ES2585345T3 - Placa de pocillos para mediciones XRF - Google Patents

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ES2585345T3 ES08798006.6T ES08798006T ES2585345T3 ES 2585345 T3 ES2585345 T3 ES 2585345T3 ES 08798006 T ES08798006 T ES 08798006T ES 2585345 T3 ES2585345 T3 ES 2585345T3
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Benjamin P. Warner
Sharon M. Baldwin
Jennifer A. Berger
Rebecca L.E. Miller
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Abstract

Un aparato (2) para preparar una o más muestras para la medición por espectrometría de fluorescencia de rayos X, que comprende una placa de pocillos (4) que tiene al menos un orificio (8) que atraviesa dicha placa de pocillos; pasando dicho al menos un orificio a través de la placa de pocillos desde una cara a la otra cara, cubriendo una película (6) dicho orificio, siendo dicha película (6) al menos un 5 % translúcida a 2.300 eV de rayos X orientados normales a dicha película (6), caracterizado por que dicho orificio (8) tiene un diámetro de menos de 500 micrómetros en al menos una dimensión paralela a dicha película (6) en el lugar donde dicho orificio (8) linda con dicha película (6) y una zona de sección transversal de menos de 0,005 centímetros cuadrados donde dicho orificio (8) linda con dicha película (6), y en el que las paredes de dicho orificio (8) tienen una rugosidad RMS de menos de 20 micrómetros.

Description

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DESCRIPCION
Placa de pocillos para mediciones XRF
Esta solicitud esta relacionada con y reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional de Estados Unidos 60/965.052 titulada “Well plate", que fue presentada el 16 de agosto de 2007.
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a la preparacion de muestras para un analisis espectroscopico.
Antecedentes de la invencion
La espectrometria de fluorescencia de rayos X (XRF) es una tecnica espectroscopica de gran alcance que se ha usado para determinar los elementos que estan presentes en una muestra quimica, y para determinar la cantidad de esos elementos en la muestra. El principio fisico subyacente del metodo es que cuando un atomo de un elemento especifico se irradia con una radiacion de rayos X, el atomo expulsa un electron del nucleo tal como un electron de la cubierta K. A continuacion, el atomo resultante esta en un estado excitado, y se puede volver al estado base reemplazando el electron expulsado con un electron de una orbita de energia mas alta. Esto va acompanado de la emision de un foton. La energia de los fotones emitidos es igual a la diferencia en las energias de las dos orbitas. Cada elemento tiene un conjunto caracteristico de energias de orbita y, por lo tanto, un espectro de fluorescencia de rayos X (XRF) caracteristico.
Un espectrometro de XRF es un aparato capaz de irradiar una muestra con un haz de rayos X, detectar la fluorescencia de rayos X de la muestra, y usar la fluorescencia de los rayos X para determinar que elementos estan presentes en la muestra y medir la cantidad de estos elementos. Un espectrometro de fluorescencia de rayos X de energia dispersiva disponible comercialmente tipico es el espectrometro de fluorescencia de rayos X de energia dispersiva EDAX Eagle XPL, equipado con un tubo de rayos X de microfoco, un detector de estado solido de silicio derivado del litio, una electronica de procesamiento, y un software operativo suministrado por el proveedor, disponible en la division EDAX de Ametek, 91 McKee Drive Mahwah, NJ 07430. Un ejemplo de un espectrometro de fluorescencia de rayos X de dispersion de longitud de onda es el ZSX Primus, disponible en Rigaku Americas, 9009 New Trails Drive, The Woodlands, TX 77381. En principio, cualquier elemento puede detectarse y cuantificarse con una XRF.
Los ensayos tipicos de proteinas-farmacos se realizan con unas concentraciones de proteina y concentraciones de farmaco de nanomoles a micromoles. La concentracion de proteina y la concentracion de farmaco no necesitan ser la misma. La tecnica existente para el analisis de muestras secadas por fluorescencia de rayos x solo puede medir muestras secas que se depositan a partir de un microlitro o menos de soluciones que tienen concentraciones minimas de aproximadamente 10 micromoles (vease Thomasin C. Miller, Christopher M. Sparks, George J. Havrilla, Meredith R. Beebe, “Semiconductor applications of nanoliter droplet methodology with total reflection X-ray fluorescence analysis", Spectrochimica Acta Part B 59 (2004) 1117-1124). Este metodo de preparacion de muestras es insuficiente para el analisis de proteinas y complejos de proteinas-farmacos, donde las concentraciones biologicamente pertinentes de la solucion a partir de la que se deposita la muestra deben ser menores que 10 micromoles y preferentemente menores que 100 nanomoles.
El documento US 2005/0090019 desvela una placa de pocillos de XRF que tiene unas perforaciones que pasan a traves de la placa de pocillos desde una cara a otra, cubriendose dichas perforaciones por una pelicula translucida a los rayos x. Los documentos US 6426050 y US 6171780 desvelan las dimensiones de las perforaciones en las diferentes placas de pocillos.
El estado de la tecnica existente es insuficiente para analizar las soluciones diluidas, especialmente las soluciones diluidas de proteinas que tienen concentraciones de menos de aproximadamente 10 micromoles.
Sigue existiendo la necesidad de unos metodos mas simples para preparar muestras para su medicion usando la espectrometria de fluorescencia de rayos X. La presente invencion esta disenada para hacer frente a esa necesidad.
