ES2599477T3

ES2599477T3 - Antígeno 75 de linfocitos (Ly75)

Info

Publication number: ES2599477T3
Application number: ES12150462.5T
Authority: ES
Inventors: Christian Rohlff; Alasdair Stamps
Original assignee: Oxford Biotherapeutics Ltd
Current assignee: Oxford Biotherapeutics Ltd
Priority date: 2007-02-26
Filing date: 2008-02-26
Publication date: 2017-02-01
Anticipated expiration: 2028-02-26
Also published as: JP5945381B2; US20100098627A1; DK3118220T3; CY1122048T1; DK3118221T3; WO2008104806A3; SI2441775T1; US9200055B2; WO2008104806A2; EP2441775A1; EP3118220A1; EP2122360A2; EP3118220B1; WO2008104804A2; LT3118220T; PL3118220T3; HRP20191609T1; WO2008104803A2; ES2745014T3; HRP20161338T1

Abstract

Un anticuerpo que es capaz de enlazarse específicamente al antígeno 75 de linfocitos para uso en el tratamiento de cáncer pancreático en donde dicho anticuerpo contiene o esta conjugado a una unidad estructural terapéutica.

Description

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Se divulga adicionalmente un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable y una composición farmacéutica que comprende uno o más de los reactivos de afinidad o agentes de hibridación como se indicó anteriormente y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

En un ejemplo el cáncer que se va a detectar, prevenir o tratar es un cáncer colorrectal.

En otro ejemplo el cáncer que se va a detectar, prevenir o tratar es cáncer de riñón.

En otro ejemplo el cáncer que se va a detectar, prevenir o tratar es cáncer de hígado.

En otro ejemplo el cáncer que se va a detectar, prevenir o tratar es cáncer de pulmón.

En otro ejemplo el cáncer que se va a detectar, prevenir o tratar es leucemia linfoide (particularmente leucemia linfocítica crónica.

En otro ejemplo el cáncer que se va a detectar, prevenir o tratar es cáncer ovárico.

En otra realización el cáncer que se va a detectar, prevenir o tratar es cáncer pancreático.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra las secuencias de aminoácidos de las tres isoformas de la proteína de la divulgación. Los péptidos trípticos detectados experimentalmente por espectrometría de masas están resaltados –los péptidos con coincidencia de masas se muestran resaltados, los péptidos en tándem están subrayados.

La figura 2 muestra el Protein Index para la proteína de la divulgación.

Descripción detallada de la invención

La invención descrita en detalle a continuación provee métodos y composiciones para criba, diagnosis y prognosis clínica de cáncer pancreático. También se describen métodos y composiciones para la criba, diagnosis y prognosis clínica de cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, leucemia linfoide (particularmente leucemia linfocítica crónica), cáncer ovárico en un sujeto mamífero para identificar pacientes que respondan lo más probablemente a un tratamiento terapéutico particular, para monitorizar los resultados de la terapia para cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, leucemia linfoide (particularmente leucemia linfocítica crónica), cáncer ovárico o cáncer pancreático, para criba de fármacos y desarrollo de fármacos. La invención también abarca la administración de composiciones farmacéuticas a un mamífero sujeto al tratamiento de cáncer pancreático. La divulgación también describe la administración de composiciones terapéuticas a un sujeto mamífero para tratar o prevenir cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, leucemia linfoide (particularmente leucemia linfocítica crónica), cáncer ovárico. El sujeto mamífero puede ser un mamífero no humano, por ejemplo un humano, tal como un humano adulto, esto es, un sujeto humano de al menos 21 (por ejemplo al menos 35, al menos 50, al menos 60, al menos 70 o al menos 80) años de edad. Los métodos y composiciones de la presente invención están adecuados especialmente para criba, diagnóstico y prognosis de un sujeto vivo, pero también pueden ser utilizados para un diagnóstico post morten en un sujeto, por ejemplo, para identificar miembros de la familia en riesgo de desarrollar la misma enfermedad.

OGTA076

Tal como se describe aquí, una electroforesis unidimensional o etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ) u otros métodos apropiados se utilizan para analizar muestras de tejido de cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, leucemia linfoide (particularmente leucemia linfocítica crónica), cáncer ovárico o cáncer pancreático de un sujeto, preferiblemente un sujeto vivo, con el fin de medir la expresión de la proteína para criba o diagnóstico de cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, leucemia linfoide (particularmente leucemia linfocítica crónica), cáncer ovárico o cáncer pancreático, para determinar la prognosis de un paciente de cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, leucemia linfoide (particularmente leucemia linfocítica crónica), cáncer ovárico o cáncer pancreático, para monitorizar la efectividad de una terapia para cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, leucemia linfoide (particularmente leucemia linfocítica crónica), cáncer ovárico o cáncer pancreático, o para el desarrollo de fármacos.

Tal como se utiliza aquí, el término “Proteína de la divulgación” o “OGTA076”, se refiere a la proteína ilustrada en la figura 1 en todas sus isoformas, en particular en sus tres isoformas diferentes detectadas experimentalmente por electroforesis en gel 1D y análisis iTRAQ de muestras de tejido de cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de

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Muestras 1: Experimento 1 LALK [35]

Muestras 1: Experimento 2 LALK [35], YLNNLYK [66]

Muestras 1: Experimento 3 LALK [35]

Tabla 2 a – Gel 1D de cáncer colorrectal

PM (Da): Subfraccionamiento Trípticos identificados [SEQ ID No]

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Tabla 2b – Gel 1D de leucemia crónica linfocítica

PM (Da): Subfraccionamient o Trípticos identificados [SEQ ID No]

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Tabla 2c – Gel 1D de cáncer pancreático

PM (Da): Subfraccionamiento Trípticos identificados [SEQ ID No]

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Para el OGTA076 el nivel detectado obtenido por análisis del tejido de sujetos que tienen cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, leucemia linfoide (particularmente leucemia linfocítica crónica), cáncer ovárico o cáncer pancreático con respecto al nivel detectado obtenido al analizar tejido de sujetos libres de 5 cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, leucemia linfoide (particularmente leucemia linfocítica crónica), cáncer ovárico o cáncer pancreático dependerá del protocolo analítico y de la técnica de detección en particular que están siendo utilizados. De acuerdo con lo anterior, la presente divulgación contempla que cada laboratorio establecerá un rango de referencia en sujetos libres de cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, leucemia linfoide (particularmente leucemia linfocítica crónica), cáncer ovárico10 o cáncer pancreático de acuerdo con el protocolo analítico y técnicas de detección en uso, como es convencional en el arte diagnóstico. Preferiblemente, al menos una muestra de tejido positiva de control de un sujeto conocido por tener cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, leucemia linfoide (particularmente leucemia linfocítica crónica), cáncer ovárico o cáncer pancreático o al menos una muestra de tejido negativo de control de un sujeto conocido por estar libre de cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de

15 pulmón, leucemia linfoide (particularmente leucemia linfocítica crónica), cáncer ovárico o cáncer pancreático (más preferiblemente muestras de control tanto positivas como negativas) se incluyen en cada lote de las muestras de prueba analizadas.

Las OGTA076 pueden ser utilizada para detección, prognosis, diagnóstico o monitorización de cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, leucemia linfoide (particularmente leucemia linfocítica 20 crónica), cáncer ovárico o cáncer pancreático o para el desarrollo de fármacos. En un ejemplo, un tejido de un sujeto (por ejemplo un sujeto del que se sospecha tiene cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, leucemia linfoide (particularmente leucemia linfocítica crónica), cáncer ovárico o cáncer pancreático) es analizado por electroforesis en gel 1D o iTRAQ para la detección de OGTA076. Una abundancia incrementada de

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OGTA076 en el tejido del sujeto con respecto al tejido de un sujeto o sujetos libres de cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, leucemia linfoide (particularmente leucemia linfocítica crónica), cáncer ovárico o cáncer pancreático (por ejemplo una muestra de control) o un rango de referencia previamente determinado indica la presencia de cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, leucemia linfoide (particularmente leucemia linfocítica crónica), cáncer ovárico o cáncer pancreático.

