ES2581902T3 - Derivatización N-terminal de insulina con ácido polisiálico - Google Patents

Derivatización N-terminal de insulina con ácido polisiálico Download PDF

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Abstract

Una composición que comprende una población de derivados polisacáridos de una proteína, en donde la proteína es insulina o una proteína similar a la insulina, en donde la proteína similar a la insulina es un homólogo de insulina que tiene al menos 50% de la actividad de la insulina y tiene 90% o más de de identidad de secuencia a nivel de aminoácidos con la sec. con núm. de ident.: 1, en donde el polisacárido es ácido polisiálico, que comprende entre 2 y 125 unidades de ácido siálico, y en donde al menos 85% de los derivados de la proteína se derivatizan sólo en el N-terminal de la cadena B de la proteína de insulina o similar a la insulina.

Description

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DESCRIPCION
Derivatizacion N-terminal de insulina con acido polisialico
La presente invencion se refiere a nuevos derivados de polisacaridos de insulina y a los metodos para producir tales derivados. Los derivados son utiles para mejorar la estabilidad, farmacocinetica y farmacodinamica de la insulina.
La diabetes es un trastorno del metabolismo de los carbohidratos y es el resultado de la produccion insuficiente de, o la reduccion de la sensibilidad a la insulina. La insulina se sintetiza en las celulas beta de los islotes pancreaticos de Langerhans y es necesaria para el uso normal de la glucosa por la mayona de las celulas en el cuerpo. En personas con diabetes, se inhibe la capacidad normal para usar la glucosa, lo que aumenta los niveles de azucar en la sangre (hiperglucemia).
Existen dos variedades de la diabetes. El tipo I es la diabetes mellitus dependiente de insulina, o IDDM. La IDDM se conoda anteriormente como diabetes con inicio en la juventud. En la IDDM, la insulina no es secretada por el pancreas y debe ser proporcionada desde una fuente externa. La diabetes con inicio en edad adulta Tipo II puede controlarse normalmente con la dieta, aunque en algunos casos avanzados se requiere insulina.
Antes del aislamiento de la insulina en la decada de 1920, la mayona de los pacientes monan en de un corto penodo de tiempo despues de la aparicion de la enfermedad. La diabetes no tratada conduce a la cetosis, la acumulacion de cetonas (productos de descomposicion de las grasas) en la sangre; esto es seguido por acidosis (acumulacion de acido en la sangre) con nauseas y vomitos. A medida que los productos toxicos de los carbohidratos desordenados y del metabolismo de las grasas se siguen acumulando, el paciente entra en coma diabetico.
El tratamiento de la diabetes requiere generalmente de inyecciones regulares de insulina. Esto resulta en una mejona clmica, dramatica para salvar la vida. Sin embargo, debido a la incomodidad de las inyecciones de insulina, la insulina ha sido el foco de esfuerzos masivos para mejorar su administracion y la bioacumulacion.
La molecula de insulina consta de dos cadenas de aminoacidos unidos por enlaces disulfuro (pm 5804). Las cpelulas-[beta] de los islotes pancreaticos secretan un solo precursor de la cadena de insulina, conocido como proinsulina. La proteolisis de la proinsulina resulta en la eliminacion de cuatro aminoacidos basicos (numeros 31, 32, 64 y 65 en la cadena proinsulina: Arg, Arg, Lys, Arg respectivamente) y el polipeptido conector ("C"). En la molecula de insulina de dos cadenas resultante, la cadena A tiene glicina en el extremo amino, y la cadena B tiene fenilalanina en el extremo amino.
La insulina puede existir como un monomero, dfmero o un hexamero formado a partir de tres de los dfmeros. El hexamero se coordina con dos atomos de Zn2+. La actividad biologica reside en el monomero. Aunque hasta hace poco se uso la insulina bovina y porcina casi exclusivamente para tratar la diabetes en humanos, se conocen numerosas variaciones en la insulina entre especies. La insulina porcina es la mas similar a la insulina humana, de la que difiere solo en que tiene una alanina en lugar del residuo de treonina en el C-terminal de la cadena B. A pesar de estas diferencias la mayona de la insulina de mamffero tiene una actividad espedfica comparable. Hasta hace poco, los extractos animales proporcionaban toda la insulina usada para el tratamiento de la enfermedad. El advenimiento de la tecnologfa recombinante permite la fabricacion a escala comercial de la insulina humana (por ejemplo, insulina Humulin(TM), disponible comercialmente de Eli Lilly and Company, Indianapolis, Ind).
Se han realizado intentos para derivatizar la insulina para mejorar sus propiedades farmacocineticas. Existe un producto en el mercado, PEG-insulina (Nektar Therapeutics). El PEG es un polfmero neutro, soluble en agua, no toxico que comprende cualquier numero de unidades de repeticion de oxido de etileno. La PEGilacion se disena para aumentar el tamano de la molecula activa y en ultima instancia, mejorar el rendimiento de los farmacos mediante la optimizacion de la farmacocinetica, el aumento de la biodisponibilidad, y la disminucion de la inmunogenicidad y la frecuencia de dosificacion. El diseno y desarrollo de PEG-insulina se describe adicionalmente en WO2004091494.
Se conoce una variedad de metodos para la produccion de derivados de insulina PEGilados. Davis y otros, (patente de Estados Unidos num. 4,179,337) describen la smtesis de una construccion de PEG-insulina usando tricloro-s- triazina (cloruro cianurico) como el enlazador entre el PEG y la protema. Siguen un esquema sintetico en el que un gran exceso (50 veces) de PEG activado con cloruro cianurico (2000 Da) se hizo reaccionar con la insulina en tampon de borato (pH 9.2) durante 2 horas. Los inventores fueron capaces de producir conjugados de PEG-insulina parcialmente activos (aproximadamente 50%), que eran no inmunogenicos y no antigenicos. Obermeier y otros, (Patente canadiense num. 1,156,217), encontro que la preparacion de conjugados de PEG-insulina de acuerdo con la patente de Davis mencionada anteriormente produda una mezcla no uniforme de conjugados que contienen aproximadamente 50% de tri-PEG-insulina, y las otras combinaciones posibles de derivados de PEG-insulina (mono- y di-PEG-insulinas) no fueron sustituidas en el residuo PheB1.
Obermeier y otros, (Patente canadiense num. 1,156,217) describe la smtesis de conjugados de PEG-insulina
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modificada espedficamente en el residuo PheBI. La base de su invencion implica la proteccion de las aminas reactivas en los residuos GlyA1 y LysB29 con grupos terc-butiloxicarbonilo (t-Boc) o metilsulfoniletiloxicarbonilo (Msc) en disolventes organicos (por ejemplo, DMF, DMSO, piridina, etc.) bajo condiciones alcalinas. A partir de la mezcla compleja de (mono-, di-, y tri-) insulinas protegidas la especie de insulina N.sup..alpha.A1, N.sup..epsilon.B29-bis-protegida se aislo por tecnicas cromatograficas convencionales. A partir del aislamiento, la insulina N.sup..alpha.A1, N.sup..epsilon.B29-bis-protegida pura se hizo reaccionar con (por ejemplo, cloruro acido o isocianato) un derivado activado de PEG con la eliminacion posterior de los grupos protectores mediante el uso de tecnicas comunes para la qmmica de peptidos. Los inventores observaron que los grupos amino de GlyAI and LysB29 fueron mas reactivos que el grupo amino de PheBI bajo condiciones de reaccion alcalinas. Determinaron que sus conjugados de mPEG(1500)-B1-insulina espedficos de sitio teman un 100% de efecto de la insulina (calculado sobre una base molar) en la reduccion de los niveles de azucar en la sangre en los conejos.
Geiger y otros, (1980) y Ehrat y otros, (1983) describen aductos de PEG-insulina espedficamente modificados en el residuo PheBI preparados mediante el uso de un esquema proteccion/conjugacion/desproteccion similar al metodo de multiples etapas descrito por Obermeier y otros, Geiger y otros, y Ehrat y otros, y observaron que el conjugado de PEG(1500)-B1-insulina era mucho menos antigenico y mucho mas estable (para las enzimas hepaticas) que la insulina nativa. Otras preparaciones de PEG-insulina (Caliceti y otros, 1999; Uchio y otros, 1999; Hinds y otros, 2002 son: 1) centradas en los esquemas basicos de proteccion/conjugacion/desproteccion de tres etapas mencionadas anteriormente, 2) resultan en modificacion no espedfica de la molecula de insulina, o 3) no producen los conjugados mas eficaces, es decir, PEG-B1-insulinas.
Liu y otros, (patente de Estados Unidos num. 6,323,311 B1) describen un metodo util para la smtesis de conjugados de PEG-B1-insulina. This method is an extension of the Obermeier esquemas de proteccion/conjugacion/desproteccion de tres etapas, pero no requiere el aislamiento de productos intermedios de reaccion entre las etapas (es decir, smtesis en un solo recipiente). Por lo tanto, la insulina esta protegida en los residuos GlyA1 y LysB29, reacciono inmediatamente con PEG, y posteriormente se desprotege antes de cualquier aislamiento de especies. Los inventores reivindican que su reaccion en un solo recipiente puede producir hasta 50% del isomero posicional correcto (es decir, PEG-B1-insulina) y 30% de insulina sin reaccionar que puede ser reciclada para la derivatizacion posterior. Suponiendo que la preparacion de estas construcciones se lleva a cabo de forma acelerada, se necesitanan por lo menos cinco dfas para la terminacion. Ademas, la invencion requiere grandes excesos de reactivo de PEG para alcanzar resultados aceptables. Aunque los productos de esta invencion pueden ser eficaces, su preparacion requiere todavfa que la protema se someta a tres etapas de reaccion en entornos adversos a las protemas (alto y bajo pH) durante periodos de tiempo extendidos.
