ES2586580T3 - Inmunización de mamíferos grandes con dosis bajas de ARN - Google Patents

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Abstract

Un ARN auto-replicante que codifica un inmunógeno para su uso en unos procedimientos profilácticos o terapéuticos de aumento de una respuesta inmunitaria en un mamífero grande mediante la liberación no vírica de dicho ARN, que comprende: (i) administrar al mamífero una dosis de entre 2 μg y 100 μg de dicho ARN que codifica un inmunógeno, en el que el mamífero grande es un ser humano, caballo, ganado o cerdo y el ARN se administra en combinación con un sistema de liberación que comprende: (i) liposomas; (ii) micropartículas de un polímero no tóxico y biodegradable; y/o (iii) una emulsión de aceite en agua catiónica submicrométrica.

Description

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DESCRIPCION
Inmunizacion de mairnferos grandes con dosis bajas de ARN Campo tecnico
La presente invencion pertenece al campo de la liberacion no vmca de ARN para inmunizacion.
Antecedentes de la tecnica
La liberacion de acidos nucleicos para la inmunizacion de animales ha sido una meta durante varios anos. Se han ensayado diversos enfoques, incluyendo el uso de ADN o ARN, de vehmulos de liberacion vmcos o no vmcos (o incluso sin vehmulo de liberacion, en una vacuna “desnuda”), de vectores replicantes o no replicantes, o de vectores vmcos o no vmcos.
Se han liberado diversas dosis diferentes de acidos nucleicos en estudios previos in vivo. La referencia 1 ha liberado 50 |ig de lipoplexos de ARNm o ADN en ratones, pero tambien ha usado dosis intralinguales de 1 |ig y 10 |ig para analizar la expresion de la luciferasa en el tejido de la lengua. La referencia 2 ha liberado 12 |ig de ARNm que codifica una nucleoprotema del virus de la gripe en ratones. La referencia 3 ha liberado 0,1 |ig, 1 |ig o 10 |ig de ARN auto-replicante que codifica p-galactosidasa en ratones. La referencia 4 ha liberado 10 |ig de ARN auto-replicante que codifica una glucoprotema del virus de la rabia en ratones. La referencia 5 ha liberado un total de 2 |ig o 4 |ig de ADN que codifica la hemaglutinina de la gripe en humanos, pero no ha liberado ARN. Fleeton y col. (Journal of Infectious Diseases, vol. 183, n.° 9, 2001, paginas 1395-1398) ha liberado 10 |ig de ARN auto-replicante en ratones. El documento WO 02/061113 ha liberado 0,1 |ig, 1 |ig o 10 |ig de ARN auto-replicante en ratones. Leitner y col. (Vaccine, vol. 18, 1999, paginas 765-777) informa de datos en los que se ha liberado 0,1 |ig de ARN auto-replicante en ratones. Chambers y col. (Clinical Infectious Diseases, vol. 30, Suplemento 3, 2000, paginas S283-S287) ha liberado 100 |ig de ADN en ratones o 1 mg de ADN en ganado. Vassilev y col. (Vaccine, vol. 19, n.° 15-16, 2001, paginas 2012-2019) ha liberado 0,6 |ig de ARN infeccioso a terneros u ovejas.
La experiencia con las vacunas de ADN se ha fomentado en trabajos anteriores con animales pequenos (por ejemplo, ratones) pero a medida que la tecnologfa se traslado a animales grandes (por ejemplo, seres humanos) se hizo evidente que se reducfa la potencia. Por consiguiente se necesitanan dosis muy altas (por ejemplo, miligramos mejor que microgramos), pero el ADN de grado clmico es caro de fabricar.
Persiste una necesidad de vacunas de acidos nucleicos adicionales y mejoradas.
Divulgacion de la invencion
De acuerdo con un primer aspecto de la invencion, se libera ARN que codifica un inmunogeno en un marnffero grande a una dosis de entre 2 |ig y 100 |ig como se define en las reivindicaciones. Como se muestra a continuacion, una dosis de 66 |ig es inmunogenica en terneros. Una vaca adulta tiene un peso corporal ~ 10x el de un adulto humano y asf el inventor ha mostrado que una dosis en seres humanos de ARN de 5-10 |ig es realista.
Como se muestra a continuacion, una dosis de ~ 0,94 |ig/kg es inmunogenica en el ganado. Los estudios de la tecnica anteriores han usado de 100 ng a 10 |ig de ARN en ratones que, con un peso corporal de ~ 20 g, es de 5 |ig/kg a 500 |ig/kg.
Por consiguiente la invencion proporciona un ARN auto-replicante que codifica un inmunogeno para su uso en un procedimiento in vivo de aumento de una respuesta inmunitaria en un marnffero grande mediante la liberacion no vmca de dicho ARN, en la que el procedimiento comprende la administracion de entre 2 |ig y 100 |ig de ARN al mamffero, en el que el mamffero grande es un ser humano, caballo, ganado, o cerdo y el ARN se administra en combinacion con un sistema de liberacion que comprende: (i) liposomas; (ii) micropartfculas de un polfmero no toxico y biodegradable; y/o (iii) una emulsion de aceite en agua submicrometrica cationica.
La invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica para su uso en un procedimiento de inmunizacion de un ser humano, caballo, ganado, o cerdo frente a una enfermedad, que comprende entre 2 |ig y 100 |ig de ARN auto-replicante que codifica un inmunogeno para la liberacion no vmca por unidad de dosis y un sistema de liberacion que comprende: (i) liposomas; (ii) micropartfculas de un polfmero no toxico y biodegradable; y/o (iii) una emulsion de aceite en agua submicrometrica cationica. En un volumen de dosificacion normal de 0,5 ml la concentracion del ARN que codifica un inmunogeno sera por lo tanto de entre 4 |ig/ml y 200 |ig/ml.
Puede usarse un dispositivo de liberacion (por ejemplo, una jeringa, nebulizador, pulverizador, inhalador, parche dermico, etc.) que contiene la composicion farmaceutica para su administracion a un mai^ero grande, en el que la composicion en el dispositivo contiene entre 2 |ig y 100 |ig de ARN que codifica un inmunogeno.
Puede usarse un recipiente hermeticamente sellado que contenga la composicion farmaceutica para la administracion a un marnffero grande, en el que la composicion en el recipiente contiene entre 2 |ig y 100 |ig de ARN
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que codifica un inmunogeno.
Administracion
La invencion implica la administracion de ARN a un mairnfero grande, como se define en las reivindicaciones. El lugar de administracion normalmente sera el tejido muscular, tal como el musculo esqueletico. Las alternativas a la administracion intramuscular incluyen, pero sin limitacion: la administracion intradermica, intranasal, intraocular, subcutanea, intraperitoneal, intravenosa, intersticial, bucal, transdermica, o sublingual. La administracion intradermica e intramuscular son dos vfas preferidas.
La administracion puede lograrse de diversas maneras. Por ejemplo, puede usarse una inyeccion mediante una aguja (por ejemplo, una aguja hipodermica), particularmente para la administracion intramuscular, subcutanea, intraocular, intraperitoneal o intravenosa. Puede usarse como una alternativa la inyeccion sin aguja.
La inyeccion intramuscular es la via preferida de administracion de ARN de acuerdo con la invencion. Es tfpica la inyeccion en la parte superior del brazo, el musculo deltoides o del muslo (por ejemplo, muslo anterolateral).
El lugar de administracion puede incluir tanto celulas inmunitarias (tales como macrofagos, por ejemplo, macrofagos derivados de la medula osea), celulas dendnticas (por ejemplo, celulas dendnticas plasmocitoides derivadas de la medula osea y/o celulas dendnticas mieloides derivadas de la medula osea), monocitos (por ejemplo, monocitos de sangre periferica de seres humanos), etc.) y celulas no inmunitarias (tales como celulas musculares, que pueden ser multinucleadas y pueden disponerse en fasdculos, y/o fibroblastos). Las celulas inmunitarias pueden estar presentes en el momento de la administracion, pero normalmente infiltraran el lugar despues de la administracion. Por ejemplo, el dano tisular causado por una administracion invasiva (por ejemplo, causado por una aguja en el lugar de administracion) puede producir que las celulas inmunitarias infiltren el area danada.
El ARN entra en el citoplasma de las celulas inmunitarias y/o las celulas no inmunitarias. La entrada puede ser mediante endocitosis. Dentro de los endosomas de las celulas inmunitarias el ARN puede unirse al TLR7 (ARNcs), TLR8 (ARNcs) o TLR3 (ARNcd), desencadenando de este modo rutas inmunitarias innatas. Cuando el ARN se escapa de los endosomas en el citoplasma de las celulas inmunitarias y no inmunitarias puede unirse a las ARN helicasas (por ejemplo, en la familia del receptor de tipo RIG I es decir los RLR) tales como RIG-I (RLR-1), MDA5 (RLR-2) y/o LGp2 (RLR-3), desencadenando tambien rutas inmunitarias innatas. El ARN tambien puede traducirse en las celulas inmunitarias y/o no inmunitarias, conduciendo a la expresion del inmunogeno, y en ultima instancia a la presentacion del inmunogeno expresado mediante el sistema CMH. Las celulas tambien pueden secretar interferones de tipo I y/o citoquinas pro-inflamatorias para proporcionar un efecto adyuvante local.
Para aumentar tanto la entrada en las celulas inmunitarias y no inmunitarias como tambien los efectos intercelulares posteriores, y tambien para reducir la cantidad de ARN requerida para un buen efecto inmunogenico, el ARN se administra en combinacion con un sistema de liberacion que comprende: (i) liposomas (ii) micropartfculas de un polfmero no toxico y biodegradable (iii) emulsiones de aceite en agua cationicas submicrometricas. Los liposomas son un sistema de liberacion preferido.
De acuerdo con un primer aspecto de la invencion, el ARN que codifica un inmunogeno se libera a un mamffero grande a una dosis de entre 2 |ig y 100 |ig, como se define en las reivindicaciones. Por ejemplo, la dosis puede ser entre 5 |ig y 75 |ig, entre 6 |ig y 50 |ig, entre 7 |ig y 25 |ig, entre 8 |ig y 20 |ig, o entre 9 |ig y 15 |ig.
Las dosis espedficas pueden ser 5 |ig, 6 |ig, 7 |ig, 8 |ig, 9 |ig, 10 |ig, 11 |ig, 12 |ig, 13 |ig ,14 |ig, 15 |ig, 20 |ig, 25 |ig, 30 |ig, 35 |ig, 40 |ig, 45 |ig, 50 |ig, 60 |ig, 70 |ig, 80 |ig, 90 |ig, o 100 |ig. Una dosis para un ser humano puede ser 5-10 |ig.
Liposomas
Diversos lfpidos anfifflicos pueden formar bicapas en un medio acuoso para encapsular un nucleo acuoso que contiene ARN como liposoma. Estos lfpidos pueden tener un grupo de cabeza hidrofilo anionico, cationico o zwitterionico. La formacion de liposomas de fosfolfpidos anionicos existe desde la decada de los 60 del siglo XX, y los lfpidos que forman liposomas cationicos se han estudiado desde de la decada de los 90 del siglo XX. Algunos fosfolfpidos son anionicos mientras que otros son zwitterionicos y otros son cationicos. Las clases adecuadas de fosfolfpidos incluyen, pero sin limitacion, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilcolinas, fosfatidilserinas, y fosfatidilgliceroles, y algunos fosfolfpidos utiles se indican en la Tabla 1. Los lfpidos cationicos utiles incluyen, pero sin limitacion, dioleoil trimetilamonio propano (DOTAP), 1,2-diesteariloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DEDMA), 1,2- dioleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DODMA), 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DLinDMA), 1,2- dilinoleniloxi-N, N-dimetil-3-aminopropano (DLenDMA). Los lfpidos zwitterionicos incluyen, pero sin limitacion, lfpidos acil zwitterionicos y lfpidos eter zwitterionicos. Los ejemplos de lfpidos zwitterionicos utiles son DPFC, DOFC y dodecilfosfocolina. Los lfpidos pueden ser saturados o insaturados. Se prefiere el uso de al menos un lfpido insaturado para la preparacion de liposomas. Si un lfpido insaturado tiene dos colas, ambas colas pueden ser insaturadas, o puede tener una cola saturada y una cola insaturada.
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Los liposomas pueden formarse a partir de un unico Ifpido o a partir de una mezcla de Kpidos. Una mezcla puede comprender (i) una mezcla de lfpidos anionicos (ii) una mezcla de Ifpidos cationicos (iii) una mezcla de Ifpidos zwitterionicos (iv) una mezcla de lfpidos anionicos y Kpidos cationicos (v) una mezcla de lfpidos anionicos y lfpidos zwitterionicos (vi) una mezcla de lfpidos zwitterionicos y lfpidos cationicos o (vii) una mezcla de lfpidos anionicos, lfpidos cationicos y Upidos zwitterionicos. De manera similar, una mezcla puede comprender tanto lfpidos saturados como insaturados. Por ejemplo, una mezcla puede comprender DEFC (zwitterionico, saturado), DlinDMA (cationico, insaturado), y/o DMG (anionico, saturado). Cuando se usa una mezcla de lfpidos, no todos los componentes lipfdicos en la mezcla necesitan ser anfifflicos, por ejemplo, uno o mas ffpidos anfifflicos pueden mezclarse con colesterol.
La parte hidrofila de un ffpido puede estar pegilada (es dedr, modificada mediante union covalente de un polietilenglicol). Esta modificacion puede aumentar la estabilidad y prevenir la adsorcion no espedfica de los liposomas. Por ejemplo, los ffpidos pueden conjugarse con PEG usando tecnicas tales como las desveladas en la referencia 6 y 7. Pueden usarse diversas longitudes de PEG, por ejemplo entre 0,5-8 kDa.
Se usa una mezcla de DEFC, DlinDMA, PEG-DMG y colesterol en los ejemplos.
Los liposomas normalmente se dividen en tres grupos: vesfculas multilamelares (VML); vesfculas unilamelares pequenas (VUP); y vesfculas unilamelares grandes (VUG). Las VML tienen multiples bicapas en cada vesfcula, formando varios compartimentos acuosos independientes. Las VUP y VUG tienen una unica bicapa que encapsula un nucleo acuoso; las VUP normalmente tienen un diametro < 50 nm, y las VUG tienen un diametro > 50 nm. Los liposomas utiles de la invencion son idealmente las VUP con un diametro en el intervalo de 50-220 nm. Para una composicion que comprende una poblacion de VUP con diferentes diametros: (i) al menos el 80 % en numero debena tener diametros en el intervalo de 20-220 nm, (ii) el diametro medio (promedio Z, por intensidad) de la poblacion esta idealmente en el intervalo de 40-200 nm, y/o (iii) los diametros debenan tener un mdice de polidispersidad < 0,2. Se espera que los complejos liposoma/ARN de la referencia 1 tengan un diametro en el intervalo de 600-800 nm y que tengan una alta polidispersidad.
Las tecnicas para la preparacion de liposomas adecuados se conocen bien en la tecnica, por ejemplo, veanse las referencias 8 a 10. Se describe un procedimiento util en la referencia 11 e implica mezclar (i) una solucion etanolica de los ffpidos (ii) una solucion acuosa del acido nucleico y (iii) un tapon, seguido de un mezclado, equilibrado, dilucion y purificacion. Los liposomas preferidos de la invencion son obtenibles mediante este procedimiento de mezclado.
El ARN preferentemente se encapsula en los liposomas, y de esta manera los liposomas forman una capa externa alrededor de un nucleo acuoso que contiene el ARN. Se ha encontrado que esta encapsulacion protege al ARN de la digestion de la ARNasa. Los liposomas pueden incluir algun ARN externo (por ejemplo, en la superficie de los liposomas), pero al menos la mitad del ARN (e idealmente todo el) esta encapsulado.
Micropartculas polimericas
Diversos poffmeros pueden formar microparffculas para encapsular o adsorber el ARN. El uso de un poffmero esencialmente no toxico significa que un receptor puede recibir de manera segura las parffculas, y el uso de un poffmero biodegradable significa que las parffculas pueden metabolizarse despues de la liberacion para evitar la permanencia a largo plazo. Los poffmeros utiles tambien son esterilizables, para ayudar a la preparacion de formulaciones de grado farmaceutico.
Los poffmeros no toxicos y biodegradables adecuados incluyen, pero sin limitacion, poli(a-hidroxiacidos), acidos polihidroxi butmcos, polilactonas (incluyendo policaprolactonas), polidioxanonas, polivalerolactona, poliortoesteres, poliantffdridos, policianoacrilatos, policarbonatos derivados de tirosina, polivinil-pirrolidinonas o poliester-amidas y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, las microparffculas se forman a partir de poli(a-hidroxiacidos), tales como unas poli(lactidas) (“PLA”), copolfmeros de lactida y glicolida tales como una poli(D,L-lactida-co-glicolida) (“PLG”), y copolfmeros de D,L-lactida y caprolactona. Los polfmeros de PLG utiles incluyen los que tienen una relacion molar lactida/glicolida que vana, por ejemplo, de 20:80 a 80:20, por ejemplo, 25:75, 40:60, 45:55, 50:50, 55:45, 60:40, 75:25. Los polfmeros de PLG utiles incluyen los que tienen un peso molecular entre, por ejemplo, 5.000-200.000 Da, por ejemplo, entre 10.000-100.000, 20.000-70.000, 30.000-40.000, 40.000-50.000 Da.
Las micropardculas idealmente tienen un diametro en el intervalo de 0,02 |im a 8 |im. Para una composicion que comprende una poblacion de micropardculas con diferentes diametros al menos el 80 % en numero debenan tener diametros en el intervalo de 0,03-7 |im.