En relación con los fragmentos, fragmentos que contienen epítopos, fragmentos inmunogénicos o fragmentos antigénicos de OGTA076:

-para aplicaciones en cáncer colorrectal, pueden comprender las secuencias identificadas como secuencias tríptico en la 3º columna de la Tabla 1a o en la 3º columna de la Tabla 2a;

-para aplicaciones en cáncer de riñón, pueden comprender las secuencias identificadas como secuencias tríptico en la 3º columna de la Tabla 1b;

-para aplicaciones en cáncer de hígado, pueden comprender las secuencias identificadas como secuencias tríptico en la 3º columna de la Tabla 1c;

-para aplicaciones en cáncer de pulmón de células no pequeñas, pueden comprender las secuencias identificadas como secuencias trípticas en la 3º columna de la Tabla 1d:

-para aplicaciones en cáncer de pulmón de células pequeñas, pueden comprender las secuencias identificadas como secuencias trípticas en la 3º columna de la Tabla 1e;

-para aplicaciones en cáncer ovárico, pueden comprender las secuencias identificadas como secuencias trípticas en la 3º columna en la Tabla 1f;

-para aplicaciones en leucemia linfocítica crónica, pueden comprender las secuencias identificadas como secuencias trípticas de la 3º columna de la Tabla 2b;

-para aplicaciones en cáncer pancreático, pueden comprender las secuencias identificadas como secuencias trípticas en la 3º columna de la Tabla 2c.

Tal como se utiliza aquí, OGTA076 está “aislado” cuando está presente en la preparación que está sustancialmente libre de proteínas contaminantes, esto es una preparación en la cual menos del 10% (por ejemplo menos del 5%, tal como menos del 1%) de la proteína total presente es proteína contaminante. Una proteína contaminante es una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos significativamente diferente de la del OGTA076 aislado, según se determina por análisis de espectrometría de masas. Tal como se utiliza aquí, una secuencia “significativamente diferente” es aquella que permite que la proteína contaminante sea resuelta de la OGTA076 por análisis espectral de masas, llevado a cabo de acuerdo con los Protocolos de Referencia.

La OGTA076 puede ser probada por cualquier método conocido por los experimentados en el arte, incluyendo pero no limitándose a, las tecnologías preferidas descritas aquí, ensayos con quinasa, ensayos con enzimas, ensayos de enlazamiento y otros ensayos funcionales, inmunoensayos, e inmunoprecipitación western. En un ejemplo, la OGTA076 es separada sobre un gel 1D por virtud de su peso molecular y se visualiza tiñendo el gel. En un ejemplo, la OGTA076 se tiñe con un colorante fluorescente y se genera imágenes con un escáner fluorescente. El Spyro Red (Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon) es un colorante adecuado para este propósito. Un colorante fluorescente preferido está divulgado en la solicitud de los Estados Unidos No. 09/412,168, presentada el 5 de octubre de 1999. En otro ejemplo, el OGTA076 es analizado utilizando etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ).

Alternativamente, la OGTA076 puede ser detectada en un inmunoensayo. En un ejemplo, un inmunoensayo se lleva a cabo poniendo en contacto una muestra de un sujeto que va a ser probado con un anticuerpo anti-OGTA076 (u otro reactivo de afinidad) bajo condiciones tales que el enlazamiento (por ejemplo enlazamiento inmunoespecífico) puede ocurrir si está presente la OGTA076, y detectar o medir la cantidad de cualquier enlazamiento (por ejemplo, enlazamiento inmunoespecífico) por el agente. Los agentes de enlazamiento de OGTA076 pueden ser producidos por los métodos y técnicas enseñados aquí.

La OGTA076 puede ser detectada en virtud de la detección de un fragmento de la misma, por ejemplo un epítopo contenido (por ejemplo uno inmunogénico o antigénico) entre un fragmento del mismo. Los fragmentos pueden tener una longitud de al menos 10, más típicamente al menos 20 aminoácidos por ejemplo al menos 50 o 100 aminoácidos, por ejemplo al menos 200 o 500 aminoácidos, por ejemplo al menos 1000 o 1500 aminoácidos.

En uno o más ejemplos la OGTA076 es expresada diferencialmente en pacientes/sujetos con cáncer colorrectal,

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cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, leucemia linfoide (particularmente leucemia linfocítica crónica), cáncer ovárico o cáncer pancreático. Por expresado diferencialmente se entiende referencia a un nivel de expresión más alto o más bajo en una muestra relevante en comparación con una muestra libre de cáncer/saludable.

En un ejemplo, el enlazamiento de un reactivo de afinidad (por ejemplo un anticuerpo) en secciones de tejido puede utilizarse para detectar localización aberrante de OGTA076 o un nivel aberrante de OGTA076. En un ejemplo específico, un anticuerpo (u otro reactivo de afinidad) para OGTA076 puede ser utilizado para probar un tejido de un paciente (por ejemplo, un tejido colorrectal, de riñón, de hígado, de pulmón, linfoide, ovárico o pancreático) en cuanto al nivel de OGTA076 donde un nivel aberrante de OGTA076 es indicativo de cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, leucemia linfoide (particularmente leucemia linfocítica crónica), cáncer ovárico o cáncer pancreático. Tal como se utiliza aquí, un “nivel aberrante” significa un nivel que es incrementado en comparación con el nivel de un sujeto libre de un cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, leucemia linfoide (particularmente leucemia linfocítica crónica), cáncer ovárico o cáncer pancreático o un nivel de referencia.

Puede utilizarse cualquier inmunoensayo adecuado, incluyendo, sin limitación, sistema de ensayo competitivo y no competitivos usando técnicas tales como inmunoprecipitación western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunosorbente enlazado a enzima), inmunoensayos “sándwich”, ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina por difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación a complemento, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos fluorescentes e inmunoensayos con proteína A.

Por ejemplo, la OGTA076 puede ser detectada en una muestra fluida (por ejemplo sangre, orina o saliva) por medio de un ensayo sándwich de dos etapas. En la primera etapa, un reactivo de captura (por ejemplo un anticuerpo anti-OGTA076 u otro reactivo de afinidad) se utiliza para capturar OGTA076. El reactivo de captura puede ser inmovilizado opcionalmente sobre una fase sólida. En la segunda etapa, un reactivo de detección directa o indirectamente marcado se utiliza para detectar la OGTA076. En un ejemplo, el reactivo de detección es una lectina. Puede utilizarse cualquier lectina para este propósito que, por ejemplo, se enlace a OGTA076 más que a otras isoformas que tienen la misma proteína núcleo que OGTA076 o a otras proteínas que comparten el determinante antigénico reconocido por el anticuerpo. En un ejemplo preferido, la lectina escogida se enlaza a OGTA076 con al menos una afinidad 2 veces mayor, más preferiblemente con una afinidad al menos 5 veces mayor, todavía más preferiblemente al menos una afinidad al menos 10 veces mayor de tal manera que otras isoformas que tengan la misma proteína de núcleo como OGTA076 o a dichas proteínas que comparten el determinante antigénico reconocido por el reactivo de afinidad. Con base en la presente descripción, una lectina que es adecuada para detectar OGTA076 puede ser identificada fácilmente por métodos bien conocidos en el arte, por ejemplo, al probar una o más lectinas enumeradas en la Tabla I en las páginas 158-159 de Sumar et al., Lectins as Indicators of Disease-Associated Glycoforms, In: Gabius H-J & Gabius S (eds.), 1993, Lectins and Glycobiology, at pp. 158-. En un ejemplo alternativo, el reactivo de detección es un anticuerpo (u otro reactivo de afinidad), por ejemplo un anticuerpo que detecta específicamente (por ejemplo, inmunoespecíficamente) otras modificaciones postraducción, tales como un anticuerpo que se enlaza inmunoespecíficamente a los aminoácidos fosforilados. Ejemplos de tales anticuerpos incluyen los enlazados a fosfotirosina (BD Transduction Laboratories, catálogos nos.: P11230050/P11230-150; P11120; P38820; P39020), aquellos que se enlazan a fosfoserina (Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA, catálogo no. 61-8100) y aquellos que se enlazan a fosfotreonina (Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA, catálogos nos. 71-8200, 13-9200).

Si se desea, un gen que codifica OGTA076, un gen relacionado, o secuencias o subsecuencias relacionadas de los ácidos nucleicos, incluyendo secuencias complementarias, también pueden ser utilizados en los ensayos de hibridación. Un nucleótido que codifica OGTA076, o subsecuencias del mismo que comprenden al menos 8 nucleótidos, al menos 12 nucleótidos, tales como al menos 15 nucleótidos pueden ser utilizados como una sonda de hibridación. Los ensayos de hibridación pueden ser usados para la detección, prognosis, diagnóstico o monitorización de condiciones, trastornos o estados de enfermedad, asociados con expresión aberrante del gen que codifica OGTA076, o para diagnóstico diferencial de sujetos con signos o síntomas que sugieren cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, leucemia linfoide (particularmente leucemia linfocítica crónica), cáncer ovárico o cáncer pancreático. En particular, tal ensayo de hibridación puede ser llevado a cabo por un método que comprende poner en contacto una muestra de un sujeto que contiene ácido nucleico con una sonda de ácido nucleico capaz de hibridar a ADN o ARN que codifica OGTA076, bajo condiciones tales que la hibridación pueda ocurrir, y se pueda detectar o medir cualquier hibridación resultante.

