ES2600354T3 - Acil-ACP reductasa con propiedades mejoradas - Google Patents

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ES2600354T3 ES14716444.6T ES14716444T ES2600354T3 ES 2600354 T3 ES2600354 T3 ES 2600354T3 ES 14716444 T ES14716444 T ES 14716444T ES 2600354 T3 ES2600354 T3 ES 2600354T3
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Abstract

Polipéptido de acil-ACP reductasa (AAR) variante que comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, en el que dicho polipéptido de AAR variante comprende una mutación en la posición de aminoácido 18, en el que la mutación es S18W, y en el que dicho polipéptido de AAR cataliza la conversión de una acil-ACP en un aldehído graso.

Description

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“polinucleótido”, “secuencia de ácido nucleico” y “secuencia de nucleótidos” se usan de manera intercambiable en el presente documento para referirse a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, o bien ARN o bien ADN. Estos términos se refieren a la estructura primaria de la molécula, y por tanto incluyen ADN bi y monocatenario y ARN bi y monocatenario. Los términos incluyen, como equivalentes, análogos de o bien ARN o bien ADN producidos a partir de análogos de nucleótidos y polinucleótidos modificados tales como, aunque no limitados a polinucleótidos metilados y/o de extremos ocupados. El polinucleótido puede estar en cualquier forma, incluyendo pero sin limitarse a, plásmido, viral, cromosómico, EST, ADNc, ARNm y ARNr.
Tal como se usa en el presente documento, los términos “polipéptido” y “proteína” se usan de manera intercambiable para referirse a un polímero de residuos de aminoácido. El término “polipéptido recombinante” se refiere a un polipéptido que se produce mediante técnicas recombinantes, en las que generalmente se inserta ADN o ARN que codifica para la proteína expresada en un vector de expresión adecuado que se usa a su vez para transformar una célula huésped para producir el polipéptido. De manera similar, los términos “polinucleótido recombinante” o “ácido nucleico recombinante” o “recombinante ADN” se producen mediante técnicas recombinantes que conocen los expertos en la técnica.
Tal como se usa en el presente documento, los términos “homólogo” y “homólogo/a” se refieren a un polinucleótido o un polipéptido que comprende una secuencia que es idéntica en al menos aproximadamente el 50 por ciento (%) a la secuencia de polinucleótido o polipéptido correspondiente. Preferiblemente, los polinucleótidos o polipéptidos homólogos tienen secuencias de polinucleótido o secuencias de aminoácidos que tienen una homología de al menos aproximadamente el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o al menos aproximadamente el 99% con la secuencia de aminoácidos o secuencia de polinucleótido correspondiente. Tal como se usa en el presente documento los términos “homología” de secuencia e “identidad” de secuencia se usan de manera intercambiable. Un experto habitual en la técnica conoce métodos para determinar la homología entre dos o más secuencias. En resumen, pueden realizarse cálculos de “homología” entre dos secuencias de la siguiente manera. Las secuencias se alinean para fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico para la alineación óptima y pueden excluirse las secuencias no homólogas para fines de comparación). En una realización preferida, la longitud de una primera secuencia que se alinea para fines de comparación es de al menos aproximadamente el 30%, preferiblemente al menos aproximadamente el 40%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 50%, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente el 60%, y incluso más preferiblemente al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 98% o aproximadamente el 100% de la longitud de una segunda secuencia. Se comparan entonces los residuos de aminoácido o nucleótidos en posiciones de aminoácido
o posiciones de nucleótido correspondientes de las secuencias primera y segunda. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El tanto por ciento de homología entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para la alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y determinación del tanto por ciento de homología entre dos secuencias puede lograrse usando un algoritmo matemático, tal como BLAST (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215(3):403-410). El tanto por ciento de homología entre dos secuencias de aminoácidos también puede determinarse usando el algoritmo de Needleman y Wunsch que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software de GCG, usando o bien una matriz Blossum 62 o bien una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 (Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453). El tanto por ciento de homología entre dos secuencias de nucleótidos también puede determinarse usando el programa GAP en el paquete de software de GCG, usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Un experto habitual en la técnica puede realizar cálculos de homología inicial y ajustar los parámetros del algoritmo en consecuencia. Un conjunto preferido de parámetros (y el que debe usarse si un profesional no está seguro de qué parámetros deben aplicarse para determinar si una molécula está dentro de una limitación de homología de las reivindicaciones) son una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización por hueco de 12, penalización por extensión de hueco de 4 y penalización por hueco con desplazamiento del marco de lectura de 5. Se conocen métodos adicionales de alineación de secuencias en las técnicas biotecnológicas (véase, por ejemplo, Rosenberg (2005) BMC Bioinformatics 6:278; Altschul et al. (2005) FEBS J. 272(20):5101-5109).
