ES2675224T3

ES2675224T3 - Acil-ACP reductasa con propiedades mejoradas

Info

Publication number: ES2675224T3
Application number: ES16181205.2T
Authority: ES
Inventors: Mathew Rude; Na Trinh; Andreas Schirmer; Jacob GANO
Original assignee: REG Life Sciences LLC
Current assignee: REG Life Sciences LLC
Priority date: 2013-01-16
Filing date: 2014-01-16
Publication date: 2018-07-09
Anticipated expiration: 2034-01-16
Also published as: WO2014113571A3; MX346830B; BR112015017005A2; EP3385375B1; EP2946009B1; AU2017200596A1; EP3103867A1; CN110387352A; JP6523393B2; KR101746040B1; JP2017209118A; CN105051189B; JP2019141083A; KR20170066694A; AU2017200596B2; KR20150105471A; JP6063585B2; AU2014207522A1; EP3385375A1; KR102082247B1

Abstract

Polipéptido de acil-ACP reductasa (AAR) variante que comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, en el que dicho polipéptido de AAR variante comprende un ácido glutámico en la posición de aminoácido 61, en el que dicho polipéptido de AAR cataliza la conversión de una acil-ACP en un aldehído graso.

Description

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DESCRIPCION

Acil-ACP reductasa con propiedades mejoradas Campo

La divulgación se refiere a variantes de enzima acil-ACP reductasa (AAR) que dan como resultado la producción mejorada de aldehídos grasos y/o alcoholes grasos cuando se expresan en células huésped recombinantes. La divulgación se refiere además a métodos de preparación y uso de tales variantes de AAR para la producción de composiciones de alcohol graso que tiene características particulares.

Antecedentes

Los alcoholes grasos indican una importante categoría de productos bioquímicos industriales. Por ejemplo, las ventas anuales a nivel mundial de alcoholes grasos y sus derivados son superiores a mil millones de USD. Estas moléculas y sus derivados tienen numerosas aplicaciones, incluyendo su uso como tensioactivos, lubricantes, plastificantes, disolventes, emulsionantes, emolientes, espesantes, sabores, fragancias y combustibles. Debido a su naturaleza anfífila, los alcoholes grasos se comportan como tensioactivos no iónicos, que son útiles en productos para el cuidado personal y de uso doméstico, por ejemplo, detergentes. Los alcoholes grasos de cadena más corta se usan en las industrias cosmética y alimentaria como emulsionantes, emolientes y espesantes.

En la naturaleza, los alcoholes grasos los producen enzimas que pueden reducir diversas moléculas de acil-ACP o acil-CoA para dar los alcoholes primarios correspondientes (por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 8.323.924; 8.268.599 y 8.097.439; y las publicaciones de patente estadounidense n.os 20120282663 y 20100105963). Sin embargo, las tecnologías actuales implican la reducción mediada por catalizadores en su mayor parte inorgánicos de ácidos grasos para dar los alcoholes primarios correspondientes. Estos alcoholes grasos se producen mediante hidrogenación catalítica de ácidos grasos producidos a partir fuentes naturales, tales como aceite de coco, aceite de palma, aceite de palmiste, sebo y manteca de cerdo, o mediante hidratación química de alfa-olefinas producidas a partir de materias primas petroquímicas. Los alcoholes grasos derivados de fuentes naturales tienen longitudes de cadena variables, que son relevantes y específicos para aplicaciones particulares. La deshidratación de alcoholes grasos para dar alfa-olefinas puede lograrse mediante catálisis química.

El documento WO 2011/127409 se refiere a polipéptidos de acil-ACP reductasa (AAR), incluyendo AAR de Prochlorococcus marinus, PCC7942, y a la expresión de los mismos en células huésped para producir alcoholes grasos.

Pueden usarse aldehídos grasos para producir productos químicos especializados industriales. Por ejemplo, se usan comúnmente aldehídos para producir polímeros, resinas, colorantes, saborizantes, plastificantes, perfumes y productos farmacéuticos. Pueden usarse también aldehídos como disolventes, conservantes, y desinfectantes. Determinados compuestos naturales y sintéticos, tales como vitaminas y hormonas, son aldehídos, y muchos azúcares contienen grupos aldehído. Los aldehídos grasos pueden convertirse en alcoholes grasos mediante reducción química o enzimática.

Una alternativa más ecológica y más limpia para la producción de aldehídos grasos y alcoholes grasos es mediante biomasa y/o azúcares fermentables. Sin embargo, para que la producción de aldehídos grasos y alcoholes grasos a partir de biomasa o azúcares fermentables sea comercialmente viable, deben optimizarse procesos industriales para una conversión y recuperación eficientes del producto final. La presente divulgación aborda esta necesidad proporcionando composiciones y métodos para la producción mejorada de aldehídos grasos y alcoholes grasos usando células huésped modificadas por ingeniería como biocatalizadores.

Sumario

La presente divulgación se refiere a células huésped fotosintéticas y heterotróficas que producen directamente aldehídos grasos y/o alcoholes grasos de longitudes de cadena específicas de manera que no es necesaria la conversión catalítica de ácidos grasos purificados. Esta ruta biológica proporciona un producto de mayor calidad, una reducción significativa de los costes y un menor impacto sobre el medio ambiente. Más específicamente, la presente divulgación se refiere a variantes de enzima acil-ACP reductasa (AAR) novedosas que producen aldehídos grasos y/o alcoholes grasos y composiciones de los mismos. También se contemplan secuencias de ácido nucleico y proteína de variantes de AAR específicas así como células huésped recombinantes novedosas y cultivos celulares que engloban tales variantes de enzima AAR modificadas por ingeniería. La divulgación también se refiere a métodos de uso de las células huésped que expresan variantes de AAR recombinantes para producir composiciones de aldehído graso y/o alcohol graso con características particulares.

Un aspecto de la divulgación se refiere a polipéptidos de acil-ACP reductasa (AAR) variantes que catalizan la conversión de una acil-ACP en un aldehído graso, en los que el polipéptido de AAR tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia de polipéptido de AAR silvestre correspondiente presentada como SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44, y métodos para expresar los polipéptidos de AAR variantes en una célula

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huésped recombinante, lo que da como resultado un mayor título de composición de aldehido graso y/o alcohol graso en comparación con el título de una composición de aldehído graso y/o alcohol graso producida mediante la expresión de un polipéptido de AAR silvestre en una célula huésped correspondiente. El polipéptido de AAR variante modificado por ingeniería genética puede tener una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia de polipéptido de AAR silvestre correspondiente presentada como SEQ ID NO: 28 y la expresión del polipéptido de AAR variante en una célula huésped recombinante da como resultado un mayor título de composición de aldehído graso y/o alcohol graso o un mayor título de alcoholes grasos C12, C14 o C16 en comparación con el título producido mediante la expresión de un polipéptido de AAR silvestre en una célula huésped correspondiente.

En un aspecto de la divulgación, el polipéptido de AAR variante tiene una mutación en una o más posiciones de aminoácido de los aminoácidos 18, 24, 31, 34, 35, 43, 50, 63, 86, 112, 113, 116, 118, 120, 135, 148, 153, 155, 157, 159, 168, 172, 187, 188, 191, 209, 210, 211, 236, 277, 283, 285, 291, 324, 328, 335, 337 y 338 de SEQ ID NO: 28. El polipéptido de AAR variante modificado por ingeniería genética puede tener una mutación S18W. En un aspecto preferido, el polipéptido de AAR variante modificado por ingeniería genética tiene una mutación S18W y comprende además una mutación tal como M21L, D24E, D24Y, L31V, W34F, W35F, D43E, A50Q, C63A, C63G, C63Y, S86G, A112R, S113K, Q116G, R118Q, T120S, A135S, T148C, T148E, T148V, I153P, Q155C, Q155L, T157V, A159V, I168V, C172L, T187V, T188H, T188V, Q191A, L209R, E210Y, A211W, T236C, Q277V, E283G, E283S, A285V, M291V, A324T, A328S, Q335N, L337V y/o L338W.

En otro aspecto de la divulgación, el polipéptido de AAR variante que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia de polipéptido de AAR silvestre correspondiente presentada como SEQ ID NO: 34 y la expresión del polipéptido de AAR variante en una célula huésped recombinante da como resultado un mayor título de aldehído graso y/o alcohol graso o un mayor título de alcohol graso C12 en comparación con el título producido mediante la expresión de un polipéptido de aAr silvestre en una célula huésped correspondiente. El polipéptido de AAR variante tiene una mutación en una posición de aminoácido incluyendo el aminoácido 40, 52, 58, 61, 273, 303, 339, 340, 344, 345, 346 y 588 de SEQ iD NO: 34. El polipéptido de AaR variante puede tener una mutación en la posición de aminoácido Q40V, G52V, S58V, D61E, G273E, K303G, K339L, H340P, L344A, L344D, L344S, L344T, L345R, V346P, V346G y/o S588V.

Otro aspecto de la divulgación engloba una célula huésped recombinante que tiene una o más mutaciones tal como se describió anteriormente y en la que cuando se modifica por ingeniería la célula huésped para expresar un polipéptido de AAR variante de SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 34, esta célula huésped recombinante produce una composición de aldehído graso y/o alcohol graso con un título que es al menos el 10% mayor, al menos el 15% mayor, al menos el 20% mayor, al menos el 25% mayor, o al menos el 30% mayor que el título de una composición de aldehído graso y/o alcohol graso producida por una célula huésped que expresa el polipéptido de AAR silvestre correspondiente, cuando se cultiva en medio que contiene una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar el polipéptido de AAR variante. La composición de aldehído graso y/o alcohol graso puede producirse a un título de 30 g/l a 250 g/l, por ejemplo, un título de al menos 100 mg/l. La composición de alcohol graso puede producirse de manera extracelular.

La divulgación engloba además un cultivo celular que incluye la célula huésped recombinante tal como se describió anteriormente, en el que la composición de alcohol graso incluye uno o más de un alcohol graso C6, Ce, C10, C12, C13, C14, C15, C16, C17, y C18, por ejemplo, un alcohol graso insaturado Cm1, C12:1, C141 Cm, o Cmr La composición de alcohol graso puede comprender un alcohol graso saturado.

Otro aspecto de la divulgación engloba un polipéptido de acil-ACP reductasa (AAR) variante que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 57, en el que el polipéptido de AAR cataliza la conversión de un acil-ACP en un aldehído graso. La expresión del polipéptido de AAR variante en una célula huésped recombinante puede dar como resultado un mayor título de una composición de aldehído graso o alcohol graso en comparación con el título de una composición de aldehído graso o alcohol graso producida mediante la expresión de un polipéptido de AAR silvestre en una célula huésped silvestre correspondiente. La expresión del polipéptido de AAR variante en una célula huésped recombinante puede dar como resultado un mayor título de una composición de aldehído graso o alcohol graso que es una composición de alcohol graso C12, C14 y/o C16 en comparación con el título de una composición de aldehído graso o alcohol graso producida mediante la expresión de un polipéptido de AAR silvestre en una célula huésped silvestre correspondiente. El polipéptido de AAR variante puede tener una mutación en la posición de aminoácido 18, en el que la mutación es S18W.

Otro aspecto de la divulgación engloba un polipéptido de acil-ACP reductasa (AAR) variante que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 57, en el que el polipéptido de AAR variante tiene otra mutación en una posición de aminoácido en el aminoácido 8, 16, 21, 24, 31, 34, 35, 43, 50, 63, 86, 112, 113, 116, 118, 120, 135, 148, 153, 154, 155, 157, 159, 168, 172, 187, 188, 191, 209, 210, 211, 236, 277, 281, 283, 285, 291, 324, 328, 335, 337 y/o 338. En un aspecto, la mutación se selecciona de L8A, D16L, M21L, D24E, D24Y, D24V, D24P, L31V, L31M, W34F, W35F, D43E, A50Q, C63A, C63G, C63Y, S86G, A112R, S113K, Q116G, R118Q, T120S, A135S, T148C, T148E, T148V, I153P, T154A, Q155C, Q155L, T157V, A159V, I168V, C172L, T187V, T188H, T188V, Q191A, L209R, E210Y, A211W, T236C, Q277V, A281L, E283G, E283S, A285V, M291V, A324T, A328S, Q335N, L337V y/o L338W. En un aspecto, el polipéptido de AAR variante tiene una mutación M21L, una mutación C63G, una mutación S113K, T154A y una mutación A281L (SEQ ID NO: 58). En otro aspecto, el polipéptido de AAR

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variante tiene una mutación L8A, una mutación M21L, una mutación C63G, una mutación S113K, una mutación T154A y una mutación A281L (SEQ ID NO: 59). En otro aspecto, el polipéptido de AAR variante tiene una mutación D16L, una mutación M21L, una mutación C63G, una mutación S113k, T154A y una mutación A281L (SEQ ID NO: 60). En otro aspecto, el polipéptido de AAR variante tiene una mutación L8A, una mutación D24V, una mutación C63G, una mutación S113K, una mutación Q155L y una mutación A281L (SEQ ID NO: 61). En otro aspecto, el polipéptido de AAR variante tiene una mutación d24P, una mutación L31M, una mutación C63G, una mutación S113K, una mutación T154A y una mutación A281L (SEQ ID NO: 62). En otro aspecto, el polipéptido de AAR variante tiene una mutación L8A, una mutación D16L, una mutación D24V, una mutación C63G, una mutación S113K, una mutación T154A y una mutación A281L (SEQ ID NO: 63). En otro aspecto, el polipéptido de AAR variante tiene una mutación D24E, una mutación C63G, una mutación S113K, una mutación T154A y una mutación A281L (SEQ ID NO: 64).

Otro aspecto de la presente divulgación engloba una célula huésped recombinante que expresa los polipéptidos de AAR variantes tal como se describió anteriormente (véase antes). La célula huésped recombinante puede producir una composición de aldehído graso o alcohol graso con un título que es al menos el 10% mayor, al menos el 15% mayor, al menos el 20% mayor, al menos el 25% mayor o al menos el 30% mayor que el título de una composición de aldehído graso o alcohol graso producida por una célula huésped que expresa un polipéptido de AAR silvestre correspondiente, cuando se cultiva en medio que contiene una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar el polipéptido de AAR variante. La composición de aldehído graso o alcohol graso producida por la célula huésped recombinante puede producirse a un título de aproximadamente 30 g/l a aproximadamente 250 g/l. La composición de aldehído graso o alcohol graso puede producirse de manera extracelular.

La divulgación contempla además un cultivo celular que incluye la célula huésped recombinante que expresa los polipéptidos de AAR variantes tal como se describió anteriormente (véase antes). La composición de alcohol graso puede incluir un alcohol graso saturado y/o insaturado. El cultivo celular puede incluir una composición de alcohol graso que incluye uno o más de un alcohol graso C6, Ce, C10, C12, C13, C14, C15, C16, C17, y C18. La composición de alcohol graso puede incluir uno o más de un alcohol graso insaturado C101, C121, C141, C161, y C181. La composición de alcohol graso puede incluir un alcohol graso que tiene un doble enlace en la posición 7 en la cadena de carbonos entre C7 y Ce desde el extremo reducido del alcohol graso.

La divulgación engloba además un método de producción de una composición de alcohol graso que tiene un aumento del título, que incluye cultivar la célula huésped que expresa AAR variante (tal como se describió anteriormente) con una fuente de carbono; y recoger una composición de alcohol graso. El título del alcohol graso puede ser de al menos del 20% al 30% mayor que el título de una composición de alcohol graso producida por una célula huésped que expresa AAR silvestre.

La presente invención se define mediante las reivindicaciones. La presente invención proporciona un polipéptido de acil-ACP reductasa (AAR) variante que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 65, en el que el polipéptido de AAR variante comprende un ácido glutámico en la posición de aminoácido 61, y en el que el polipéptido cataliza la conversión de una acil-ACP en un aldehído graso. En una realización, la expresión del polipéptido de AAR variante en una célula huésped recombinante puede dar como resultado un mayor título de una composición de aldehído graso o alcohol graso en comparación con el título de una composición de aldehído graso o alcohol graso producida mediante la expresión de un polipéptido de AAR silvestre en una célula huésped silvestre correspondiente. En otra realización, la expresión del polipéptido de AAR variante en una célula huésped recombinante puede dar como resultado un mayor título de una composición de alcohol graso C12, C14 y/o C16 en comparación con el título de una composición de aldehído graso o alcohol graso producida mediante la expresión de un polipéptido de AAR silvestre en una célula huésped silvestre correspondiente.

La divulgación engloba además un polipéptido de acil-ACP reductasa (AAR) variante que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ ID NO: 34, en el que expresión del polipéptido de AAR variante en una célula huésped recombinante da como resultado un mayor título de una composición de aldehído graso o alcohol graso o un mayor título de una composición de alcohol graso C12, C14 y/o C16 en comparación con el título de una composición de alcohol graso producida mediante la expresión de un polipéptido de AAR silvestre en una célula huésped silvestre correspondiente, y en el que el polipéptido de AAR tiene una mutación en la posición de aminoácido 40, 52, 273, 303, 340, 344, 345 o 346. El polipéptido de AAR variante puede tener una mutación seleccionada de Q40V, G52V, G273E, K303G, H340P, L344A, L344D, L344S, L344T, L345R, V346P y V346G. El polipéptido de AAR variante puede tener una mutación en V346P (SEQ ID NO: 66), en Q40V (SEQ ID NO: 67), en A345R (SEQ ID NO: 68), en L344S (SEQ ID NO: 69), en V346G (SEQ ID NO: 70), en L344D (SEQ ID NO: 71), en G52V (SEQ ID NO: 72), en L344T (SEQ ID NO: 73), en K303G (SEQ ID NO: 74), en L344A (SEQ ID NO: 75), en H340P (SEQ ID NO: 76) o en G273E (SEQ ID NO: 77).