Por lo tanto el ácido nucleico que codifica OGTA076 (por ejemplo ADN o de manera más adecuada ARN) puede ser detectado, por ejemplo, usando un agente de hibridación capaz de hibridar al ácido nucleico que codifica OGTA076.

Un tal método de ejemplo comprende:

(a) poner en contacto una o más sondas de oligonucleótidos que comprenden 10 o más nucleótidos consecutivos

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182 (1990); Solid Phase Peptide Synthesis, Greg B. Fields ed., Meth. Enzymol. Vol 289 (1997); Kiso et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 38: 1192-99, 1990; Mostafavi et al., Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids 1: 255-60, 1995; Fujiwara et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 44: 1326-31, 1996. Los polipéptidos seleccionados pueden ser utilizados entonces para inmunizar por inyección diversos animales huésped, incluyendo pero no limitándose a conejos, ratones, ratas, etc., para generar anticuerpos policlonales o monoclonales. La tecnología preferida descrita aquí en el Ejemplo 1 provee OGTA076 adecuado para tal inmunización. Si el OGTA076 es purificado por electroforesis en gel, el OGTA076 puede ser usado para inmunización con o sin extracción previa a partir del gel de poliacrilamida. Pueden utilizarse diversos adyuvantes (esto es, inmunoestimuladores) para potenciar la respuesta inmunológica, dependiendo de las especies huésped, incluyendo, pero no limitándose a, adyuvante de Freund completo o incompleto, un gel mineral tal como hidróxido de aluminio, una sustancia con actividad superficial tal como lisolecitina, un poliol plurónico, un polianion, un péptido, una emulsión oleosa, hemocianina de lapa, dinitrofenol, y un adyuvante tal como BCG (bacilo Calmette-Guerin) o Corynebacterium parvum. En el arte son conocidos también adyuvantes adicionales.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales (mAbs) dirigidos hacia OGTA076, puede utilizarse un fragmento de OGTA076, un polipéptido relacionado con OGTA076, o un fragmento de un polipéptido relacionado con OGTA076, cualquier técnica que provee la producción de moléculas de anticuerpos por líneas celulares continuas en cultivo. Por ejemplo, la técnica del hibridoma desarrollado originalmente por Kohler y Milstein (1975, Nature 256:495-497), así como la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kosbor et al., 1983, immunology Today 4:72), y la técnica del hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de las mismas. El hibridoma que produce el mAbs de la invención puede ser cultivado in vitro o in vivo. En un ejemplo adicional, los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos en animales libres de germen utilizando tecnología conocida (PCT/US90/02545).

Los anticuerpos monoclonales incluyen pero no se limitan a anticuerpos monoclonales humanos y anticuerpos monoclonales quiméricos (por ejemplo, quimeras humana-ratón). Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual diferentes porciones son derivadas de diferentes especies animales, tales como las que tienen una región constante de inmunoglobulina humana y una región variable derivada de un mAb murínico. (Véase, por ejemplo Cabilly et al., Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567; y Boss et al., Patente de los Estados Unidos No. 4,816,397). Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo de especies no humanas que tienen una o más regiones determinantes de complementareidad (CDRs) de la especie no humana y una región marco de una molécula de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Queen, Patente de los Estados Unidos No. 5,585,089).

Los anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados pueden ser producidos por técnicas de ADN recombinante conocidas en el arte, por ejemplo, utilizando métodos descritos en la publicación PCT No WO 87/02671; Solicitud de Patente Europea 184,187; Solicitud de Patente Europea 171,496; Solicitud de Patente Europea 173,494; PCT Publication No. WO 86/01533; Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567; Solicitud de Patente Europea 125,023; Better et al., 1988, Science 240:1041-1043; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al., 1985, Nature 314:446-449; and Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559; Morrison, 1985, Science 229:1202-1207; Oi et al., 1986, Bio/Techniques 4:214; Patente de los Estados Unidos 5,225,539; Jones et al., 1986, Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; y Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141:4053-4060.

Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de sujetos humanos. Tales anticuerpos pueden ser producidos utilizando ratones transgénicos que son incapaces de expresar genes de cadena pesada y liviana de inmunoglobulina endógenos, pero que pueden expresar genes de cadena pesada y liviana humanos. Los ratones transgénicos son inmunizados en la forma normal con un antígeno seleccionado, por ejemplo, todo o una porción OGTA076. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno pueden ser obtenidos utilizando tecnología de hibridoma convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana alojados por los ratones transgénicos se reordenan durante la diferenciación de las células B, y subsecuentemente experimentan conmutación de clase y mutación somática. Así, utilizando tal técnica, es posible producir anticuerpos de IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para una revisión de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, véase Lomberg y Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93). Para una discusión detallada de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir tales anticuerpos, véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos 5,625,126; Patente de los Estados Unidos 5,633,425; Patente de los Estados Unidos 5,569,825; Patente de los Estados Unidos 5,661,016; y Patente de los Estados Unidos 5,545,806. Además, compañías tales como Abgenix, Inc. (Freemont, CA) y Genpharm (San Jose, CA) pueden ser requeridas para proveer anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado utilizando una tecnología similar a la descrita más arriba.

Los anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítopo seleccionado pueden ser generados utilizando una técnica denominada como “selección guiada”. En esta metodología un anticuerpo monoclonal no humano

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vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptidos en proporciones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las proporciones no tienen significado particular.

En un ejemplo de esta metodología, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina hibrida con una primera especificidad de enlazamiento en un brazo y un par de cadena pesadacadena liviana de inmunoglobulina hibrido (que provee una segunda especificidad de enlazamiento) en el otro brazo. Se ha encontrado que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseadas, como la presencia de una cadena liviana de inmunoglobulina en solamente la mitad de la molécula biespecífica provee una manera fácil de separación. Esta metodología esta divulgada en WO 94/04690 publicada el 3 de marzo de 1994. Para detalles adicionales para la generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enxymology, 1986, 121:210.

Esta invención provee fragmentos funcionalmente activos, derivados o análogos de las moléculas de inmunoglobulina anti-OGTA076. Los medios funcionalmente activos significab que el fragmento, derivado o análogo es capaz de provocar anticuerpos anti-anti-idiotipo (esto es anticuerpos terciarios) que reconocen el mismo antígeno que es reconocido por el anticuerpo del cual el fragmento, derivado o análogo es derivado. Específicamente, en un ejemplo preferido la antigenicidad del idiotipo de la molécula de inmunoglobulina puede ser potenciada eliminando el marco y las secuencias de CDR que son C terminales a la secuencia de CDR que reconoce específicamente el antígeno. Para determinar cuáles secuencias CDR se enlazan al antígeno, pueden utilizarse péptidos sintéticos que contienen la secuencia CDR en ensayos de enlazamiento con el antígeno por cualquier método de ensayo de enlazamiento conocido en el arte.

La presente invención provee fragmentos de anticuerpos tales como, pero no limitándose a, fragmentos F(ab’)2 y fragmentos Fab. Los fragmentos de anticuerpos que reconocen epítopos específicos pueden ser generados por técnicas conocidas. Los fragmentos F(ab’)2 consisten de la región variable, la región constante de cadena liviana y el dominio CH1 de la cadena pesada y son generados por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo. Los fragmentos Fab son generados por reducción de los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab’)2. La invención también provee dímeros de cadena pesada y cadena liviana de los anticuerpos de la invención, o cualquier fragmento mínimo de los mismos tal como anticuerpos Fvs o de cadena sencilla (SCAs) (por ejemplo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos 4,946,778; Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; y Ward et al., 1989, Nature 334:544-54), o cualquier otra molécula con la misma especificidad que el anticuerpo de la invención. Los anticuerpos de cadena sencilla se forman enlazando los fragmentos de cadena pesada y liviana en la región Fv a través de un puente de aminoácido, dando como resultado un polipéptido de cadena sencilla. Pueden usarse técnicas para ensamblaje de fragmentos de Fv funcionales en E. coli (Skerra et al., 1988, Science 242:1038-1041).