El término “se hibrida en condiciones de rigurosidad baja, rigurosidad media, rigurosidad alta o condiciones de rigurosidad muy alta” describe condiciones para la hibridación y el lavado. Puede encontrarse orientación para realizar reacciones de hibridación en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1
6.3.6. Se describen métodos acuosos y no acuosos en esa referencia y puede usarse cualquier método. Condiciones de hibridación específicas a las que se hace referencia en el presente documento son de la siguiente manera: (1) condiciones de hibridación de rigurosidad baja --6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido por dos lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% al menos a 50ºC (la temperatura de los lavados puede aumentarse hasta 55ºC para condiciones de rigurosidad baja); (2) condiciones de hibridación de rigurosidad media --6X SSC a aproximadamente 45ºC, seguido por uno o más lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% a
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puede reducir diversas moléculas de acil-ACP o acil-CoA para dar los alcoholes primarios correspondientes (véanse las publicaciones de patente estadounidense n.os 20100105963 y 20110206630, y la patente estadounidense n.º 8097439). Una composición de alcohol graso incluye a menudo alcoholes grasos junto con otros derivados de ácido graso, por ejemplo, aldehídos grasos y/o ácidos grasos. Normalmente, la composición de alcohol graso se recupera 5 del entorno extracelular de la célula huésped recombinante, es decir, el medio de cultivo celular. En determinadas realizaciones, se modula la expresión de un polipéptido, por ejemplo, una enzima directa o indirectamente implicada en la biosíntesis de ácidos grasos (por ejemplo, se expresa, sobreexpresa o atenúa), en la que tal modulación da como resultado un mayor rendimiento, mayor título o mayor productividad de un derivado de ácido graso de interés, tal como un alcohol graso. La enzima puede estar codificada por un polinucleótido de biosíntesis de ácidos grasos 10 que es exógeno o heterólogo (por ejemplo, un polipéptido que se origina a partir de un organismo distinto de la célula huésped parental, o, una variante de un polipéptido nativo para la célula microbiana parental) o un polipéptido endógeno (por ejemplo, un polipéptido nativo para la célula huésped parental) en el que el polipéptido endógeno se sobreexpresa en la célula huésped recombinante. La tabla 1 proporciona un listado de proteínas a modo de ejemplo que pueden expresarse en células huésped recombinantes para facilitar la producción de composiciones de alcohol
15 graso particulares.
Tabla 1: Designaciones de genes
Designación de gen
Organismo fuente Nombre de enzima N.º de registro Número EC Uso a modo de ejemplo
Aumento de la producción de ácido graso / aumento de la producción de producto
accA
E. coli, lactococos acetil-CoA carboxilasa, subunidad A (carboxiltransferasa alfa) AAC73296, NP_414727 6.4.1.2 aumento de la producción de malonil-CoA
accB
E. coli, lactococos acetil-CoA carboxilasa, subunidad B (BCCP: proteína transportadora de biotina carboxilasa) NP_417721 6.4.1.2 aumento de la producción de malonil-CoA
accC
E. coli, lactococos acetil-CoA carboxilasa, subunidad C (biotina carboxilasa) NP_417722 6.4.1.2, 6.3.4.14 aumento de la producción de malonil-CoA
accD
E. coli, lactococos acetil-CoA carboxilasa, subunidad D (carboxiltransferasa beta) NP_416819 6.4.1.2 aumento de la producción de malonil-CoA
fadD
E. coli W3110 acil-CoA sintasa AP_002424 2.3.1.86, 6.2.1.3 aumento de la producción de ácidos grasos
fabA
E. coli K12 β-hidroxidecanoiltioéster deshidratasa/ isomerasa NP_415474 4.2.1.60 aumento de la producción de acil graso-ACP/CoA
fabB
E. coli 3-oxoacil-[acil-portadorproteína] sintasa I BAA16180 2.3.1.41 aumento de la producción de acil graso-ACP/CoA
fabD
E. coli K12 [proteína transportadora de acilo] S-maloniltransferasa AAC74176 2.3.1.39 aumento de la producción de acil graso-ACP/CoA
fabF
E. coli K12 3-oxoacil-[proteína transportadora de acilo] sintasa II AAC74179 2.3.1.179 aumento de la producción de acil graso-ACP/CoA
fabG
E. coli K12 3-oxoacil-[proteína transportadora de acilo] reductasa AAC74177 1.1.1.100 aumento de la producción de acil graso-ACP/CoA
fabH
E. coli K12 3-oxoacil-[proteína transportadora de acilo] sintasa III AAC74175 2.3.1.180 aumento de la producción de acil graso-ACP/CoA
fabI
E. coli K12 enoil-[proteína transportadora de acilo] reductasa NP_415804 1.3.1.9 aumento de la producción de acil graso-ACP/CoA
fabR
E. coli K12 represor transcripcional NP_418398 ninguna modular la producción de ácidos grasos insaturados
fabV
Vibrio cholerae enoil-[proteína transportadora de acilo] reductasa YP_001217 283 1.3.1.9 aumento de la producción de acil graso-ACP/CoA
fabZ
