ES2591284T3

ES2591284T3 - Método para la producción de proteínas heterogéneas

Info

Publication number: ES2591284T3
Application number: ES08792251.4T
Authority: ES
Inventors: Hisahiro Tabuchi; Tomoya Sugiyama
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2007-08-07
Filing date: 2008-08-06
Publication date: 2016-11-25
Anticipated expiration: 2028-08-06
Also published as: US9499618B2; TW200920845A; EP2186905A1; CN101809161B; BRPI0815036A2; EP2186905A4; MX2010001319A; DK2186905T3; RU2487168C2; US9284374B2; AU2008284753A1; CN101809161A; CA2695849C; US8697397B2; KR20100057598A; CA2695849A1; RU2010108308A; US20150315624A1; AU2008284753B2; JPWO2009020144A1

Abstract

Un método para producir un polipéptido deseado, que comprende transferir artificialmente un gen de alanina aminotransferasa y un gen que codifica un polipéptido deseado a una célula y cultivar dicha célula que expresa dicha alanina aminotransferasa y tiene un ADN transferido que codifica el polipéptido deseado y que permite de ese modo a la célula producir dicho polipéptido deseado, en donde la célula que expresa la alanina aminotransferasa es una célula que es transformada por un vector que incorpora un ADN que codifica dicha alanina aminotransferasa, en donde el polipéptido deseado es un anticuerpo.

Description

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Además, como un gen del transportador de la taurina que se expresa fuertemente en una célula, puede utilizarse uno cualquiera de los siguientes ADNs (a1) a (e1) que codifican un transportador de la taurina.

(a1) un ADN que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en las secuencias de Nº de identificación: 62, 64, 66 o 68;

(b1) un ADN que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos como se muestra en las secuencias de Nº de identificación: 62, 64, 66 o 68 por sustitución, deleción, adición y/o inserción de uno o más residuos de aminoácidos y que todavía tiene actividad transportadora de la taurina;

(c1) un ADN que codifica un polipéptido que tiene 70% o más homología de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos como se muestra en las secuencias de Nº de identificación: 62, 64, 66 o 68 y, que todavía tiene actividad transportadora de la taurina;

(d1) un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos como se muestra en las secuencias de Nº de identificación: 61, 63, 65 o 67;

(e1) un ADN que se hibrida con un ADN complementario a un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos como se muestra en las secuencias de Nº de identificación: 61, 63, 65 o 67 en condiciones rigurosas y que todavía codifica un polipéptido que tiene actividad de transportador de la taurina.

La producción de un polipéptido deseado puede ser llevada a cabo mediante la transferencia de un gen que codifica el polipéptido deseado en una célula que expresa fuertemente un gen transportador de la taurina y un gen de ALT y cultivando la célula resultante en un medio. Además, se puede preparar un polipéptido deseado mediante el uso de una célula en la que un gen endógeno ha sido activado por la tecnología de activación de genes (véase, por ejemplo, el documento de patente internacional WO94/12650) de manera que se produzca el polipéptido deseado.

Cuando un polipéptido deseado se produce utilizando una célula en la que un gen de transportador de la taurina y un gen de ALT se han transferido artificialmente, el orden de la transferencia del gen transportador de la taurina, la transferencia del gen de ALT y la transferencia del gen que codifica el polipéptido deseado no está particularmente limitado. El gen que codifica el polipéptido deseado puede ser transferido después de la transferencia del gen transportador de la taurina y el gen de ALT. Alternativamente, el gen transportador de la taurina y el gen de ALT pueden ser transferidos después de la transferencia del gen que codifica el polipéptido deseado. También es posible transferir el gen transportador de la taurina, gen de ALT y gen que codifica el polipéptido deseado de forma simultánea.

Un gen transportador de la taurina, un gen de ALT y un gen que codifica un polipéptido deseado pueden ser transferidos de forma simultánea en un único vector. Alternativamente, pueden ser transferidos por separado usando una pluralidad de vectores.

Para el cultivo de la célula que expresa fuertemente ALT (y que puede expresar fuertemente un transportador de la taurina), pueden usarse medios utilizados en el cultivo celular convencional (preferiblemente, cultivo de células animales). Estos medios contienen generalmente aminoácidos, vitaminas, factores de lípidos, fuentes de energía, reguladores osmóticos, fuentes de hierro y reguladores del pH. Los contenidos de estos componentes son por lo general como sigue: aminoácidos 0,05-1.500 mg/l, vitaminas 0,001-10 mg/l, factores de lípidos 0-200 mg/l, fuentes de energía 1-20 g/l, reguladores osmóticos 0,1-10.000 mg/l, fuentes de hierro 0,1 a 500 mg/l, reguladores de pH 1 a

10.000 mg/l, oligoelementos metálicos 0,00001-200 mg/l, tensioactivos 0-5.000 mg/l, cofactores de crecimiento 0,0510.000µg/l y nucleósidos 0,001 a 50 mg/l. Sin embargo, el contenido no se limita a estos intervalos y puede seleccionarse apropiadamente dependiendo del tipo de la célula que se va a cultivar, el tipo de polipéptido deseado, y así sucesivamente.

Además de estos componentes, pueden añadirse oligoelementos metálicos, agentes tensioactivos, cofactores de crecimiento, nucleósidos, y similares.

Ejemplos específicos de tales componentes incluyen aminoácidos, tales como L-alanina, L-arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-cisteína, L-cistina, L-glutamina, ácido L-glutámico, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, Llisina, L-metionina, L-ornitina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina , L-treonina, L-triptófano, L-tirosina, y L-valina, preferiblemente, L-alanina, L-arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-cistina, L-glutamina, ácido L-glutámico, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, Ltriptófano, L-tirosina y L-valina; vitaminas, tales como i-inositol, biotina, ácido fólico, ácido lipoico, nicotinamida, ácido nicotínico, ácido p-aminobenzoico, pantotenato de calcio, hidrocloruro de piridoxal, hidrocloruro de piridoxina, riboflavina, hidrocloruro de tiamina, vitamina B12 y ácido ascórbico, preferiblemente, biotina, ácido fólico, ácido lipoico, nicotinamida, pantotenato de calcio, hidrocloruro de piridoxal, riboflavina, hidrocloruro de tiamina, vitamina B12 y ácido ascórbico; factores de lípidos, tales como cloruro de colina, tartrato de colina, ácido linoleico, ácido oleico y colesterol, preferiblemente, cloruro de colina; fuentes de energía, tales como glucosa, galactosa, manosa, y fructosa, preferiblemente, glucosa; reguladores osmóticos, tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, y nitrato de potasio, preferiblemente, cloruro de sodio; fuentes de hierro, tales como EDTA de hierro, citrato férrico, cloruro