En otros ejemplos, la divulgación provee proteínas de fusión de las inmunoglobulinas de la invención (o fragmentos funcionalmente activos de las mismas), por ejemplo en las cuales la inmunoglobulina es fusionada a través de un enlace covalente (por ejemplo, un enlace peptídico), bien sea el terminal N o el terminal C de una secuencia de aminoácidos de otra proteína (o porción de la misma, preferiblemente una porción de al menos 10, 20 o 50 aminoácidos de la proteína) que no es la inmunoglobulina. Preferiblemente la inmunoglobulina, o un fragmento de la misma, esta enlazada covalentemente a la otra proteína en el terminal N del dominio constante. Como se estableció más arriba, tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación, incrementar la vida media in vivo y potenciar el suministro de un antígeno a través de una barrera epitelial al sistema inmune.

Las inmunoglobulinas de la invención incluyen análogos y derivados que son modificados, esto es, por la unión covalente de cualquier tipo de molécula en tanto tal unión covalente no impida el enlazamiento inmunoespecífico. Por ejemplo, pero no a manera de limitación, los derivados y análogos de las inmunoglobulinas incluyen aquellos que han sido modificados adicionalmente, por ejemplo, por glicosilación, acetilación, pegilación, fosfilación, amidación, derivación por grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolítica, enlazamiento a un ligando celular u otra proteína, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas puede llevarse a cabo por técnicas conocidas, incluyendo, pero no limitándose a escisión química, acetilación, formilación, etc. Adicionalmente, el análogo o derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.

Los anticuerpos anteriores pueden ser utilizados en métodos conocidos en el arte con relación a la localización y actividad de OGTA076, por ejemplo, para generar imágenes de esta proteína, medir niveles de la misma en muestras fisiológicas apropiadas, en métodos de diagnóstico, etc.

Producción de Aficuerpos a OGTA076

Las moléculas de Aficuerpos representan una nueva clase de proteínas de afinidad basadas en un dominio de proteína de 58 residuos de aminoácidos, derivado de uno de los dominios de enlazamiento de IgG de la proteína A de estafilococos. Este domino en has de tres hélices ha sido utilizado como armazón para la construcción de genotecas de fagémidos combinacionales, a partir de los cuales las variantes Aficuerpo que apuntan a las moléculas deseadas pueden seleccionarse utilizando la tecnología de despliegue de fagos (Nord K, Gunneriusson E, Ringdahl

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J, Stahl S, Uhlen M, Nygren PA, Binding proteins selected from combinatorial libraries of an α-helical bacterial receptor domain, Nat Biotechnol 1997;15:772-7. Ronmark J, Gronlund H, Uhlen M, Nygren PA, Human immunoglobulin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A, Eur J Biochem 2002;269:264755.). La estructura simple, robusta de las moléculas Aficuerpo en combinación con su bajo peso molecular (6 kDa) las hace adecuadas para una amplia variedad de aplicaciones por ejemplo como reactivos de detección (Ronmark J, Hansson M, Nguyen T, et al, Construction and characterization of Affibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli, J Immunol Methods 2002;261:199-211) y para inhibir las interacciones con el receptor (Sandstorm K, Xu Z, Forsberg G, Nygren PA, Inhibition of the CD28-CD80 co-stimulation signal by a CD28-binding Affibody ligand developed by combinatorial protein engineering, Protein Eng 2003;16:691-7). Detalles adicionales de Aficuerpos y métodos de producción de los mismos pueden obtenerse con referencia a la Patente de los Estados Unidos 5831012.

Los Aficuerpos marcados también pueden ser útiles en aplicación de generación de imágenes para determinar la abundancia de isoformas.

Producción de anticuerpos de dominio OGTA076

Las referencias a anticuerpos aquí abarcan referencias a anticuerpos de dominio. Los anticuerpos de dominio (dAbs) son las unidades de enlazamiento funcionales más pequeñas de los anticuerpos, correspondientes a regiones variables de las cadenas pesada (VH) o liviana (VL) de anticuerpos humanos. Los anticuerpos de dominio tienen un peso molecular de aproximadamente 13 kDa. Domantis han desarrollado una serie de genotecas grandes y altamente funcionales de dAbs VH y VL completamente humanas (más de diez miles de millones de secuencias diferentes en cada genoteca), y utilizan estas genotecas para seleccionar dAbs que sean específicos a las dianas terapéuticas. En contraste con muchos anticuerpos convencionales, los anticuerpos de dominio son bien expresados en sistema bacterianos, de levaduras y de células de mamífero. Detalles adicionales sobre los anticuerpos de dominio y métodos de producción de los mismos pueden obtenerse por referencia a las Patentes de los Estados Unidos 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; 6,696,245; US Serial No. 2004/0110941; Solicitud de Patente Europea No. 1433846 y Patentes Europeas 0368684 & 0616640; WO05/035572, WO04/101790, WO04/081026, WO04/058821, WO04/003019 y WO03/002609.

Producción de nanocuerpos a OGTA076

Los nanocuerpos son proteínas terapéuticas derivadas de anticuerpos que contienen las propiedades estructurales y funcionales únicas de los anticuerpos de cadena pesada de origen natural. Estos anticuerpos de cadena pesada contienen un domino variable sencillo (VHH) y dos dominios constantes (CH2 y CH3). De manera importante, el dominio clonado y aislado VHH es un polipéptido perfectamente estable que aloja la capacidad de enlazamiento a antígeno completa del anticuerpo de cadena pesada original. Los nanocuerpos tienen una alta homología con los dominios VH de los anticuerpos humanos y pueden ser humanizados adicionalmente sin ninguna pérdida de actividad. De forma importante, los nanocuerpos tienen un potencial inmunogénico bajo, lo cual ha sido confirmado en estudios con primates con compuestos candidatos de nanocuerpos.

Los nanocuerpos combinan las ventajas de los anticuerpos convencionales con importantes características de fármacos de molécula pequeña. Como los anticuerpos convencionales, los nanocuerpos muestran alta especificidad a la diana, alta afinidad por su diana y baja toxicidad inherente. Sin embargo, al igual que los fármacos de molécula pequeña pueden inhibir enzimas y tener fácilmente acceso a las hendiduras reptoras. Adicionalmente, los nanocuerpos son extremadamente estables, pueden ser administrados por medios diferentes a la inyección (véase por ejemplo la WO 04/041867) y son fáciles de manufacturar. Otras ventajas de los nanocuerpos incluyen un reconocimiento poco común o epítopos ocultos como resultado de su pequeño tamaño, enlazamiento en cavidades

o sitios activos de dianas proteínicas con alta afinidad y selectividad debido a su tridimensionalidad única, flexibilidad al formato de fármaco, ajuste de la vida media y facilidad y velocidad de descubrimiento de fármacos.

Los nanocuerpos son codificados por genes individuales y son producidos eficientemente en casi todo los huéspedes procariotas y eucariotas, por ejemplo, E. coli (véase, por ejemplo US 6,765,087), mohos, por ejemplo Aspergillus o Trichoderma) y levaduras (por ejemplo Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula o Pichia) (véase por ejemplo la US 6,838,254). El proceso de producción es escalable y han sido producidas cantidades de multikilogramos. Puesto que los nanocuerpos exhiben una estabilidad superior en comparación con los anticuerpos convencionales, pueden ser formulados como una solución de vida útil larga, lista para el uso.

El método de nanoclón (véase, por ejemplo la WO 06/079372) es un método original para la generación de nanocuerpos contra una diana deseada, con base en una selección exhaustiva automatizada de células B.

Producción de unicuerpos para OGTA076

Un unicuerpo es una nueva tecnología de anticuerpos original que crea un formato de anticuerpo estable, más pequeño con una ventana terapéutica más larga anticipada que los formatos de anticuerpos pequeños corrientes.

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Los anticuerpos de IgG4 se consideran inertes y así no interactúan con el sistema inmune. Genmab modificó los anticuerpos IgG4 completamente humanos eliminando la región bisagra del anticuerpo. A diferencia del anticuerpo IgG4 de tamaño completo, el fragmento de molécula media es muy estable y se denomina un unicuerpo. Al dividir por la mitad la molécula de IgG4 se deja solamente un área del unicuerpo que puede enlazarse a dianas de enfermedades y el unicuerpo por lo tanto se enlaza de manera univalente a solamente un sitio sobre las células diana. Este enlazamiento univalente no estimula que las células cancerosas crezcan como podrían hacerlo los anticuerpos bivalentes y abre la puerta al tratamiento de algunos tipos de cáncer que los anticuerpos ordinarios no pueden tratar.

El unicuerpo tiene aproximadamente la mitad del tamaño de un anticuerpo IgG4 regular. Este tamaño pequeño puede ser de gran beneficio cuando se tratan algunas formas de cáncer, permitiendo una mejor distribución de la molécula a lo largo de tumores sólidos más grandes y potencialmente incrementando su eficacia.