Aún otro aspecto de la divulgación engloba una célula huésped recombinante que expresa el polipéptido de AAR variante tal como se describió anteriormente (véase antes). La célula huésped recombinante puede producir una composición de aldehído graso o alcohol graso con un título que es al menos el 10% mayor, al menos el 15% mayor, al menos el 20% mayor, al menos el 25% mayor, o al menos el 30% mayor que el título de una composición de aldehído o alcohol graso producida por una célula huésped que expresa un polipéptido de AAR silvestre correspondiente, cuando se cultiva en medio que contiene una fuente de carbono en condiciones eficaces para

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expresar el polipéptido de AAR variante. La composición de alcohol graso puede producirse a un título de aproximadamente 30 g/l a aproximadamente 250 g/l. La composición de alcohol graso puede producirse de manera extracelular.

La divulgación contempla además un cultivo celular con la célula huésped recombinante que expresa el polipéptido de AAR variante tal como se describió anteriormente (véase antes). La composición de alcohol graso puede incluir uno o más de un alcohol graso Ce, C8, C10, C12, C13, C14, C15, C16, C17, y C18. La composición de alcohol graso puede incluir un alcohol graso insaturado o saturado. La composición de alcohol graso puede incluir uno o más de un alcohol graso insaturado Cm1, C12:1, C14:1, Cm1, y C18:1. La composición de alcohol graso puede incluir un alcohol graso que tiene un doble enlace en la posición 7 en la cadena de carbonos entre C7 y C8 desde el extremo reducido del alcohol graso.

Otro aspecto de la divulgación engloba un método de producción de una composición de alcohol graso que tiene un aumento del título, que incluye cultivar la célula huésped que expresa la AAR (tal como se describió anteriormente) con una fuente de carbono; y recoger una composición de alcohol graso. El alcohol graso puede ser de al menos del 20% al 30% mayor que el título de una composición de alcohol graso producida por una célula huésped que expresa AAR silvestre.

Breve descripción de los dibujos

La presente divulgación se entiende mejor cuando se lee junto con las figuras adjuntas, que sirven para ilustrar las realizaciones preferidas. Sin embargo, se entiende que la divulgación no se limita a las realizaciones específicas dadas a conocer en las figuras.

La figura 1 es una visión general esquemática de una ruta de biosíntesis a modo de ejemplo para su uso en la producción de acil-CoA como precursor para dar derivados de ácido graso en una célula huésped recombinante. El ciclo se inicia mediante la condensación de malonil-ACP y acetil-CoA.

La figura 2 es una visión general esquemática de un ciclo de biosíntesis de ácidos grasos a modo de ejemplo, en el que los ciclos de elongación comienzan con la condensación de malonil-ACP y una acil-ACP catalizada por p- cetoacil-ACP sintasa I (fabB) y p-cetoacil-ACP sintasa II (fabF) para producir una p-ceto-acil-ACP, luego la p-ceto- acil-ACP se reduce por una p-cetoacil-ACP reductasa dependiente de NADPH (fabG) para producir una p-hidroxi- acil-ACP, que se deshidrata para dar una trans-2-enoil-acil-ACP por p-hidroxiacil-ACP deshidratasa (fabA o fabZ). FabA también puede isomerizar trans-2-enoil-acil-ACP para dar c/s-3-enoil-acil-ACP, que puede sortear a fabI y puede usarse por fabB (normalmente para una longitud de cadena alifática de hasta C16) para producir p-ceto-acil- ACP. La etapa final en cada ciclo está catalizada por una enoil-ACP reductasa dependiente de NADH o NADHPH (fabI) que convierte trans-2-enoil-acil-ACP en acil-ACP. En los métodos descritos en el presente documento, se produce la terminación de la síntesis de ácidos grasos mediante la retirada por tioesterasa del grupo acilo de acil- ACP para liberar ácidos grasos libres (FFA, free fatty ac/d). Las tioesterasas (por ejemplo, tesA) hidrolizan enlaces tioéster, que aparecen entre cadenas de acilo y ACP a través de enlaces sulfhidrilo.

La figura 3 ilustra la estructura y función del complejo enzimático de acetil-CoA carboxilasa (accABCD). La biotina carboxilasa está codificada por el gen accC, mientras que la proteína transportadora de biotina y carboxilo (BCCP) está codificada por el gen accB. Las dos subunidades implicadas en la actividad carboxilo transferasa están codificadas por los genes accA y accD. La biotina unida covalentemente de BCCP transporta el resto carboxilato. El gen b/rA biotinila holo-accB.

La figura 4 presenta una visión general esquemática de una ruta de biosíntesis a modo de ejemplo para la producción de alcohol graso partiendo de acil-ACP, en la que la producción de aldehído graso está catalizada por la actividad enzimática de acil-ACP reductasa (AAR) o tioesterasa y ácido carboxílico reductasa (Car). El aldehído graso se convierte en alcohol graso por aldehído reductasa (también denominada alcohol deshidrogenasa). Esta ruta no incluye acil graso-CoA sintetasa (fadD).

La figura 5 muestra la producción de alcoholes grasos en E. col/ DV2 que expresa acil-ACP reductasa de Synechococcus elongatus (AAR_7942) y que coexpresa diversas proteínas transportadoras de acilo (ACP) cianobacterianas.

La figura 6 muestra la producción de alcoholes grasos en E. col/ DV2 que expresa acil-ACP reductasa de Synechococcus elongatus (AAR_7942) (pLS9-185) y que coexpresa el complejo de acetil carboxilasa de Corynebacter/um glutam/cum (pSL9-185-D+) (se muestran tres cepas individuales, véanse D+1, D+2 y D+3).

La figura 7 presenta resultados que ilustran la producción mejorada de alcoholes grasos de células huésped recombinantes que se basan en la sobreexpresión de AAR mediada por ifab e ifadR.

La figura 8 presenta resultados que muestran niveles de alcoholes grasos elevados en células huésped recombinantes que expresan variantes de AAR_7942 derivadas de bibliotecas de combinación (AAR_Com 2a-d) que se coexpresan con ACP, AlrA (alcohol deshidrogenasa (ADH)) y un operón acc sintético en la cepa Shu2. Son útiles varios polipéptidos de alcohol deshidrogenasa según la divulgación e incluyen, pero no se limitan a AlrA de

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Acinetobacter sp. M-1 (SEQ ID NO: 52) y un homólogo de AlrA tal como AlrAadpl (SEQ ID NO: 53)

Las figuras 9A y 9B presentan resultados de una fermentación en tanque de la variante de AAR_7942 S18W que ilustran el título de FALC (9A) y el rendimiento con respecto a glucosa (9B) que muestran que la expresión de la variante de AAR_7942 S18W da como resultado actividad y distribución de longitud de cadena alteradas.

La figura 10 presenta resultados que ilustran un desplazamiento en la distribución de longitud de cadena para FALC desde C16 hasta C14 cuando la variante de D61E de MED4_AAR se expresó en células huésped recombinantes.

Descripción detallada

Visión general

Un modo de eliminar la dependencia de los productos petroquímicos es producir derivados de ácido graso tales como aldehídos grasos y alcoholes grasos a través de microorganismos respetuosos con el medio ambiente que sirven como huéspedes de producción en miniatura. Tales huéspedes celulares (es decir, células huésped recombinantes o cepas de producción) se han modificado por ingeniería para producir aldehídos grasos y/o alcoholes grasos a partir de fuentes renovables tales como materia prima renovable (por ejemplo, azúcares fermentables, hidratos de carbono, biomasa, celulosa, glicerol, CO, CO2, etc.). Estos aldehídos grasos y alcoholes grasos son los materiales de partida para muchos productos industriales incluyendo detergentes y combustibles.

La presente divulgación se refiere a variantes de enzima acil-ACP reductasa (AAR) que dan como resultado título, rendimiento y/o productividad mejorados de composiciones de aldehído graso y/o alcohol graso cuando se expresan en células huésped recombinantes. En el presente documento, se logra la biosíntesis potenciada de aldehído graso y/o alcohol graso transformando células huésped de manera que expresen una proteína acil-ACP reductasa (AAR) variante, que cataliza la reacción de una acil-ACP para dar un aldehído graso y/o un alcohol graso. La divulgación se refiere además a las células huésped recombinantes o cepas de producción que expresan las variantes de enzima AAR.

Definiciones

Tal como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un/o”, “una” y “el/la” incluyen referentes en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “una célula huésped” incluye dos o más de tales células huésped, la referencia a “un éster graso” incluye uno o más ésteres grasos, o mezclas de ésteres, la referencia a “una secuencia de ácido nucleico” incluye una o más secuencias de ácido nucleico, la referencia a “una enzima” incluye una o más enzimas, y similares.

Los números de registro en la totalidad de esta descripción se obtuvieron de bases de datos proporcionadas por el NCBI (Centro Nacional para la Información Biotecnológica) mantenidas por los Institutos Nacionales de Salud, EE.UU. (que se identifican en el presente documento como “números de registro de NCBI” o alternativamente como “números de registro de GenBank”), y de las bases de datos UniProt Knowledgebase (UniProtKB) y Swiss-Prot proporcionadas por el Instituto Suizo de Bioinformática (que se identifican en el presente documento como “números de registro de UniProtKB”).

Se establecen los números de clasificación de enzimas (EC) por el Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (IUBMB), cuya descripción está disponible en el sitio web de Nomenclatura de Enzimas del IUBMB en Internet. Los números EC clasifican las enzimas según la reacción que catalizan. Por ejemplo, la actividad enzimática acil-ACP reductasa (AAR) se clasifica según E.C. 1.2.1.80 (también conocida como acil-[proteína transportadora de acilo] de cadena larga reductasa) o EC 1.2.1.42. La funcionalidad de AAR se conserva en la mayor parte de procariotas de una especie a la siguiente. Por tanto, diferentes especies microbianas pueden portar la misma actividad enzimática AAR que se clasifica según E.C. 1.2.1.80 o EC 1.2.1.42.

Tal como se usa en el presente documento, el término “nucleótido” se refiere a una unidad monomérica de un polinucleótido que consiste en una base heterocíclica, un azúcar y uno o más grupos fosfato. Las bases que se producen de manera natural (guanina, (G), adenina, (A), citosina, (C), timina, (T) y uracilo (U)) son normalmente derivados de purina o pirimidina, aunque debe entenderse que también están incluidos análogos de bases que se producen de manera natural y no natural. El azúcar que se produce de manera natural es la pentosa (azúcar de cinco carbonos), la desoxirribosa (que forma ADN) o la ribosa (que forma ARN), aunque debe entenderse que también están incluidos análogos de azúcares que se producen de manera natural y no natural. Los ácidos nucleicos se unen normalmente mediante enlaces fosfato para formar ácidos nucleicos o polinucleótidos, aunque se conocen en la técnica muchas otras uniones (por ejemplo, fosforotioatos, boranofosfatos, y similares).

El término “polinucleótido” se refiere a un polímero de ribonucleótidos (ARN) o deoxirribonucleótidos (ADN), que puede ser monocaterio o bicatenario y que puede contener nucleótidos no naturales o alterados. Los términos “polinucleótido”, “secuencia de ácido nucleico” y “secuencia de nucleótidos” se usan de manera intercambiable en el presente documento para referirse a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, o bien ARN o bien ADN. Estos términos se refieren a la estructura primaria de la molécula, y por tanto incluyen ADN bi y monocatenario y ARN bi y monocatenario. Los términos incluyen, como equivalentes, análogos de o bien aRn o bien ADN

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producidos a partir de análogos de nucleótidos y polinucleótidos modificados tales como, aunque no limitados a polinucleótidos metilados y/o de extremos ocupados. El polinucleótido puede estar en cualquier forma, incluyendo pero sin limitarse a, plásmido, viral, cromosómico, EST, ADNc, ARNm y ARNr.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “polipéptido” y “proteína” se usan de manera intercambiable para referirse a un polímero de residuos de aminoácido. El término “polipéptido recombinante” se refiere a un polipéptido que se produce mediante técnicas recombinantes, en las que generalmente se inserta ADN o ARN que codifica para la proteína expresada en un vector de expresión adecuado que se usa a su vez para transformar una célula huésped para producir el polipéptido. De manera similar, los términos “polinucleótido recombinante” o “ácido nucleico recombinante” o “ADN recombinante” se producen mediante técnicas recombinantes que conocen los expertos en la técnica.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “homólogo” y “homólogo/a” se refieren a un polinucleótido o un polipéptido que comprende una secuencia que es idéntica en al menos aproximadamente el 50 por ciento (%) a la secuencia de polinucleótido o polipéptido correspondiente. Preferiblemente, los polinucleótidos o polipéptidos homólogos tienen secuencias de polinucleótido o secuencias de aminoácidos que tienen una homología de al menos aproximadamente el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o al menos aproximadamente el 99% con la secuencia de aminoácidos o secuencia de polinucleótido correspondiente. Tal como se usa en el presente documento los términos “homología” de secuencia e “identidad” de secuencia se usan de manera intercambiable. Un experto habitual en la técnica conoce métodos para determinar la homología entre dos o más secuencias. En resumen, pueden realizarse cálculos de “homología” entre dos secuencias de la siguiente manera. Las secuencias se alinean para fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico para la alineación óptima y pueden excluirse las secuencias no homólogas para fines de comparación). En una realización preferida, la longitud de una primera secuencia que se alinea para fines de comparación es de al menos aproximadamente el 30%, preferiblemente al menos aproximadamente el 40%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 50%, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente el 60%, e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 98% o aproximadamente el 100% de la longitud de una segunda secuencia. Se comparan entonces los residuos de aminoácido o nucleótidos en posiciones de aminoácido o posiciones de nucleótido correspondientes de las secuencias primera y segunda. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El tanto por ciento de homología entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para la alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y determinación del tanto por ciento de homología entre dos secuencias puede lograrse usando un algoritmo matemático, tal como BLAST (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215(3):403-410). El tanto por ciento de homología entre dos secuencias de aminoácidos también puede determinarse usando el algoritmo de Needleman y Wunsch que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software de GCG, usando o bien una matriz Blossum 62 o bien una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 (Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453). El tanto por ciento de homología entre dos secuencias de nucleótidos también puede determinarse usando el programa GAP en el paquete de software de GCG, usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Un experto habitual en la técnica puede realizar cálculos de homología inicial y ajustar los parámetros del algoritmo en consecuencia. Un conjunto preferido de parámetros (y el que debe usarse si un profesional no está seguro de qué parámetros deben aplicarse para determinar si una molécula está dentro de una limitación de homología de las reivindicaciones) son una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización por hueco de 12, penalización por extensión de hueco de 4 y penalización por hueco con desplazamiento del marco de lectura de 5. Se conocen métodos adicionales de alineación de secuencias en las técnicas biotecnológicas (véase, por ejemplo, Rosenberg (2005) BMC Bioinformatics 6:278; Altschul et al. (2005) FEBS J. 272(20):5101-5109).

El término “se hibrida en condiciones de rigurosidad baja, rigurosidad media, rigurosidad alta o condiciones de rigurosidad muy alta” describe condiciones para la hibridación y el lavado. Puede encontrarse orientación para realizar reacciones de hibridación en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 - 6.3.6. Se describen métodos acuosos y no acuosos en esa referencia y puede usarse cualquier método. Condiciones de hibridación específicas a las que se hace referencia en el presente documento son de la siguiente manera: (1) condiciones de hibridación de rigurosidad baja -- 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido por dos lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% al menos a 50°C (la temperatura de los lavados puede aumentarse hasta 55°C para condiciones de rigurosidad baja); (2) condiciones de hibridación de rigurosidad media -- 6X SSC a aproximadamente 45°C, seguido por uno o más lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 60°C; (3) condiciones de hibridación de rigurosidad alta -- 6X SSC a aproximadamente 45°C, seguido por uno o más lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 65°C; y (4) condiciones de hibridación de rigurosidad muy alta -- fosfato de sodio 0,5 M, 7% SDS a 65°C, seguido por uno o más lavados a 0,2X SSC, SDS al 1% a 65°C. Las condiciones de rigurosidad muy alta (4) son las condiciones preferidas a menos que se especifique de otro modo.

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Un polipéptido “endógeno” se refiere a un polipéptido codificado por el genoma de la célula parental (o célula huésped). Un polipéptido “exógeno” se refiere a un polipéptido que no está codificado por el genoma de la célula parental. Un polipéptido variante o mutante es un ejemplo de un polipéptido exógeno. Por tanto, se considera que una molécula de ácido nucleico que se produce de manera no natural es exógena para una célula una vez introducida en la célula. Una molécula de ácido nucleico que se produce de manera natural también puede ser exógena para una célula particular. Por ejemplo, una secuencia codificante completa aislada de la célula X es un ácido nucleico exógeno con respecto a la célula Y una vez que se introduce la secuencia codificante en la célula Y, aunque X e Y sean el mismo tipo celular.

El término “sobreexpresado” significa que se hace que se transcriba un gen a una tasa elevada en comparación con la tasa de transcripción endógena para ese gen. En algunos ejemplos, la sobreexpresión incluye adicionalmente una tasa de traducción elevada del gen en comparación con la tasa de transcripción endógena para ese gen. Se conocen bien en la técnica métodos de prueba de la sobreexpresión, por ejemplo pueden evaluarse los niveles de ARN transcrito usando rtPCR y pueden evaluarse los niveles de proteína usando análisis en gel mediante SDS- PAGE.