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Los residuos de aminoácidos a mutar no están particularmente limitados. Preferiblemente, los residuos de aminoácidos son mutados a otros aminoácidos en los que se conserva la naturaleza de la cadena lateral del aminoácido inicial. Ejemplos específicos de la naturaleza de la cadena lateral de aminoácidos incluyen aminoácidos hidrófobos (A, I, L, M, F, P, W, Y y V), aminoácidos hidrófilos (R, D, N, C, E, Q, G H, K, S y T), aminoácidos con una cadena lateral alifática (G, A, V, L, I y P), aminoácidos con una cadena lateral que contiene un grupo hidroxilo (S, T y Y), aminoácidos con una cadena lateral que contiene un átomo de azufre (C y M), aminoácidos con una cadena lateral que contiene un ácido carboxílico y una amida (D, N, E y Q), aminoácidos con una cadena lateral que contiene una base (R, K y H) y los aminoácidos con una cadena lateral que contiene un grupo aromático (H, F, Y y W) (en paréntesis están los códigos de una letra para los aminoácidos).

Se ha informado de que un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos derivado de una secuencia de aminoácidos original por modificación (por ejemplo, deleción, adición y/o sustitución de uno o más aminoácidos) mantiene la actividad biológica del polipéptido original (Marcos, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666; Zoller, M. J. y Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500; Wang, A. et al, Science 224, 1431-1433; Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1982) 79, 6409-6413).

Como un ejemplo del polipéptido en el que uno o más residuos de aminoácido se añaden a ALT derivada de un ser humano o similar, puede darse un polipéptido de fusión que comprende ALT derivada de ser humano o semejante. Dicho polipéptido de fusión se compone de ALT derivada de ser humano o similar, y otro polipéptido fusionado a la misma. Dicho polipéptido de fusión se puede preparar mediante la vinculación de un gen que codifica ALT derivada de ser humano o similar en marco con un gen que codifica el otro polipéptido, transfiriendo el ADN resultante en un vector de expresión y expresando el ADN en una célula anfitriona. Pueden ser utilizadas las técnicas conocidas por los expertos en la técnica. No hay limitación en el polipéptido a fusionarse al derivado de ser humano o similares.

Los ejemplos de polipéptidos que se funden con ALT derivada de ser humano o similares incluyen, pero no se limitan a, FLAG (Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), 6xHis que comprende seis residuos de histidina (His), 10xHis, hemaglutinina de la gripe (HA), fragmento de c-myc humano, fragmento de VSV-GP, fragmento de p18HIV, etiqueta T7, etiqueta HSV, fragmento de antígeno SV40T, etiqueta Ick, fragmento de αtubulina, etiqueta B, fragmento de proteína C, glutatión-S-transferasa (GST), hemaglutinina de la gripe (HA), región constante de inmunoglobulina, β-galactosidasa y proteína de unión a la maltosa (MBP).

Un gen comercialmente disponible que codifica dicho polipéptido se fusiona con el gen que codifica ALT derivada de ser humano o similares. El gen fusionado así preparado se expresa para preparar un polipéptido fusionado.

Un método alternativo conocido por los expertos en la técnica para preparar polipéptidos funcionalmente equivalentes a un polipéptido específico es un método que utiliza la técnica de hibridación (Sambrook, J et al., Molecular Cloning segunda edición, 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Los expertos en la técnica podrían aislar rutinariamente un ADN altamente homólogo a la secuencia de ADN (por ejemplo, las secuencias de Nº de identificación: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 ó 59) de ALT derivada de ser humano o similares sobre la base de esa secuencia de ADN o una parte de la misma, y aislar polipéptidos funcionalmente equivalentes a ALT derivada de ser humano o similares a partir de ese ADN.

Las condiciones de hibridación para aislar un ADN que codifica un polipéptido funcionalmente equivalente a ALT derivada de ser humano o similares se pueden seleccionar apropiadamente por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se pueden dar condiciones de hibridación de bajo rigor. Las condiciones de hibridación de bajo rigor son, por ejemplo, 42º C, 2 x SSC y SDS al 0,1%, preferiblemente 50º C, 2 x SSC y SDS al 0,1% Más preferiblemente, se pueden dar condiciones de alto rigor. Por ejemplo, las condiciones de alto rigor son 65º C, 2 x SSC y SDS al 0,1%. En estas condiciones, a medida que la temperatura de hibridación se reduce, se obtienen no sólo los ADNs de elevada homología sino también los ADNs de baja homología. A la inversa, se espera que sólo aquellos ADNs de alta homología se obtengan con una temperatura elevada de hibridación. Sin embargo, no sólo la temperatura sino también una pluralidad de factores (tales como las concentraciones de sal) afectan al rigor de la hibridación. Los expertos en la técnica podrían apropiadamente seleccionar estos factores para realizar un rigor similar.

El polipéptido codificado por un ADN aislado por estas técnicas de hibridación puede tener 70% o más de homología y por lo general tiene una alta homología con ALT derivada de ser humano o similar en la secuencia de aminoácidos. El término "alta homología" se refiere a por lo general 97% o más de homología, preferiblemente 98%

o más de homología, más preferiblemente 99% o más de homología. Para la determinación de la homología de polipéptidos, el algoritmo descrito en Wilbur, W. J. y Lipman, D. J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1983) 80, 726-730 puede ser seguido.

El polipéptido puede variar en la secuencia de aminoácidos, peso molecular, punto isoeléctrico, presencia o ausencia de cadenas de azúcar, morfología, etc. dependiendo de la célula o anfitrión que produce el polipéptido o el método de purificación que se describirá más adelante. Sin embargo, siempre que el polipéptido resultante tenga funciones equivalentes a las funciones de ALT derivada de ser humano o similar, el ADN que codifica el polipéptido se puede utilizar en la presente invención. Por ejemplo, cuando el polipéptido de la presente invención se expresa en un procariota (por ejemplo, Escherichia coli), un residuo de metionina se añade a la N-terminal de la secuencia

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Proc Natl Acad Sci USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) utilizando el kit 5'-Ampli FINDER RACE (Clontech) y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores.