Sumario de la presente invencion
Un aspecto de la presente invencion comprende un aparato (2) para preparar una o mas muestras para la medicion por espectrometria de fluorescencia de rayos X, que comprende una placa de pocillos (4) que tiene al menos un orificio (8) que penetra dicha placa de pocillos; pasando a traves de dicho al menos un orificio de la placa de pocillos desde una cara a la otra cara, cubriendo dicho orificio una pelicula (6), siendo dicha pelicula (6) al menos un 5 % translucida a 2.300 eV de rayos X orientados normales a dicha pelicula (6), y teniendo dicho orificio (8) un diametro de menos de 500 micrometros en al menos una dimension paralela a dicha pelicula (6) en la localizacion donde dicho orificio (8) linda con dicha pelicula (6) y una zona de seccion transversal de menos de 0,005 centimetros cuadrados donde dicho orificio (8) linda con dicha pelicula (6), caracterizado por que las paredes de dicho orificio (8)
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tienen una rugosidad RMS de menos de 20 micrometros.
Otro aspecto mas de la presente invencion comprende un metodo de acuerdo con la reivindicacion 3.
Los objetivos adicionales, ventajas y nuevas caracteristicas de la invencion se expondran en parte en la descripcion siguiente y en parte resultaran evidentes para los expertos en la materia tras el examen de lo siguiente o pueden aprenderse por la practica de la invencion. Los objetivos y ventajas de la invencion pueden realizarse y alcanzarse por medio de las instrumentalidades y combinaciones especificamente indicadas en las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripcion de las figuras
La figura 1 muestra una representacion esquematica de la presente invencion.
La figura 2 muestra una vista en corte de seccion de la placa 4 que muestra unos ejemplos de las formas del orificio(s) 8.
La figura 3 muestra unas muestras de proteinas preparadas usando un aparato 2 y mediante una pipeta.
La figura 4 muestra un espectro de fluorescencia de rayos X de las muestras de proteina preparadas usando un aparato 2 y mediante una pipeta.
La figura 5 muestra una comparacion del perfil de espesor de seccion transversal de unas muestras de proteina preparadas usando un aparato 2 y mediante una pipeta.
Descripcion detallada
En resumen, la presente invencion incluye un aparato para preparar las muestras para la medicion por espectrometria de fluorescencia de rayos X. El aparato comprende una placa que tiene uno o mas orificios que pasan a traves de la placa. Los orificios estan cubiertos por una pelicula en un lado de la placa. Los orificios son de menos de 500 micrometros a traves de una dimension donde la pelicula cubre los orificios. La pelicula es translucida a los rayos x. La presente invencion tambien incluye un aparato para preparar muestras para la medicion por espectrometria de fluorescencia de rayos X. El aparato comprende una placa que tiene uno o mas orificios que pasan a traves de la placa. Los orificios estan cubiertos en un lado de la placa por una cubierta desmontable que forma un cierre estanco al agua contra la placa. La cubierta esta sustancialmente libre de los elementos osmio, itrio, iridio, fosforo, zirconio, platino, oro, niobio, mercurio, talio, molibdeno, azufre, plomo, bismuto, tecnecio, rutenio, cloro, rodio, paladio, argon, plata, y torio. Los orificios son de menos de aproximadamente 500 micrometros a traves de una dimension donde la cubierta cubre los orificios. La presente invencion tambien incluye un metodo para preparar muestras para la medicion por espectrometria de fluorescencia de rayos X. El metodo comprende proporcionar una solucion con menos de 10 micromoles de soluto y un volumen de entre aproximadamente 2 microlitros y aproximadamente 2 mililitros. La solucion se concentra y se analiza usando la espectrometria de fluorescencia de rayos X.
La presente invencion comprende un aparato 2, que incluye una placa 4 y una pelicula 6. La pelicula 6 cubre una cara de la placa 4. La placa 4 tiene uno o mas orificios 8. Los orificios 8 pasan a traves de la placa 4 desde la cara de la placa 4 que esta cubierta por la pelicula 6 hasta la cara opuesta de la placa 4. La pelicula 6 puede estar unida a la placa 4.
El aparato 2 no deberia tener fugas de disolvente en la union de la pelicula 6 y la placa 4. Preferentemente, la union de la pelicula 6 y la placa 4 mantiene un cierre estanco al agua cuando el aparato 2 se somete o a temperaturas por encima de aproximadamente 37,7 °C o la aceleracion excede aproximadamente 20 veces la constante gravitacional de la tierra al nivel del mar, o la presion atmosferica es inferior a aproximadamente 760 torr.
Las dimensiones de la placa 4 son mas preferentemente de 127,76 mm ± 0,25 mm por 85,48 mm ± 0,25 mm, cuando se mide desde una posicion dentro de 12,7 mm (0,5000 pulgadas) de las esquinas exteriores de la placa 4. Si la placa 4 es sustancialmente rectangular o si la placa 4 tiene una pestana en la parte inferior entonces la placa 4 o su pestana tiene preferentemente un radio de esquina hasta el exterior de 3,18 mm ± 1,6 mm. Si la placa 4 es sustancialmente rectangular pero tiene uno o mas chaflanes o esquinas biseladas, entonces los radios de esquina de las esquinas no biseladas son preferentemente de 3,18 mm ± 1,6 mm hacia el exterior. Si el aparato 2 comprende 96 unos orificios 8, entonces los orificios 8 estan dispuestos preferentemente en forma de ocho filas por doce columnas. En este caso, la distancia entre al menos un borde exterior de la placa 4 y el centro de la primera columna de orificios 8 es preferentemente de 14,38 mm ± 4 mm. La distancia entre cada columna de orificios 8 es preferentemente de 9 mm ± 4 mm. La distancia entre al menos un borde exterior de la placa 4 y el centro de la primera fila de orificios 8 es preferentemente de 11,24 mm ± 4 mm. La distancia entre cada fila de orificios 8 es preferentemente de 9 mm ± 4 mm. Al menos uno de los orificios 8 se marca preferentemente de una manera distintiva, y mas preferentemente cada fila se marca de una manera distintiva y cada columna se marca de una manera distintiva. Si el aparato 2 comprende 384 orificios 8, entonces los orificios 8 estan dispuestos
