ES2595161T3

ES2595161T3 - Agente inmunoinductor

Info

Publication number: ES2595161T3
Application number: ES12784927.1T
Authority: ES
Inventors: Akira Kurihara; Fumiyoshi Okano
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2011-05-19
Filing date: 2012-05-18
Publication date: 2016-12-28
Anticipated expiration: 2032-05-18
Also published as: US20160030540A1; US20140120059A1; JPWO2012157737A1; AU2012256757B2; EP2711017A1; DK2711017T3; BR112013029704A2; RU2614386C2; US10463725B2; AU2012256757A1; CA2836568C; KR101949186B1; EP2711017A4; JP5954174B2; CA2836568A1; CN103547284A; KR20140034224A; RU2013156368A; CN103547284B; EP2711017B1

Abstract

Un agente inmunoinductor para su uso en un método de tratamiento médico o veterinario, comprendiendo el agente inmunoinductor como principio(s) eficaz(ces) al menos un polipéptido que tiene actividad inmunoinductora seleccionado de entre los polipéptidos (a) a (b) más adelante y/o un(os) vector(es) recombinante(s) que comprende(n) un(os) polinucleótido(s) que codifica(n) dicho al menos un polipéptido, siendo capaz(ces) dicho(s) vector(es) recombinante(s) de expresar in vivo dicho(s) polipéptido(s): (a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO:4, 2, 8, 10 y 12; (b) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de no menos del 85 % con el polipéptido (a).

Description

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incluyen el sistema pUC, pBluescriptII, sistema de expresión pET y sistema de expresión pGEX. Incorporando un ADN que codifica el polipéptido anterior dentro de dicho vector de expresión y transformando células anfitrionas procariotas con el vector, seguido de cultivo de los transformantes resultantes, el polipéptido codificado por el ADN puede expresarse en las células anfitrionas procariotas. En tal caso, el polipéptido también puede expresarse como una

5 proteína de fusión con otra proteína.

En los casos en los que se usan células eucariotas como células anfitrionas, se usa un vector de expresión para células eucariotas, que comprende un promotor, sitio de corte y empalme, sitio de adición de poli (A) y/o similar como el vector de expresión. Los ejemplos de dicho vector de expresión incluyen pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBKCMV, pBKRSV, vector de VEB pRS, pcDNA3, pMSG y pYES2. De forma similar al caso anterior, incorporando un ADN que codifica el polipéptido anterior dentro de dicho vector de expresión y transformando células anfitrionas eucariotas con el vector, seguido de cultivo de los transformantes resultantes, el polipéptido codificado por el ADN puede expresarse en las células anfitrionas eucariotas. En los casos en los que se usa pIND/V5His, pFLAG CMV2, pEGFPN1, pEGFPC1 o similar como el vector de expresión, el polipéptido anterior puede expresarse como una

15 proteína de fusión que comprende un marcador tal como un marcador de His, un marcador FLAG, un marcador myc, un marcador HA o GFP

Para la introducción del vector de expresión dentro de las células anfitrionas, puede usarse un método bien conocido tal como electroporación, el método del fosfato cálcico, el método de los liposomas o el método de DEAEdextrano.

El aislamiento y purificación del polipéptido de interés a partir de las células anfitrionas puede llevarse a cabo mediante una combinación de operaciones de separación conocidas. Los ejemplos de las operaciones de separación conocidas incluyen, pero no se limitan a, tratamiento con un desnaturalizante tal como urea o con un tensioactivo; tratamiento con ultrasonido; digestión enzimática; expulsión salina o precipitación fraccionada del disolvente; diálisis, centrifugación,

25 ultrafiltración, filtración en gel, SDSPAGE; isoelectroenfoque; cromatografía de intercambio iónico; cromatografía hidrófoba; cromatografía de afinidad; y cromatografía de fase inversa.

