ES2593467T3 - Nuevo bacteriófago y composición antibacteriana que comprende el mismo - Google Patents

Abstract

Un bacteriófago aislado, que tiene una actividad bactericida específica frente a una o más bacterias de Salmonella seleccionadas del grupo que consiste en Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum y Salmonella pullorum, que está identificado con el número de acceso KCCM11148P.

Description

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corporal, la mortalidad, los síntomas generales y anomalías en órganos (véase la FIG. 9, las tablas 4 y 5).

Asimismo, cuando el bacteriófago de la presente divulgación se utiliza como aditivo en la alimentación de pollos de engorde, no muestra ningún efecto negativo sobre el crecimiento o el desarrollo de los órganos y músculos de pollos de engorde (véanse las tablas 6 y 7).

Los resultados de las pruebas de eficacia, el efecto de desinfección y la eficiencia en la limpieza mostraron que, cuando se usa en granjas de ganado, el bacteriófago de la presente divulgación puede controlar con eficacia la Salmonella (SE) mediante la inhibición de su propagación y eliminación fecal (véanse las Tablas 8 y 9) y tiene una excelente y constante actividad bactericida contra Salmonella en diversas condiciones, en comparación con los productos de limpieza convencionales como control positivo.

Estos datos implican que el bacteriófago de la presente invención tal como se define en la reivindicación 1 se puede aplicar a diversos productos para el control de bacterias de Salmonella.

El bacteriófago de la presente divulgación que tiene una actividad bactericida específica contra SE, ST, SG y SP y las características anteriores se ha designado ΦCJ8 y se ha depositado en el Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos (361–221, Honje 1–dong, Seodaemun–gu, Seúl, Corea del Sur) el 14 de diciembre de 2010, con el número de acceso KCCM11148P.

De acuerdo con otro aspecto, la presente invención atañe a una composición para su uso en la prevención o tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por una o más bacterias de Salmonella seleccionadas entre el grupo que consiste en Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum y Salmonella pullorum, que comprenden el bacteriófago tal como se reivindica como principio activo.

Al tener actividad bactericida específica frente a Salmonella enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Gallinarum, y Salmonella Pullorum, el bacteriófago de la presente invención se puede usar con el fin de prevenir o tratar las enfermedades causadas por ellas. La composición puede comprender además un antibiótico.

Preferentemente, entre los ejemplos de las enfermedades infecciosas se incluyen salmonelosis e intoxicación alimentaria por Salmonella con Salmonella enteritidis o Salmonella Typhimurium, tifosis aviar con Salmonella Gallinarum y pullorosis con Salmonella Pullorum incluyen, pero no se limitan a los mismos.

Como se usa en el presente documento, el término "samonelosis" se refiere a los síntomas que aparecen después de la infección con Salmonella, tales como fiebre, dolor de cabeza, diarrea y vómitos. Es decir, la salmonelosis es una infección con bacterias del género Salmonella, que se acompaña de dos síntomas representativos: septicemia, tal como fiebre tifoidea; y gastroenteritis aguda, tal como intoxicación alimentaria, enteritis, y bacteriemia aguda.

Como se usa en el presente documento, el término "prevención" pretende incluir todas las acciones para contener o retrasar la evolución de la enfermedad a través de la administración de la composición. El término "tratamiento", en este contexto, incluye todas las acciones para mejorar o cambiar de forma beneficiosa el estado del paciente a través de la administración de la composición.

La composición de la presente invención puede comprender el bacteriófago de la presente invención tal como se reivindica como principio activo en una cantidad de 5 × 102 a 5 × 1012 ufp/ml, y, preferiblemente, en una cantidad de1 × 106 a 1 × 1010 ufp/ml.

La composición de la presente invención puede comprender adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable, y se puede formular junto con el vehículo en alimentos, medicamentos y aditivos alimentarios.

Como se usa en el presente documento, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo o diluyente que ni causa irritación significativa a un organismo ni degrada la actividad biológica ni las propiedades del principio activo administrado. Para uso en la formulación de la composición en una preparación líquida, un vehículo farmacéuticamente aceptable debe ser adecuado para estilización y biocompatibilidad. Los ejemplos incluyen solución salina, agua estéril, solución de Ringer, solución salina fisiológica tamponada, solución de infusión de albúmina, solución de dextrosa, solución de maltodextrina, glicerol, y etanol. Se pueden usar solos o en cualquier combinación. Si fuera necesario, se puede añadir a la composición otro aditivo convencional, tal como antioxidantes, tampones, agentes bacteriostáticos, etc. Cuando se combinan adicionalmente con diluyentes, dispersantes, tensioactivos, aglutinantes y/o lubricantes, la composición de la presente invención se puede formular en inyecciones tales como soluciones acuosas, suspensiones y emulsiones, o píldoras, cápsulas, gránulos o comprimidos.

Las composiciones profilácticas o terapéuticas de la presente divulgación se pueden aplicar por vía local a las zonas afectadas mediante recubrimiento o pulverización. Como alternativa, la composición de la presente invención se puede administrar a través de vías orales o parenterales. Las vías parenterales están disponibles para administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea o tópica.