E. coli K12 (3R)-hidroximiristol-proteína transportadora de acilo deshidratasa NP_414722 4.2.1. aumento de la producción de acil graso-ACP/CoA
fadE
E. coli K13 acil-CoA deshidrogenasa AAC73325 1.3.99.3, 1.3.99. reducir la degradación de ácidos grasos
fadR
E. coli proteína reguladora transcripcional NP_415705 ninguna Bloquear o revertir la degradación de ácidos grasos
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Designación de gen
Organismo fuente Nombre de enzima N.º de registro Número EC Uso a modo de ejemplo
Control de la longitud de cadena
tesA (con o sin secuencia líder)
E. coli tioesterasa – la secuencia líder son los aminoácidos 1-26 POADA1 3.1.2.-, 3.1.1.5 Longitud de cadena C18
tesA (sin secuencia líder)
E. coli tioesterasa AAC73596, NP_415027 3.1.2.-, 3.1.1.5 Longitud de cadena C18:1
tesA (mutante de E. coli tioesterasa I complejado con ácido octanoico)
E. coli tioesterasa L109P 3.1.2.-, 3.1.1.5 Longitud de cadena <C18
fatB1
Umbellularia californica tioesterasa Q41635 3.1.2.14 Longitud de cadena C12:0
fatB2
Cuphea hookeriana tioesterasa AAC49269 3.1.2.14 Longitud de cadena C8:0 C10:0
fatB3
Cuphea hookeriana tioesterasa AAC72881 3.1.2.14 Longitud de cadena C14:0 -C16:0
fatB
Cinnamomum camphora tioesterasa Q39473 3.1.2.14 Longitud de cadena C14:0
fatB
Arabidopsis thaliana tioesterasa CAA85388 3.1.2.14 Longitud de cadena C16:1
fatA1
Helianthus annuus tioesterasa AAL79361 3.1.2.14 Longitud de cadena C18:1
atfata
Arabidopsis thaliana tioesterasa NP_189147, NP_193041 3.1.2.14 Longitud de cadena C18:1
fatA
Brassica juncea tioesterasa CAC39106 3.1.2.14 Longitud de cadena C18:1
fatA
Cuphea hookeriana tioesterasa AAC72883 3.1.2.14 Longitud de cadena C18:1
tesA
Photobacterium profundum tioesterasa YP_130990 3.1.2.14 Longitud de cadena
tesB
E. coli tioesterasa NP_414986 3.1.2.14 Longitud de cadena
fadM
E. coli tioesterasa NP_414977 3.1.2.14 Longitud de cadena
yciA
E. coli tioesterasa NP_415769 3.1.2.14 Longitud de cadena
ybgC
E. coli tioesterasa NP_415264 3.1.2.14 Longitud de cadena
Control del nivel de saturación*
Sfa
E. coli supresor de fabA AAN79592, AAC44390 ninguno aumento de ácidos grasos monoinsaturados
fabA
E. coli K12 β-hidroxidecanoiltioéster deshidratasa/isomerasa NP_415474 4.2.1.60 producir ácidos grasos insaturados
GnsA
E. coli supresores de la mutación nula de secG ABD 18647. 1 ninguno aumento de ésteres de ácidos grasos insaturados
GnsB
E. coli supresores de la mutación nula de secG AAC74076. 1 ninguno aumento de ésteres de ácidos grasos insaturados
fabB
E. coli 3-oxoacil-[proteína transportadora de acilo] sintasa I BAA16180 2.3.1.41 modular la producción de ácidos grasos insaturados
des
Bacillus subtilis D5 acil graso desaturasa O34653 1.14.19 modular la producción de ácidos grasos insaturados
Salida de productos: Producción de ésteres
AT3G51970
Arabidopsis thaliana alcohol de cadena larga Oacil graso transferasa NP_190765 2.3.1.26 producción de cera
ELO1
Pichia angusta ácido graso elongasa BAD98251 2.3.1. producir ácidos grasos de longitud de cadena de muy larga
plsC
Saccharomyces cerevisiae aciltransferasa AAA16514 2.3.1.51 producción de cera
DAGAT/DG
Arabidopsis diacilglicerolaciltransferasa AAF19262 2.3.1.20 producción de cera
22
Designación de gen
Organismo fuente Nombre de enzima N.º de registro Número EC Uso a modo de ejemplo
AT
thaliana
hWS
Homo sapiens acil-CoA cera alcohol aciltransferasa AAX48018 2.3.1.20 producción de cera
aft1
Acinetobacter sp. ADP1 éster de cera bifuncional sintasa/acilCoA:diacilglicerolacil transferasa AAO17391 2.3.1.20 producción de cera
ES9
Marinobacter hydrocarbonoclasticus éster de cera sintasa ABO21021 2.3.1.20 producción de cera
mWS
Simmondsiachi nensis éster de cera sintasa AAD38041 2.3.1. producción de cera
acr1
Acinetobacter sp. ADP1 acil-CoA reductasa YP_047869 1.2.1.42 modificar salida
yqhD
E. coli K12 alcohol deshidrogenasa AP_003562 1.1.-. modificar salida
AAT
Fragaria x ananassa alcohol O-acetiltransferasa AAG13130 2.3.1.84 modificar salida
Salida de productos: Salida de alcohol graso
tioesterasas (véase anteriormente)
aumento de la producción de ácidos grasos/ alcoholes grasos
BmFAR
Bombyx mori FAR (acil-CoA reductasa de formación de alcohol graso) BAC79425 1.1.1. convertir acil-CoA en alcohol graso
acr1
Acinetobacter sp. ADP1 acil-CoA reductasa YP_047869 1.2.1.42 reducir acil graso-CoA para dar aldehídos grasos
yqhD
E. coli W3110 alcohol deshidrogenasa AP_003562 1.1.-. reducir aldehídos grasos para dar alcoholes grasos; aumento de la producción de alcoholes grasos
alrA
Acinetobacter sp. ADP1 alcohol deshidrogenasa CAG70252 1.1.-. reducir aldehídos grasos para dar alcoholes grasos
BmFAR
Bombyx mori FAR (acil-CoA reductasa de formación de alcohol graso) BAC79425 1.1.1. reducir acil graso-CoA para dar alcohol graso
GTNG_1865
Geobacillus thermodenitrificans NG80-2 aldehído de cadena larga deshidrogenasa YP_001125 970 1.2.1.3 reducir aldehídos grasos para dar alcoholes grasos