La invencion en US2007083006 se dirige a las deficiencias de los metodos de la tecnica anterior para la PEGilacion de las insulinas proporcionando un metodo por la preparacion sencilla de derivados de insulina de alta pureza espedficamente PEGilados en el extremo N-terminal de la cadena B de la insulina (PheB1) en una sola etapa. En contraste a la experiencia previa (por ejemplo, Caliceti y Otros, 1999, supra), que indican que la PEGilacion en PheB1 es el producto de reaccion menos probable, el presente metodo emplea condiciones espedficas de control del pH, el uso de un quelante de iones metalicos y la adicion de disolvente organico para mejorar la reactividad relativa del terminal amino PheB1 en donde este se convierte en el sitio predominante de PEGilacion. Considerando las numerosas propiedades beneficiosas impartidas a la insulina (por ejemplo, disminucion de la inmunogenicidad/antigenicidad; aumento proteolftico, estabilidad ffsica y qmmica; aumento de la vida media de circulacion; aumento de la solubilidad acuosa/organica; actividad biologica completa) a traves de la PEGilacion espedfica de sitio en el residuo PheB1, un proceso simple, rentable y facilmente escalable para lograr este resultado sena un avance significativo en la tecnica.
En vista de la tecnica anterior, existe una necesidad de proporcionar mejores derivados de insulina que pueden usarse en la terapia humana y animal y tienen estabilidad, vida media optimizada y baja toxicidad. Hemos encontrado que la union de los PSA a la insulina imparte tales propiedades.
Los acidos polisialicos (PSA) son polfmeros no ramificados de acido sialico de origen natural producidos por ciertas cepas bacterianas y en los mamfferos en ciertas celulas. Pueden producirse en varios grados de polimerizacion de n = aproximadamente 80 o mas residuos de acido sialico hacia abajo a n = 2 mediante hidrolisis acida limitada o mediante digestion con neuraminidasa, o mediante fraccionamiento de las formas del polfmero natural, derivadas de bacterias.
En anos recientes, las propiedades biologicas de los acidos polisialicos, particularmente las del acido polisialico homopolimerico alfa-2,8 enlazado, han sido explotadas para modificar las propiedades farmacocineticas de las protemas y moleculas de bajo peso molecular del farmaco. La derivatizacion del acido polisialico da lugar a mejoras espectaculares en la vida media en circulacion de un numero de protemas terapeuticas, que incluyen la catalasa y la asparaginasa, y permite ademas que tales protemas se usen en vista de que los anticuerpos pre-existentes aumentan como una consecuencia indeseable (y a veces inevitable) de la exposicion previa a la protema terapeutica [Fernandes and Gregoriadis, 1996, 1997]. El acido polisialico alfa-2,8 enlazado ofrece una alternativa atractiva a PEG, es un polfmero biodegradable inmunologicamente invisible que es parte natural del cuerpo humano, y el cual se degrada a traves de neuraminidasas de tejido a acido sialico, un sacarido no toxico.
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Hemos descrito previamente metodos para la fijacion de polisacaridos (en particular PSA) a los agentes terapeuticos, tales como las protemas [documentosUS-A-5846,951; WO-A-0187922. Algunos de estos metodos dependen tras la derivatizacion qmmica del extremo 'no reductor' del poKmero para crear una porcion aldehudo reactiva de la protema que reacciona en los grupos de amina primaria. Una unidad terminal de acido sialico no reductor, ya que contiene dioles vecinales, puede oxidarse facilmente (y selectivamente) con peryodato para producir una forma mono-aldehudo, que es mucho mas reactivo hacia las protemas, y que comprende un elemento adecuadamente reactivo para la union de protemas a traves de la aminacion reductora y otras qmmicas. La reaccion se ilustra en las Figuras 1 y 2 en donde
La Figura 1 muestra la oxidacion del acido colommico (acido polisialico alfa-2,8 enlazado de E. coli) con peryodato de sodio para formar un aldehudo reactivo de la protema en el extremo no reductor; y
La Figura 2 muestra la reduccion selectiva de la base de Schiff con cianoborohidruro de sodio para formar un enlace covalente irreversible estable con el grupo amino de la protema.
Los inventores han descrito en publicaciones previas, por ejemplo en Biochimica et Biophysica Acta (2003), la smtesis de la insulina polisialiladas. En esta referencia acido colommico de 22 kDa y 39 kDa se oxidan y reaccionan con los grupos amino de la insulina humana recombinante. La polidispersidad de los CA usados es 1.33 y 1.40, que es demasiado grande para uso terapeutico.
Tambien hemos descrito en nuestra solicitud de patente anterior, publicada como WO2005/016974, la smtesis de conjugados de acido colommico-insulina. Sin embargo, en esta solicitud, los conjugados no son todos espedficamente N-terminal, y se produce una variedad de conjugados.
Los subproductos pueden generarse de manera no intencional durante las reacciones de conjugacion convencionales descritas anteriormente mediante por ejemplo, la reaccion del acido colommico con cadenas laterales de aminoacidos. Estos pueden ser suficientes para ser problematicos en la fabricacion de los conjugados qmmicamente definidos de acuerdo con las autoridades reguladoras para el uso terapeutico en el hombre y los animales.
No es sencillo purificar el producto de reaccion previsto (por ejemplo el producto monopolisialilado) separado de los diferentes productos no deseados, ya que las caractensticas fisicoqmmicas de la mayor parte de los productos de reaccion son similares. Esto significa que las tecnicas como la cromatograffa de intercambio ionico y cromatograffa de permeacion en gel (que separan sobre la base de la carga y tamano respectivamente) producen perfiles de purificacion pobres.
De acuerdo con el primer aspecto de la invencion, se proporciona una composicion que comprende una poblacion de derivados de polisacaridos de una protema, en donde la protema es insulina o una protema similar a la insulina, en donde la protema similar a la insulina es un homologo de insulina que tiene al menos 50 % de actividad de la insulina y tiene 90% o mas de identidad de secuencia a nivel de aminoacidos con la sec. con num. de ident.: 1, en donde el polisacarido es acido polisialico, que comprende entre 2 y 125 unidades de acido sialico, y en donde al menos 85% de los derivados de la protema se derivatizan solo en el N-terminal de la cadena B de la insulina o de la protema similar a la insulina.
De aqrn en adelante, cuando se usa el termino insulina, se pretende cubrir tambien las protemas similares a la insulina. Por protema similar a la insulina, se entiende una protema que tiene una actividad equivalente a la de insulina. La insulina disminuye ffpicamente la concentracion de glucosa en la sangre. Tambien aumenta la permeabilidad celular a monosacaridos, aminoacidos y acidos grasos, y acelera la glucolisis, el ciclo de las pentosas fosfato y la smtesis de glucogeno en el hffgado. La protema similar a la insulina tiene al menos 50% de la actividad de la insulina humana derivada de Swissprot con numero de acceso P01308.
Los mutantes de insulina que tienen la actividad requerida, como se detallo anteriormente, pueden usarse tambien. Una protema "similar a la insulina" es un "homologo de insulina". Si dos secuencias son homologas se calcula de forma rutinaria usando un porcentaje de similitud o identidad, terminos que son bien conocidos en la tecnica. Las secuencias deben ser comparadas con la sec. con num. de ident.: 1 que es el precursor no procesado de la insulina humana. Los residuos 25-54 corresponden a la cadena de insulina B y los residuos 90-110 corresponden a la cadena de insulina A. Las secuencias homologas tambien pueden compararse con la forma activa de la insulina humana.
Los homologos de la invencion tienen 90% o mas de identidad a nivel de aminoacidos. Un numero de programas estan disponibles para calcular la similitud o identidad; programas preferidos son los programas BLASTn, BLASTp y BLASTX, corren con los parametros por defecto, disponibles en
www.ncbi.nlm.nih.gov. Por ejemplo, 2 secuencias de aminoacidos pueden compararse usando el programa BLASTn con parametros por defecto (puntuacion = 100, longitud de palabra = 11, valor esperado = 11, filtro de baja complejidad = encendido). Los niveles de homologfa anteriores se calculan usando estos parametros por defecto.
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La insulina puede ser natural, es dedr, derivada de un ser humano o animal, o sintetica, por ejemplo obtenida por un metodo recombinante.
Como es bien conocido en la tecnica, la insulina comprende dos cadenas de peptidos. En esta invencion, la insulina se derivatiza con el polisacarido en el extremo N-terminal de su cadena B.
Por "poblacion" se entiende que existe mas de un derivado de polisacarido en la composicion. Los derivados pueden comprender los mismos o diferentes numeros de unidades de sacaridos. Preferentemente, la polidispersidad del polisacarido en la composicion es menos de 1.3, con mayor preferencia menos de 1.1.