Dependiendo de diversos factores que incluyen formulaciones, el modo de administración, la edad, el peso, el sexo,

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El aditivo alimentario que comprende el bacteriófago de acuerdo con la presente invención puede incluir aditivos para prevenir el deterioro de la calidad, tales como aglutinantes, emulgentes y conservantes, y aditivos para aumentar la utilidad, tales como aminoácidos, vitaminas, enzimas, probióticos, aromatizantes, nitrógeno no proteico, silicatos, agentes de tamponamiento, agentes colorantes, extractos, y oligosacáridos, pero no se limita a los mismos.

Cuando se proporciona con agua de bebida que contiene el bacteriófago de la presente invención, la población de bacterias de Salmonella en el intestino del ganado se puede reducir continuamente en el mismo ganado. Como resultado, se puede producir ganado sin Salmonella.

De acuerdo con otro aspecto adicional, la presente invención se refiere a un agente de limpieza o un desinfectante, que comprende el bacteriófago como principio activo.

El agente desinfectante que comprende el bacteriófago de la presente invención como principio activo es muy útil para la higiene de alimentos frente a, por ejemplo, intoxicación alimentaria. Con detalle, el agente desinfectante se puede usar, no solo como un agente o un aditivo alimentario para prevenir la contaminación con Salmonella, sino también en la producción de ganado sin Salmonella. Para eliminar la Salmonella, el agente desinfectante también se puede pulverizar sobre aguas residuales domésticas y se puede aplicar a granjas avícolas, mataderos, lugares en los que murió el ganado, espacios de cocina e instalaciones de cocina.

Además, el agente de limpieza que comprende el bacteriófago de la presente invención como principio activo se puede usar en una zona corporal de animales vivos, tales como la piel, las plumas y similares, que ya está contaminada o potencialmente contaminada con bacterias de Salmonella.

La composición de la presente invención se puede administrar en forma de una formulación farmacéutica en animales o se puede ingerir en forma de una mezcla con alimentos o agua potable para animales y, preferentemente, en forma de una mezcla con pienso para animales. En la presente invención, los animales incluyen ganado, cerdos, pollos, aves de corral y seres humanos, pero no se limitan a los mismos.

Siempre y cuando alcance los tejidos diana, se puede tomar cualquier vía, ya sea oral o parenteral, para la administración de la composición de la presente invención. Con detalle, la composición de la presente invención se puede administrar a través de las vías oral, rectal, tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, transdérmica, intranasal, e inhalación.

Modo de la invención

Se puede obtener una mejor comprensión de la presente invención mediante los ejemplos siguientes que se exponen para ilustrar pero que no deben interpretarse como limitantes de la presente invención.

Ejemplo 1: Aislamiento de bacteriófago de Salmonella

1–1. Identificación sistemática de bacteriófago y aislamiento de bacteriófago individual

De un matadero de pollos, localizado en Muan, Jeollanam–do, Corea del Sur, y de una planta de eliminación de aguas residuales cercana, se transfirieron 50 ml de cada muestra a un tubo de centrífuga, y se centrifugaron a 4000 rpm durante 10 minutos, seguido de filtración del sobrenadante a través de un filtro de 0,45 μm. Se mezclaron 18 ml del filtrado de muestra con 150 μl de un medio de cultivo en agitación de Salmonella Enteritidis (denominada "SE" en lo sucesivo en el presente documento) (DO600 = 2) y 2 ml de de medio de Luria-Bertani (LB), (10 g de triptona; 5 g de extracto de levadura; 10 g de NaCl; en un volumen final de 1 l). La mezcla se cultivó a 37 ºC durante 18 horas y a continuación se centrifugó a 4000 rpm durante 10 minutos, tras lo cual el sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,45 μm. Por separado, una mezcla de 3 ml de agar al 0,7 % (p/v) y 150 μl de del medio de cultivo en agitación de SE (DO600 = 2) se vertió a través de una placa de LB y se permitió que solidificara. Sobre esta placa se extendieron 10 μl del filtrado de cultivo, seguido de incubación durante 18 horas a 37 ºC (como "agar de cobertura" se usó agar al 0,7 % y la valoración del lisado del fago se realizó en la cobertura de agar, denominada técnica de superposición de agar blando).

El medio de cultivo de la muestra que contenía el lisado del fago se diluyó adecuadamente, se mezcló con 150 μl de un medio de cultivo en agitación de SEE (DO600 = 2) y después se sometió a ensayo de superposición de agar blando para producir placas individuales. Dado que una placa individual consistía en el mismo bacteriófago, se tomó una placa y se disolvió en 400 μl de una solución de SM (5,8 g de NaCl; 2 g de MgSO4,7H2O; 50 ml de Tris-Cl 1 M (pH 7,5); H2O, en un volumen final de 1 l), y se dejó durante 4 horas a temperatura ambiente para aislar un solo bacteriófago. Para amplificar el bacteriófago aislado, se tomaron 100 μl del sobrenadante de la solución de bacteriófago individual, mezclados con 5 ml de agar al 0,7 % y 100 μl de un medio de cultivo en agitación de SE, y se sometió a un ensayo de superposición de agar blando en una placa de LB (90 mm de diámetro). Se vertieron 5 ml de una solución de SM en una placa en la que se había completado la lisis, tras lo cual la placa se agitó cuidadosamente durante 4 horas a temperatura ambiente para eluir los bacteriófagos del agar de cobertura. La solución de SM que contenía los bacteriófagos eluidos se recuperó y se añadió cloroformo a la misma en una cantidad que corresponde a un 1 % del volumen final, y se mezcló bien durante 10 minutos. Después de centrifugación a 4000 rpm durante 10 minutos, el sobrenadante resultante se filtró a través de un filtro de 0,45 μm, y