Las Fabs típicamente no tienen una vida media muy larga. Los unicuerpos, sin embargo, fueron eliminados a una rata similar a los anticuerpos IgG4 completos y fueron capaces de enlazarse así como los anticuerpos completos y los fragmentos de anticuerpos en estudios preclínicos. Otros anticuerpos trabajan primariamente matando las células diana mientras que los unicuerpos solamente inhiben o silencian las células.

Pueden obtenerse detalles adicionales de los unicuerpos con referencia a la Patente WO2007/059782.

Expresión de reactivos de afinidad

Expresión de anticuerpos

Los anticuerpos de la invención pueden ser producidos por cualquier método conocido en el arte para la síntesis de anticuerpos, en particular, por síntesis química o por expresión recombinante, y son producidos preferiblemente por técnicas de expresión recombinante.

La expresión recombinante de anticuerpos, o fragmentos, derivados o análogos de los mismos, requiere la construcción de un ácido nucleico que codifica el anticuerpo. Si la secuencia de nucleótidos del anticuerpo es conocida, puede ensamblarse un ácido nucleico que codifica el anticuerpo a partir de oligonucleótidos sintetizados químicamente (por ejemplo como lo describe Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242), lo cual, en resumen, involucra la síntesis de oligonucleótidos superpuestos que contienen porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, fusionando y ligando estos oligonucleótidos, y luego la amplificación de los oligonucleótidos ligados por PCR.

Alternativamente, el ácido nucleico que codifica el anticuerpo puede ser obtenido clonando el anticuerpo. Si un clon que contiene el ácido nucleico que codifica el anticuerpo particular no está disponible, pero la secuencia de la molécula de anticuerpo es conocida, puede obtenerse un ácido nucleico que codifica el anticuerpo a partir de una fuente adecuada (por ejemplo, una genoteca de ADNc del anticuerpo, o una genoteca de ADNc generada de cualquier tejido o células que expresen el anticuerpo) para purificación por PCR utilizando cebadores sintético hibridables en los extremos 3ʼ y 5ʼ de la secuencia o por clonación utilizando una sonda de oligonucleótidos específica para la secuencia genética particular.

Si una molécula de anticuerpo que reconoce específicamente un antígeno particular no está disponible (o una fuente para una genoteca de ADNc para clonar un ácido nucleico que codifique tal anticuerpo), los anticuerpos específicos para un antígeno particular pueden ser generados por cualquier método conocido en el arte, por ejemplo, inmunizando un animal, tal como un conejo, para generar anticuerpos policlonales o, más preferiblemente generando anticuerpos monoclonales. Alternativamente, un clon que codifica al menos la porción Fab del anticuerpo puede ser obtenido cribando las genotecas de expresión de Fab (por ejemplo como describe Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281) para clones de fragmentos de Fab que se enlazan al antígeno específico o cribando genotecas de anticuerpos (véase, por ejemplo, Clackson et al., 1991, Nature 352:624; Hane et al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937).

Una vez que se obtiene un ácido nucleico que codifica al menos el dominio variable de la molécula de anticuerpo, puede ser introducido en un vector que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo (véase, por ejemplo, la Publicación PCT WO 86/05807; la Publicación PCT WO 89/01036 y la Patente de los Estados Unidos No. 5,122,464). Los vectores que contienen la cadena liviana o pesada completa para la coexpresión con el ácido nucleico para permitir la coexpresión de una molécula de anticuerpo completo también están disponibles. Entonces, el ácido nucleico que codifica el anticuerpo puede ser usado para introducir las sustituciones o eliminaciones de nucleótidos necesarias para sustituir (o eliminar) el uno o más residuos de cisteína de la región variable que participan en un puente de disulfuro intracadena con un residuo de aminoácidos que no contiene un grupo sulfhidrilo. Tales modificaciones pueden llevarse a cabo por cualquier método conocido en el arte para la introducción de mutaciones o eliminaciones específicas en una secuencia de nucleótidos, por ejemplo, pero

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no limitándose a, mutagénesis química, mutagénesis dirigida al sitio in vitro (Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551), métodos basados en PCT, etc.

Además, pueden utilizarse técnicas desarrolladas para la producción de “anticuerpos quiméricos” (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454) empalmando genes de una molécula de anticuerpo de ratón de especificidad antígeno apropiada junto con genes de una molécula de anticuerpo humana de actividad biológica apropiada. Como se describió más arriba, un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual diferentes porciones son derivadas de diferentes especies animales, tales como aquellas que tienen una región variable derivada de un mAb murínico y una región constante de anticuerpo humano, por ejemplo, anticuerpos humanizados.

Una vez que un ácido nucleico que codifica una molécula de anticuerpo de la invención ha sido obtenido, el vector para la producción de la molécula de anticuerpo puede ser producido por tecnología de ADN recombinante utilizando técnicas bien conocidas en el arte. Así, se describen aquí métodos para preparar la proteína de la invención expresando ácido nucleico que contiene las secuencias de la molécula de anticuerpo. Los métodos que son bien conocidos para los experimentados en el arte pueden ser utilizados para construir vectores de expresión que contienen una molécula de anticuerpo que codifica secuencias y señales de control transcripcionales y de traducción apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrok et al., (1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) y Ausubel et al. (eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY).

El vector de expresión es transferido a una célula huésped por técnicas convencionales y las células transfectadas son cultivadas entonces por técnicas convencionales para producir un anticuerpo de la invención.

Las células huésped usadas para expresar un anticuerpo recombinante de la invención pueden ser bien células bacterianas tales como Escherichia coli, o, preferiblemente, células eucariotas, especialmente para la expresión de la molécula de anticuerpo recombinante entera. En particular, células de mamíferos tales como células de ovario de hámster chino (CHO), en conjunción con un vector tal como el elemento promotor del gen temprano intermediario principal para citomegalovirus humano son un sistema de expresión efectivo para anticuerpos (Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Tecnology 8:2).

Puede utilizarse una variedad de sistemas de vector de expresión en huéspedes para expresar una molécula de anticuerpo de la invención. Tales sistemas de expresión de huéspedes representan vehículos mediante los cuales la secuencias de codificación de interés pueden ser producidas y subsecuentemente purificadas, pero también representa células que pueden, cuando se transforman o transfectan con la secuencia de codificación de nucleótidos apropiadas, expresan la molécula de anticuerpo de la invención in situ. Incluyen pero no se limitan a microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B.subtilis) transformadas con bacteriófago recombinante ADN, vectores de expresión de ADN de plásmidos o de ADN de cósmidos que contienen secuencias de codificación de anticuerpos; levaduras (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadas con vectores de expresión recombinantes en levadura que contienen secuencias de codificación de anticuerpos; sistemas celulares de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, baculovirus) que contienen las secuencias de codificación de anticuerpos; sistemas celulares vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus mosaico de la coliflor, CaMV, virus mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión en plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen secuencias de codificación de anticuerpos; o sistemas celulares de mamíferos (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, 293, 3T3) que alojan constructos de expresión recombinante que contienen promotores derivados del genoma de células de mamíferos (por ejemplo, promotor de la metalotioneína) a partir de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor de virus de vaccinia de 7.5K).

En sistemas bacterianos, una serie de vectores de expresión pueden ser seleccionada ventajosamente dependiendo del uso previsto para la molécula de anticuerpo que está siendo expresada. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de tal proteína, para la generación de composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de anticuerpo, puede ser deseable vectores que dirijan la expresión de altos niveles de productos de proteína de fusión que son purificados fácilmente. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791) en el cual la secuencia de codificación del anticuerpo puede ser ligada individualmente al vector en marco con la región de modificación lac Z de tal manera que se produzca una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); y similares. Los vectores pGEX también pueden ser utilizados para expresar polipéptidos foráneos como proteínas de fusión con glutationa S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden ser purificadas fácilmente a partir de células lisadas por adsorción y enlazamiento a una matriz de perlas de glutationa-agarosa seguida por elusión en la presencia de glutationa libre. Los vectores pGEX son diseñados para incluir sitios de escisión de trombina o factor Xa proteasa de tal manera que el producto genético diana clonado pueda ser liberado de la unidad estructural de GST.

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En un sistema en insectos, el virus de polihedrosis nuclear Autographa califórnica (AcNPV) como vector para expresar genes foráneos. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. El anticuerpo que codifica la secuencia puede ser clonado individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo el gen de polihedrina) del virus y colocado bajo control de un promotor AcNPV (por ejemplo el promotor de polihedrina). En células huésped de mamíferos, puede utilizarse una serie de sistemas de expresión basados en virus (por ejemplo un sistema de expresión de adenovirus).