Un fragmento de ADN de interés se prepara a partir del producto de PCR resultante y se liga a un vector de ADN para preparar de ese modo un vector recombinante. El vector se introduce en un anfitrión (por ejemplo, E. coli), seguido de la selección de las colonias resultantes para obtener así un vector recombinante deseado. La secuencia de nucleótidos del ADN de interés puede ser confirmada por un método conocido tal como el método de terminación de cadena de didesoxinucleótido.

Además, se puede diseñar una secuencia de nucleótidos de una mayor eficacia de expresión para el ADN que codifica ALT considerando la frecuencia de uso de codones en el anfitrión que se utiliza para la expresión (Grantham, R. et al., Nucleic Acids Research (1981) 9, páginas 43-74). Además, el ADN que codifica ALT se puede modificar utilizando kits disponibles comercialmente o métodos conocidos. Ejemplos de tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, la digestión con enzimas de restricción, la inserción de oligonucleótidos sintéticos o fragmentos de ADN apropiados, la adición de enlazadores, y la inserción de un codón de iniciación (ATG) y/o un codón de terminación (TAA, TGA o TAG).

El ADN que codifica ALT también incluye un ADN que se hibrida con un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos como se muestra en las secuencias de Nº de identificación: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 ó 59 en condiciones de rigor y que codifica un polipéptido funcionalmente equivalente a ALT.

Las condiciones de rigor se pueden seleccionar apropiadamente por los expertos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, condiciones de rigor bajo. Las condiciones de rigor bajo se refieren a, por ejemplo, 42º C, 2 x SSC y SDS al 0,1%, preferiblemente 50º C, 2 x SSC y SDS al 0,1%. Más preferiblemente, se pueden seleccionar condiciones de rigor alto. Las condiciones de rigor alto se refieren a, por ejemplo, 65º C, 2 x SSC y SDS al 0,1%. En estas condiciones, a medida que se eleva la temperatura de hibridación, se pueden obtener ADNs con una homología más alta. El ADN anteriormente descrito que se hibrida es preferiblemente un ADN derivado de la naturaleza, por ejemplo, ADNc o ADN cromosómico.

Estos ADN aislados mediante técnicas de hibridación normalmente tienen una identidad de secuencia de nucleótidos alta con un ADN que codifica ALT derivada de un ser humano o similares. El ADN que codifica ALT también incluye un ADN que codifica un polipéptido funcionalmente equivalente a ALT derivada de un ser humano o similar, y tiene una alta identidad con un ADN que codifica ALT derivada de un ser humano o similar. El término "alta identidad" se refiere a por lo general 96% o más de homología, preferiblemente 98% o más de homología, más preferiblemente 99% o más de identidad. La identidad de las secuencias de nucleótidos puede ser determinada por el algoritmo BLAST (Karlin y Altschul, Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873-5877, 1993). Sobre la base de este algoritmo, se han desarrollado programas tales como BLASTN y BLASTX (Altschul et al. J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990). Cuando las secuencias de nucleótidos son analizadas por BLASTN basado en BLAST, los parámetros se pueden establecer como puntuación = 100 y longitud de palabra = 12, por ejemplo. Se conocen procedimientos específicos para estos métodos de análisis (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.).

El ADN que codifica ALT se puede insertar en un vector.

Cuando la célula anfitriona a ser usada es E. coli, es preferible que el vector tenga un origen de replicación ("ori") de modo que el vector se amplifique en gran medida en E. coli (por ejemplo, JM109, DH5α, HB101 y XL 1-Blue) y se prepare en gran cantidad, y también genes para la selección de E. coli transformada (por ejemplo, genes de resistencia a fármacos que permiten la discriminación de transformantes con algunos fármacos tales como la ampicilina, tetraciclina, kanamicina o cloranfenicol). Ejemplos de vectores preferibles incluyen, pero no se limitan a, vectores M13, vectores pUC, pBR322, pBluescript y PCR-script. Además de estos vectores, se pueden enumerar pGEM-T, pDIRECT, pT7, etc. cuando se usa el vector con el fin de subclonar un ADNc y cortar el ADNc subclonado. Cuando se utiliza el vector con el fin de producir el polipéptido, un vector de expresión es especialmente útil. Cuando se pretende la expresión en E. coli, el vector de expresión preferiblemente tiene las características antes descritas de modo que el vector se amplifica en E. coli, y también tiene preferiblemente un promotor que permite la expresión eficaz en E. coli tales como JM109, DH5α, HB101 o XL1-Blue, por ejemplo, el promotor lacZ (Ward et al, Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), el promotor araB (Better et al, Science (1988) 240, 10411043) o el promotor T7. Ejemplos específicos de tales vectores incluyen, además de los mencionados anteriormente, pGEX-5X-1 (Pharmacia), QlAexpress system (Qiagen), pEGFP, o pET (para su anfitrión, se prefiere BL21 que expresa ARN T7 polimerasa).

El vector puede comprender secuencias de señal para la secreción del polipéptido. Cuando el polipéptido se va a producir en el periplasma de E. coli, se puede usar la secuencia de señal pelB (Lei, S. P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) como una secuencia de señal para la secreción del polipéptido. La introducción del vector en una célula anfitriona se puede realizar, por ejemplo, por el método de cloruro de calcio o la electroporación.

En los casos en que se utiliza una célula anfitriona que no sea E. coli, vectores útiles para la producción de un polipéptido deseado incluyen, pero no se limitan a, vectores de expresión derivado de los mamíferos [por ejemplo,

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pcDNA3 de Invitrogen; pEGF-BOS (Nucleic Acids Res. 1990, 18(17), página 5322); pEF, pCDM8], vectores de expresión derivados de células de insectos (por ejemplo, sistema de expresión de baculovirus Bac-to-BAC de GIBCO BRL; pBacPAK8), vectores de expresión derivados de plantas (por ejemplo, pMH1, pMH2), vectores de expresión derivados de virus animales (por ejemplo, pHSV, pMV, pAdexLew), vectores de expresión derivados de retrovirus (por ejemplo, pZIpneo), vectores de expresión derivados de levaduras (por ejemplo, Pichia Expression Kit de Invitrogen; PNV11; SP-Q01), y vectores de expresión derivados de Bacillus subtilis (por ejemplo, pPL608, pKTH50).