Las tecnicas para la preparacion de micropartfculas adecuadas se conocen bien en la tecnica, por ejemplo, veanse las referencias 10,12 (en particular el capftulo 7) y 13. Para facilitar la adsorcion de ARN, una micropartfcula puede incluir, por ejemplo, un tensioactivo y/o lfpido cationico como se desvela en las referencias 14 & 15. Una via alternativa de fabricacion de micropartfculas polimericas es, por ejemplo, moldeando y curando como se desvela en la referencia 16.
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Las micropartfculas de la invencion pueden tener un potencial zeta de entre 40-100 mV.
Una ventaja de las micropartfculas sobre los liposomas es que se liofilizan facilmente para un almacenamiento estable.
El ARN puede adsorberse a las micropartfculas, y la adsorcion se facilita incluyendo materiales cationicos (por ejemplo, lfpidos cationicos) en la micropartfcula.
Emulsiones de aceite en agua cationicas
Las emulsiones de aceite en agua cationicas se conocen por ser adyuvantes de las vacunas de la gripe por ejemplo, el adyuvante MF59™ en el producto FLUAD™, y el adyuvante AS03 en el producto PEPANDRIX™. La liberacion del ARN de acuerdo con la presente invencion puede utilizar una emulsion de aceite en agua, siempre que la emulsion incluya una o mas moleculas cationicas. Por ejemplo, un lfpido cationico puede incluirse en la emulsion para proporcionar una superficie de la gota positiva a la que puede unirse el ARN cargado negativamente.
La emulsion comprende uno o mas aceites. El/los aceite(s) adecuado(s) incluye(n) el/los de, por ejemplo, una fuente animal (por ejemplo, tal como el pescado) o una vegetal. El aceite es idealmente biodegradable (metabolizable) y biocompatible. Las fuentes para aceites vegetales incluyen frutos secos, semillas y granos. Son ejemplos de aceites de frutos secos, el aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite de coco y aceite de oliva, los mas disponibles comunmente. El aceite de jojoba puede usarse, por ejemplo, obtenido de la semilla de jojoba. Los aceites de semillas incluyen aceite de cartamo, aceite de semilla de algodon, aceite de semilla de girasol, aceite de semilla de sesamo y similares. En el grupo de los granos, el aceite de mafz es el mas facilmente disponible, pero tambien puede usarse el aceite de otros granos de cereales tales como trigo, avena, centeno, arroz, teff, triticale y similares. Los esteres con acidos grasos de 6-10 carbonos de glicerol y 1,2-propanodiol, mientras que no se produzcan de manera natural en los aceites de semillas, pueden prepararse mediante hidrolisis, separacion y esterificacion de los materiales apropiados comenzando a partir de los aceites de frutos secos y semillas. Las grasas y aceites de la leche de los mairnferos se metabolizan y de este modo pueden usarse. Los procedimientos para la separacion, purificacion, saponificacion y otros medios necesarios para la obtencion de aceites puros de fuentes animales se conocen bien en la tecnica.
La mayona de los peces contienen aceites metabolizables que pueden recuperarse facilmente. Por ejemplo, el aceite de hugado de bacalao, aceites de hugado de tiburon, y aceite de ballena tal como el esperma de ballena son ejemplos de diversos aceites de pescado que pueden usarse en el presente documento. Una cantidad de aceites de cadena ramificada se sintetizan bioqmmicamente en unidades de isopreno de 5 carbonos y generalmente se denominan como terpenoides. Las emulsiones preferidas comprenden escualeno, un aceite de hugado de tiburon que es un terpenoide ramificado insaturado (C30H50; [(CH3)2C(=CHCH2CH2C(CH3)]2=CHCH2-]2; 2,6,10,15,19,23- hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno; NR CAS 7683-64-9). Tambien puede usarse el escualano, el analogo saturado del escualeno. Los aceites de pescado, incluyendo el escualeno y el escualano estan disponibles facilmente de fuentes comerciales o pueden obtenerse mediante procedimientos conocidos en la tecnica.
Otros aceites utiles son los tocoferoles, particularmente en combinacion con escualeno. Cuando la fase de aceite de una emulsion incluye un tocoferol, puede usarse cualquiera de los tocoferoles a, p, y, 8, e o £, pero se prefieren los a-tocoferoles. Pueden usarse tanto D-a-tocoferol como DL-a-tocoferol. Un a-tocoferol preferido es el DL-a-tocoferol. Puede usarse una combinacion de aceites que comprenda escualeno y un tocoferol (por ejemplo DL-a-tocoferol).
El aceite en la emulsion puede comprender una combinacion de aceites, por ejemplo, escualeno y al menos un aceite adicional.
El componente acuoso de la emulsion puede ser agua pura (por ejemplo, agua para inyeccion) o pueden incluir componentes adicionales, por ejemplo, solutos. Por ejemplo, puede incluir sales para formar un tampon, por ejemplo, sales de citrato o fosfato, tales como sales de sodio. Los tampones tfpicos incluyen: un tampon fosfato; un tampon Tris; un tampon borato; un tampon succinato; un tampon de histidina; o un tampon citrato. Se prefiere una fase acuosa tamponada, y tampones que normalmente se incluiran en el intervalo de 5-20 mM.
La emulsion tambien incluye un lfpido cationico. Preferentemente este lfpido es un tensioactivo de manera que pueda facilitar la formacion y estabilizacion de la emulsion. Los lfpidos cationicos utiles generalmente contienen un atomo de nitrogeno que esta cargado positivamente a condiciones fisiologicas, por ejemplo, como una amina terciaria o cuaternaria. Este nitrogeno puede estar en el grupo de la cabeza hidrofila de un tensioactivo anfifflico. Los lfpidos cationicos utiles incluyen, pero sin limitacion: 1,2-dioleoiloxi-3-(trimetilamonio)propano (DOTAP), 3'-[N-(N',N'- dimetilaminoetano)-carbamoil] colesterol (DC Colesterol), dimetildioctadecilamonio (DDA, por ejemplo, bromuro), 1,2- dimiristoil-3-trimetil-amoniopropano (DMTAP), dipalmitoil(C16:0)trimetil amonio propano (DPTAP), diestearoiltrimetilamonio propano (DETAP). Otros lfpidos cationicos utiles son: cloruro de benzalconio (BAC), cloruro de bencetonio, cetramida (que contiene bromuro de tetradeciltrimetilamonio y posiblemente pequenas cantidades de bromuro de dedeciltrimetilamonio y bromuro de hexadeciltrimetilamonio), cloruro de cetilpiridinio (CCP), cloruro de cetiltrimetilamonio (CCTA), N,N',N'-polioxietileno(10)-N-sebo-1,3-diaminopropano, bromuro de dodeciltrimetilamonio, bromuro de hexadeciltrimetilamonio, bromuro de alquil trimetil amonio mixto, cloruro de bencildimetildodecilamonio,
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cloruro de bencildimetilhexadecilamonio, metoxido de benciltrimetilamonio, bromuro de cetildimetiletilamonio, bromuro de dimetildioctadecil amonio (BDDA), cloruro de metilbencetonio, cloruro de decametonio, cloruro mixto de metilo y trialquil amonio, cloruro de metil trioctilamonio, cloruro de N,N-dimetil-N-[2-(2-metil-4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)- fenoxi]-etoxi)-etil]-bencenometanaminio (DEBDA), sales de dialquildimetilamonio, cloruro de [1-(2,3-dioleiloxi)-propil]-
N, N,N-trimetilamonio, 1,2-diacil-3-(trimetilamonio)propano (grupo acilo = dimiristoil, dipalmitoil, diestearoil, dioleoil),
1,2-diacil-3(dimetilamonio)propano (grupo acilo = dimiristoil, dipalmitoil, diestearoil, dioleoil), 1,2-dioleoil-3-(4'- trimetilamonio)butanoil-sn-glicerol, ester de 1,2-dioleoil-3-succinil-sn-glicerol colina, butanoato de colesteril(4'- trimetilamonio), sales de N-alquil piridinio (por ejemplo, bromuro de cetilpiridinio y cloruro de cetilpiridinio), sales de N-alquilpiperidinio, electrolitos bolaform dicationicos (Ci2Me6; Ci2Bu6), dialquilglicetilfosforilcolina, lisolecitina, L-a- dioleoil-fosfatidiletanolamina, ester de colina con hemisuccinato de colesterol, lipopoliaminas, incluyendo pero sin limitacion dioctadecilamidoglicilespermina (DOGE), dipalmitoil fosfatidiletanol amidospermina (DPFEE), lipopoli-L (o D)-lisina (LPLL, LPDL), poli(L (o D)-lisina conjugada con N-glutarilfofatidiletanolamina, ester de didodecil glutamato con un grupo amino colgante (Ci2GluPhCnN+), ester de ditetradecil glutamato con un grupo amino colgante (Ci2GluPhCnN+), derivados cationicos de colesterol, incluyendo pero sin limitacion sal de colesteril-3-p- oxisuccinamidaetilentrimetilamonio, colesteril-3-p-oxisuccinamidoetileno-dimetilamina, sal de colesteril-3-p-
carboxiamidoetilenotrimetilamonio y colesteril-3-p-carboxiamidoetilenodimetilamina. Se describen otros lfpidos cationicos utiles en las referencias 17 y 18.
El lfpido cationico es preferentemente biodegradable (metabolizable) y biocompatible.
Ademas del aceite y el lfpido cationico, una emulsion puede incluir un tensioactivo no ionico y/o un tensioactivo zwitterionico. Dichos tensioactivos incluyen, pero sin limitacion: los tensioactivos de esteres de sorbitan polioxietilenado (comunmente denominados como los Tweens), especialmente el polisorbato 20 y polisorbato 80; copolfmeros de oxido de etileno (OE), oxido de propileno (OP) y/u oxido de butileno (OB), vendidos con el nombre comercial DOWFAX™, tales como los copolfmeros en bloque de OE/OP lineales; octoxinoles, que pueden variar en el numero de repeticion de los grupos etoxi (oxi-1,2-etanodiil), con octoxinol-9 (Triton X-100, o t- octilfenoxipolietoxietanol) siendo de particular interes; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfoKpidos tales como fosfatidilcolina (lecitina); eteres grasos polioxietilenados derivados de alcoholes launlicos, cetilicos, esteanlicos y o^licos (conocidos como tensioactivos Brij), tales como trietilenglicol monolauril eter (Brij 30); polioxietileno-9-lauril eter; y esteres de sorbitan (comunmente conocidos como los Spans), tales como trioleato de sorbitan (Span 85) y monolaurato de sorbitan. Los tensioactivos preferidos para incluirlos en la emulsion son polisorbato 80 (Tween 80; monooleato de sorbitan polioxietilenado), Span 85 (trioleato de sorbitan), lecitina y Triton X-100.
Pueden incluirse las mezclas de estos tensioactivos en la emulsion, por ejemplo, mezclas de Tween 80/Span 85, o mezclas de Tween 80/Triton X-100. Tambien es adecuada una combinacion de un ester de sorbitan polioxietilenado tal como monooleato de sorbitan polioxietilenado (Tween 80) y un octoxinol tal como t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100). Otra combinacion util comprende laureth 9 plus un ester de sorbitan polioxietilenado y/o un octoxinol. Las mezclas utiles pueden comprender un tensioactivo con un valor EHL en el intervalo de 10-20 (por ejemplo, polisorbato 80, con un EHL de 15,0) y un tensioactivo con un valor EHL en el intervalo de 1-10 (por ejemplo, trioleato de sorbitan, con un EHL de 1,8).
Las cantidades preferidas de aceite (% en volumen) en la emulsion final estan entre 2-20 %, por ejemplo, 5-15 %, 614 %, 7-13 %, 8-12 %. Es particularmente util un contenido de escualeno de aproximadamente 4-6 % o aproximadamente 9-11 %.
Las cantidades preferidas de tensioactivos (% en peso) en la emulsion final estan entre 0,001 % y 8 %. Por ejemplo: de 0,2 a 4 % de esteres de sorbitan polioxietilenado (tales como polisorbato 80), en particular entre 0,4-0,6 %, entre
O, 45-0,55 %, aproximadamente 0,5 % o entre 1,5-2 %, entre 1,8-2,2 %, entre 1,9-2,1 %, aproximadamente 2 %, o 0,85-0,95 %, o aproximadamente 1 %; de 0,02 a 2 % de esteres de sorbitan (tales como trioleato de sorbitan), en particular aproximadamente 0,5 % o aproximadamente 1 %; de 0,001 a 0,1 % de octil- o nonilfenoxi polioxietanoles (tales como Triton X-100), en particular de 0,005 a 0,02 %; de 0,1 a 8 % de eteres de polioxietileno (tales como laureth 9), preferentemente de 0,1 a 10 % y en particular de 0,1 a 1 % o aproximadamente 0,5 %.
Las cantidades absolutas de aceite y tensioactivo, y su relacion, pueden variarse dentro de amplios lfmites, mientras que todavfa formen una emulsion. Un experto puede variar facilmente las proporciones relativas de los componentes para obtener una emulsion deseada, pero es tfpica una relacion en peso de entre 4:1 y 5:1 para aceite y tensioactivo (exceso de aceite).
Un parametro importante para garantizar la actividad inmunoestimulante de una emulsion, en particular en animales grandes, es el tamano de las gotas de aceite (diametro). Las emulsiones mas eficaces tienen un tamano de las gotas en el intervalo submicrometrico. Los tamanos de las gotas adecuados estaran el intervalo de 50-750 nm. Mas utilmente el tamano medio de las gotas es de menos de 250 nm, por ejemplo, de menos de 200 nm, de menos de 150 nm. El tamano medio de las gotas de manera util esta en el intervalo de 80-180 nm. De manera ideal, al menos el 80 % (en numero) de las gotas de aceite de la emulsion son de menos de 250 nm en diametro, y preferentemente al menos el 90 %. Estan disponibles en el mercado aparatos para la determinacion del tamano medio de las gotas en una emulsion, y la distribucion de tamanos. Estos usan tipicamente las tecnicas de dispersion dinamica de luz y/o
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sensores opticos de partfculas individuales, por ejemplo, las series de instrumentos Accusizer™ y Nicomp™ disponibles de Particle Sizing Systems (Santa Barbara, Estados Unidos), o los instrumentos Zetasizer™ de Malvern Instruments (Reino Unido), o los instrumentos Particle Size Distribution Analyzer de Horiba (Kyoto, Japon).
De manera ideal, la distribucion de los tamanos de las gotas (en numero) tiene solo un maximo, es dear, existe una unica poblacion de gotas distribuidas alrededor de una media (moda), en lugar de tener dos maximos. Las emulsiones preferidas tienen una polidispersidad de < 0,4 por ejemplo, 0,3, 0,2, o menos.
Pueden obtenerse las emulsiones adecuadas con gotas submicrometricas y una distribucion de tamanos estrecha mediante el uso de la microfluidizacion. Esta tecnica reduce el tamano medio de las gotas de aceite mediante la propulsion de corrientes de los componentes de entrada a traves de canales fijados geometricamente a alta presion y alta velocidad. Estas corrientes se ponen contacto con las paredes del canal, las paredes de la camara y entre sf. Los resultados de las fuerzas de cizalla, impacto y cavitacion provocan una reduccion en el tamano de las gotas. Pueden realizarse etapas repetidas de microfluidizacion hasta que se alcance una emulsion con una media y distribucion de tamanos de las gotas deseados.
Como alternativa a la microfluidizacion, pueden usarse procedimientos termicos para provocar la inversion de fase, como se desvela en la referencia 19. Estos procedimientos tambien pueden proporcionar una emulsion submicrometrica con una distribucion de tamano de las partfculas estrecha.
Las emulsiones preferidas pueden esterilizarse por filtracion, es dear, sus gotas pueden pasar a traves de un filtro de 220 nm. Ademas de proporcionar una esterilizacion, este procedimiento tambien retira cualquiera de las gotas grandes en la emulsion.
En ciertas realizaciones, el lfpido cationico en la emulsion es DOTAP. La emulsion cationica de aceite en agua puede comprender de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml de DOTAP. Por ejemplo, la emulsion de aceite en agua cationica puede comprender DOTAP a de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 0,6 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 0,7 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 0,9 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,0 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,1 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,2 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,3 a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,4 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,5 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,6 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,7 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 24 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 22 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 18 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 12 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 1,9 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 1,8 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 1,7 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 1,6 mg/ml, de aproximadamente 0,6 mg/ml a aproximadamente 1,6 mg/ml, de aproximadamente 0,7 mg/ml a aproximadamente 1,6 mg/ml, de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 1,6 mg/ml, aproximadamente 0,5 mg/ml, aproximadamente 0,6 mg/ml, aproximadamente 0,7 mg/ml, aproximadamente 0,8 mg/ml, aproximadamente 0,9 mg/ml, aproximadamente 1,0 mg/ml, aproximadamente 1,1 mg/ml, aproximadamente 1,2 mg/ml, aproximadamente 1,3 mg/ml, aproximadamente 1,4 mg/ml, aproximadamente 1,5 mg/ml, aproximadamente 1,6 mg/ml, aproximadamente 12 mg/ml, aproximadamente 18 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 21,8 mg/ml, aproximadamente 24 mg/ml, etc. En una realizacion ejemplar, la emulsion de aceite en agua cationica comprende de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 1,6 mg/ml de DOTAP, tal como 0,8 mg/ml, 1,2 mg/ml, 1,4 mg/ml o 1,6 mg/ml.