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Ejemplo 5: Tamaño del ADN genómico total de ΦCJ8

El ADN genómico de ΦCJ8 se aisló usando ultracentrifugación. En este sentido, a una solución de cultivo de ΦCJ8 purificado se añadieron EDTA (ácido etilendiaminotetraacético (pH 8,0)), proteinasa K y SDS (dodecil sulfato sódico) a una concentración final de 20 mM, 50 ug/ml, y 0,5 % (p/v), respectivamente, seguido de incubación a 50 ºC durante 1 hora. Se añadió un volumen igual de fenol (pH 8,0) y se mezcló bien. Después de centrifugación a 12.000 rpm y a temperatura ambiente durante 10 minutos, el sobrenadante se mezcló bien con un volumen igual de PCI (fenol:cloroformo=1:1). Otra centrifugación a 12.000 rpm y a temperatura ambiente durante 10 minutos produjo un sobrenadante que se mezcló a continuación con un volumen a 1/10 de acetato sódico 3 M y dos volúmenes de etanol frío al 95 %, y se dejó a -20 ºC durante 1 hora. Después de ello, la mezcla resultante se sometió a centrifugación a 0 ºC, 12.000 rpm durante 10 minutos, para retirar completamente un sobrenadante. El ADN resultante se disolvió en 50 μl de TE (Tris-EDTA (pH 8,0). El ADN extraído se diluyó 10 veces y la absorbancia se midió a DO260 para determinar su concentración. Se cargó 1 μg del ADN genómico total sobre gel de agarosa PFGE al 1 % (electroforesis en gel de campo pulsado) y se sometió a electroforesis a temperatura ambiente durante 20 horas con la ayuda de un programa de sistema de PFGE de BIO RAD (intervalo de tamaño de 25-100 kpb; rampa del tiempo de desplazamiento 0,4-2,0 segundos, forma lineal; tensión directa 180 V; tensión inversa 120 V). Como se muestra en la FIG. 4, el ADN genómico de ΦCJ8 tenía una longitud en el intervalo de aproximadamente 44,1 a 49 kpb.

Ejemplo 6: Análisis genético de ΦCJ8

El análisis genético del ΦCJ8 purificado comenzó con doble digestión de 5 μg del ADN genómico de ΦCJ8 con tres combinaciones de enzimas de restricción: SalI y XhoI, EcoRV y NruI, HinCII y PvuII. Por otra parte, un vector pBluescript II SK(+) se digirió con EcoRV y se trató con CIP (fosfatasa alcalina intestinal de ternera). El ADN genómico digerido se mezcló en una proporción de 3:1 con el vector y se ligó a 16 °C durante 2 horas. El vector recombinante resultante se transformó en E. coli DH5α, que después se sembró en una placa de LB que contenía ampicilina y X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galactopiranósido) para la selección de colonias de color azul/blanco. Las colonias seleccionadas se cultivaron durante 16 horas en medio LB que contenía ampicilina con agitación. A continuación, los plásmidos se extrajeron usando un kit de purificación de plásmidos (Promega).

La clonación de los plásmidos se confirmó por PCR usando un conjunto de cebadores de M13 directos e inversos (SEQ ID NO: 16 y 17) y solamente seleccionaron fragmentos de inserto con un tamaño de 1 kb o superior. Los plásmidos seleccionados de este modo se sometieron a análisis de secuencia usando los conjuntos de cebador. Las secuencias de bases obtenidas de este modo se proporcionaron en las SEQ ID NO: 1 a 5, teniendo cada una un tamaño de aproximadamente 1 a 4 kb, y se analizó la similitud de secuencias con la ayuda de los programas blastx y blastn del NCBI. Los resultados se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2 5

Similitud de Secuencias entre ΦCJ8 y otros bacteriófagos

N.º

Organismo Proteína Blastx

Consulta

Sujeto Identidad Valor e

1

Fago SETP3 de Salmonella proteína hipotética 1 – 672 6 – 516 183/224 (81 %) 1e – 97

Fago KS7 de Salmonella

proteína hipotética 1 – 675 6 – 230 181/225 (80 %) 3e – 96

Fago KS7 de Salmonella

Proteína estructural 651 – 211 345 – 491 116/147 (78 %) 2e – 57

Fago SETP3 de Salmonella

Proteína estructural putativa 651 – 235 345 – 481 92/139 (66 %) 1e – 47

Fago SETP3 de Salmonella

amidasa 1 – 171 159 – 215 55/57 (96 %) 6e – 24

Fago E1 de Salmonella

proteína hipotética 1 – 171 160 – 216 53/57 (92 %) 1e – 22

Fago SETP3 de Salmonella

ADN polimerasa 524 – 3 258 – 431 141/174 (81 %) 3e – 73

2

Fago KS7 de Salmonella proteína hipotética 524 – 3 258 – 431 141/174 (81 %) 3e – 73

Fago SSL–2009a de Enterobacterias

ADN polimerasa I 524 – 48 259 – 438 104/195 (53 %) 2e – 48

Fago SETP3 de Salmonella

proteína hipotética 3 – 440 36 – 181 144/146 (98 %) 9e – 69

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(continuación)