Cuando se desea la expresión del polipéptido en células animales (tales como células CHO, células COS, células NIH3T3, etc.), el vector tiene preferiblemente un promotor necesario para la expresión del polipéptido en esas células. Ejemplos de tales promotores incluyen, pero no se limitan a, el promotor SV40 (Mulligan et al, Nature (1979) 277, 108), el promotor MMLV-LTR, el promotor Ef1α (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) y el promotor CMV. Más preferiblemente, el vector también tiene genes para la selección de las células transformadas (por ejemplo, genes de resistencia a fármacos que permiten la discriminación con fármacos tales como la neomicina

o G418). Ejemplos de vectores que tienen tales propiedades incluyen, pero no se limitan a, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV y pOP13.

Además, cuando la expresión estable de un gen de interés y la amplificación intracelular del número de copias del gen está indentada, se puede usar el método siguiente. Brevemente, se introduce en células CHO que carecen de una ruta de síntesis de ácido nucleico, un vector que tiene un gen DHFR que complementa la carencia (por ejemplo, pCHOI), seguido de la amplificación con metotrexato (MTX). Por otro lado, cuando se quiere la expresión provisional de un gen de interés, puede usarse un método en el que células COS que llevan un gen que expresa el antígeno SV40T en el cromosoma se transforman con un vector que tiene el origen de replicación de SV40 (por ejemplo, pcD). Como el origen de replicación, también pueden utilizarse un origen de replicación derivado de poliomavirus, adenovirus o virus del papiloma bovino (BPV). Además, el vector de expresión puede contener marcadores seleccionables para amplificar el número de copias del gen en un sistema de célula anfitriona. Ejemplos de tales marcadores seleccionables incluyen, pero no se limitan a, el gen de la aminoglucósido fosfotransferasa (APH), el gen de la timidina quinasa (TK), el gen de la xantina-guanina fosforribosil transferasa de E. coli (Ecogpt) y el gen de la dihidrofolato reductasa (dhfr).

La célula anfitriona en la que el ADN que codifica ALT (que puede estar incorporado en un vector) se transfiere no está particularmente limitada. Por ejemplo, pueden utilizarse E. coli o varias células animales. Si el ADN que codifica el polipéptido deseado se transfiere a una célula anfitriona en la que se transfiere el ADN que codifica ALT, esta célula anfitriona puede expresar ALT fuertemente, lo que conduce a un aumento de la producción del polipéptido deseado. El ADN que codifica un transportador de la taurina (que puede estar incorporado en un vector) puede ser transferido adicionalmente a la célula anfitriona a la que se transfiere el ADN que codifica ALT. Mediante la transferencia de ADN que codifica un polipéptido deseado y ADN que codifica un transportador de la taurina a una célula anfitriona en la que el ADN que codifica ALT se transfiere, el rendimiento del polipéptido deseado puede ser aumentado. Para la producción del polipéptido, existen sistemas de producción in vivo e in vitro. Ejemplos de sistemas de producción in vitro incluyen los sistemas que utilizan eucariotas y los sistemas que utilizan procariotas.

En la presente invención, como el ADN que codifica un transportador de la taurina, puede ser utilizado un ADN que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en las secuencias de Nº de identificación: 62, 64, 66 o 68. Alternativamente, puede usarse un ADN que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos como se muestra en el Nº de identificación de secuencia: 62, 64, 66 o 68 por sustitución, deleción, adición y/o inserción de uno o más residuos de aminoácido y que todavía tiene actividad transportadora de la taurina.

El polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos que se muestra en el Nº de identificación de secuencia: 62, 64, 66 o 68 por sustitución, deleción, adición y/o inserción de uno o más residuos de aminoácido y que todavía tiene actividad transportadora de la taurina es funcionalmente equivalente a un transportador de la taurina de hámster, rata, ratón o ser humano (en lo sucesivo designado a veces como "transportador de la taurina derivado de hámster o similar"). Tal polipéptido abarca, por ejemplo, mutantes del transportador de la taurina derivado de hámster o similar.

Como métodos bien conocidos por los expertos en la técnica para preparar polipéptidos funcionalmente equivalentes a un polipéptido específico, pueden darse los métodos de introducción de mutaciones en los polipéptidos. Por ejemplo, los expertos en la técnica podrían preparar polipéptidos funcionalmente equivalentes al transportador de la taurina del hámster mediante la introducción de mutaciones apropiadamente en los aminoácidos del transportador de la taurina del hámster por mutagénesis dirigida al sitio (Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275; Zoller, MJ y Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 94419456; Kramer W, y Fritz HJ (1987) Methods Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA (1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492; Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766). Las mutaciones en los aminoácidos también pueden ocurrir en la naturaleza.

Los ejemplos específicos de polipéptidos funcionalmente equivalentes al transportador de la taurina derivado de hámster o similar incluyen, pero no se limitan a, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de

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la secuencia de aminoácidos del transportador de la taurina derivado de hámster o similar por deleción de uno o más aminoácidos, preferentemente de 2-30 aminoácidos, más preferiblemente de 2-10 aminoácidos; un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos del transportador de la taurina derivado del hámster o similar mediante la adición de uno o más aminoácidos, preferiblemente de 2-30 aminoácidos, más preferiblemente de 2-10 aminoácidos; y un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos del transportador de la taurina derivado del hámster o similar por sustitución de uno o más aminoácidos, preferiblemente de 2-30 aminoácidos, más preferiblemente de 2-10 aminoácidos, con otros aminoácidos.

Los residuos de aminoácidos a mutar no están particularmente limitados. Preferiblemente, los residuos de aminoácidos son mutados a otros aminoácidos en los que se conserva la naturaleza de la cadena lateral del aminoácido inicial. Ejemplos específicos de la naturaleza de la cadena lateral de aminoácido incluyen aminoácidos hidrófobos (A, I, L, M, F, P, W, Y y V), aminoácidos hidrófilos (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S y T), aminoácidos con una cadena alifática lateral (G, A, V, L, I y P), aminoácidos con una cadena lateral que contiene grupos hidroxilo (S, T e Y), aminoácidos con una cadena lateral que contiene un átomo de azufre (C y M), aminoácidos con una cadena lateral que contiene un ácido carboxílico y una amida (D, N, E y Q), aminoácidos con una cadena lateral que contiene una base (R, K y H) y aminoácidos con una cadena lateral que contiene un grupo aromático (H, F, Y y W) (los paréntesis son los códigos de una letra para los aminoácidos).

