultivo celular no comprende suero ni componentes de una fuente de
mamffero). Mas preferiblemente, el medio de cultivo celular esta libre de una fuente animal (es decir, el medio de cultivo celular no comprende suero ni componentes de una fuente animal, incluyendo el ser humano). Los ejemplos de medio libre de suero que se pueden utilizar para el cultivo de celulas PER.C6 incluyen medios disponibles en el mercado tales como, por ejemplo, medio EX Cell™ VPRO (SAFC), HyQ® CDM4Retino™ (HyClone), IS ProVec CD 5 (Irvine scientific), 293-SFM II (Invitrogen).
En realizaciones preferidas, la sustancia biologica producida en el proceso de la presente invencion se recolecta a partir del flujo cuyo contenido se mantiene en o preferiblemente se retroalimenta al reactor, o a partir del cultivo de celulas que se retira del reactor o de ambos. La sustancia o sustancias biologicas producidas en el proceso de la 10 presente invencion se pueden cosechar adicionalmente del cultivo celular en el denominado procesamiento aguas abajo, utilizando metodos que dependen de la sustancia biologica, metodos que, como tales, se conocen bien por el experto. El procesamiento aguas abajo comprende habitualmente varias etapas de purificacion en combinaciones y orden variables. Los ejemplos de etapas de purificacion en el procesamiento de aguas abajo son etapas de separacion (por ejemplo, mediante cromatograffa de afinidad y/o cromatograffa de intercambio ionico y/o extraccion 15 mediante sistemas acuosos bifasicos y/o precipitacion mediante, por ejemplo, sulfato de amonio), etapas para la concentracion de la sustancia biologica (por ejemplo, mediante ultrafiltracion o diafiltracion), etapas para intercambiar tampones y/o etapas para eliminar o inactivar virus (por ejemplo, mediante la filtracion de virus, cambio del pH o tratamiento con detergente disolvente).
20 En un aspecto, la invencion se refiere a un cultivo celular que comprende celulas de mamffero, preferiblemente celulas hEr inmortalizadas por E1, mas preferiblemente celulas PER.C6, con una densidad de celulas viables de al menos 50.106 celulas/ml, preferiblemente al menos 60.106 celulas/ml, en particular al menos 90.106 celulas/ml y una concentracion de sustancia biologica de al menos 5 g/l, mas preferiblemente al menos 10 g/l, en particular al menos 11 g/l. En principio, la concentracion de la sustancia biologica puede ser tan alta como lo permita la solubilidad de la 25 sustancia biologica. La concentracion de celulas viables es tfpicamente no mayor de 200.106 celulas/ml, y preferiblemente dentro del intervalo de 80-150.106 celulas/ml.
La densidad de celulas viables se puede determinar, por ejemplo, usando el metodo de exclusion con azul de tripano, por ejemplo, mediante el uso de un contador de celulas tal como esta comercialmente disponible, por 30 ejemplo, en Innovatis (contador de celulas Cedex).
Con cultivo celular se refiere al lfquido que comprende medio de cultivo celular, celulas y sustancia biologica, cuyo lfquido es el resultado de un proceso para el cultivo de celulas en un reactor en un medio de cultivo celular, en el que las celulas producen la sustancia biologica.
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La invencion se explicara ahora por medio de los siguientes ejemplos, sin embargo sin estar limitada a los mismos. Descripcion de las figuras
40 La figura 1/9 muestra la densidad de celulas viables Y (106.ml-1) representada graficamente frente al tiempo
del proceso X (dfas) para el proceso A (por lotes), B (por lotes alimentado) y C1 (proceso de la invencion).
La figura 2/9 muestra la concentracion de IgG en el reactor Z (% en comparacion con la concentracion de IgG en el proceso A) frente al tiempo del proceso X (dfas) para el proceso A (por lotes), B (por lotes alimentado) y C1 (proceso de la invencion).
45 La figura 3/9 muestra la densidad de celulas viables Y (106.ml-1) representada graficamente frente al tiempo
del proceso X (dfas) para el proceso A (por lotes), B (por lotes alimentado) y C2 (proceso de la invencion).
