ES2593754T3

ES2593754T3 - Anticuerpos anti-IL-23

Info

Publication number: ES2593754T3
Application number: ES11781949.0T
Authority: ES
Inventors: Rachel Rebecca Barrett; Keith Canada; Katrina Mary Catron; Robert Copenhaver; Lee Edward Frego; Ernest Lee Raymond; Sanjaya Singh; Xiangyang Zhu
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 2010-11-04
Filing date: 2011-11-02
Publication date: 2016-12-13
Anticipated expiration: 2031-11-02
Also published as: IL225648A; CY2019040I2; LT2635601T; PH12013500810A1; KR20180137588A; HRP20161141T1; SG190006A1; IL225648A0; MX2019000046A; LTC2635601I2; PT2635601T; CN107522784B; AU2018236692B2; UY33703A; MX362039B; CY1118014T1; EP2635601A1; JP6445596B2; CY2019040I1; EP3115375A1

Abstract

Un anticuerpo anti-IL-23p19 humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende: a) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 (CDR1-L); la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 (CDR2-L); y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 (CDR3-L); y b) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66 o 67 (CDR1-H); la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64 (CDR2-H); y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 (CDR3-H).

Description

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adicionalmente porque inhibe la fosforilación de STAT3 inducida por IL-23 humana en células DB humanas con CI50 iguales o inferiores a 40 pM.

En un aspecto, un anticuerpo anti-IL-23p19 humanizado de la presente divulgación puede caracterizarse adicionalmente porque no tiene ninguna actividad predicha en ADCC/CDC.

En un aspecto, un anticuerpo anti-IL-23p19 humanizado de la presente divulgación puede caracterizarse adicionalmente porque tiene una KD igual o inferior a 1 pM para IL-23 de macaco cangrejero.

En un aspecto, un anticuerpo anti-IL-23p19 humanizado de la presente divulgación puede caracterizarse adicionalmente porque no tiene ninguna reactividad cruzada frente a IL-23 de ratón o rata.

En un aspecto, un anticuerpo anti-IL-23p19 humanizado de la presente divulgación puede caracterizarse adicionalmente porque inhibe la producción de IL-17 e IL-22 inducida por IL-23 humana en una oreja de ratón al 80%

o inhibición mayor de ambas citocinas a 1 mg/kg.

En un aspecto, un anticuerpo anti-IL-23p19 humanizado de la presente divulgación puede caracterizarse adicionalmente por una temperatura de fusión de 83ºC tal como se determina mediante calorimetría diferencial de barrido.

En un aspecto, un anticuerpo anti-IL-23p19 humanizado de la presente divulgación puede caracterizarse adicionalmente por una solubilidad igual o superior a 100 mg/ml, tal como se mide mediante espectroscopía de UV y se monitoriza mediante turbidez.

En un aspecto adicional, un anticuerpo anti-IL-23p19 humanizado de la presente invención puede caracterizarse adicionalmente porque está presente en al menos el 90% en forma monomérica, o en al menos el 92% en forma monomérica, o en al menos el 95% en forma monomérica en un tampón.

En un aspecto adicional, un anticuerpo anti-IL-23p19 humanizado de la presente invención puede caracterizarse adicionalmente porque permanece en al menos el 90% en forma monomérica, o en al menos el 92% en forma monomérica, o en al menos el 95% en forma monomérica en un tampón durante un mes o durante cuatro meses.

En un aspecto, el anticuerpo anti-IL-23p19 humanizado es un anticuerpo monoclonal humanizado, por ejemplo un anticuerpo monoclonal humanizado de longitud completa.

Realizaciones adicionales abarcan una molécula de ADN que codifica para una región variable de cadena ligera anterior, una molécula de ADN que codifica para una región variable de cadena pesada anterior, una molécula de ADN que codifica para una región de cadena ligera anterior, o una molécula de ADN que codifica para una región de cadena pesada anterior.

Realizaciones adicionales abarcan un vector de expresión que contiene una molécula de ADN anterior. En una realización, un vector de expresión comprende una molécula de ADN que codifica para la cadena pesada constante y/o la cadena ligera constante, respectivamente, unida a la molécula de ADN que codifica para la cadena pesada variable y/o la cadena ligera variable, respectivamente. Realizaciones adicionales abarcan una célula huésped que porta uno o más vectores de expresión anteriores. En una realización, un huésped es una célula de mamífero. Realizaciones adicionales abarcan un método para producir un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo anterior, que comprende transfectar una célula huésped de mamífero con uno o más de los vectores anteriores, cultivar la célula huésped y recuperar y purificar el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

Realizaciones adicionales abarcan un método para producir un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo anterior, que comprende obtener una célula huésped de mamífero que comprende uno o más de los vectores anteriores, y cultivar la célula huésped. En una realización, el método comprende además recuperar y purificar el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

En una realización, la presente divulgación proporciona además un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo anterior para su uso en medicina. En una realización, el uso es el tratamiento de una enfermedad inflamatoria, de una enfermedad autoinmunitaria, de una enfermedad respiratoria, de un trastorno metabólico o de cáncer. En una realización, el uso es para el tratamiento de psoriasis, enfermedad inflamatoria del intestino (enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa), artritis psoriásica, esclerosis múltiple, artritis reumatoide o espondilitis anquilosante. En una realización, el uso es para el tratamiento de psoriasis. En una realización, el uso es para el tratamiento de enfermedad inflamatoria del intestino.

En una realización, la presente divulgación proporciona además una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo molécula o fragmento de unión a antígeno anterior y un portador farmacéuticamente aceptable.

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de péptidos.