En ciertas realizaciones, el lfpido cationico es DC Colesterol. La emulsion cationica de aceite en agua puede comprender DC Colesterol a de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml de DC Colesterol. Por ejemplo, la emulsion cationica de aceite en agua puede comprender DC Colesterol de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,2 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,3 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,4 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de
aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,62 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 2,46 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 3 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de
aproximadamente 3,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 4 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 4,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a
aproximadamente 4,92 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 4,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 4 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 3,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 3 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 2,46 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a
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En ciertas realizaciones, el lfpido cationico es DDA. La emulsion de aceite en agua cationica puede comprender de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml de DDA. Por ejemplo, la emulsion de aceite en agua cationica puede comprender DDA a de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 4,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 4 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 3,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 3 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 2,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,45 mg/ml, de aproximadamente 0,2 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,3 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,4 mg/ml a
aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,6 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,73 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de
aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,9 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1,0 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1,2 mg/ml a
aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1,45 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 2,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de
aproximadamente 3 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 3,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 4 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 4,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, aproximadamente 1,2 mg/ml, aproximadamente 1,45 mg/ml, etc. Alternativamente, la emulsion de aceite en agua cationica puede comprender DDA a aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 21 mg/ml, aproximadamente 21,5 mg/ml, aproximadamente 21,6 mg/ml, aproximadamente 25 mg/ml. En una realizacion ejemplar, la emulsion de aceite en agua cationica comprende de aproximadamente 0,73 mg/ml a aproximadamente 1,45 mg/ml de DDA, tal como 1,45 mg/ml.
Ciertas composiciones preferidas de la invencion para la administracion a un paciente comprenden escualeno, span 85, polisorbato 80 y DOTAP. Por ejemplo: el escualeno puede estar presente a 5-15 mg/ml; el span 85 puede estar presente a 0,5-2 mg/ml; el polisorbato 80 puede estar presente a 0,5-2 mg/ml; y el DOTAP puede estar presente a 0,1-10 mg/ml. La emulsion puede incluir la misma cantidad (en volumen) de span 85 y polisorbato 80. La emulsion puede incluir mas escualeno que tensioactivo. La emulsion puede incluir mas escualeno que DOTAP.
El ARN
La invencion implica la liberacion in vivo de ARN auto-replicante que codifica un inmunogeno. El ARN puede desencadenar rutas de inmunidad innata y tambien traducirse, conduciendo a la expresion del inmunogeno.
El ARN es de cadena +, y de esta manera puede traducirse sin necesidad de que intervenga ninguna de las etapas de replicacion tales como la transcripcion inversa.
La molecula de ARN auto-replicante (replicon) puede, cuando se libera a una celula de un mairnfero incluso sin ninguna protema, conducir a la produccion de multiples ARN hijos mediante transcripcion de sf mismo (mediante una copia antisentido que genera de sf misma). Una molecula de ARN auto-replicante es por lo tanto normalmente una molecula de cadena + que puede traducirse directamente tras la liberacion a una celula, y esta traduccion proporciona una ARN polimerasa dependiente de ARN que despues produce tanto transcripciones antisentido como en sentido del ARN liberado. Por lo tanto el ARN liberado conduce a la produccion de multiples ARN hijos. Estos ARN hijos, asf como los transcritos subgenomicos colineales, pueden traducirse por sf mismos para proporcionar in situ la expresion de un inmunogeno codificado, o pueden transcribirse para proporcionar transcritos adicionales con el mismo sentido que el ARN liberado que se traducen para proporcionar in situ la expresion del inmunogeno. El resultado global de esta secuencia de transcripcion es una gran amplificacion en el numero de los replicones de ARN introducidos y de esta manera el inmunogeno codificado se convierte en un producto polipeptido principal de las celulas.
Un sistema adecuado para lograr la auto-replicacion es usar un replicon de ARN de un alfavirus. Estos replicones de cadena + se traducen despues de la liberacion en una celula para proporcionar una replicasa (o una replicasa- transcriptasa). La replicasa se traduce como una poliprotema que se auto-adhiere para proporcionar un complejo de replicacion que crea copias genomicas de cadena - del ARN liberado de cadena +. Estos transcritos de cadena - pueden transcribirse por ellos mismos para proporcionar copias adicionales del ARN padre de cadena + y tambien proporcionar un transcrito subgenomico que codifica el inmunogeno. La traduccion del transcrito subgenomico por consiguiente conduce a la expresion in situ del inmunogeno por la celula infectada. Los replicones adecuados del alfavirus pueden usar una replicasa de un virus sindbis, un virus del bosque semliki, un virus de la encefalitis equina del este, un virus de la encefalitis equina venezolana, etc. Pueden usarse secuencias de virus mutantes o de tipo salvaje, por ejemplo, se ha usado el mutante atenuado TC83 del VEEV en replicones [20].
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Una molecula de ARN auto-replicante preferida de este modo codifica (i) una ARN polimerasa dependiente de ARN que puede transcribir ARN de la molecula de ARN auto-replicante y (ii) un inmunogeno. La polimerasa puede ser una replicasa de un alfavirus, por ejemplo, que comprenda una o mas protemas nsP1, nsP2, nsP3 y nsP4 de alfavirus. Considerando que los genomas naturales del alfavirus codifican las protemas estructurales del virion ademas de la poliprotema replicasa no estructural, se prefiere que una molecula de ARN auto-replicante de la invencion no codifique las protemas estructurales del alfavirus. Por consiguiente el ARN auto-replicante preferido puede conducir a la produccion de copias de ARN genomicas de sf mismo en una celula, pero no a la produccion de viriones que contengan ARN. La incapacidad para producir estos viriones significa que, a diferencia de un alfavirus de tipo salvaje, la molecula de ARN auto-replicante no puede perpetuarse por sf misma en la forma infecciosa. Las protemas estructurales del alfavirus que son necesarias para la perpetuacion en los virus de tipo salvaje estan ausentes de los ARN auto-replicantes de la invencion y su lugar esta ocupado por gen(es) que codifica(n) el inmunogeno de interes, de modo que el transcrito subgenomico codifica el inmunogeno en lugar de las protemas estructurales del virion de alfavirus.
Por consiguiente una molecula de ARN auto-replicante util con la invencion puede tener dos marcos de lectura abierta. El primer marco de lectura abierta (5') codifica una replicasa; el segundo marco de lectura abierta (3') codifica un inmunogeno. En algunas realizaciones el ARN puede tener marcos de lectura abierta adicionales (por ejemplo, aguas abajo), por ejemplo, para codificar inmunogenos adicionales (vease a continuacion) o para codificar polipeptidos accesorios.
Una molecula de ARN auto-replicante puede tener una secuencia 5' que es compatible con la replicasa codificada.
Las moleculas de ARN auto-replicantes pueden tener diversas longitudes pero son normalmente de 5000-25000 nucleotidos de largo por ejemplo, 8000-15000 nucleotidos, o 9000-12000 nucleotidos. Por consiguiente el ARN es mas largo que el observado en la liberacion de ARNpi.
Una molecula de ARN util con la invencion puede tener una caperuza 5' (por ejemplo, una 7-metilguanosina). Este extremo puede mejorar la traduccion in vivo del ARN.
El nucleotido 5' de una molecula de ARN util con la invencion puede tener un grupo trifosfato en 5'. En un ARN con caperuza este puede unirse a una 7-metilguanosina mediante un puente 5'-5'. Un trifosfato en 5' puede mejorar la union a RIG-I.
Una molecula de ARN puede tener una cola de poli A en 3'. Tambien puede incluir una secuencia de reconocimiento de la poli A polimerasa (por ejemplo, AAUAAA) cerca de su extremo 3'.
Una molecula de ARN util con la invencion normalmente sera de cadena simple. Los ARN de cadena simple en general, pueden iniciar un efecto adyuvante uniendose al TLR7, TLR8, ARN helicasas y/o PKR. El ARN liberado en forma de cadena doble (ARNcd) puede unirse al TLR3, y este receptor tambien puede activarse por el ARNdc que se forma o bien durante la replicacion de un ARN de cadena simple o dentro de la estructura secundaria de un aRn de cadena simple.
Una molecula de ARN util con la invencion pueden prepararse de manera conveniente mediante transcripcion in vitro (TIV). La TIV puede usar un molde (ADNc) creado y propagado en forma de plasmido en bacterias, o creados sinteticamente (por ejemplo, por procedimientos de ingeniena de smtesis de genes y/o reaccion en cadena de la polimerasa (PCR)). Por ejemplo, una ARN polimerasa dependiente de ADN (tal como las ARN polimerasas de los bacteriofagos T7, T3 o SP6) puede usarse para transcribir el ARN a partir de un molde de ADN. Las reacciones apropiadas de formacion de la caperuza y adicion de la poli A pueden usarse segun sea necesario (aunque la poli A del replicon generalmente esta codificada en el molde de aDn). Estas ARN polimerasas pueden tener requisitos estrictos para el/los nucleotido(s) 5' transcrito(s) y en algunas realizaciones estos requisitos deben coincidir con los requisitos de la replicasa codificada, para garantizar que el ARN transcrito por TIV pueda funcionar eficazmente como sustrato para su replicasa auto-codificada.
Como se ha discutido en la referencia 21, el ARN auto-replicante pude incluir (ademas de cualquier estructura con caperuza 5') uno o mas nucleotidos que tienen una nucleobase modificada. Por consiguiente el ARN puede comprender m5C (5-metilcitidina), m5U (5-metiluridina), m6A (N6-metiladenosina), s2U (2-tiouridina), Um (2'-O- metiluridina), m1A (1-metiladenosina); m2A (2-metiladenosina); Am (2'-O-metiladenosina); ms2m6A (2-metiltio-N6- metiladenosina); i6A (N6-isopenteniladenosina); ms2i6A (2-metiltio-N6-isopenteniladenosina); io6A (N6-(cis- hidroxiisopentenil)adenosina); ms2io6A (2metiltio-N6-(cis-idroxiisopentenil)adenosina); g6A (N6- glicinilcarbamoiladenosina); t6A (N6-treonil carbamoiladenosina); ms2t6A (2-metiltio-N6-treonil carbamoiladenosina); m6t6A (N6-metil-N6-treonilcarbamoiladenosina); hn6A (N6-hidroxinorvalilcarbamoil adenosina); ms2hn6A (2-metiltio- N6-hidroxinorvalil carbamoiladenosina); Ar(p) (2'-O-ribosiladenosina (fosfato)); I (inosina); mil (1-metilinosina); m'Im (1,2'-O-dimetilinosina); m3C (3-metilcitidina); Cm (2T-O-metilcitidina); s2C (2-tiocitidina); ac4C (N4-acetilcitidina); f5C (5-fonilcitidina); m5Cm (5,2-O-dimetilcitidina); ac4Cm (N4-acetil-2T-O-metilcitidina); k2C (lisidina); miG (1- metilguanosina); m2G (N2-metilguanosina); m7G (7-metilguanosina); Gm (2'-O-metilguanosina); m22G (N2,N2- dimetilguanosina); m2Gm (N2,2'-O-dimetilguanosina); m22Gm (N2,N2,2'-O-trimetilguanosina); Gr(p) (2'-O- ribosilguanosina (fosfato)); iW (wibutosina); o2iW (peroxiwibutosina); OHiW (hidroxiwibutosina); OHiW*
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(hidroxiwibutosina submodificada); imG (wiosina); mimG (metilguanosina); Q (queosina); oQ (epoxiqueosina); galQ (galtactosil queosina); manQ (manosil queosina); preQo (7-ciano-7-deazaguanosina); preQi (7-aminometil-7- deazaguanosina); G* (arqueosina); D (diidrouridina); m5Um (5,2'-O-dimetiluridina); s4U (4-tiouridina); m5s2U (5- metil-2-tiouridina); s2Um (2-tio-2'-O-metiluridina); acp3U (3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina); ho5U (5-hidroxiuridina); mo5U (5-metoxiuridina); cmo5U (acido uridina 5-oxiacetico); mcmo5U (ester metflico del acido uridina-5-oxiacetico); chm5U (5-(carboxi hidroximetil) uridina)); mchm5U (ester metilico de la 5-(carboxihidroximetil) uridina)); mcm5U (5- metoxicarbonil metiluridina); mcm5Um (S-metoxicarbonilmetil-2-O-metiluridina); mcm5s2U (5-metoxicarbonilmetil-2- tiouridina); nm5s2U (5-aminometil-2-tiouridina); mnm5U (5-metilaminometiluridina); mnm5s2U (5-metilaminometil-2- tiouridina); mnm5se2U (5-metilaminometil-2-selenouridina); ncm5U (5-carbamoilmetil uridina); ncm5Um (5- carbamoilmetil-2'-O-metiluridina); cmnm5U (5-carboximetilaminometiluridina); cnmm5Um (5-carboximetilaminometil- 2-L-O-metiluridina); cmnm5s2U (5-carboximetilaminometil-2-tiouridina); m62A (N6,N6-dimetiladenosina); Tm (2'-O- metilinosina); m4C (N4-metilcitidina); m4Cm (N4,2-O-dimetilcitidina); hm5C (5-hidroximetilcitidina); m3U (3- metiluridina); cm5U (5-carboximetiluridina); m6Am (N6,T-O-dimetiladenosina); rn62Am (N6,N6,O-2- trimetiladenosina); m2'7G (N2,7-dimetilguanosina); m2'2'7G (N2,N2,7-trimetilguanosina); m3Um (3,2T-O- dimetiluridina); m5D (5-metildiidrouridina); f5Cm (5-formil-2'-O-metilcitidina); m1Gm (1,2'-O-dimetilguanosina); m'Am (1,2-O-dimetil adenosina) irinometiluridina); tm5s2U (S-taurinometil-2-tiouridina)); imG-14 (4-desmetil guanosina); imG2 (isoguanosina); o ac6A (N6-acetiladenosina), hipoxantina, inosina, 8-oxoadenina, derivados 7-sustituidos de los mismos, diidrouracilo, pseudouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-aminouracilo, 5-(C1C6)-alquiluracilo, 5- metiluracilo, 5-(C2-C6)-alqueniluracilo, 5-(C2-C6)-alquiniluracilo, 5-(hidroximetil)uracilo, 5-clorouracilo, 5- fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-hidroxicitosina, 5-(C1-C6 )-alquilcitosina, 5-metilcitosina, 5-(C2-C6)-alquenilcitosina, 5-(C2-C6)-alquinilcitosina, 5-clorocitosina, 5-fluorocitosina, 5-bromocitosina, N2-dimetilguanina, 7-deazaguanina, 8- azaguanina, 7-deaza-7-guanina sustituida, 7-deaza-7-(C2-C6)alquinilguanina, 7-deaza-8-guanina sustituida, 8- hidroxiguanina, 6-tioguanina, 8-oxoguanina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, 2,4-diaminopurina, 2,6- diaminopurina, 8-azapurina, 7-deazapurina sustituida, 7-deaza-7-purina sustituida, 7-deaza-8-purina sustituida, o un nucleotido abasico. Por ejemplo, un ARN auto-replicante puede incluir una o mas nucleobases de pirimidina modificada, tales como residuos pseudouridina y/o 5-metilcitosina. En algunas realizaciones, sin embargo, el ARN incluye nucleobases no modificadas, y pueden incluir nucleotidos no modificados, es dear, todos los nucleotidos en el aRn son ribonucleotidos de A, C, G y U convencionales (excepto para cualquier estructura con caperuza 5', que puede incluir una 7'-metilguanosina). En otras realizaciones, el ARN puede incluir una caperuza 5' que comprende una 7'-metilguanosina, y los primeros 1, 2 o 3 ribonucleotidos 5' pueden estar metilados en la posicion 2' de la ribosa.
Un ARN usado con la invencion de manera ideal incluye solo enlaces fosfodiester entre los nucleosidos, pero en algunas realizaciones puede contener enlaces de fosforamidato, fosforotioato y/o metilfosfonato.
De manera ideal, el ARN administrado incluye menos de 10 especies diferentes de ARN, por ejemplo, 5, 4, 3 o 2 especies diferentes; mas preferentemente, una composicion incluye una unica especie de ARN, es dear, todas las moleculas de ARN en la composicion (por ejemplo en un liposoma) tienen la misma secuencia y la misma longitud.
El inmunogeno
Las moleculas de ARN usadas con la invencion codifican un inmunogeno polipeptido. Tras la administracion del ARN el inmunogeno se traduce in vivo y puede provocar una respuesta inmunitaria en el receptor. El inmunogeno puede provocar una respuesta inmunitaria frente a una bacteria, un virus, un hongo o un parasito (o, en algunas realizaciones, frente a un alergeno; y en otras realizaciones, frente a un antfgeno tumoral). La respuesta inmunitaria puede comprender una respuesta con anticuerpos (incluyendo normalmente IgG) y/o una respuesta inmunitaria mediada por celulas. El inmunogeno polipeptido normalmente provocara una respuesta inmunitaria que reconoce el correspondiente polipeptido bacteriano, vmco, fungico o de un parasito (o alergeno o tumor) pero en algunas realizaciones, el polipeptido puede actuar como un mimotopo para provocar una respuesta inmnunitaria que reconoce un sacarido bacteriano, vmco, fungico o de un parasito. El inmunogeno normalmente sera un polipeptido de superficie, por ejemplo, una adhesina, una hemaglutinina, una glucoprotema de envoltura, una glucoprotema de la espicula, etc.
Las moleculas de ARN pueden codificar un unico inmunogeno polipeptido o multiples polipeptidos. Los inmunogenos multiples pueden presentarse como un unico inmunogeno polipeptido (polipeptido de fusion) o como polipeptidos separados. Si los inmunogenos se expresan como polipeptidos separados entonces uno o mas de estos pueden proporcionarse con un IRES aguas arriba o un elemento promotor vmco adicional. De manera alternativa, los inmunogenos multiples pueden expresarse a partir de una poliprotema que codifica inmunogenos individuales fusionados a una proteasa autocatalttica corta (por ejemplo, protema 2A del virus de la enfermedad de pie y boca), o como intemas.
A diferencia de las referencias 1 y 22, el ARN codifica un inmunogeno. Para evitar dudas, la invencion no abarca un ARN que codifica una luciferasa de luciernaga o que codifica una protema de fusion de p-galactosidasa de E. coli o que codifica una protema verde fluorescente (PVF). Ademas, el ARN no es ARN completo de timo de raton.