Similitud de Secuencias entre ΦCJ8 y otros bacteriófagos

N.º

Organismo Proteína Blastx

3

Fago KS7 de Salmonella proteína hipotética 3 – 440 23 – 168 144/146 (98 %) 1e – 68

Fago KS7 de Salmonella

proteína hipotética 555 – 1 180 – 364 175/185 (94 %) 4e – 95

Fago SETP3 de Salmonella

proteína hipotética 558 – 1 179 – 364 172/186 (92 %) 2e – 94

4

Fago KS7 de Salmonella Proteína estructural 3 – 917 162 – 466 300/305 (98 %) 3e – 174

Fago SETP3 de Salmonella

Proteína estructural putativa 3 – 194 162 – 465 285/304 (93 %) 2e – 174

Fago KS7 de Salmonella

Proteína estructural 915 – 253 272 – 491 189/221 (85 %) 3e – 94

Fago SETP3 de Salmonella

Proteína estructural putativa 915 – 277 272 – 481 164/213 (76 %) 4e – 83

Fago SETP3 de Salmonella

Helicasa putativa 2 – 811 384 – 653 258/270 (95 %) 1e – 131

5

Fago KS7 de Salmonella proteína hipotética 2 – 811 37 – 306 259/270 (95 %) 2e – 130

Fago SETP3 de Salmonella

Helicasa putativa 904 – 197 588 – 821 216/236 (91 %) 6e – 109

Fago KS7 de Salmonella

proteína hipotética 904 – 197 241 – 474 213/236 (90 %) 8e – 108

Ejemplo 7: Análisis por PCR usando cebadores específicos de ΦCJ8

Para identificar a ΦCJ8, se diseñaron cebadores específicos de ΦCJ8 basándose en las SEQ ID NO: 1 a 5. La PCR se realizó usando cada conjunto de cebadores de las SEQ ID NO: 6 y 7, SEQ ID NO: 8 y 9, SEQ ID NO: 10 y 11, SEQ ID NO: 12 y 13, y SEQ ID NO: 14 y 15. Se añadieron 0,1 µg del ADN genómico de bacteriófago y 0,5 pmol de cada cebador a una mezcla previa (Bioneer) y el volumen final se ajustó a 20 μl. La PCR se realizó con 30 ciclos de desnaturalización; 94 ºC durante 1 minuto, hibridación; 60 ºC durante 1 minuto y polimerización; 72 ºC durante 1 minuto después de la desnaturalización inicial a 94 ºC durante 10 minutos, seguido de la amplificación final a 72 ºC durante 10 minutos. Los productos de PCR obtenidos de este modo tenían una longitud de aproximadamente 3,5, 2,1, 1,6, 1,2 y 1,4 kpb, respectivamente. Los resultados se muestran en la FIG. 5.

Ejemplo 8: Estabilidad al pH de ΦCJ8

Para determinar si ΦCJ8 sobrevive al ambiente de pH bajo el estómago del ganado, su estabilidad se evaluó en un intervalo de pH amplio (pH 2,1, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,5, 6,4, 6,9, 7,4, 8,2, 9,0, 9,8, 11,0). Se prepararon varias soluciones de pH (tampón de acetato sódico (pH 2,1, 4,0, 5,5 y 6,4), tampón de citrato sódico (pH 2,5, 3,0 y 3,5), tampón de fosfato sódico (pH 6,9 y 7,4) y Tris-HCl (pH 8,2, 9,0, 9,8 y 11,0)) para que tuvieran una concentración de 2 M. Se mezclaron 180 μl de cada solución de pH con 20 μl de una solución de bacteriófago (1,1 × 1011 ufp/ml) seguido de incubación a temperatura ambiente durante 2 horas. La solución de reacción se diluyó en serie y se cultivaron 10 μl de cada dilución a 37 ºC durante 18 horas de acuerdo con un procedimiento de superposición de agar blando para determinar las titulaciones de los lisados de fago. Los cambios de la titulación de acuerdo con la diferencia de pH se compararon para examinar la estabilidad relativa. Los resultados mostraron que el bacteriófago no perdía su actividad y permanecía estable hasta un pH de 3,0. Sin embargo, perdía su actividad a pH 2,5 o inferior. Los resultados se muestran en la FIG. 6.

Ejemplo 9: Estabilidad al calor de ΦCJ8

Para analizar la estabilidad de un bacteriófago al calor generado durante el procedimiento de formulación cuando se usó como aditivo para piensos, se realizó el siguiente experimento. Se incubaron 200 μl de una solución de ΦCJ8 con una titulación 1,0 × 1011 ufp/ml a 37, 45, 53, 60, 70 y 80 °C, durante 10 30, 60 y 120 minutos, respectivamente. La solución se diluyó en serie y se cultivaron 10 μl de cada dilución a 37 ºC durante 18 horas de acuerdo con un procedimiento de superposición de agar blando para determinar las titulaciones de los lisados de fago. Los cambios de la titulación de acuerdo con la temperatura y el tiempo de exposición se compararon para examinar la estabilidad relativa. Los resultados mostraron que el bacteriófago conservaba su actividad tras una incubación a 60 ºC hasta 2 horas. Sin embargo, el bacteriófago perdió rápidamente su actividad tras la incubación a 80 ºC durante 10 minutos o más. Los resultados se muestran en la FIG. 7.