Los polipéptidos obtenidos mediante los métodos anteriores también incluyen, tal como se ha mencionado anteriormente, aquellos en forma de una proteína de fusión con otra proteína arbitraria. Los ejemplos de dichos polipéptidos incluyen proteínas de fusión con glutatión Stransferasa (GST) y proteínas de fusión con un marcador de His. Dicho polipéptido en forma de una proteína de fusión también se incluye dentro del alcance de la presente invención como el polipéptido (c) descrito anteriormente. Además, en algunos casos, el polipéptido expresado en una célula transformada se modifica de diversas formas en la célula después de la traducción. Dicho polipéptido modificado postraduccionalmente también se incluye dentro del alcance de la presente invención siempre y cuando

35 tenga una actividad inmunoinductora. Los ejemplos de dicha modificación postraduccional incluyen: eliminación de metionina Nterminal; acetilación Nterminal; glucosilación; degradación limitada por una proteasa intracelular; miristoilación; isoprenilación y fosforilación.

Tal como se describe de forma más concreta en los ejemplos que se mencionan más adelante, la administración del polipéptido que tiene una actividad inmunoinductora a un organismo vivo portador de un tumor posibilita la regresión de un tumor ya existente. Por lo tanto, el agente inmunoinductor para su uso de acuerdo con la presente invención puede usarse como como agente terapéutico y/o profiláctico para el cáncer. Además, el polipéptido que tiene una actividad inmunoinductora puede usarse para un método de terapia y/o profilaxis del cáncer mediante inmunoinducción.

45 Tal como se usa en el presente documento, los términos "tumor" y "cáncer" significan una neoplasia maligna y se usan indistintamente.

En este caso, el cáncer que se va a tratar no se restringe, siempre y cuando el gen que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO:KATNAL1 se exprese en el cáncer y el cáncer sea preferentemente cáncer de mama, tumor cerebral, adenocarcinoma perianal, neuroblastoma, mastocitoma, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de tiroides o leucemia.

El animal objeto es preferentemente un mamífero, más preferentemente un mamífero tal como un primate, un animal 55 de compañía, un animal doméstico o un animal de deporte, en especial, preferentemente un ser humano, perro o gato.

La vía de administración del agente inmunoinductor para su uso de acuerdo con la presente invención a un organismo vivo puede ser, bien administración oral, o bien administración parenteral y es preferentemente administración parenteral tal como administración intramuscular, administración subcutánea, administración intravenosa o administración intraarterial. En los casos en los que el agente inmunoinductor se usa para terapia del cáncer, puede administrarse a un ganglio linfático regional cerca del tumor que se va a tratar, tal como se describe en los ejemplos a continuación, a fin de potenciar su actividad anticancerosa. La dosis puede ser cualquier dosis siempre y cuando la dosis sea eficaz para la inmunoinducción y, por ejemplo, en los casos en los que el agente se usa para terapia y/o profilaxis del cáncer, la dosis puede ser una eficaz para terapia y/o profilaxis del cáncer. La dosis eficaz para terapia y/o 65 profilaxis del cáncer se selecciona apropiadamente dependiendo del tamaño, síntomas y similares del tumor y la dosis eficaz es habitualmente de 0,0001 µg a 1000 µg, preferentemente de 0,001 µg a 1000 µg por animal objeto por día. El

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agarosa NZY con un tamaño de 90 mm de diámetro x 15 mm y se cultivó a 42 ºC durante 3 a 4 horas para permitir que el fago formase placas. La placa se cubrió con una membrana de nitrocelulosa (Hybond C Extra: fabricada por GE Healthcare BioScience) impregnada con IPTG (isopropilβDtiogalactósido) a 37 °C durante 4 horas para permitir la inducción y expresión de proteínas y las proteínas se transfirieron a la membrana. Posteriormente, la membrana se

5 recuperó y se sumergió en TBS (TrisHCl 10 mM, NaCl 150 mM; pH 7,5) complementado con leche deshidratada desgrasada al 0,5 %. La membrana se agitó después a 4 ºC durante toda la noche para suprimir reacciones inespecíficas. Este filtro se dejó reaccionar después con suero de perro paciente diluido 500 veces a temperatura ambiente durante 2 o 3 horas.