En la poblacion, esencialmente todo de las protemas se derivatiza solamente en el extremo N-terminal. Puesto que hay dos cadenas de peptidos en la insulina, hay dos unidades N terminales. Preferentemente, al menos 85%, mas preferentemente al menos 90%, mas preferentemente al menos 95% de las cadenas B en la poblacion se derivatizan en el extremo N-terminal con el polisacarido anionico. El N-terminal de las cadenas A no necesita ser derivatizado.
El grado de derivatizacion en el N-terminal puede determinarse mediante tecnicas estandar en la tecnica tales como mapeo de peptidos o degradacion de Edman.
Preferentemente, el polisacarido anionico tiene al menos 2, con mayor preferencia al menos 5, Mas preferentemente al menos 10, por ejemplo al menos 50 unidades de sacarido.
El polisacarido es acido polisialico y preferentemente consiste esencialmente solamente de unidades de acido sialico. Sin embargo, el polisacarido puede tener unidades distintas de acido sialico en la molecula. Por ejemplo, las unidades de acido sialico pueden alternar con otras unidades de sacarido. Preferentemente, sin embargo, el polisacarido consiste esencialmente en unidades de acido sialico.
El polisacarido es un acido polisialico, o sea, un polisacarido que comprende al menos 2 unidades de acido sialico unidas entre sf a traves de enlaces a-2-8 o a-2-9. Un acido polisialico adecuado tiene un peso molecular promedio en peso en el intervalo de 2 a 100 kDa, preferentemente en el intervalo de 1 a 35 kDa. El acido polisialico mas preferido tiene un peso molecular en el intervalo de 10 a 20 kDa, tfpicamente de aproximadamente 14 kDa. Mas preferentemente, el acido polisialico se deriva de una fuente bacteriana, por ejemplo el polisacarido B de E. coli Kl, N. meningitidis, Maraxella liquefaciens o Pasteurella aeruginosa o polisacarido K92 de la cepa de E. coli K92. Con la maxima preferencia es el acido colommico de E. coli K1.
El acido polisialico puede estar en forma de una sal o del acido libre. Puede estar en una forma hidrolizada, de manera que el peso molecular se ha reducido despues de la recuperacion a partir de una fuente bacteriana. El acido polisialico puede ser el material que tiene una amplia difusion de pesos moleculares tales como los que tienen una polidispersidad de mas de 1.3, por ejemplo tanto como 2 o mas. Preferentemente, la polidispersidad de peso molecular es de menos de 1.3 o 1.2, preferentemente menos de 1.1, por ejemplo tan bajo como 1.01.
Tfpicamente, el compuesto de esta invencion es un derivado de acido polisialico de la insulina y comprende 2-125 unidades de acido sialico. Mas tfpicamente, el compuesto comprende 10-80 unidades de acido sialico, preferentemente 20 a 60 unidades de acido sialico, lo mas preferentemente 40-50 unidades de acido sialico.
Los derivados de polisacarido en el primer aspecto de esta invencion son conjugados enlazados covalentemente entre el N-terminal de insulina y un polisacarido anionico. El enlace covalente puede ser un enlace amida entre un grupo carboxilo y un grupo amino. Otro enlace por el que la insulina puede unirse de forma covalente al polisacarido es a traves de una base de Schiff. Los grupos adecuados para conjugar a las aminas se describen adicionalmente en el documento WO2006/016168.
En la invencion, el polisacarido puede ser un polisacarido de origen natural, o un derivado de un polisacarido de origen natural, por ejemplo, un polisacarido que se ha derivatizado mediante una reaccion de uno o mas grupos activos en los residuos de sacarido, o que se ha unido covalentemente a un grupo de derivatizacion en el extremo de la cadena de polisacarido.
El polisacarido puede unirse a la insulina a traves de su unidad terminal reductora o no reductora.
Los metodos para unir los polisacaridos a las protemas son bien conocidos en la tecnica y se describen con mas detalle en el documento WO92/22331 y WO-A-0187922. Los metodos preferidos en esta invencion se describen con mas detalle a continuacion. Los metodos se describen ademas en las Figuras 1 y 2 de esta solicitud.
El polisacarido puede estar unido a la insulina a traves de su unidad terminal reductora y no-reductora. Esto significa que una cadena de polisacarido puede enlazarse a dos protemas insulina, es decir, derivatizarse tanto en su extremo reductor como no reductor.
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El polisacarido puede enlazarse al peptido de insulina directamente, es dedr, como se muestra en las Figuras 1 y 2, o a traves de un enlazador. Los enlazadores adecuados se derivan de reactivos que contienen N-maleimida, vinilsulfona, N-yodoacetamida, ortopiridilo o N-hidroxisuccinimida. El enlazador puede ser bioestable o biodegradable y comprender, por ejemplo, un polipeptido o un oligomero sintetico. El enlazador puede derivarse de una porcion bifuncional, como se describio adicionalmente en el documento WO2005/016973. Un reactivo bifuncional adecuado es, por ejemplo, Bis-NHS. El reactivo puede tener la formula general Z-R1-Z en donde cada Z es un grupo funcional y puede ser el mismo o diferente y R1 es un radical organico bifuncional. Preferentemente, R1 se selecciona del grupo que consiste en alcanodiilo, arileno, alcarileno, heteroarileno y alquilheteroarileno, cualquiera de los cuales puede sustituirse y/o interrumpirse por carbonilo, ester, sulfuro, eter, amida y/o enlaces de amina. Particularmente se prefiere alcanodiilo de C3-C6. Mas preferentemente, R1 corresponde a la porcion apropiada del reactivo bifuncional adecuado.
Un derivado de polisacarido preferido es el de formula general (I)
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en donde m es 1-124;
HNB se deriva de B-NH2 que es el N-terminal de la insulina o un peptido similar a la insulina;
L es un enlace, un grupo de enlace, o comprende un polipeptido o un oligomero sintetico;
GlyO es una unidad de acido sialico;
en donde el grupo de enlace, si esta presente, es de la formula general -Y-C(O)-R1-C(O)-;
en donde Y es NR2 o NR2-NR2 y R1 es un radical organico bifuncional como se definio anteriormente; y R2 es H o alquilo de C1-6.
En este aspecto de la invencion, la insulina se enlaza al extremo no reductor del polisacarido. La unidad de polisacarido terminal es una unidad de acido sialico. Las otras unidades de sacarido en el polisacarido se representan por GLyO y pueden ser el mismo o diferente. Cuando la insulina se une directamente al polisacarido, el grupo L es un enlace. Sin embargo, el grupo L, alternativamente, puede derivarse de un reactivo que contiene N- maleimida, vinilsulfona, N-yodoacetamida, ortopiridilo 0 N-hidroxisuccinimida. El reactivo puede tener la formula general Z-R1-Z como se definio anteriormente. En esta modalidad, L es tipicamente un grupo fj n<
0 0 .
Otro aspecto de la invencion es una composicion como se definio anteriormente, que es una composicion farmaceutica y comprende ademas uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables.
La composicion farmaceutica puede estar en la forma de una suspension acuosa. Las suspensiones acuosas contienen los compuestos nuevos en mezcla con excipientes adecuados para la fabricacion de suspensiones acuosas. Las composiciones farmaceuticas pueden estar en la forma de una suspension acuosa u homogenea inyectable esteril. Esta suspension puede formularse de acuerdo con la tecnica conocida usando agentes humectantes o dispersantes y agentes de suspension.
Las composiciones farmaceuticas pueden administrarse por via oral, por via intravenosa, por via intraperitoneal, por via intramuscular, por via subcutanea, por via intranasal, por via intradermica, por via topica o por via intratraqueal para uso humano o veterinario.
Las composiciones pueden comprender ademas un aditivo de la formulacion. Por aditivo de la formulacion se entiende un excipiente que es capaz de estabilizar la insulina ya sea interna o externamente, como se describe en Wang y otros (1999). El excipiente puede ser un estabilizador, un solubilizador o un ion metalico. Los ejemplos adecuados de aditivos de la formulacion incluyen uno o mas tampones, estabilizadores, tensioactivos, sales, polfmeros, iones metalicos, azucares, polioles o aminoacidos. Estos pueden usarse solos o en combinacion.
Los estabilizadores actuan rtpicamente mediante la desestabilizacion del estado desnaturalizado de una proterna
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conduciendo a un aumento del cambio de la energfa libre de Gibbs para el desplegamiento de la protema. El estabilizador es preferentemente un azucar o un poliol, por ejemplo sacarosa, sorbitol, trehalosa, glicerol, manitol, lactosa y etilenglicol. Un tampon estabilizante es el fosfato de sodio.
El solubilizante es preferentemente un tensioactivo, preferentemente un tensioactivo no ionico. Los ejemplos adecuados incluyen Tween 80, Tween 20, Tween 40, Pluoronic F68, Brij 35 y Triton X100.
El ion metalico es preferentemente divalente. Los iones metalicos adecuados incluyen Zn2+, Ni2+, Co2+, Sr2+, Cu2+, Ca2+, Mg2+ y Fe2+.