Los expertos en la técnica conocen bien la estructura generalizada de anticuerpos o inmunoglobulina. Estas moléculas son glicoproteínas heterotetraméricas, normalmente de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas y se denominan normalmente anticuerpos de longitud completa. Cada cadena ligera está unida covalentemente a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro para formar un heterodímero, y la molécula heterotetramérica se forma mediante un enlace disulfuro covalente entre las dos cadenas pesadas idénticas de los heterodímeros. Aunque las cadenas ligeras y pesadas se unen entre sí mediante un enlace disulfuro, el número de enlaces disulfuro entre las dos cadenas pesadas varía por isotipo de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracatenarios espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en el extremo amino-terminal un dominio variable (VH), seguido por tres o cuatro dominios constantes (CH1, CH2, CH3 y CH4), así como una región bisagra entre CH1 y CH2. Cada cadena ligera tiene dos dominios, un dominio variable amino-terminal (VL) y un dominio constante carboxilo-terminal (CL). El dominio VL se asocia de manera no covalente con el dominio VH, mientras que el dominio CL se une comúnmente de manera covalente al dominio CH1 mediante un enlace disulfuro. Se cree que residuos de aminoácido particulares forman una superficie de contacto entre los dominios variables de cadenas ligera y pesada (Chothia et al., 1985, J. Mol. Biol. 186: 651-663). Los dominios variables también se denominan en el presente documento regiones variables.

Determinados dominios dentro de los dominios variables difieren ampliamente entre diferentes anticuerpos, es decir, son “hipervariables”. Estos dominios hipervariables contienen residuos que están directamente implicados en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular por su determinante antigénico específico. La hipervariabilidad, en los dominios variables tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada, se concentra en tres segmentos conocidos como regiones determinantes de la complementariedad (CDR) o bucles hipervariables (HVL). Las CDR se definen mediante comparación de secuencias en Kabat et al., 1991, en: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., mientras que los HVL (también denominados en el presente documento CDR) se definen estructuralmente según la estructura tridimensional del dominio variable, tal como se describe por Chothia y Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917. Estos dos métodos dan como resultado identificaciones ligeramente diferentes de una CDR. Tal como se define por Kabat, CDR-L1 está colocada aproximadamente en los residuos 24-34, CDR-L2, aproximadamente en los residuos 50-56, y CDR-L3, aproximadamente en los residuos 89-97 en el dominio variable de cadena ligera; CDR-H1 está colocada aproximadamente en los residuos 31-35, CDR-H2 aproximadamente en los residuos 50-65, y CDR-H3 aproximadamente en los residuos 95-102 en el dominio variable de cadena pesada. Los números de residuo exactos que abarcan una CDR particular variarán dependiendo de la secuencia y el tamaño de la CDR. Los expertos en la técnica pueden determinar de manera rutinaria qué residuos comprenden una CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de región variable del anticuerpo. Las CDR1, CDR2, CDR3 de las cadenas pesada y ligera definen por tanto las propiedades únicas y funcionales para un anticuerpo dado.

Las tres CDR dentro de cada una de las cadenas pesada y ligera están separadas por regiones de entramado (FR), que contienen secuencias que tienden a ser menos variables. Desde el extremo amino-terminal hasta el extremo carboxilo-terminal de los dominios variables de cadenas pesada y ligera, las FR y CDR están dispuestas en el orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La configuración en gran medida en láminas  de las FR pone las CDR dentro de cada una de las cadenas en estrecha proximidad entre sí así como con las CDR de la otra cadena. La conformación resultante contribuye al sitio de unión a antígeno (véase Kabat et al., 1991, pub. de NIH nº 91-3242, vol. I, páginas 647-669), aunque no todos los residuos de CDR están necesariamente implicados de manera directa en la unión a antígeno.

Los residuos de FR y los dominios constantes de Ig no están directamente implicados en la unión a antígeno, pero contribuyen a la unión a antígeno y/o median en la función efectora de anticuerpos. Se piensa que algunos residuos de FR tienen un efecto significativo sobre la unión a antígeno al menos de tres maneras: mediante unión no covalente directamente a un epítopo, mediante interacción con uno o más residuos de CDR, y afectando a la superficie de contacto entre las cadenas pesada y ligera. Los dominios constantes no están directamente implicados en la unión a antígeno pero median en diversas funciones efectoras de Ig, tales como participación del anticuerpo en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC); citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP).

Las cadenas ligeras de inmunoglobulina de vertebrados se asignan a una de dos clases claramente diferenciadas, kappa () y lambda (), basándose en la secuencia de aminoácidos del dominio constante. Mediante comparación, las cadenas pesadas de inmunoglobulinas de mamíferos se asignan a una de cinco clases principales, según la secuencia de los dominios constantes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. IgG e IgA se dividen adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan , , ,  y , respectivamente. Se conocen bien las estructuras de subunidades y las configuraciones tridimensionales de las clases de inmunoglobulinas nativas.

Los términos “anticuerpo”, “anticuerpo anti-IL-23p19”, “anticuerpo anti-IL-23p19 humanizado”, “anticuerpo anti

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epítopo de IL-23p19 humanizado” y “anticuerpo anti-epítopo de IL-23p19 humanizado variante” abarcan específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de anticuerpo tales como dominios variables y otras partes de anticuerpos que muestran una actividad biológica deseada, por ejemplo, unión a IL-23p19. El término “anticuerpo monoclonal” (AcM) se refiere a un anticuerpo que es altamente específico, que se dirige frente a un único determinante antigénico, un “epítopo”. Por tanto, el modificador “monoclonal” es indicativo de anticuerpos dirigidos al epítopo idéntico y no debe interpretarse como que requiera la producción del anticuerpo mediante ningún método particular. Debe entenderse que pueden producirse anticuerpos monoclonales mediante cualquier técnica o metodología conocida en la técnica; incluyendo, por ejemplo, el método del hibridoma (Kohler et al., 1975, Nature 256: 495), o métodos de ADN recombinante conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente estadounidense nº 4.816.567), o métodos de aislamiento de compuestos monoclonales producidos de manera recombinante usando bibliotecas de anticuerpos de fagos, usando técnicas descritas en Clackson et al., 1991, Nature 352: 624-628, y Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597.