En algunas realizaciones el inmunogeno provoca una respuesta inmunitaria frente a una de estas bacterias:
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Neisseria meningitidis: los inmunogenos utiles incluyen, pero sin limitacion, protemas de membrana tales como adhesinas, autotransportadoras, toxinas, protemas de adquisicion de hierro y protemas de union al factor H. Se desvela una combinacion de los tres polipeptidos utiles en la referencia 23.
Streptococcus pneumoniae: los inmunogenos polipeptidos utiles se desvelan en la referencia 24. Estos incluyen, pero sin limitacion, la subunidad del pilus RrgB, el precursor de la beta-N-acetil-hexosaminidasa (spr0057), spr0096, protema de estres general gSp-781 (spr2021, SP2216), serina/treonina quinasa StkP (SP 1732), y la adhesina de superficie neumococica PsaA.
Streptococcus pyogenes: los inmunogenos utiles incluyen, pero sin limitacion, los polipeptidos desvelados en las referencias 25 y 26.
Moraxella catarrhalis.
Bordetella pertussis: los inmunogenos de pertussis utiles incluyen, pero sin limitacion, toxina o toxoide de tos ferina (TTF), hemaglutinina filamentosa (HAF), pertactina y aglutinogenos 2 y 3.
Staphylococcus aureus: los inmunogenos utiles incluyen, pero sin limitacion, los polipeptidos desvelados en la referencia 27, tales como hemolisina, esxA, esxB, protema de union a ferricromo (sta006) y/o la lipoprotema sta011.
Clostridium tetani: el inmunogeno tfpico es el toxoide de tetanos.
Cornynebacterium diphtheriae: el inmunogeno tfpico es el toxoide de difteria.
Haemophilus influenzae: los inmunogenos utiles incluyen, pero sin limitacion, los polipeptidos desvelados en las referencias 28 y 29.
Pseudomonas aeruginosa
Streptococcus agalactiae: los inmunogenos utiles incluyen, pero sin limitacion, los polipeptidos desvelados en la referencia 25.
Chlamydia trachomatis: los inmunogenos utiles incluyen, pero sin limitacion, PepA, LcrE, ArtJ, DnaK, CT398, OmpHlike, L7/L12, OmcA, AtoS, CT547, Eno, HtrAy MurG (por ejemplo, como se desvela en la referencia 30). El LcrE [31] y HtrA[32] son dos inmunogenos preferidos.
Chlamydia pneumoniae: los inmunogenos utiles incluyen, pero sin limitacion, los polipeptidos desvelados en la referencia 33.
Helicobacter pylori: los inmunogenos utiles incluyen, pero sin limitacion, CagA, VacA, NAP, y/o ureasa [34].
Escherichia coli: los inmunogenos utiles incluyen, pero sin limitacion, inmunogenos derivados de E. coli enterotoxigenica (ECET), E. coli enteroagregativa (ECEAg), E. coli de adherencia difusa (ECAD), E. coli enteropatogena (ECEP), E. coli patogena extraintestinal (ECPEx) y/o E. coli enterohemorragica (ECEH). Las cepas de ECPEx incluyen E. coli uropatogena (ECUP) y E. coli asociada a meningitis/sepsis (ECMN). Los inmunogenos polipeptidos de ECUP utiles se desvelan en las referencias 35 y 36. Los inmunogenos ECMN utiles se desvelan en la referencia 37. Un inmunogeno util para varios tipos de E. coli es AcfD [38].
Bacillus anthracis
Yersinia pestis: los inmunogenos utiles incluyen, pero sin limitacion, los desvelados en las referencias 39 y 40.
Staphylococcus epidermis
Clostridium perfringens o Clostridium botulinums
Legionella pneumophila
Coxiella burnetii
Brucella, tales como B. abortus, B. canis, B. melitensis, B. neotomae, B. ovis, B. suis, B. pinnipediae.
Francisella, tales como F. novicida, F. philomiragia, F. tularensis.
Neisseria gonorrhoeae Treponema pallidum Haemophilus ducreyi
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Enterococcus faecalis o Enterococcus faecium
Staphylococcus saprophyticus
Yersinia enterocolitica
Mycobacterium tuberculosis
Rickettsia
Listeria monocytogenes Vibrio cholerae Salmonella typhi Borrelia burgdorferi Porphyromonas gingivalis Klebsiella
En algunas realizaciones el inmunogeno provoca una respuesta inmunitaria frente a uno de estos virus:
Orthomyxovirus: Los inmunogenos utiles pueden ser de un virus de la gripe A, B o C, tales como la hemaglutinina, neuraminidasa o protemas de matriz M2. Cuando el inmunogeno es una hemaglutinina del virus de la gripe A puede ser de cualquier subtipo por ejemplo, H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 o H16.
Virus Paramyxoviridae: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero sin limitacion, los derivados de Pneumovirus (por ejemplo, el virus respiratorio sincitial, VRS), Rubulavirus (por ejemplo, virus de las paperas), Paramixovirus (por ejemplo, virus parainfluenza), Metapneumovirus y Morbilivirus (por ejemplo, virus del sarampion).
Poxviridae: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero sin limitacion, los derivados de Orthopoxvirus tales como Variola vera, incluyendo pero sin limitacion, Variola mayor y Variola menor.
Picornavirus: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero sin limitacion, los derivados de Picornavirus, tales como Enterovirus, Rinovirus, Heparnavirus, Cardiovirus y Aptovirus. En una realizacion, el enterovirus es un poliovirus, por ejemplo, un poliovirus de tipo 1, tipo 2 y/o tipo 3. En otra realizacion, el enterovirus es un enterovirus EV71. En otra realizacion, el enterovirus es un virus coxsackie A o B.
Bunyavirus: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero sin limitacion, los derivados de un Orthobunyavirus, tal como el virus de la encefalitis de California, un Phlebovirus, tal como el virus de la fiebre del Valle del Rift, o un Nairovirus, tal como el virus de la fiebre hemorragica de Crimea-Congo.
Heparnavirus: Los inmunogenos vmicos incluyen, pero sin limitacion, los derivados de un Heparnavirus, tal como el virus de la hepatitis A (VHA).
Filovirus: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero sin limitacion, los derivados de un filovirus, tal como un virus del Ebola (incluyendo un ebolavirus de Zaire, Costa de Marfil, Reston o Sudan) o un virus de Marburgo.
Togavirus: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero sin limitacion, los derivados de un Togavirus, tal como un Rubivirus, un Alphavirus, o un Arterivirus. Esto incluye el virus de la rubeola.
Flavivirus: Los inmunogenos vmicos incluyen, pero sin limitacion, los derivados de un Flavivirus, tal como el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (ETG), virus del dengue (tipos 1, 2, 3 o 4), virus de la fiebre amarilla, virus de la encefalitis japonesa, virus del bosque de Kyasanur, virus de la encefalitis del Nilo Occidental, virus de la encefalitis de St. Louis, virus de la encefalitis rusa de primavera-verano, virus de la encefalitis de Powassan.
Pestivirus: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero sin limitacion, los derivados de un Pestivirus, tal como la diarrea viral bovina (DVB), la peste porcina clasica (PPC) o la enfermedad de la frontera (EF).
Hepadnavirus: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero sin limitacion, los derivados de un Hepadnavirus, tal como el virus de la hepatitis B. Una composicion puede incluir el antfgeno de superficie del virus de hepatitis B (HBsAg).
Otros virus de hepatitis: Una composicion puede incluir un inmunogeno del virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis delta, virus de la hepatitis E, o virus de la hepatitis G.
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Rhabdovirus: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero sin limitacion, los derivados de un Rhabdovirus, tal como un Lisavirus (por ejemplo, virus de la rabia) y Vesiculovirus (VSV).
Caliciviridae: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero sin limitacion, los derivados de Calciviridae, tales como el virus Norwalk (Norovirus), y virus de tipo Norwalk, tales como virus de Hawai y virus de nieve de la montana.
Coronavirus: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero sin limitacion, los derivados de un coronavirus del SARS, bronquitis infecciosa aviar (BI), virus de la hepatitis de raton (VHR), virus de la gastroenteritis porcina transmisible (VGPT). El inmunogeno del coronavirus puede ser un polipeptido de la espmula.
Retrovirus: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero sin limitacion, los derivados de un Oncovirus, un Lentivirus (por ejemplo, VIH-1 o VIH-2) o un Espumavirus.
Reovirus: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero sin limitacion, los derivados de un Ortoreovirus, un Rotavirus, un Orbivirus, o un Coltivirus.
Parvovirus: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero sin limitacion, los derivados de Parvovirus B19.
Herpesvirus: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero sin limitacion, los derivados de un virus del herpes humano, tal como, a modo solo de ejemplo, virus de herpes simple (VHS) (por ejemplo, VHS de los tipos 1 y 2), virus de la varicela zoster (VVZ), virus de Epstein Barr (VEB), Citomegalovirus (CMV), virus del herpes humano 6 (VHH6), virus del herpes humano 7 (VHH7) y virus del herpes humano 8 (VHH8).
Papovaviruses: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero sin limitacion, los derivados de los Papilomavirus y los Poliomavirus. El virus del papiloma (humano) puede ser del serotipo 1, 2, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51, 57, 58, 63 o 65, por ejemplo, de uno o mas de los serotipos 6, 11, 16 y/o 18.
Adenovirus: Los inmunogenos vmcos incluyen los derivados del serotipo 36 de adenovirus (Ad-36).
En algunas realizaciones, el inmunogeno provoca una respuesta inmunitaria frente a un virus que infecta al pez, tal como: virus de la anemia infecciosa del salmon (VAIS), virus de la enfermedad pancreatica del salmon (VEPS), virus de la necrosis pancreatica infecciosa (VNPI), virus de bagre de canal (VBC), virus de la enfermedad de Linfocistis del pez (VELP), virus de la necrosis hematopoyetica infecciosa (VNHI), herpesvirus koi, virus tipo picorna del salmon (tambien conocido como virus tipo picorna del salmon atlantico), virus del salmon encerrado (VSE), rotavirus del salmon atlantico (RSA), virus de la enfermedad de la fresa de la trucha (EFT), virus del tumor del salmon plateado (VTSP) o virus de la septicemia hemorragica viral (VSHV).
Los inmunogenos fungicos pueden derivarse de dermatofitos, incluyendo: Epidermophyton floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis, Microsporum distortum, Microsporum equinum, Microsporum gypsum, Microsporum nanum, Trichophyton concentricum, Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton megnini, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleini, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, T. verrucosum var. album, var. discoides, var. ochraceum, Trichophyton violaceum, y/o Trichophyton faviforme; o de Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi, Aspergillus flavatus, Aspergillus glaucus, Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida enolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei, Candida lusitaniae, Candida pseudotropicalis, Candida guilliermondi, Cladosporium carrionii, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans, Geotrichum clavatum, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Microsporidia, Encephalitozoon spp., Septata intestinalis y Enterocytozoon bieneusi; los menos comunes son Brachiola spp, Microsporidium spp., Nosema spp., Pleistophora spp., Trachipleistophora spp., Vittaforma spp Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii, Pythiumn insidiosum, Pityrosporum ovale, Sacharomyces cerevisae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces pombe, Scedosporium apiosperum, Sporothrix schenckii, Trichosporon beigelii, Toxoplasma gondii, Penicillium marneffei, Malassezia spp., Fonsecaea spp., Wangiella spp., Sporothrix spp., Basidiobolus spp., Conidiobolus spp., Rhizopus spp, Mucor spp, Absidia spp, Mortierella spp, Cunninghamella spp, Saksenaea spp., Alternaria spp, Curvularia spp, Helminthosporium spp, Fusarium spp, Aspergillus spp, Penicillium spp, Monolinia spp, Rhizoctonia spp, Paecilomyces spp, Pithomyces spp, y Cladosporium spp.
En algunas realizaciones el inmunogeno provoca una respuesta inmunitaria frente a un parasito del genero Plasmodium, tal como P. falciparum, P. vivax, P. malariae o P. ovale. Por consiguiente la invencion puede usarse para la inmunizacion contra la malaria. En algunas realizaciones el inmunogeno provoca una respuesta inmunitaria frente a un parasito de la familia de Caligidae, de manera particular los de los generos Lepeophtheirus y Caligus, por ejemplo, el piojo de mar tal como Lepeophtheirus salmonis o Caligus rogercresseyi.
En algunas realizaciones el inmunogeno provoca una respuesta inmunitaria frente a: alergenos del polen (alergenos del polen de arbol, hierba, maleza y cesped); alergenos de insectos o aracnidos (alergenos inhalantes, saliva y veneno, por ejemplo, alergenos de los acaros, cucarachas y alergenos de jejenes, alergenos de veneno de himenopteros); alergenos del pelo y caspa de animales (de por ejemplo, perro, gato, caballo, rata, raton, etc.); y
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alergenos alimentarios (por ejemplo, una gliadina). Los alergenos importantes del polen de arboles, cesped y hierbas son los procedentes de los ordenes taxonomicos de Fagales, Oleales, Pinales y Platanaceae que incluyen, pero sin limitacion, abedul (Betula), aliso (Alnus), avellano (Corylus), carpe (Carpinus) y olivo (Olea), cedro (Cryptomeria y Juniperus), arbol del platano (Platanus), el orden de Poales incluyendo hierbas de los generos Lolium, Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis, Holcus, Phalaris, Secale y Sorghum, los ordenes de Asterales y Urticales que incluyen hierbas de los generos Ambrosia, Artemisia y Parietaria. Otros alergenos por inhalacion importantes son los de los acaros del polvo domestico del genero Dermatophagoides y Euroglyphus, acaros de almacenamiento, por ejemplo, Lepidoglyphys, Glycyphagus y Tyrophagus, los de cucarachas, jejenes, y pulgas, por ejemplo, Blatella, Periplaneta, Chironomus y Ctenocepphalides, y los de mairnferos tales como el gato, perro y caballo, los alergenos de veneno incluyendo los procedentes de insectos que pican o muerden tales como los del orden taxonomico de Hymenoptera incluyendo abejas (Apidae), avispas (Vespidea) y hormigas (Formicoidae).
En algunas realizaciones el inmunogeno es un antfgeno tumoral seleccionado de: (a) antfgenos de cancer de testmulo tales como NY-ESO-1, SSX2, SCP1 asf como RAGE, BAGE, polipeptidos de la familia Gage y MAGE, por ejemplo, GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6 y MAGE-12 (que pueden usarse, por ejemplo, para hacer frente a melanomas, tumores de pulmon, cabeza y cuello, CPNm, mama, gastrointestinales y de vejiga; (b) antfgenos mutados, por ejemplo, p53 (asociado con varios tumores solidos, por ejemplo, cancer colorrectal, de pulmon, de cabeza y cuello), p21/Ras (asociados con, por ejemplo, melanoma, cancer de pancreas y cancer colorrectal), CDK4 (asociado con, por ejemplo, melanoma ), MUM1 (asociado con, por ejemplo, melanoma), caspasa-8 (asociada con, por ejemplo, cancer de cabeza y cuello), CIA 0205 (asociado con, por ejemplo, cancer de vejiga), HLA-A2-R1701, beta catenina (asociada con, por ejemplo, melanoma), TCR (asociado con, por ejemplo, linfoma no Hodgkin de celulas T), BCR-Ab1 (asociado con, por ejemplo, leucemia mielogena cronica), triosafosfato isomerasa, KIA 0205, CDC-27 y LDLR-FUT; (c) antfgenos sobreexpresados, por ejemplo, galectina 4 (asociada con, por ejemplo, cancer colorrectal), galectina 9 (asociada con, por ejemplo, la enfermedad de Hodgkin), proteinasa 3 (asociada con, por ejemplo, leucemia mielogena cronica), WT 1 (asociado con, por ejemplo, diversas leucemias), anhidrasa carbonica (asociada con, por ejemplo, cancer renal), aldolasa A (asociada con, por ejemplo, cancer de pulmon), PRAME (asociado con, por ejemplo, melanoma), HER-2/neu (asociados con, por ejemplo, cancer de mama, colon, pulmon y ovario), mamaglobina, alfa-fetoprotema (asociada con, por ejemplo, hepatoma), KSA (asociada con, por ejemplo, cancer colorrectal), gastrina (asociada con, por ejemplo, cancer pancreatico y gastrico), protema catalttica de la telomerasa, MUC-1 (asociada con, por ejemplo, cancer de mama y ovario), G-250 (asociado con, por ejemplo, carcinoma de celulas renales), p53 (asociado con, por ejemplo, cancer de mama, colon) y el antfgeno carcinoembrionario (asociado con, por ejemplo, cancer de mama, cancer de pulmon y canceres del tracto gastrointestinal tales como cancer colorrectal); (d) antfgenos compartidos, por ejemplo, antfgenos de diferenciacion del melanoma-melanocitos tales como MART-1/Melan A, gp100, MC1R, receptor de la hormona estimulante de melanocitos, tirosinasa, protema-1 relacionada con la tirosinasa/TRP1 y protema-2 relacionada con la tirosinasa/TRP2 (asociadas con, por ejemplo, melanoma); (e) antfgenos asociados a la prostata tales como PAP, PSA, PSMA, PSH-P1, PSM-P1, PSM-P2, asociados con, por ejemplo, cancer de prostata; (f) idiotipos de inmunoglobulinas (asociados con mieloma y linfomas de celulas B, por ejemplo). En ciertas realizaciones, los inmunogenos tumorales incluyen, pero sin limitacion, p15, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antfgenos del virus de Epstein Barr, EBNA, antfgenos del papilomavirus humano (PVH), incluyendo E6 y E7, antfgenos del virus de la hepatitis B y C, antfgenos del virus linfotropico de celulas T humanas, TSP-180, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, mn-23H1, TAG72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, p16, TAGE, PSCA, CT7, 43-9F, 5T4, 791 Tgp72, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (protema de union a Mac-2/protema asociada a ciclofilina C), TAAL6, TAG72, TLP, TPS y similares.