AAR
Synechococcus elongatus acil-ACP reductasa YP_400611 1.2.1.80 1.2.1.42 reducir acil graso-ACP/CoA para dar aldehídos grasos
carB
Mycobacterium smegmatis proteína ácido carboxílico reductasa (CAR) YP_889972 6.2.1.3, 1.2.1.42 reducir ácidos grasos para dar aldehído graso
FadD
E. coli K12 acil-CoA sintetasa NP_416319 6.2.1.3 activa ácidos grasos para dar acil graso-CoA
atoB
Erwinia carotovora acetil-CoA acetiltransferasa YP_049388 2.3.1.9 producción de butanol
hbd
Butyrivibrio fibrisolvens beta-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa BAD51424 1.1.1.157 producción de butanol
CPE0095
Clostridium perfringens crotonasebutiril-CoA deshidryogenasa BAB79801 4.2.1.55 producción de butanol
bcd
Clostridium beijerinckii butiril-CoA deshidrogenasa AAM14583 1.3.99.2 producción de butanol
ALDH
Clostridium beijerinckii aldehído deshidrogenasa de acilación de coenzima A AAT66436 1.2.1.3 producción de butanol
AdhE
E. coli CFT073 aldehído-alcohol deshidrogenasa AAN80172 1.1.1.1 1.2.1.10 producción de butanol
Exportación de producto
AtMRP5
Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana asociada a resistencia a múltiples fármacos NP_171908 ninguno modificar producto exportar cantidad
AmiS2
Rhodococcus sp. Transportador de ABC AmiS2 JC5491 ninguno modificar producto exportar cantidad
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Designación de gen
Organismo fuente Nombre de enzima N.º de registro Número EC Uso a modo de ejemplo
AtPGP1
Arabidopsis thaliana Glicoproteína 1 de Arabidopsis thaliana p NP_181228 ninguno modificar producto exportar cantidad
AcrA
Candidatus Protochlamydia amoebophila UWE25 supuesta proteína transportadora de flujo de entrada de múltiples fármacos acrA CAF23274 ninguno modificar producto exportar cantidad
AcrB
Candidatus Protochlamydia amoebophila UWE25 probable proteína transportadora de flujo de entrada de múltiples fármacos, acrB CAF23275 ninguno modificar producto exportar cantidad
TolC
Francisella tularensis subsp. novicida proteína de la membrana externa [biogénesis de envuelta celular, ABD59001 ninguno modificar producto exportar cantidad
AcrE
Shigella sonnei Ss046 proteína transmembrana afecta a la formación del tabique y la permeabilidad de la membrana celular YP_312213 ninguno modificar producto exportar cantidad
AcrF
E. coli proteína F con resistencia a acriflavina P24181 ninguno modificar producto exportar cantidad
tll1619
Thermosynechococcus elongatus [BP-1] transportador de flujo de entrada de múltiples fármacos NP_682409. 1 ninguno modificar producto exportar cantidad
tl10139
Thermosynechococcus elongatus [BP-1] transportador de flujo de entrada de múltiples fármacos NP_680930. 1 ninguno modificar producto exportar cantidad
Fermentación
replicación checkpoint genes
aumentar eficiencia de salida
umuD
Shigella sonnei Ss046 ADN polimerasa V, subunidad YP_310132 3.4.21. aumentar eficiencia de salida
umuC
E. coli ADN polimerasa V, subunidad ABC42261 2.7.7.7 aumentar eficiencia de salida
pntA, pntB
Shigella flexneri NADH:NADPH transhidrogenasa (subunidades alfa y beta) P07001, P0AB70 1.6.1.2 aumentar eficiencia de salida
Otros
fabK
Streptococcus pneumoniae trans-2-enoil-ACP reductasa II AAF98273 1.3.1.9 Contribuye a la biosíntesis de ácidos grasos
fabL
Bacillus licheniformis DSM 13 enoil-(proteína transportadora de acilo) reductasa AAU39821 1.3.1.9 Contribuye a la biosíntesis de ácidos grasos
fabM
Streptococcus mutans trans-2, cis-3-decenoil-ACP isomerasa DAA05501 4.2.1.17 Contribuye a la biosíntesis de ácidos grasos
Células huésped recombinantes y cultivos celulares
Las estrategias para aumentar la producción de composiciones de aldehído graso o de alcohol graso por células huésped recombinantes incluyen el aumento del flujo a través de la ruta de biosíntesis de ácidos grasos mediante la 5 sobreexpresión de genes nativos de biosíntesis de aldehídos grasos o alcoholes grasos y la expresión de genes exógenos de biosíntesis de aldehídos grasos o alcoholes grasos de diferentes organismos en el huésped de producción. Tal como se usa en el presente documento, el término célula huésped recombinante o célula huésped modificada por ingeniería se refiere a una célula huésped cuya composición genética se ha alterado con relación a la célula huésped silvestre correspondiente, por ejemplo, mediante introducción deliberada de nuevos elementos 10 genéticos y/o la modificación deliberada de elementos genéticos presentes de manera natural en la célula huésped. La descendencia de tales células huésped recombinantes también contiene estos elementos genéticos nuevos y/o modificados. En cualquiera de los aspectos de la divulgación descritos en el presente documento, la célula huésped
24
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para evaluar la producción de especies de ácido graso.