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preferentemente en forma de dieciseis filas por veinticuatro columnas. En este caso, la distancia entre al menos un borde exterior de la placa 4 y el centro de la primera columna de orificios 8 es preferentemente de 12,13 mm ± 4 mm. La distancia entre cada columna de orificios 8 es preferentemente de 4,5 mm ± 2 mm. La distancia entre al menos un borde exterior de la placa 4 y el centro de la primera fila de orificios 8 es preferentemente de 8,99 mm ± 4 mm. La distancia entre cada fila de orificios 8 es preferentemente de 4,5 mm ± 2 mm. Al menos uno de orificios 8 se marca preferentemente de una manera distintiva, y mas preferentemente cada fila se marca de una manera distintiva y cada columna se marca de una manera distintiva. Si el aparato 2 comprende 1536 orificios 8, entonces los orificios 8 estan dispuestos preferentemente como treinta y dos filas por cuarenta y ocho columnas. En este caso, la distancia entre al menos un borde exterior de la placa 4 y el centro de la primera columna de orificios 8 es preferentemente de 11,005 mm ± 4 mm. La distancia entre cada columna de orificios 8 es preferentemente de 2,25 mm ± 1 mm. La distancia entre al menos un borde exterior de la placa 4 y el centro de la primera fila de orificios 8 es preferentemente de 7,865 mm ± 4 mm. La distancia entre cada fila de orificios 8 es preferentemente de 2,25 mm ± 1 mm. Al menos uno de orificios 8 se marca preferentemente de una manera distintiva, y mas preferentemente cada fila se marca de una manera distintiva y cada columna se marca de una manera distintiva. La placa 4 esta preferentemente entre 7 mm y 35 mm de altura. La cara superior 12 y la cara inferior 10 preferentemente son sustancialmente paralelas entre si. La placa 4 puede comprender un pestana en uno o mas lados de la placa 4. Si la placa 4 comprende una pestana, entonces la altura de la pestana esta preferentemente entre 1 mm y 10 mm, y mas preferentemente es de 2,41 mm ± 0,38 mm o 6,10 mm ± 0,38 mm o 7,62 mm ± 0,38 mm cuando se mide desde el plano de apoyo inferior de la placa 4 hasta la parte superior de la pestana. Es preferible, si la placa 4 es sustancialmente rectangular, con o sin chaflanes en las esquinas, que las pestanas de al menos dos de los lados de la placa 4 tengan la misma altura de pestana cuando se mide desde el plano de apoyo inferior de la placa 4 hasta la parte superior de la pestana. La pestana se extiende preferentemente desde la placa 4 al menos 0,5 mm y preferentemente 1,27 mm cuando se mide en la parte superior de la pestana. Cualquiera de los chaflanes no tiene preferentemente unas pestanas. Una pestana en la placa 4 puede tener interrupciones o salientes. Preferentemente, cualquier borde de cualquier interrupcion o saliente en una pestana es de un minimo de 47,8 mm desde los bordes de la placa 4 que son sustancialmente perpendiculares hasta la pestana que tiene la interrupcion(s) o el saliente(s).
La placa 4 se compone preferentemente de plastico, aunque el uso de metal para componer la placa 4 hara la placa 4 mas duradera. La placa 4 tiene preferentemente unas dimensiones de una longitud de 127,7 mm (mas o menos 12,7 mm) por una anchura de 85,4 mm (mas o menos 12,7 mm). La altura de la placa 4 esta preferentemente entre 1 milimetro y 150 milimetros. La placa 4 se ajusta mas preferentemente a las normas ANSI/SBS 1-2004 y ANSI/SBS 2-2004. La placa 4 tiene una cara superior 12 y una cara inferior 10.
La placa 4 tiene uno o mas orificios 8, que pasan a traves de la cara inferior 10 de la placa 4 y de la cara superior 12 de la placa 4. Si hay noventa y seis (96) orificios 8, o trescientos ochenta y cuatro (384) orificios 8, o mil quinientos treinta y seis (1.536) orificios 8, entonces, la colocacion de los orificios 8 se ajusta preferentemente a la norma ANSI/SBS 4-2004. Los orificios 8 pasan a traves de la placa 4. En la cara superior 12, el orificio 8 tiene un diametro de entre 500 micrometros y treinta (30) milimetros. En la cara inferior 10, los orificios 8 tienen un diametro de entre 10 micrometros y dos milimetros, y preferentemente un diametro de entre 50 micrometros y 500 micrometros, y mas preferentemente un diametro de entre 50 micrometros y 350 micrometros. Cada orificio 8 tiene preferentemente un volumen suficiente para contener un minimo de 10 microlitros entre los planos definidos por la cara superior 12 y la cara inferior 10. Cada orificio 8 puede estar recubierto opcionalmente con silicona u otro recubrimiento que minimice la union de proteina a las paredes del orificio 8. El orificio(s) 8 puede ser conico o conico truncado con el extremo ancho del cono en la cara superior 12 de la placa 4 y el extremo estrecho del cono en la cara inferior 10 de la placa 4. El orificio(s) 8 puede ser cilindrico en la parte superior y conico o conico truncado en la parte inferior. El orificio(s) 8 puede ser cilindrico en la parte superior y conico o conico truncado en el medio, y cilindrico en la parte inferior. El orificio(s) 8 puede ser cilindrico en la parte superior y conico o conico truncado en el medio, y conico en la parte inferior con el extremo ancho de la abertura de cono inferior en la cara inferior 10 de la placa 4; en esta configuracion, el orificio(s) 8 tiene forma de mancuerna. Cualquier forma que permita que el liquido fluya a traves del orificio(s) 8 es aceptable. El perimetro en la parte mas ancha del orificio(s) 8 es preferentemente mayor que el perimetro del orificio(s) 8 donde el orificio(s) 8 esta cubierto por la pelicula 6.