Composiciones farmaceuticas
El ARN se administrara como un componente en una composicion farmaceutica para la inmunizacion de sujetos frente a diversas enfermedades. Estas composiciones incluiran normalmente un vehmulo farmaceuticamente aceptable ademas del ARN, a menudo como parte de un sistema de liberacion como se ha descrito anteriormente. Esta disponible una discusion a fondo de los vehmulos farmaceuticamente aceptables en la referencia 41.
Una composicion farmaceutica de la invencion puede incluir uno o mas inmunopotenciadores de moleculas pequenas. Por ejemplo, la composicion puede incluir un agonista del TLR2 (por ejemplo, Pam3CSK4), un agonista del TLR4 (por ejemplo, un fosfato de aminoalquil glucosaminida, tal como E6020), un agonista del TLR7 (por ejemplo, imiquimod), un agonista del TLR8 (por ejemplo, resiquimod) y/o un agonista del TLR9 (por ejemplo, IC31). Cualquiera de dichos agonista de manera ideal tiene un peso molecular de <2000 Da. Cuando un ARN se encapsula, en algunas realizaciones dicho(s) agonista(s) tambien se encapsula(n) con el ARN, pero en otras realizaciones estan sin encapsular. Cuando un ARN se adsorbe a una partmula, en algunas realizaciones dicho(s) agonista(s) tambien se adsorbe(n) con el ARN, pero en otras realizaciones estan sin adsorber.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden incluir las partmulas en agua pura (por ejemplo, agua para inyeccion) o en un tampon, por ejemplo, un tampon fosfato, un tampon Tris, un tampon borato, un tampon succinato, un tampon de histidina, o un tampon citrato. Las sales del tampon se incluiran normalmente en el intervalo de 520 mM.
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Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden tener un pH entre 5,0 y 9,5, por ejemplo, entre 6,0 y 8,0.
Las composiciones de la invencion pueden incluir sales de sodio (por ejemplo, cloruro de sodio) para proporcionar tonicidad. Es tipica una concentracion de NaCl de 10 + 2 mg/ml, por ejemplo, aproximadamente 9 mg/ml.
Las composiciones de la invencion pueden incluir quelantes de iones metalicos. Estos pueden prolongar la estabilidad del ARN retirando los iones que pueden acelerar la hidrolisis del fosfodiester. Por consiguiente una composicion puede incluir uno o mas de los acidos EDTA, EGTA, BAPTA, pentetico, etc. Dichos quelantes normalmente estan presentes a entre 10-500 |iM, por ejemplo, 0,1 mM. Una sal de citrato, tal como citrato de sodio, tambien puede actuar como un quelante, mientras que de manera ventajosa tambien proporciona actividad de tamponamiento.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden tener una osmolalidad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, por ejemplo, entre 240-360 mOsm/kg, o entre 290-310 mOsm/kg.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden incluir uno o mas conservantes, tales como tiomersal o 2- fenoxietanol. Se prefieren las composiciones libres de mercurio, y pueden prepararse vacunas libres de conservantes.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion preferentemente son esteriles.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion preferentemente no son pirogenicas, por ejemplo, conteniendo < 1 UE (unidad de endotoxina, una medida convencional) por dosis, y preferentemente <0,1 UE por dosis.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion preferentemente estan libres de gluten.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden prepararse en forma de dosis unitaria. En algunas realizaciones una dosis unitaria puede tener un volumen de entre 0,1-1,0 ml, por ejemplo, aproximadamente 0,5 ml.
Las composiciones pueden prepararse como inyectables, o como soluciones o suspensiones. La composicion puede prepararse para la administracion pulmonar, por ejemplo, mediante un inhalador, usando una pulverizacion fina. La composicion puede prepararse para la administracion nasal, auditiva u ocular, por ejemplo, como pulverizacion o gotas. Son tfpicos los inyectables para la administracion intramuscular.
El contenido de ARN de las composiciones de la invencion se expresa en terminos de la cantidad de ARN por dosis unitaria. El ARN se cuantifica facilmente usando las tecnicas disponibles.
Los ARN no se liberan en combinacion con ribosomas y por lo tanto las composiciones farmaceuticas de la invencion estan libres de ribosomas.
Procedimientos de tratamiento y usos medicos
El ARN liberado de acuerdo con la invencion es para provocar una respuesta inmunitaria in vivo frente a un inmunogeno de interes. La respuesta inmunitaria es preferentemente protectora y preferentemente implica una inmunidad mediada por anticuerpos y/o celulas. El procedimiento puede aumentar una respuesta de refuerzo.
Aumentando una respuesta inmunitaria el mairnfero puede protegerse frente a diversas enfermedades y/o infecciones, por ejemplo, frente a enfermedades bacterianas y/o vmcas como se ha discutido anteriormente. Las composiciones que contienen ARN son inmunogenicas, y mas preferentemente son composiciones de vacunas. Las vacunas de acuerdo con la invencion pueden ser o profilacticas (es dear, para prevenir una infeccion) o terapeuticas (es dear, para tratar una infeccion), pero normalmente seran profilacticas.
El marnffero inmunizado de acuerdo con la presente invencion es un mamffero grande, que es un ser humano o un caballo, ganado, o cerdo. Cuando la vacuna es para uso profilactico, el ser humano preferentemente es un nino (por ejemplo, un nino pequeno o bebe) o un adolescente; cuando la vacuna es para uso terapeutico, el ser humano preferentemente es un adolescente o un adulto. Una vacuna destinada a ninos tambien puede administrarse a adultos, por ejemplo, para evaluar la seguridad, dosificacion, inmunogenicidad, etc.
Las vacunas preparadas de acuerdo con la invencion pueden usarse para tratar tanto a ninos como adultos. Por consiguiente un paciente humano puede tener menos de 1 ano de edad, menos de 5 anos de edad, 1-5 anos de edad, 5-15 anos de edad, 15-55 anos de edad, o al menos 55 anos de edad. Los pacientes preferidos para recibir las vacunas son los ancianos (por ejemplo, > 50 anos de edad, > 60 anos de edad y preferentemente > 65 anos de edad), los jovenes (por ejemplo, < 5 anos de edad), pacientes hospitalizados, los trabajadores de la salud, personal del servicio armado y militar, mujeres embarazadas, los pacientes enfermos cronicos o inmunodeficientes. Las vacunas no son adecuadas unicamente para estos grupos y, sin embargo, pueden usarse mas generalmente en una poblacion.
Las composiciones de la invencion generalmente se administraran directamente a un paciente. La liberacion directa puede conseguirse mediante inyeccion parenteral (por ejemplo, via subcutanea, intraperitoneal, intravenosa,
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intramuscular, o al espacio intersticial de un tejido; a diferencia de la referencia 1, la inyeccion intralingual normalmente no se usa con la presente invencion), o via mucosa, tal como rectal, oral (por ejemplo, comprimido, pulverizacion), vaginal, topica, transdermica o transcutanea, intranasal, ocular, auditiva, pulmonar u otra administracion mucosa. La inyeccion puede ser mediante una aguja (por ejemplo, una aguja hipodermica), pero puede usarse alternativamente la inyeccion sin aguja. Una dosis intramuscular tfpica es 0,5 ml.
La invencion puede usarse para provocar una inmunidad sistemica y/o de la mucosa, preferentemente para provocar un aumento de la inmunidad sistemica y/o de la mucosa.
La dosificacion puede ser mediante una pauta de una sola dosis unitaria o una pauta de multiples dosis unitarias. Pueden usarse multiples dosis en una pauta de inmunizacion primaria y/o en una pauta de inmunizacion de refuerzo. En una pauta de multiples dosis las diversas dosis pueden proporcionarse mediantes las mismas o diferentes rutas, por ejemplo, una principal parenteral y una de refuerzo mucosa, una principal mucosa y una de refuerzo parenteral, etc. Las dosis multiples normalmente se administraran al menos separadas 1 semana (por ejemplo, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.). En una realizacion, puede administrarse una dosis unitaria aproximadamente 6 semanas, 10 semanas y 14 semanas tras el nacimiento, por ejemplo, a una edad de 6 semanas, 10 semanas y 14 semanas, como se usa a menudo en el Programa Ampliado de Inmunizacion (“PAI”) de la Organizacion Mundial de la Salud. En una realizacion alternativa, se administran dos dosis unitarias primarias aproximadamente separadas dos meses, por ejemplo, aproximadamente separadas 7, 8 o 9 semanas, seguido de una o mas dosis unitarias de refuerzo aproximadamente de 6 meses a 1 ano tras la segunda dosis primaria, por ejemplo, aproximadamente 6, 8,10 o 12 meses tras la segunda dosis primaria. En una realizacion adicional, se administran tres dosis primarias aproximadamente separadas dos meses, por ejemplo, aproximadamente separadas 7, 8 o 9 semanas, seguido de una o mas dosis de refuerzo aproximadamente de 6 meses a 1 ano tras la tercera dosis primaria, por ejemplo, aproximadamente 6, 8, 10 o 12 meses tras la tercera dosis primaria.
Realizaciones generales
En algunas realizaciones de la invencion, el ARN incluye nucleotidos no modificados (vease anteriormente). En otras realizaciones el ARN opcionalmente puede incluir al menos un nucleotido modificado, siempre que tambien se requiera una mas de las siguientes caractensticas (ya desveladas anteriormente):
A. Cuando el ARN se libera con un liposoma, el liposoma comprende DEDMA, DODMA, DLinDMA y/o DLenDMA.
B. Cuando el ARN se encapsula en un liposoma, la parte hidrofila de un lfpido en el liposoma esta pegilada.
C. Cuando el ARN se encapsula en un liposoma, al menos el 80 % en numero de los liposomas tienen diametros en el intervalo de 20-220 nm.
D. Cuando el ARN se libera con una micropartfcula, la micropartfcula es una micropartfcula de un polfmero no toxico y biodegradable.
E. Cuando el ARN se libera con una micropartfcula, las micropartfculas tienen un diametro en el intervalo de 0,02 |im a 8 |im.
F. Cuando el ARN se libera con una micropartfcula, al menos el 80 % en numero de las micropartfculas tienen un diametro en el intervalo de 0,03-7 |im.
G. Cuando el ARN se libera con una micropartfcula, la composicion se liofiliza.
H. Cuando el ARN se libera con una emulsion, la emulsion comprende un aceite biodegradable (por ejemplo, escualeno).
I. Cuando el ARN se libera con una emulsion, la emulsion incluye una o mas moleculas cationicas, por ejemplo, uno o mas lfpidos cationicos.
J. El ARN tiene una cola de poli A 3', y el inmunogeno puede provocar una respuesta inmunitaria in vivo frente a una bacteria, un virus, un hongo o un parasito.
K. El ARN se libera en combinacion con un quelante de iones metalicos con un sistema de liberacion seleccionado de (i) liposomas (ii) micropartfculas de un polfmero no toxico y biodegradable (iii) emulsiones de aceite en agua cationicas submicrometricas.
General
La practica de la presente invencion empleara, a menos que se indique lo contrario, procedimientos convencionales de qmmica, bioqmmica, biologfa molecular, inmunologfa y farmacologfa, dentro de la experiencia de la tecnica.
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Dichas tecnicas se explican completamente en la literatura. Vease, por ejemplo, las referencias 42-48, etc.
El termino “comprende” engloba “incluye” as^ como “consiste”, por ejemplo, una composicion que comprende X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X + Y.
El termino “aproximadamente” en relacion a un valor numerico x es opcional y significa, por ejemplo, x + 10 %.
La palabra “sustancialmente” no excluye “completamente”, por ejemplo, una composicion que esta “sustancialmente libre” de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando es necesario, la palabra “sustancialmente” puede omitirse de la definicion de la invencion.
Las referencias a carga, a cationes, a aniones, a zwitteriones, etc., se toman a pH 7.
El TLR3 es el receptor de tipo Toll 3. Es un receptor individual que atraviesa la membrana que desempena un papel clave en el sistema inmunitario innato. Los agonistas del TLR3 conocidos incluyen poli(I:C). El “TLR3” es el nombre aprobado del CNGH para el gen que codifica este receptor, y su unico ID del CNGH es CNGH: 11849. La secuencia de referencia para el gen del TLR3 humano es GI: 2459625.
El TLR7 es el receptor de tipo Toll 7. Es un receptor individual que atraviesa la membrana que desempena un papel clave en el sistema inmunitario innato. Los agonistas del TLR7 conocidos incluyen, por ejemplo, imiquimod. El “TLR7” es el nombre aprobado del CNGH para el gen que codifica este receptor, y su unico ID del CNGH es CNGH:
15631. La secuencia de referencia para el gen del TLR7 humano es GI: 67944638.
El TLR8 es el receptor de tipo Toll 8. Es un receptor individual que atraviesa la membrana que desempena un papel clave en el sistema inmunitario innato. Los agonistas del TLR8 conocidos incluyen, por ejemplo, resiquimod. El “TLR8” es el nombre aprobado del CNGH para el gen que codifica este receptor, y su unico ID del CNGH es CNGH:
15632. La secuencia de referencia para el gen del TLR8 humano es GI: 20302165.
La familia del receptor de tipo RIG-I (“RLR”) incluye diversas ARN helicasas que desempenan papeles clave en el sistema inmunitario innato [49]. El RLR-1 (tambien conocido como RIG-I o gen 1 inducible por acido retinoico) tiene dos dominios de reclutamiento de caspasas cerca de su N-terminal. El nombre aprobado del CNGH para el gen que codifica la helicasa RLR-1 es “DDX58” (para el polipeptido de caja DEAD (Asp-Glu-Ala Asp) 58) y el unico ID del CNGH es CNGH: 19102. La secuencia de referencia para el gen del RLR-1 humano es Gi: 77732514. El RLR-2 (tambien conocido como MDA5 o gen 5 asociado con la diferenciacion del melanoma) tambien tiene dos dominios de reclutamiento de caspasas cerca de su N-terminal. El nombre aprobado del CNGH para el gen que codifica la helicasa RLR-2 es “IFIH1” (para el interferon inducido con el dominio C de la helicasa 1) y el unico ID del CNGH es CNGH: 18873. La secuencia de referencia para el gen del RLR-2 humano es GI: 27886567. El RLR-3 (tambien conocido como LGP2 o laboratorio de genetica y fisiologfa 2) no tiene dominios de reclutamiento de caspasas. El nombre aprobado del CNGH para el gen que codifica la helicasa RLR-3 es “DHX58” (para el polipeptido de caja DEXH (Asp-Glu-X-His) 58) y el unico ID del CNGH es CNGH: 29517. La secuencia de referencia para el gen del RLR-3 humano es GI: 149408121.
La PKR es una protema quinasa dependiente de ARN de cadena doble. Desempena un papel clave en el sistema inmunitario innato. El “EIF2AK2” (para la alfa quinasa 2 del factor de iniciacion de la traduccion eucariotico 2) es el nombre aprobado del CNGH para el gen que codifica esta enzima, y su unico ID del CNGH es CNGH: 9437. La secuencia de referencia para el gen de la pKr humana es GI: 208431825.
Breve descripcion de los dibujos
La FIG 1 muestra un gel con un ARN tenido. Los carriles muestran (1) los marcadores (2) el replicon desnudo (3) el replicon despues del tratamiento con ARNasa (4) el replicon encapsulado en el liposoma (5) el liposoma despues del tratamiento con ARNasa (6) el liposoma tratado con ARNasa despues de someterse a extraccion con fenol/cloroformo.
La FIG 2 es una micrograffa electronica de los liposomas.
La FIG 3 muestra la expresion de las protemas (como unidades de luz relativa, ULR) en los dfas 1, 3 y 6 despues de la liberacion del ARN como un replicon empaquetado en viriones (cuadrados), ARN desnudo (triangulos), o como micropartmulas (cmculos).
La FIG 4 muestra un gel con un ARN tenido. Los carriles muestran (1) los marcadores (2) el replicon desnudo (3) el replicon encapsulado en el liposoma (4) el liposoma tratado con ARNasa despues de someterse a extraccion con fenol/cloroformo.
La FIG 5 muestra la expresion de las protemas en los dfas 1, 3 y 6 tras la liberacion del ARN como un replicon empaquetado en viriones (cuadrados), como ARN desnudo (diamantes), o en liposomas (+ = 0,1 |ig, x = 1 |ig).
La FIG 6 muestra la expresion de las protemas en los dfas 1, 3 y 6 tras la liberacion de cuatro dosis diferentes del ARN encapsulado en liposomas.
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La FIG 7 muestra los tftulos de IgG anti-F en los animales que han recibido replicon empaquetado en viriones (PRV o PRSV), 1 |ig de ARN desnudo, y 1 |ig de ARN encapsulado en liposomas.
La FIG 8 muestra los tftulos de IgG anti-F en los animales que han recibido PRV, 1 |ig de ARN desnudo, y 0,1 g o 1 |ig de ARN encapsulado en liposomas.
La FIG 9 muestra los tftulos de los anticuerpos neutralizados en los animales que han recibido PRV o, o bien 0,1 g o 1 |ig de ARN encapsulado en liposomas.
La FIG 10 muestra los niveles de expresion tras la liberacion de un replicon como ARN desnudo (drculos), ARN encapsulado en liposomas (triangulo & cuadrado), o como un lipoplexo (triangulo invertido).
La FIG 11 muestra los tftulos de IgG espedficas de F (2 semanas tras la segunda dosis) tras la liberacion de un replicon como ARN desnudo (0,01-1 |ig), ARN encapsulado en liposomas (0,01-10 |ig), o empaquetado como un virion (PRV, 106unidades infecciosas o UI).