Como se discutió más arriba, una cepa de células huésped puede ser escogida de manera que module la expresión de secuencias insertadas, o modifique y procese el producto genético en la forma específica deseada. Tales modificaciones (por ejemplo glicosilación) y procesamiento (por ejemplo escisión) de productos proteínicos pueden ser importantes para la función de la proteína.

Para la producción a largo plazo con alto rendimiento de anticuerpos recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, pueden producirse líneas celulares que expresen de manera estable un anticuerpo de interés transfectando las células con un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos del anticuerpo y la secuencia de nucleótidos de un seleccionable (por ejemplo neomicina o higromicina) y seleccionando la expresión del marcador seleccionable. Tales líneas celulares modificadas pueden ser útiles particularmente en la criba y evaluación de compuestos que interactúan directa o indirectamente con la molécula de anticuerpo.

Los niveles de expresión de la molécula de anticuerpo pueden ser incrementados por amplificación con vector (para una revisión, véase Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol.3. (Academic Press, New York, 1987)). Cuando un marcador en el sistema de vector que expresa el anticuerpo es amplificable, un incremento en el nivel del inhibidor presente en el cultivo de la célula huésped incrementará el número de copias del gen marcador. Puesto que la región amplificada está asociada con el gen del anticuerpo, la producción del anticuerpo también se incrementará (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257).

La célula huésped puede ser cotransfectada con dos vectores de expresión de la divulgación, codificando el primer vector un polipéptido derivado de cadena pesada y codificando el segundo vector un polipéptido derivado de cadena liviana. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten la expresión igualada de los polipéptidos de cadena pesada y liviana. Alternativamente, puede usarse un vector individual que codifica ambos polipéptidos de cadena pesada y liviana. En tales situaciones, la cadena liviana debería ser colocada antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197). Las secuencias de codificación para las cadenas pesada y liviana puede comprender ADNc o ADN genómico.

Una vez que la molécula de anticuerpo de la invención ha sido expresada de forma recombinante, puede ser purificada por cualquier método conocido en el arte para purificación de una molécula de anticuerpo, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad tal como con proteína A o antígeno específico, y cromatografía en columna por tamaño), centrifugación. Solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas.

Alternativamente, cualquier proteína de fusión puede ser purificada fácilmente utilizando un anticuerpo específico para la proteína de fusión que está siendo expresada. Por ejemplo, un sistema descrito por Janknecht et al., permite la purificación rápida de proteínas de fusión no desnaturalizadas expresadas en líneas celulares humana (Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-897). En este sistema, el gen de interés es subclonado en un plásmido de recombinación de vaccinia de tal manera que el marco de lectura abierto del gen es fusionado por traslación a una etiqueta terminal amino que consiste de seis residuos de histidina. La etiqueta sirve como dominio de enlazamiento a matriz para la proteína de fusión. Los extractos de células infectadas con el virus de vaccinia recombinante son cargadas sobre columnas de Ni2+ ácido nitriloacético-agarosa y las proteínas etiquetadas con histidina son eluidas selectivamente con reguladores que contienen imidazol.

Los anticuerpos que son generados por estos métodos pueden ser seleccionados entonces por una primera criba en cuanto a la afinidad y especificidad con el polipéptido purificado de interés y, si se requiere, comparando los resultados con la afinidad y especificidad de los anticuerpos con polipéptidos que se desean excluir del enlazamiento. El procedimiento de criba puede involucrar la inmovilización de los polipéptidos purificados en pozos separados de las placas de microtitulación. La solución que contiene un anticuerpo o grupos de anticuerpos potenciales es colocado entonces en los pozos de microtitulación respectivos e incubados durante aproximadamente 30 minutos hasta 2 horas. Los pozos de microtitulación son lavados entonces y se agrega un anticuerpo secundario marcado (por ejemplo, un anticuerpo anti-ratón conjugado a fosfatasa alcalina si los anticuerpos surgidos son anticuerpos de ratón) a los pozos e incubados durante aproximadamente 30 minutos y luego lavados. Se agrega sustrato a los pozos y aparecerá una reacción con color donde el anticuerpo del polipéptido inmovilizado está presente.

Los anticuerpos así identificados pueden ser analizados posteriormente en cuanto a la afinidad y especificidad en el

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diseño de ensayo seleccionado. En el desarrollo de inmunoensayos para una proteína diana, la proteína diana purificada actúa como un estándar con el cual juzgar la sensibilidad y especificidad del inmunoensayo utilizando los anticuerpos que han sido seleccionados. Debido a que la afinidad a enlazamiento de diversos anticuerpos puede diferir, ciertos pares de anticuerpos que (por ejemplo en ensayos en sándwich) pueden interferir con otro estéricamente, etc., el rendimiento del ensayo de un anticuerpo puede ser una medida más importante que la afinidad y especificidad absolutas de un anticuerpo.

Los experimentados en el arte reconocerán que muchas metodologías pueden abordarse en la producción de anticuerpos o fragmentos de enlazamiento y en la criba y selección en cuanto a afinidad y especificidad para los diversos polipéptidos, pero estas metodologías no cambian el alcance de la invención.

Para aplicaciones terapéuticas, los anticuerpos (particularmente anticuerpos monoclonales) pueden ser adecuadamente humanos o animales humanizados (por ejemplo, ratón). Los anticuerpos animales pueden ser obtenidos en animales utilizando la proteína humana (por ejemplo OGTA076) como inmunógeno. La humanización involucra típicamente el injerto de CDR identificados de esta manera en regiones marco humanas. Normalmente se requiere una retromutacion subsecuente para optimizar la conformación de las cadenas. Tales procesos son conocidos por personas experimentadas en al arte.

Expresión de Aficuerpos

La construcción de aficuerpos ha sido descrita en otros lugares ((Ronnmark J, Gronlund H, Uhle’ n, M., Nygren P.A°, Human immunoglobulin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A, 2002, Eur. J. Biochem. 269, 2647-2655.), incluyendo la construcción de genotecas de despliegue de fagos aficuerpo (Nord, K., Nilsson, J., Nilsson, B., Uhle’ n, M. & Nygren, P.A, A combinatorial library of an a-helical bacterial receptor domain, 1995, Protein Eng. 8, 601-608. Nord, K., Gunneriusson, E., Ringdahl, J., Stahl, S., Uhle’ n, M. & Nygren, P.A, Binding proteins selected from combinatorial libraries of an a-helical bacterial receptor domain, 1997, Nat. Biotechnol.15, 772-777.)

Los análisis por biosensor para investigar las variantes de aficuerpo óptimas utilizando estudios de enlazamiento de biosensores también han sido descritos en otros lugares (Ronnmark J, Gronlund H, Uhle’ n, M., Nygren P.A, Human immunoglobulin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A, 2002, Eur. J. Biochem. 269, 2647-2655).

Modificaciones en los reactivos de afinidad

En una realización, los reactivos de afinidad anti-OGTA076 tales como anticuerpos o fragmentos de los mismos son conjugados a una unidad estructural de diagnóstico (tal como un marcador detectable) o una unidad estructural terapéutica. Los anticuerpos pueden ser usados para diagnóstico o para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede ser facilitada acoplando el anticuerpo a una sustancia detectable (marcador). Ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, núclidos radiactivos, metales emisores de positrones (para uso en tomografía por emisión de positrones) e iones metálicos paramagnéticos no radioactivos. Véase en general la Patente de los Estados Unidos No. 4,741,900, para iones metálicos que pueden ser conjugados a anticuerpos como uso diagnóstico de acuerdo con la presente invención. Enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina, avidina y biotina; materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotiazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo y ficoeritrina; materiales luminiscentes adecuados incluyen luminol; materiales bioluminiscentes adecuados incluyen luciferasa, luciferina y aecuerina; y núclidos radioactivos adecuados incluyen 125I, 131I, y 111In y 99Tc. El 68Ga también puede ser empleado.

Los anticuerpos anti-OGTA076 o fragmentos de los mismos así como otros reactivos de afinidad pueden ser conjugados a un agente terapéutico o unidad estructural de fármaco para modificar una respuesta biológica dada. Un agente terapéutico de ejemplo al cual el reactivo de afinidad puede ser conjugado es una unidad estructural citotóxica. El agente terapéutico o unidad estructural de fármaco no debe considerarse como limitado a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la unidad estructural de fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, o toxinas de difteria; una proteína tal como un factor de necrosis tumoral, alfainterferón, beta-interferón, factor de crecimiento de nervios, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador de plasminógeno de tejidos, un agente trombótico o un agente antiangiogénico, por ejemplo, angiestatina o endostatina; o, un modificador de la respuesta biológica tal como una linfoquina, interleucina-1 (IL-1) interleucina-2 (IL2), interleucina-6 (IL-6), factor estimulador de colonias de macrófagos de granulocitos (GM-CSF), factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento de nervios (NGF) u otro factor de crecimiento.