Ejemplo 10: Tolerancia a la desecación de ΦCJ8

Para analizar la estabilidad del bacteriófago en condiciones de desecación durante el procedimiento de formulación cuando se usó como aditivo para piensos, se realizó el siguiente experimento. Basándose en los resultados obtenidos a partir del ensayo de estabilidad al calor, el experimento se realizó en condiciones de desecación a 5 temperatura ambiente (a 60 °C durante 120 minutos). Se secaron 200 µl de una solución de ΦCJ8 (6,0 × 1011 ufp/ml) usando un Speed vacuum (Speed–Vacuum Concentrator 5301, Eppendorf). El sedimento obtenido se resuspendió completamente en 200 µl de la solución SM a 4 ºC durante un día. La solución se diluyó en serie y se cultivaron 10 μl de cada muestra diluida se cultivó a 37 ºC durante 18 horas de acuerdo con un procedimiento de superposición de agar blando para determinar las titulaciones de los lisados de fago. Los cambios de la titulación antes y después de

10 la desecación se compararon para examinar la estabilidad relativa. Los resultados mostraron que su actividad se reducía en aproximadamente 50 veces. Los resultados se muestran en la FIG. 8.

Ejemplo 11: Examen del espectro de infección de ΦCJ8 en cepas de salmonella de tipo silvestre

Además de SE (SCSG SE2282), ST (ATCC ST14028), SG (SGSC SG2293) y SP (SGSC SP2295), la actividad lítica de ΦCJ8 se analizó para la SE de tipo silvestre coreana (49 cepas), ST (25 cepas), SG (53 cepas), SP (19 cepas),

15 SC (7 cepas) y SD (3 cepas), obtenidas del laboratorio de enfermedades aviares, del Colegio de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional de Seúl, y Servicio Nacional de Investigación Veterinaria y de Cuarentena y los Centros de Corea para el control y Prevención de Enfermedades.

Se mezclaron 150 µl de cada cepa en medio de cultivo con agitación (DO600 = 2) y se cultivaron 10 µl de solución ΦCJ8 (1010 ufp/ml) a 37 ºC durante 18 horas de acuerdo con un procedimiento de superposición de agar blando, y 20 se examinó la formación de placas. Se encontró que el bacteriófago ΦCJ8 mostraba actividad lítica de 95 % contra SE, ST, SG y SP. Los resultados se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3

Actividad lítica de ΦCJ8 contra las cepas de tipo silvestre coreanas SE, ST, SG y SP

Serotipo

Nombre de la cepa ΦCJ8 Serotipo Nombre de la cepa ΦCJ8

Formación de placas

Formación de placas

SG

SNU SG1 O SGSC SE2282 O

SNU SG2

O SGSC SE2377 O

SNU SG3

O PT4 S1400194 O

SNU SG4

O PT4 LA52 O

SNU SG5

O NVRQS SE004 O

SNU SG6

O NVRQS SE005 O

SNU SG7

O KCDC SE008 O

SNU SG8

O KCDC SE009 O

SNU SG9

O KCDC SE010 O

SNU SG10

O KCDC SE011 O

SNU SG11

X KCDC SE012 O

SNU SG12

O SE KCDC SE013 O

SNU SG13

O KCDC SE014 O

SNU SG14

O KCDC SE015 O

SNU SG15

O KCDC SE016 O

SNU SG16

O KCDC SE017 O

SNU SG17

O KCDC SE018 O

SNU SG18

O KCDC SE019 O

SNU SG19

O KCDC SE020 O

SNU SG20

O KCDC SE021 O

SNU SG21

O KCDC SE022 O

SNU SG22

O KCDC SE023 O

SNU SG23

O KCDC SE024 O

(continuación)

Actividad lítica de ΦCJ8 contra las cepas de tipo silvestre coreanas SE, ST, SG y SP

Serotipo

Nombre de la cepa ΦCJ8 Serotipo Nombre de la cepa ΦCJ8

Formación de placas

Formación de placas

SNU SG24

O KCDC SE025 O

SNU SG25

O KCDC SE026 O

SNU SG26

O KCDC SE027 O

SNU SG27

O KCDC SE028 O

SNU SG28

O KCDC SE029 O

SNU SG30

O KCDC SE030 O

SNU SG31

O KCDC SE031 O

SNU SG32

O KCDC SE032 O

SNU SG33

O KCDC SE033 O

SNU SG34

O KCDC SE034 O

SNU SG36

O KCDC SE035 O

SNU SG37

O KCDC SE036 O

SNU SG38

O KCDC SE037 O

SNU SG39

O KCDC SE038 O

SNU SG40

O KCDC SE039 O

SNU SG41

O KCDC SE040 O

SNU SG42

O KCDC SE041 O

SNU SG43

X KCDC SE042 O

SNU SG44

O KCDC SE043 O

SNU SG45

X KCDC SE044 O

SNU SG46

O KCDC SE045 O

SNU SG47

X KCDC SE046 O

SNU SG48

O KCDC SE047 O

SNU SG49

O KCDC SE048 O

SNU SG50

O KCDC SE049 O

SGSC SG9184

O KCDC SE050 O

SGSC SG2292

O ST SNU ST1 O

SGSC SG2293

O SNU ST2 O

SGSC SG2744

O SNU ST3 O

SGSC SG2296

O SNU ST4 O

SP

SNU SP1 O SNU ST7 O

SNU SP4

O SNU ST8 O

SNU SP5

O SNU ST11 O

SNU SP8

O SNU ST12 O

SNU SP11

O SNU ST13 O

SGSC SP2294

O SNU ST14 O

SGSC SP2295

O SNU ST17 O

SGSC SP2737

X SNU ST18 X

(continuación)