El término “heterólogo” significa derivados de un organismo diferente, tipo celular diferente o especie diferente. Tal como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de nucleótidos, de polinucleótido, de polipéptido o de proteína, no presente de manera natural en un organismo dado. Por ejemplo, una secuencia de polinucleótido que es nativa para cianobacterias puede introducirse en una célula huésped de E. coli mediante métodos recombinantes, y el polinucleótido de cianobacterias es entonces heterólogo para la célula de E. coli (por ejemplo, célula recombinante). El término “heterólogo” también puede usarse con referencia a una secuencia de nucleótidos, de polinucleótido, de polipéptido o de proteína que está presente en una célula huésped recombinante en un estado no nativo. Por ejemplo, una secuencia de nucleótido, polinucleótido, polipéptido o proteína “heteróloga” puede modificarse con relación a la secuencia silvestre presente de manera natural en la célula huésped silvestre correspondiente, por ejemplo, una modificación en el nivel de expresión o en la secuencia de un nucleótido, polinucleótido, polipéptido o proteína.

Tal como se usa en el presente documento, el término “fragmento” de un polipéptido se refiere a una parte más corta de un polipéptido o una proteína de longitud completa cuyo tamaño oscila entre dos residuos de aminoácido y toda la secuencia de aminoácidos menos un residuo de aminoácido. En determinadas realizaciones de la divulgación, un fragmento se refiere a toda la secuencia de aminoácidos de un dominio de un polipéptido o una proteína (por ejemplo, un dominio de unión a sustrato o un dominio catalítico).

El término “mutagénesis” se refiere a un procedimiento mediante el cual se cambia la información genética de un organismo de manera estable. La mutagénesis de una secuencia de ácido nucleico que codifica para proteína produce una proteína mutante. Mutagénesis también se refiere a cambios en secuencias de ácido nucleico no codificantes que dan como resultado actividad de proteína modificada.

Una “mutación”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un cambio permanente en una posición de ácido nucleico de un gen o en una posición de aminoácido de un polipéptido o una proteína. Las mutaciones incluyen sustituciones, adiciones, inserciones y deleciones. Por ejemplo, una mutación en una posición de aminoácido puede ser una sustitución de un tipo de aminoácido por otro tipo de aminoácido (por ejemplo, puede sustituirse una serina (S) por una alanina (A); puede sustituirse una lisina (L) por una T (treonina); etc.). Como tal, un polipéptido o una proteína pueden tener una o más mutaciones en las que se sustituye un aminoácido por otro aminoácido.

Los términos “variante de acil-ACP reductasa (AAR)” y “acil-ACP reductasa (AAR) variante” se usan de manera intercambiable en el presente documento y significan un polipéptido o una proteína relacionados con AAR que tienen una o más mutaciones en su secuencia de aminoácidos. La AAR se refiere a una enzima que cataliza la reducción de una acil-ACP para dar un aldehído graso y/o un alcohol graso. La variante de AAR puede englobar una mutación en uno o más aminoácidos de su secuencia de polipéptido. Cuando se ha transformado una célula con una variante de AAR es una célula que expresa la variante de aAr (por ejemplo, una célula recombinante). En una realización, el título y/o rendimiento de un alcohol graso producido por una célula que expresa la variante de AAR es al menos el doble del de una célula silvestre correspondiente (es decir, una célula correspondiente que no expresa la variante de AAR). En un huésped heterólogo tal como Escherichia coli, pueden convertirse aldehídos grasos en alcoholes grasos por alcohol deshidrogenasas endógenas. En otra realización, el título y/o rendimiento de un alcohol graso producido por una célula que expresa la variante de AAR es al menos aproximadamente 1 vez, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 9 veces o al menos aproximadamente 10 veces mayor que el de una célula silvestre correspondiente. En una realización, el título y/o rendimiento de un alcohol graso producido por una célula que expresa la variante de AAR es al menos aproximadamente el 1 por ciento, al menos aproximadamente el 2 por ciento, al menos aproximadamente el 3 por ciento, al menos aproximadamente el 4 por ciento, al menos aproximadamente el 5 por ciento, al menos aproximadamente el 6 por ciento, al menos aproximadamente el 7 por ciento, al menos aproximadamente el 8 por ciento, al menos aproximadamente el 9 por ciento o aproximadamente el 10 por ciento mayor que el de una célula silvestre correspondiente. En otra realización,

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el título y/o rendimiento de alcoholes grasos producidos en una célula recombinante debido a la expresión de una variante de AAR es de al menos aproximadamente el 20 por ciento a al menos aproximadamente el 100 por ciento mayor que el de una silvestre célula. En realizaciones particulares, el título y/o rendimiento de un alcohol graso producido por una célula es al menos aproximadamente el 20 por ciento, al menos aproximadamente el 25 por ciento, al menos aproximadamente el 30 por ciento, al menos aproximadamente el 35 por ciento, al menos aproximadamente el 40 por ciento, al menos aproximadamente el 45 por ciento al menos aproximadamente el 50 por ciento, al menos aproximadamente el 55 por ciento, al menos aproximadamente el 60 por ciento, al menos aproximadamente el 65 por ciento, al menos aproximadamente el 70 por ciento, al menos aproximadamente el 75 por ciento, al menos aproximadamente el 80 por ciento, al menos aproximadamente el 85 por ciento, al menos aproximadamente el 90 por ciento, al menos aproximadamente el 95 por ciento, al menos aproximadamente el 97 por ciento, al menos aproximadamente el 98 por ciento, o al menos aproximadamente el 100 por ciento mayor que el de la célula silvestre correspondiente.

Tal como se usa en el presente documento, el término “gen” se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican para o bien un producto de ARN o bien un producto de proteína, así como secuencias de ácido nucleico operativamente unidas que afectan a la expresión del ARN o la proteína (por ejemplo, tales secuencias incluyen pero no se limitan a secuencias promotoras o potenciadoras) o secuencias de ácido nucleico operativamente unidas que codifican para secuencias que afectan a la expresión del ARN o la proteína (por ejemplo, tales secuencias incluyen pero no se limitan a sitios de unión al ribosoma o secuencias de control de la traducción).

Se conocen en la técnica secuencias de control de la expresión e incluyen, por ejemplo, promotores, potenciadores, señales de poliadenilación, terminadores de la transcripción, sitios internos de entrada al ribosoma (IRES), y similares, que proporcionan la expresión de la secuencia de polinucleótido en una célula huésped. Las secuencias de control de la expresión interaccionan específicamente con proteínas celulares implicadas en la transcripción (Maniatis et al. (1987) Science 236:1237-1245). Se describen secuencias de control de la expresión a modo de ejemplo, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). En los métodos de la divulgación, una secuencia de control de la expresión está operativamente unida a una secuencia de polinucleótido. Por “operativamente unida” quiere decirse que una secuencia de polinucleótido y una secuencia de control de la expresión se conectan de tal manera que se permita la expresión génica cuando se unen las moléculas apropiadas (por ejemplo, proteínas activadoras de la transcripción) a la secuencia de control de la expresión. Están ubicados promotores operativamente unidos en el sentido de 5' de la secuencia de polinucleótido seleccionada en cuanto a la dirección de transcripción y traducción. Pueden estar ubicados potenciadores operativamente unidos en el sentido de 5', dentro de o en el sentido de 3' del polinucleótido seleccionado.

Tal como se usa en el presente documento, el término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico, es decir, una secuencia de polinucleótido, a la que se ha unido. Un tipo de vector útil es un episoma (es decir, un ácido nucleico que puede dar replicación extracromosómica). Los vectores útiles son aquéllos que pueden dar replicación y/o expresión autónoma de ácidos nucleicos a los que se unen. Los vectores que pueden dirigir la expresión de genes a los que se unen operativamente se denominan en el presente documento “vectores de expresión”. En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de “plásmidos”, que se refieren en general a bucles de ADN bicatenario circular que, en su forma de vector, no se unen al cromosoma. Otros vectores de expresión útiles se proporcionan en forma lineal. También están incluidas otras de tales formas de vectores de expresión que sirven para funciones equivalentes y que se han conocido en la técnica posteriormente al presente documento. En algunas realizaciones, un vector recombinante incluye además un promotor operativamente unido a la secuencia de polinucleótido. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor regulado en el desarrollo, un promotor específico de orgánulo, un promotor específico de tejido, un promotor inducible, un promotor constitutivo o un promotor específico de célula. El vector recombinante comprende normalmente al menos una secuencia seleccionada de una secuencia de control de la expresión acoplada operativamente a la secuencia de polinucleótido; un marcador de selección acoplado operativamente a la secuencia de polinucleótido; una secuencia de marcador acoplada operativamente a la secuencia de polinucleótido; un resto de purificación acoplado operativamente a la secuencia de polinucleótido; una secuencia de secreción acoplada operativamente a la secuencia de polinucleótido; y una secuencia de selección como diana acoplada operativamente a la secuencia de polinucleótido. En determinadas realizaciones, la secuencia de nucleótidos se incorpora de manera estable en el ADN genómico de la célula huésped, y la expresión de la secuencia de nucleótidos está bajo el control de una región promotora regulada. Los vectores de expresión tal como se usan en el presente documento incluyen una secuencia de polinucleótido particular tal como se describe en el presente documento en una forma adecuada para la expresión de la secuencia de polinucleótido en una célula huésped. Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que va transformarse, el nivel de expresión de polipéptido deseado, etc. Los vectores de expresión descritos en el presente documento pueden introducirse en células huésped para producir polipéptidos, incluyendo polipéptidos de fusión, codificados por las secuencias de polinucleótido tal como se describe en el presente documento. La expresión de genes que codifican para polipéptidos en procariotas, por ejemplo, E. coli, se lleva a cabo con la mayor frecuencia con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de polipéptidos o bien de fusión o bien de no fusión. Los vectores de fusión añaden un número de aminoácidos a un polipéptido codificado en el mismo, habitualmente al extremo amino-

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terminal o carboxi-terminal del polipéptido recombinante. Tales vectores de fusión sirven normalmente para uno o más de los tres propósitos siguientes, incluyendo aumentar la expresión del polipéptido recombinante; aumentar la solubilidad del polipéptido recombinante; y ayudar en la purificación del polipéptido recombinante actuando como ligando en purificación por afinidad. A menudo, en los vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión del resto de fusión y el polipéptido recombinante. Esto permite la separación del polipéptido recombinante del resto de fusión después de la purificación del polipéptido de fusión. En determinadas realizaciones, una secuencia de polinucleótido de la divulgación está operativamente unida a un promotor derivado del bacteriófago T5.

En determinadas realizaciones, la célula huésped es una célula de levadura, y el vector de expresión es un vector de expresión de levadura. Los ejemplos de vectores para la expresión en la levadura S. cerevisiae incluyen pYepSec1 (Baldari et al. (1987) EMBO J. 6:229-234); pMFa (Kurjan et al. (1982) Cell 30:933-943); pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 113-123); pYES2 (Invitrogen Corp., San Diego, Ca) y picZ (Invitrogen Corp., San Diego, CA). En otras realizaciones, la célula huésped es una célula de insecto, y el vector de expresión es un vector de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto en cultivo (por ejemplo, células Sf9) incluyen, por ejemplo, la serie de pAc (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y la serie de pVL (Lucklow et al. (1989) Virology 170:31-39). En aún otra realización, las secuencias de polinucleótido descritas en el presente documento pueden expresarse en células de mamífero usando un vector de expresión de mamífero. Se conocen bien en la técnica otros sistemas de expresión adecuados para células tanto procariotas como eucariotas; véase, por ejemplo, Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989).

Tal como se usa en el presente documento, el término “CoA” o “acil-CoA” se refiere a un acil-tioéster formado entre el carbono de carbonilo de la cadena de alquilo y el grupo sulfhidrilo del resto 4'-fosfopantetionilo de la coenzima A (CoA), que tiene la fórmula R-C(O)S-CoA, en la que R es cualquier grupo alquilo que tiene al menos 4 átomos de carbono.

El término “ACP” significa proteína transportadora de acilo. ACP es un producto intermedio transportador de acilo altamente conservado durante la biosíntesis de ácidos grasos, en el que la cadena en crecimiento se une durante la síntesis como éster de tiol en el tiol distal de un resto 4'-fosfopanteteína. La proteína existe en dos formas, es decir, apo-ACP (inactiva en la biosíntesis de ácidos grasos) y ACP o holo-ACP (activa en la biosíntesis de ácidos grasos). Los términos “ACP” y “holo-ACP” se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a la forma activa de la proteína. Una enzima denominada fosfopanteteiniltransferasa está implicada en la conversión de la apo-ACP inactiva en la holo-ACP activa. Más específicamente, ACP se expresa en la forma apo-ACP inactiva y debe unirse de manera postraduccional un resto 4'-fosfopanteteína a un residuo de serina conservado en la ACP mediante la acción de la proteína transportadora de holo-acilo sintasa (ACPS), una fosfopanteteiniltransferasa, para producir holo-ACP.

Tal como se usa en el presente documento, el término “acil-ACP” se refiere a un acil-tioéster formado entre el carbono de carbonilo de una cadena de alquilo y el grupo sulfhidrilo del resto fosfopanteteinilo de una proteína transportadora de acilo (ACP). En algunas realizaciones, una ACP es un producto intermedio en la síntesis acil-ACP totalmente saturadas. En otras realizaciones, una ACP es un producto intermedio en la síntesis de acil-ACP insaturadas. En algunas realizaciones, la cadena de carbonos tendrá aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25 ó 26 carbonos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “derivado de ácido graso” significa un “ácido graso” o un “derivado de ácido graso”, al que puede hacerse referencia como “ácido graso o derivado del mismo”. El término “ácido graso” significa un ácido carboxílico que tiene la fórmula RCOOH. R representa un grupo alifático, preferiblemente un grupo alquilo. R puede incluir entre aproximadamente 4 y aproximadamente 22 átomos de carbono. Los ácidos grasos pueden ser saturados, monoinsaturados o poliinsaturados. Un “derivado de ácido graso” es un producto producido en parte a partir de la ruta de biosíntesis de ácidos grasos del organismo huésped de producción. Los “derivados de ácido graso” incluyen productos producidos en parte a partir de ACP, acil-ACP o derivados de acil-ACP. Los derivados de ácido graso a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, acil-CoA, ácidos grasos, aldehídos grasos, alcoholes de cadena corta y larga, alcoholes grasos, hidrocarburos, ésteres (por ejemplo, ceras, ésteres de ácidos grasos o ésteres grasos), olefinas terminales, olefinas internas y cetonas.

Tal como se usa en el presente documento, el término “ruta de biosíntesis de ácidos grasos” significa una ruta de biosíntesis que produce ácidos grasos y derivados de los mismos. La ruta de biosíntesis de ácidos grasos puede incluir enzimas adicionales para producir derivados de ácidos grasos que tienen características deseadas.

Tal como se usa en el presente documento, “aldehído graso” significa un aldehído que tiene la fórmula RCHO caracterizada por un grupo carbonilo (C=O). En algunas realizaciones, el aldehído graso es cualquier aldehído producido a partir de un alcohol graso. En determinadas realizaciones, el grupo R tiene al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18 o al menos 19, carbonos de longitud. Alternativamente, o además, el grupo R tiene 20 o menos, 19 o menos, 18 o menos, 17 o menos, 16 o menos, 15 o menos, 14 o menos, 13 o menos, 12 o menos, 11 o menos, 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos o 6 o menos carbonos de longitud. Por tanto, el

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grupo R puede tener un grupo R delimitado por dos cualesquiera de los extremos anteriores. Por ejemplo, el grupo R puede tener 6-16 carbonos de longitud, 10-14 carbonos de longitud o 12-18 carbonos de longitud. En algunas realizaciones, el aldehído graso es un aldehído graso C6, C7, Ce, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18 C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25, o uno C26. En determinadas realizaciones, el aldehído graso es un aldehído graso C6, Ce,

C10, C12, C13, C14, C15, C16, C17 o C18.

Tal como se usa en el presente documento, “alcohol graso” significa un alcohol que tiene la fórmula ROH. En algunas realizaciones, el grupo R tiene al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18 o al menos 19, carbonos de longitud. Alternativamente, o además, el grupo R tiene 20 o menos, 19 o menos, 18 o menos, 17 o menos, 16 o menos, 15 o menos, 14 o menos, 13 o menos, 12 o menos, 11 o menos, 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos o 6 o menos carbonos de longitud. Por tanto, el grupo R puede tener un grupo R delimitado por dos cualesquiera de los extremos anteriores. Por ejemplo, el grupo R puede tener 6-16 carbonos de longitud, 10-14 carbonos de longitud o 12-18 carbonos. En algunas realizaciones, el alcohol graso es un alcohol graso C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25, o uno C26. En determinadas realizaciones, el alcohol graso es un alcohol graso C6, C8, C10, C12, C13, C14, C15, C16, C17 o C18.

Una “composición de alcohol graso” tal como se hace referencia en el presente documento se produce por una célula huésped recombinante y comprende normalmente una mezcla de alcoholes grasos. En algunos casos, la mezcla incluye más de un tipo de producto (por ejemplo, alcoholes grasos y ácidos grasos). En otros casos, las composiciones de derivado de ácido graso pueden comprender, por ejemplo, una mezcla de alcoholes grasos con diversas longitudes de cadena y características de saturación o ramificación. En todavía otros casos, la composición de alcohol graso comprende una mezcla de tanto más de un tipo de producto como de productos con diversas longitudes de cadena y características de saturación o ramificación.

Una célula huésped modificada por ingeniería para producir un aldehído graso convertirá normalmente parte del aldehído graso en un alcohol graso. En una realización a modo de ejemplo, se convierte acil-ACP en un aldehído graso mediante la acción de AAR. La conversión de aldehídos grasos en alcoholes grasos puede verse facilitada además, por ejemplo, mediante un polipéptido de biosíntesis de alcoholes grasos. En algunas realizaciones, un gen que codifica para un polipéptido de biosíntesis de alcoholes grasos se expresa o sobreexpresa en la célula huésped. En determinadas realizaciones, el polipéptido de biosíntesis de alcoholes grasos tiene actividad aldehído reductasa o alcohol deshidrogenasa.