La FIG 12 muestra los tftulos de IgG espedficas de F (cftculos) y tftulos del ENRP (cuadrados) tras la liberacion de un replicon como ARN desnudo (1 |ig), ARN encapsulado en liposomas (0,1 o 1 |ig), o empaquetado como un virion (PRV, 106 UI). Tambien se muestran los tftulos en ratones naive. Las lrneas continuas muestran las medias geometricas.
La FIG 13 muestra la produccion intracelular de citoquinas tras la re-estimulacion con peptidos sinteticos que representan los epftopos principales en la protema F, 4 semanas despues de una segunda dosis. El eje y muestra el % de citoquinas de CD8+ CD4-.
La FIG 14 muestra los tftulos de IgG espedficas de F (media de los tftulos en log10 + desviacion estandar) durante 63 dfas (FIG. 14A) y 210 dfas (FIG. 14B) tras la inmunizacion de terneros. Las cuatro lrneas se distinguen facilmente en el dfa 63 y son, de abajo a arriba: control negativo con PBS; ARN liberado en liposomas; ARN liberado en emulsion; y el producto “Triangulo 4”.
Modos para llevar a cabo la invencion
Replicones de ARN
A continuacion se usan diversos replicones. En general estos son en base a un genoma de un alfavirus hforido con protemas no estructurales del virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV), una senal de empaquetamiento del virus Sindbis, y una RNT 3' del virus Sindbis o un mutante del VEEV. El replicon es de aproximadamente 10 kb de largo y tiene una cola de poli A.
El ADN del plasmido que codifica los replicones del alfavirus (denominados: pT7-mVEEV-FL.RSVF o A317; pT7- mVEEV-FASE o A306; pSP6-VCR-PVF o A50) sirvio como molde para la smtesis de ARN in vitro. Los replicones contienen elementos geneticos del alfavirus requeridos para la replicacion del ARN pero al faltar los productos de los genes que los codifican necesarios para el ensamblado de las partmulas; las protemas estructurales se sustituyen en su lugar por una protema de interes (o bien un reportero, tal como FASE o PVF, o un inmunogeno, tal como la protema F del VRS de longitud completa) y por lo tanto los replicones son incapaces de inducir la generacion de partmulas infecciosas. Un promotor de un bacteriofago (T7 o SP6) aguas arriba del ADNc del alfavirus facilita la smtesis del ARN del replicon in vitro y una ribozima del virus de la hepatitis delta (VHD) inmediatamente aguas abajo de la cola de poli (A) genera el extremo 3' correcto a traves de su auto-actividad de escision.
Despues de la linealizacion del ADN del plasmido aguas abajo de la ribozima del VHD con una endonucleasa de restriccion adecuada, las copias de los transcritos se sintetizaron in vitro usando la ARN polimerasa dependiente de ADN derivada del bacteriofago T7 o SP6. Las transcripciones se realizaron durante 2 horas a 37 °C en presencia de 7,5 mM (ARN polimerasa de T7) o 5 mM (ARN polimerasa de SP6) de cada uno de los nucleosidos trifosfato (ATP, CTP, GTP y UTP) siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Ambion). Despues de la transcripcion el ADN molde se digirio con TURBO ADNasa (Ambion). El ARN del replicon se precipito con LiCl y se reconstituyo en agua libre de nucleasas. Al ARN sin la caperuza se le unio la caperuza post-transcripcionalmente con la enzima de formacion de la caperuza de Vaccinia (ECV) usando el sistema de formacion de la caperuza ScriptCap m7G (Epicentre Biotechnologies) como se indica en el manual del usuario; a los replicones con la caperuza formada de esta manera se les proporciona el prefijo "v", por ejemplo, vA317 es el replicon A317 con la caperuza formada por la ECV. El ARN con la caperuza formada post-trascripcionalmente se precipito con LiCl y se reconstituyo en agua libre de nucleasas. La concentracion de las muestras de ARN se determino midiendo la DO260nm. La integridad de los transcritos in vitro se confirmo mediante electroforesis en gel desnaturalizante de agarosa.
Adsorcion a PLG
Las micropartmulas se fabricaron usando 500 mg de PLG RG503 (relacion molar lactida/glicolida 50:50, PM ~ 30 kDa) y 20 mg de DOTAP usando un homogeneizador Omni Macro. La suspension de partmulas se agito a 150 rpm
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toda la noche y despues se filtro a traves de un filtro esteril de 40 |im para el almacenamiento a 2-8 °C. El ARN auto- replicante se adsorbio a las partfculas. Para preparar 1 ml de suspension de PLG/ARN se anadio el volumen requerido de suspension de las partfculas de PLG a un vial y se anadio agua libre de nucleasas para llevar el volumen a 900 |il. Se anadieron gota a gota 100 |il de ARN (10 |ig/ml) a la suspension de PLG, con agitacion constante. El PLG/ARN se incubo a temperatura ambiente durante 30 min. Para 1 ml de suspension reconstituida, se anadieron 45 mg de manitol, 15 mg de sacarosa y 250-500 |ig de APV. Los viales se congelaron a -80 °C y se liofilizaron.
Para evaluar la adsorcion de ARN, se centrifugaron 100 |il de la suspension de partfculas a 10.000 rpm durante 5 min y se recogio el sobrenadante. El PLG/ARN se reconstituyo usando 1 ml de agua libre de nucleasas. Se anadio a 100 |il de la suspension de partfculas (1 |ig de ARN), 1 mg de sulfato de heparina. La mezcla se agito en un mezclador de vortice y se dejo reposar a temperatura ambiente durante 30 min para la desorcion del ARN. La suspension de partfculas se centrifugo y se recogio el sobrenadante.
Para la estabilidad de la ARNasa, se incubaron 100 |il de la suspension de partfculas con 6,4 mUA de ARNasa a temperatura ambiente durante 30 min. La ARNasa se inactivo con 0,126 mUA de proteinasa K a 55 °C durante 10 min. Se anadio 1 mg de sulfato de heparina para la desorcion del ARN seguido de centrifugacion. Las muestras del sobrenadante que conteman ARN se mezclaron con colorante de carga en formaldehndo, se calentaron a 65 °C durante 10 min y se analizaron usando un gel desnaturalizante al 1% (460 ng de ARN cargados por carril).
Para evaluar la expresion, los ratones Balb/c se inmunizaron con 1 |ig de ARN en 100 |il de volumen de inyeccion intramuscular (50 |il/pata) en el dfa 0. Los sueros se recogieron en los dfas 1, 3 y 6. La expresion de las protemas se determino usando un ensayo de quimioluminiscencia. Como se muestra en la FIG. 3, la expresion era mayor cuando el ARN se libero por la PLG (triangulos) que sin alguna partfcula de liberacion (drculos).
Nanoemulsion cationica
Se preparo una emulsion de aceite en agua mediante microfluidificacion con escualeno, span 85, polisorbato 80 y cantidades variables de DOTAP. En resumen, los componentes solubles en aceite (escualeno, span 85, lfpidos cationicos, tensioactivos lipfdicos) se combinaron en un vaso de precipitados, los componentes lipfdicos se disolvieron en un disolvente organico. La solucion lipfdica resultante se anadio directamente a la fase oleosa. El disolvente se dejo evaporar a temperatura ambiente durante 2 horas en una campana de ventilacion antes de la combinacion de la fase acuosa y la homogeneizacion de la muestra para proporcionar una materia prima homogenea. Las emulsiones primarias se pasaron de tres a cinco veces a traves de un microfluidizador con un serpentm en un bano de hielo. Las muestras de los lotes se retiraron de la unidad y se almacenaron a 4 °C.
De este modo esta emulsion es similar al adyuvante comercial MF59, pero suplementada por un DOTAP cationico para proporcionar una nanoemulsion cationica (“NEC”). La composicion final de la emulsion “NEC17” era escualeno (4,3 % en peso), span 85 (0,5 % en peso), polisorbato 80 (0,5 % en peso), DOTAP (1,4 mg/ml), en tampon citrato 10 mM, pH 6,5.
El ARN se adsorbe a la superficie de las gotas de aceite en estas emulsiones cationicas. Para adsorber el ARN se diluye una solucion de ARN a la concentracion apropiada en agua libre de ARNasa y despues se anade directamente en un volumen igual de la emulsion mientras se agita suavemente en un mezclador de vortice. La solucion se deja reposar a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 horas para permitir la adsorcion. La solucion resultante se diluye a la concentracion de ARN requerida antes de la administracion.
Encapsulacion liposomal
El ARN se encapsulo en liposomas fabricados mediante el procedimiento de las referencias 11 y 50. Los liposomas se fabricaron de DEFC (zwitterionico) al 10 %, DlinDMA (cationico) al 40 %, colesterol al 48 % y DMG conjugado con PEG (2 kDa de PEG) al 2 %. Estas proporciones hacen referencia al % en moles en el liposoma total.
El DlinDMA (1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano) se sintetizo usando el procedimiento de la referencia 6. La DEFC (1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina) se adquirio de Genzyme. El colesterol se obtuvo de Sigma-Aldrich. El DMG conjugado con PEG (sal de amonio del 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi (polietilenglicol)]), el DOTAP (sal de cloruro de 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano) y el DC-Colesterol (clorhidrato de 3p-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil] colesterol) eran de Avanti Polar Lipids.
En resumen, los lfpidos se disolvieron en etanol (2 ml), se disolvio el replicon de ARN en tampon (2 ml, citrato de sodio 100 mM, pH 6) y estos se mezclaron con 2 ml de tampon, seguido de 1 hora de equilibrado. La mezcla se diluyo con 6 ml de tampon despues de filtrarse. El producto resultante contema liposomas, con una eficiencia de encapsulacion del ~ 95 %.
Por ejemplo, en un procedimiento particular, se prepararon soluciones madre lipfdicas recientes en etanol. Se pesaron 37 mg de DlinDMA, 11,8 mg de DEFC, 27,8 mg de colesterol y 8,07 mg de PEG-DMG y se disolvieron en 7,55 ml de etanol. La solucion madre lipfdica recien preparada se mecio suavemente a 37 °C durante
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aproximadamente 15 min para formar una mezcla homogenea. Despues, se anadieron 755 |il de la madre a 1,245 ml de etanol para fabricar una solucion madre lipfdica de trabajo de 2 ml. Se utilizo esta cantidad de Kpidos para formar liposomas con 250 |ig de ARN. Tambien se preparo una solucion de trabajo de 2 ml de ARN de una solucion madre de ~ 1 |ig/|il en tampon citrato 100 mM (pH 6). Se enjuagaron tres viales de vidrio de 20 ml (con barras de agitacion) con una solucion sin ARNasa (Molecular Bioproducts) y se lavaron con abundante agua Milli-Q antes de su uso para descontaminar los viales de ARNasas. Uno de los viales se uso para la solucion de trabajo de ARN y los otros para la recogida de las mezclas de lfpidos y ARN (como se describe mas adelante). Las soluciones de trabajo de lfpidos y ARN se calentaron a 37 °C durante 10 min antes de cargarse en jeringas luer-lok de 3 cc. Se cargaron 2 ml de tampon citrato (pH 6) en otra jeringa de 3 cc. Las jeringas que conteman ARN y los lfpidos se conectaron a un mezclador en T (PEEK™ d.i. de la union de 500 |im, Idex Health Science) usando tubos de FEP (propileno-etileno fluorado); todos los tubos de FEP usados teman un diametro interno de 2 mm y un diametro externo de 3 mm; obtenidos de Idex Health Science). La salida del mezclador en T tambien era de tubo de FEP. La tercera jeringa que contema el tampon citrato se conecto a un trozo separado de tubo. Despues todas las jeringas se impulsaron a un caudal de 7 ml/min usando una bomba de jeringa. Las salidas de los tubos se posicionaron para recoger las mezclas en un vial de vidrio de 20 ml (mientras se agitaba). Se saco la barra de agitacion y la solucion acuosa de etanol se dejo equilibrar a temperatura ambiente durante 1 h. Se cargaron 4 ml de la mezcla en una jeringa de 5 cc, que se conecto a un trozo de tubo de FEP y en otra jeringa de 5 cc conectada a un tubo de FEP de la misma longitud, se cargo la misma cantidad de tampon citrato 100 mM (pH 6). Las dos jeringas se impulsaron a un caudal de 7 ml/min usando la bomba de jeringa y la mezcla final se recogio en un vial de vidrio de 20 ml (mientras se agitaba). A continuacion, la mezcla recogida de la segunda etapa de mezclado (liposomas) se hizo pasar a traves de una membrana Mustang Q (un soporte de intercambio anionico que une y retira las moleculas anionicas, obtenido de Pall Corporation). Antes de usar esta membrana para los liposomas, se hicieron pasar sucesivamente a traves de ella 4 ml de NaOH 1 M, 4 ml de NaCl 1 M y 10 ml de tampon citrato 100 mM (pH 6). Los liposomas se calentaron durante 10 min a 37 °C antes de hacerlos pasar a traves de la membrana. A continuacion, los liposomas se concentraron a 2 ml y se dializaron frente a 10-15 volumenes de PBS 1X usando filtracion por flujo tangencial antes de recuperar el producto final. El sistema de FFT y las membranas de filtracion de fibra hueca se adquirieron de Spectrum Labs (Rancho Dominguez) y se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usaron membranas de filtracion de fibra hueca de polisulfona con un corte de tamano de poro de 100 kD y un area superficial de 8 cm2. Para los experimentos in vitro e in vivo las formulaciones se diluyeron a la concentracion de ARN requerida con PBS 1X.
La FIG. 2 muestra un ejemplo de micrograffa electronica de los liposomas preparados mediante estos procedimientos. Estos liposomas contienen ARN encapsulado que codifica el antfgeno F del VRS de longitud completa. La dispersion de luz dinamica de un lote mostro un diametro medio de 141 nm (en intensidad) o 78 nm (en numero).
El porcentaje de ARN encapsulado y la concentracion de ARN se determinaron mediante el conjunto de reactivos de ARN de Quant-iT RiboGreen (Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN ribosomal convencional proporcionado en el conjunto se uso para generar una curva patron. Los liposomas se diluyeron 10x o 100x en tampon TE 1X (del conjunto) antes de la adicion del colorante. De manera separada, los liposomas se diluyeron 10x o 100x en tampon TE 1X que contema Triton X al 0,5 % antes de la adicion del colorante (para romper los liposomas y por lo tanto para valorar el ARN total). A partir de aim se anadio la misma cantidad de colorante a cada solucion y despues se cargaron ~ 180 ml de cada solucion tras la adicion de colorante por duplicado en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos. La fluorescencia (Ex 485 nm, Em 528 nm) se leyo en un lector de microplacas. Todas las formulaciones de liposomas se dosificaron in vivo en base a la cantidad encapsulada de ARN.
Se mostro que la encapsulacion en liposomas protegfa el ARN de la digestion por la ARNasa. Los experimentos usaron 3,8 mUA de ARNasa A por microgramo de ARN, que se incubo durante 30 minutos a temperatura ambiente. La ARNasa se inactivo con proteinasa K a 55 °C durante 10 minutos. Despues se anadio una mezcla 1:1 v/v de la muestra a 25:24:1 v/v/v de fenol:cloroformo:alcohol isoairnlico para extraer el ARN de los lfpidos en la fase acuosa. Las muestras se mezclaron agitando en un mezclador de vortice durante unos pocos segundos y despues se colocaron en una centnfuga durante 15 minutos a 12 k rpm. La fase acuosa (que contema el ARN) se retiro y se uso para analizar el ARN. Antes de la carga (400 ng de ARN por pocillo) todas las muestras se incubaron con colorante de carga en formaldeh^do, se desnaturalizaron durante 10 minutos a 65 °C y se enfriaron a temperatura ambiente. Se usaron los marcadores Ambion Milenio para aproximar el peso molecular de la construccion de ARN. El gel se opero a 90 V. El gel se tino usando oro SYBR al 0,1 % de acuerdo con las instrucciones del fabricante en agua meciendo a temperatura ambiente durante 1 hora. La FIG. 1 muestra que la ARNasa digiere completamente el ARN en ausencia de encapsulacion (carril 3). El ARN es indetectable tras la encapsulacion (carril 4), y no se observa ningun cambio si estos liposomas se tratan con ARNasa (carril 4). Despues los liposomas tratados con ARNasa se someten a extraccion con fenol, se observa el ARN sin digerir (carril 6). Incluso despues de 1 semana a 4 °C el ARN pudo observarse sin ninguna fragmentacion (FIG. 4, flecha). La expresion de las protemas in vivo se mantuvo sin cambios despues de 6 semanas a 4 °C y un ciclo de congelacion-descongelacion. De este modo el ARN encapsulado en liposomas es estable.
Para evaluar la expresion in vivo del ARN se codifico una enzima reportera (FASE; fosfatasa alcalina secretada) en el replicon, en lugar de un inmunogeno. Los niveles de expresion se midieron en sueros diluidos 1:4 en tampon de
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dilucion PhosphaLight 1X usando un sustrato de fosfatasa alcalina quimioluminiscente. Se inyectaron ratones BALB/c de 8-10 semanas de edad (5/grupo) por v^a intramuscular en el dfa 0, 50 |il por pata con una dosis de 0,1 |ig o 1 |ig de ARN. El mismo vector se administro tambien sin los liposomas (en PBS 1X libre de ARNasa) a 1 |ig. Tambien se ensayaron los replicones empaquetados en viriones. Los replicones empaquetados en viriones usados en el presente documento (a los que se hace referencia como "PRV") se obtuvieron mediante los procedimientos de la referencia 51, donde el replicon de alfavirus se deriva del VEEV mutante o una quimera derivada del genoma del VEEV disenado para contener el RNT 3' del virus Sindbis y una senal de empaquetamiento (SR) del virus Sindbis, empaquetados mediante la co-electroporacion de estos en celulas BHK con los ARN auxiliares defectuosos que codifican la capside del virus Sindbis y los genes de las glucoprotemas.