Como un ejemplo del polipéptido en el que se añaden uno o más residuos de aminoácidos al transportador de la taurina derivado de hámster o similar, se puede dar un polipéptido de fusión que comprende el transportador de la taurina derivado de hámster o similar. Dicho polipéptido de fusión se compone del transportador de la taurina derivado de hámster o similar, y de otro polipéptido fusionado al mismo. Dicho polipéptido de fusión puede ser preparado mediante la vinculación de un gen que codifica el transportador de la taurina derivado de hámster o similar en el marco de un gen que codifica el otro polipéptido, transfiriendo el ADN resultante a un vector de expresión y expresando el ADN en una célula anfitriona. Pueden utilizarse técnicas conocidas para los expertos en la técnica. No hay limitación en el polipéptido que se fusiona con el transportador de la taurina derivado de hámster o similar.

Ejemplos de polipéptidos que pueden fusionarse con el transportador de la taurina derivado de hámster o similar incluyen, pero no se limitan a, FLAG (Hopp, T. P. et al., Biotechnology (1988) 6, 1204-1210), 6xHis que comprende seis residuos de histidina (His), 10xHis, hemaglutinina de la gripe (HA), fragmento de c-myc humano, fragmento de VSV-GP, fragmento de p18HIV, etiqueta T7, etiqueta HSV, etiqueta E, fragmento de antígeno SV40T, etiqueta lck, fragmento de α-tubulina, etiqueta B, fragmento de la proteína C, glutatión-S-transferasa (GST), hemaglutinina de la gripe (HA), región constante de la inmunoglobulina, β-galactosidasa y la proteína de unión a maltosa (MBP).

Un gen disponible comercialmente que codifica dicho polipéptido es fusionado con el gen que codifica el transportador de la taurina derivado de hámster o similar. El gen fusionado así preparado se expresa para preparar un polipéptido fusionado.

Un método alternativo conocido para los expertos en la técnica para preparar polipéptidos funcionalmente equivalentes a un polipéptido específico es un método que utiliza la técnica de hibridación (Sambrook, J et al., Molecular Cloning segunda edición, 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Los expertos en la técnica podrían aislar rutinariamente un ADN muy homólogo a la secuencia de ADN del transportador de la taurina derivado de hámster o similar basado en esa secuencia de ADN o una parte de la misma, y aislar polipéptidos funcionalmente equivalentes al transportador de la taurina derivado de hámster o similar a partir de ese ADN.

Las condiciones de hibridación para aislar un ADN que codifica un polipéptido funcionalmente equivalente al transportador de la taurina derivado de hámster o similar se pueden seleccionar apropiadamente por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se pueden dar condiciones de hibridación de rigor bajo. Las condiciones de hibridación de rigor bajo son, por ejemplo, 42º C, 2 x SSC y SDS al 0,1%, preferiblemente 50º C, 2 x SSC y SDS al 0,1%. Más preferiblemente, se pueden dar condiciones de hibridación de rigor alto. Por ejemplo, las condiciones de hibridación de rigor alto son 65º C, 2 x SSC y SDS al 0,1%. En estas condiciones, a medida que la temperatura de hibridación se reduce, se obtienen no sólo los ADNs con elevada homología, sino también ADNs con sólo baja homología. A la inversa, se espera que se obtengan sólo los ADNs con alta homología a medida que se eleva la temperatura de hibridación. Sin embargo, no sólo la temperatura sino también varios factores (tales como las concentraciones de sal) afectan al rigor de la hibridación. Los expertos en la técnica podrían apropiadamente seleccionar estos factores para producir un rigor similar.

El polipéptido codificado por un ADN aislado por estas técnicas de hibridación puede tener 70% o más de homología y por lo general tiene una alta homología con el transportador de la taurina derivado de hámster o similar en la secuencia de aminoácidos. El polipéptido también incluye aquellos polipéptidos que son funcionalmente equivalentes al transportador de la taurina derivado de hámster o similar y que tienen una alta homología con la secuencia de aminoácidos del transportador de la taurina derivado de hámster o similar. El término "alta homología" se refiere a por lo general 97% o más de homología, preferiblemente 98% o más de homología, más preferiblemente 99% o más de homología. Para la determinación de la homología de polipéptidos, puede seguirse el algoritmo descrito en Wilbur, W. J. y Lipman, D. J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730.

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El polipéptido puede variar en la secuencia de amino ácidos, peso molecular, punto isoeléctrico, presencia o ausencia de cadenas de azúcar, morfología, etc. dependiendo de la célula o anfitrión que produce el polipéptido o el método de purificación que se describirá más adelante. Sin embargo, siempre que el polipéptido resultante tenga funciones equivalentes a las funciones del transportador de la taurina derivado de hámster o similar, se puede utilizar un ADN que codifica el polipéptido. Por ejemplo, cuando el polipéptido se expresa en un procariota (por ejemplo, Escherichia coli), se añade un residuo de metionina al N-terminal de la secuencia inicial de aminoácidos del polipéptido. Cuando el polipéptido se expresa en un eucariota (por ejemplo, una célula de mamífero), se elimina la secuencia de señal N-terminal. Se pueden utilizar los ADNs que codifican tales polipéptidos.

El polipéptido se puede preparar como un polipéptido recombinante o un polipéptido natural mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Se puede preparar un polipéptido recombinante mediante la incorporación de un ADN que codifica el polipéptido en un vector de expresión apropiado, introduciendo el vector en una célula anfitriona apropiada, recogiendo el transformante resultante, extrayendo un polipéptido bruto, y después purificando el polipéptido por cromatografía (tal como de intercambio iónico, fase inversa o cromatografía de filtración en gel, o cromatografía de afinidad en la que un anticuerpo para el polipéptido se fija en una columna) o una combinación de estas técnicas cromatográficas.

Cuando el polipéptido se expresa en una célula anfitriona (por ejemplo, una célula animal o E. coli) como un polipéptido de fusión con el polipéptido de glutatión-S-transferasa o como un polipéptido recombinante con residuos de histidina añadidos al mismo, el polipéptido expresado puede ser purificado con una columna de glutatión o una columna de níquel.

Después de la purificación de un polipéptido de fusión, las regiones distintas del polipéptido de interés pueden ser cortadas por la trombina o el factor Xa y eliminadas del polipéptido de fusión.

Cuando el polipéptido es un polipéptido natural, el polipéptido puede ser aislado por métodos de purificación conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, un extracto de tejidos o células que expresan el polipéptido puede ser aplicado a una columna de afinidad a la que se une un anticuerpo para el transportador de la taurina derivado de hámster o similar descrito más adelante. El anticuerpo puede ser tanto un anticuerpo policlonal como un anticuerpo monoclonal.