La figura 4/9 muestra la concentracion de IgG en el reactor Z (% en comparacion con la concentracion de IgG en el proceso A) frente al tiempo del proceso X (dfas) para el proceso A (por lotes), B (por lotes alimentado) y C2 (proceso de la invencion).
50 La figura 5/9 muestra la densidad de celulas viables Y (106.ml-1) representada graficamente frente al tiempo
del proceso X (dfas) para el proceso A (por lotes), B (por lotes alimentado) y C3 (proceso de la invencion).
La figura 6/9 muestra la concentracion de IgG en el reactor Z (% en comparacion con la concentracion de IgG en el proceso A3) frente al tiempo del proceso X (dfas) para los procesos A y C3.
La figura 7/9 muestra el rendimiento acumulativo Q (% en comparacion con el rendimiento en el proceso A, 55 por L de volumen de reactor) representado graficamente frente el tiempo del proceso X (dfas) para los
procesos A, B y C3.
La figura 8/9 muestra el numero de celulas Y (106.ml-1) representado graficamente frente el tiempo del proceso X (dfas) para C4 (proceso de la invencion).
La figura 9/9 muestra la concentracion de IgG en el reactor Z (% en comparacion con la concentracion
maxima de IgG alcanzada frente al tiempo del proceso X (dfas) para el proceso C4 (una realizacion del proceso de la invencion)
Ejemplos
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Ejemplo 1: Comparacion entre un proceso por lotes, un proceso por lotes alimentado y el proceso de acuerdo con la invencion
En este ejemplo, el rendimiento del proceso de acuerdo con la presente invencion se comparo con los procesos por 10 lotes y por lotes alimentado.
La figura 1/9 muestra la densidad de celulas viables Y (106.mM) representada graficamente frente al tiempo del proceso X (dfas) para el proceso A (por lotes), B (por lotes alimentado) y C1 (proceso de la invencion).
15 La figura 2/9 muestra la concentracion de IgG en el reactor Z (% en comparacion con la concentracion de IgG en el proceso A) frente al tiempo del proceso X (dfas) para el proceso A (por lotes), B (por lotes alimentado) y C1 (proceso de la invencion).
Todas las fermentaciones se realizaron utilizando un controlador Sartorius Biostat B para controlar la temperatura a 20 36,5 °C, el pH entre 7,2 y 6,8 y la DO a una saturacion del aire del 50 % y a 200 rpm. Se utilizo en todos los experimentos la misma lfnea celulas PER.C6 productora de IgG (vease el documento WO 2004/099396).
Proceso por lotes A
25 El proceso por lotes se ejecuto a un volumen de trabajo de 4 l en un recipiente Sartorius B5. Las celulas se inocularon a razon de 3 x 10e5 celulas/ml en medio VPRO (SAFC) complementado con L-glutamina 6 mM y posteriormente se cultivaron durante 17 dfas.
Proceso por lotes alimentado B 30
El proceso por lotes alimentado se ejecuto a un volumen de trabajo de 4 l en un recipiente Sartorius B5. Las celulas se inocularon a razon de 3 x 10e5 celulas/ml en medio VPRO (SAFC) complementado con L-glutamina 6 mM. Durante el cultivo se anadieron glucosa y glutamina para mantener la concentracion por encima de, respectivamente, 15 mM y 1 mM. Los aminoacidos y peptidos se anadieron a partir del dfa 5 para reponer los 35 aminoacidos consumidos.
Proceso de la invencion C1
El proceso de la invencion se realizo en un recipiente Applikon de 2 l. Se utilizo una membrana de fibra hueca con un 40 corte de peso molecular (MWCO) de 100 kDa obtenida de General Electric (GE) operada en modo de flujo ATF con un sistema ATF-2 (Refine Technology) para retener las celulas y el producto de IgG. El cultivo se inicio con 3 x 10e5 celulas/ml en medio VPRO (SAFC) complementado con L-glutamina 6 mM. El medio de cultivo VPRO (SAFC) complementado con L-glutamina 6 mM se perfundio a traves del cultivo celular en suspension utilizando una tasa de flujo especffica (SFR) de entre 0,05 y 0,2 nl/celula/dfa. La concentracion de producto mas elevada obtenida fue de 45 1,4 g/l.