Las técnicas para conjugar tal unidad estructural de agentes terapéuticos a anticuerpos son bien conocidas, véase

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por ejemplo Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).

Alternativamente, un anticuerpo puede ser conjugado a un segundo anticuerpo para formar un hetoroconjugado de anticuerpos tal como lo describe Segal en la Patente de los Estados Unidos No. 4,676,980.

Un anticuerpo con o sin una unidad estructural terapéutica conjugada al mismo puede ser utilizado como un agente terapéutico que es administrado solo o en combinación con factores citotóxicos y/o citoquinas.

La invención también provee anticuerpos completamente humanos o humanizados para inducir citotoxicidad mediada por células dirigida a anticuerpos (ADCC). Un anticuerpo completamente humano es aquel en el cual las secuencias de proteínas son codificadas por secuencias de inmunoglobulina humana de origen natural, bien sea a partir de linfocitos B humanos productores de anticuerpos aislados o a partir de linfocitos B murínicos transgénicos de ratones en los cuales la inmunoglobulina murínica que codifica regiones cromosómicas ha sido reemplazada por secuencias humanas ortólogas. Los anticuerpos transgénicos de este último tipo incluyen, pero no se restringen a, HuMab (Medarex, Inc, CA) y Xenomouse (Abgenix Inc., CA). Un anticuerpo humanizado es aquel en el cual la región constante de una molécula de anticuerpo no humana de especificidad a antígeno apropiada, es reemplazada por la región constante de un anticuerpo humano, por ejemplo del subtipo IgG, con funciones efectoras apropiadas (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454). Funciones efectoras apropiadas incluyen ADCC, la cual es un proceso natural mediante el cual los anticuerpos completamente humanos o los anticuerpos humanizados, cuando se unen a dianas sobre la superficie de las células cancerosas, conmutan las propiedades de matanza celular de los linfocitos que son parte del sistema inmune normal. Estos linfocitos activos, denominados células asesinas naturales (NK), utilizan un proceso citotóxico para destruir células vivas a las cuales están enlazados los anticuerpos. La actividad ADCC puede ser detectada y cuantificada midiendo la liberación de Europium (Eu3+) de células vivas marcadas con Eu3+ en la presencia de un anticuerpo específico para el antígeno y células mononucleares de sangre periférica extraídas de un sujeto humano vivo inmunocompetente. El proceso ADCC esta descrito en detalle en Janeway Jr. C.A. et al., Immunobiology, 5th ed., 2001, Garland Publishing, ISBN 0-8153-3642-X; Pier G.B. et al., Immunology, Infection, and Immunity, 2004, p246-5; Albanell J. et al., Advances in Experimental Medicine and Biology, 2003, 532:p2153-68 y Weng, W.-K. et al., Journal of Clinical Oncology, 2003, 21:p 3940-3947. Métodos adecuados para la detección y cuantificación de ADCC pueden ser encontrados en Blomberg et al., Journal of Immunological Methods. 1986, 86:p225-9; Blomberg et al., Journal of Immunological Methods. 1986, 21;92:p117-23 y Patel & Boyd, Journal of Immunological Methods. 1995, 184:p29-38.

El ADCCC involucra típicamente la activación de células NK y depende del reconocimiento de células recubiertas con anticuerpo por receptores Fc sobre la superficie de la célula NK. Los receptores Fc reconocen la porción Fc (cristalina) de los anticuerpos tales como IgG, enlazados específicamente a la superficie de una célula diana. El receptor Fc que dispara la activación de la célula NK se denomina CD16 o FcγRIIIa. Una vez que el receptor FcγRIIIa esta enlazado a la IgG Fc, la célula NK libera citoquinas tales como IFN-γ, y gránulos citotóxicos que contienen perforina y granzimas para entrar a la célula diana y promover la muerte celular disparando la apoptosis.

La inducción de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) por un anticuerpo puede ser potenciada por modificaciones que alteran las interacciones entre la región constante del anticuerpo (Fc) y diversos receptores que están presentes sobre la superficie de células del sistema inmune. Tales modificaciones incluyen la reducción o ausencia de unidades estructurales de fucosa enlazadas por alfa 1,6 en las cadenas de oligosacárido complejas que son agregadas nuevamente al Fc de los anticuerpos durante la síntesis natural o recombinante en células de mamíferos. En una realización, se producen reactivos de afinidad no fucosilados anti-OGTA076 tales como anticuerpos o fragmentos de los mismos para el propósito de potenciar su capacidad para inducir la respuesta ADCC.

Las técnicas para reducir o recortar las unidades estructurales de fucosa enlazadas por alfa 1,6 en las cadenas de oligosacáridos del Fc están bien establecidas. En un ejemplo, el anticuerpo recombinante es sintetizado en una línea celular que está impedida en su capacidad de agregar fucosa en un enlace alfa 1,6 en la N-acetilglucosamina más interna de los oligosacáridos Fc del tipo complejo bicatenario enlazado en N. Tales líneas celulares incluyen, pero no se limitan a, el hibridoma de ratas YB2/0, el cual expresa un nivel reducido del gen alfa 1,6-fucosil transferasa, FUT8. Por ejemplo, el anticuerpo es sintetizado en una línea celular que es incapaz de agregar unidades estructurales fucosilo enlazadas en alfa 1,6 a cadenas de oligosacáridos complejas, debido a la eliminación de ambas copias del gen FUT8. Tales líneas celulares incluyen, pero no se limitan a, líneas celulares FUT8-/-CHO/DG44. Las técnicas para sintetizar anticuerpos parcialmente fucosilados o no fucosilados y reactivos de

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afinidad están descritos en Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278:3466-34735 (2003); Yamane-Ohnuki et al., Biotechnology and Bioengineering 87: 614-22 (2004) y en WO00/61739 A1, WO02/31140 A1 y WO03/085107 A1. En un segundo ejemplo, la fucosilación de un anticuerpo recombinante es reducida o abolida por síntesis en una línea celular que ha sido modificada genéticamente para sobreexpresar una glicosil transferasa que modifica glicoproteínas a un nivel que maximiza la producción de oligosacáridos complejos enlazados por N que portan Nacetilglucosamina bisectante. Por ejemplo, el anticuerpo es sintetizado en una línea celular de ovarios de hámster chino que expresa la enzima N-acetl glucosamina transferasa III (GnT III). Las líneas celulares transfectadas de manera estable con las glicosil transferasas que modifican las glicoproteínas adecuadas, y métodos para sintetizar anticuerpos en estas células están descritas en WO9954342.

Un anticuerpo no fucosilado o un reactivo de afinidad pueden ser utilizados como un agente terapéutico que se administra solo o en combinación con factores citotóxicos y/o citoquinas.

En una modificación adicional, las secuencias de aminoácidos del anticuerpo Fc son alteradas de la manera que potencian la activación de ADCC, sin afectar la afinidad del ligando. Ejemplos de tales modificaciones están descritos en Lazar et al., Proceedings of the National Academy of Sciences 2006, 103:p4005-4010; WO03074679 y WO2007039818. En estos ejemplos, la sustitución de aminoácidos en el anticuerpo Fc, tal como aspartato porcerina en la posición 239, e isoleucina por glutamato en la posición 332, alteró la afinidad de enlazamiento de un anticuerpo por los receptores de Fc, llevando un incremento en la activación de ADCC.

Un reactivo anticuerpo con activación de ADCC potenciada debido a la sustitución de aminoácidos puede ser utilizado como un agente terapéutico que se administra solo o en combinación con factores citotóxicos y/o citoquinas.