Protocolo de cultivo a 32ºC (4NBT)
Se usaron 20 µl de cultivo LB (de un cultivo LB que se hizo crecer en una placa de 96 pocillos) para inocular 400 µl de medios 2NBT (tabla 2), lo que se incubó luego durante aproximadamente 16 horas con agitación a 32ºC. Se usaron 20 µl de la simiente durante la noche para inocular 400 µl de 4NBT con nitrógeno o bien 1 o bien 2 g/l (NBT_1N o NBT_2N). Después de crecimiento a 32ºC durante 6 horas, se indujeron los cultivos con IPTG (concentración final de 1 mM) (tabla 2). Entonces se incubaron los cultivos a 32ºC con agitación durante 18 horas, después de lo cual se extrajeron siguiendo el protocolo de extracción convencional detallado a continuación.
Tabla 2: Nombres y formulaciones de medios
Nombre de medio
Formulación
2NBT
1 X 5x disol. salina con NH4Cl
1
g/l NH4Cl 100 g/l
1
mg/l Tiamina 10 mg/ml
1
mM MgSO4 1 M
0,1
mM CaCl2 1 M
20
g/l glucosa 500 g/l
1
X 1000x TM2
10
mg/l citrato de Fe 10 g/l
100
µg/ml espectinomicina100 mg/ml
100
mM BisTris 2 M (pH 7,0)
4NBT_1N
1 X disol. salina con NH4Cl 5x
1
mg/l Tiamina 10 mg/ml
1
mM MgSO4 1 M
0,1
mM CaCl2 1 M
40
g/l glucosa 500 g/l
1
X 1000x TM2
10
mg/l citrato de Fe 10 g/l
100
µg/ml espectinomicina100 mg/ml
100
mM BisTris 2 M (pH 7,0)
4NBT_2N
1 X 5x disol. salina con NH4Cl
1
g/l NH4Cl 100 g/l
1
mg/l Tiamina 10 mg/ml
1
mM MgSO4 1 M
0,1
mM CaCl2 1 M
40
g/l glucosa 500 g/l
1
X 1000x TM2
10
mg/l citrato de Fe 10 g/l
100
µg/ml espectinomicina100 mg/ml
100
mM BisTris 2 M (pH 7,0)
10 Protocolo de extracción convencional de especies de ácido graso
A cada pocillo que iba a extraerse, se le añadieron 40 µl de HCl 1 M, seguido por 300 µl de acetato de butilo (con 500 mg/l de C11-FAME como patrón interno). Entonces se termosellaron las placas de 96 pocillos usando un sellador de placas (calefactor ALPS-300; Abgene, ThermoScientific, Rockford, IL), y se agitaron durante 15 minutos a 2000 rpm usando el mezclador MIXMATE (Eppendorf, Hamburgo, Alemania). Después de la agitación, se 15 centrifugaron las placas durante 10 minutos a 4500 rpm a temperatura ambiente (Allegra X-15R, rotor SX4750A, Beckman Coulter, Brea, CA) para separar las fases acuosa y orgánica. Se transfirieron 50 µl de la fase orgánica a una placa de 96 pocillos (polipropileno, Corning, Ámsterdam, Países Bajos), que posteriormente se termoselló y se almacenó a -20ºC hasta que se evaluó mediante CG-FID usando el método FALC_Broth.met. Se llevó a cabo el método FALC_Broth.met de la siguiente manera: se inyectó 1 µl de muestra sobre una columna analítica (DB-1,
20 10mx180 µm x 0,2 µm de grosor de película, disponible de JW 121-101A) en un dispositivo Agilent 7890A CG Ultra (Agilent, Santa Clara, CA) con un detector de ionización de llama (FID). Se configuró el instrumento para detectar y cuantificar alcoholes grasos C6 a C18. El protocolo detallado anteriormente representa condiciones convencionales, que pueden modificarse según sea necesario para optimizar los resultados analíticos.
Especies de ácido graso -Protocolo de ensayo con rojo Nilo convencional
25 Después de 24 horas de fermentación, se realizó un ensayo con rojo Nilo añadiendo 70 µl de caldo de fermentación a 130 µl de rojo Nilo 1,54 µg/ml en disolución del 84,6% de agua y el 15,4% de acetonitrilo para una concentración
32
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imagen27
C63H, S967T, L177H, A281V
2045 53% 180% 237%
S18T, C63Y, A281V, E283K
1696 45% 172% 278%
S18T, C63Y
1640 43% 166% 260%
S18T, L177H, A281V, E283K
1618 44% 164% 270%
S18T, L177H, A281V, E283K
1617 43% 164% 264%
S18T, S96T, L177H, E283K
1814 43% 160% 194%
S18T, C63H, L177H
1811 39% 160% 173%
S18T, L177H, A281V, E283K
1503 39% 152% 237%
L65F, S96T, A281V, E283K
1638 43% 144% 191%
C63Y, A281V, A282T
1622 38% 143% 168%
L11F, C63Y, S96T, L177H, A281V A282T, E283K
1579 41% 143% 186%
L65F, S96T, L177H, A281V, E283K
1585 42% 140% 189%
G22S, C63H, S96T, L177H, E283K
1229 39% 125% 237%
C63H, L65F, S96T, A281V
1178 41% 119% 252%