El orificio(s) 8 deberia ser quimicamente inerte bajo las condiciones de uso. Preferentemente, el orificio(s) 8 no libera contaminantes que interfieren con las mediciones XRF de la muestra 18. Mas preferentemente, los orificios (8) no liberan mas de 5 partes por billon de azufre o 5 partes por billon de cloro o cinco partes por billon de fosforo en cualquier forma quimica cuando se expone a una solucion que comprende agua, proteinas, dimetilsulfoxido o dimetilformamida a 50 °C durante 3 horas.
El orificio(s) 8 es tambien preferentemente liso de tal manera que la muestra 18 no quede atrapada en superficies rugosas. Cualquier caracteristica de superficie en el orificio(s) 8 es preferentemente menor que 200 micrometros en la dimension normal de la cara interior del orificio(s) 8. La cara interior del orificio(s) 8 tiene una rugosidad media cuadratica (RMS) de menos de aproximadamente 20 micrometros. Un orificio (8) que tiene una depresion interna de 200 micrometros funciono aceptablemente en la presente invencion. Un orificio (8) que tiene una rugosidad de aproximadamente 5 micrometros funciono aceptablemente en la presente invencion. Para minimizar la cantidad de muestra 18 que llega a adherirse al lateral del orificio(s) 8, el orificio(s) 8 deberia tener un angulo incluido de menos de aproximadamente 45 grados, y mas preferentemente de menos de aproximadamente 42 grados, y lo mas
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La linea que define la interfaz entre la solucion, la superficie solida del orificio(s) 8, y la atmosfera se llama la linea de contacto. El orificio(s) 8 esta conformado preferentemente de tal manera que la longitud de la linea de contacto disminuye durante al menos una parte del tiempo en el que se reduce el volumen de la solucion. Es deseable que una parte de la muestra 18 se adhiera a la pelicula 6 si la pelicula 6 se separa; por lo tanto, es deseable que el orificio(s) 8 sea mas ancho donde linda con la pelicula 6 que donde el orificio(s) 8 es mas estrecho.
El orificio(s) 8 deberia tener una pequena zona de seccion transversal en la parte inferior, es decir, la localizacion donde el orificio(s) 8 linda con la pelicula 6. La seccion transversal del orificio(s) 8 en esta localizacion es de menos de aproximadamente 500 micrometros de diametro en una dimension, y es mas preferentemente de menos de 1000 micrometros de diametro en la otra dimension, de tal manera que la totalidad de la zona de seccion transversal del orificio(s) 8 en la localizacion donde el orificio(s) 8 linda con la pelicula 6 es de menos de aproximadamente 0,005 centimetros cuadrados.
La pelicula 6 se localiza al otro lado de la cara inferior 10 de la placa 4. La pelicula 6 puede sujetarse contra la cara inferior 10 de la placa 4 mediante un adhesivo opcional 14. Como alternativa, la pelicula 6 puede sujetarse contra la cara inferior 10 de la placa 4 mediante una placa inferior opcional 16, en cuyo caso la pelicula 6 se coloca entre la placa inferior 14 y la cara inferior 10 de la placa 4. Una junta 20 puede colocarse entre la pelicula 6 y la placa inferior 16. La pelicula 6 puede unirse a la cara inferior 10 de la placa 4 por calor o por un disolvente. La pelicula 6 puede estar unida de manera permanente a la placa 4 o puede ser extraible. La pelicula 6 esta preferentemente sustancialmente libre de al menos uno de los elementos de azufre, fosforo o cloro. Unos ejemplos de materiales adecuados incluyen Porvair #229302, Porvair #229112, Porvair #229058, Porvair #229304, y Porvair #229301, todos los cuales estan disponibles en Porvair plc, Brampton House, 50 Bergen Way, King's Lynn, Norfolk PE30 2JG, Reino Unido), unas laminas de aluminio (ejemplos: Lamina 'F' de microsellado de Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547). Otras cintas que pueden usarse para la pelicula 6 incluyen: cinta de proteccion superficial superdelgada de poliester, cinta de proteccion superficial Surlyn resistente a productos quimicos, cinta de proteccion superficial de poliuretano resistente a la abrasion, cinta Kapton resistente al calor con adhesivo de silicona o con adhesivo acrilico, cinta de proteccion superficial de polietileno resistente a UV, cinta de proteccion superficial de poliuretano de liberacion de limpieza, cinta de poliimida de baja estatica, todas disponibles en McMaster-Carr, 6100 Fulton Industrial Blvd., Atlanta, GA 30336 a 2852. Otros materiales que pueden usarse para la pelicula 6 incluyen una lamina de oro puro al 99,99 %, de 0,02 micrometros de espesor, disponible en Lebow Company, 5960 Mandarin Ave., Goleta, CA 93117 Estados Unidos; una lamina de aluminio puro al 99,95 % de 0,07 micrometros de espesor, disponible en Lebow Company, 5960 Mandarin Ave., Goleta, CA 93117 Estados Unidos; PARYLENE N® de 0,1 micrometros a 20 micrometros de espesor, disponible en Lebow Company, 5960 Mandarin Ave., Goleta, CA 