El término “monómero” se refiere a una forma homogénea de un anticuerpo. Por ejemplo, para un anticuerpo de longitud completa, monómero significa un anticuerpo monomérico que tiene dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas.

Los anticuerpos quiméricos consisten en las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo a partir de un anticuerpo de una especie (por ejemplo, un mamífero no humano tal como un ratón) y las regiones constantes de cadena pesada y ligera de uno de otra especie (por ejemplo, humana) y pueden obtenerse uniendo las secuencias de ADN que codifican para las regiones variables del anticuerpo de la primera especie (por ejemplo, ratón) con las secuencias de ADN para las regiones constantes del anticuerpo de la segunda (por ejemplo humano) especie y transformando un huésped con un vector de expresión que contiene las secuencias unidas para permitir que produzca un anticuerpo quimérico. Alternativamente, el anticuerpo quimérico también puede ser uno en el que una o más regiones o dominios de la cadena pesada y/o ligera son idénticas a, homólogas a, o una variante de la secuencia correspondiente en un anticuerpo monoclonal de otra clase o isotipo de inmunoglobulina, o de una secuencia consenso o de línea germinal. Los anticuerpos quiméricos pueden incluir fragmentos de tales anticuerpos, siempre que el fragmento de anticuerpo muestre la actividad biológica deseada de su anticuerpo original, por ejemplo unión al mismo epítopo (véanse, por ejemplo, la patente estadounidense nº 4.816.567; y Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855).

Los términos “fragmento de anticuerpo”, “fragmento de anticuerpo anti-IL-23p19”, “fragmento de anticuerpo antiepítopo de IL-23p19”, “fragmento de anticuerpo anti-IL-23p19 humanizado”, “fragmento de anticuerpo anti-epítopo de IL-23p19 humanizado”, “fragmento de anticuerpo anti-epítopo de IL-23p19 humanizado variante” se refieren a una parte de un anticuerpo anti-IL-23p19 de longitud completa, en la que se conserva una región variable o una capacidad funcional, por ejemplo, unión a epítopo de IL-23p19 específico. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a estos, un fragmento Fab, Fab’, F(ab’)2, Fd, Fv, scFv y scFv-Fc, un diacuerpo, un anticuerpo lineal, un anticuerpo de cadena sencilla, un minicuerpo, un diacuerpo formado a partir de fragmentos de anticuerpo, y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

Pueden tratarse anticuerpos de longitud completa con enzimas tales como papaína o pepsina para generar fragmentos de anticuerpo útiles. La digestión con papaína se usa para producir dos fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno idénticos denominados fragmentos “Fab”, cada uno con un único sitio de unión a antígeno, y un fragmento “Fc” residual. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab’)2 que tiene dos sitios de unión a antígeno y todavía es capaz de unirse de manera cruzada al antígeno.

Los fragmentos Fab’ se diferencian de los fragmentos Fab por la presencia de residuos adicionales incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo en el extremo C-terminal del dominio CH1. Los fragmentos de anticuerpo F(ab’)2 son pares de fragmentos Fab’ unidos mediante residuos de cisteína en la región bisagra. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.

El fragmento “Fv” contiene un sitio de unión y reconocimiento de antígeno completo que consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociación estrecha, no covalente. En esta configuración, las tres CDR de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión a antígeno sobre la superficie del dímero VH-VL. De manera colectiva, las seis CDR confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo.

Un fragmento de anticuerpo “Fv de cadena sencilla” o “scFv” es una variante de Fv de cadena sencilla que comprende los dominios VH y VL de un anticuerpo en la que los dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. El Fv de cadena sencilla es capaz de reconocer y unirse a antígeno. El polipéptido de scFv también puede contener opcionalmente un grupo de unión polipeptídico colocado entre los dominios VH y VL con el fin de facilitar la formación de una estructura tridimensional deseada para la unión a antígeno por parte del scFv (véase, por ejemplo, Pluckthun, 1994, en The Pharmacology of monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315).

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Un “diacuerpo” se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de unión a antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL o VL-VH). Los diacuerpos se describen más completamente, por ejemplo, en Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448.

Otros fragmentos de anticuerpo reconocidos incluyen aquellos que comprenden un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1) para formar un par de regiones de unión a antígeno. Estos “anticuerpos lineales” pueden ser biespecíficos o monoespecíficos tal como se describe, por ejemplo, en Zapata et al. 1995, Protein Eng. 8(10): 10571062.

Un “anticuerpo humanizado” o un “fragmento de anticuerpo humanizado” es un tipo específico de anticuerpo quimérico que incluye una variante de secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina, o fragmento de la misma, que es capaz de unirse a un antígeno predeterminado y que comprende una o más FR que tienen sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana y una o más CDR que tienen sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina no humana. Esta secuencia de aminoácidos no humana denominada con frecuencia secuencia “de importación” se toma normalmente de un dominio de anticuerpo “de importación”, particularmente un dominio variable. En general, un anticuerpo humanizado incluye al menos las CDR

o HVL de un anticuerpo no humano, insertadas entre las FR de un dominio variable de cadena pesada o ligera humano. La presente invención describe anticuerpos anti-IL-23p19 humanizados específicos que contienen CDR derivadas de los anticuerpos monoclonales de ratón o CDR humanizadas mostrados en las tablas 3 y 4 insertadas entre las FR de dominios variables de cadena pesada y ligera de secuencia de línea germinal humana. Se entenderá que determinados residuos de FR de ratón pueden ser importantes para la función de los anticuerpos humanizados y por tanto algunos de los residuos de dominios variables de cadena pesada y ligera de secuencia de línea germinal humana se modifican para ser iguales a los de la secuencia de ratón correspondiente.