El aditivo de la formulacion puede ser ademas un poKmero seleccionado de PSA, PEG o hidroxi-beta-ciclodextrina. Los conservantes tales como el m-cresol se pueden usartambien.
Los aminoacidos adecuados y derivados de aminoacidos para el uso como el aditivo de la formulacion incluyen histidina, glicina, otros aminoacidos similares y aspartato de sodio.
Un aspecto adicional de la invencion es un compuesto como se ha descrito anteriormente para uso en la terapia.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invencion, se proporciona un metodo para producir una poblacion de derivados de acido polisialico (PSA) de insulina o una protema similar a la insulina, el metodo comprende las etapas de: hacer reaccionar la cadena B de la insulina o protema similar a la insulina con PSA en una primera solucion acuosa de pH acido; y purificar el derivado de PSA resultante en una segunda solucion acuosa de pH mas alto que el de la primera solucion acuosa, en donde el PSA comprende 2-125 unidades de acido sialico, en donde la poblacion tiene al menos 85% de insulina o protema similar a la insulina derivatizada con PSA solo en el N-terminal de la cadena B, y en donde la protema similar a la insulina es un homologo de insulina que tiene al menos 50% de la actividad de la insulina y que tiene 90% o mas de identidad de secuencia a nivel de aminoacidos con la sec. con num. de ident.: 1. Los derivados de polisacaridos que se pueden obtener por este metodo, y cualquiera de las modalidades preferidas, como se detalla mas abajo, tambien forman parte de esta invencion.
Hemos desarrollado un nuevo metodo para la conjugacion de los polisacaridos a las protemas mediante el cual puede usarse la alta reactividad del N-terminal de la protema y se evita la complejidad del producto obtenido usando el metodo establecido (Figuras 1 y 2) de aminacion reductora de protemas con el acido colominico natural oxidado con peryodato.
El polisacarido puede reaccionar ademas con una forma modificada de insulina. Por ejemplo, uno o mas grupos en la insulina pueden haber experimentado una transformacion qrnmica, por ejemplo, por reduccion u oxidacion. Un carbonilo reactivo puede generarse en el lugar del grupo amino terminal de la insulina usando por ejemplo condiciones de oxidacion.
Los polisacaridos adecuados para el uso en el metodo de esta invencion son como se describieron anteriormente para las nuevas composiciones.
Los compuestos de la invencion pueden fabricarse por cualquiera de los metodos adecuados descritos en la tecnica anterior. Por ejemplo, un metodo tfpico se describe en nuestra solicitud de patente anterior WO92/22331.
Tfpicamente, el polisacarido anionico se activa antes de la derivatizacion a insulina. Puede tener, por ejemplo, un grupo aldetndo reactivo y la reaccion de derivatizacion pueden llevarse a cabo bajo condiciones de reduccion. El grupo aldetndo reactivo puede producirse mediante la oxidacion controlada de un grupo hidroxilo del polisacarido. Mas preferentemente, este aldetndo reactivo se genera en una etapa preliminar, en la que se hace reaccionar el polisacarido bajo condiciones de oxidacion controladas, por ejemplo usando peryodato de sodio, en solucion acuosa. Preferentemente, la oxidacion es una oxidacion qrnmica, aunque pueden ademas usarse enzimas que son capaces de llevar a cabo esta etapa. El grupo aldetndo reactivo puede estar en el extremo no reductor o extremo reductor del polisacarido. La insulina, tfpicamente el N-terminal, puede reaccionar despues con el grupo aldetndo reactivo para producir un aducto que, cuando se reduce, produce el derivado N-terminal de insulina.
La activacion del polisacarido debe llevarse a cabo preferentemente bajo condiciones de manera que no existe esencialmente la escision a mitad de la cadena de la cadena principal del polisacarido, que no es esencialmente la reduccion del peso molecular. El oxidante es convenientemente perrutenato, o, preferentemente, peryodato. La oxidacion puede llevarse a cabo con peryodato a una concentracion en el intervalo de 1 mM a 1 M, a un pH en el intervalo de 3 a 10, una temperatura en el intervalo de 0 a 60°C durante un tiempo en el intervalo de 1 min a 48 horas.
Las condiciones reductoras adecuadas para la reaccion de derivatizacion pueden utilizar hidrogeno con catalizadores o, preferentemente hidruros, tales como borohidruros. Estos pueden inmovilizarse tales como borohidruro soportado con Amberlita (marca comercial). Preferentemente, los hidruros metalicos alcalinos tal como
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borohidruro de sodio se usa como el agente reductor, a una concentracion en el intervalo de 1|jM a 0.1 M, un pH en el intervalo de 4 a 10, una temperatura en el intervalo de 0 a 60°C y un penodo en el intervalo 1 min a 72 horas. Las condiciones de reaccion se seleccionan de manera que no se reducen los grupos carboxilo colgante del material de partida. Otros agentes reductores adecuados son cianoborohidruro bajo condiciones acidas, por ejemplo, poffmero soportado en cianoborohidruro o cianoborohidruro de metal alcalino, acido L-ascorbico, metabisulfito de sodio, L- selectrida, triacetoxiborohidruro etc.
Otros derivados activados de los polisacaridos pueden tener utilidad en la presente invencion, e incluyen aquellos con grupos funcionales colgantes tales como NHS, como se describe en nuestra solicitud de patente anterior WO2006/090119.
En una modalidad, el aldehffdo reactivo esta en el extremo reductor del polisacarido y el extremo no reductor se pasiva de manera que no reacciona con los grupos colgantes en insulina.
La reactividad del extremo reductor del acido colommico, aunque debil hacia las protemas objetivo, es suficiente para ser problematico en la fabricacion de los conjugados qmmicamente definidos.
La qrnmica adecuada para preparar un polisacarido con un aldehffdo reactivo en el terminal reductor de un polisacarido se describe en nuestra solicitud anterior WO05/016974. El proceso implica una etapa de oxidacion selectiva preliminar seguido por la reduccion y despues la oxidacion adicional para producir un compuesto con un aldehffdo en el terminal reductor y un extremo no reductor pasivado.
El documento WO2005/016973 describe derivados de acido polisialico que son utiles para la conjugacion a protemas, particularmente los que tienen famacos con sulfhidrilo libre. El compuesto de acido polisialico se hace reaccionar con un reactivo heterobifuncional para introducir un grupo funcional colgante para la conjugacion espedfica de sitio a los grupos sulfidrilo. Los polisacaridos anionicos usados en la presente invencion pueden derivatizarse ademas con un reactivo heterobifuncional de esta manera.
El polisacarido puede derivatizarse antes de que reaccione con la insulina. Por ejemplo, el polisacarido puede reaccionar con un reactivo bifuncional.
El polisacarido puede someterse a una etapa de reaccion preliminar, en la que un grupo seleccionado de un grupo amina primaria, un grupo amina secundaria y una hidrazina se forma en el sacarido terminal, que es preferentemente acido sialico, seguido de una etapa de reaccion en la que este reacciona con un reactivo bifuncional para formar un intermediario de la reaccion, como se describe adicionalmente en el documento WO2006/016168. El producto intermedio puede reaccionar despues con el peptido de insulina o similar a la insulina. El reactivo bifuncional puede tener la formula general Z-R1-Z, como se definio anteriormente.
Se encontro que ciertas condiciones de reaccion promueven la derivatizacion selectiva en el extremo N-terminal de la insulina. Para promover la reaccion selectiva en el extremo N-terminal, la reaccion de derivatizacion debe llevarse a cabo en una primera solucion acuosa de pH acido, y el derivado de polisacarido resultante debe purificarse despues en una segunda solucion acuosa de pH mayor que la primera solucion acuosa. Por pH acido nos referimos a un pH de menos de 7. Tfpicamente, el pH de la primera solucion acuosa esta en el intervalo de 4.0-6.5, preferentemente 4.0-6.0 y el pH de la segunda solucion acuosa esta en el intervalo de 6.5-9.0, preferentemente de 6.5-8.5 o 6.5-8.0. El pH bajo de la reaccion de derivatizacion promueve la derivatizacion selectiva en el extremo N- terminal de la protema en lugar de en cualquiera de los sitios a mitad de la cadena.
Ademas, encontramos que el uso de ciertos aditivos de la formulacion promueven la formacion de un derivado de insulina polisacarido, estable, selectivo. El aditivo de la formulacion puede seleccionarse de uno o mas tampones, estabilizadores, tensioactivos, sales, poffmeros, iones metalicos, azucares, polioles o aminoacidos. Estos pueden anadirse al medio de reaccion, o, alternativamente, pueden anadirse a la composicion del producto final, como un estabilizador.
En una modalidad de esta invencion, el aditivo de la formulacion es sorbitol, trehalosa o sacarosa. En una modalidad diferente, el aditivo de la formulacion es un tensioactivo no ionico. El aditivo de la formulacion puede ser alternativamente un poffmero seleccionado de PSA, PEG o hidroxi-beta-ciclodextrina. En una modalidad diferente el aditivo de la formulacion es un ion metalico divalente. Los iones metalicos divalentes preferidos incluyen Zn2+, Ni2+, Co2+, Sr2+ o Fe2+.
El aditivo de la formulacion puede ser un tampon. Preferentemente, cuando el aditivo de la formulacion es un tampon, este es fosfato de sodio o acetato de sodio.