Al igual que el suero de perro paciente descrito anteriormente, se usó suero de un perro paciente con un tumor perianal. El suero se almacenó a 80 °C y se pretrató inmediatamente antes de su uso. El método del pretratamiento del suero fue de la forma siguiente. Esto es, la E. coli anfitriona (XL1Blue MRF’) se infectó con fago λ ZAP Express, que no tiene ningún gen exógeno insertado, y después se cultivó en medio en medio NZY en placa a 37 ºC durante toda la noche. Posteriormente, se añadió a la placa tampón NaHCO3 0,2 M (pH 8,3) complementado con 0,5 M NaCl y

15 la placa se dejó permanecer a 4 ºC durante 15 horas, seguido de la recogida del sobrenadante como extracto de E. coli/fago. A partir de ahí, el extracto de E. coli/fago se hizo pasar a través de una columna NHS (fabricada por GE Healthcare BioScience) para inmovilizar acto seguido las proteínas procedentes de E. coli/fago. El suero del perro paciente se hizo pasar y reaccionar con esta columna de proteína inmovilizada para eliminar los anticuerpos que se adsorben sobre E. coli y/o fago. La fracción de suero que pasó a través de la columna se diluyó 500 veces con TBS complementado con leche deshidratada desgrasada al 5 % y el diluyente resultante se usó como material para la inmunoexploración.

La membrana sobre la que se transfirieron el suero así tratado y la proteína de fusión descrita anteriormente se lavó 4 veces con TBST (Tween 20 al 0,05 %/TBS) y se hizo reaccionar con IgG de cabra antiperro (conjugado Goat anti Dog

25 IgGh+l HRP: fabricado por BETHYL Laboratories) diluido 5.000 veces con TBS complementado con leche deshidratada desgrasada al 5 % como anticuerpo secundario, a temperatura ambiente durante 1 hora seguido de detección mediante reacción colorimétrica enzimática usando una solución de reacción NBT/BCIP (fabricada por Roche). Las colonias en las posiciones correspondientes a los sitios con reacción colorimétrica positiva se recuperaron de la placa de agarosa NZY que tenía un tamaño de 90 mm de diámetro x 15 mm y se disolvieron en 500 µl de tampón SM (NaCl 100 mM, MgClSO4 10 mM, TrisHCl 50 mM, gelatina al 0,01 %; pH 7,5). La exploración se repitió como segunda y tercera exploración de la misma manera descrita anteriormente hasta que se obtuvo una única colonia con reacción colorimétrica positiva. El aislamiento del clon positivo único se logró después de explorar 9110 clones de fago reactivos con la IgG del suero.

35 (3) Búsqueda de homología de secuencia del gen del antígeno aislado

Para someter al clon positivo único aislado mediante el método descrito anteriormente a análisis de la secuencia de bases, se llevó a cabo una operación de conversión del vector de fago a un vector de plásmido. Más específicamente, se mezclaron 200 µl de una solución preparada de modo que la E. coli anfitriona (XL1Blue MRF’) estuviera contenida a una absorbancia de DO600 de 1,0 con 100 µl de una solución de fago purificado y después con 1 µl de fago auxiliar ExAssist (fabricado por STRATAGENE) y después se dejó proseguir la reacción a 37°C durante 15 minutos. Esto se siguió de la adición de 3 ml de medio LB a la mezcla de reacción y se realizó el cultivo con la mezcla resultante a 37 ºC durante 2,5 a 3 horas. El cultivo resultante se incubó inmediatamente en un baño de agua a 70 °C durante 20 minutos. El cultivo se centrifugó después a 4°C, 1.000 xg durante 15 minutos y se recuperó el sobrenadante como una solución

45 de fagémido. Posteriormente, se mezclaron 200 µl de una solución preparada de modo que la E. coli anfitriona del fagémido (SOLR) estuviera contenida a una absorbancia de DO600 de 1,0 con 10 µl de una solución de fago purificado y se dejó proseguir la reacción a 37°C durante 15 minutos. A partir de ahí, se sembraron en placa 50 µl de la mezcla de reacción en medio de agar LB complementado con ampicilina (concentración final: 50 µg/ml), y se realizó el cultivo a 37°C durante toda la noche. Se recuperó una única colonia de SOLR transformada y se cultivó en medio LB complementado con ampicilina (concentración final: 50 µg/ml) a 37 ºC, seguido de purificación del ADN de plásmido que tenía el inserto de interés usando QIAGEN plasmid Miniprep Kit (fabricado por Qiagen).