En otro aspecto, un anticuerpo anti-IL-23p19 humanizado comprende sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables (tal como se contienen, por ejemplo, en fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2, Fabc, y Fv) en los que todas, o sustancialmente todas, las CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana, y específicamente en el presente documento, todas las CDR son secuencias de ratón o humanizadas tal como se detalla en las tablas 1 a 4 a continuación en el presente documento y todas, o sustancialmente todas, las FR son las de una secuencia de línea germinal o consenso de inmunoglobulina humana. En otro aspecto, un anticuerpo anti-IL23p19 humanizado también incluye al menos una parte de una región Fc de inmunoglobulina, normalmente la de una inmunoglobulina humana. Habitualmente, el anticuerpo contendrá tanto la cadena ligera así como también al menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir una o más de las regiones CH1, bisagra, CH2, CH3 y/o CH4 de la cadena pesada, según sea apropiado.

Puede seleccionarse un anticuerpo anti-IL-23p19 humanizado de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluyendo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Por ejemplo, el dominio constante puede ser un dominio constante de fijación a complemento cuando se desea que el anticuerpo humanizado muestre actividad citotóxica, y el isotipo es normalmente IgG1. Cuando tal actividad citotóxica no es deseable, el dominio constante puede ser de otro isotipo, por ejemplo, IgG2. Un anticuerpo anti-IL-23p19 humanizado alternativo puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo de inmunoglobulina, y seleccionar dominios constantes particulares para optimizar las funciones efectoras deseadas está dentro de la habilidad habitual en la técnica. En realizaciones específicas, la presente invención proporciona anticuerpos que son anticuerpos de IgG1 y más particularmente, son anticuerpos de IgG1 en los que hay una desactivación de funciones efectoras.

No se necesita que las FR y CDR, o HVL, de un anticuerpo anti-IL-23p19 humanizado correspondan precisamente con las secuencias originales. Por ejemplo, uno o más residuos en la CDR de importación, o HVL, o la secuencia de FR de línea germinal o consenso pueden alterarse (por ejemplo, mutagenizarse) mediante sustitución, inserción o deleción de tal manera que el residuo de aminoácido resultante ya no es idéntico al residuo original en la posición correspondiente en ninguna de las secuencias originales, pero el anticuerpo conserva no obstante la función de unión a IL-23p19. Normalmente tal alteración no será extensa y serán alteraciones conservativas. Habitualmente, al menos el 75% de los residuos del anticuerpo humanizado corresponderán a los de las secuencias CDR de importación y FR de línea germinal o consenso originales, más frecuentemente al menos el 90%, y lo más frecuentemente más del 95%, o más del 98% o más del 99%.

Los residuos de inmunoglobulina que afectan a la superficie de contacto entre regiones variables de cadena pesada y ligera (“la superficie de contacto VL-VH”) son aquellos que afectan a la proximidad u orientación de las dos cadenas una con respecto a la otra. Determinados residuos que pueden estar implicados en interacciones entre cadenas incluyen los residuos de VL 34, 36, 38, 44, 46, 87, 89, 91, 96 y 98 y los residuos de VH 35, 37, 39, 45, 47, 91, 93, 95, 100 y 103 (usando el sistema de numeración expuesto en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987)). La patente estadounidense nº 6.407.213 también divulga que residuos tales como los residuos de VL 43 y 85, y los residuos de VH 43 y 60 también pueden estar implicados en esta interacción. Aunque estos residuos se indican únicamente para IgG humana, son aplicables en

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del virus del herpes simple y su anticuerpo (Paborsky et al. 1990, Protein Engineering 3(6): 547-553). En determinadas realizaciones, la etiqueta de epítopo es un “epítopo de unión a receptor de rescate”. Tal como se usa en la presente, el término “epítopos de unión a receptor de rescate” se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula de IgG (tales como, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable del aumento de la semivida en suero in vivo de la molécula de IgG.

En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención pueden conjugarse con un agente citotóxico. Esto es cualquier sustancia que inhibe o impide la función de células y/o provoca la destrucción de células. Se pretende que el término incluya isótopos radiactivos (tales como I131, I125, Y90 y Re186), agentes quimioterápicos y toxinas tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, y fragmentos de los mismos. Tales agentes citotóxicos pueden acoplarse a los anticuerpos humanizados de la presente invención usando procedimientos convencionales, y usarse, por ejemplo, para tratar a un paciente indicado para terapia con el anticuerpo.

Un “agente quimioterápico” es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Hay numerosos ejemplos de agentes quimioterápicos que pueden conjugarse con los anticuerpos terapéuticos de la presente invención. Ejemplos de tales agentes quimioterápicos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida; alquilsulfonatos tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida, y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona); camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecán); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina, auristatinas (incluyendo análogos monometil-auristatina E y monometil-auristatina F); duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CBI-TMI); eleuterobina; pancratistatina; sarcodictina; espongistatina; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, clomafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina; trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como los antibióticos de enodiinos (por ejemplo, calicheamicina, especialmente calichemicina gamma1l y calicheamicina phil1, véase por ejemplo, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186; dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos, tales como clodronato; esperamicina; así como cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos antibióticos de enodiina de cromoproteínas relacionadas), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carcinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (Adriamycin™) (incluyendo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina y desoxidoxorubicina), epirubucina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenérgicos tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reponedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glicósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; democolcina; diaziquona; elfomitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona, mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; rizoxina; sizofurano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2’,2”-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitabronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido (“Ara-C”); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) y doxetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina (Gemzar™); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina (Navelbine™); novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptable de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en esta definición agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre tumores tales como antiestrógenos y moduladores selectivos de receptores estrogénicos (SERM), incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo Nolvadex™), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno; keoxifeno, LY117018, onapristona, y toremifeno (Fareston™); inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol (Megace™), exemestano, formestano, fadrozol, vorozol (Rivisor™), letrozol (Femara™) y anastrozol (Arimidex™); y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. Uno cualquiera o más de estos agentes pueden conjugarse con los anticuerpos humanizados de la presente invención para proporcionar un agente terapéutico útil para el tratamiento de diversos trastornos.