El proceso de la invencion dio como resultado un aumento de las densidades de celulas viables y un aumento de las concentraciones de productos en comparacion con los modos de cultivo mencionados en menos tiempo, como puede verse en la figura 1 y la figura 2 a continuacion.
50
Ejemplo 2: Comparacion entre un proceso por lotes, un proceso por lotes alimentado y el proceso de acuerdo con la invencion
En este ejemplo, el proceso de acuerdo con la presente invencion se compara de nuevo con los procesos por lotes y 55 por lotes alimentado; en el proceso C2 se controla la presion de CO2 y se utilizo un sistema de separacion de 50 kDa.
La figura 3/9 muestra la densidad de celulas viables Y (106.ml-1) representada graficamente frente al tiempo de proceso X (dfas) para el proceso A (por lotes), B (por lotes alimentado) y C2 (proceso de la invencion).
La figura 4/9 muestra la concentracion de IgG en el reactor Z (% en comparacion con la concentracion de IgG en el proceso A) frente al tiempo de proceso X (dfas) para el proceso A (por lotes), B (por lotes alimentado) y C2 (proceso de la invencion).
5
Todas las fermentaciones se realizaron utilizando un controlador Sartorius Biostat B para controlar la temperatura a 36,5 °C, el pH entre 7,2 y 6,8 y la DO a una saturacion del aire del 50 % y a 200 rpm. Se utilizo en todos los experimentos la misma lmea celulas PER.C6 productora de IgG (de aproximadamente 150 kDa) (vease el documento WO 2004/099396).
10
Proceso por lotes A
El proceso por lotes se ejecuto a un volumen de trabajo de 4 l en un recipiente Sartorius B5. Las celulas se inocularon a razon de 3 x 105 celulas.ml'1 en medio VPRO (SAFC) suplementado con L-glutamina 6 mM y 15 posteriormente se cultivaron durante 17 dfas.
Proceso por lotes alimentado B
El proceso por lotes alimentado se ejecuto a un volumen de trabajo de 4 l en un recipiente Sartorius B5. Las celulas 20 se inocularon a razon de 3 x 105 celulas.ml-1 en medio VPRO (SAFC) complementado con L-glutamina 6 mM. Durante el cultivo se anadieron glucosa y glutamina para mantener la concentracion por encima de, respectivamente, 15 mM y 1 mM. Los aminoacidos y peptidos se anadieron a partir del dfa 5 para reponer los aminoacidos consumidos.
25 Proceso de la invencion C2
El proceso de la invencion se realizo en un recipiente Applikon de 2 l. Se utilizo una membrana de fibra hueca con un corte de peso molecular (MWCO) de 50 kDa (GE) operada en modo de flujo ATF con un sistema ATF-2 (Refine Technology) para retener las celulas y el producto de IgG. El cultivo se inicio con 3 x 10e5 celulas/ml en medio 30 VPRO (SAFC) complementado con L-glutamina 6 mM. El medio de cultivo VPRO (SAFC) complementado con L- glutamina 6 mM se perfunde a traves del cultivo celular en suspension utilizando una SFR de entre 0,05 y 0,2 nl.celula'Ldia-1. La presion de CO2 se controlo por debajo del 15 %.
Resultado
35
Como puede verse en la figura 3/9 y en la figura 4/9, el proceso de acuerdo con la invencion da como resultado densidades de celulas viables significativamente aumentadas y concentraciones de producto aumentadas (2415 % x rendimiento por lotes; 690 % x rendimiento por lotes alimentado) en tiempo igual o inferior (tiempo por lotes al 100 %; tiempo por lotes alimentado al 81 %).