93117 Estados Unidos; y una lamina de titanio puro al 99,99 % de 0,5 micrometros de espesor a 25,0 micrometros de espesor, disponible en Lebow Company, 5960 Mandarin Ave., Goleta, CA 93117 Estados Unidos; y polipropileno de 4 micrometros de espesor a 8 micrometros de espesor, disponible en Lebow Company, 5960 Mandarin Ave., Goleta, CA 93117 Estados Unidos. Otros sustratos que se usan convenientemente son AP1, AP3, ProLINE serie 10, ProLINE serie 20, sustratos DuraBeryllium de Moxtek, 452 West 1260 North, Orem, Utah 84057. Otros materiales que pueden usarse para la pelicula 6 son Ultralene®, mylar, policarbonato, proleno y kapton, disponibles en SPEX CertiPrep Ltd, 2 Dalston Gardens, Stanmore, Middlesex HA7 1BQ, Inglaterra. Otros materiales que pueden usarse convenientemente son Hostaphan®, poliester, y Etnom® disponibles en Chemplex Industries, Inc., 2820 SW 42a Avenue, Palm City, FL 34990-5573 Estados Unidos. Otro material que puede usarse convenientemente es una parte de pelicula de zona libre ZAF-PE-50, disponible en Excel Scientific, 18350 George Blvd, Victorville, CA, 92394. Esta lista no es exhaustiva, y pueden usarse otros materiales para la pelicula 6. La pelicula 6 puede estar hecha de fluorocarbonos. La pelicula 6 tambien esta preferentemente sustancialmente libre de elementos que tienen picos de emision de fluorescencia de rayos X que tienen energias entre 1,9 KeV y 3 KeV, debido a que estos picos tienden a interferir con las senales de mayor interes para la aplicacion del aparato 2 en aplicaciones bioquimicas y biologicas. Los elementos que tienen picos de emision de fluorescencia de rayos X que tienen energias entre 1,9 KeV y 3 KeV son: osmio, itrio, iridio, fosforo, zirconio, platino, oro, niobio, mercurio, talio, molibdeno, azufre, plomo, bismuto, tecnecio, rutenio, cloro, rodio, paladio, argon, plata, y torio. Si el aparato 2 se usa con un espectrometro de fluorescencia de rayos X que usa un detector de rayos x que comprende silicio, entonces la pelicula 6 tambien esta preferentemente libre de elementos que tienen picos de escape de fluorescencia de rayos X (es decir, picos de emision de fluorescencia de rayos X de menos de 1,74 KeV) que tienen energias entre 1,9 KeV y 3 KeV, debido a que estos picos de escape tienden a interferir con las senales de mayor interes para la aplicacion del aparato 2 en aplicaciones bioquimicas y biologicas. Los elementos que tienen picos de escape de fluorescencia de rayos X que tienen energias entre 1,9 KeV y 3 KeV son: calcio, telurio, yodo, escandio, xenon, cesio, bario, titanio, y lantano. “Sustancialmente libre" se define en el presente documento como que es menos de aproximadamente un 4 % en peso. La pelicula 6 puede tener elementos quimicos adicionales, que pueden usarse para medir el espesor de la muestra 18. Si se usa la fluorescencia de rayos X de dispersion de longitud de onda, entonces la pureza elemental de la pelicula 6 no es tan importante; en este caso, la pelicula deberia estar sustancialmente libre del elemento o los elementos que se usan para cuantificar la muestra. La pelicula 6 puede tratarse para aumentar la adhesion de proteinas; una lista no inclusiva de tratamientos incluye tratar la pelicula 6 con
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plasma de oxigeno o nitrogeno o con poli-lisina.
Si la pelicula 6 esta unida a la placa 4, entonces la pelicula 6 debe deformarse con la muestra 18. La peKcula 6 deformada a partir del plano definido por el perimetro del orificio(s) 8 donde el orificio(s) 8 linda con la peKcula 6, una distancia mmima de 100 nanometros.
Si la pelicula 6 puede desmontarse de la placa 4, entonces la placa 4 se deforma como resultado de la carga durante el uso normal. La placa 4 se deforma desde el plano de peiicula 6 una distancia minima de 10 micrometros.
Si la pelicula 6 no puede desmontarse de la cara inferior 10 de la placa 4, entonces la pelicula 6 es preferentemente translucida a los rayos X tienen energias de 2,3 KeV. En este caso, translucido se define como que permite al menos un 5 % de los rayos X que son normales a la pelicula 6 y que tienen una energia de 2,3 KeV para que pasen a traves de la pelicula 6, cuando la pelicula 6 se coloca en un plano que es perpendicular a una linea definida por la muestra 18 y un detector de rayos x. Las composiciones y espesores de material que pueden usarse para la pelicula 6 (si la pelicula 6 no puede desmontarse de la cara inferior 10 de la placa 4) pueden medirse o calcularse usando los parametros de atenuacion de rayos x para los diversos materiales. Una lista no exhaustiva de materiales que son adecuados para la pelicula 6 (si la pelicula 6 no puede desmontarse de la cara inferior 10 de la placa 4) incluye polipropileno, que es de menos de aproximadamente 195 micrometros de espesor, y policarbonato que es de menos de aproximadamente 105 micrometros de espesor.