Como se muestra en la FIG. 5, la encapsulacion aumento los niveles de la FASE en aproximadamente 1/2 log a la dosis de 1 |ig, y en el dfa 6 la expresion de una dosis encapsulada de 0,1 |ig coincidio con los niveles observados con una dosis sin encapsular de 1 |ig. En el dfa 3 los niveles de expresion superaron los alcanzados con las PRV (cuadrados). De este modo lo expresado aumento cuando el ARN se formulo en los liposomas en relacion al control de ARN desnudo, incluso a una dosis mas baja de 10x. La expresion tambien era mayor en relacion al control de la PRV, pero las cineticas de expresion eran muy diferentes (vease la FIG. 5). La liberacion del ARN con electroporacion resulto en la expresion aumentada en relacion al control de ARN desnudo, pero estos niveles eran mas bajos que con los liposomas.
Para evaluar si el efecto observado en los grupos con liposomas era debido simplemente a los componentes de los liposomas, o estaba vinculado a la encapsulacion, el replicon se administro en la forma encapsulada (con dos protocolos de purificacion diferentes, 0,1 |ig de ARN), o mezclado con los liposomas despues de su formacion (un “lipoplexo” no encapsulado, 0,1 |ig de ARN), o como ARN desnudo (1 |ig). La FIG. 10 muestra que el lipoplexo proporciono los niveles mas bajos de expresion, mostrando que la encapsulacion es esencial para una expresion potente.
Adicionalmente los experimentos de la FASE mostraron una respuesta clara a la dosis in vivo, con una expresion observada tras la liberacion tan pequena como 1 ng de ARN (FIG. 6). Los experimentos adicionales que compararon la expresion de los replicones encapsulados y desnudos indicaron que 0,01 |ig de ARN encapsulado era equivalente a 1 |ig de ARN desnudo. A una dosis de 0,5 |ig de ARN el material encapsulado proporciono una expresion 12 veces mas alta en el dfa 6; a unos niveles de dosis de 0,1 |ig eran 24 veces mas altos en el dfa 6.
En lugar de observar los niveles medios en el grupo, tambien se estudiaron los animales individuales. Considerando que varios animales eran no respondedores a replicones desnudos, la encapsulacion elimino a los no respondedores.
Los experimentos adicionales reemplazaron DlinDMA con DOTAP. Aunque los liposomas de DOTAP proporcionaron una mejor expresion del replicon desnudo, eran inferiores a los liposomas de DlinDMA (de 2 a 3 veces la diferencia en el dfa 1).
Para evaluar la inmunogenicidad in vivo se construyo un replicon para expresar la protema F de longitud completa del virus respiratorio sincitial (VRS). Este se libero desnudo (1 |ig), encapsulado en liposomas (0,1 o 1 |ig), o empaquetado en viriones (106 UI; “PRV") en los dfas 0 y 21. La FIG. 7 muestra los tftulos de IgG anti-F 2 semanas despues de la segunda dosis, y los liposomas aumentan claramente la inmunogenicidad. La FIG. 8 muestra los tftulos 2 semanas mas tarde, en cuyo momento no hubo una diferencia estadfstica entre el ARN encapsulado a 0,1 |ig, el ARN encapsulado a 1 |ig, o el grupo de la PRV. Los tftulos de neutralizacion (medidos como una reduccion del 60 % de las placas "ENRP60") no eran significativamente diferentes en estos tres grupos 2 semanas despues de la segunda dosis (FIG. 9). La FIG. 12 muestra tanto los tftulos de IgG como los de ENRP 4 semanas despues de la segunda dosis.
La FIG. 13 confirma que el ARN provoca una respuesta fuerte de las celulas T CD8.
Los experimentos adicionales compararon los tftulos de IgG espedficas de F en ratones que recibieron las PRV, 0,1 |ig de ARN encapsulado en liposomas o 1 |ig de ARN encapsulado en liposomas. Las relaciones de los tftulos (PRV:liposoma) en diversos momentos tras la segunda dosis eran como sigue:
2 semanas 4 semanas 8 semanas
0,1 |ig
2,9 1,0 1,1
1 ^g
2,3 0,9 0,9
De este modo el ARN encapsulado en liposomas fundamentalmente induce la misma magnitud de respuesta inmunitaria que la observada con la liberacion del virion.
Experimentos adicionales mostraron respuestas superiores de la IgG espedficas de F con una dosis de 10 |ig, respuestas equivalentes para dosis de 1 |ig y 0,1 |ig, y una menor respuesta con una dosis de 0,01 |ig. La FIG. 11
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muestra los tftulos de IgG en los ratones que recibieron el replicon en la forma desnuda a 3 dosis diferentes, en liposomas a 4 dosis diferentes, o como PRV (106 UI). La respuesta observada con 1 |ig de ARN encapsulado en liposomas era estadfsticamente no significativa (ANOVA) cuando se comparo con las PRV, pero la respuesta mas alta observada con 10 |ig de ARN encapsulado en liposomas era estadfsticamente significativa (p <0,05) cuando se comparo con ambos de estos grupos.
Un estudio adicional confirmo que 0,1 |ig de ARN encapsulado en liposomas proporciono respuestas mucho mas altas de IgG anti-F (15 dfas despues de la segunda dosis) que 0,1 |ig de ADN liberado, e incluso era mas inmunogenico que 20 |ig de ADN del plasmido que codifica el antigeno F, liberado por electroporacion (Sistema de liberacion de ADN Elgen™, Inovio).
Se realizo un estudio adicional en ratas del algodon (Sigmodon hispidis) en lugar de ratones. A una dosis de 1 |ig la encapsulacion en liposomas aumento los tftulos de IgG especfticas de F en 8,3 veces en comparacion con el ARN desnudo y aumento los tftulos del ENRP en 9,5 veces. La magnitud de la respuesta de los anticuerpos era equivalente a la inducida por 5x106 UI de PRV. Tanto el ARN desnudo como el encapsulado en liposomas eran capaces de proteger a las ratas del algodon del esftmulo del VRS (1x105 unidades formadoras de placa), reduciendo la carga viral del pulmon en al menos 3,5 logs. La encapsulacion aumento la reduccion en aproximadamente 2 veces.
Respuestas de defensa del huesped a dosis de ARN mas altas
Se usaron ratones para observar si las respuestas de defensa del huesped (inmunidad innata o adaptativa) podnan limitar la respuesta inmunitaria para los antfgenos codificados a dosis de ARN mas altas.
Se usaron tres ARN diferentes para este estudio: (i) el replicon “vA317” que expresa la F del VRS, es dedr, la glucoprotema de fusion de superficie del VRS; (ii) el replicon “vA17” que expresa la PVF; y (iii) el “vA336” que es de replicacion defectuosa y codifica la PVF.
Los ARN se liberaron o bien desnudos o con liposomas fabricados con DlinDMA al 40%, DEFC al 10%, colesterol al 48% y PEG-DMG al 2% (las proporciones estan en % en moles de liposoma total). Estos liposomas se prepararon en lotes de 75 |ig. Se prepararon soluciones madre lipfdicas recientes en etanol. Se pesaron 37 mg de DlinDMA, 11,8 mg de DEFC, 27,8 mg de colesterol y 8,07 mg de PEG-DMG y se disolvieron en 7,55 ml de etanol. La solucion madre lipfdica recien preparada se mecio suavemente a 37 °C durante aproximadamente 15 min para formar una mezcla homogenea. Despues, se anadieron 226,7 |il de la madre a 1,773 ml de etanol para fabricar una solucion madre lipfdica de trabajo de 2 ml. Se utilizo esta cantidad de ftpidos para formar liposomas con 75 |ig de ARN. Tambien se preparo una solucion de trabajo de 2 ml de ARN de una solucion madre de ~ 1 |ig/|il en tampon citrato 100 mM (pH 6). Se enjuagaron tres viales de vidrio de 20 ml (con barras de agitacion) con una solucion sin ARNasa (Molecular Bioproducts) y se lavaron con abundante agua Milli Q antes de su uso para descontaminar los viales de ARNasas. Uno de los viales se uso para la solucion de trabajo de ARN y los otros para la recogida de las mezclas de ftpidos y ARN (como se describe mas adelante). Las soluciones de trabajo de ftpidos y ARN se calentaron a 37 °C durante 10 min antes de cargarse en jeringas de 3 cc. Se cargaron 2 ml de tampon citrato (pH 6) en otra jeringa de 3 cc. Las jeringas que conteman ARN y los ftpidos se conectaron a un mezclador en T (PEEK™ d.i. de la union de 500 |im) usando tubos de FEP. La salida del mezclador en T tambien era de tubo de FEP. La tercera jeringa que contema el tampon citrato se conecto a un trozo separado de tubo. Despues todas las jeringas se impulsaron a un caudal de 7 ml/min usando una bomba de jeringa. Las salidas de los tubos se posicionaron para recoger las mezclas en un vial de vidrio de 20 ml (mientras se agitaba). Se saco la barra de agitacion y la solucion acuosa de etanol se dejo equilibrar a temperatura ambiente durante 1 h. Despues se cargo la mezcla en una jeringa de 5 cc, que se conecto a un trozo de tubo de FEP y en otra jeringa de 5 cc con un tubo de FEP de la misma longitud, se cargo la misma cantidad de tampon citrato 100 mM (pH 6). Las dos jeringas se impulsaron a un caudal de 7 ml/min usando una bomba de jeringa y la mezcla final se recogio en un vial de vidrio de 20 ml (mientras se agitaba). A continuacion, los liposomas se concentraron a 2 ml y se dializaron frente a 10-15 volumenes de PBS 1X usando FFT antes de recuperar el producto final. El sistema de FFT y las membranas de filtracion de fibra hueca se adquirieron de Spectrum Labs y se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usaron membranas de filtracion de fibra hueca de polietersulfona (PES) (numero de componente P-C1-100E-100-01N) con un corte de tamano de poro de 100 kD y un area superficial de 20 cm2. Para los experimentos in vitro e in vivo las formulaciones se diluyeron a la concentracion de ARN requerida con PBS 1X.
Las cuatro formulaciones de liposomas teman las siguientes caractensticas:
ARN
Tamano de particula promedio Z (nm) Polidispersidad Encapsulacion del ARN
vA317
155,7 0,113 86,6 %
vA17
148,4 0,139 92 %
vA336
145,1 0,143 92,9 %
Vacfo
147,9 0,147 -
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A los ratones BALB/c, 5 animales por grupo, se les proporcionaron vacunaciones intramusculares bilaterales (50 |il por pata) en los dfas 0 y 21 con:
Grupo 1 ARN de la F del VRS auto-replicante desnudo (vA317, 0,1 |ig)
Grupo 2 ARN de la F del VRS auto-replicante (vA317, 0,1 |ig) encapsulado en liposomas
Grupo 3 ARN de la F del VRS auto-replicante (vA317, 0,1 |ig) anadido a liposomas vados
Grupo 4 una mezcla de ARN de la F del VRS auto-replicante (vA317, 0,1 |ig) y ARN de la PVF auto-replicante (vA17, 10 |ig)
Grupo 5 una mezcla de ARN de la F del VRS auto-replicante (vA317, 0,1 |ig) y ARN de la PVF de replicacion defectuosa (vA336, 10 |ig)
Grupo 6 una mezcla de ARN de la F del VRS auto-replicante formulado en liposomas (vA317, 0,1 |ig) y ARN de la PVF auto-replicante (vA17, 10 |ig)
Grupo 7 una mezcla de ARN de la F del VRS auto-replicante formulado en liposomas (vA317, 0,1 |ig) y ARN de la PVF de replicacion defectuosa (vA336, 10 |ig)
Grupo 8 una mezcla de ARN de la F del VRS auto-replicante formulado en liposomas (vA317, 0,1 |ig) y ARN de la PVF auto-replicante formulado en liposomas (vA17, 1 |ig)
Grupo 9 una mezcla de ARN de la F del VRS auto-replicante formulado en liposomas (vA317, 0,1 |ig) y ARN de la PVF de replicacion defectuosa formulado en liposomas (vA336, 1 |ig)
Grupo 10 protema de la subunidad F (5 |ig)
Se recogio el suero para el analisis de anticuerpos en los dfas 14, 35 y 51. Se midieron los tftulos de IgG del suero espedficas de F (mGt); si un animal individual tema un tftulo de < 25 (ftmite de deteccion), se le asigno un tftulo de 5. Ademas, se extrajeron los bazos de los ratones en el dfa 51 para el analisis de celulas T, para determinar las celulas que eran positivas en citoquinas y espedficas para el peptido F51-66 del VRS (CD4+) o para los peptidos F85-93 y F249-258 de la F del VRS (CD8+).
Los tftulos de IgG eran como sigue en los 10 grupos y en los ratones control no inmunizados.
Dia
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 -
14
22 1819 5 5 24 174 1130 44 347 5 5
35
290 32533 9 5 746 6887 13171 773 4364 19877 5
51
463 30511 18 10 1076 7201 14426 922 4697 20853 5
Los tftulos de neutralizacion del VRS en el suero en el dfa 51 eran como sigue:
Dia
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
51
35 50 24 25 31 31 54 34 24 38
Los animales que mostraron celulas T esplenicas CD4+ espedficas de F del VRS en el dfa 51 eran como sigue, donde se proporciona un numero (% de celulas positivas) solo si la respuesta estimulada era estadfsticamente significativa por encima de cero:
Citoquina
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
IFN-y
0,04 0,02 0,02
IL2
0,02 0,06 0,02 0,02 0,02 0,02
IL5
0,01
TNF a
0,03 0,05 0,02 0,02
Los animales que mostraron celulas T esplenicas CD8+ espedficas de F del VRS en el dfa 51 eran como sigue, donde se proporciona un numero solo si la respuesta estimulada era estadfsticamente significativa por encima de cero:
5
10
15
20
25
30
Citoquina
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
IFN-y
0,37 0,87 0,37 0,40 0,49 0,06 0,54
IL2
0,11 0,40 0,15 0,18 0,20 0,03 0,23 0,04
IL5
TNF a
0,29 0,79 0,35 0,42 0,40 0,53 0,06
Estos resultados muestran que las respuestas de defensa del huesped pueden limitar la respuesta inmunitaria al vector liberado. Por ejemplo, los grupos 2 y 6-9 usaron el mismo vector auto-replicante que codifica el antigeno, liberado en liposomas, pero los grupos 6-9 tambien teman un exceso 100 veces o 10 veces de vector que codifica la PVF, liberado o bien desnudo o dentro de liposomas, y o bien auto-replicante o de replicacion defectuosa. El ARN adicional redujo las respuestas anti-VRS, en particular si era auto-replicante y/o encapsulado.
Los experimented adicionales se dirigieron para observar si las respuestas del huesped al ARN podnan limitar la expresion de las protemas. De este modo la expresion se siguio durante solo 6 dfas, antes de que fuera evidente una respuesta adaptativa (anticuerpos, celulas T). El replicon “vA306” codifica la FASE; el replicon “vA17” codifica la PVF; el replicon “vA336” codifica la PVF, pero no puede auto-replicarse; el replicon “vA336*” es el mismo que vA336 pero se preparo con un 10 % de uridinasa sustituida con 5-metiluridina; el replicon “vA336**” es el mismo que va336 pero el 100 % de sus residuos de uridina son M5U. A los ratones BALB/c se les proporcionaron las vacunaciones intramusculares bilaterales (50 |il por pata) en el dfa 0. Los animales, 35 en total, se dividieron en 7 grupos (5 animales por grupo) y se inmunizaron como sigue:
Grupo 1 Control Naive.
Al grupo 2 se les proporcionaron vacunaciones intramusculares bilaterales (50 |il por pata) en el dfa 0 con ARN (vA306, 0,1 |ig, FASE) formulado en liposomas mezclado con ARN auto-replicante (vA17, 1,0 |ig, PVF) formulado en liposomas.
Al grupo 3 se les proporcionaron vacunaciones intramusculares bilaterales (50 |il por pata) en el dfa 0 con ARN (vA306, 0,1 |ig, FASE) formulado en liposomas mezclado con ARN no replicante (vA336, 1,0 |ig, PVF) formulado en liposomas.
Al grupo 4 se les proporcionaron vacunaciones intramusculares bilaterales (50 |il por pata) en el dfa 0 con ARN (vA306, 0,1 |ig, FASE) formulado en liposomas mezclado con ARN no replicante (vA336*, 1,0 |ig, PVF) formulado en liposomas.
Al grupo 5 se les proporcionaron vacunaciones intramusculares bilaterales (50 |il por pata) en el dfa 0 con ARN (vA306, 0,1 |ig, FASE) formulado en liposomas mezclado con ARN no replicante (vA336**, 1,0 |ig, PVF) formulado en liposomas.
Al grupo 6 se les proporcionaron vacunaciones intramusculares bilaterales (50 |il por pata) en el dfa 0 con ARN (vA306, 0,1 |ig, FASE) formulado en liposomas mezclado con liposomas vactes a la misma dosis lipfdica que en los grupos 2-5.
Al grupo 7 se les proporcionaron vacunaciones intramusculares bilaterales (50 |il por pata) en el dfa 0 con ARN (vA306, 0,1 |ig, FASE) formulado en liposomas mezclado con ARN auto-replicante (vA17, 1,0 |ig, PVF) formulado en liposomas.