Actividad lítica de ΦCJ8 contra las cepas de tipo silvestre coreanas SE, ST, SG y SP

Serotipo

Nombre de la cepa ΦCJ8 Serotipo Nombre de la cepa ΦCJ8

Formación de placas

Formación de placas

SGSC SP2739

O SNU ST19 X

SGSC SP2742

O SNU ST20 O

SGSC SP2743

O SNU ST25 O

SGSC SP2745

O SNU ST26 O

SGSC SP2751

O SNU ST37 O

SGSC SP4663

O SNU ST38 O

SGSC SP4664

O SNU ST41 O

SGSC SP4665

O SNU ST42 O

SGSC SP4666

O ATCC UK1 O

SGSC SP4667

O ATCC 14028S O

SGSC SA1684

O SGSC STM1412 O

SC

ATCC SC10708 X SGSC STM260 O

ATCC SC2929

X SGSC STM SA2197 O

ATCC SC2930

O ATCC SD2466 O

ATCC SC2931

X SD ATCC SD2467 X

ATCC SC2932

O ATCC SD2468 O

ATCC SC2933

O SA ATCC 12398 X

ATCC SC2425

O SB ATCC 12397 X

* SNU: Laboratorio de enfermedades aviares, del Colegio de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional de Seúl * SGSC: Centro de reserva genética de Salmonella * ATCC: Centro de recursos biológicos globales * NVRQS: Servicio Nacional de Investigación Veterinaria y Cuarentena * KCDC: Centros coreanos para el control y prevención de enfermedades

Ejemplo 12: Ensayo de Toxicidad de ΦCJ8

Para uso seguro en la prevención de la salmonelosis, la intoxicación alimentaria por Salmonella, la tifosis aviar y la pullorosis, el bacteriófago se sometió a un análisis de la toxicidad in vivo. El ensayo de toxicidad se realizó con dosis 5 orales individuales. En este ensayo, se administró a las ratas por vía oral una sola dosis de ΦCJ8 y se controló la toxicidad aguda para determinar las concentraciones letales aproximadas de ΦCJ8. Las ratas macho y hembra (10 ratas de cada uno) sin patógeno específico (SPE) de 7 semanas de edad se mantuvieron en ayunas antes de la administración de ΦCJ8. El día de la administración, se administró a los machos y las hembras (5 ratas de cada uno) 1 × 1013 ufp de ΦCJ8 por vía oral y una solución mixta de Tris-HCl 20 mM y MgCl2 2mM a 5 ratas como grupo 10 control tras 4 horas, para comenzar la realimentación. El día de la administración, las ratas se examinaron 30 minutos después de la administración, y cada 4 horas. Durante 14 días, los signos clínicos se examinaron y se registraron una vez al día. Como resultado, no hubo ninguna muerte animal y no se observaron signos clínicos debido a la toxicidad de ΦCJ8. Los resultados se muestran en las Tablas 4 a 6. Los cambios en el peso corporal se midieron y se registraron antes de la administración, y 1, 3, 7, 10 y 14 días después de la administración. Como se

15 muestra en la figura. 9, no se produjeron cambios significativos en el peso corporal, en comparación con el grupo control. Los resultados indican que ΦCJ8 no induce ninguna reacción tóxica que cause pérdida de apetito o cambios en el peso corporal. Además, no se encontraron anomalías notables en ningún órgano, tal como se analizó en la autopsia y a simple vista. Por lo tanto, el nuevo bacteriófago ΦCJ8 no es tóxico.

Tabla 4

Incidencia de muerte después de la administración oral de ΦCJ8

Sexo

Realizado (ufp) Días después del tratamiento Nº de muertos/n.ºanimales tratados

1

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 0/5

Varones

Control 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5

1013

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5

Mujeres

Control 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5

1013

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5

Tabla 5

Signos clínicos después de la administración oral de ΦCJ8

Sexo

Realizado (ufp) Mortalidad final Signos clínicos

Machos

Hembras Machos Hembras

Machos

Control 0/5 0/5 0/5 0/5

1013

0/5 0/5 0/5 0/5

Hembras

Control 0/5 0/5 0/5 0/5

1013

0/5 0/5 0/5 0/5

Tabla 6

Anomalía orgánica después de la administración oral de ΦCJ8

Sexo

Realizado (ufp) Hallazgo macroscópico FrecuenciaA

Machos

Control Ausencia de hallazgos macroscópicos 5/5

1013

Ausencia de hallazgos macroscópicos 5/5

Hembras

Control Ausencia de hallazgos macroscópicos 5/5

1013

Ausencia de hallazgos macroscópicos 5/5

A Número de animales con el signo/número de animales examinados.