El aparato 2 se usa con un espectrometro de fluorescencia de rayos X. El aparato 2 se usa preferentemente colocando una solucion de la muestra 18 en uno o mas orificios 8. Al menos una parte del disolvente que contiene la muestra 18 que se evapora a continuacion. Preferentemente, al menos el 80 % del disolvente de la muestra 18 se evapora; mas preferentemente, se evapora sustancialmente la totalidad del disolvente de la muestra 18. El disolvente se evapora preferentemente usando unas temperaturas elevadas que estan por encima de 22 °C o una reduccion de la presion atmosferica que es inferior a aproximadamente 760 torr. El aparato 2 se coloca preferentemente en una centrifugadora de vacio, tal como una Savant Speed Vac Plus SC 250DDA o un Thermo Savant SPD 1010 SpeedVac®. El disolvente se elimina preferentemente de la muestra 18 mientras el aparato 2 centrifuga y la muestra 18 se concentra recogiendose en la parte del orificio 8 que pasa a traves de la cara inferior 10 de la placa 4 y sobre una pelicula 6. La ventaja del aparato 2 es que la muestra se concentra en una zona pequena. Si la pelicula 6 puede desmontarse y la pelicula 6 es lo suficientemente gruesa de manera que no es translucida (translucida se define como que permite que al menos el 5 % de los rayos X que son normales a la pelicula 6 y que tienen una energia de 2.300 eV pasen a traves de la pelicula 6, cuando la pelicula 6 se coloca en un plano que es perpendicular a una linea definida por la muestra 18 y un detector de rayos x), entonces la pelicula 6 se separa a continuacion de la placa 4 y se mide en un espectrometro de fluorescencia de rayos X (por ejemplo, un EDAX Eagle III ^probe, disponible en EDAX, 91 McKee Drive Mahwah, NJ 07430; o un MicroXR VXR Microbeam XRF System, disponible en Thermo Fisher Scientific, Inc., 81 Wyman Street, Waltham, MA 02454). En este caso, la pelicula 6 esta orientada en el espectrometro de fluorescencia de rayos X de manera que la muestra 18 esta entre la pelicula 6 y el detector de rayos X del espectrometro de fluorescencia de rayos X. La pelicula 6 se sujeta preferentemente en un bastidor 20 para sujetar la pelicula 6 plana. Si la pelicula 6 es translucida a los rayos X como se ha definido anteriormente, entonces la muestra 18 puede medirse sin separar la pelicula 6 de la placa 4. Si la pelicula 6 es translucida a los rayos X, entonces la muestra 18 puede medirse usando un espectrometro de fluorescencia de rayos X con la pelicula 6 orientada entre la muestra 18 y el detector de rayos x, si se separa o no la pelicula 6 de la placa 4. La ventaja de no separar la pelicula 6 de la placa 4 es que la placa 4 funciona como un bastidor, y por lo tanto no es necesario un bastidor adicional 20. La ventaja de separar la pelicula 6 es que la muestra 18 puede medirse sin atenuacion de la pelicula 6. El aparato 2 se usa preferentemente con un espectrometro de fluorescencia de rayos X, cuyo tamano del haz se corresponde con el tamano de la muestra 18 despues de que el disolvente se ha evaporado; en este caso un tamano de haz coincidente se define como la zona del haz de excitacion de rayos X que contiene al menos un 80 % del flujo de rayos X que incide sobre la muestra 18 que esta dentro de un factor de 100 de la zona de la muestra 18. La fuente de excitacion de rayos X puede ser enfocada, tal como por medio de una optica de enfoque policapilar ofrecida por X-Ray Optical Systems, Inc., 15 Tech Valley Drive, East Greenbush, Nueva York 12061. Un espectrometro de fluorescencia de rayos X equipado con un colimador u otro tipo de optica de enfoque en la fuente de excitacion de rayos X tambien es aceptable.
La ventaja de usar un aparato 2 para preparar muestras para las mediciones de espectrometria de fluorescencia de rayos X es que los limites de medicion son mejores cuando se usa un aparato 2 en comparacion con simplemente pipeteando o imprimiendo una muestra en una pelicula como se describe, por ejemplo, en Miller TC et al. “Semiconductor applications of nanoliter droplet methodology with total reflection x-ray fluorescence analysis". Spectrochimica Acta B. 2004, 59: 1117-1124; o Miller TC y GJ Havrilla. “Nanodroplets: a new method for dried spot preparation and analysis" X-Ray Spect 2004, 33:101-106. La segunda ventaja de usar el aparato 2 es que muchas muestras biologicas se preparan como soluciones diluidas, por ejemplo, como unas soluciones diluidas de proteinas. El aparato 2 permite volumenes relativamente grandes de una solucion de muestra a prepararse, y la muestra se concentra en una gota seca de muestra con unas propiedades optimas. Los volumenes de solucion estan preferentemente entre 2 microlitros a 2 mililitros, y mas preferentemente estan entre 10 microlitros y 250 microlitros. En contraste, los metodos de preparacion de muestras existentes requieren unas soluciones de muestra altamente concentradas con el fin de depositar una cantidad suficiente de muestra para la medicion. Tambien en contraste, los
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metodos de preparacion de muestras existentes requieren una gran cantidad de muestra para cebar el cabezal de impresion o llenar sus depositos, lo que desecha muestra valiosa. Por ejemplo, supongase que se desea medir aproximadamente 30 picogramos de azufre en una muestra. Usando los metodos de deposicion convencionales, que podrian usar 10 nanolitros de solucion, la concentracion de azufre en la solucion inicial tendria que ser 100 micromoles. Usando un aparato 2, pueden usarse 100 microlitros de disolvente, lo que resulta en una concentracion de muestra inicial de 10 nanomoles. Para la biologia, la bioquimica, y el desarrollo de farmacos, es importante ser capaz de trabajar con soluciones que tengan una concentracion de nanomoles, frente a unas soluciones con decenas o cientos de concentraciones de micromoles. Si el aparato 2 se usa con una proteina o un acido nucleico, la masa del azufre o de fosforo o una combinacion de azufre y fosforo en la proteina o en el acido nucleico esta preferentemente entre 50 femtogramos y 1 microgramo, y mas preferentemente la masa del fosforo o del azufre o las combinaciones de los mismos en la muestra 18 esta entre 100 picogramos y 100 nanogramos.
La muestra 18 se deposita en una forma que esta definida por la forma del orificio 8 a medida que penetra en la cara inferior 10 de la placa 4. La forma mas eficiente para la muestra 18 es una que sea similar al tamano del haz de excitacion de rayos x del espectrometro de fluorescencia de rayos X. Por lo general, tanto la muestra 18 como el haz de excitacion de rayos X son aproximadamente de contorno circular. Similitud, en este contexto, significa que la zona de la muestra 18 esta dentro de un factor de 100 veces mayor o menor que la zona del haz de excitacion de rayos X, ya que ilumina la muestra 18 (por ejemplo, el diametro de la muestra 18 esta dentro de un factor de 10 del haz de excitacion de rayos X, ya que ilumina la muestra 18). Preferentemente, la muestra 18 esta dentro de un factor de 25 veces mas grande o mas pequeno que la zona del haz de excitacion de rayos X, ya que ilumina la muestra 18 (por ejemplo, el diametro de la muestra 18 esta dentro de un factor de 5 del haz de excitacion de rayos X que ilumina la muestra 18). Si la zona del haz de excitacion de rayos X, que ilumina la muestra 18 es significativamente mayor que la zona de la muestra 18, entonces se desperdician los fotones de rayos X. Si la zona del haz de excitacion de rayos X, que ilumina la muestra 18 es significativamente menor que la zona de la muestra 18, entonces el tiempo de medicion sera innecesariamente largo, o bien una parte de la muestra 18 se desperdiciara porque no se esta midiendo.