La actividad de la FASE en el suero (unidades relativas de luz) en los dfas 0, 3 y 6 eran como sigue (MGT):
Dia 1 Dia 2 Dia 3
1
898 1170 2670
2
1428 4219 28641
3
1702 9250 150472
4
1555 8005 76043
5
1605 8822 91019
6
10005 14640 93909
7
1757 6248 53497
5
10
15
20
25
30
35
40
45
El ARN competente para la replicacion que codifica la PVF suprimio la expresion de la FASE mas que el ARN de la PVF de replicacion defectuosa, lo que sugiere una fuerte respuesta de defensa del huesped frente al ARN de replicacion que conduce a la supresion de la expresion de la FASE. Es posible que los interferones inducidos en respuesta al ARN de la PVF suprimieran la expresion de la FASE. En el modelo de respuesta/supresion del huesped, se esperana el bloqueo del reconocimiento del huesped del ARN para dar lugar a una expresion aumentada de la FASE, pero la metilacion 5' de los residuos U en el ARN de la PVF no se asocio con la FASE aumentada, lo que sugiere que el reconocimiento del huesped del ARN era insensible a la metilacion 5'.
Volumen de liberacion
La liberacion hidrodinamica emplea la fuerza generada por la inyeccion rapida de un gran volumen de solucion para superar las barreras ffsicas de las membranas celulares que impiden que los compuestos grandes e impermeables a la membrana entren en las celulas. Se ha mostrado previamente que este fenomeno es util para la liberacion intracelular de vacunas de ADN.
Un volumen de liberacion tfpico para la inyeccion intramuscular en un raton es de 50 |il en la pata trasera, que es un volumen relativamente alto para el musculo de la pata de un raton. Por el contrario, una dosis intramuscular para seres humanos de ~ 0,5 ml es relativamente pequena. Si la inmunogenicidad en los ratones fuera dependiente del volumen entonces la eficacia de las vacunas de replicones podna deberse, al menos en parte, a las fuerzas hidrodinamicas, que no se fomentanan para el uso de las mismas vacunas en seres humanos y en animales mas grandes.
El replicon vA317 se libero a ratones BALB/c, 10 por grupo, en vacunaciones intramusculares bilaterales (5 o 50 por pata) en el dfa 0 y 21:
El grupo 1 recibio el replicon desnudo, 0,2 |ig en 50 |il por pata
El grupo 2 recibio el replicon desnudo, 0,2 |ig en 5 |il por pata
El grupo 3 recibio el replicon formulado en emulsion (0,2 |ig, 50 |il por pata)
El grupo 4 recibio el replicon formulado en emulsion (0,2 |ig, 5 |il por pata)
El grupo 5 recibio el replicon formulado en liposomas (0,2 |ig, 50 |il por pata)
El grupo 6 recibio el replicon formulado en liposomas (0,2 |ig, 5 |il por pata)
El suero se recogio para el analisis de anticuerpos en los dfas 14 y 35. Las MGT de IgG del suero espedficas de F eran:
Dia
1 2 3 4 5 6
14
42 21 783 760 2669 2610
35
241 154 2316 2951 17655 18516
Por consiguiente la inmunogenicidad del replicon formulado no vario de acuerdo con el volumen liberado, indicando de este modo que estas vacunas de ARN no se basan en la liberacion hidrodinamica para su eficacia.
Estudio en un mam^fero grande
Se realizo un estudio en un animal grande en ganado. Los terneros (4-6 semanas de edad, ~ 60-80 kg, 5 por grupo) se inmunizaron con 66 |ig del replicon vA317 que codifica la protema F del VRS de longitud completa en los dfas 0, 21, 86 y 146. Los replicones se formularon o bien dentro de los liposomas o con la emulsion CNE17. El PBS solo se uso como control negativo, y se uso una vacuna autorizada como control positivo (“Triangulo 4” de Fort Dodge, que contema virus muertos). Todos los terneros recibieron 15 |ig de la protema F ayudada con la emulsion MF59 en el dfa 146. Una vaca se vacuno por error con la vacuna basada en CNE17 el dfa 86 en lugar del Triangulo 4 y por eso sus datos se excluyeron del dfa 100 en adelante.
Las vacunas de ARN codificaron la F del VRS humano mientras que la vacuna “Triangulo 4” contiene la F del VRS bovino, pero la protema F del VRS se conserva altamente entre el VRSB y el VRSH.
Los liposomas teman la misma proporcion de DlinDMA, DEFC, colesterol y PEG-DMG como se ha mencionado anteriormente. Se prepararon soluciones madre lipfdicas recientes en etanol. Se pesaron 37 mg de DlinDMA, 11,8 mg de DEFC, 27,8 mg de colesterol y 8,07 mg de PEG-DMG y se disolvieron en 7,55 ml de etanol. La solucion madre lipfdica recien preparada se mecio suavemente a 37 °C durante aproximadamente 15 min para formar una mezcla homogenea. Despues, se anadieron 226,7 |il de la madre a 1,773 ml de etanol para fabricar una solucion madre lipfdica de trabajo de 2 ml. Tambien se preparo una solucion de trabajo de 2 ml de ARN de una solucion
5
10
15
20
25
30
35
40
madre de ~ 1 |ig/|il en tampon citrato 100 mM (pH 6). Se enjuagaron tres viales de vidrio de 20 ml (con barras de agitacion) con una solucion sin ARNasa (Molecular Bioproducts) y se lavaron con abundante agua Milli Q antes de su uso para descontaminar los viales de ARNasas. Uno de los viales se uso para la solucion de trabajo de ARN y los otros para la recogida de las mezclas de ftpidos y ARN (como se describe mas adelante). Las soluciones de trabajo de ftpidos y ARN se calentaron a 37 °C durante 10 min antes de cargarse en jeringas de 3 cc. Se cargaron 2 ml de tampon citrato (pH 6) en otra jeringa de 3 cc. Las jeringas que conteman ARN y los ftpidos se conectaron a un mezclador en T (PEEK™ d.i. de la union de 500 |im) usando tubos de FEP. La salida del mezclador en T tambien era de tubo de FEP. La tercera jeringa que contema el tampon citrato se conecto a un trozo separado de tubo de FEP. Despues todas las jeringas se impulsaron a un caudal de 7 ml/min usando una bomba de jeringa. Las salidas de los tubos se posicionaron para recoger las mezclas en un vial de vidrio de 20 ml (mientras se agitaba). Se saco la barra de agitacion y la solucion acuosa de etanol se dejo equilibrar a temperatura ambiente durante 1 h. Despues se cargo la mezcla en una jeringa de 5 cc, que se conecto a un trozo de tubo de FEP y en otra jeringa de 5 cc con un tubo de FEP de la misma longitud, se cargo el mismo volumen de tampon citrato 100 mM (pH 6). Las dos jeringas se impulsaron a un caudal de 7 ml/min usando una bomba de jeringa y la mezcla final se recogio en un vial de vidrio de 20 ml (mientras se agitaba). A continuacion, la mezcla recogida de la segunda etapa de mezclado (liposomas) se hizo pasar a traves de una membrana Mustang Q (un soporte de intercambio anionico que une y retira las moleculas anionicas, obtenido de Pall Corporation, Ann Arbor, MI, Estados Unidos). Antes de hacer pasar los liposomas, se hicieron pasar sucesivamente a traves de la membrana Mustang 4 ml de NaOH 1 M, 4 ml de NaCl 1 M y 10 ml de tampon citrato 100 mM (pH 6). Los liposomas se calentaron durante 10 min a 37 °C antes de hacerlos pasar a traves del filtro. A continuacion, los liposomas se concentraron a 2 ml y se dializaron frente a 10-15 volumenes de PBS 1X usando el sistema de FFT antes de recuperar el producto final. El sistema de FFT y las membranas de filtracion de fibra hueca se adquirieron de Spectrum Labs y se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usaron membranas de filtracion de fibra hueca de polietersulfona (PES) con un corte de tamano de poro de 100 kD y un area superficial de 20 cm2. Para los experimentos in vitro e in vivo las formulaciones se diluyeron a la concentracion de ARN requerida con PBS 1X.
Los terneros recibieron 2 ml de cada vacuna experimental, administrada via intramuscular como 2x1 ml en cada lado del cuello. Por el contrario, la vacuna "Triangulo 4" se proporciono como una dosis de 2 ml unica en el cuello.
El suero se recogio para el analisis de los anticuerpos en los dfas 0, 14, 21, 35, 42, 56, 63, 86, 100, 107, 114, 121, 128, 135, 146, 160, 167, 174, 181, 188, 195 y 202. Si un animal individual tema un tftulo por debajo del ftmite de deteccion se le asigno un tftulo de 5.
La FIG. 14A muestra los tftulos de IgG espedficas de F en los primeros 63 dfas. El replicon de ARN era inmunogenico en las vacas usando ambos sistemas de liberacion, a pesar de que proporcionaron tftulos mas bajos que la vacuna autorizada. Todas las vacas vacunadas mostraron anticuerpos espedficos de F tras la segunda dosis, y los tftulos eran muy estables a partir del periodo de 2 a 6 semanas tras la segunda dosis (y eran particularmente estables para las vacunas de ARN). Los tftulos con el sistema de liberacion de liposomas estaba mas estrechamente agrupados que con la emulsion.
La FIG. 14B muestra los tftulos IgG del suero espedficas de F (MGT) en 210 dfas, y los valores medidos hasta el dfa 202 eran como sigue:
D0 3wp1 D21 2wp2 D35 5wp2 D56 ~9wp2 D86 2wp3 D100 5wp3 D121 8wp3 D146 2wp4 D160 5wp4 D181 8wp4 D202
PBS
5 5 5 5 5 5 5 5 46 98 150
Liposoma
5 5 12 11 20 768 428 74 20774 7022 2353
CNE17
5 5 34 46 56 773 538 70 8297 4843 2073
Triangulo 4
5 5 1784 721 514 3406 2786 336 13376 4775 2133
La vacuna ayudada con la emulsion indujo una respuesta de neutralizacion cuando se ensayo sin complemento, con tftulos mas altos que los del triangulo 4 (aunque mas variable). Los tftulos de los anticuerpos de neutralizacion del VRS en el suero eran como sigue:
D0 2wp2 D35 5wp2 D56 2wp3 D100 3wp3 D107 4wp3 D114 8wp3 D146 2wp4 D160 3wp4 D167 4wp4 D174
PBS Liposoma CNE17 Triangulo 4
12 10 10 14 18 20 14 10 10 10
13
10 10 20 13 17 13 47 26 21
10
10
13 28 44 52 14 64 57 40
12
15 13 39 38 41 13 24 26 15
Los datos de este estudio proporcionan una prueba de concepto para las vacunas del VRS de replicon de ARN en animales grandes, con dos de los cinco terneros en el grupo ayudado con la emulsion demostrando buenos tftulos de anticuerpos de neutralizacion despues de la tercera vacunacion, tal como se mide mediante el ensayo de neutralizacion del VRSH independiente del complemento. Aunque las vacunas ayudadas con la emulsion parecen 5 ser mas inmunogenicas que las vacunas ayudadas con liposomas, un factor que lo complica es que el material usado para la segunda dosis de liposomas no estaba recien preparado, y el mismo lote de ARN mostro una disminucion en la potencia en un estudio de inmunogenicidad en un raton. Por lo tanto es posible que la vacuna ayudada con liposomas hubiera sido mas inmunogenica si se hubiera usado el material reciente para todas las vacunas.
10 Cuando se ensayo con el complemento, se detectaron anticuerpos de neutralizacion en todas las vacas vacunadas. En este ensayo, todos los terneros vacunados teman buenos tftulos de anticuerpos de neutralizacion despues de la segunda vacunacion con ARN independientemente de la formulacion. Ademas, ambas vacunas de ARN provocaron tftulos de IgG en el suero espedficas de F que se detectaron en unos pocos terneros despues de la segunda vacunacion y en todos los terneros despues de la tercera.
15 La F del VRS ayudada con MF59 era capaz de estimular la respuesta de las IgG en todos los terneros vacunados previamente, y de estimular los tftulos de neutralizacion del VRSh independiente del complemento de los terneros vacunados previamente con ARN.
La prueba de concepto para las vacunas de ARN en animales grandes es particularmente importante en vista de la perdida en la potencia observada previamente con las vacunas basadas en ADN cuando se pasa de modelos de
20 animales pequenos a animales y seres humanos mas grandes. Una dosis tfpica para una vacuna de ADN para una vaca sena 0,5-1 mg [45,46] y por lo tanto es muy alentador que las respuestas inmunitarias se indujeran con solo 66 |ig de ARN.
DDFC
DEFA
DEFC
DEFE
DEFG
DLOFC
DLFA
DLFC
DLFE
DLFG
DLFS
DMG
DMFA
DMFC
DMFE
DMFG
DMFS
DOFA
DOFC
DOFE
Tabla 1: fosfolipidos utiles
1.2- Didecanoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
1.2- Dierucoil-sn-glicero-3-fosfato
1.2- Erucoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
1.2- Dierucoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina
1.2- Dierucoil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac-(1 -glicerol...)
1.2- Linoleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
1.2- Dilauroil-sn-glicero-3-fosfato
1.2- Dilauroil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
1.2- Dilauroil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina
1.2- Dilauroil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac-(1-glicerol...)
1.2- Dilauroil-sn-glicero-3-fosfatidilserina
1.2- Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina
1.2- Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfato
1.2- Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
1.2- Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina
1.2- Miristoil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac-(1-glicerol...)
1.2- Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidilserina
1.2- Dioleoil-sn-glicero-3-fosfato
1.2- Dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
1.2- Dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina
(continuacion)
Tabla 1: fosfolipidos utiles
DOFG
1,2-Dioleoil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac-(1 -glicerol...)
DOFS
1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilserina
DPFA
1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfato
DPFC
1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
DPFE
1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina
DPFG
1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac-(1 -glicerol...)
DPFS
1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilserina
DFyFE
1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina
DEFA
1,2-Diestearoil-sn-glicero-3-fosfato
DEFC
1,2-Diestearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
DEFE
1,2-Diestearoil-sn-glicero-3-fosfatidilethanolamina
DEFG
1,2-Diestearoil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac-(1-glicerol...)
DEFS
1,2-Diestearoil-sn-glicero-3-fosfatidilserina
FCH
FC de huevo
FCHH
FC de huevo hidrogenada
FCSH
FC de soja hidrogenada de alta pureza
FCSH
FC de soja hidrogenada
LYSOFC MIRfSTICO
1 -Miristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
LYSOPFC PALMmCO
1 -Palmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
LYSOFC ESTEARICO
1-Estearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
Esfingomielina de la leche MPFC
1-Miristoil,2-palmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
MEFC
1-Miristoil,2-estearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
PMFC
1-Palmitoil,2-miristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
POFC
1-Palmitoil,2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
POFE
1-Palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina
DOFG
1,2-Dioleoil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac-(1 -glicerol)...]
PEFC
1-Palmitoil,2-estearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
EMFC
1-Estearoil,2-miristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
EOFC
1-Estearoil,2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
EPFC Referencias
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Claims (13)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    REIVINDICACIONES
    1. Un ARN auto-replicante que codifica un inmunogeno para su uso en unos procedimientos profilacticos o terapeuticos de aumento de una respuesta inmunitaria en un mai^ero grande mediante la liberacion no vmca de dicho ARN, que comprende: (i) administrar al mai^ero una dosis de entre 2 |ig y 100 |ig de dicho ARN que codifica un inmunogeno, en el que el mairnfero grande es un ser humano, caballo, ganado o cerdo y el ARN se administra en combinacion con un sistema de liberacion que comprende: (i) liposomas; (ii) micropartfculas de un polfmero no toxico y biodegradable; y/o (iii) una emulsion de aceite en agua cationica submicrometrica.
  2. 2. El ARN para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el ARN se administra al tejido del musculo esqueletico.
  3. 3. El ARN para su uso de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en el que el ARN se administra mediante inyeccion.
  4. 4. El ARN para su uso de acuerdo con la reivindicacion 3, en el que la inyeccion es mediante una aguja.
  5. 5. El ARN para su uso de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en el que el ARN es de cadena +.
  6. 6. El ARN para su uso de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en el que el ARN es un replicon de ARN basado en un alfavirus.
  7. 7. El ARN para su uso de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en el que la molecula de ARN codifica (i) una ARN polimerasa dependiente de ARN que puede transcribir ARN de la molecula de ARN auto-replicante y (ii) un inmunogeno.
  8. 8. El ARN para su uso de acuerdo con la reivindicacion 7, en el que la polimerasa es una replicasa de un alfavirus.
  9. 9. El ARN para su uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que la molecula de ARN no codifica las protemas estructurales de un alfavirus.
  10. 10. El ARN para su uso de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en el que el ARN codifica un inmunogeno que puede provocar una respuesta inmunitaria frente a una bacteria, un virus, un hongo o un parasito.
  11. 11. El ARN para su uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en el que el inmunogeno puede provocar una respuesta inmunitaria in vivo frente al (a) virus respiratorio sincitial (VRS), tal como la glucoprotema F del VRS; (b) ortomixovirus, tal como el virus de la gripe A, B y C; o (c) virus del herpes, tal como el virus del herpes simple (VHS), virus de la varicela zoster (VVZ), virus de Epstein Barr (VEB), citomegalovirus (CMV), virus del herpes humano 6 (VHH6), virus del herpes humano 7 (VHH7) y virus del herpes humano 8 (VHH8).
  12. 12. El ARN para su uso de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en el que el marnffero grande es un ser humano.
  13. 13. Una composicion farmaceutica para su uso en un procedimiento de inmunizacion de un ser humano, caballo, ganado, o cerdo frente a una enfermedad, que comprende (a) entre 2 |ig y 100 |ig de ARN auto-replicante que codifica un inmunogeno para la liberacion no vmca por dosis unitaria y (b) un sistema de liberacion que comprende: (i) liposomas; (ii) micropartfculas de un polfmero no toxico y biodegradable; y/o (iii) una emulsion de aceite en agua cationica submicrometrica.
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