Los ejemplos de polipéptidos de alcohol deshidrogenasa útiles según la divulgación incluyen, pero no se limitan a AlrA de Acinetobacter sp. M-1 (SEQ ID NO: 52) u homólogos de AlrA, tales como AlrAadp1 (SEQ ID NO:53) y alcohol deshidrogenasas de E. coli endógenas tales como YjgB, (AAC77226), DkgA (NP_417485), DkgB (NP_414743), YdjL (AAC74846), YdjJ (NP_416288), AdhP (NP_415995), YhdH (NP_417719), YahK (NP_414859), YphC (AAC75598), YqhD (446856) e YbbO [AAC73595.1]. Se describen ejemplos adicionales en las publicaciones de solicitud de patente internacional n.os WO 2007/136762, WO2008/119082 y WO 2010/062480. En determinadas realizaciones, el polipéptido de biosíntesis de alcoholes grasos tiene actividad aldehído reductasa o alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1).

El grupo R de un ácido graso, aldehído graso o alcohol graso puede ser una cadena lineal o una cadena ramificada. Las cadenas ramificadas pueden tener más de un punto de ramificación y pueden incluir ramificaciones cíclicas. En algunas realizaciones, el ácido graso ramificado, aldehído graso ramificado o alcohol graso ramificado es un ácido graso ramificado, aldehído graso ramificado o alcohol graso ramificado C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15,

C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25, o uno C26. En realizaciones particulares, el ácido graso ramificado, aldehído graso ramificado o alcohol graso ramificado es un ácido graso ramificado, aldehído graso ramificado o alcohol graso ramificado C6, C8, C10, C12, C13, C14, C15, C16, C17 o C18. En determinadas realizaciones, el grupo hidroxilo del ácido graso ramificado, aldehído graso ramificado o alcohol graso ramificado está en la posición primaria (C1).

En determinadas realizaciones, el ácido graso ramificado, aldehído graso ramificado o alcohol graso ramificado es un ácido graso iso, aldehído graso iso o alcohol graso iso, o un ácido graso anteiso, un aldehído graso anteiso o alcohol graso anteiso. En realizaciones a modo de ejemplo, el ácido graso ramificado, aldehído graso ramificado o alcohol graso ramificado se selecciona de ácido graso ramificado, aldehído graso ramificado o alcohol graso ramificado iso-C7:0, iso-C8:0, iso-C9:0, iso-C10:0, iso-Cn:0, iso-C12:0, iso-C13:0, iso-C14:0, iso-C15:0, iso-C16:0, iso-C17:0, iso-

C18:0, iso-C19:0, anteiso-C7:0, anteiso-C8:0, anteiso-C9:0, anteiso-C10:0, anteiso-Cn:0,anteiso-C12:0, anteiso-C13:0, anteiso- C14:0, anteiso-C15:0, anteiso-C16:0, anteiso-C17:0, anteiso-C18:0 y anteiso-C19:0.

El grupo R de un ácido graso ramificado o no ramificado, aldehído graso ramificado o no ramificado o alcohol graso ramificado o no ramificado puede ser saturado o insaturado. Si es insaturado, el grupo R puede tener uno o más de un punto de insaturación. En algunas realizaciones, el ácido graso insaturado, aldehído graso insaturado o alcohol graso insaturado es un ácido graso monoinsaturado, aldehído graso monoinsaturado o alcohol graso monoinsaturado. En determinadas realizaciones, el ácido graso insaturado, aldehído graso insaturado o alcohol graso insaturado es un ácido graso insaturado, aldehído graso insaturado o alcohol graso insaturado C61, C71, C81,

C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C^:1, C19:1, C20:1, C21:1, C22:1, C23:1, C24:1, C25:1, o uno C26:1. En

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determinadas realizaciones preferidas, el ácido graso insaturado, aldehido graso insaturado o alcohol graso insaturado es Cm-i, C-m, Ci4:i, Ci6:i o C18:1. En aún otras realizaciones, el ácido graso insaturado, aldehído graso insaturado o alcohol graso insaturado es insaturado en la posición omega-7. En determinadas realizaciones, el ácido graso insaturado, aldehído graso insaturado o alcohol graso insaturado comprende un doble enlace cis.

Tal como se usa en el presente documento, una “célula huésped recombinante” o “célula huésped modificada por ingeniería” es una célula huésped, por ejemplo, un microorganismo que se ha modificado de manera que produce alcoholes grasos. En algunas realizaciones, la célula huésped recombinante comprende uno o más polinucleótidos, codificando cada polinucleótido para un polipéptido que tiene actividad enzimática de biosíntesis de aldehidos grasos y/o alcoholes grasos, en la que la célula huésped recombinante produce una composición de alcohol graso cuando se cultiva en presencia de una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleótidos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “clon” se refiere normalmente a una célula o un grupo de células que descienden de y esencialmente idénticas genéticamente a un único ancestro común, por ejemplo, las bacterias de una colonia bacteriana clonada surgida a partir de una única célula bacteriana.

Tal como se usa en el presente documento, el término “cultivo” se refiere normalmente a un medio líquido que comprende células viables. En una realización, un cultivo comprende células que se reproducen en medios de cultivo predeterminados en condiciones controladas, por ejemplo, un cultivo de células huésped recombinantes hechas crecer en medios líquidos que comprenden una fuente de carbono y/o nitrógeno seleccionada.

Los términos “cultivar” o “cultivo” se refieren al crecimiento de una población de células (por ejemplo, células microbianas) en condiciones adecuadas en un medio líquido o sólido. En realizaciones particulares, cultivar se refiere a la bioconversión fermentativa de un sustrato en un producto final. Se conocen bien medios de cultivo y los componentes individuales de tales medios de cultivo están disponibles de fuentes comerciales, por ejemplo, en los medios DIFCO y medios BBL. En un ejemplo no limitativo, el medio de nutrientes acuoso es un “medio rico” que comprende fuentes complejas de nitrógeno, sales y carbono, tal como el medio YP, que comprende 10 g/l de peptona y 10 g/l de extracto de levadura de un medio de este tipo.

La célula huésped puede modificarse por ingeniería adicionalmente para asimilar el carbono eficazmente y usar materiales celulósicos como fuentes de carbono según los métodos descritos, por ejemplo, en las patentes estadounidenses 5.000.000; 5.028.539; 5.424.202; 5.482.846; 5.602.030 y WO2010127318. Además, la célula huésped puede modificarse por ingeniería para expresar una invertasa de modo que puede usarse sacarosa como fuente de carbono.

Tal como se usa en el presente documento, el término “en condiciones eficaces para expresar dichas secuencias de nucleótidos heterólogas” significa cualesquiera condiciones que permiten que una célula huésped produzca un aldehído graso o alcohol graso deseado. Las condiciones adecuadas incluyen, por ejemplo, condiciones de fermentación.

Tal como se usa en el presente documento, un “nivel modificado” o “alterado de” actividad de una proteína, por ejemplo una enzima, en una célula huésped recombinante se refiere a una diferencia en una o más características en la actividad determinadas con relación a la célula huésped parental o nativa. Normalmente se determinan diferencias en actividad entre una célula huésped recombinante, que tiene actividad modificada, y la célula huésped silvestre correspondiente (por ejemplo, comparación de un cultivo de una célula huésped recombinante con relación a la célula huésped silvestre). Actividades modificadas pueden ser el resultado de, por ejemplo, cantidades modificadas de proteína expresada por una célula huésped recombinante (por ejemplo, como resultado de un aumento o una disminución del número de copias de secuencias de ADN que codifican para la proteína, un aumento o una disminución del número de transcritos de ARNm que codifican para la proteína, y/o un aumento o una disminución de las cantidades de traducción de proteína de la proteína a partir del ARNm); cambios en la estructura de la proteína (por ejemplo, cambios en la estructura primaria, tales como cambios en la secuencia codificante de la proteína que dan como resultado cambios en la especificidad de sustrato, cambios en parámetros cinéticos observados); y cambios en la estabilidad de la proteína (por ejemplo, un aumento o una disminución de la degradación de la proteína). En algunas realizaciones, el polipéptido es un mutante o una variante de cualquiera de los polipéptidos descritos en el presente documento. En determinados casos, la secuencia codificante para los polipéptidos tal como se describe en el presente documento se somete a optimización de codones para la expresión en una célula huésped particular. Por ejemplo, para la expresión en E. coli, pueden optimizarse uno o más codones (Grosjean et al. (1982) Gene 18:199-209).

El término “secuencias reguladoras” tal como se usa en el presente documento se refiere normalmente a una secuencia de bases en ADN, operativamente unida a secuencias de ADN que codifican para una proteína que controla en última instancia la expresión de la proteína. Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen, pero no se limitan a, secuencias promotoras de ARN, secuencias de unión a factor transcripción, secuencias de terminación de la transcripción, moduladores de la transcripción (tales como elementos potenciadores), secuencias de nucleótidos que afectan a la estabilidad del ARN y secuencias reguladoras de la traducción (tales como, sitios de unión al ribosoma (por ejemplo, secuencias de Shine-Dalgarno en procariotas o secuencias de Kozak en eucariotas), codones de iniciación, codones de terminación).

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Tal como se usa en el presente documento, la frase “la expresión de dicha secuencia de nucleótidos se modifica con relación a la secuencia de nucleótidos silvestre”, significa un aumento o una disminución en el nivel de expresión y/o actividad de una secuencia de nucleótidos endógena o la expresión y/o actividad de una secuencia de nucleótidos que codifica para polipéptido heterólogo o no nativo.

Tal como se usa en el presente documento, el término “expresar” con respecto a un polinucleótido es hacer que funcione. Un polinucleótido que codifica para un polipéptido (o proteína) se transcribirá y traducirá, cuando se exprese, para producir ese polipéptido (o proteína). Tal como se usa en el presente documento, el término “sobreexpresar” significa expresar (o hacer que se exprese) un polinucleótido o polipéptido en una célula a una mayor concentración de lo que se expresa normalmente en una célula silvestre correspondiente en las mismas condiciones.

Los términos “nivel alterado de expresión” y “nivel modificado de expresión” se usan de manera intercambiable y significan que está presente un polinucleótido, polipéptido o hidrocarburo en una concentración diferente en una célula huésped modificada por ingeniería en comparación con su concentración en una célula silvestre correspondiente en las mismas condiciones.

Tal como se usa en el presente documento, el término “título” se refiere a la cantidad de aldehído graso o alcohol graso producido por volumen unitario de cultivo de células huésped. En cualquier aspecto de las composiciones y los métodos descritos en el presente documento, un alcohol graso se produce a un título de aproximadamente 25 mg/l, aproximadamente 50 mg/l, aproximadamente 75 mg/l, aproximadamente 100 mg/l, aproximadamente 125 mg/l, aproximadamente 150 mg/l, aproximadamente 175 mg/l, aproximadamente 200 mg/l, aproximadamente 225 mg/l,

aproximadamente 250 mg/l, aproximadamente 275 mg/l, aproximadamente 300 mg/l, aproximadamente 325 mg/l,

aproximadamente 350 mg/l, aproximadamente 375 mg/l, aproximadamente 400 mg/l, aproximadamente 425 mg/l,

aproximadamente 450 mg/l, aproximadamente 475 mg/l, aproximadamente 500 mg/l, aproximadamente 525 mg/l,

aproximadamente 550 mg/l, aproximadamente 575 mg/l, aproximadamente 600 mg/l, aproximadamente 625 mg/l,

aproximadamente 650 mg/l, aproximadamente 675 mg/l, aproximadamente 700 mg/l, aproximadamente 725 mg/l,

aproximadamente 750 mg/l, aproximadamente 775 mg/l, aproximadamente 800 mg/l, aproximadamente 825 mg/l,

aproximadamente 850 mg/l, aproximadamente 875 mg/l, aproximadamente 900 mg/l, aproximadamente 925 mg/l,

aproximadamente 950 mg/l, aproximadamente 975 mg/l, aproximadamente 1000 mg/l, aproximadamente 1050 mg/l, aproximadamente 1075 mg/l, aproximadamente 1100 mg/l, aproximadamente 1125 mg/l, aproximadamente 1150

mg/l, aproximadamente 1175 mg/l, aproximadamente 1200 mg/l, aproximadamente 1225 mg/l, aproximadamente

1250 mg/l, aproximadamente 1275 mg/l, aproximadamente 1300 mg/l, aproximadamente 1325 mg/l,

aproximadamente 1350 mg/l, aproximadamente 1375 mg/l, aproximadamente 1400 mg/l, aproximadamente 1425

mg/l, aproximadamente 1450 mg/l, aproximadamente 1475 mg/l, aproximadamente 1500 mg/l, aproximadamente

1525 mg/l, aproximadamente 1550 mg/l, aproximadamente 1575 mg/l, aproximadamente 1600 mg/l,

aproximadamente 1625 mg/l, aproximadamente 1650 mg/l, aproximadamente 1675 mg/l, aproximadamente 1700

mg/l, aproximadamente 1725 mg/l, aproximadamente 1750 mg/l, aproximadamente 1775 mg/l, aproximadamente

1800 mg/l, aproximadamente 1825 mg/l, aproximadamente 1850 mg/l, aproximadamente 1875 mg/l,

aproximadamente 1900 mg/l, aproximadamente 1925 mg/l, aproximadamente 1950 mg/l, aproximadamente 1975 mg/l, aproximadamente 2000 mg/l (2 g/l), 3 g/l, 5 g/l, 10 g/l, 20 g/l, 30 g/l, 40 g/l, 50 g/l, 60 g/l, 70 g/l, 80 g/l, 90 g/l, 100 g/l o un intervalo delimitado por dos cualesquiera de los valores anteriores. En otras realizaciones, se produce un aldehído graso o alcohol graso a un título de más de 100 g/l, más de 200 g/l, más de 300 g/l, o mayor, tal como 500 g/l, 700 g/l, 1000 g/l, 1200 g/l, 1500 g/l o 2000 g/l. El título preferido de aldehído graso o alcohol graso producido por una célula huésped recombinante según los métodos de la divulgación es de desde 5 g/l hasta 200 g/l, de 10 g/l a 150 g/l, de 20 g/l a 120 g/l y de 30 g/l a 100 g/l.

Tal como se usa en el presente documento, el término “rendimiento del aldehído graso o alcohol graso producido por una célula huésped” se refiere a la eficacia mediante la que una fuente de carbono de entrada se convierte en producto (es decir, alcohol graso o aldehído graso) en una célula huésped. Células huésped modificadas por ingeniería para producir alcoholes grasos y/o aldehídos grasos según los métodos de la divulgación tienen un rendimiento de al menos el 3%, al menos el 4%, al menos el 5%, al menos el 6%, al menos el 7%, al menos el 8%, al menos el 9%, al menos el 10%, al menos el 11%, al menos el 12%, al menos el 13%, al menos el 14%, al menos el 15%, al menos el 16%, al menos el 17%, al menos el 18%, al menos el 19%, al menos el 20 %, al menos el 21%, al menos el 22%, al menos el 23%, al menos el 24%, al menos el 25%, al menos el 26%, al menos el 27%, al menos el 28%, al menos el 29%, o al menos el 30% o un intervalo delimitado por dos cualesquiera de los valores anteriores. En otras realizaciones, se produce un aldehído graso o alcohol graso con un rendimiento de más del 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90% o más. Alternativamente, o además, el rendimiento es de aproximadamente el 30% o menos, aproximadamente el 27% o menos, aproximadamente el 25% o menos o aproximadamente el 22% o menos. Por tanto, el rendimiento puede estar delimitado por dos cualesquiera de los extremos anteriores. Por ejemplo, el rendimiento del alcohol graso o aldehído graso producido por la célula huésped recombinante según los métodos de la divulgación puede ser del 5% al 15%, del 10% al 25%, del 10% al 22%, del 15% al 27%, del 18% al 22%, del 20% al 28% o del 20% al 30%. El rendimiento preferido de alcohol graso producido por la célula huésped recombinante según los métodos de la divulgación es de desde el 10% hasta el 30%.

Tal como se usa en el presente documento, el término “productividad” se refiere a la cantidad de aldehído graso o alcohol graso producido por volumen unitario de cultivo de células huésped por tiempo unitario. En cualquier aspecto

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de las composiciones y los métodos descritos en el presente documento, la productividad de aldehido graso o alcohol graso producido por una célula huésped recombinante es de al menos 100 mg/l/hora, al menos 200 mg/l/hora, al menos 300 mg/l/hora, al menos 400 mg/l/hora, al menos 500 mg/l/hora, al menos 600 mg/l/hora, al menos 700 mg/l/hora, al menos 800 mg/l/hora, al menos 900 mg/l/hora, al menos 1000 mg/l/hora, al menos 1100 mg/l/hora, al menos 1200 mg/l/hora, al menos 1300 mg/l/hora, al menos 1400 mg/l/hora, al menos 1500 mg/l/hora, al menos 1600 mg/l/hora, al menos 1700 mg/l/hora, al menos 1800 mg/l/hora, al menos 1900 mg/l/hora, al menos 2000 mg/l/hora, al menos 2100 mg/l/hora, al menos 2200 mg/l/hora, al menos 2300 mg/l/hora, al menos 2400 mg/l/hora o al menos 2500 mg/l/hora. Alternativamente, o además, la productividad es de 2500 mg/l/hora o menos, 2000 mg/l/DO600 o menos, 1500 mg/l/DO600 o menos, 120 mg/l/hora o menos, 1000 mg/l/hora o menos, 800 mg/l/hora o menos o 600 mg/l/hora o menos. Por tanto, la productividad puede estar delimitada por dos cualesquiera de los extremos anteriores. Por ejemplo, la productividad puede ser de 3 a 30 mg/l/hora, de 6 a 20 mg/l/hora o de 15 a 30 mg/l/hora. La productividad preferida de un aldehído graso o alcohol graso producido por una célula huésped recombinante según los métodos de la divulgación se selecciona de 500 mg/l/hora a 2500 mg/l/hora, o desde 700 mg/l/hora hasta 2000 mg/l/hora.