La muestra 18 comprende normalmente una muestra acuosa de una proteina o un acido nucleico, que se ha modificado opcionalmente sumando un inhibidor, un cofactor, un metal, una proteina, un azucar, u otro producto quimico. La muestra 18 puede medirse convenientemente usando un instrumento de fluorescencia de rayos X. Este instrumento de fluorescencia de rayos X comprende preferentemente al menos uno de los siguientes: una optica de enfoque monocapilar, una optica de enfoque policapilar, un colimador, un tubo de rayos X de micro enfoque, una fuente de rayos X de sincrotron, una fuente de rayos X de acelerador lineal, un tubo de rayos X de rodio, un tubo de rayos X de molibdeno, un tubo de rayos X de cromo, un tubo de rayos X de plata, un tubo de rayos X de paladio, una fuente de rayos X monocromatica, una fuente de rayos X policromatica, una fuente de rayos X polarizada, una disposicion de enfoque de espectrometro de fluorescencia de rayos X confocal, un detector de diodo PIN, un detector de rayos X de semiconductor, un detector de rayos X de germanio o dopado de germanio, un detector de rayos X de silicio o dopado de silicio, un espectrometro de fluorescencia de rayos X de dispersion de longitud de onda, un espectrometro de fluorescencia de rayos X de dispersion de energia, un espectrometro de fluorescencia de rayos X de reflectancia total, y similares.
Si la pelicula 6 contiene unos elementos quimicos adicionales que puedan medirse con el espectrometro de fluorescencia de rayos X que se usa con el aparato 2, entonces estos elementos pueden usarse para medir el espesor de la muestra 18. Por ejemplo, si la pelicula 6 contiene silicio, entonces la atenuacion de la senal de rayos x de silicio por la muestra 18 permitira que se estime el espesor de la muestra 18. La figura 5 muestra los espesores relativos de una muestra de proteina depositada usando el aparato 2 y una muestra de proteina depositada usando una pipeta. La muestra de proteina depositada usando un aparato 2 es significativamente mas compacta y carece de la forma de anillo, en comparacion con las muestras depositadas por una pipeta que muestran alternativamente unos anillos de muestra depositada y unos anillos que se agotan en la muestra. La figura 3 muestra una fotografia de una muestra depositada por una pipeta. La figura 3 muestra tambien una fotografia de una muestra depositada usando el aparato 2. La muestra depositada usando una pipeta es significativamente mas grande y tiene mas anillos que la muestra depositada usando el aparato 2. La muestra mas compacta depositada usando un aparato 2 proporciona una senal mas intensa en el espectro de fluorescencia de rayos x, como se muestra en la figura 4. Unas correcciones de espesor se realizan midiendo la senal de la pelicula 6 (por ejemplo, una senal de silicio) en una region donde no hay muestra 18, y midiendo la misma senal elemental de una region de la pelicula 6 que esta cubierta por la muestra 18. La diferencia en la senal de rayos X de la pelicula puede relacionarse con el espesor de la muestra 18 calculando el espesor de la muestra 18 necesario para atenuar la senal de rayos x por la cantidad medida.
El aparato 2 puede usarse con proteinas. Muchas proteinas requieren un regulador para mantener el pH dentro de un intervalo especifico (por ejemplo un regulador de pH), o para mantener el estado redox de un producto quimico (por ejemplo, un regulador redox), o para mantener una fuerza ionica (por ejemplo, un regulador isotonico). Muchos reguladores contienen elementos que pueden interferir con la medicion de la quimica. El regulador debe estar preferentemente libre de al menos un elemento quimico con un numero atomico mayor que cuatro, donde ese elemento quimico esta presente en la muestra 18. El regulador deberia estar mas preferentemente libre de al menos un elemento quimico que tenga un numero atomico mayor de ocho, donde ese elemento quimico esta presente en la
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muestra 18. El regulador deberia estar preferentemente libre de al menos uno de los siguientes productos qmmicos o grupos funcionales: dimetilsulfoxido, tioles, anion de sulfato, anion de sulfonato, anion de cloruro, anion de bromuro, anion de fluoruro, anion de yoduro, anion de perclorato, anion de fosfato, y anion de fosfonato. El regulador comprende preferentemente uno o mas de los siguientes grupos quimicos o funcionales: amina, imina, anion de nitrato, anion de nitrito, cation de amonio, anion de acetato, anion de carboxilato, anion de carbonato, y cation de iminio; estos productos quimicos ofrecen las propiedades de regulacion correctas con una minima interferencia de fluorescencia de rayos x. El mas preferentemente, el regulador comprende una sal de nitrato de amonio tal como el nitrato de tris (etanol) amina, tambien conocido como tris nitrato.