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tratamiento conduce a la mejora de la enfermedad como si no, comprende “tratamiento” o “terapia” tal como se usa en el presente documento. Además, siempre que las composiciones de la invención o bien solas o bien en combinación con otro agente terapéutico alivien o mejoren al menos un síntoma de un trastorno que está tratándose en comparación con ese síntoma en ausencia del uso de la composición de anticuerpo anti-IL-23p19 humanizado, el

5 resultado debe considerarse un tratamiento eficaz del trastorno subyacente independientemente de si se alivian todos los síntomas del trastorno o no.

El término “prospecto” se usa para hacer referencia a instrucciones incluidas habitualmente en envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, administración, contraindicaciones

10 y/o advertencias referentes al uso de tales productos terapéuticos.

Anticuerpos

En un aspecto, en el presente documento se describen y divulgan anticuerpos anti-IL-23, en particular anticuerpos

15 anti-IL-23p19 humanizados, y composiciones y artículos de fabricación que comprenden uno o más anticuerpos antiIL-23, en particular uno o más anticuerpos anti-IL-23p19 humanizados de la presente invención. También se describen agentes de unión que incluyen un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-IL-23, en particular un anticuerpo anti-IL-23p19 humanizado. Los anticuerpos anti-IL-23p19 humanizados y agentes de unión pueden inhibir la producción de citocinas asociadas con Th17, que contribuyen a enfermedades autoinmunitarias e

20 inflamatorias crónicas. Por tanto, los anticuerpos anti-IL-23p19 humanizados y agentes de unión pueden usarse en el tratamiento de una variedad de enfermedades o trastornos. Un anticuerpo anti-IL-23p19 humanizado y un agente de unión a IL-23p19 incluyen cada uno al menos una parte que reconoce específicamente un epítopo de IL-23p19 (es decir, un fragmento de unión a antígeno).

25 En la caracterización inicial se seleccionaron anticuerpos de ratón basándose en la caracterización de unión a IL23p19.

Por consiguiente en un aspecto, un anticuerpo de la presente divulgación tiene una KD para IL-23, en particular IL-23 humana, de menos de 100 pM. En otro aspecto, un anticuerpo de la presente divulgación tiene una KD de menos de

30 40 pM. En otro aspecto, un anticuerpo de la presente divulgación tiene una KD de menos de 20 pM. En otro aspecto, un anticuerpo de la presente divulgación tiene una KD de menos de 10pm. En otro aspecto, un anticuerpo monoclonal de la presente divulgación tiene una KD de menos de 1 pM.

Los anticuerpos de ratón seleccionados tienen las siguientes regiones variables de cadena ligera y regiones 35 variables de cadena pesada tal como se muestran en la tabla 1 y 2:

Tabla 1: Líderes de ratón anti-IL-23p19 – Secuencias de VK

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Tabla 2: Líderes de ratón anti-IL-23p19 – Secuencias VH

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Se seleccionaron secuencias de entramado humanas para cada uno de los líderes de ratón basándose en la homología de entramado, estructura de CDR, residuos canónicos conservados, residuos de empaquetamiento de superficie de contacto conservados y otros parámetros.

5 Las CDR de cadena ligera y cadena pesada de ratón de los diversos anticuerpos de ratón se muestran en la tabla 3 y en la tabla 4, respectivamente. La tabla 4 también muestra tres CDR de cadenas pesadas derivadas del anticuerpo de ratón 6B8 mediante el proceso de humanización.

10 Tabla 3: Secuencias de CDR DE CADENA LIGERA

L-CDR1: L-CDR2 L-CDR3

18C4: RASQSISEYLH (SEQ ID NO: 1) YASQSIS (SEQ ID NO: 2) QNGHSFPFT (SEQ ID NO: 3)

18E5: RASQSISDYLY (SEQ ID NO: 4) FASQSIS (SEQ ID NO: 5) QNGHSFPFT (SEQ ID NO: 3)

18D3: RASQSISDYLY (SEQ ID NO: 4) FASQSIS (SEQ ID NO: 5) QNGHSFPFT (SEQ ID NO: 3)

20E8: RASQSISEYLH (SEQ ID NO: 1) YASQSIS (SEQ ID NO: 2) QNGHSFPFT (SEQ ID NO: 3)

22E2: RASQSISVYLH (SEQ ID NO: 6) YASQSIS (SEQ ID NO: 2) QNGHSFPFT (SEQ ID NO: 3)

24A5: RASQSISDYLH (SEQ ID NO: 7) YASQSIS (SEQ ID NO: 2) QNGHSFPFT (SEQ ID NO: 3)

15C11: RSSQSLVHSNGNTYLH (SEQ ID NO: 8) KVSNRFS (SEQ ID NO: 9) SQSTHVPYT (SEQ ID NO: 10)

43F5: RSSQSLVHSNGNTYLH (SEQ ID NO: 8) KVSNRFS (SEQ ID NO: 9) SQSTHVPYT (SEQ ID NO: 10)

27G8: RASKSVSTSGYSYIH (SEQ ID NO: 11) LASNLDS (SEQ ID NO: 12) QHSRELPYT (SEQ ID NO: 13)

31H9: RASQSISDYLH (SEQ ID NO: 7) YASQSIS (SEQ ID NO: 2) QNGHSFPYT (SEQ ID NO: 14)

2D1: RTSESVYSYGQNFIH (SEQ ID NO: 15) RASNLES (SEQ ID NO: 16) QQTNEDPYT (SEQ ID NO: 17)