Los términos “especie grasa total” y “producto de ácido graso total” pueden usarse de manera intercambiable en el presente documento con referencia a la cantidad total de alcoholes grasos, aldehídos grasos, ácidos grasos libres y ésteres grasos presentes en una muestra tal como se evalúa mediante CG-FID tal como se describe en la publicación de solicitud de patente internacional WO 2008/119082. Las muestras pueden contener uno, dos, tres o cuatro de estos compuestos dependiendo del contexto.

Tal como se usa en el presente documento, el término “tasa de utilización de glucosa” significa la cantidad de glucosa usada por el cultivo por tiempo unitario, notificada como gramos/litro/hora (g/l/h).

Tal como se usa en el presente documento, el término “fuente de carbono” se refiere a un sustrato o compuesto adecuado para usarse como fuente de carbono para el crecimiento de células procariotas o eucariotas simples. Las fuentes de carbono pueden estar en diversas formas, incluyendo, pero sin limitarse a polímeros, hidratos de carbono, ácidos, alcoholes, aldehídos, cetonas, aminoácidos, péptidos y gases (por ejemplo, CO y CO2). Las fuentes de carbono a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, monosacáridos, tales como glucosa, fructosa, manosa, galactosa, xilosa y arabinosa; oligosacáridos, tales como fructo-oligosacárido y galacto-oligosacárido; polisacáridos tales como almidón, celulosa, pectina y xilano; disacáridos, tales como sacarosa, maltosa, celobiosa y turanosa; material celulósico y variantes tales como hemicelulosas, metilcelulosa y carboximetilcelulosas sódicas; ácidos grasos saturados o insaturados, succinato, lactato y acetato; alcoholes, tales como etanol, metanol y glicerol, o mezclas de los mismos. La fuente de carbono también puede ser un producto de fotosíntesis, tales como glucosa. En determinadas realizaciones, la fuente de carbono es una mezcla gaseosa que contiene CO procedente de gas de chimenea. En otra realización, la fuente de carbono es una mezcla gaseosa que contiene CO procedente del reformado de un material que contiene carbono, tal como biomasa, carbón o gas natural. En otras realizaciones, la fuente de carbono es gas de síntesis, metano o gas natural. En determinadas realizaciones preferidas, la fuente de carbono es biomasa. En otras realizaciones preferidas, la fuente de carbono es glucosa. En otras realizaciones preferidas, la fuente de carbono es sacarosa. En otras realizaciones, la fuente de carbono es glicerol. En otras realizaciones preferidas, la fuente de carbono es guarapo, jarabe de azúcar de caña o jarabe de maíz. En otras realizaciones preferidas, la fuente de carbono se deriva de materias primas renovables, tales como CO2, CO, glucosa, sacarosa, xilosa, arabinosa, glicerol, manosa, o mezclas de los mismos. En otras realizaciones, la fuente de carbono se deriva de materias primas renovables incluyendo almidones, biomasa celulósica, melaza, y otras fuentes de hidratos de carbono incluyendo mezclas de hidratos de carbono derivadas de la hidrólisis de biomasa celulósica, o los materiales de desecho derivados del procesamiento de aceites naturales o vegetales.

Tal como se usa en el presente documento, el término “biomasa” se refiere a cualquier material biológico del que se derive una fuente de carbono. En algunas realizaciones, se procesa una biomasa para dar una fuente de carbono, que es adecuada para la bioconversión. En otras realizaciones, la biomasa no requiere procesamiento adicional para dar una fuente de carbono. Una fuente de biomasa a modo de ejemplo es vegetación o materia vegetal, tal como maíz, caña de azúcar o césped de pradera. Otra fuente de biomasa a modo de ejemplo es productos de desecho metabólicos, tales como materia animal (por ejemplo, estiércol de vaca). Fuentes de biomasa a modo de ejemplo adicionales incluyen algas y otras plantas marinas. La biomasa también incluye productos de desecho de la industria, la agricultura, silvicultura y domésticos, incluyendo, pero sin limitarse a, glicerol, residuo de fermentación, ensilado, paja, madera, aguas cloacales, basura, desechos urbanos celulósicos y restos de comidas (por ejemplo, jabones, aceites y ácidos grasos). El término “biomasa” también puede referirse a fuentes de carbono, tales como hidratos de carbono (por ejemplo, monosacáridos, disacáridos o polisacáridos).

Tal como se usa en el presente documento, el término “aislados”, con respecto a productos (tal como ácidos grasos y derivados de los mismos) se refiere a productos que están separados de componentes celulares, medios de cultivo celular, o precursores químicos o sintéticos. Los ácidos grasos y derivados de los mismos producidos mediante los métodos descritos en el presente documento pueden ser relativamente inmiscibles en el caldo de fermentación, así como en el citoplasma. Por tanto, los ácidos grasos y derivados de los mismos pueden recogerse en una fase orgánica o bien de manera intracelular o bien de manera extracelular.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “purificar”, “purificado” o “purificación” significan la retirada

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o el aislamiento de una molécula de su entorno, por ejemplo, mediante aislamiento o separación. Las moléculas “sustancialmente purificadas” están libres en al menos aproximadamente el 60% (por ejemplo, libres en al menos aproximadamente el 70%, libres en al menos aproximadamente el 75%, libres en al menos aproximadamente el 85%, libres en al menos aproximadamente el 90%, libres en al menos aproximadamente el 95%, libres en al menos aproximadamente el 97%, libres en al menos aproximadamente el 99%) de otros componentes con los que se asocian. Tal como se usa en el presente documento, estos términos también se refieren a la retirada de contaminantes de una muestra. Por ejemplo, la retirada de contaminantes puede dar como resultado un aumento en el porcentaje de derivados de ácido graso tales como alcoholes grasos en una muestra. Por ejemplo, cuando se produce un derivado de ácido graso en una célula huésped recombinante, el derivado de ácido graso puede purificarse mediante la retirada de proteínas de la célula huésped u otros materiales de la célula huésped. Después de la purificación, el porcentaje de derivado de ácido graso en la muestra está aumentado. Los términos “purificar”, “purificado” y “purificación” son términos relativos que no requieren pureza absoluta. Por tanto, por ejemplo, cuando se produce un derivado de ácido graso en células huésped recombinantes, un derivado de ácido graso purificado es un derivado de ácido graso que está sustancialmente separado de otros componentes celulares (por ejemplo, ácidos nucleicos, polipéptidos, lípidos, hidratos de carbono u otros hidrocarburos).

Aumento de la producción de alcoholes grasos

La divulgación proporciona la producción de una composición de alcohol graso que está potenciada como resultado de la expresión modificada de un gen de acil-ACP reductasa (AAR) en una célula huésped. AAR está implicada en una ruta de biosíntesis para la producción de aldehídos grasos y alcoholes grasos. Se usa AAR variante sola o en combinación con la expresión modificada de otro gen implicado en la ruta de biosíntesis que convierte un aldehído graso en un alcohol graso. En el presente documento, la divulgación proporciona células huésped recombinantes, que se han modificado por ingeniería para expresar una AAR variante para proporcionar biosíntesis potenciada de alcoholes grasos con relación a células huésped no modificadas por ingeniería o nativas o silvestres que expresan AAR silvestre u otros polipéptidos de biosíntesis de alcoholes grasos con la misma función que AAR. La divulgación identifica polinucleótidos y polipéptidos relacionados con AAR útiles en las células huésped recombinantes. Sin embargo, se reconocerá que no es necesaria una identidad de secuencia absoluta con polinucleótidos relacionados con AAR. Por ejemplo, pueden realizarse cambios en una secuencia de polinucleótido particular y examinarse el polipéptido codificado para detectar actividad. Tales cambios incluyen normalmente mutaciones conservativas y mutaciones silenciosas tales como, por ejemplo, a través de la optimización de codones. Pueden examinarse polinucleótidos modificados o mutados (es decir, mutantes) y polipéptidos variantes codificados para detectar una función deseada, tal como, una función mejorada en comparación con el polipéptido parenteral, incluyendo pero sin limitarse a actividad catalítica aumentada, estabilidad aumentada o inhibición disminuida (por ejemplo, retroinhibición disminuida), usando métodos conocidos en la técnica. La divulgación identifica actividades enzimáticas implicadas en diversas etapas (es decir, reacciones) de las rutas de biosíntesis de ácidos grasos descritas en el presente documento según el número de clasificación de enzimas (EC), y proporciona polipéptidos (enzimas) a modo de ejemplo clasificados mediante tales números EC, y polinucleótidos a modo de ejemplo que codifican para tales polipéptidos. Tales polipéptidos y polinucleótidos a modo de ejemplo, que se identifican en el presente documento mediante los números de registro y/o números de identificación de secuencia (SEQ ID NO), son útiles para modificar por ingeniería rutas de ácidos grasos en células huésped parentales para obtener las células huésped recombinantes descritas en el presente documento. Sin embargo, ha de entenderse que los polipéptidos y polinucleótidos descritos en el presente documento son a modo de ejemplo y, por tanto, no limitativos. Las secuencias de homólogos de polipéptidos a modo de ejemplo descritos en el presente documento están disponibles para los expertos en la técnica usando bases de datos tales como, por ejemplo, las bases de datos Entrez proporcionadas por el Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI), las bases de datos ExPasy proporcionadas por el Instituto Suizo de Bioinformática, la base de datos BRENDA proporcionada por la Universidad Técnica de Brunswick, y la base de datos KEGG proporcionada por el Centro de Bioinformática de la Universidad de Kioto y la Universidad de Tokio, que están todas disponibles en Internet. Una variedad de diferentes células huésped pueden modificarse para expresar enzimas de biosíntesis de alcoholes grasos AAR variantes tales como las descritas en el presente documento, lo que da como resultado células huésped recombinantes adecuadas para la producción potenciada de composiciones de alcohol graso. Se entiende que una variedad de células pueden proporcionar fuentes de material genético, incluyendo secuencias de polinucleótido que codifican para polipéptidos adecuados para su uso en una célula huésped recombinante tal como se describe en el presente documento.

Polipéptidos de acil-ACP reductasa (AAR) y variantes de los mismos

En un aspecto, la divulgación se refiere a la producción mejorada de derivados de ácido graso tales como aldehídos grasos y/o alcoholes grasos modificando por ingeniería una célula huésped para expresar una proteína acil-ACP reductasa (AAR) nativa o no nativa. La proteína AAR cataliza la reducción de una acil-ACP para dar un aldehído graso y también puede catalizar la conversión de un aldehído graso en un alcohol graso (véase la publicación de patente estadounidense n.° 20120282663). El polipéptido de AAR o la secuencia de polinucleótido que codifica para el polipéptido de AAR puede ser nativo (por ejemplo, endógeno) o no nativo (por ejemplo, exógeno, heterólogo, etc.), es decir, puede diferir de la secuencia silvestre y la expresión del mismo presente de manera natural en la célula huésped silvestre correspondiente. Los ejemplos incluyen una modificación en la secuencia del polinucleótido, polipéptido o proteína aAr que da como resultado una AAR variante (por ejemplo, mutante) y/o en el nivel de expresión de la misma. La divulgación incluye polipéptidos, homólogos y variantes de AAR.

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En un aspecto, un polipéptido de AAR para su uso en la puesta en práctica de la divulgación tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia de polipéptido de aAr silvestre de SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44. La AAR puede derivarse de una especie de Synechococcus o una especie de Prochlorococcus. En otros aspectos, un polipéptido de AAR para su uso en la puesta en práctica de la divulgación tiene una identidad de secuencia de al menos el 75% (por ejemplo, al menos el 76%, el 77%, el 78%, el 79%, el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o al menos el 99%) con la secuencia de polipéptido de AAR silvestre de SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44, y también puede incluir una o más sustituciones que dan como resultado características y/o propiedades útiles tal como se describe en el presente documento. En un aspecto, el polipéptido de AAR para su uso en la puesta en práctica de la presente divulgación tiene una identidad de secuencia de al menos el 75% (por ejemplo, al menos el 76%, el 77%, el 78%, el 79%, el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o al menos el 99%) con la secuencia de polipéptido de AAR silvestre de SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 34. En otros aspectos, un polipéptido de AAR para su uso en la puesta en práctica de la divulgación tiene una identidad de secuencia del 100% con SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44. La secuencia de polipéptido de AAR mejorado o variante puede derivarse de una especie distinta de una especie de Synechococcus o una especie de Prochlorococcus.

En un aspecto relacionado, la divulgación incluye polipéptidos de AAR que tienen una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de al menos el 75% (por ejemplo, al menos el 76%, el 77%, el 78%, el 79%, el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o/y al menos el 99%) con SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 43. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico codifica para una variante de AAR con una o más sustituciones que dan como resultado características y/o propiedades mejoradas tal como se describe en el presente documento. En aún otro aspecto relacionado, un polipéptido de AAR para su uso en la puesta en práctica de la divulgación está codificada por una secuencia de nucleótidos que tienen una identidad de secuencia del 100% con SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 43. En otro aspecto, la divulgación se refiere a polipéptidos de AAR que comprenden una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas por sustancialmente toda la longitud de un ácido nucleico correspondiente a SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 43.

En un aspecto, la divulgación proporciona un polipéptido de AAR para su uso en la puesta en práctica de la divulgación que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia de polipéptido de AAR variante de una cualquiera de SEQ ID NO: 57 a SEQ ID NO: 78. En algunos aspectos, la AAR variante se deriva de una especie de Synechococcus o una especie Prochlorococcus. En otros aspectos, un polipéptido de AAR para su uso en la puesta en práctica de la divulgación tiene una identidad de secuencia de al menos el 75% (por ejemplo, al menos el 76%, el 77%, el 78%, el 79%, el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o al menos el 99%) con la secuencia de polipéptido de AAR variante de una cualquiera de SEQ ID NO: 57 a SEQ ID NO: 78. El polipéptido de AAR variante puede incluir una o más sustituciones que dan como resultado características y/o propiedades útiles tal como se describe en el presente documento. En otro aspecto, el polipéptido de AAR para su uso en la puesta en práctica de la divulgación tiene una identidad de secuencia de al menos el 75% (por ejemplo, al menos el 76%, el 77%, el 78%, el 79%, el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o al menos el 99%) con la secuencia de polipéptido de AAR variante de SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 o SEQ ID NO: 65. En otros aspectos, un polipéptido de AAR para su uso en poner en práctica la divulgación tiene una identidad de secuencia del 100% con una cualquiera de SEQ ID NO: 57 a SEQ ID NO: 78. En todavía otros aspectos, la secuencia de polipéptido de AAR mejorado o variante se deriva de una especie distinta de una especie de Synechococcus o una especie de Prochlorococcus.

Los inventores construyeron una biblioteca de propensión a error de la acil-ACP reductasa de Synechococcus elongatus PCC7942 (AAR_7942) para examinar variantes que tienen mejoras con respecto a la AAR_7942 silvestre (véase el ejemplo 3, más adelante). Las mejoras se clasifican como o bien que mejoran el título de alcohol graso global o bien que aumentan la fracción de alcoholes grasos C10, C12, C14 o C16 sin afectar significativamente al título. La biblioteca de propensión a error identificó diversas posiciones de aminoácido incluyendo la posición de aminoácido 18. Se prepararon bibliotecas de saturación y de combinación para someter a prueba adicionalmente estas posiciones. SEQ ID NO: 57 codifica para la secuencia de aminoácidos para una variante de AAR (mutante) que tiene una mutación en el aminoácido 18. La mutación S18W en la que se reemplaza serina por triptófano da como resultado un aumento significativo de la producción de alcoholes grasos cuando se expresan en células (véanse los ejemplos 3 y 4, más adelante). Más específicamente, la mutación S18W conduce a un aumento del 227 por ciento en la producción de alcohol graso total (FALC) y un aumento del 324 por ciento en alcoholes grasos C14

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en comparación con AAR silvestre usada como control (véanse las tablas 4A y 4B, más adelante).

Los inventores construyeron bibliotecas de saturación basándose en la mutación S18W para identificar variantes (mutantes) que aumentaron adicionalmente el título de FALC global o la fracción de alcoholes grasos C12 (véanse el ejemplo 4 y la tabla 5, más adelante). Las bibliotecas de combinación que usaron la mutación S18W (SEQ ID NO: 57) como molde produjeron 7 mutantes de combinación que mostraron aumentos significativos adicionales en el título total de FALC y/o la producción de alcoholes grasos C12 (véase la tabla 6B, más adelante). Los 7 mutantes de combinación incluyen AAR con la mutación S18W (SEQ ID NO: 57); AAR con las mutaciones M21L, C63G, S113K, T154A, A281L (sEq ID NO: 58); AAR con las mutaciones L8A, m21L, C63G, A77A (mutación de codón silenciosa de GCC a GCA), S113K, T154A, A281L (SEQ ID NO: 59); AAR con las mutaciones D16L, M21L, C63G, S113K, T154A, A281L (SEQ ID NO: 60); AAR con las mutaciones L8A, D24V, C63G, S113K, Q155L, A281L (SEQ ID NO: 61); AAR con las mutaciones D24P, L31M, C63G, S113K, T154A, A281L (SEQ ID NO: 62); AAR con las mutaciones L8A, D16L, D24V, C63G, S113K, T154A, A281L (SEQ ID NO: 63); y AAR con las mutaciones D24E, C63G, S113K, T154A, A281L (SEQ ID NO: 64). Particularmente, SEQ ID NO: 58 mostró la mayor fracción de alcoholes grasos C12 mientras que SEQ ID NO: 59 mostró el mayor título de los mutantes de combinación (véase la tabla 6B, más adelante).