La purificacion del derivado de polisacarido en el metodo de la presente invencion puede llevarse a cabo usando una variedad de metodos conocidos en la tecnica. Los ejemplos de metodos de purificacion adecuados incluyen HIC (cromatograffa de interaccion hidrofobica), SEC (cromatograffa de exclusion por tamano), HPLC (cromatograffa ffquida de alta eficacia), IEC (cromatograffa de intercambio anionico).
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Una poblacion de acidos polisialicos que tienen una distribucion de peso molecular amplia puede fraccionarse en fracciones con polidispersidades mas bajas, es decir en fracciones con diferentes pesos moleculares promedios. El fraccionamiento se realiza preferentemente por cromatograffa de intercambio anionico, usando para la elucion un tampon basico adecuado, como se describio en nuestras solicitudes de patente anteriores WO 2005/016794 y WO2005/03149. El metodo de fraccionamiento es adecuado para un material de partida polisacarido, asf como con los derivados. La tecnica puede asf aplicarse antes o despues de las etapas esenciales del proceso de esta invencion. Preferentemente, el derivado de polisacarido resultante de la insulina tiene una polidispersidad de menos de 1.1.
La derivatizacion de la insulina de acuerdo con esta invencion, resulta en una mayor vida media, estabilidad mejorada, inmunogenicidad reducida, y/o control de la solubilidad y por lo tanto, la biodisponibilidad y las propiedades farmacocineticas de la insulina. El nuevo metodo es de particular valor para la creacion de un conjugado de insulina-monopolisialilado.
La invencion se ilustra por los Ejemplos 1-6 y con referencia a los siguientes dibujos:
La Figura 1 muestra la oxidacion del acido colommico (acido polisialico enlazado a alfa-2,8 de E. coli) con peryodato de sodio;
La Figura 2 muestra la reduccion selectiva de la base de Schiff con cianoborohidruro de sodio para formar un enlace covalente irreversible estable con el grupo amino de la protema;
La Figura 3 es un SDS-PAGE de conjugados CAO-rh-Insulina de 22 kDa a diferentes temperaturas;
La Figura 4 muestra los efectos de la temperatura en el grado de derivatizacion;
La Figura 5 es un SDS-PAGE de conjugaciones de CAO-rh-Insulina de 27 kDa a diferentes relaciones molares;
La Figura 6 muestra los efectos de la relacion de molar del grado de derivatizacion;
La Figura 7 es un SDS-PAGE de conjugados de CAO-rh-Insulina de 8 y 11 kDa;
La Figura 8 es un SE-HPLC de formulaciones de CAO-rh-Insulina y insulina de 8 kDa;
La Figura 9 muestra la eficacia in vivo de formulaciones CAO-insulina de 10, 15 y 21,5 kDa;
La Figura 10 muestra el montaje experimental de HPLC preparativa con IEC o HIC para la purificacion de un conjugado;
La Figura 11 muestra la purificacion de un conjugado CAO-insulina por cromatograffa de interaccion hidrofoba en una columna HiTrap de butilo FF;
La Figura 12 muestra la purificacion de un conjugado CAO-insulina de HIC pico 2, con 13 kDa CAO como ejemplo, por cromatograffa de intercambio anionico en una columna de la columna Hitrap Q FF;
La Figura 13 es un enfoque isoelectrico (IEF) en gel de un conjugado CAO-insulina de 13 kDa y 27 kDa;
La Figura 14 muestra resultados in vivo del conjugado CAO-insulina en ratones; y
La Figura 15 muestra los resultados de la degradacion de aminoacidos de Edman.
EJEMPLOS
1. Determinacion de protema y acido colommico
La estimacion cuantitativa de acidos polisialicos (como acido sialico) con el reactivo resorcinol se llevo a cabo por el metodo de resorcinol [Svennerholm, 1957] como se describio en otra parte [Gregoriadis y otros, 1993; Fernandes y Gregoriadis, 1996, 1997]. La protema se midio por el metodo colorimetrico bCa o absorbancia UV a 280 nm.
2. Activacion del acido colommico
La solucion 0.02 M de metaperyodato de sodio (NaIO4) preparada fresca (exceso molar de 8 veces) se mezclo con CA a 20°C y la mezcla de reaccion se agito magneticamente durante 15 min en la oscuridad. Despues, se anadio un volumen de dos veces de etilenglicol a la mezcla de reaccion para gastar el exceso de NaIO4 y la mezcla se mantuvo en agitacion a 20°C por otros 30 min. adicionales. El acido colommico oxidado (CAO) se dializo (tubo de
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dialisis con corte de 3.5KDa de peso molecular) extensivamente (24 h) contra un tampon de carbonato de amonio 0.01% (pH 7.4) a 4°C. La ultrafiltracion (corte de 3.5 kDa de peso molecular) se uso para concentrar la solucion CAO a partir del tubo de dialisis. Despues de la concentracion hasta el volumen necesario, el filtrado se liofilizo y se almaceno a -40°C hasta el uso mas adelante. Alternativamente, CAO se recupero de la mezcla de reaccion mediante precipitacion (dos veces) con etanol.
3. Determinacion del estado de oxidacion de CA y derivados
La estimacion cualitativa del grado de oxidacion del acido colommico se llevo a cabo con 2,4 dinitrofenilhidrazina (2,4-DNPH), que produce 2,4 dinitrofenil-hidrazonas moderadamente solubles en la interaccion con los compuestos carbonilo. (CA) no oxidado/(CAO)oxidado se anadieron al reactivo 2,4-DNPH (1.0 ml), las soluciones se agitaron y despues se dejaron reposar a 37°C hasta que se observo un precipitado cristalino [Shriner y otros, 1980]. El grado (cuantitativo) de oxidacion de CA se midio con un metodo [Park y Johnson, 1949] basado en la reduccion de los iones de ferricianuro en solucion alcalina a ferrocianuro ferrico (azul persa), que se mide despues a 630 nm. En este caso, la glucosa se uso como un estandar.
4. Cromatograffa de permeacion en gel
Las muestras de acido colommico (CA y CAO) se disolvieron en NaNO3 (0.2M), CH3CN (10%; 5mg/ml) y se cromatografiaron en columnas 2x GMPWXl con deteccion mediante mdice de refraccion (sistema GPC: bomba de disolvente VE1121 GPC, detector VE3580 RI y comparacion con el software Trisec 3 Viscotek Europe Ltd). Las muestras (5 mg/ml) se filtraron sobre membrana de nylon de 0.45 pm y corrieron a 0.7 cm/min con 0.2 M NaNO3 y CH3CN (10%) como la fase movil.
5. Estabilidad del acido colommico
Las reglas para la qmmica de la PEGilacion no pueden aplicarse a la polisialilacion como tal debido a la diferencia en las propiedades fisicoqmmicas de estas moleculas. El PSA es un polfmero labil acido y es estable durante semanas alrededor de pH neutro (Figura 3). Los resultados en la Figura 3 muestran que a pH 6.0 y 7.4 CAO es estable durante 8 dfas, a pH 5.0 existe una degradacion lenta (despues de 48 horas 92% del PM inicial), y a pH 4.0 existe una degradacion lenta (despues de 48 horas 70 % del PM inicial). El acido polisialico es altamente hidrofflico, mientras que PEG es una molecula anfifilica en la naturaleza. Cuando la polisialilacion se lleva a cabo usando condiciones usadas para la PEGilacion, la agregacion y precipitacion de las protemas se ve en muchos casos.
6. Preparacion de conjugados protema N-terminal-CA con aditivos de la formulacion
6.1 Preparacion de conjugados insulina-CA (metodo de N-terminal)
Insulina (5804 Da) se suministro como un solido blanco. La insulina se disolvio por HCl mmimo 100 mM, y despues se ajusto al pH requerido y se colocoa en hielo. La cantidad de CAO a anadir para la conjugacion se calculo basandose en la formula:
Cantidad de prole ina (g)
Peso de CAO = .................................., j, (PM de CAO) x (Exoeso molar de CAO)
(PM de pnoteina)
La cantidad necesaria de CAO se peso. El CAO se solubilizo en NaOAc 10 mM, pH 6.0, la mezcla se sometio a vortice suavemente hasta que todo el CAO se disolvio y despues se filtro en un nuevo recipiente para eliminar cualquier material agregado/precipitado. Se anadio una cantidad requerida de solucion de protema de insulina a la solucion CAO para dar un exceso molar de 7.5 (pequena escala) y 5 (a gran escala) de CAO y se mezclo suavemente, manteniendo la mezcla de reaccion en un agitador suave a 4±1°C. Se anadieron 100 mg/ml de solucion de NaCNBH3 para tener 8 mg/ml en la mezcla de reaccion final, se mezclaron suavemente y el pH de la mezcla de reaccion final se comprueba, si es necesario ajustar el pH a 6.0 con 0.5 M NaOH/HCl a 4±1°C. Finalmente se ajusto el volumen de la reaccion usando NaOAc 10 mM, pH 6.0 para dar una concentracion de protema de 1 mg/ml en la mezcla de reaccion. El tubo se sello y se agito a la temperatura deseada (4±1°C) durante 24 horas. La reaccion se detuvo mediante un metodo adecuado (tal como tampon de tris(hidroximetil)aminometano pH 7.4) y se tomaron las muestras para SDS-PAGE (usando gel de Tris-glicina al 18%), SE-HPLC (columna superosa 12) y se comprobo el pH de la mezcla de reaccion. Para eliminar cualquier precipitado, la mezcla de reaccion se centrifugo a 13000 rpm durante 5 min antes del analisis SE-HPLC y la purificacion, el tampon preferido para SE-HPLC fue 0.1 M fosfato de Na (pH 6.9).