9D12: RASETINFYGTSFMH (SEQ ID NO: 18) RASNLES (SEQ ID NO: 16) QQTNEDPYT (SEQ ID NO: 17)

6B8: KASRDVAIAVA (SEQ ID NO: 19) WASTRHT (SEQ ID NO: 20) HQYSSYPFT (SEQ ID NO: 21)

73H10: RASENIDSYLA (SEQ ID NO: 22) AARNLAD (SEQ ID NO: 23) QHYYSTPFT (SEQ ID NO: 24)

74H3: RASENIDSYLA (SEQ ID NO: 22) AATNLAD (SEQ ID NO: 25) LHYYSTPFT (SEQ ID NO: 26)

35H8: RSSQSLVHSNGNTYLH (SEQ ID NO: 8) KVSNRFS (SEQ ID NO: 9) SQSTHVPYT (SEQ ID NO: 10)

26F7: RASKSVRFSDYFYMH (SEQ ID NO: 27) LASNLES (SEQ ID NO: 28) QNSRELPYT (SEQ ID NO: 29)

34G3: RSSQSLVHSNGNTYLH (SEQ ID NO: 8) KVSNRFS (SEQ ID NO: 9) SQSTHVPYT (SEQ ID NO: 10)

34D9: KASQDVGNAVV (SEQ ID NO: 30) WASTRHI (SEQ ID NO: 31) QQYSSYLT (SEQ ID NO: 32)

Tabla 4: Secuencias de CDR DE CADENA PESADA

H-CDR1: H-CDR2 H-CDR3

18C4: GYTFTSSVIH (SEQ ID NO: 33) YINPYNDGTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 34) RLDEAY (SEQ ID NO: 35)

18E5: GYTFTRYLIH (SEQ ID NO: 36) YINPYNDGTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 34) NWDLDY (SEQ ID NO: 37)

18D3: GYTFTRYLIH (SEQ ID NO: 36) YINPYNDGTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 34) NWDLDY (SEQ ID NO: 37)

20E8: GYTFTSSVMH (SEQ ID NO: 38) YINPYNDGTQYNEKFKG (SEQ ID NO: 39) RLDEAY (SEQ ID NO: 35)

22E2: GYTFTSSIIH (SEQ ID NO: 40) YINPYDDVTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 41) RWDESY (SEQ ID NO: 42)

24A5: GYTFTTSIMH (SEQ ID NO: 43) YINPYDDVTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 41) RWDEAY (SEQ ID NO: 44)

15C11: GYTFTDYYMN (SEQ ID NO: 45) VIIPYNGGTSYNQKFKG (SEQ ID NO: 46) DGHRWYFDV (SEQ ID NO: 47)

43F5: GYSFTGYYMN (SEQ ID NO: 48) EIIPTTGGTSYNQKFKA (SEQ ID NO: 49) ESGGFYWYFDV (SEQ ID NO: 50)

27G8: GYTFTDHTIH (SEQ ID NO: 51) YIYPRDGYPKFNEKFKG (SEQ ID NO: 52) RPPYYAMDY (SEQ ID NO: 53)

31H9: GYTFTRYLMH (SEQ ID NO: 54) YINPYNDGTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 55) NWDYAY (SEQ ID NO: 56)

2D1: GFSLTTYAIS VIWTGGGTKYNSALKS KDYNYGGAMDY

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6B8CVK-65: imagen86

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6B8CVK-66: imagen88

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6B8CVK-67: imagen90

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Tabla 6: 6B8 humanizado – Secuencia de VH

6B8CVH-02: imagen93

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6B8CVH-05: imagen95

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Tabla 7: Secuencias de aminoácidos y ADN de cadena pesada y ligera para anticuerpos A, B, C, y D

Anticuerpo A: Cadena ligera de IgK nº 66 imagen101

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Cadena pesada de IgG1KO nº 2: imagen103

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Anticuerpo B: Cadena ligera de IgK nº 66 (SEQ ID NO: 173)

(SEQ ID NO: 174)

Cadena pesada de IgG1KO nº 5: imagen106

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Anticuerpo C: Cadena ligera de IgK nº 65 imagen108

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Cadena pesada de IgG1KO nº 2: (SEQ ID NO: 175)

(SEQ ID NO: 176)

Anticuerpo D: Cadena ligera de IgK nº 65 (SEQ ID NO: 179)

(SEQ ID NO: 180)

Cadena pesada de IgG1KO nº 5: (SEQ ID NO: 177)

(SEQ ID NO: 178)

Las regiones variables de cadenas ligeras y cadena pesada de los anticuerpos A, B, C y D están subrayadas en la tabla 7 anterior.

5 En un aspecto, un anticuerpo anti-IL-23p19 humanizado de la presente divulgación tiene al menos una de las siguientes propiedades. En un aspecto adicional, un anticuerpo anti-IL-23p19 humanizado de la presente divulgación tiene cualquier combinación de al menos dos, o al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 de las siguientes propiedades. En un aspecto adicional, un anticuerpo anti-IL-23p19 humanizado de la presente divulgación tiene todas las siguientes propiedades.

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véanse las tablas 1 y 2), anticuerpos quiméricos (filas 20-23) y los anticuerpos A a D. También se sometieron a prueba el anticuerpo 6H12 (divulgado en el documento WO 2007/027714), el anticuerpo QF20 (divulgado en el documento WO 2007/024846) y el anticuerpo C1273 (divulgado en el documento WO 2007/005955).