Las proteinas a usarse con la presente invencion se purifican preferentemente para eliminar los productos quimicos, incluyendo reguladores de pH y reguladores redox y reguladores isotonicos, que no estan quimicamente unidos o que se unen debilmente a la proteina. Esta purificacion tambien elimina las sales que contribuyen a la mala calidad de la muestra. Debilmente unido se define en el sentido de que tiene una afinidad de union que es mas debil que alrededor de diez milimoles. Esta etapa de desalacion puede realizarse convenientemente usando la cromatografia de filtracion en gel o la cromatografia de exclusion por tamano, una columna de proteina de giro rapido que usa un Sephadex G-25, esta disponible en Roche Applied Science, PO Box 50414, Indianapolis, IN, 46250. Este proceso es susceptible de multiplexacion usando un formato de placa de pocillos, tal como un formato de placa de 96 pocillos, 384 pocillos, o 1536 pocillos. Los sistemas de separaciones tales como las placas de 96 pocillos Zeba disponibles en Pierce Biotechnology Inc., PO Box 117, Rockford, Illinois, 61105, son especificamente convenientes. La ventaja de la elimination de los reguladores y otros productos quimicos unidos debilmente es que su elimination minimiza los elementos de interferencia que podrian atenuar la senal de fluorescencia de rayos X deseada o anadir unas senales de fluorescencia de rayos x enganosas, o que crean unas senales de rayos x no fluorescentes por medio de la difraccion y otros procesos similares.
Tanto el proceso de cromatografia de filtracion en gel monoplexado como multiplexado pueden acelerarse usando una centrifugadora, tal como la IEC CL40 disponible en Thermo Fisher Scientific, producto # 11210923, 450 Fortune Blvd, Milford, MA, 01757; o un colector de vacio, tal como un aparato de vacio, tal como el colector de vacio MultiScreen con apilamiento directo de Millipore, 290 Concord Road, Billerica, MA 01821, unido a una bomba de vacio convencional (por ejemplo, Millipore, Catalogo # WP61 115 60) tambien disponible en Millipore. Las separaciones se realizan preferentemente en menos de 300 segundos de centrifugation, y se realizan mas preferentemente en menos de 30 segundos de centrifugacion. Un metodo alternativo de separation es la ultrafiltracion, tal como podria realizarse usando un Centricon YM-3 centrifugado durante 3 horas a 7000 g.
La desalacion por columnas de exclusion por tamano puede usarse convenientemente con el aparato 2, usando una placa de pocillos de desalacion que tiene el mismo numero de pocillos y localizaciones de pocillos que numeros y localizaciones de orificios 8 en el aparato 2. La placa de desalado se coloca en la parte superior del aparato 2, y una solution de la muestra 2 se coloca en uno o mas de los pocillos de la placa de desalado. La placa de desalado apilada y el aparato 2 se centrifugan hasta que la solucion que contiene la muestra 18 pasa a traves de la placa de desalinizacion y entra en el orificio 8 del aparato 2. El aparato 2 se coloca a continuation en una centrifugadora de vacio como se ha descrito anteriormente. Como alternativa, la solucion de la muestra 18 puede desalarse y transferirse a un aparato 2, por ejemplo, mediante una pipeta.
Si la muestra 18 comprende una proteina, esta deberia estar preferentemente presente en una concentration de menos de 10 micromoles, y mas preferentemente de menos de 100 nanomoles. Ademas de las proteinas, otras moleculas biologicas que pueden usarse incluyen acidos nucleicos, polisacaridos, peptidos, y otras moleculas de origen biologico; como las proteinas, estas estan presentes preferentemente en la solucion a concentraciones de menos de 10 micromoles, y mas preferentemente de menos de 100 nanomoles.
La description anterior de la invencion se ha presentado con fines de ilustracion y description y no pretende ser exhaustiva o limitar la invencion a la forma precisa desvelada, y obviamente, son posibles muchas modificaciones y variaciones a la luz de las ensenanzas anteriores.
La realizacion(s) se ha elegido y descrito con el fin de explicar mejor los principios de la invencion y su aplicacion practica para permitir de este modo que otros expertos en la materia usen mejor la invencion en varias realizaciones y con varias modificaciones que sean adecuadas para el uso especifico contemplado. Se pretende que el alcance de la invencion este definido por las reivindicaciones adjuntas a la misma.

Claims (5)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un aparato (2) para preparar una o mas muestras para la medicion por espectrometria de fluorescencia de rayos X, que comprende una placa de pocillos (4) que tiene al menos un orificio (8) que atraviesa dicha placa de pocillos;
    5 pasando dicho al menos un orificio a traves de la placa de pocillos desde una cara a la otra cara, cubriendo una pelicula (6) dicho orificio, siendo dicha pelicula (6) al menos un 5 % translucida a 2.300 eV de rayos X orientados normales a dicha pelicula (6), caracterizado por que dicho orificio (8) tiene un diametro de menos de 500 micrometros en al menos una dimension paralela a dicha pelicula (6) en el lugar donde dicho orificio (8) linda con dicha pelicula (6) y una zona de seccion transversal de menos de 0,005 centimetros cuadrados donde dicho orificio 10 (8) linda con dicha pelicula (6), y en el que las paredes de dicho orificio (8) tienen una rugosidad RMS de menos de
    20 micrometros.
  2. 2. El aparato (2) de la reivindicacion 1, en el que dicha pelicula (6) puede deformarse a partir del plano definido por la parte de dicho orificio (8) que linda con dicha pelicula (6), siendo dicha deformacion de al menos 100 nanometros.
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  3. 3. Un metodo para preparar una muestra para la medicion por espectrometria de fluorescencia de rayos X, que comprende proporcionar una solucion que tiene una concentration de soluto de menos de aproximadamente 10 micromoles y un volumen de entre aproximadamente 2 microlitros y aproximadamente 2 mililitros, concentrar la solucion en una muestra que tiene menos de una quinta parte del volumen original de la solucion y analizar la
    20 muestra usando la espectrometria de fluorescencia de rayos X, caracterizado por que la muestra se concentra en un orificio (8) de un aparato de acuerdo con la reivindicacion 1.
  4. 4. El metodo de la reivindicacion 3, en el que el soluto tiene una masa total de entre 50 femtogramos y 1 microgramo de un elemento seleccionado de la lista de fosforo, azufre y combinaciones de los mismos.
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  5. 5. El metodo de la reivindicacion 3, en el que el pocillo tiene un angulo incluido de menos de 45 grados.
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