6.2 Optimizacion
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La aminacion reductora se llevo a cabo con un intervalo de pesos moleculares de CAO (10-30kDa) en la insulina para la derivatizacion N-terminal y aleatoria. El intervalo de variables del proceso se estudiaron para las reacciones de conjugacion: exceso molar de CAO 10-20 (pequena escala) y 5-10 (gran escala); reactivo= 50-100mM NaCNBH3, tampon de reaccion= 10mM NaOAc pH 5.5-6.5, temperatura= 4±1°C, tiempo= 16-24 horas etc.
Se encontraron condiciones de reaccion optimizadas que son las siguientes: Exceso molar de CAO= 7.5 (pequena escala) y 5 (gran escala), reactivo = 50 mM NaCNBH3, tampon de reaccion= 10m NaOAc pH 5.5, temperatura = 4±1°C, tiempo= 24 horas.
6.3 Purificacion y caracterizacion de conjugados de insulina-CA (metodo N-terminal)
Para eliminar el CAO libre de la mezcla, se uso HIC (HiTrap Butil FF). Preparar la solucion de carga mediante dilucion de la mezcla de reaccion de insulina con volumen mmimo usando (NH^SO4 concentrado (por ejemplo, 3 M), 20mM Na2HPO4 (pH 7.4) para dar una concentracion de 0.8 M (NH4)2SO4 en la solucion de carga. Verificar el pH, que debe ser 7.4 o ajustar con 0.5 M HCl/NaOH, la solucion de carga tiene que ser filtrada con un filtro de membrana de 0.2 micras.
Esta solucion se carga despues en la columna HIC (velocidad = 0.5 ml/min) previamente equilibrada con tampon B de HIC (fosfato de sodio 20 mM + 0.8 M (NH4)2SO4, pH 7.4). La fraccion de carga se recogio (cada fraccion del volumen de columna de 1.5) y se marco (L1-Lx) siguiendo con el lavado de la columna con tampon B para HIC (al menos 5 volumenes de columna; velocidad = 0.5 ml/min; fraccion de volumen de columna de 1.5) se recogio y se marco (W1-Wx). El producto con tampon A HIC (tampon de fosfato de sodio 10 mM, pH 7.4) (velocidad = 5 ml/min) se eluyo y se recogieron las fracciones (fraccion de volumen de columna 1; volumen de columna 6) y se marco (E1- Ex). Si dos fracciones consecutivas estaban ausentes en el contenido de protema (UV280 nm), se llevo a cabo la siguiente etapa. Las muestras se mantuvieron en hielo durante la purificacion. La concentracion de protema se analizo mediante UV (280 nm) (Coeficiente de extincion 1 mg/ml de insulina fue aproximadamente 1.043 a 280 nm). Se tomaron las muestras para SdS-PAGE y SE-HPLC.
Las fraccions HIC que conteman fracciones de protema se lavaron con tampon A para IEC (20 mM tampon de fosfato, pH 7.4). Para eliminar el sulfato de amonio en su caso en Vivaspin 20 (MW: 5 Kd). Verificar el pH y ajustar si es necesario a un pH de 7.4. Cargar en la columna de IEC previamente equilibrada con tampon A para IEC. Se aplico un sistema de gradiente de la manera siguiente:
Carga: 0.25ml/min de muestra inyectada en tampon A para IEC, lavado de 3CV
Lavado: Sistema de gradiente: Tampon A para IEC: 90%, tampon B para AEX (20 mM tampon de fosfato + 1 M NaCl, pH 7.4): 10%, gradiente de 5cV y lavado de 3CV, regimen de flujo: 0.25ml/min
Tampon A para IEC: 68%, Tampon B para IEC: 32%, gradiente de 5 CV y lavado de 3CV, regimen de flujo: 0.25ml/min
Tampon A para IEC: 35%, Tampon B para IEC: 65%, gradiente de 5CV y lavado de 3CV, regimen de flujo: 0.25ml/min
Tampon A para IEC: 0%, Tampon B para IEC: 100%, gradiente de 5CV y lavado de 3CV, regimen de flujo: 0.25ml/min
Las fracciones IEC que contienen el conjugado purificado se combinan, se lavan para eliminar la sal con el cambio de tampon del tampon PBS. Ajustar el pH despues de la eliminacion de la sal a 7.4. La solucion se concentra despues a 4±1°C y la concentracion de protemas se analizo por espectroscopfa UV (280 nm). Los conjugados se filtraron esteriles y se tomaron muestras para el ensayo de la actividad y para la caracterizacion por sDS-PAGE y SE-HPLC. Sf era necesario se elimino una almuota para ensayo de protemas y el ensayo de CA. El resto se almaceno a 4±1°C hasta su uso posterior y se estudio la estabilidad ffsica por SE-HPLC.
Se estudiaron los efectos de varios procesos que afectan la estabilidad de la insulina en solucion y el grado de derivatizacion.
6.4 Preparacion de conjugados insulina-CA 14 kDa (monodisperso)
La insulina (5808 Da) se suministro como un solido blanco. La insulina se disolvio mediante la adicion de una cantidad minima de 100 mM de HCl, y despues el pH se ajusto a lo requerido y se coloca en hielo. La cantidad de CA 14 kDa a anadir para la conjugacion se calculo basandose en la formula:
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Cantidad de protein a (g)
Peso de 14 kDa de CAO = — —— -.......— * (PM de CAO) x (Exceso molar de CAO)
{PM de la pnotefna)
Se peso la cantidad requerida de CAO 14 kDa. CAO 14 kDa se solubilizo en 10 mM tampon de fosfato, pH 6.0 (aqu se uso 20% de volumen del volumen de reaccion final), se agito suavemente la mezcla hasta que todo el CAO 14 kDa se haya disuelto y despues se filtro en un nuevo recipiente para eliminar cualquier material agregado/precipitado. Se anadio una cantidad necesaria de solucion de protema de insulina a la solucion de CAO 14 kDa para dar un exceso molar de 7.5 (pequena escala) y 5 (gran escala) de CAO 14 kDa y se agito suavemente manteniendo la mezcla de reaccion en un agitador suave a 4±1°C. Se anadieron 100 mg/ml de la solucion de NaCNBH3 para tener 63.5 mM o 4 mg/ml en la mezcla de reaccion final, se mezclo suavemente y se comprobo el pH de la mezcla de reaccion final, si era necesario se ajusto el pH a 6.0 con 0.5 M NaOH/HCl a 4±1°C. Finalmente se ajusto el volumen de la reaccion mediante el uso de 10 mM NaOAc, pH 6.0 para dar una concentracion de protema de 1 mg/ml en la mezcla de reaccion. El tubo se sello y se agito a la temperatura deseada (4±1°C) durante 24 horas. La reaccion se detuvo mediante un metodo adecuado y se tomaron las muestras para SDS-PAGE (usando gel de Tris-glicina al 18%), SE-HPLC (columna superosa 12) y se comprobo el pH de la mezcla de reaccion. Para eliminar cualquier precipitado, la mezcla de reaccion se centrifugo a 13000 rpm durante 5 min antes del analisis SE-HPLC y la purificacion, el tampon preferido para SE-HPLC fue fosfato de Na 0.1 M (pH 6.9).
6.5 Optimizacion
La aminacion reductora se llevo a cabo con un intervalo de pesos moleculares de CA (10-30kda) en insulina para la derivatizacion N-terminal y aleatoria. El intervalo de variables del proceso se estudio para las reacciones de conjugacion: exceso molar de CAO 10-20 (pequena escala) y 5-10 (gran escala); reactivo= 50-100mM NaCNBH3, tampon de reaccion= 10mM tampon de fosfato, pH= 5-7.4; temperatura= 4 -37 ±1°C, tiempo= 16-24 horas etc.
Se encontro que las condiciones de reaccion optimizadas son las siguientes: exceso molar de CAO= 7.5 (pequena escala) y 5 (gran escala), reactivo = 63.5 mM NaCNBH3 (,4 mg/ml). Tampon de reaccion= 10mM NaOAc pH 6.0, temperatura = 4±1°C, tiempo= 24 horas.
6.6 Purificacion y caracterizacion de conjugados de insulina-CA (metodo N-terminal)
Para eliminar CAO libre de la mezcla, se uso HIC. Preparar solucion de carga mediante la dilucion de la mezcla de reaccion de insulina con volumen mmimo usando (NH4)2SO4 concentrado (por ejemplo, 3 M), 20mM Na2HPO4, (pH 7.4) para dar una concentracion de 0.8 M (NH4)2SO4 en la solucion de carga. Verificar el pH, debena ser 7.4 o ajustar con 0.5 M HCl/NaOH, la solucion de carga tiene que ser filtrada con un filtro de membrana de 0.2 micras.