Tabla 12

Anticuerpo: Valores de CI50 (pM), IL-23 humana recombinante Valores de CI50 (pM), IL-23 humana natural

18C4: 471 100, 413

18E5: no determinado 9, 9, 13

18D3: 234 no determinado

20E8: no determinado 438, 561

22E2: 61, 130 117, 35

24A5: 22, 37 85, 31

15C11: 126 232

43F5: 250, 8000 8000

27G8: 235 5000

31H9: 960 2000

2D1: no determinado 2336, 1911, 1597

9D12: 59 281, 138

6B8: 13 8, 2

73H10: 1411 no determinado

74H3: 1352 no determinado

36H8: no determinado no determinado

26F7: 27 2, 8

34G3: 336 27, 25

34D9: 510 456

18E5 quimérico: 31 8, 36, 10, 9

22E2 quimérico: 100 9, 178

24A5 quimérico: 404 95, 102

6B8 quimérico: 26, 37, 57 5, 2, 6 3

Anticuerpo A: 5, 5, 5, 15 1, 1

Anticuerpo B: 13, 30, 54, 42 9, 8

Anticuerpo C: 53, 71, 162, 89 16, 32

Anticuerpo D: 236, 225, 614, 458 133, 125

6H12: 1600, 806, 1300 957, 4400, 1013, 439

QF20: no determinado 7, 12

C1273: no determinado 93, 44

Ejemplo 5: Pruebas de especificidad funcional frente a IL-12 en ensayo de células T activadas humanas

10 Se sometieron a prueba anticuerpos anti-IL-23p19 para determinar la inhibición funcional de IL-12 en un ensayo de células T activadas humanas. Se preincubó IL-12 recombinante humana (1 ng/ml) con anticuerpos anti-IL-23p19 5 g/ml. Entonces se añadieron combinaciones de IL-12/anticuerpo a linfloblastos T derivados de PHA humanos. Se usó IL-12 recombinante sola como control positivo. Se usó un anticuerpo anti-IL-12p70 (Bender MedSystems, Viena, Austria) como anticuerpo inhibidor de control. Tras dos días en cultivo, se recogieron los sobrenadantes celulares y

15 se sometieron a ensayo para determinar IFN- mediante ELISA (R&D Systems). Se sometieron a ensayo las muestras por triplicado y se determinaron los pg/ml de IFN- promedio. Los resultados (con desviaciones estándar) se muestran en la tabla a continuación.

Tabla 13 20

Anticuerpo: Estimulación de citocina pg/ml de IFN- promedio +/desviación estándar

Sin anticuerpo: Ninguna 87 +/-7

Sin anticuerpo: IL-12 1 ng/ml 532+/-51

18E5 quimérico: IL-12 1 ng/ml 511 +/-3

6B8 quimérico: IL-12 1 ng/ml 523+/-60

Anticuerpo A: IL-12 1 ng/ml 497 +/-30

Anticuerpo B: IL-12 1 ng/ml 537 +/-2

Anticuerpo C: IL-12 1 ng/ml 495 +/-25

Anticuerpo D: IL-12 1 ng/ml 539 +/-38

Anticuerpo anti-IL-12p70: IL-12 1 ng/ml 119 +/-12

Ejemplo 6: Inhibición de fosforilación de STAT3 inducida por IL-23 en la línea celular humana DB

La línea celular humana DB (ATCC, Manassas, VA) responde a estimulación de IL-23 a través de un complejo IL

5 23R (IL-23R e IL-12R1) endógeno y fosforila STAT3 de manera dependiente de la dosis IL-23. Se desarrolló un ensayo para someter a prueba la inhibición por el anticuerpo anti-IL-23p19 de la fosforilación de STAT3 inducida por IL-23. Se sembraron en placa células DB a 1x10e6 células/pocillo en una placa de 96 pocillos. Se diluyeron en serie los anticuerpos que iban a someterse a prueba y se preincubaron con IL-23 humana recombinante (10 ng/ml) durante 1 hora a temperatura ambiente. Entonces se añadió la mezcla de anticuerpo/IL-23 a las células durante 30

10 minutos a 37ºC. Se recogieron las células mediante centrifugación a 4ºC durante 10 minutos y entonces se lisaron en tampón helado (Cell Signaling Technology, Beverly, MA). Una parte del lisado se utilizó en un ELISA de fosfo-STAT3 (Invitrogen). Se calcularon los valores de CI50 del anticuerpo como la inhibición en porcentaje de la fosforilación de STAT3 en comparación con los pocillos control sin anticuerpo. Los valores de CI50 representativos se muestran en la tabla a continuación.

15 Tabla 14

Anticuerpo: CI50 (pM)

Anticuerpo A: 25, 15, 38, 23, 13, 18

Anticuerpo B: 73, 84

Anticuerpo C: 132, 80

Anticuerpo D: 158

QF20: 26, 26, 27

C-1273: 163, 438

Ejemplo 7: Modelo in vivo de producción de citocinas inducidas por IL-23 en la oreja de ratón

20 Se usó un modelo in vivo en el ratón. Se inyectó IL-23 humana recombinante en la piel de la oreja de ratón durante 4 días consecutivos dando como resultado engrosamiento epidérmico y regulación por incremento de las proteínas IL17 e IL-22. Se evaluaron los anticuerpos anti-IL-23p19 en este modelo. Se administró una única inyección intraperitoneal de anticuerpo 1 mg/kg o 5 mg/kg 1 hora antes de la inyección inicial de IL-23 en la piel. Se inyectó IL

25 23 humana recombinante (con conector) una vez al día durante 3 días adicionales y se recogió tejido para la evaluación de citocinas. Se demostró la inhibición de la producción de citocinas por los anticuerpos. Los resultados de tres experimentos se muestran en la tabla a continuación (exp. 1: filas 1-7, exp. 2: filas 8-10, exp. 3: filas 11-14).