Diagnóstico de cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, leucemia linfoide (particularmente leucemia linfocítica crónica), cáncer ovárico o cáncer pancreático

De acuerdo con la presente divulgación, las muestras de prueba de tejido colorrectal, riñón, hígado, pulmón, linfoide, ovárico o pancreático, suero, plasma u orina obtenidos de un sujeto del que se sospecha tiene o se sabe que tiene cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, leucemia linfoide (particularmente leucemia linfocítica crónica), cáncer ovárico o cáncer pancreático pueden ser utilizadas para diagnóstico o monitorización. En un ejemplo, un cambio en la abundancia de OGTA076 en una muestra de prueba con respecto a una muestra de control (de un sujeto o sujetos libres de cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, leucemia linfoide (particularmente leucemia linfocítica crónica), cáncer ovárico o cáncer pancreático) o un rango de referencia previamente determinado indica la presencia de cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, leucemia linfoide (particularmente leucemia linfocítica crónica), cáncer ovárico o cáncer pancreático. En otro ejemplo, la abundancia relativa de OGTA076 en una muestra de prueba en comparación con una muestra de control o con un rango de referencia previamente determinado indica un subtipo de cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, leucemia linfoide (particularmente leucemia linfocítica crónica), cáncer ovárico o cáncer pancreático (por ejemplo cáncer colorrectal familiar o esporádico, carcinoma fibrolamelar hepatocelular, carcinoma escamoso de células pulmonares, leucemia linfocítica crónica de células T, adenocarcinoma seroso papilar maligno o tumores endocrinos del páncreas). Es aún otro ejemplo, la abundancia relativa de OGTA076 en una muestra de prueba con respecto a una muestra de control o un rango de referencia previamente determinado indica el grado o severidad de cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, leucemia linfoide (particularmente leucemia linfocítica crónica), cáncer ovárico o cáncer pancreático (por ejemplo la probabilidad de metástasis). En cualquiera de los métodos antes citados, la detección de OGTA076 puede ser combinada opcionalmente con la detección de uno o más biomarcadores adicionales para cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, leucemia linfoide (particularmente leucemia linfocítica crónica), cáncer ovárico o cáncer pancreático. Cualquier método adecuado en el arte puede ser empleado para medir el nivel de OGTA076, incluyendo pero no limitándose a las tecnologías preferidas descritas aquí, ensayos de quinasa, inmunoensayos para detectar y/o visualizar el OGTA076 (por ejemplo, inmunoprecipitación western, inmunoprecipitación seguida por electroforesis en gel con dodecil sulfato de sodio poliacrilamida, inmunohistoquímica, etc. En un ejemplo adicional, un cambio en la abundancia de ARNm que codifica OGTA076 en una muestra de prueba con una muestra de control o un rango de referencia previamente determinado indica la presencia de cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, leucemia linfoide (particularmente leucemia linfocítica crónica), cáncer ovárico o cáncer pancreático. Cualquier ensayo de hibridación adecuado puede ser utilizado para detectar la expresión de OGTA076 detectando y/o visualizando el ARNm que codifica el OGTA076 (por ejemplo, ensayos Northern, inmunoprecipitación en puntos, hibridación in situ, etc.

En otro ejemplo de la divulgación, pueden utilizarse anticuerpos marcados (u otros reactivos de afinidad), derivados y análogos de los mismos, los cuales se enlazan específicamente a OGTA076 para propósitos de diagnóstico para detectar, diagnosticar y monitorizar cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, leucemia linfoide (particularmente leucemia linfocítica crónica), cáncer ovárico o cáncer pancreático. Preferiblemente, el cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, leucemia linfoide (particularmente leucemia linfocítica crónica), cáncer ovárico o cáncer pancreático se detectan en un animal, más

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Carcinoma de vejiga: Glioblastoma Cáncer de ovario

Cáncer de mama: Hepatoblastoma Cáncer pancrático

Enfermedades de mama, benignas: Hipertensión Cáncer de próstata

Linfoma de Burkitt: Focos lactacionales Enfermedades prostáticas, benignas

Bursitis: Cáncer de riñón Prostatitis

Cáncer no especificado: Leucemia, no especificada Retinoblastoma

Cáncer de cérvix: Cáncer de hígado Esquizofrenia

Leucemia linfocítica crónica: Cirrosis de hígado Úlcera de piel

Enfermedad pulmonar obstructiva crónica: Cáncer de pulmón Fumadores

Cáncer colorrectal: Linfoma, histiocitico Teratocarcinoma

Demencia, vascular: Melanoma

Depresión: Síndrome metabólico X

Localización subcelular

Gránulos de Birbeck: Membrana Secretado

Digestión de superficie celular: Fracción de enlazamiento a glicoproteínas de membrana Fracción soluble

Fracción de cromatina: Mitocondria Sobrenadante

Membrana celular cruda: Núcleo Célula entera

Citosol: Perosixomas

Golgi/Mitocondrias: Membrana de plasma

La figura 2 muestra el Protein Index para OGTA076 que es alto en cáncer colorrectal, medio en leucemia linfocítica

5 crónica, medio en cáncer de riñón, bajo en cáncer de hígado, alto en cáncer de pulmón, medio en cáncer de ovario y bajo en cáncer pancreático membrana de plasma y muy bajo en membrana de plasma normal y membrana. El OGTA076 no fue detectado en ninguna otra enfermedad. Esto indica que el OGTA076 es potencialmente un buen marcador para cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, leucemia linfocítica crónica, cáncer de ovario y cáncer pancreático.

10 Ejemplo 2: Identificación de proteínas de membrana expresadas en cáncer colorectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón o cáncer de ovario en muestras de sangre y tejido

Usando el siguiente Protocolo de Referencia, las proteínas de membrana extraídas de muestras de tejido de cáncer colorectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón o cáncer de ovario y muestras de tejido adyacente colorrectal, de riñón, de hígado, de pulmón y de ovario, fueron digeridas, marcadas con reactivos de Tagging for

15 Absolute & Relative Quantitation (iTRAQ; Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos) y los péptidos resultantes fueron secuenciados por espectrometría de masas en tándem.

2.1 Materiales y métodos

2.1.1-Fraccionamiento de membrana de plasma

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El proceso descrito en el Ejemplo 1 sección 1.1.6 fue empleado para discriminar las proteínas asociadas con cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón y cáncer de ovario en las muestras experimentales.

2.2 Resultados

5 Estos experimentos identificaron OGTA076, en sus tres isoformas diferentes, como se describe aquí adicionalmente. El OGTA076 de longitud completa fue detectado en la membrana de plasma de muestras de cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón y cáncer de ovario. El análisis con iTRAQ mostró que los niveles de OGTA076 en las muestras de cáncer fueron más altos que en las muestras de tejido adyacente normales correspondientes.

10 La figura 2 muestra el Protein Index para OGTA076. Véase Ejemplo 1 sección 1.2 para una descripción del Protein Index para OGTA076.

A lo largo de la especificación y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera otra cosa, la palabra “comprenden” y variaciones tales como “comprende” y “que comprende” se entenderán con la implicación de la inclusión de un entero establecido, etapa, grupo de enteros o grupo de etapas pero no la exclusión de ningún otro

15 entero, etapa, grupo de enteros o grupo de etapas.

Secuencia: Seq . ID

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AANDPFTIVHGNTGK: 4

AFSSDLISIHSLADVEVVVTK: 5

CEHHSLYGAAR: 6

CLGLDITK: 7

CSMLIASNETWKK: 8

DGAICYKPTK: 9

DGHGTAISNASDVWKK: 10

DVDSCGEYNWATVGGRRR: 11

EEVWIGLK: 12

EFIYLRPFACDTK: 13

EGIAK: 14

ELTYSNFHPLLVSGR: 15

ENNNITMR: 16

EVKPVDSVK: 17

FEQEYLNDLMK: 18

FPVTFGEECLYMSAK: 19

GNCEVSSVEGTLCK: 20

GWHFYDDR: 21

HDHSATIVSIK: 22

HFVSLCQK: 23

HGETCYK: 24

HMATTQDEVHTK: 25

IANISGDGQK: 26

IEMVDYK: 27

IIPK: 28

IPENFFEEESR: 29

ISEWPIDDHFTYSR: 30

KGNCEVSSVEGTLCK: 31

KRNWEEAER: 32

KVECEHGFGR: 33

KYFWTGLR: 34

LALK: 35

LFHLHSQK: 36

LHLAGFSSVR: 37

LHNEDIK: 38

LNDASSDK: 39

LNPK: 40

LPFICEK: 41

MCPPDEGWKR: 42

MFSCDSSAMLWWK: 43

MSGPLGPEEASPK: 44

NNSLMWFDK: 45

NWEEAER: 46

QTLQNASETVK: 47

RGWHFYDDR: 48

RHGETCYK: 49

RLHFSR: 50

RNWEEAER: 51

SDQALHSFSEAK: 52

SHILSIR: 53

SNFHPLLVSGR: 54

SPDLQGSWQWSDR: 55

TLTWHSAK: 56

TPDWYNPDR: 57

TPLSYTHWR: 58

TPVSTIIMPNEFQQDYDIR: 59

VECEHGFGR: 60

VFHRPWR: 61

VIEEAVYFHQH: 62

VQCSEQWIPFQNK: 63

WVSQHR: 64

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Claims

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