Esta solucion se carga despues en la columna HIC (velocidad = 0.5ml/min) previamente equilibrada con tampon B para HIC (20 mM fosfato de sodio + 0.8 M (NH4)2SO4, pH 7.4). Recoger las fracciones cargadas (cada fraccion de volumen de columna 1.5) y marcar (L1-Lx). Lavar la columna con tampon B para HIC (al menos 5 volumenes de columna; velocidad = 0.5 ml/min; recoger 1.5 fraccion de volumen de columna) recoger las fracciones y marcar (W1- Wx). Eluir el producto con tampon A HIC (10 mM tampon de fosfato de sodio, pH 7.4) (velocidad = 5 ml/min); recoger las fracciones (1 fraccion de volumen de columna; 6 volumen de columna) y marcar (E1-Ex). Si dos fraciones consecutivas estaban ausentes en el contenido de protemas (UV280 nm), se llevo a cabo la siguiente etapa. Las muestras se mantuvieron en hielo durante la purificacion. La concentracion de protemas se analizo por UV (280 nm) (Coeficiente de extincion de 1 mg/ml de insulina fue aproximadamente 1.043 a 280 nm). Se tomaron las muestras para SDS-PAGE y SE-HPLC.
Las fracciones HIC que contienen las fracciones de protema se lavaron con tampon A para IEC (20 mM tampon de fosfato, pH 7.4). Para eliminar el sulfato de amonio si hubiera en Vivaspin 20 (PM: 5 Kd). Verificar el pH y ajustralo si es necesario a pH 7.4. Cargar en la columna IEC previamente equilibrada con tampon A para IEC. El sistema de gradiente se aplico de la siguiente manera:
Carga: 0.25ml/min de muestra inyectada en tampon A para IEC, lavado de 3CV
Lavado: Sistema gradiente: Tampon A para IEC: 90%, tampon B para AEX (20 mM tampon de fosfato + 1M NaCl, pH 7.4): 10%, gradiente de 5CV y lavado de 3CV, regimen de flujo: 0.25ml/min
Tampon A para IEC: 68%, Tampon B para IEC: 32%, gradiente de 5 CV y lavado de 3CV, regimen de flujo: 0.25ml/min
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Tampon A para IEC: 35%, Tampon B para IEC: 65%, gradiente de 5CV y lavado de 3CV, regimen de flujo : 0.25ml/min
Tampon A para IEC: 0%, Tampon B para IEC: 100%, gradiente de 5CV y lavado de 3CV, regimen de flujo : 0.25ml/min
Las fracciones IEC que contienen el conjugado purificado se combinan, se lavan para eliminar la sal con el cambio de tampon del tampon PBS. El pH se ajusta despues de la eliminacion de la sal a 7.4. La solucion se concentra despues a 4±1°C y la concentracion de protemas se analizo por espectroscopfa UV (280 nm). El conjugado se filtra de manera esteril y las muestras se toman para el ensayo de la actividad y para la caracterizacion por SDS-PAGE y SE-HPLC. Si era necesario, se elimino una almuota para un ensayo de protemas y ensayo de CA. El resto se almaceno a 4±1°C hasta su uso posterior y se estudio para la estabilidad ffsica por SE-HPLC.
Se estudiaron los efectos de varios procesos que afectan la estabilidad de la insulina en solucion y el grado de derivatizacion.
6.7 SE-HPLC de formulaciones de insulina
La HPLC se realizo en un Cromatografo Lfquido (JASCO) equipado con un Jasco, AS-2057 mas automuestreador refrigerado a 4°C, y un detector Jasco UV-975 UV/VIS. Los datos se registraron mediante el software EZChrom Elite en una IBM/PC. Las muestras de la SEC se analizaron con una fase movil isocratica de 0.1 M fosfato de Na, pH 6.9; en una columna de Superosa 12 (Figura 8). La Figura 8 muestra un solo pico a RT=75.408, lo cual se atribuye a la insulina.
6.8 Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS y inmunoelectrotransferencia
SDS-PAGE se realizo usando de geles de triglicina al 18%. Las muestras se diluyeron con tampon ya sea reductor o no reductor y 5.0 ug de protema se cargo en cada pocillo. Los geles se corrieron en un sistema tampon de triglicerina y se tino and con Azul Coomasie (Figuras 5 y 7). La inmunoelectrotransferencia se realizo usando el anticuerpo anti PSA. La Figura 4 muestra la SDS-PAGE de las formulaciones de insulina (espedfica de sitio; N- terminal).
6.9 Enfoque isoelectrico (IEF) en gel de CAO-insulina de 27 y 13 kDa
El gel para IEF Novex® se uso para determinar las diferencias en los puntos isoelectricos de la insulina y el conjugado de CAO-insulina. Las muestras se disolvieron a una concentracion de 0.5 mg/ml. 5 ul de muestra se diluyeron con 5 ul de tampon de muestra para IEF Novex pH 3-10 y despues se cargo la muestra de protema en el gel.
6.10 Estudios de estabilidad
Los conjugados de insulina esteriles se almacenaron en tampon PBS; a 4°C durante seis semanas. PAGE-Nativo de las muestras se realizo cada semana
6.11 Eficacia in vivo de las formulaciones de insulina
La eficacia in vivo de las formulaciones de insulina se estudio en ratones hembra CD-1, de 7-8 semanas de edad. Se inyecto una dosis de protema de 0.3 IU (igual actividad) en ratones por via subcutanea. Los animales se dividieron en siete grupos de cuatro. Las formulaciones de insulina se administraon a cada animal de cada grupo de la siguiente manera; insulina (0.3 UI/raton), conjugado insulina-PSA Lantus (Aventis) (14 KDa), PBS. Se extrajo una gota de sangre de cada animal y se midio la glucosa en sangre ACCU-CHEK Active (Roche Diagnostics).
Resultados
Activacion de CA y determinacion del grado de oxidacion
Se uso acido colommico (CA), que es un homopolfmero lineal alfa-2,8 enlazado de residuos de acido N- acetilneurammico (Neu5Ac). La exposicion de los acidos colommicos a la oxidacion se llevo a cabo durante 15 min usando 20 mM peryodato a temperatura ambiente. La integridad de los residuos Neu5Ac internos alfa-2,8 enlazados despues del tratamiento con peryodato se analizo mediante cromatograffa de permeacion en gel y los cromatografos obtenidos para el material oxidado (CAO), se comparo con el de CA nativo. Se encontro que el Ca oxidado y nativo exhiben perfiles de elucion casi identicos, sin evidencia de que la etapa de oxidacion sucesiva da lugar a la fragmentacion significativa de la cadena del polfmero.
La medicion cuantitativa del estado de oxidacion de CA se realizo mediante la reduccion del ion de ferricianuro en solucion alcalina a ferrocianuro (Azul de Prusia) [Park y Johnson, 1949] usando glucosa como un estandar. Este
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muestra que el acido colommico oxidado se encontro que tiene una cantidad del agente reductor mayor que la estequimetrica (> 100%), es decir, 112 % en mol de contenido de aldehndo aparente que comprende el poder reductor combinado del hemicetal extremo reductor y el aldehfdo introducido (en el otro extremo).
Optimizacion de la reaccion polisialacion
Las condiciones de polisialacion se optimizaron mediante el uso de 1 mg rh-insulina con CAO bajo temperaturas y relacion molar del reactivo, y longitud de la cadena variables. Los resultados se muestran en la Figura 5-12. 4°C parece ser la temperatura optima para CAO y la estabilidad de la insulina durante la reaccion. Sin embargo, a una temperatura mas alta, se puede alcanzar mas conjugacion 7.5: 1 de relacion molar de CAO a la insulina es mas eficaz.
Tabla 1 muestra el efecto de la relacion molar en la polisialilacion.
Numero de pocillo
1 3 5 7 8 11 12
Relacion molar
1 : 1 1 : 2 1: 4 Ma insulina cn 1. 10
CAO PM
27 kDa CAO con 100 CHO%
Insulina (mg)
1 1 1 1 1
CAO (mg)
4.49 8.98 17.96 33.675 44.9
NaCNBH Finals
4 mg/ml
Reaccion
4
pH
6
Tabla 1.
Bajo la influencia del control de PBS, 21.5 kd CAO-insulina tiene el efecto mas significativo en la disminucion de la glucosa en sangre en ratones entre los conjugados usados en la Figura 9.
La Tabla 2 muestra una prueba-T (analisis estadfstico, prueba pareada) de la cadena de diferentes conjugados CAO-insulina en la eficacia in vivo.
Tiempo (minutos)
0.0 32.0 64.5 99.4 170.8 230.2 303.3 358.0 1354.9
CAO-insulina de 13 kDa
** *** ***
CAO-insulina de 21 kDa
*** *** *
CAO-insulina de 27 kDa
** *** ** ** **
CAO-insulina de 32 kDa
*** *** *** *
Insulina
*** *** ***
Tabla 2.
Los asteriscos indican el nivel de probabilidad de la diferencia entre grupos contra el tampon Tris: *P < 0.05, **P< 0.01, ***P < 0.001
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Lantus CAO-insulina 15 KDa (Sigma)
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30
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60
*** ***
90
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120
* **
150
*
210
270
330
Tabla 3.