Tabla 15 30

Tejido de oreja pg/ml de IL-17 Media +/-EEM: Tejido de oreja IL-17 Inhibición en porcentaje Tejido de oreja pg/ml de IL-22 Media +/-EEM Tejido de oreja IL-22 Inhibición en porcentaje

BSA al 0,1% + tampón citrato i.p. (control no estimulado): 3 +/-1 ND 1 +/-0 ND

0,3 ug de IL-23 + tampón citrato i.p. (control con vehículo): 25 +/-3 ND 274 +/-30 ND

0,3 ug de IL-23 + anticuerpo 6B8 1 mg/kg: 7 +/-2 81 57 +/-19 80

0,3 ug de IL-23 + anticuerpo A 1 mg/kg: 2 +/-1 101 17 +/-3 94

0,3 ug de IL-23 + anticuerpo B 1 mg/kg: 5 +/-1 93 30 +/-2 89

0,3 ug de IL-23 + anticuerpo C 1 mg/kg: 11 +/-1 66 108 +/-12 61

0,3 ug de IL-23 + anticuerpo D 1 mg/kg: 10 +/-1 67 151 +/-12 45

BSA al 0,1% + vehículo (control no estimulado): 14 +/-1 ND 1 +/-1 ND

0,3 ug de IL-23 + vehículo: 31 +/-4 ND 129 +/-29 ND

0,3 ug de IL-23 + 24A5 5 mg/kg: 14 +/-1 102 10 +/-5 93

BSA al 0,1% + mIgG (control no estimulado): 17 +/-1 ND 4 +/-1 ND

0,3 ug de IL-23 + mlgG (control con vehículo): 30 +/-2 ND 208 +/-40 ND

0,3 ug de IL-23 + 24A5 5 mg/kg: 16 +/-0 109 28+/-5 88

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Ejemplo 8: Estudios farmacocinéticos en macaco cangrejero

Se administraron anticuerpos anti-IL-23p19 humanizados mediante infusión intravenosa de diez minutos a una dosis

5 de 1,0 mg/kg a tres macacos cangrejeros. Se recogieron muestras de suero a lo largo de un transcurso de tiempo de 6 semanas y se midieron las concentraciones de anticuerpo libre usando un ELISA específico. Los perfiles de concentración en suero-tiempo para los anticuerpos y los parámetros farmacocinéticos correspondientes se resumen en la tabla 16 a continuación.

10 Tabla 16

Anticuerpo: CL (ml/d/kg) Vol (ml/kg) AUC (nM·h/ml) T1/2 (días) MRT (días)

Anticuerpo A: 5,2 88 32262 12,1 17,2

Anticuerpo B: 6,0 87 27030 10,1 14,8

Anticuerpo C: 4,7 91 34642 14,1 19,6

Anticuerpo D: 3,4 67 47633 12,6 19,8

Ejemplo 9: Expresión en células NSO y datos biofísicos

15 Transfección de células NSO y generación de reservas estables; se hicieron crecer células NSO en presencia de FBS al 1% antes de la transfección. Se recogieron 40x10e6 células y se resuspendieron en 0,8 ml en medios que contenían FBS al 2% con 20 ug de ADN linealizado (vectores de expresión de cadena pesada y cadena ligera) y entonces se incubaron las células en hielo durante aproximadamente 15 min antes de la electroporación de las células a 750 V/25 uF (Bio-Rad Gene Pulser Xcell). Se recuperaron las células con FBS al 2% durante

20 aproximadamente 48 horas a 37ºC y el 5% de CO2, entonces se sembraron en placas de 96 pocillos a 2x10e5 células/ml que contenían G418 y ácido micofenólico durante 14-21 días hasta la formación de colonias.

Se examinó mediante ELISA el sobrenadante de las placas de 96 pocillos con colonias. Se recubrieron placas de ELISA con 1 ug/ml de anticuerpo de cabra anti-kappa (Southern Biotech, Birmingham, AL) en PBS y se incubaron 25 los sobrenadantes diluidos y entonces se detectaron con anticuerpo de cabra anti-IgG Fc humano-HRP (de Jackson InmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Se reunieron las colonias positivas para la ampliación a escala. Se determinaron los títulos para la producción de anticuerpos mediante ForteBio usando extremos de proteína A según el protocolo de fabricación. Los títulos para el anticuerpo A y el anticuerpo D fueron de entre 250-350 mg/l, con más del 80% de recuperación a partir de la purificación de proteínas, y más del 94% de monómero tras la purificación

30 mediante IEX. Se resuspendieron las proteínas en un tampón final que contenía citrato de sodio 20 mM y NaCl 115 mM, pH 6,0 y fueron estables a 4ºC durante al menos 4 meses y con solubilidad de hasta 100 mg/ml en este tampón.

Tabla 17 35

Columna de proteína A: Columna de IEX

Título (mg/l): Rendimiento (mg/l) Recuperación Rendimiento (mg/l) Recuperación

Anticuerpo A: 345 275 80% 221 80%

Anticuerpo D: 248 225 90% 175 78%

Tabla 18:

Calidad: Estabilidad Solubilidad

AUC reciente (% M): SEC reciente (% M) AUC 1 mes (% M) SEC 1 mes (% M) AUC 4 meses (% M) SEC 4 meses (% M) AUC a 100 mg/ml (% M)

Anticuerpo A: 98 99 97 99 96 99 99

Anticuerpo D: 94 100 98 100 99 99 97

40 AUC: Ultracentrifugación analítica tal como se mide mediante el método de velocidad de sedimentación a concentraciones de 0,5 -1 mg/ml; SEC: Cromatografía de exclusión molecular; %M: monómero en porcentaje.

Ejemplo 10: Mapeo de epítopos

45 Se empleó espectrometría de masas con intercambio de hidrógeno/deuterio (HXMS) para mapear el epítopo del anticuerpo A que se une a IL-23p19 humana. Este método determinó la propensión de los hidrógenos de la estructural principal de amida de IL-23p19 para intercambiarse con D2O. El experimento se realizó con IL-23 sola e

Claims

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