Los inventores también construyeron una biblioteca de saturación completa de la acil-ACP reductasa de Prochlorococcus marinus MED4_AAR para examinar variantes que muestran mejoras con respecto a MED4_AAR silvestre (véase el ejemplo 7, más adelante). Las variantes de AAR se seleccionaron basándose en la producción de más alcoholes grasos que la enzima AAR silvestre o la capacidad para producir alcoholes grasos con un perfil alterado de longitud de cadena, por ejemplo, una fracción aumentada de alcoholes grasos C12, C14 o C16. La tabla 8 (véase el ejemplo 7, más adelante) muestra datos representativos de 16 variantes de AAR que produjeron los mayores títulos de FALC que oscilaron entre 1,4 veces y 2,2 veces con respecto a MED4_AaR silvestre. Los inventores también examinaron variantes de AAR que tienen un perfil alterado de longitud de cadena, en el que es de interés un aumento de la proporción de especies FALC con una longitud de cadena más corta que C16. Dos clones variantes que conducen a un aumento de 2-3 veces en la cantidad de FALC se muestran en la figura 10. La expresión de una de estas variantes de AAR, es decir, el mutante D61E (SEQ ID NO: 65) en una célula huésped recombinante, desvió la distribución de longitud de cadena de especies de alcohol graso hacia cadenas de carbonos más cortas. Todas las variantes condujeron a una mayor cantidad de FALC ya que tienen un título aumentado, pero sólo SEQ ID NO: 65 tenía una fracción aumentada de C14 (y un mayor título). La tabla 9 (véase el ejemplo 7, más adelante) ilustra la distribución de longitud de cadena de FALC producida por células huésped recombinantes que expresan la variante de D61E de MED4_AAR en comparación con MED4_AAR silvestre (WT) y la variante de V346P de MED4_AAR que no produjo productos con longitudes de cadena alteradas.

Proteína transportadora de acilo (ACP)

Existen informes contradictorios en la bibliografía en cuanto a los factores que pueden limitar la biosíntesis de ácidos grasos en células huésped, tales como Escherichia coli (E. coli). Aunque las proteínas transportadoras de acilo (ACP) se conservan en cierta medida en todos los organismos, su secuencia primaria puede diferir. Se ha sugerido que cuando se expresan en E. coli enzimas de rutas terminales de fuentes distintas de E. coli para convertir las acil graso-ACP en productos, pueden existir limitaciones tales como en el reconocimiento, la afinidad y/o el recambio de la enzima de ruta recombinante hacia las acil graso-ACP (véanse Suh et al. (1999) The Plant Journal 17(6):679-688; Salas et al. (2002) Archives of Biochemistry and Biophysics 403:25-34). Una sugerencia es que una limitación de los precursores principales para la biosíntesis de ácidos grasos, por ejemplo, acetil-CoA y malonil-CoA puede dar como resultado una disminución de la síntesis de derivados de ácido graso. Un enfoque para aumentar el flujo a través de la biosíntesis de ácidos grasos es manipular diversas enzimas en la ruta (véanse las figuras 1-3). El suministro de acil-ACP a partir de acetil-CoA mediante el complejo de acetil-CoA carboxilasa (acc) y la ruta de biosíntesis de ácidos grasos (fab) pueden tener un impacto sobre la tasa de producción de derivados de ácido graso (véase la figura 2). Tal como se detalla en los ejemplos (más adelante), se evaluó el efecto de la sobreexpresión de ACP sobre la producción de alcoholes grasos con fines ilustrativos.

Una célula huésped que se modifica por ingeniería para expresar una ACP puede presentar un aumento en el título de una composición de aldehído graso y/o alcohol graso o una composición específica de aldehído graso y/o alcohol graso en el que el aumento es de al menos el 3%, al menos el 4%, al menos el 5%, al menos el 6%, al menos el 7%, al menos el 8%, al menos el 9%, al menos el 10%, al menos el 11%, al menos el 12%, al menos el 13%, al menos el 14%, al menos el 15%, al menos el 16%, al menos el 17%, al menos el 18%, al menos el 19%, al menos el 20 %, al menos el 21%, al menos el 22%, al menos el 23%, al menos el 24%, al menos el 25%, al menos el 26%, al menos el 27%, al menos el 28%, al menos el 29%, o al menos el 30% mayor que el título del composición de aldehído graso y/o alcohol graso producida por una célula huésped correspondiente que no expresa ACP cuando se cultiva en las mismas condiciones. En un aspecto, la divulgación se refiere a la producción mejorada de una composición de aldehído graso y/o alcohol graso modificando por ingeniería una célula huésped para expresar una proteína ACP nativa (por ejemplo, endógena) o no nativa (por ejemplo, exógena, heteróloga). El polipéptido de ACP o la secuencia de polinucleótido que codifica para el polipéptido de ACP puede ser no nativo, es decir, puede diferir de la secuencia silvestre presente de manera natural en la célula huésped silvestre correspondiente. Los ejemplos incluyen, una modificación en el nivel de expresión o en la secuencia de un nucleótido, polipéptido o una proteína. La divulgación incluye polipéptidos de ACP y homólogos de los mismos.

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En un aspecto, un polipéptido de ACP para su uso en la puesta en práctica de la divulgación tiene una identidad de secuencia de al menos el 70% con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10. La ACP puede derivarse de Marinobacter hydrocarbonoclasticus o E. coli. En otros aspectos, un polipéptido de ACP para su uso en la puesta en práctica de la divulgación tiene una identidad de secuencia de al menos el 75% (por ejemplo, al menos el 76%, el 77%, el 78%, el 79%, el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o al menos el 99%) con la secuencia de polipéptido de ACP silvestre de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 o SeQ ID NO: 10, y también puede incluir una o más sustituciones que dan como resultado características y/o propiedades útiles tal como se describe en el presente documento. En un aspecto, un polipéptido de ACP para su uso en la puesta en práctica de la divulgación tiene una identidad de secuencia del 100% con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID nO: 6, SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10. La secuencia de polipéptido de ACP mejorada o variante puede derivarse de una especie distinta de M. hydrocarbonoclasticus o E. coli. En un aspecto relacionado, un polipéptido de ACP para su uso en la puesta en práctica de la divulgación está codificado por una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia del 100% con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9. En otro aspecto relacionado, la divulgación se refiere a polipéptidos de ACP que comprenden una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de al menos el 75% (por ejemplo, al menos el 76%, el 77%, el 78%, el 79%, el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o/y al menos el 99%) con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9. La secuencia de ácido nucleico puede codificar para una variante de ACP con una o más sustituciones que dan como resultado características y/o propiedades mejoradas tal como se describe en el presente documento. En otros aspectos de la divulgación, la secuencia de ácido nucleico de ACP mejorada o variante se deriva de una especie distinta de una especie de Marinobacter o E. coli. En otro aspecto, la divulgación se refiere a polipéptidos de ACP que tienen una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas por sustancialmente toda la longitud de un ácido nucleico correspondiente a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9.

Variaciones y mutaciones

En algunas realizaciones, el polipéptido de AAR o ACP es un mutante o una variante de cualquiera de los polipéptidos descritos en el presente documento. Un polipéptido variante o mutante tal como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de un polipéptido silvestre en al menos un aminoácido. Por ejemplo, el mutante puede tener una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos conservativas, incluyendo pero sin limitarse a, reemplazo de un aminoácido alifático, tal como alanina, valina, leucina e isoleucina, por otro aminoácido alifático; reemplazo de una serina por una treonina; reemplazo de una treonina por una serina; reemplazo de un residuo ácido, tal como ácido aspártico y ácido glutámico, por otro residuo ácido; reemplazo de un residuo que porta un grupo amida, tal como asparagina y glutamina, por otro residuo que porta un grupo amida; intercambio de un residuo básico, tal como lisina y arginina, por otro residuo básico; y reemplazo de un residuo aromático, tal como fenilalanina y tirosina, por otro residuo aromático. En algunas realizaciones, el polipéptido variante o mutante tiene aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más sustituciones, adiciones, inserciones o deleciones de aminoácidos. Algunos fragmentos preferidos de un polipéptido que funcionan como variante o mutante conservan parte o la totalidad de la función biológica (por ejemplo, actividad enzimática) del polipéptido silvestre correspondiente. En algunas realizaciones, el fragmento conserva al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95% o al menos el 98% o más de la función biológica del polipéptido silvestre correspondiente. En otras realizaciones, el fragmento o mutante conserva aproximadamente el 100% de la función biológica del polipéptido silvestre correspondiente. Puede encontrarse orientación sobre la determinación de qué residuos de aminoácido pueden sustituirse, insertarse o delecionarse sin afectar la biológica actividad usando programas informáticos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, el software LASERGENE (ADNSTAR, Inc., Madison, WI). En aún otras realizaciones, un fragmento presenta un aumento de la función biológica en comparación con un polipéptido silvestre correspondiente. Por ejemplo, un fragmento puede presentar una mejora de al menos un 10%, al menos un 25%, al menos un 50%, al menos un 75% o al menos un 90% de la actividad enzimática en comparación con el polipéptido silvestre correspondiente. En otras realizaciones, el fragmento presenta una mejora de al menos el 100%, al menos el 200%, o al menos el 500% de la actividad enzimática en comparación con el polipéptido silvestre correspondiente.

Se entiende que los polipéptidos descritos en el presente documento pueden tener sustituciones de aminoácidos conservativas o no esenciales adicionales que no tienen un efecto sustancial sobre la función del polipéptido. Puede determinarse si se tolerará o no una sustitución particular (es decir, no afectará adversamente a la función biológica deseada, tal como actividad acil-ACP reductasa), tal como se conoce en la técnica (véase Bowie et al. (1990) Science, 247:1306-1310). Una sustitución de aminoácidos conservativa es una en la que el residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales apolares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales con ramificación beta (por ejemplo, treonina, valina,

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isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

Las variantes pueden producirse de manera natural o crearse in vitro. En particular, tales variantes pueden crearse usando técnicas de ingeniería genética, tales como mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis química al azar, procedimientos de deleción con exonucleasa III o técnicas de clonación convencionales. Alternativamente, tales variantes, mutantes, fragmentos, análogos o derivados pueden crearse usando procedimientos de modificación o síntesis química. Se conocen bien en la técnica métodos de producción de variantes. Por ejemplo, pueden prepararse variantes usando mutagénesis al azar y dirigida al sitio. La mutagénesis al azar y dirigida al sitio se conocen generalmente en la técnica (véase, por ejemplo, Arnold (1993) Curr. Opin. Biotech. 4:450-455). Puede lograrse la mutagénesis al azar usando PCR propensa a error (véanse, por ejemplo, Leung et al. (1989) Technique 1:11-15; y Caldwell et al. (1992) PCR Methods Applic. 2: 28-33). En la PcR propensa a error, la propia PCR se realiza en condiciones en las que la fidelidad de copiado de la ADN polimerasa es baja, de manera que se obtiene una alta tasa de mutaciones puntuales a lo largo de toda la longitud del producto de PCR. En resumen, en tales procedimientos, se mezclan ácidos nucleicos que van a mutagenizarse (por ejemplo, una secuencia de polinucleótido que codifica para una enzima AAR) con cebadores de PCR, tampón de reacción, MgCh, MnCh, Taq polimerasa, y una concentración apropiada de dNTP para lograr una alta tasa de mutaciones puntuales a lo largo de toda la longitud del producto de pCr. Por ejemplo, la reacción puede realizarse usando 20 fmoles de ácido nucleico que va a mutagenizarse, 30 pmoles de cada cebador de PCR, un tampón de reacción que comprende KCl 50 mM, Tris HCl 10 mM (pH 8,3), gelatina al 0,01%, MgCh 7 mM, MnCh 0,5 mM, 5 unidades de Taq polimerasa, dGTP 0,2 mM, dATP 0,2 mM, dCTP 1 mM y dTTP 1 mM. Puede realizarse PCR durante 30 ciclos de 94°C durante 1 min, 45°C durante 1 min y 72°C durante 1 min. Sin embargo, los expertos en la técnica apreciarán que estos parámetros pueden variarse según sea apropiado. Los ácidos nucleicos mutagenizados se clonan entonces en un vector apropiado, y se evalúan las actividades de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos mutagenizados. Puede lograrse la mutagénesis dirigida al sitio usando mutagénesis dirigida por oligonucleótidos para generar mutaciones específicas de sitio en cualquier ADN clonado de interés. La mutagénesis por oligonucleótidos se describe en la técnica (véase, por ejemplo, Reidhaar-Olson et al. (1988) Science 241:53-57). En resumen, en tales procedimientos, se sintetizan una pluralidad de oligonucleótidos bicatenarios que portan una o más mutaciones que van a introducirse en el ADN clonado, y se insertan en el ADN clonado que va a mutagenizarse (por ejemplo, una secuencia de polinucleótido que codifica para un polipéptido de AAR). Se recuperan los clones que contienen el ADN mutagenizado, y se evalúan las actividades de los polipéptidos para los que codifican.

Otro método para generar variantes es la PCR de ensamblaje. La PCR de ensamblaje implica el ensamblaje de un producto de PCR de una mezcla de fragmentos de ADN pequeños. Un gran número de diferentes reacciones PCR se producen en paralelo en el mismo vial, cebando con los productos de una reacción los productos de otra reacción (véase la patente estadounidense 5.965.408). Todavía otro método de generación de variantes es la mutagénesis por PCR sexual. En la mutagénesis por PCR sexual, se produce recombinación homóloga forzada entre moléculas de ADN de diferentes secuencias de ADN, pero altamente relacionadas, in vitro como resultado de fragmentación al azar de la molécula de ADN basándose en la homología de secuencia. Esto va seguido por fijación del cruzamiento mediante extensión de cebadores en una reacción PCR. La mutagénesis por PCR sexual se describe en publicaciones conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:10747- 10751). También pueden crearse variantes mediante mutagénesis in vivo. En algunas realizaciones, se generan mutaciones al azar en una secuencia de ácido nucleico propagando la secuencia en una cepa bacteriana, tal como una cepa de E. coli, que porta mutaciones en una o más de las rutas de reparación de ADN. Tales cepas mutadoras tienen una mayor tasa de mutación al azar que la de una cepa silvestre. La propagación de una secuencia de ADN (por ejemplo, una secuencia de polinucleótido que codifica para un polipéptido de AAR) en una de estas cepas generará eventualmente mutaciones al azar dentro del ADN. Se describen cepas mutadoras adecuadas para su uso para mutagénesis in vivo en la publicación en la técnica (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO1991/016427). También pueden generarse variantes usando mutagénesis de casete. En la mutagénesis de casete, una pequeña región de una molécula de ADN bicatenario se reemplaza por un casete de oligonucleótido sintético que difiere de la secuencia nativa. El oligonucleótido contiene a menudo una secuencia nativa completa y/o parcialmente aleatorizada. También puede usarse mutagénesis de conjunto recursivo para generar variantes. La mutagénesis de conjunto recursivo es un algoritmo para la modificación por ingeniería de proteínas (es decir, mutagénesis de proteínas) desarrollado para producir diversas poblaciones de mutantes relacionados fenotípicamente cuyos miembros difieren en la secuencia de aminoácidos. Este método usa un mecanismo de realimentación para controlar tandas sucesivas de mutagénesis de casete combinatoria (véase, por ejemplo, Arkin et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 89:7811-7815). En algunas realizaciones, se crean variantes usando mutagénesis de conjunto exponencial. La mutagénesis de conjunto exponencial es un procedimiento para generar bibliotecas combinatorias con un alto porcentaje de mutantes únicos y funcionales, en los que se aleatorizan pequeños grupos de residuos en paralelo para identificar, en cada posición alterada, aminoácidos que conducen a proteínas funcionales (véase, por ejemplo, Delegrave et al. (1993) Biotech. Res. 11:1548-1552). En algunas realizaciones, se crean variantes usando procedimientos de intercambio en los se fusionan entre sí partes de una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican para distintos polipéptidos para crear secuencias de ácido nucleico quiméricas que codifican para polipéptidos quiméricos (tal como se describe, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.os 5.965.408 y 5.939.250).

Producción de aldehídos grasos y alcoholes grasos

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Una célula huésped nativa o recombinante puede comprender un polinucleótido que codifica para una enzima que tiene actividad de biosíntesis de aldehídos grasos (también denominada en el presente documento polipéptido de biosíntesis de aldehídos grasos o enzima o polipéptido de biosíntesis de aldehídos grasos). Se produce un aldehído graso cuando la enzima de biosíntesis de aldehídos grasos se expresa o sobreexpresa en la célula huésped. La expresión o sobreexpresión de un polipéptido de acil-ACP reductasa (AAR) en una célula huésped recombinante puede dar como resultado la producción de un aldehído graso por la célula huésped recombinante. En una realización, la célula huésped recombinante produce un aldehído graso. En algunas realizaciones, el aldehído graso producido por la célula huésped recombinante se convierte en un alcohol graso. En algunas realizaciones, polipéptidos nativos (endógenos) de biosíntesis de aldehídos grasos, tales como aldehído reductasas, están presentes en la célula huésped (por ejemplo, E. coli) y son eficaces para convertir aldehídos grasos en alcoholes grasos. En otras realizaciones, se sobreexpresa un polipéptido nativo (endógeno) de biosíntesis de aldehídos grasos. En todavía otras realizaciones, se introduce un polipéptido exógeno de biosíntesis de aldehídos grasos en una célula huésped recombinante y se expresa o sobreexpresa. Un aldehído graso puede producirse expresando o sobreexpresando en la célula huésped recombinante un polinucleótido que codifica para un polipéptido de biosíntesis de aldehídos grasos, tal como un polipéptido que tiene actividad acil-ACP reductasa (AAR). La expresión de AAR en una célula huésped recombinante da como resultado la producción de aldehídos grasos y alcoholes grasos (figura 4). Se describen polipéptidos de AAR a modo de ejemplo en el presente documento y en las publicaciones PCT n.os WO2009/140695 y WO/2009/140696.