En la presente invención, como el ADN que codifica un transportador de la taurina, puede utilizarse un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos como se muestra en las secuencias de Nº de identificación: 61, 63, 65 o 67. Alternativamente, puede usarse un ADN que se hibrida con un ADN complementario a un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos como se muestra en las secuencias de Nº de identificación: 61, 63, 65 o 67 en condiciones de rigor y, sin embargo codifica un polipéptido que tiene actividad transportadora de la taurina.

El ADN que codifica un transportador de la taurina se puede utilizar en la producción in vivo o in vitro de un polipéptido deseado como se describió anteriormente. Además, el ADN que codifica un transportador de la taurina se puede utilizar en la creación de una célula que expresa fuertemente un transportador de la taurina. El ADN que codifica un transportador de la taurina puede adoptar cualquier forma con tal de que sea capaz de codificar un transportador de la taurina. Es decir, el ADN puede ser, por ejemplo, un ADNc sintetizado a partir de ARNm, un ADN genómico o un ADN sintetizado químicamente. Cabe señalar que, siempre que el ADN sea capaz de codificar un transportador de la taurina, el ADN puede tener cualquier secuencia de nucleótidos basada en la degeneración de los códigos genéticos.

El ADN que codifica un transportador de la taurina se puede preparar por métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, el ADN se puede preparar mediante la preparación de una biblioteca de ADNc de una célula que expresa un transportador de la taurina y la realización de la hibridación utilizando una parte de la secuencia de ADN que codifica un transportador de la taurina (por ejemplo, secuencias de Nº de identificación: 61, 63, 65 o 67) como una sonda. La biblioteca de ADNc se puede preparar, por ejemplo, por el método descrito en Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Alternativamente, puede utilizarse una biblioteca comercial de ADNc. También es posible preparar el ADN que codifica un transportador de la taurina mediante la preparación de ARN a partir de una célula que expresa el transportador de la taurina, la síntesis de moléculas de oligo ADN basada en la secuencia de ADN del transportador de la taurina (por ejemplo, secuencias de Nº de identificación: 61, 63, 65 o 67), y realizando PCR utilizando las moléculas de oligo ADN como cebadores para amplificar de ese modo un ADNc que codifique al transportador de la taurina.

Además, mediante la determinación de la secuencia de nucleótidos del ADNc resultante, es posible determinar la región de traducción que codifica un transportador de la taurina y obtener la secuencia de aminoácidos del transportador de la taurina. Además, mediante la criba de una biblioteca genómica usando el ADNc resultante como una sonda, es posible aislar un ADN genómico.

Específicamente, se pueden utilizar los siguientes procedimientos. En primer lugar, el ARNm se aísla a partir de células, tejidos o similares que expresan un transportador de la taurina. Para el aislamiento del ARNm, se prepara el ARN total por métodos conocidos, por ejemplo, el método de ultracentrifugación de guanidina (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), el método de AGPC (Chomczynski, P. y Sacchi, N., Anal. Biochem. (1987) 162,

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156-159) o similares, y luego el ARNm se purifica a partir del ARN total usando el kit de purificación de ARNm (Pharmacia), etc. Alternativamente, el ARNm puede prepararse directamente usando el kit QuickPrep mRNA Purification kit (Pharmacia).

A partir del ARNm resultante, se sintetiza ADNc usando una transcriptasa inversa. Alternativamente, el ADNc se puede sintetizar usando un kit tal como AMV Reverse Transcriptase First-Strand cDNA Synthesis kit (SEIKAGAKU CORPORATION). También es posible sintetizar y amplificar el ADNc según el método de 5'-RACE (Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 29192932) utilizando 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores.

Además, puede diseñarse una secuencia de nucleótidos de una mayor eficacia de expresión para el ADN que codifica un transportador de la taurina, considerando la frecuencia de uso de codones en el anfitrión que se va a usar para la expresión (Grantham, R. et al., Nucleic Acids Research (1981) 9, páginas 43-74). Además, el ADN que codifica un transportador de la taurina se puede modificar utilizando kits disponibles comercialmente o métodos conocidos. Ejemplos de tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, la digestión con enzimas de restricción, la inserción de oligonucleótidos sintéticos o fragmentos de ADN apropiados, la adición de enlazadores, y la inserción de un codón de iniciación (ATG) y/o un codón de terminación (TAA, TGA o TAG). El ADN que codifica un transportador de la taurina también incluye un ADN que se hibrida con un ADN complementario a un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos como se muestra en las secuencias de Nº de identificación: 61, 63, 65 o 67 en condiciones de rigor y codifica un polipéptido funcionalmente equivalente a un transportador de la taurina.

Las condiciones de rigor se pueden seleccionar apropiadamente por los expertos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, las condiciones de rigor bajo. Las condiciones de rigor bajo se refieren a, por ejemplo, 42º C, 2 x SSC y SDS al 0,1%, preferiblemente 50º C, 2 x SSC y SDS al 0,1%. Más preferiblemente, se pueden seleccionar condiciones de rigor alto. Las condiciones de rigor alto se refieren a, por ejemplo, 65º C, 2 x SSC y SDS al 0,1%. En estas condiciones, a medida que la temperatura de hibridación se eleva, pueden obtenerse ADNs con una homología más elevada. El ADN anteriormente descrito que se hibrida es preferiblemente un ADN derivado de la naturaleza, por ejemplo, ADNc o ADN cromosómico.

Estos ADNs aislados mediante técnicas de hibridación normalmente tienen una identidad de secuencia de nucleótidos alta con el que codifica al transportador de la taurina derivado de hámster, etc. El ADN también incluye un ADN que codifica un polipéptido funcionalmente equivalente al transportador de la taurina derivado de hámster, etc. y tiene una alta identidad con un ADN que codifica al transportador de la taurina derivado de hámster, etc. El término "alta identidad" se refiere a por lo general 96% o más de homología, preferiblemente 98% o más de homología, más preferiblemente 99% o más de identidad. La identidad de secuencias de nucleótidos se puede determinar por el algoritmo BLAST (Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5.873-5.877, 1993). Sobre la base de este algoritmo, se han desarrollado programas tales como BLASTN y BLASTX (Altschul et al. J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990). Cuando las secuencias de nucleótidos se analizan por BLASTN basado en BLAST, los parámetros se pueden establecer como valor esperado = 100 y tamaño de palabra = 12, por ejemplo. Se conocen procedimientos específicos para estos métodos de análisis (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

El ADN que codifica un transportador de la taurina puede insertarse en un vector.