40
El aumento de la productividad global en g.M^a'1 del proceso de la invencion es 23,9 veces la productividad por lotes en g.M^a'1 y 8,5 veces la productividad por lotes alimentada en g.M^a'1. En el proceso de la invencion C2, se produjeron 11,1 g de producto/l. La obstruccion del dispositivo de retencion no se produjo durante 17 dfas, incluso con muy alta densidad celular.
45
Ejemplo 3: Comparacion entre un proceso por lotes, un proceso por lotes alimentado y el proceso de acuerdo con la invencion
En este ejemplo, el rendimiento del proceso de acuerdo con la presente invencion con eliminacion del cultivo celular 50 se compara de nuevo con los procesos por lotes y por lotes alimentado; en el proceso C3 se ha eliminado el cultivo celular.
La figura 5/9 muestra la densidad de celulas viables Y (106.ml-1) representada graficamente frente al tiempo de proceso X (dfas) para el proceso A (por lotes), B (por lotes alimentado) y C3 (proceso de la invencion).
55
La figura 6/9 muestra la concentracion de IgG en el reactor Z (% en comparacion con la concentracion de IgG en el proceso A3) frente al tiempo de proceso X (dfas) para los procesos A y c3.
La figura 7/9 muestra el rendimiento acumulativo Q (% en comparacion con el rendimiento en el proceso A, por L de
volumen de reactor) representado graficamente frente al tiempo de proceso X (dfas) para los procesos A, B y C3.
Todas las fermentaciones se realizaron utilizando un controlador Sartorius Biostat B para controlar la temperatura a 36,5 °C, el pH entre 7,2 y 6,8 y la DO a una saturacion del aire del 50 % y a 200 rpm. Se utilizo en todos los 5 experimentos la misma lfnea celulas PER.C6 productora de IgG (de aproximadamente 150 kDa) (vease el documento WO 2004/099396).
Proceso por lotes A
10 El proceso por lotes se ejecuto a un volumen de trabajo de 4 l en un recipiente Sartorius B5. Las celulas se inocularon a razon de 3 x 105 celulas.ml-1 en medio VPRO (SAFC) complementado con L-glutamina 6 mM y posteriormente se cultivaron durante 17 dfas.
Proceso por lotes alimentado B 15
El proceso por lotes alimentado se ejecuto a un volumen de trabajo de 4 l en un recipiente Sartorius B5. Las celulas se inocularon a razon de 3 x 105 celulas.ml-1 en medio VPRO (SAFC) complementado con L-glutamina 6 mM. Durante el cultivo se anadieron glucosa y glutamina para mantener la concentracion por encima de, respectivamente, 15 mM y 1 mM. Los aminoacidos y peptidos se anadieron a partir del dfa 5 para reponer los 20 aminoacidos consumidos.
Proceso de la invencion C3
El proceso de la invencion se realizo en un recipiente Applikon de 2 l. Se utilizo una membrana de fibra hueca con un 25 corte de peso molecular (MWCO) de 100 kDa (GE) operada en modo de flujo ATF con un sistema ATF-2 (Refine Technology) para retener las celulas y el producto de IgG. El cultivo se inicio con 3 x 10e5 celulas/ml en medio VPRO (SAFC) complementado con L-glutamina 6 mM. El medio de cultivo VPRO (SAFC) complementado con L- glutamina 6 mM se perfunde a traves del cultivo celular en suspension utilizando una SFR de entre 0,05 y 0,2 nl.celula-1.dfa-1. El cultivo celular se retira al 10 % del volumen de trabajo por dfa por encima de 10.106 celulas.ml' 30 1 y al 30 % del volumen de trabajo por dfa cuando la densidad de celulas viables excede de 30.106 celulas.ml-1 y en adelante.
Resultado
35 Como puede verse en la figura 5/9, con el proceso de la Invencion se alcanzan rapidamente densidades de celulas viables superiores. Ademas, la figura 5/9 tambien muestra que la viabilidad de las celulas se puede mantener durante mas tiempo con el proceso de la invencion, dado que el proceso C3 se mantuvo en funcionamiento a lo largo de un perfodo de casi 40 dfas, porque no se produjo obstruccion del dispositivo de retencion, incluso con altas densidades de celulas.