El plásmido purificado se sometió a análisis de la secuencia de longitud completa del inserto mediante el método del paseo con cebador usando el cebador de T3 de las SEQ ID NO: 13 y el cebador de T7 de la SEQ ID NO:14. Mediante 55 este análisis de secuencia, se obtuvo el gen de la SEQ ID NO:1. Usando la secuencia de bases y la secuencia de aminoácidos de este gen, se llevó a cabo una búsqueda de homología frente a genes conocidos usando un programa de homología de secuencias BLAST (http://www.nc bi.nlm.nih.gov/BLAST/). Como resultado, se reveló que el gen obtenido es el gen KATNAL1. La KATNAL1 humana, que es un factor homólogo humano de KATNAL1 de perro, tuvo una identidad de secuencia del 95 % en cuanto a la secuencia de bases y del 98 % en cuanto a la secuencia de aminoácidos; La KATNAL1 de ratón, que es un factor homólogo de ratón, tuvo una identidad de secuencia del 85 % en cuanto a la secuencia de bases y del 94 % en cuanto a la secuencia de aminoácidos; la KATNAL1 bovina, que es un factor homólogo de bovino, tuvo una identidad de secuencia del 91 % en cuanto a la secuencia de bases y del 97 % en cuanto a la secuencia de aminoácidos; la KATNAL1 equina, que es un factor homólogo equino, tuvo una identidad de secuencia del 87 % en cuanto a la secuencia de bases y del 88 % en cuanto a la secuencia de aminoácidos; y la 65 KATNAL1 de pollo, que es un factor homólogo de pollo, tuvo una identidad de secuencia del 81 % en cuanto a la secuencia de bases y del 90 % en cuanto a la secuencia de aminoácidos; La secuencia de bases y la secuencia de

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aminoácidos de KATNAL1 humana se muestran en la SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4, respectivamente; La secuencia de bases y la secuencia de aminoácidos de KATNAL1 de ratón se muestran en la SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6, respectivamente; La secuencia de bases y la secuencia de aminoácidos de KATNAL1 bovina se muestran en la SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8, respectivamente; La secuencia de bases y la secuencia de aminoácidos de KATNAL1 equina

5 se muestran en la SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:10, respectivamente; y la secuencia de bases y la secuencia de aminoácidos de KATNAL1 de ratón se muestran en la SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO:6, 12, respectivamente.

(4) Análisis de la expresión en diversos tejidos

La expresión de los genes obtenidos mediante el método anterior en tejidos normales de perro, ser humano y ratón y en diversas líneas celulares se investigó mediante el método de RTPCR (transcripción inversaPCR). La reacción de transcripción inversa se llevó a cabo de la forma siguiente. Esto es, se extrajo ARN total de entre 50 y 100 mg de cada tejido o entre 5 x 106 y 10 x 106 células de cada línea celular, usando el reactivo TRIZOL(fabricado por Invitrogen) de acuerdo con el protocolo descrito en las instrucciones adjuntas. Usando este ARN total, se sintetizó ADNc con el 15 sistema Superscript FirstStrand Synthesis System para RTPCR (fabricado por Invitrogen) de acuerdo con el protocolo descrito en las instrucciones adjuntas. Como ADNc de tejidos humanos normales (cerebro, hipocampo, testículo, colon y placenta), se usaron Gene Pool cDNA (fabricado por Invitrogen), QUICKClone cDNA (fabricado por CLONETECH) y LargeInsert cDNA Library (fabricado por CLONETECH). La reacción de PCR se llevó a cabo usando cebadores específicos para el gen obtenido (los cebadores de perro que se muestran en las SEQ ID NO:15 and 16, los cebadores humanos que se muestran en las SEQ ID NO:17 y 18 y los cebadores de ratón que se muestran en las SEQ ID NO:19 y 20) tal como se describe más adelante. Esto es, los reactivos y el tampón adjunto se mezclaron de modo que 0,25 µl de la muestra preparada mediante la reacción de transcripción inversa, 2 µM de cada uno de los cebadores anteriores, 0,2 mM de cada uno de los dNTP, y 0,65 U de polimerasa ExTaq (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.) estaban contenidos en la mezcla resultante en un volumen final de 25 µl y la reacción se llevó a cabo mediante 30