Cuando la célula anfitrión que se va a usar es E. coli, es preferible que el vector tenga un origen de replicación ("ori") de modo que el vector se amplifique en gran medida en E. coli (por ejemplo, JM109, DH5α, HB101 y XL1-Blue) y se prepare en gran cantidad, y también los genes para seleccionar la E. coli transformada (por ejemplo, genes de resistencia a fármacos que permiten la discriminación de transformantes con algunos fármacos tales como la ampicilina, tetraciclina, kanamicina o cloranfenicol). Ejemplos de vectores preferibles incluyen, pero no se limitan a, vectores M13, vectores pUC, pBR322, pBluescript y PCR-script. Además de estos vectores, pueden enumerarse pGEM-T, pDIRECT, pT7, etc. cuando se usa el vector con el fin de subclonar un ADNc y cortar el ADNc subclonado. Cuando se utiliza el vector con el fin de producir el polipéptido como se describe en este documento, un vector de expresión es especialmente útil. Cuando se pretende la expresión en E. coli, el vector de expresión preferiblemente tiene las características antes descritas de modo que el vector se amplifica en E. coli, y también tiene preferiblemente un promotor que permite la expresión eficaz en E. coli tal como JM109, DH5α, HB101 o XL1-Blue, por ejemplo, el promotor lacZ (Ward et al, Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), promotor araB (Better et al, Science (1988) 240, 1041-1043) o el promotor T7. Ejemplos específicos de tales vectores incluyen, además de los mencionados anteriormente, pGEX-5X-1 (Pharmacia), QlAexpress system (Qiagen), pEGFP, o pET (para su anfitrión, se prefiere BL21 que expresa la polimerasa T7 ARN).

El vector puede comprender secuencias de señal para la secreción de polipéptidos. Cuando el polipéptido se va a

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producir en el periplasma de E. coli, se puede usar la secuencia de señal pelB (Lei, S. P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) como una secuencia de señal para la secreción del polipéptido. La introducción del vector en una célula anfitriona se puede realizar, por ejemplo, por el método de cloruro de calcio o por electroporación.

En los casos en que se utiliza una célula anfitriona que no sea E. coli, vectores útiles para la producción de un polipéptido deseado incluyen, pero no se limitan a, vectores de expresión derivados de mamíferos [por ejemplo, pcDNA3 de Invitrogen; pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18 (17), página 5322); pEF, pCDM8], vectores de expresión derivados de células de insectos (por ejemplo, sistema de expresión de baculovirus Bac-to-BAC de GIBCO BRL; pBacPAK8), vectores de expresión derivados de plantas (por ejemplo, pMH1, pMH2), vectores de expresión derivados de virus animales (por ejemplo, pHSV, pMV, pAdexLcw), vectores de expresión derivados de retrovirus (por ejemplo, pZIpneo), vectores de expresión derivados de levaduras (por ejemplo, el kit Pichia Expression Kit de Invitrogen; pNV11; SP-Q01), y vectores de expresión derivados de Bacillus subtilis (por ejemplo, pPL608, pKTH50).

Cuando se pretende la expresión del polipéptido en células animales (tales como células CHO, células COS, células NIH3T3, etc.), el vector tiene preferiblemente un promotor necesario para la expresión del polipéptido en esas células. Ejemplos de tales promotores incluyen, pero no se limitan a, el promotor SV40 (Mulligan et al, Nature (1979) 277, 108), el promotor MMLV-LTR, el promotor EF1α (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322 ) y el promotor CMV. Más preferiblemente, el vector también tiene genes para la selección de células transformadas (por ejemplo, genes de resistencia a fármacos que permiten la discriminación con fármacos tales como la neomicina o G418). Ejemplos de vectores que tienen tales propiedades incluyen, pero no se limitan a, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV y pOP13.

Además, cuando la expresión estable de un gen de interés y la amplificación intracelular del número de copias del gen están indentadas, puede usarse el método siguiente. Brevemente, se introduce en células CHO que carecen de una ruta de síntesis de ácido nucleico, un vector que tiene un gen DHFR que complementa la carencia (por ejemplo, pCHOI), seguido de la amplificación con metotrexato (MTX). Por otro lado, cuando se pretende la expresión provisional de un gen de interés, puede usarse un método en el que células COS que llevan un gen que expresa el antígeno SV40T en el cromosoma se transforman con un vector que tiene el origen de replicación de SV40 (por ejemplo, pcD). Como el origen de replicación, también puede utilizarse un origen de replicación derivado de poliomavirus, adenovirus o virus del papiloma bovino (BPV). Además, el vector de expresión puede contener marcadores seleccionables para amplificar el número de copias del gen en un sistema de célula anfitriona. Ejemplos de tales marcadores seleccionables incluyen, pero no se limitan a, el gen de la aminoglicósido fosfotransferasa (APH), el gen de la timidina quinasa (TK), el gen de la xantina-guanina fosforribosil transferasa (Ecogpt) de E. coli y el gen de la dihidrofolato reductasa (dhfr).

La presente divulgación proporciona una célula que tiene un ADN transferido que codifica ALT y un ADN transferido que codifica un transportador de la taurina, ambos o cualquiera de los cuales puede ser incorporado en un vector.

Cuando se utilizan los eucariotas, pueden utilizarse células animales, células vegetales, células de hongos, etc. como la anfitriona. Ejemplos específicos de células animales incluyen células de mamíferos, tales como células CHO

(J. Exp. Med. (1995) 108, 945), células COS, células 3T3, células de mieloma, células BHK (riñón de hámster bebé), células HeLa y células Vero; células de anfibio, tales como ovocitos de Xenopus laevis (Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340); o células de insectos, tales como células sf9, sf21 y Tn5. Entre las células CHO, las células dhfr-CHO que carecen del gen DHFR (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4420) y CHO K-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275) se utilizan con especial ventaja. Cuando se pretende una gran expresión en una célula animal, se prefieren especialmente las células CHO. La introducción del ADN que puede ser incorporado en un vector en la célula anfitriona puede realizarse por métodos tales como el método del fosfato de calcio, el método de DEAE-dextrano, un método que utiliza un ribosoma catiónico DOTAP (Boehringer-Mannheim), la electroporación, lipofección, etc.