40
La figura 6/9 muestra que las concentraciones de producto para el procedimiento de la presente invencion son mucho mas altas que la concentracion del producto en el proceso por lotes. El flujo de producto que contenfa el producto se recogio del proceso C3 en aproximadamente de un 200 % a 250 % veces la concentracion final en el proceso por lotes A.
45
La figura 7/9 muestra que la mayorfa del producto se forma por el proceso de la presente invencion y que el proceso de la invencion se puede mantener mas tiempo que el proceso por lotes A o por lotes alimentado B. El dfa 17, el rendimiento acumulativo del proceso C3 es 8,1 veces el rendimiento acumulativo del proceso por lotes (A3) y 2,1 veces el rendimiento acumulativo del proceso por lotes alimentado (B). Ademas, el dfa 17, finalizo el proceso por 50 lotes. El dfa 21, el rendimiento acumulativo del proceso C3 es 3,0 veces el rendimiento acumulativo del proceso por lotes alimentado B. El dfa 21, finalizo el proceso por lotes alimentado. Despues de 39 dfas, el rendimiento acumulativo global del proceso C3 es 25 veces el rendimiento acumulativo del proceso por lotes A y 6 veces el rendimiento del proceso por lotes alimentado B.
55 Se puede concluir a partir de este experimento que el rendimiento global de un material biologico deseado en el proceso de acuerdo con la presente invencion puede mejorarse adicionalmente mediante la aplicacion de una sangrfa del cultivo celular cuando la densidad celular excede un cierto nivel alto.
Ejemplo 4: Cultivo de y produccion con celulas CHO.
En este ejemplo el proceso de acuerdo con la presente invencion se ha realizado con una linea celular CHO productora de IgG e incluye una cafda de temperatura para disminuir el crecimiento celular.
5 La figura 8/9 muestra el numero de celulas Y (106.mM) representado graficamente frente el tiempo de proceso X (dfas) para C4 (proceso de la invencion).
La figura 9/9 muestra la concentracion de IgG en el reactor Z (% en comparacion con la concentracion maxima de IgG alcanzada frente al tiempo de proceso X (dfas) para el proceso C4 (una realizacion del proceso de la invencion).
10
La fermentacion se realizo utilizando un controlador Sartorius Biostat B para controlar la temperatura a 36,5 °C, el pH entre 7,1 y 6,9 y la DO a una saturacion del aire del 40 % y a 100 rpm. La temperatura se hizo descender a 32 °C el dfa 5.
15 Proceso de la invencion C4
El proceso de la invencion se realizo en un recipiente Applikon de 2 l. El dispositivo de retencion de celulas y producto es una membrana de fibra hueca (General Electric) con un corte de peso molecular (MWCO) de 50 kD operada en modo de flujo ATF con un sistema ATF-2 (Refine Technology). El cultivo se inicio con 5.106 celulas.mM 20 en medio de cultivo MTCM-49 (Hyclone). El medio se perfundio a traves del cultivo celular en suspension utilizando una SFR entre 0,1 y 0,4 nl.celula-1.dfa-1. La presion de CO2 se controlo por debajo del 15 %.
Resultado
25 Los datos muestran que el proceso de la invencion tambien funciona cuando se utiliza una linea celular CHO productora de protefnas. La densidad celular lograda y las concentraciones de los productos estan aumentadas en comparacion con el cultivo por lotes. Los datos tambien demuestran que en el proceso de acuerdo con la presente invencion se puede detener el crecimiento celular (por ejemplo, mediante una cafda de la temperatura), mientras que continua la acumulacion de producto en el sistema de cultivo.
30
Ejemplo 5: Proceso de la invencion realizado con una linea celular de mieloma.