S18T, L65F, S96T, L177H, A281V
1136 33% 115% 203%
C63R, L177H, A281V, E283K
1275 44% 112% 196%
Bibliotecas de saturación
Mutaciones
Título de FALC (total*) FALC C14 (% de fracción) FALC normalizado (% con respecto al control) C14 normalizado (% con respecto al control)
S18M
2809 40% 243% 212%
S18F
2564 54% 222% 285%
S18Y
2550 45% 221% 236%
S18W
2530 55% 227% 314%
S18M
2495 41% 224% 231%
S18Y
2039 44% 188% 252%
S18Y
1997 44% 179% 251%
S18T
1729 31% 155% 177%
S18T
1690 31% 152% 176%
S18T
1683 31% 151% 176%
S18T
1599 30% 143% 172%
S18L
1568 48% 141% 271%
S18C
1381 28% 120% 149%
S18C
1372 26% 123% 147%
S18C
1368 28% 118% 148%
S18L
1359 47% 122% 266%
S18C
1355 26% 121% 148%
S18V
1344 30% 121% 170%
S18C
1340 26% 120% 147%
S18L
1326 47% 119% 268%
S18L
1315 47% 118% 266%
S18C
1313 26% 118% 149%
S18V
1306 30% 121% 170%
S18C
1305 26% 117% 148%
S18L
1302 47% 117% 267%
V17L
1188 23% 110% 130%
V17L
1185 33% 103% 173%
V17L
1175 32% 102% 171%
Combinación de bibliotecas β
Título de FALC (total*)
FALC C14 (% de fracción) FALC normalizado (% con respecto al control) C14 normalizado (% con respecto al control)
S18W, S96T, E283K, R286Q, A324V
3437 49% 246% 255%
S18W
3286 53% 235% 275%
S18W, S96T, E283K
3199 46% 229% 237%
S18W, C63Y, S96T
3186 46% 228% 241%
S18W, C68Y, E2834K
2949 50% 211% 260%
C63Y, E283K
2680 36% 192% 189%
S18W, C63Y
2675 54% 191% 280%
C63Y, S96T
2583 38% 185% 196%
C63Y,E283K, Q316K
2420 36% 173% 188%
35
S96T
1605 23% 115% 121%
E283K
1532 25% 110% 131%
Tabla 4B: Mutaciones de bibliotecas de combinación y de saturación limitada de AAR_7942 correlacionadas con un aumento de la fracción de alcohol graso C14
Combinación de bibliotecas α
Título de FALC (total*)
FALC C14 (% de fracción) FALC normalizado (% con respecto al control) C14 normalizado (% con respecto al control)
C63H, S96T, L177H, A281V
2045,36 53% 180% 237%
G22S, C63H, F64V, S96T, L177H A281V
152,47 51% 14% 233%
S18T, C63H, S96T, L177H, A281V E283K
2202,46 50% 200% 229%
S18T, C63Y, S96T, L177H, A281V
2472,80 48% 251% 294%
S18T, C63Y, A281V, E283K
1695,59 45% 172% 278%
S18T, L177H, A281V, E283K
1618,20 44% 164% 270%
C63R, L177H, A281V, E283K
1275,38 44% 112% 196%
S18T, C63H, L65F, S96T, L177F A281V, E283K
912,50 44% 83% 199%
S18T, S96T, L177H, E283K
1814,34 43% 160% 194%
S18T, L179H, A281V, E283K
1616,51 43% 164% 264%
S18T, C63H, S96T, L177H
2088,12 43% 189% 197%
L65F, S96T, A281V, E283K
1638,28 43% 144% 191%
C63H, L65F, A281V, E283K
632,66 43% 56% 190%
S18T, C63Y
1640,33 43% 166% 260%
L65F, S96T, L177H, A281V, E283K
1585,32 42% 140% 189%
C63Y, L65F, L177H
639,46 41% 56% 184%
C63H, L65F, S96T, A281V
1177,76 41% 119% 252%
L11F, C63Y, S96T, L177H, A281V A282T, E283K
1578,54 41% 143% 186%
S18T, C63Y
1797,99 39% 182% 241%
S18T, L178H, A282V, E284K
1502,59 39% 152% 237%
G23S, C63H, S96T, L177H, E283K
1229,34 39% 125% 237%
S18T, C63H, L177H
1811,40 39% 160% 173%
C63Y, A281V, A282T
1622,23 38% 143% 168%
S18T, C63Y, L65F, S96T, L177H A281V, E283K, M284I
454,42 35% 41% 162%
S18T, L65F, S96T, L177H, A281V
1135,95 33% 115% 203%
L65F, L178H, G180S, E283K
151,40 33% 13% 146%
L66F, L177H, G180S, E283K
143,83 31% 13% 138%
S18T, C63H, L65F, L177H
103,21 30% 9% 133%
Bibliotecas de saturación
Título de FALC (total*)
FALC C14 (% de fracción) FALC normalizado (% con respecto al control) C14 normalizado (% con respecto al control)
S18W
2530 55% 227% 314%
S18F
2564 54% 222% 285%
V17N
571 49% 49% 260%
S18L
1568 48% 141% 271%
S18L
1024 47% 92% 268%
S18L
1326 47% 119% 268%
S18L
1302 47% 117% 267%
S18L
1106 47% 99% 267%
S18L
1315 47% 118% 266%
S18L
1359 47% 122% 266%
S18Y
2550 45% 221% 236%
S18Y
2039 44% 188% 252%
S18Y
1997 44% 179% 251%
S18M
2495 41% 224% 231%
S18M
2809 40% 243% 212%
V17L
1127 33% 97% 175%
36
V17L
1185 33% 103% 173%
V17L
1091 32% 94% 171%
V17L
1175 32% 102% 171%
S18T
1729 31% 155% 177%
S18T
1690 31% 152% 176%
S18T
1683 31% 151% 176%
S18T
1599 30% 143% 172%
S18V
1344 30% 121% 170%
S18V
1306 30% 121% 170%
S18V
1015 30% 91% 169%
S18C