Ejemplo 13: Eficiencia de ΦCJ8 como aditivo alimentario

Con el fin de examinar la seguridad y el efecto preventivo de ΦCJ8 en Salmonella para su uso como aditivo alimentario, se midieron el crecimiento y los pesos relativos de los órganos y músculos. En este experimento, se 10 utilizó un total de 320 pollos de engorde machos, pollos Ross de 2 días de edad (peso corporal promedio de 41,4 g) durante 5 semanas del ensayo de alimentación. Se asignaron a 4 tratamientos (control: dieta basal, BP-1: dieta basal + ΦCJ8 0,05 %, BP–2: dieta basal + ΦCJ8 0,10 %, BP-3: dieta basal + ΦCJ8 0,20 %) con 8 repeticiones y 10 pollos por corral en diseño de bloques completos aleatorios (RCB). En este momento, ΦCJ8 tenía un título de 109 ufp/g. El siguiente experimento se llevó a cabo con una dieta basada en maíz-soja y se usaron programas de

15 alimentación de dos fases. En la fase I, se suministró una dieta que contiene 23,0 % de proteína cruda y 1,19 % de lisina durante 2 semanas. En la fase II, se suministró una dieta que contiene 21,0 % de proteína cruda y 1,05 % de lisina durante las últimas 3 semanas. Todos los otros nutrientes cumplieron o excedieron los requisitos de Corea del estándar de alimentación de aves de corral (2007).

Como resultado, suplementación con ΦCJ8 en los piensos para pollos de engorde durante 5 semanas del ensayo de

alimentación no causó ningún efecto negativo sobre el rendimiento del crecimiento en pollos de engorde (Tabla 7). No hubo diferencias significativas en los pesos relativos de los órganos, tales como el hígado, el bazo, la grasa abdominal, el músculo de la pechuga, y el músculo de la pata y los músculos entre tratamientos (Tabla 8). Estos resultados indican que la suplementación de ΦCJ8 no indujo ningún efecto negativo sobre el crecimiento o el 5 desarrollo de órganos y músculos de pollos de engorde a una concentración de 0,05 a 0,2 %. El suplemento continuo de ΦCJ8 durante 5 semanas desde la cría hasta el envío de pollos de engorde no mostró ningún efecto negativo sobre el crecimiento o el desarrollo de los órganos y músculos de pollos de engorde, lo que confirma la seguridad de ΦCJ8. Estos resultados sugieren que la intoxicación alimentaria causada por Salmonella enteritidis se puede prevenir en los consumidores de los pollos alimentados con el suplemento ΦCJ8 debido a su actividad

10 bactericida específica contra el patógeno.

Tabla 7

Efecto del pienso suplementado con ΦCJ8 sobre los rendimientos de crecimiento en pollos de engorde

Criterios

Tratamiento A SEMB

CON

BP–1 BP–2 BP–3

Peso del hígado (g/ave)

Inicial

41,4 41,4 41,4 41,4 0,03

2 semanas

382,1 369,6 379,6 375,6 2,68

5 semanas

1.988,40 1.959,00 1.999,90 1.991,10 10,64

Ganancia de PC (g/ave)

0–2 semanas

340,7 328,2 338,4 334,3 2,69

2-5 semanas

1.606,30 1.589,50 1.620,30 1.615,50 9,28

0-5 semanas

1.947,00 1.917,70 1.958,60 1.949,70 10,64

Ingesta del pienso (g/ave)

0-2 semanas

483,7 471,7 476,4 481,9 2,73

2-5 semanas

2.727,30 2.740,70 2.789,60 2.728,90 20,35

0-5 semanas

3.210,90 3.212,40 3.266,00 3.210,70 21,69

FCR(relación F/G)

0-2 semanas

1,42 1,44 1,41 1,45 0,01

2-5 semanas

1,7 1,73 1,72 1,69 0,01

0-5 semanas

1,65 1,68 1,67 1,65 0,01

A Control (dieta basal), BP-1 (dieta basal + ΦCJ8 0,05 %), BP-2 (dieta basal + ΦCJ8 0,10 %), BP-3 (dieta basal + ΦCJ8 0,20 %). B Error estándar de la media

Tabla 8

Efecto de los piensos suplementados con ΦCJ8 en los pesos relativos de los órganos y músculos de pollos de engorde

Criterios

Tratamiento A SEMB

CON

BP–1 BP–2 BP–3

Hígado, g/100 g de PC

1,88 1,93 1,77 1,79 0,16

(continuación)

Efecto de los piensos suplementados con ΦCJ8 en los pesos relativos de los órganos y músculos de pollos de engorde

Criterios

Tratamiento A SEMB

CON

BP–1 BP–2 BP–3

Grasa abdominal, g/100 g de PC

2,23 2,22 2,31 2,15 0,14

Músculo de la pechuga, g/100 g de PC

7,8 7,64 7,57 7 0,23

Músculo de la pata, g/100 g de PC

9,31 9,43 9,44 9,47 0,09

A Control (dieta basal), BP-1 (dieta basal + ΦCJ8 0,05 %), BP-2 (dieta basal + ΦCJ8 0,10 %), BP-3 (dieta basal + ΦCJ8 0,20 %). B Error estándar de la media

Ejemplo 14: Efectos inhibidores de ΦCJ8 en la propagación y eliminación fecal de SE

Con el fin de examinar el potencial de ΦCJ8 para prevenir o tratar Salmonella, se evaluaron sus efectos inhibitorios

5 en los pollos. El ensayo de eficacia se realizó en 270 poblaciones parentales en una granja avícola bajo un estricto control de Salmonella. Las ponedoras de 270 días de edad se dividieron en tres grupos de tratamiento y un grupo control positivo (60 pollos jóvenes), y un grupo de control negativo (30 pollos jóvenes) y cada grupo se crió por separado.