Se produce una composición que comprende aldehídos grasos (una composición de aldehído graso) cultivando una célula huésped en presencia de una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar la enzima de biosíntesis de aldehídos grasos, por ejemplo, AAR. Una célula huésped recombinante modificada por ingeniería para producir un aldehído graso convertirá normalmente parte del aldehído graso en un alcohol graso. En algunas realizaciones, la composición de aldehído graso comprende aldehídos grasos y alcoholes grasos. Normalmente, la composición de aldehído graso se recupera del entorno extracelular de la célula huésped recombinante, es decir, el medio de cultivo celular. En algunas realizaciones, la célula huésped recombinante incluye un polinucleótido que codifica para un polipéptido (una enzima) que tiene actividad de biosíntesis de alcoholes grasos (también denominado en el presente documento polipéptido de biosíntesis de alcoholes grasos o enzima de biosíntesis de alcoholes grasos), y se produce un alcohol graso por la célula huésped recombinante. Una composición que incluye los alcoholes grasos (es decir, una composición de alcohol graso) puede producirse cultivando la célula huésped recombinante en presencia de una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar un enzima de biosíntesis de alcoholes grasos. Las aldehído reductasas nativas (por ejemplo, endógenas) presentes en una célula huésped recombinante (por ejemplo, E. coli), convertirán aldehídos grasos en alcoholes grasos. En algunas realizaciones, polipéptidos nativos (por ejemplo, endógenos) de biosíntesis de aldehídos grasos, tales como aldehído reductasas presentes en la célula huésped son suficientes para convertir aldehídos grasos en alcoholes grasos. Sin embargo, en otras realizaciones, se produce un alcohol graso expresando o sobreexpresando en la célula huésped recombinante un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene actividad de biosíntesis de alcoholes grasos que convierte un aldehído graso en un alcohol graso. Por ejemplo, una alcohol deshidrogenasa (también denominada en el presente documento aldehído reductasa, por ejemplo, EC 1.1.1.1), puede ser útil en la puesta en práctica de la divulgación. Tal como se usa en el presente documento, el término alcohol deshidrogenasa se refiere a un polipéptido que puede catalizar la conversión de un aldehído graso en un alcohol graso. Un experto habitual en la técnica apreciará que determinadas alcohol deshidrogenasas también pueden catalizar otras reacciones, y estas alcohol deshidrogenasas no específicas también están englobadas por el término alcohol deshidrogenasa. Los ejemplos de polipéptidos de alcohol deshidrogenasa útiles según la divulgación incluyen, pero no se limitan a, AlrA de Acinetobacter sp. M-1 (SEQ ID NO: 52) u homólogos de AlrA tales como AlrAadp1 (SEQ ID NO: 53) y alcohol deshidrogenasas endógenas de E. coli tales como YjgB, (AAC77226) (SEQ ID nO: 5), DkgA (NP_417485), DkgB (NP_414743), YdjL (AAC74846), YdjJ (NP_416288), AdhP (NP_415995), YhdH (NP_417719), YahK (NP_414859), YphC (AAC75598), YqhD (446856) y YbbO [AAC73595.1]. Se describen ejemplos adicionales en las publicaciones de solicitud de patente internacional n.os WO2007/136762, WO2008/119082 y WO2010/062480. En determinadas realizaciones, el polipéptido de biosíntesis de alcoholes grasos tiene actividad aldehído reductasa o alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1). En algunas realizaciones, un polipéptido nativo (por ejemplo, endógeno) de biosíntesis de alcoholes grasos se sobreexpresa y en otras realizaciones, un polipéptido exógeno de biosíntesis de alcoholes grasos se introduce en una célula huésped recombinante y se expresa o sobreexpresa.

Pueden producirse alcoholes grasos mediante una ruta dependiente de acil-CoA que utiliza productos intermedios de acil graso-ACP y acil graso-CoA y una ruta independiente de acil-CoA que utiliza productos intermedios de acil graso-ACP pero no un producto intermedio de acil graso-CoA. En realizaciones particulares, se selecciona la enzima codificada por el gen sobreexpresado de una ácido graso sintasa, una acil-ACP tioesterasa, una acil graso-CoA sintasa y una acetil-CoA carboxilasa. También se producen alcoholes grasos en la naturaleza por enzimas que puede reducir diversas moléculas de acil-ACP o acil-CoA para dar los alcoholes primarios correspondientes (véanse las publicaciones de patente estadounidense n.os 20100105963 y 20110206630, y la patente estadounidense n.° 8097439). Una composición de alcohol graso incluye a menudo alcoholes grasos junto con otros derivados de ácido graso, por ejemplo, aldehídos grasos y/o ácidos grasos. Normalmente, la composición de alcohol graso se recupera del entorno extracelular de la célula huésped recombinante, es decir, el medio de cultivo celular. En determinadas realizaciones, se modula la expresión de un polipéptido, por ejemplo, una enzima directa o indirectamente implicada en la biosíntesis de ácidos grasos (por ejemplo, se expresa, sobreexpresa o atenúa), en la que tal modulación da

como resultado un mayor rendimiento, mayor título o mayor productividad de un derivado de ácido graso de interés, tal como un alcohol graso. La enzima puede estar codificada por un polinucleótido de biosíntesis de ácidos grasos que es exógeno o heterólogo (por ejemplo, un polipéptido que se origina a partir de un organismo distinto de la célula huésped parental, o, una variante de un polipéptido nativo para la célula microbiana parental) o un polipéptido 5 endógeno (por ejemplo, un polipéptido nativo para la célula huésped parental) en el que el polipéptido endógeno se sobreexpresa en la célula huésped recombinante. La tabla 1 proporciona un listado de proteínas a modo de ejemplo que pueden expresarse en células huésped recombinantes para facilitar la producción de composiciones de alcohol graso particulares.

Tabla 1: Designaciones de genes

Designación de gen: Organismo fuente Nombre de enzima N.° de registro Número EC Uso a modo de ejemplo

Aumento de la producción de ácido graso / aumento de la producción de producto

accA: E. coli, lactococos acetil-CoA carboxilasa, subunidad A (carboxiltransferasa alfa) AAC73296, NP_414727 6.4.1.2 aumento de la producción de malonil-CoA

accB: E. coli, lactococos acetil-CoA carboxilasa, subunidad B (BCCP: proteína transportadora de biotina carboxilasa) NP_417721 6.4.1.2 aumento de la producción de malonil-CoA

accC: E. coli, lactococos acetil-CoA carboxilasa, subunidad C (biotina carboxilasa) NP_417722 6.4.1.2, 6.3.4.14 aumento de la producción de malonil-CoA

accD: E. coli, lactococos acetil-CoA carboxilasa, subunidad D (carboxiltransferasa beta) NP_416819 6.4.1.2 aumento de la producción de malonil-CoA

fadD: E. coli W3110 acil-CoA sintasa AP_002424 2.3.1.86, 6.2.1.3 aumento de la producción de ácidos grasos

fabA: E. coli K12 P-hidroxidecanoiltioéster deshidratasa/isomerasa NP_415474 4.2.1.60 aumento de la producción de acil graso-ACP/CoA

fabB: E. coli 3-oxoacil-[acil-portador- proteína] sintasa I BAA16180 2.3.1.41 aumento de la producción de acil graso-ACP/CoA

fabD: E. coli K12 [proteína transportadora de acilo] S-maloniltransferasa AAC74176 2.3.1.39 aumento de la producción de acil graso-ACP/CoA

fabF: E. coli K12 3-oxoacil-[proteína transportadora de acilo] sintasa II AAC74179 2.3.1.179 aumento de la producción de acil graso-ACP/CoA

fabG: E. coli K12 3-oxoacil-[proteína transportadora de acilo] reductasa AAC74177 1.1.1.100 aumento de la producción de acil graso-ACP/CoA

fabH: E. coli K12 3-oxoacil-[proteína transportadora de acilo] sintasa III AAC74175 2.3.1.180 aumento de la producción de acil graso-ACP/CoA

fabI: E. coli K12 enoil-[proteína transportadora de acilo] reductasa NP_415804 1.3.1.9 aumento de la producción de acil graso-ACP/CoA

fabR: E. coli K12 represor transcripcional NP_418398 ninguna modular la producción de ácidos grasos insaturados

fabV: Vibrio cholerae enoil-[proteína transportadora de acilo] reductasa YP 001217 283 1.3.1.9 aumento de la producción de acil graso-ACP/CoA

fabZ: E. coli K12 (3R)-hidroximiristol-proteína transportadora de acilo deshidratasa NP_414722 4.2.1.- aumento de la producción de acil graso-ACP/CoA

fadE: E. coli K13 acil-CoA deshidrogenasa AAC73325 1.3.99.3, 1.3.99.- reducir la degradación de ácidos grasos

fadR: E. coli proteína reguladora transcripcional NP_415705 ninguna Bloquear o revertir la degradación de ácidos grasos

Control de la longitud de cadena

tesA (con o sin secuencia líder): E. coli tioesterasa - la secuencia líder son los aminoácidos 1-26 POADA1 3.1.2.-, 3.1.1.5 Longitud de cadena C18

tesA (sin secuencia: E. coli tioesterasa AAC73596, NP 415027 3.1.2.-, 3.1.1.5 Longitud de cadena C181

líder)

tesA (mutante de E. coli tioesterasa I complejado con ácido octanoico): E. coli tioesterasa L109P 3.1.2.-, 3.1.1.5 Longitud de cadena <C18

fatBI: Umbellularia californica tioesterasa Q41635 3.1.2.14 Longitud de cadena C120

fatB2: Cuphea hookeriana tioesterasa AAC49269 3.1.2.14 Longitud de cadena C80 - C10:0

fatB3: Cuphea hookeriana tioesterasa AAC72881 3.1.2.14 Longitud de cadena C14:0 - C16:0

fatB: Cinnamomum camphora tioesterasa Q39473 3.1.2.14 Longitud de cadena C14:0

fatB: Arabidopsis thaliana tioesterasa CAA85388 3.1.2.14 Longitud de cadena C161

fatA1: Helianthus annuus tioesterasa AAL79361 3.1.2.14 Longitud de cadena C181

atfata: Arabidopsis thaliana tioesterasa NP 189147, NP 193041 3.1.2.14 Longitud de cadena C181

fatA: Brassica juncea tioesterasa CAC39106 3.1.2.14 Longitud de cadena C181

fatA: Cuphea hookeriana tioesterasa AAC72883 3.1.2.14 Longitud de cadena C181

tesA: Photobacterium orofundum tioesterasa YP_130990 3.1.2.14 Longitud de cadena

tesB: E. coli tioesterasa NP 414986 3.1.2.14 Longitud de cadena

fadM: E. coli tioesterasa NP 414977 3.1.2.14 Longitud de cadena

yciA: E. coli tioesterasa NP 415769 3.1.2.14 Longitud de cadena

ybgC: E. coli tioesterasa NP 415264 3.1.2.14 Longitud de cadena

Control del nivel de saturación*

Sfa: E. coli supresor de fabA AAN79592, AAC44390 ninguno aumento de ácidos grasos monoinsaturados

fabA: E. coli K12 P-hidroxidecanoiltioéster deshidratasa/isomerasa NP_415474 4.2.1.60 producir ácidos grasos insaturados

GnsA: E. coli supresores de la mutación nula de secG ABD 18647. 1 ninguno aumento de ésteres de ácidos grasos insaturados

GnsB: E. coli supresores de la mutación nula de secG AAC74076. 1 ninguno aumento de ésteres de ácidos grasos insaturados

fabB: E. coli 3-oxoacil-[proteína transportadora de acilo] sintasa I BAA16180 2.3.1.41 modular la producción de ácidos grasos insaturados

des: Bacillus subtilis D5 acil graso desaturasa O34653 1.14.19 modular la producción de ácidos grasos insaturados

Salida de productos: Producción de ésteres

AT3G51970: Arabidopsis thaliana alcohol de cadena larga O- acil graso transferasa NP_190765 2.3.1.26 producción de cera

ELO1: Pichia angusta ácido graso elongasa BAD98251 2.3.1.- producir ácidos grasos de longitud de cadena de muy larga

pIsC: Saccharomyces cerevisiae aciltransferasa AAA16514 2.3.1.51 producción de cera

DAGAT/DG AT: Arabidopsis thaliana diacilglicerolaciltransferasa AAF19262 2.3.1.20 producción de cera

hWS: Homo sapiens acil-CoA cera alcohol aciltransferasa AAX48018 2.3.1.20 producción de cera

aftl: Acinetobacter sp. ADP1 éster de cera bifuncional sintasa/acil- CoA:diacilglicerolacil transferasa AAO17391 2.3.1.20 producción de cera

ES9: Marinobacter hydrocarbono- clasticus éster de cera sintasa ABO21021 2.3.1.20 producción de cera

mWS: Simmondsiachi nensis éster de cera sintasa AAD38041 2.3.1.- producción de cera

acrl: Acinetobacter sp. ADP1 acil-CoA reductasa YP_047869 1.2.1.42 modificar salida

yqhD: E. coli K12 alcohol deshidrogenasa AP 003562 1.1.-.- modificar salida

AAT: Fragaria x ananassa alcohol O-acetiltransferasa AAG13130 2.3.1.84 modificar salida

Salida de productos: Salida de alcohol graso


: tioesterasas (véase anteriormente) aumento de la producción de ácidos grasos/ alcoholes grasos

BmFAR: Bombyx mori FAR (acil-CoA reductasa de formación de alcohol graso) BAC79425 1.1.1.- convertir acil-CoA en alcohol graso

acrl: Acinetobacter sp. ADP1 acil-CoA reductasa YP_047869 1.2.1.42 reducir acil graso-CoA para dar aldehídos grasos

yqhD: E. coli W3110 alcohol deshidrogenasa AP_003562 1.1.-.- reducir aldehídos grasos para dar alcoholes grasos; aumento de la producción de alcoholes grasos

alrA: Acinetobacter sp. ADP1 alcohol deshidrogenasa CAG70252 1.1.-.- reducir aldehídos grasos para dar alcoholes grasos

BmFAR: Bombyx mori FAR (acil-CoA reductasa de formación de alcohol graso) BAC79425 1.1.1.- reducir acil graso-CoA para dar alcohol graso

GTNG_1865: Geobacillus thermodenitri- ficans NG80-2 aldehído de cadena larga deshidrogenasa YP 001125 970 1.2.1.3 reducir aldehídos grasos para dar alcoholes grasos

AAR: Synechococc us elongatus acil-ACP reductasa YP_400611 O CM OO "3- c\i c\i reducir acil graso- ACP/CoA para dar aldehídos grasos

carB: Mycobacteriu m smegmatis proteína ácido carboxílico reductasa (CAR) YP_889972 6.2.1.3, 1.2.1.42 reducir ácidos grasos para dar aldehído graso

FadD: E. coli K12 acil-CoA sintetasa NP_416319 6.2.1.3 activa ácidos grasos para dar acil graso-CoA

atoB: Erwinia carotovora acetil-CoA acetiltransferasa YP_049388 2.3.1.9 producción de butanol

hbd: Butyrivibrio fibrisolvens beta-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa BAD51424 1.1.1.157 producción de butanol

CPE0095: Clostridium perfringens crotonasabutiril-CoA deshidrogenasa BAB79801 4.2.1.55 producción de butanol

bcd: Clostridium beijerinckii butiril-CoA deshidrogenasa AAM14583 1.3.99.2 producción de butanol

ALDH: Clostridium beijerinckii aldehído deshidrogenasa de acilación de coenzima A AAT66436 1.2.1.3 producción de butanol

AdhE: E. coli CFT073 aldehído-alcohol deshidrogenasa AAN80172 1.1.1.1 1.2.1.10 producción de butanol

Exportación de: producto

AtMRP5: Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana asociada a resistencia a múltiples fármacos NP_171908 ninguno modificar producto exportar cantidad

AmiS2: Rhodococcus sp. Transportador de ABC AmiS2 JC5491 ninguno modificar producto exportar cantidad

AtPGPI: Arabidopsis thaliana Glicoproteína 1 de Arabidopsis thaliana p NP_181228 ninguno modificar producto exportar cantidad

AcrA: Candidatus Protochlamydia amoebophila UWE25 supuesta proteína transportadora de flujo de entrada de múltiples fármacos acrA CAF23274 ninguno modificar producto exportar cantidad

AcrB: Candidatus probable proteína CAF23275 ninguno modificar producto

: Protochlamydia amoebophila UWE25 transportadora de flujo de entrada de múltiples fármacos, acrB exportar cantidad

TolC: Francisella tularensis subsp. novicida proteína de la membrana externa [biogénesis de envuelta celular, ABD59001 ninguno modificar producto exportar cantidad

AcrE: Shigella sonnei Ss046 proteína transmembrana afecta a la formación del tabique y la permeabilidad de la membrana celular YP_312213 ninguno modificar producto exportar cantidad