1381 28% 120% 149%
S18C
1368 28% 118% 148%
R19H, R58S
873 27% 81% 152%
V17C
927 27% 80% 140%
V17C
882 26% 76% 139%
S18C
1313 26% 118% 149%
S18C
1355 26% 121% 148%
S18C
1305 26% 117% 148%
S18C
1372 26% 123% 147%
S18C
1340 26% 120% 147%
V17W
849 25% 73% 134%
V17W
815 25% 71% 133%
V17W
831 25% 72% 132%
V17W
840 25% 73% 131%
R19V
844 24% 78% 139%
R19V
813 24% 75% 136%
R19V
821 24% 76% 135%
R19V
862 24% 80% 135%
R19V
814 24% 75% 135%
R19K, V117L
1188 23% 110% 130%
R19S
803 22% 74% 128%
R19T
735 22% 68% 127%
R19S
783 22% 72% 127%
R19S
764 22% 75% 129%
R19I
862 22% 80% 123%
R19A
901 21% 83% 122%
R19A
705 21% 65% 119%
R19M
937 20% 86% 114%
Combinación de bibliotecas β
Título de FALC (total*)
FALC C14 (% de fracción) FALC normalizado (% con respecto al control) C14 normalizado (% con respecto al control)
S18W
3184 57% 228% 296%
S18W, C63Y
2675 54% 191% 280%
S18W, C63Y, S95T
2832 54% 203% 279%
S18W, S96T, E283K
2874 54% 206% 278%
S18W, C63Y, E283K
2915 51% 209% 263%
S18W, S96T, E283K, R286Q, A324V
3437 49% 246% 255%
C63Y, S96T
2583 38% 185% 196%
C63Y, E283K
2176 38% 156% 195%
C63Y, E283K, Q316K
2420 36% 173% 188%
E283K
1474 25% 105% 132%
S96T
1605 23% 115% 121%
Combinación de bibliotecas 3
Título de FALC (total*)
FALC C14 (% de fracción) FALC normalizado (% con respecto al control) C14 normalizado (% con respecto al control)
S18W
2853 217% 51% 274%
Y23N
954 72% 35% 191%
Y23N, Q238H
892 68% 35% 190%
G150D, I274N
766 62% 30% 162%
I274N
1359 107% 29% 161%
I274N, A285V
1317 103% 28% 155%
37
P38T, I274N, A285V
587 46% 26% 143%
Q238H, M291V
1383 109% 22% 119%
M291V
1618 123% 22% 118%
G151D, M291V
1302 105% 21% 114%
T135M, M291V
1265 100% 18% 101%
EJEMPLO 4: Biblioteca de saturación preparada usando AAR (S18W) como molde
Se construyó una biblioteca de saturación completa de una variante de acil-ACP reductasa de Synechococcus elongatus PCC7942 (“’AAR(S18W)_7942”), y se examinó para detectar variantes que mostrasen mejoras con respecto a AAR (S18W), identificada como variante de AAR significativamente mejorada en la primera tanda de 5 examen (ejemplos 2 y 3). Los criterios de selección fueron un aumento en el título de FALC o un aumento en el tanto por ciento de fracción de C12. Los esfuerzos de modificación por ingeniería se centraron en mitigar la dependencia de AAR de la sobreexpresión de ACP con el fin de producir altos títulos. Aunque no desea limitarse por la teoría, se planteó la hipótesis de que la ventaja observada en cepas que sobreexpresan ACP resultaba de una mayor concentración de productos intermedios de biosíntesis de ácidos grasos disponibles durante la escisión por AAR.
10 Mediante el examen de bibliotecas de saturación y de combinación construidas con AAR en una cepa que carecía de sobreexpresión de ACP (que tenía una menor concentración de productos intermedios de FAS), pudieron seleccionarse variantes con mayores afinidades por los productos intermedios de FAS.
El plásmido que se usó para producir la biblioteca de saturación completa se designó como pAAR-1. Es un derivado de pLS9-185 que alberga el gen de AAR que codifica para la variante (S18W) seguido por el gen de aldehído 15 reductasa, AlrA, de Acinetobacter bailyi (SEQ ID NO: 54). Se añadió AlrA para reducir totalmente los productos intermedios de aldehído graso generados por AAR y no reducidos totalmente por las aldehído graso endógenas de
E. coli. Se examinó la biblioteca de saturación completa en la cepa Shu.002. La cepa Shu.002 es DV2 PT5-ifab138 PT5_ifadR (tabla 7, más adelante). Para ifab138 véase SEQ ID NO: 55 en la tabla 10. Se examinaron las bibliotecas usando uno de los protocolos convencionales descritos anteriormente. Las mejoras se clasificaron como o bien que
20 mejoran el título o bien que aumentan la fracción de alcoholes grasos C12 producidos por la acil-ACP reductasa sin afectar significativamente al título. Los resultados del examen de bibliotecas de saturación se muestran en la tabla 5 a continuación.