El proceso de acuerdo con la presente invencion tambien puede aplicarse a lfneas celulares de mieloma. Para este fin, la fermentacion se realiza utilizando un controlador Sartorius Biostat B para controlar la temperatura a 36,5 °C, el
35 pH entre 7,2 y 6,8 y la DO a una saturacion del aire del 40 % y a 100 rpm. El cultivo de las celulas comienza con la
inoculacion de las celulas de mieloma a razon de 3 x 10e5 celulas/ml en medio de cultivo SFM4Mab (Hyclone) en un recipiente Sartorius de 5 l. El dispositivo de retencion de celulas y producto es una membrana de fibra hueca (General Electric) con un corte de peso molecular (MWCO) de 30 kD operada en modo de flujo ATF con un sistema ATF-4 (Refine Technology). El medio de cultivo SFM4Mab (Hyclone) se perfunde a traves del cultivo celular en 40 suspension usando una SPR de entre 0,1 y 0,4 nl.celula-1.dfa-1. La presion de CO2 se controla por debajo del 15 %.
Ejemplo 6: Proceso de la invencion realizado con una linea celular MDCK.
El procedimiento de acuerdo con la presente invencion tambien puede aplicarse a lfneas celulares MDCK. Para este 45 fin, la fermentacion se realiza utilizando un controlador Sartorius Biostat B para controlar la temperatura a 36,5 °C, el pH entre 7,2 y 6,8 y la DO a una saturacion del aire del 40 % y a 100 rpm. El cultivo de las celulas comienza con la
inoculacion de las celulas MCDK transformadas a razon de 3 x 10e5 celulas/ml en medio de cultivo VP-SFM
(Invitrogen) en un recipiente Sartorius de 5 l. El dispositivo de retencion de celulas y producto es una membrana de fibra hueca (General Electric) con un corte de peso molecular (MWCO) de 30 kD operada en modo de flujo ATF con 50 un sistema ATF-4 (Refine Technology). El medio de cultivo VP-SFM (Invitrogen) se perfunde a traves del cultivo celular en suspension usando una SPR de entre 0,1 y 0,4 nl.celula'Tdfa'1. La presion de CO2 se controla por debajo del 15 %.

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Proceso para el cultivo de celulas eucariotas en un reactor en suspension en un medio de cultivo celular,
    5 en el que las celulas producen una sustancia biologica deseada, seleccionada de protemas y vacunas, que puede usarse como un principio activo en una preparacion farmaceutica,
    en el que al menos un componente del medio de cultivo celular se alimenta al cultivo celular, y en el que el cultivo celular que comprende las celulas, la sustancia biologica deseada y el medio de cultivo celular se hace circular por un filtro usando un flujo tangencial, y en el que el filtro tiene un tamano de poro caracterizado por 10 un corte de peso molecular menor que el peso molecular de la sustancia biologica deseada para separar la sustancia biologica deseada de sustancias que tienen un peso molecular menor que la sustancia biologica deseada, en el que el flujo de salida de lfquido del filtro contiene esencialmente solo componente que tienen un peso molecular menor que el de la sustancia biologica deseada, y en el que la sustancia biologica deseada se retiene en o se retroalimenta al reactor.
    15
  2. 2. Proceso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el corte de peso molecular es menor en al menos un factor de 2 que el peso molecular de la sustancia biologica deseada.
  3. 3. Proceso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el que el corte de peso molecular es menor en al 20 menos un factor de 3 que el peso molecular de la sustancia biologica deseada.
  4. 4. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, en el que la sustancia biologica deseada esta codificada por al menos un gen transfectado en las celulas.
    25 5. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en el que la sustancia biologica
    deseada es una IgG.
  5. 6. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, en el que las celulas eucariotas son celulas de mairnfero.
    30
  6. 7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que las celulas de mai^ero son celulas CHO, hibridomas, celulas BHK, celulas de mieloma, celulas humanas o celulas de raton.
  7. 8. Proceso de acuerdo con la reivindicacion 7, en el que las celulas humanas son celulas HEK-293, 35 celulas linfoblastoides humanas o celulas HER inmortalizadas por e1.
  8. 9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 7, en el que las celulas de raton son celulas NS0.
  9. 10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 7, en el que las celulas de mai^ero son celulas CHO. 40
  10. 11. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 10, en el que la sustancia biologica deseada se recolectar de las celulas y/o del cultivo celular.
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