25 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 1 minuto usando un termociclador (fabricado por BIO RAD). Como control para la comparación se usaron al mismo tiempo cebadores específicos para GAPDH (los cebadores de GAPDH de perro y ser humano se muestran en las SEQ ID NO:21 y 22; y los cebadores de la GAPDH de ratón se muestran en las SEQ ID NO:23 y 24). Como resultado, tal como se muestra en la fig. 1, el gen de KATNAL1 de perro no se expresó en la mayoría de los tejidos de perro sanos, mientras que el gen se expresó intensamente en los tejidos de tumor de perro. También en cuanto a los genes de KATNAL1 de ratón y ser humano, la expresión no se observó en la mayoría de los tejidos de ratón y humanos normales, mientras que la expresión se detectó en la mayoría de las líneas celulares de cáncer (fig. 2 y 3), al igual que en el caso del gen de KATNAL1 de perro.

35 (5) Análisis cuantitativo de la expresión en diversos tejidos

El gen obtenido mediante el método anterior se sometió a investigación de la expresión en tejidos normales humanos mediante el método de RTPCR (transcripción inversaPCR) cuantitativa. Al igual que los ADNc de tejidos normales y tejidos de cáncer humanos, se usó el panel I del Tissue scan Real Time para seguimiento del cáncer (fabricado por ORIGENE). La RTPCR cuantitativa se llevó a cabo usando el termociclador CFX96 Real Time System C1000, fabricado por BioRad Laboratories, Inc. La reacción de PCR se llevó a cabo de la forma siguiente usando cebadores específicos para el gen obtenido (que se muestran en las SEQ ID NO:17 and 18). Esto es, se mezclaron 5 µl de la muestra de ADNc, 2 µM de cada uno de los cebadores, y los reactivos y el tampón contenido en la premezcla 2 x SYBR Premix Ex TaqII polymerase (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.) para preparar una mezcla en un volumen final de

45 20 µl y la reacción se llevó a cabo mediante 30 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos y 72°C durante 1 minuto. Como resultado, el nivel de expresión del gen KATNAL1 en cada uno de cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de tiroides, cáncer de hígado, cáncer de próstata y cáncer de pulmón no fue menos de 5 veces superior al nivel de expresión en su tejido normal correspondiente. Basándose en estos resultados, puede esperarse que no hay ninguna preocupación en absoluto sobre la aparición de efectos secundarios por agentes antitumorales dirigidos a KATNAL1 human en tejidos normales y que el beneficio del efecto farmacológico de los agentes supera ampliamente el riesgo de sus efectos secundarios.

Ejemplo 2: Análisis de la antigenicidad en cáncer de KATNAL1 in vivo

55 (1) Preparación de vector recombinante que expresa KATNAL1 in vivo

Basándose en la secuencia de bases de la SEQ ID NO:5, se preparó un vector recombinante que expresa KATNAL1 in vivo. La PCR se preparó a partir de la línea celular de cáncer de ratón N2a (adquirida de ATCC), que mostró la expresión del ejemplo 1. Los reactivos y el tampón adjunto se mezclaron de modo que 1 µl del ADNc, 0,4 µM de cada uno de dos tipos de cebadores que tenían los sitios de restricción de HindIII y XbaI (mostrados en las SEQ ID NO:25 y 26), dNTP 0,2 mM y 1,25 U de polimerasa U PrimeSTAR HS (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.) estaban contenidos en la mezcla resultante en un volumen final de 50 µl y la PCR se llevó a cabo mediante 30 ciclos de 98°C durante 10 segundos, 55 °C durante 15 segundos y 72 °C durante 4 minuto usando un termociclador (fabricado por BIO RAD). Los dos tipos de cebadores descritos anteriormente fueron los de la amplificación de la región que codifica 65 la longitud total de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:5. Después de la PCR, el ADN amplificado se sometió a electroforesis usando gel de agarosa al 1 % y se purificó un fragmento de ADN de alrededor de 1500 pb

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