Los asteriscos indican el nivel de probabilidad de la diferencia entre grupos contra el tampon PBS: *P < 0.05, **P< 0.01, ***P < 0.001
El efecto del pH en la eficiencia in vivo de CAO-insulina 15 kDa tambien revelo que el pH 6.0 es mejor que 7.4. Por lo tanto, el experimento despues se realizo a pH 6.0. Los datos del mapeo de peptidos y la degradacion de Edman confirmaron ademas que el conjugado de la condicion de polisialilacion pH 6.0 es N-terminal bloqueado espedficamente en la cadena B de la insulina.
Preparacion, purificacion y caracterizacion de los conjugados de insulina
CAO-insulina monodispersa se puede conjugar con exito y los conjugados altamente puros se purificaron por HIC e IEC escalados. La eficacia de la purificacion se mejoro a partir de la combinacion de IEC e HIC establecida con el instrumento de HPLC preparativa como se demostro en la Figura 10.
El procedimiento para preparar y purificar los conjugados de acido colommico (CA) de insulina de manera selectiva N-terminal conduciendo la reaccion a un pH reducido (pH 6.0) y a 4±1°C se detalla anteriormente. Esto implica la conjugacion en presencia de cianoborohidruro de sodio, seguido por la purificacion usando cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC) para eliminar el CA libre libre (Figura 11) seguido de la eliminacion de insulina mediante cromatograffa de intercambio ionico (IEC) (Figura 12). El pH bajo se usa para favorecer la derivatizacion selectiva en el N-terminal de la cadena B de la insulina (PheB1), y tambien para minimizar la agregacion de la insulina durante la reaccion. La composicion del tampon de la reaccion final fue 1 mg/ml de insulina, 8mg/ml de NaCNBH3 y exceso molar de 5 molar de CAO en 10 mM de NaOAc a pH 6.0.
El enfoque isoelectrico (IEF) en gel de conjugados CAO-insulina de 13 Kda y 27 Kda en la Figura 13 muestra que el conjugado de insulina polisialilada no tiene un punto isoelectrico fijo (pI).
La formacion de los conjugados de insulina-CA y la estabilidad se confirmo mediante la SE-HPLC (cambio del tiempo de retencion de insulina-CA en comparacion con insulina; co-elucion ademas de ambas porciones); cromatograffa de intercambio ionico (union de conjugados en la columna de IEC) y electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE; desplazamiento de bandas con especies de alto p.m.).
Los conjugados de insulina usados en la eficacia in vivo (en ratones CD-1, promedio 25 g) mostraron una eficacia in vivo superior (prolongacion) y romo (perfil de menos pico) en comparacion con la insulina. La prolongacion de la capacidad reductora de la glucosa en sangre de los conjugados fue proporcional a la longitud de la cadena de polfmero usado en la formulacion como se aprecia en la Figura 14.
El estudio de estabilidad de los conjugados CAO-insulina de 27 kDa mostro que no habfa ningun tipo de degradacion durante el almacenamiento ° C 4 40 dfas basado en la observacion de Native-PAGE.
Caracterizacion de conjugados de insulina de 14 kDa a partir de la from preparacion y purificacion escalada
En el ejemplo de la insulina como 700 mg de reactivo de partida, 230 mg de CAO-insulina de 14 kDa (peso de la masa de protema) se produjo con el uso de purificacion en columna escalada.
Por comparacion de los cromatogramas, los cambios en las cantidades de aminoacidos en la Figura 15 revelan los
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aminoacidos del N-terminal. La muestra acuosa 1mg/mL en PBS pH 7.4 se diluyo x100 con agua. 2|jL de esta solucion diluida se tomo para el analisis. En conclusion, la secuencia G-I-V-E, identifica la cadena A de insulina. La ausencia de aminoacido Phe/Val/Asn/Gln indica que la cadena B de insulina fue bloqueada en el N-terminal.
Se encontro que los conjugados de PSA son activos en el ensayo de actividad in vitro. El estudio de eficacia in vivo muestra que los conjugados PSA-insulina son muy superiores a la insulina.
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Claims (19)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Una composicion que comprende una poblacion de derivados polisacaridos de una protema, en donde la protema es insulina o una protema similar a la insulina, en donde la protema similar a la insulina es un homologo de insulina que tiene al menos 50% de la actividad de la insulina y tiene 90% o mas de de identidad de secuencia a nivel de aminoacidos con la sec. con num. de ident.: 1, en donde el polisacarido es acido polisialico, que comprende entre 2 y 125 unidades de acido sialico, y en donde al menos 85% de los derivados de la protema se derivatizan solo en el N-terminal de la cadena B de la protema de insulina o similar a la insulina.
  2. 2. Una composicion de conformidad con la reivindicacion 1, en donde el polisacarido comprende al menos 5 unidades de acido sialico.
  3. 3. Una composicion de conformidad con la reivindicacion 2, en donde el polisacarido comprende al menos 10 unidades de acido sialico.
  4. 4. Una composicion de conformidad con cualquier reivindicacion anterior, en donde al menos 90% de los derivados se derivatizan solo en el N-terminal de la cadena B.
  5. 5. Una composicion de conformidad con cualquier reivindicacion anterior, en donde al menos 95% de los derivados se derivatizan solo en el N-terminal de la cadena B.
  6. 6. Una composicion de conformidad con cualquier reivindicacion anterior, en donde el polisacarido tiene un peso molecular promedio en peso en el intervalo de 2 a 100 kDa.
  7. 7. Una composicion de conformidad con cualquier reivindicacion anterior, en donde el acido polisialico consiste esencialmente solo de unidades de acido sialico.
  8. 8. Una composicion de conformidad con cualquier reivindicacion anterior, en donde la protema de insulina o similar a la insulina se derivatiza por el polisacarido en la unidad terminal reductora del polisacarido.
  9. 9. Una composicion de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7, en donde una cadena de polisacarido esta unida a dos protemas de insulina o similar a la insulina a traves de unidades terminales reductoras y no reductoras del polisacarido.
  10. 10. Una composicion de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7, en donde los derivados del polisacarido son de la formula general (I)
    imagen1
    en donde m es 1-124;
    HNB se deriva de B-NH2 que es el N-terminal de la cadena B de la protema de insulina o similar a la insulina;
    L es un enlace, un grupo de enlace, o comprende un polipeptido o un digomero sintetico;
    GlyO es una unidad de acido sialico;
    en donde el grupo de enlace, si esta presente, es de la formula general -Y-C(O)-R1-C(O)-; en donde Y es NR2 o NR2-NR2; R1 es un radical organico difuncional seleccionado del grupo que consiste en alcanodiilo, arileno, alcarileno, heteroarileno y alquilheteroarileno, cualquiera de estos puede ser sustituido y/o interrumpido por enlaces carbonilo, ester, sulfuro, eter, amida y/o amina; y R2 es H o alquilo de C1-6.
  11. 11. Una composicion de conformidad con la reivindicacion 10, en donde L es un enlace 0 es un grupo
  12. 12. Una composicion de conformidad con cualquier reivindicacion anterior, en donde el polisacarido comprende 20-60 unidades de acido sialico.
  13. 13. Una composicion de conformidad con cualquier reivindicacion anterior, en donde la polidispersidad del polisacarido es menor que 1.3.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
  14. 14. Una composicion de conformidad con la reivindicacion 13, en donde la polidispersidad del polisacarido es menor que 1.2
  15. 15. Una composicion de conformidad con cualquier reivindicacion anterior, que es una composicion farmaceutica y comprende uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables.
  16. 16. Una composicion de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para su uso en terapia.
  17. 17. Un metodo para producir una poblacion de derivados de acido polisialico (PSA) de la protema de insulina o similar a la insulina, el metodo comprende las etapas de:
    reaccionar la cadena B de la protema de insulina o similar a la insulina con PSA en una primera solucion acuosa de pH acido; y
    purificar el derivado de PSA resultante en una segunda solucion acuosa de pH mayor que la primera solucion acuosa,
    en donde el PSA comprende 2-125 unidades de acido sialico,
    en donde la poblacion tiene al menos 85% de protema insulina o similar a la insulina derivatizada con PSA solo en el N-terminal del a cadena B, y
    en donde la protema similar a la insulina es un homologo de insulina que tene al menos 50% de la actividad de la insulina y tiene 90% o mas de identidad de secuencia a nivel de aminoacido con la sec. con num. de ident.: 1.
  18. 18. Un metodo de conformidad con la reivindicacion 17, en donde las etapas se llevan a cabo bajo uno de los siguientes conjuntos de condiciones:
    (i) el pH de la primera solucion acuosa esta en el intervalo de 4.0-6.5 y el pH de la segunda solucion acuosa esta en el intervalo de 6.5-9.0;
    (ii) el pH de la primera solucion acuosa esta en el intervalo de 4.0-6.0 y el pH de la segunda solucion acuosa esta en el intervalo de 6.5-8.5; o
    (iii) el pH de la primera solucion acuosa esta en el intervalo de 4.0-6.0 y el pH de la segunda solucion acuosa esta en el intervalo de 6.5-8.0.
  19. 19. Un metodo de conformidad con la reivindicacion 17 o reivindicacion 18 para producir una composicion de conformidad con las reivindicaciones 1 a 16.
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