Como células de plantas para la producción de polipéptidos, se conoce una célula derivada de Nicotiana tabacum como un sistema de producción de polipéptidos y esta puede ser sometido a cultivo de callos. Como células de hongos para la producción de polipéptidos, los ejemplos específicos incluyen levaduras que pertenece al género Saccharomyces, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, y hongos filamentosos pertenecientes al género Aspergillus, por ejemplo, Aspergillus niger.

Cuando se utilizan los procariotas, se conocen sistemas de producción que utilizan células bacterianas. Ejemplos específicos de tales células bacterianas incluyen E. coli (tal como JM109, DH5α, HB101) y Bacillus subtilis.

El polipéptido codificado por un gen de interés se puede obtener mediante la transformación de estas células con el gen de interés y el cultivo de las células transformadas in vitro. El cultivo puede llevarse a cabo por métodos conocidos. Por ejemplo, como un caldo de cultivo para células animales, se puede utilizar un medio tal como DMEM, MEM, RPMI1640 o IMDM. Se puede usar de forma conjunta un suplemento de suero tal como suero de ternera fetal (FCS). Alternativamente, puede llevarse a cabo un cultivo libre de suero. El pH durante el cultivo es preferiblemente de aproximadamente 6 a 8. El cultivo se realiza generalmente a aproximadamente 30-40º C durante aproximadamente de 15 a 200 horas. Si es necesario, se lleva a cabo la sustitución del medio, la aireación y la

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agitación.

Por otro lado, los sistemas de producción in vivo incluyen los que utilizan animales o plantas. Un gen de interés se transfiere a estos animales o plantas para producir el polipéptido en los cuerpos de los animales u organismos vegetales. A continuación, se recoge el polipéptido. El término "anfitrión" como se usa en este documento incluye tales animales o plantas.

Cuando se utilizan animales, los sistemas de producción disponibles incluyen los que utilizan mamíferos o insectos. Se pueden utilizar cabras, cerdos, ovejas, ratones y el ganado como mamíferos (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Cuando se usan mamíferos, los animales transgénicos pueden ser utilizados.

En primer lugar, se fusiona un gen de interés a un gen que codifica un polipéptido producido intrínsecamente en la leche (tal como β-caseína de la cabra) para preparar así un gen de fusión. Un fragmento de ADN que contiene este gen de fusión se inyecta en un embrión de cabra, que se implanta a continuación en el útero de una cabra hembra. El polipéptido de interés puede obtenerse a partir de la leche producida por cabras transgénicas nacidas de la cabra que aceptó el embrión o la progenie de las cabras transgénicas. Con el fin de aumentar el rendimiento de la leche que contiene el polipéptido producido por las cabras transgénicas, pueden administrarse adecuadamente hormonas a las cabras transgénicas (Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

Ejemplos de insectos que pueden ser usados incluyen los gusanos de seda. En este caso, el gusano de seda es infectado con un baculovirus que lleva un gen transferido que codifica el polipéptido de interés. El polipéptido de interés puede obtenerse a partir del fluido corporal del gusano de seda (Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592594).

Además, cuando se utilizan plantas, el tabaco puede típicamente ser utilizado. Cuando se usa el tabaco, un gen que codifica el polipéptido de interés se inserta en un vector de expresión de plantas (por ejemplo, pMON 530), que es transferido a continuación dentro de una bacteria tal como Agrobacterium tumefaciens. Una planta de tabaco (por ejemplo, Nicotiana tabacum) es infectada con la bacteria resultante. El polipéptido de interés puede obtenerse a partir de las hojas de esta planta (Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).

El polipéptido así obtenido puede ser aislado desde el interior de la célula anfitriona o desde su exterior (por ejemplo, medio), y purificado hasta un polipéptido sustancialmente puro y homogéneo. El aislamiento y la purificación de los polipéptidos se pueden realizar utilizando métodos de aislamiento y purificación convencionales para polipéptidos, y no están limitados de ninguna manera. Por ejemplo, los polipéptidos pueden ser aislados y purificados mediante la selección apropiada y la combinación de varias herramientas y técnicas, tales como columnas de cromatografía, filtros, ultrafiltración, precipitación por sales, precipitación con disolventes, extracción con disolventes, destilación, inmunoprecipitación, electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, enfoque isoeléctrico, diálisis, recristalización, etc.

Ejemplos de cromatografía incluyen la cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, filtración en gel, cromatografía de fase inversa, cromatografía de adsorción, etc. (Strategies for Protein Purification and Characterizations: A Laboratory Course Manual. Editores Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Estas técnicas cromatográficas pueden llevarse a cabo mediante cromatografía de fase líquida, por ejemplo, HPLC, FPLC, etc.

Antes o después de la purificación, también es posible dar modificaciones opcionales al polipéptido o eliminar un péptido parcial del mismo haciendo reaccionar el polipéptido con una enzima de modificación de polipéptidos apropiada. Ejemplos de tal enzima incluyen, pero no se limitan a, la tripsina, quimotripsina, lisil endopeptidasa, proteína quinasa y glucosidasa.

El concepto de "células en las que el ADN se ha transferido" abarca no sólo las células en las que se ha incorporado ADN exógeno por la tecnología de recombinación genética; sino también células en las que el ADN endógeno se ha activado por la tecnología de activación genética (véase, por ejemplo, el documento de patente internacional WO94/12650), de modo que la expresión de una proteína correspondiente al ADN endógeno o la transcripción del ADN se ha iniciado o aumentado.

Ejemplos

De aquí en adelante, la presente invención se describirá en más detalle con referencia a los siguientes Ejemplos. Cabe señalar que estos ejemplos se proporcionan sólo para ilustrar la presente invención y no para limitar el alcance de la presente invención.

[Ejemplo 1] Clonación del gen alanina aminotransferasa de células hepáticas humanas

Utilizando un hígado humano comercial QUICK-Clone cADN (Clontech Laboratories, Inc.) como molde, se obtuvo un gen de alanina aminotransferasa (ALT1) derivado de un hígado humano mediante un método de PCR. El gen clonado de este modo se secuenció y se confirmó para codificar ALT 1 sobre la base de su homología con ALT1 humana publicada. El gen ALT 1 así obtenido tenía mutaciones en cinco sitios en la secuencia de 1488 bases (c157a, a215g, c765t, t857c, t995a) y codificó para 496 aminoácidos incluyendo cuatro aminoácidos diferentes

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