Tabla 5: Mutaciones de una biblioteca de saturación completa de AAR (S18W) 7942 correlacionadas con un aumento del título de alcoholes grasos y/o un aumento de la fracción de alcoholes grasos C12
Mutaciones de ARR (además de S18W)
Título de FALC C12
Total*
FIOC** Fracción* FIOC**
T148V
747 1,21 7,9% 0,99
A159V
702 1,14 7,0% 0,87
T157V
674 1,10 7,2% 0,90
A135S
803 1,31 7,8% 0,98
A328S
712 1,16 8,1% 1,02
Q191A
780 1,27 7,7% 0,96
A285V, M291V
837 1,36 8,0% 1,00
Q277V
854 1,39 7,9% 0,99
Q155C
626 1,02 8,3% 1,04
E210Y
676 1,10 8,5% 1,06
T120S
623 1,01 8,1% 1,02
T236C
691 1,12 7,6% 0,95
Q335N
763 1,24 6,8% 0,86
C172L
700 1,14 7,7% 0,97
E283S
858 1,39 8,0% 1,00
L209R
837 1,36 7,6% 0,96
I153P
606 0,99 8,0% 1,00
A211W
797 1,30 6,9% 0,86
A324T
909 1,48 4,0% 0,50
W34F
817 1,22 7,5% 0,98
T187V
825 1,23 6,9% 0,91
D24E
737 1,10 7,1% 0,93
T188H
862 1,29 8,6% 1,13
V18A
798 1,19 6,4% 0,84
V18A, L338W
732 1,27 7,6% 0,97
T188V
775 1,34 7,4% 0,95
I168V
731 1,27 8,1% 1,03
W35F
666 1,15 7,5% 0,96
T148V
836 1,45 6,2% 0,80
38
Q155L
740 1,28 8,5% 1,08
T148C
731 1,26 8,6% 1,10
T148E
694 1,20 8,3% 1,06
A50Q, L337V
800 1,38 7,2% 0,92
R118Q
724 1,25 7,3% 0,94
L31V
901 1,56 6,8% 0,87
A135S
775 1,34 8,7% 1,12
D24Y
890 0,93 19,1% 2,05
C63A
895 0,94 16,1% 1,73
S113K
812 0,85 13,3% 1,43
L31V
645 0,68 15,7% 1,69
E283G
917 0,96 14,3% 1,54
A112R
918 0,96 10,7% 1,15
D43E
1002 1,05 13,0% 1,39
Q116G
894 0,94 14,0% 1,50
S86G
849 0,89 13,4% 1,44
* Promedio de 4 réplicas
** FIOC = veces de aumento con respecto al control AAR (S18W)
Ejemplo 5: Bibliotecas de combinación preparadas usando AAR (S18W) como molde
Se usaron técnicas convencionales que conocen los expertos en la técnica para preparar bibliotecas de
5 combinación. Las mutaciones sometidas a prueba en bibliotecas de combinación (tablas 6A, 6B y 6C) se identificaron originariamente en la biblioteca de saturación completa (ejemplo 4). Se construyeron las bibliotecas de combinación en el mismo plásmido y se examinaron en la misma cepa tal como se describe en el ejemplo 3. Se examinaron las bibliotecas usando uno de los protocolos convencionales descritos anteriormente. Las mejoras se clasificaron como o bien que mejoran el título o bien que aumentan la fracción de alcoholes grasos C12 producidos
10 por la acil-ACP reductasa sin afectar significativamente al título. Los resultados del examen de bibliotecas de combinación de AAR se muestran en las tablas 6A, 6B y 6C a continuación.
Tabla 6A: Mutaciones de la 1ª biblioteca de combinación de AAR(S18W)_7942 correlacionadas con un aumento del título de alcoholes grasos
Mutaciones de ARR (además de S18W)
Título* de FALC C12
mg/l*
FIOC** Fracción* FIOC**
A281L
1478 1,29 14,1% 1,11
A281Y
1527 1,28 12,1% 0,96
T154A, A281L
1550 1,28 14,3% 1,13
T154A, A281Y
1384 1,19 13,3% 1,05
C63G, A281F
1472 1,24 12,9% 1,02
C63G, A281L
1432 1,19 18,2% 1,44
N83G, A281Y
1428 1,23 10,7% 0,84
C63G, A281Y
1419 1,21 15,6% 1,24
S10G, A281L
1419 1,20 12,6% 1,00
S113K, Q155G
1305 1,15 12,3% 0,97
D43E, A50Q, A281L
1517 1,32 9,1% 0,72
M21L, N83G, A281Y
1513 1,29 10,2% 0,81
M21L, S113K, A281L
1392 1,20 20,4% 1,61
C63G, T154A, A281F
1369 1,24 12,4% 0,98
C63G, N83G, A281Y
1330 1,32 14,6% 1,16
Q155G, A281L, E283G
1327 1,16 22,2% 1,76
A50Q, C63G, A281F
1286 1,15 17,9% 1,41
S18W, D43E, A50Q, A281L
1635 1,32 9,4% 0,77
M21L, C63G, S113K, T154A A281L
1518 1,24 28,3% 2,23
M21L, L31V, N83G, Q116G A281L
1353 1,18 15,3% 1,21
* Promedio de 4 réplicas 15 ** FIOC = veces de aumento con respecto al control (S18W)
Tabla 6B: Mutaciones de la 2ª biblioteca de combinación de AAR(S18W)_7942 correlacionadas con un aumento del título de alcoholes grasos
39
imagen28
imagen29
imagen30

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  1. imagen1
    imagen2
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