A los tres grupos de tratamiento con ΦCJ8 se administró pienso que contenía ΦCJ8 a una concentración de 105, 107

10 y 109ufp/kg, respectivamente, y se alimentó a los grupos positivos y negativos con pienso normal. Entre 60 pollos jóvenes de cada grupo de tratamiento, se expuso a 30 pollos jóvenes por vía oral a SE (Salmonella enteritidis: 5 × 107 UFC/ave)("grupo de exposición"), y se crió a los 30 pollos jóvenes restantes con el grupo the tratamiento expuesto a SE ("grupo infectado por contacto"). A los 7, 14 y 21 días de la exposición a SE, se aisló SE de las heces fecales de cada 10 pollos jóvenes del grupo de exposición y el grupo infectado infectadas por contacto y se realizó

15 un análisis cuantitativo. A los 7, 14 y 21 días de la exposición a SE, se recogieron muestras se de la puerta de entrada, el suelo y el filtro de ventilación en las instalaciones de los grupos de tratamiento y control de los pollos jóvenes, y se comparó el aislamiento cuantitativo de Salmonella.

A los 7, 14 y 21 días de la exposición a SE se observó la reducción de la Salmonella intestinal en los grupos de exposición a los que se administró ΦCJ8 de 107 y 109 ufp/kg y sus grupos infectados por contacto, en comparación 20 con el grupo control positivo. Los grupos de tratamiento a los que se administró ΦCJ8 de 107 y 109 ufp/kg mostraron una reducción de la contaminación ambiental por SE, en comparación con los grupos no tratados, lo que implica que el bacteriófago ΦCJ8 de la presente invención inhibe la excreción de SE al medio ambiente. La administración de ΦCJ8 también inhibió la proliferación de SE en los intestinos del grupo de exposición, lo que da como resultado una disminución de la excreción de SE al medio ambiente, lo que, en consecuencia, conduce al bloqueo de la 25 propagación de SE en el grupo infectado por contacto criado con ellos. Los resultados se muestran en las tablas 9 y

10.

Tabla 9

Efecto inhibitorio de ΦCJ8 aditivo en el pienso sobre la propagación de SE

Exposición

N.º Análisis cuantitativo de SE aislada de heces fecales tras la exposición oral a SE (UFC/g)A

7dpcB

14dpc 21dpc

Tratamiento (109 ufp/kg)c

Grupo de exposición D 30 3,41E + 05 3,06E + 05 2,68E + 04

Grupo infectado por contacto E

30 3,00E + 04 2,90E + 04 1,41E + 04

Tratamiento (107 ufp/kg)

Grupo de exposición 30 5,03E + 05 1,58E + 06 7,21E + 04

Grupo infectado por contacto

30 1,68E + 04 8,19E + 05 4,73E + 04

(continuación)

Efecto inhibitorio de ΦCJ8 aditivo en el pienso sobre la propagación de SE

Exposición

N.º Análisis cuantitativo de SE aislada de heces fecales tras la exposición oral a SE (UFC/g)A

7dpcB

14dpc 21dpc

Tratamiento (105 ufp/kg)

Grupo de exposición 30 3,58E + 05 3,18E + 06 1,27E + 05

Grupo infectado por contacto

30 1,41E + 05 1,47E + 06 5,08E + 05

Sin tratamiento F

Grupo de exposición 30 2,48E + 06 3,55E + 06 6,23E + 05

Grupo infectado por contacto

30 1,62E + 05 1,75E + 06 5,01E + 05

Control negativoG

30 0 0 0

A Aislamiento cuantitativo de Salmonella de heces fecales durante 3 semanas después de la exposición oral a SEB Día después de la exposiciónC Grupo al que se le ha administrado ΦCJ8 como aditivo para piensosD Grupo de exposición expuesto por vía oral a SEE Grupo infectado por contacto criado con el grupo expuesto a SE F grupo no tratado alimentado con pienso normal SIN suplementar con ΦCJ8G Grupo control negativo no expuesto a SE después de criado con pienso normal sin suplementar con ΦCJ8

Tabla 10

Efecto inhibidor de ΦCJ8 sobre la excreción de SE

Análisis cuantitativo de SE en muestras ambientales después de la exposición oral a SE

7 dpcE

Puerta de entrada

Suelo Filtro de ventilación Total

Tratamiento (109 ufp/kg)c

2/2 1/2 0/2 3/6 (50)

Tratamiento (107 ufp/kg)

2/2 0/2 0/2 2/6 (33)

Tratamiento (107 ufp/kg)

2/2 1/2 1/2 4/6 (66)

Sin tratamientoD

2/2 2/2 1/2 5/6 (33)

Control negativoE

0/2 0/2 0/2 0/6 (0)

14 dpc

Puerta de entrada

Suelo Filtro de ventilación Total

Tratamiento (109 ufp/kg)C

1/2 2/2 0/2 3/6 (50)

Tratamiento (107 ufp/kg)

2/2 1/2 0/2 3/6 (50)

Tratamiento (107 ufp/kg)

2/2 2/2 1/2 5/6 (33)

Sin tratamientoD

2/2 2/2 1/2 5/6 (33)

Control negativoE

0/2 0/2 0/2 0/6 (0)

Tratamiento (109 ufp/kg)C

1/2 0/2 0/2 1/6 (16)

Tratamiento (107 ufp/kg)

2/2 0/2 1/2 3/6 (50)

Claims (1)

1. imagen1