AcrF: E. coli proteína F con resistencia a acriflavina P24181 ninguno modificar producto exportar cantidad

tll1619: Thermosyne- chococcus elongatus [BP-1] transportador de flujo de entrada de múltiples fármacos NP 682409. 1 ninguno modificar producto exportar cantidad

tl10139: Thermosyne- chococcus elongatus [BP-1] transportador de flujo de entrada de múltiples fármacos NP 680930. 1 ninguno modificar producto exportar cantidad

Fermentación

replicación checkpoint genes: aumentar eficiencia de salida

umuD: Shigella sonnei Ss046 ADN polimerasa V, subunidad YP_310132 3.4.21.- aumentar eficiencia de salida

umuC: E. coli ADN polimerasa V, subunidad ABC42261 2.7.7.7 aumentar eficiencia de salida

pntA, pntB: Shigella flexneri NADH:NADPH transhidrogenasa (subunidades alfa y beta) P07001, P0AB70 1.6.1.2 aumentar eficiencia de salida

Otros

fabK: Streptococcus pneumoniae trans-2-enoil-ACP reductasa II AAF98273 1.3.1.9 Contribuye a la biosíntesis de ácidos grasos

fabL: Bacillus licheniformis DSM 13 enoil-(proteína transportadora de acilo) reductasa AAU39821 1.3.1.9 Contribuye a la biosíntesis de ácidos grasos

fabM: Streptococcus mutans trans-2, cis-3-decenoil-ACP isomerasa DAA05501 4.2.1.17 Contribuye a la biosíntesis de ácidos grasos

Células huésped recombinantes y cultivos celulares

Las estrategias para aumentar la producción de composiciones de aldehido graso o de alcohol graso por células huésped recombinantes incluyen el aumento del flujo a través de la ruta de biosíntesis de ácidos grasos mediante la sobreexpresión de genes nativos de biosíntesis de aldehídos grasos o alcoholes grasos y la expresión de genes 5 exógenos de biosíntesis de aldehídos grasos o alcoholes grasos de diferentes organismos en el huésped de producción. Tal como se usa en el presente documento, el término célula huésped recombinante o célula huésped modificada por ingeniería se refiere a una célula huésped cuya composición genética se ha alterado con relación a la célula huésped silvestre correspondiente, por ejemplo, mediante introducción deliberada de nuevos elementos genéticos y/o la modificación deliberada de elementos genéticos presentes de manera natural en la célula huésped. 10 La descendencia de tales células huésped recombinantes también contiene estos elementos genéticos nuevos y/o modificados. En cualquiera de los aspectos de la divulgación descritos en el presente documento, la célula huésped puede seleccionarse de una célula vegetal, célula de insecto, célula fúngica (por ejemplo, de un hongo filamentoso, tal como Candida sp., o una levadura en gemación, tal como Saccharomyces sp.), una célula de alga y una célula bacteriana. En una realización preferida, las células huésped recombinantes son microorganismos recombinantes. 15 Los ejemplos de células huésped que son microorganismos incluyen, pero no se limitan a, células del género Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Zymomonas, Rhodococcus, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces, Stenotrophamonas, Schizosaccharomyces, Yarrowia o Streptomyces. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula bacteriana Gram-positiva. En 20 otras realizaciones, la célula huésped es una célula bacteriana Gram-negativa. En algunas realizaciones, la célula

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huésped es una célula de E. coli. En otras realizaciones, la célula huésped es una célula de Bacillus lentus, una célula de Bacillus brevis, una célula de Bacillus stearothermophilus, una célula de Bacillus lichenoformis, una célula de Bacillus alkalophilus, una célula de Bacillus coagulans, una célula de Bacillus circulans, una célula de Bacillus pumilis, una célula de Bacillus thuringiensis, una célula de Bacillus clausii, una célula de Bacillus megaterium, una célula de Bacillus subtilis o una célula de Bacillus amyloliquefaciens. En otras realizaciones, la célula huésped es una célula de Trichoderma koningii, una célula de Trichoderma viride, una célula de Trichoderma reesei, una célula de Trichoderma longibrachiatum, una célula de Aspergillus awamori, una célula de Aspergillus fumigates, una célula de Aspergillus foetidus, una célula de Aspergillus nidulans, una célula de Aspergillus niger, una célula de Aspergillus oryzae, una célula de Humicola insolens, una célula de Humicola lanuginose, una célula de Rhodococcus opacus, una célula de Rhizomucor miehei o una célula Mucor michei. En aún otras realizaciones, la célula huésped es una célula de Streptomyces lividans o una célula Streptomyces murinus. En aún otras realizaciones, la célula huésped es una célula de Actinomycetes. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula de Saccharomyces cerevisiae.

En otras realizaciones, la célula huésped es una célula vegetal eucariota, una célula de alga, una célula de cianobacteria, una célula de bacteria verde de azufre, una célula de bacteria verde no de azufre, una célula de bacteria púrpura de azufre, una célula de bacteria púrpura no de azufre, una célula extremófila, una célula de levadura, una célula fúngica, una célula modificada por ingeniería de cualquiera de las especies descritas en el presente documento, o un organismo sintético. En algunas realizaciones, la célula huésped depende de la luz o fija carbono. En algunas realizaciones, la célula huésped tiene actividad autótrofa. En algunas realizaciones, la célula huésped tiene actividad fotoautrótofa, tal como en presencia de luz. En algunas realizaciones, la célula huésped es heterótrofa o mixótrofa en ausencia de luz. En determinadas realizaciones, la célula huésped es una célula de Arabidopsis thaliana, Panicum virgatum, Miscanthus giganteus, Zea mays, Botryococcuse braunii, Chlamydomonas reinhardtii, Dunaliela salina, Synechococcus Sp. PCC 7002, Synechococcus Sp. PCC 7942, Synechocystis Sp. PCC 6803, Thermosynechococcus elongates BP-1, Chlorobium tepidum, Chlorojlexus auranticus, Chromatiumm vinosum, Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter capsulatus, Rhodopseudomonas palusris, Clostridium ljungdahlii, Clostridium thermocellum, Penicillium chrysogenum, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pseudomonas fluorescens o Zymomonas mobilis.

Modificación por ingeniería de células huésped

En algunas realizaciones, se proporciona una secuencia de polinucleótido (o gen) a la célula huésped por medio de un vector recombinante, que incluye un promotor operativamente unido a la secuencia de polinucleótido. En determinadas realizaciones, el promotor es un promotor regulado en el desarrollo, específico de orgánulo, específico de tejido, inducible, constitutivo o uno específico de célula. En algunas realizaciones, el vector recombinante incluye al menos una secuencia seleccionada de una secuencia de control de la expresión acoplada operativamente a la secuencia de polinucleótido; un marcador de selección acoplado operativamente a la secuencia de polinucleótido; una secuencia de marcador acoplada operativamente a la secuencia de polinucleótido; un resto de purificación acoplado operativamente a la secuencia de polinucleótido; una secuencia de secreción acoplada operativamente a la secuencia de polinucleótido; y una secuencia de selección como diana acoplada operativamente a la secuencia de polinucleótido. Los vectores de expresión descritos en el presente documento incluyen una secuencia de polinucleótido en una forma adecuada para la expresión de la secuencia de polinucleótido en una célula huésped. Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que va transformarse, el nivel de expresión de polipéptido deseado, y similares. Los vectores de expresión descritos en el presente documento pueden introducirse en células huésped para producir polipéptidos, incluyendo polipéptidos de fusión, codificados por las secuencias de polinucleótido tal como se describió anteriormente (véase antes). La expresión de genes que codifican para polipéptidos en procariotas, por ejemplo, E. coli, se lleva a cabo con la mayor frecuencia con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de polipéptidos o bien de fusión o bien de no fusión. Los vectores de fusión añaden un número de aminoácidos a un polipéptido codificado en los mismos, habitualmente al extremo amino- terminal o carboxi-terminal del polipéptido recombinante. Tales vectores de fusión sirven normalmente para uno o más de los tres propósitos siguientes incluyendo aumentar expresión del polipéptido recombinante; aumentar la solubilidad del polipéptido recombinante; y ayudar en la purificación del polipéptido recombinante actuando como ligando en purificación por afinidad. A menudo, en los vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión del resto de fusión y el polipéptido recombinante. Esto permite la separación del polipéptido recombinante del resto de fusión después de la purificación del polipéptido de fusión. Los ejemplos de tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento relacionadas, incluyen factor Xa, trombina y enterocinasa. Los vectores de expresión de fusión a modo de ejemplo incluyen el vector pGEX (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ; Smith et al. (1988) Gene 67:31-40), el vector pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y el vector pRITS (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, N.J.), que fusionan glutatión S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa E, o proteína A, respectivamente, con el polipéptido recombinante diana.

Los ejemplos de vectores de expresión de E. coli inducibles, no de fusión incluyen el vector pTrc (Aman et al. (1988) Gene 69:301-315) y el vector pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89). La expresión de genes diana a partir del vector pTrc se basa en la transcripción de ARN polimerasa del huésped a partir de un promotor de fusión trp-lac híbrido. La expresión de genes diana a partir del vector pET 11d se basa en la transcripción a partir de un promotor de fusión gn10-lac de T7

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mediado por una ARN polimerasa viral coexpresada (gn1 de T7). Esta polimerasa viral la suministran cepas huésped tales como BL21(DE3) o HMS174(DE3) de un profago X residente que alberga un gen de gn1 de T7 bajo el control transcripcional del promotor lacUV 5. Se conocen bien en la técnica sistemas de expresión adecuados para células tanto procariotas como eucariotas (véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory). Los ejemplos de vectores de expresión de E. coli inducibles, no de fusión incluyen el vector pTrc (Aman et al. (1988) Gene 69:301-315) y el vector PET 11d (Studier et al. (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA, pp. 60-89). En determinadas realizaciones, una secuencia de polinucleótido de la divulgación está operativamente unida a un promotor derivado del bacteriófago T5. En una realización, la célula huésped es una célula de levadura. En esta realización, el vector de expresión es un vector de expresión de levadura. Pueden introducirse vectores en células procariotas o eucariotas mediante una variedad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir ácido nucleico foráneo (por ejemplo, ADN) en una célula huésped. Pueden encontrarse métodos adecuados para transformar o transfectar células huésped, por ejemplo, en Sambrook et al. (véase antes). Para la transformación estable de células bacterianas, se sabe que (dependiendo del vector de expresión y la técnica de transformación usados) una determinada fracción de células captarán y replicarán el vector de expresión. Para identificar y seleccionar estos transformantes, puede introducirse un gen que codifica para un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a un antibiótico) en las células huésped junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables incluyen los que confieren resistencia a fármacos tales como, pero sin limitarse a, ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Pueden introducirse ácidos nucleicos que codifican para un marcador seleccionable en una célula huésped en el mismo vector que el que codifica para un polipéptido descrito en el presente documento o pueden introducirse en un vector independiente. Pueden identificarse células transformadas de manera estable con el ácido nucleico introducido mediante crecimiento en presencia de un fármaco de selección apropiado. La célula huésped modificada por ingeniería o recombinante tal como se describe en el presente documento (véase antes) es una célula usada para producir una composición de derivado de ácido graso tal como un aldehído graso o un alcohol graso. En cualquiera de los aspectos de la divulgación descritos en el presente documento, la célula huésped puede seleccionarse de una planta eucariota, bacteria, alga, cianobacteria, bacteria verde de azufre, bacteria verde no de azufre, bacteria púrpura de azufre, bacteria púrpura no de azufre, extremófila, levadura, hongo, organismos modificados por ingeniería de los mismos, o un organismo sintético. En algunas realizaciones, la célula huésped depende de la luz o fija carbono. En algunas realizaciones, la célula huésped tiene actividad autótrofa. Diversas células huésped pueden usarse para producir derivados de ácido graso, tal como se describe en el presente documento.

Las células huésped o microorganismos de la divulgación incluyen cepas huésped o células huésped que se modifican por ingeniería genética o se modifican para contener alteraciones para someter a prueba la eficacia de mutaciones específicas sobre actividades enzimáticas (es decir, células o microorganismos recombinantes). Pueden usarse de manera intercambiable diversas manipulaciones y alteraciones genéticas opcionales de una célula huésped a otra, dependiendo de qué rutas enzimáticas nativas estén presentes en la célula huésped original. En una realización, puede usarse una cepa huésped para someter a prueba la expresión de un polipéptido de AAR en combinación con otros polipéptidos de biosíntesis (por ejemplo, enzimas). Una cepa huésped puede englobar varias alteraciones genéticas para someter a prueba variables específicas, incluyendo pero sin limitarse a, condiciones de cultivo incluyendo componentes de fermentación, fuente de carbono (por ejemplo, materia prima), temperatura, presión, condiciones de contaminación reducida del cultivo y niveles de oxígeno.

En una realización, una cepa huésped engloba una deleción de fadE y fhuA opcional. La acil-CoA deshidrogenasa (FadE) es una enzima que es importante para metabolizar ácidos grasos. Cataliza la segunda etapa en la utilización de ácidos grasos (beta-oxidación), que es el proceso de ruptura de largas cadenas de ácidos grasos (acil-CoA) para dar moléculas de acetil-CoA. Más específicamente, la segunda etapa del ciclo de p-oxidación de degradación de ácidos grasos en bacterias es la oxidación de acil-CoA para dar 2-enoil-CoA, que está catalizada por FadE. Cuando E. coli carece de FadE, no puede crecer con ácidos grasos como fuente de carbono pero puede crecer con acetato. La incapacidad para utilizar ácidos grasos de cualquier longitud de cadena concuerda con el fenotipo notificado de cepas de fadE, es decir, cepas mutantes de fadE en las que se perturba la función de FadE. El gen fadE puede desactivarse opcionalmente o atenuarse para garantizar que las acil-CoA, que pueden ser productos intermedios en una ruta de derivados de ácido graso, pueden acumularse en la célula de manera que todas las acil-CoA pueden convertirse eficazmente en derivados de ácido graso. Sin embargo, la atenuación de fadE es opcional cuando se usa azúcar como fuente de carbono puesto que en tales condiciones, es probable que esté reprimida la expresión de FadE y por tanto FadE sólo puede estar presente en pequeñas cantidades y no puede competir eficazmente con éster sintasa u otras enzimas por los sustratos de acil-CoA. FadE se reprime debido a represión por catabolitos. E. coli y muchos otros microbios prefieren consumir azúcar con respecto a ácidos grasos, así que cuando están disponibles ambas fuentes, se consume en primer lugar el azúcar mediante la represión del regulón fad (véase D. Clark, J Bacteriol. (1981) 148(2):521-6)). Además, la ausencia de azúcares y la presencia de ácidos grasos induce la expresión de FadE. Podrían perderse productos intermedios de acil-CoA en la ruta de beta-oxidación puesto que las proteínas expresadas por el regulón fad (incluyendo FadE) están reguladas por incremento y competirán eficazmente por las acil-CoA. Por tanto, puede ser beneficioso tener el gen fadE desactivado o atenuado. Puesto que la mayor parte de las fuentes de carbono se basan principalmente en azúcar, es opcional atenuar FadE. El gen fhuA codifica para la proteína TonA, que es un transportador con acoplamiento de energía y receptor en la membrana externa de E. coli (V. Braun (2009) J Bacteriol. 191(11 ):3431-3436). Su deleción es opcional. La deleción

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de fhuA permite que la célula se vuelva más resistente al ataque por fagos, lo que puede ser beneficioso en determinadas condiciones de fermentación. Por tanto, puede ser deseable delecionar fhuA en una célula huésped que es probable que esté sujeta a posible contaminación durante series de fermentación.

En otra realización, la cepa huésped (véase antes) también engloba la sobreexpresión opcional de uno o más de los siguientes genes incluyendo fadR, fabA, fabD, fabG, fabH, fabV y/o fabF. Ejemplos de tales genes son fadR de Escherichia coli, fabA de Salmonella typhimurium (NP_460041), fabD de Salmonella typhimurium (NP_460164), fabG de Salmonella typhimurium (NP_460165), fabH de Salmonella typhimurium (NP_460163), fabV de Vibrio cholera (YP_001217283) y fabF de Clostridium acetobutylicum (NP_350156). La sobreexpresión de uno o más de estos genes, que codifican para enzimas y reguladores en la biosíntesis de ácidos grasos, puede servir para aumentar el título de compuestos derivados de ácido graso incluyendo aldehídos grasos y alcoholes grasos en diversas condiciones de cultivo.

En otra realización, se usan cepas de E. coli como células huésped para la producción de derivados de ácido graso tales como aldehídos grasos y/o alcoholes grasos. De manera similar, estas células huésped proporcionan la sobreexpresión opcional de uno o más genes de biosíntesis (es decir, genes que codifican para enzimas y reguladores de la biosíntesis de ácidos grasos) que pueden aumentar o potenciar adicionalmente el título de compuestos derivados de ácido graso tales como derivados de ácido graso (por ejemplo, alcoholes grasos, aldehídos grasos, etc.) en diversas condiciones de cultivo incluyendo, pero sin limitarse a, fadR, fabA, fabD, fabG, fabH, fabV y/o fabF. Los ejemplos de alteraciones genéticas incluyen fadR de Escherichia coli, fabA de Salmonella typhimurium (NP_460041), fabD de Salmonella typhimurium (NP_460164), fabG de Salmonella typhimurium (NP_460165), fabH de Salmonella typhimurium (NP_460163), fabV de Vibrio cholera (YP_001217283) y fabF de Clostridium acetobutylicum (NP_350156). En algunas realizaciones, pueden modificarse por ingeniería operones sintéticos que portan estos genes de biosíntesis y expresarse en células para someter a prueba la sobreexpresión de aldehídos grasos y/o alcoholes grasos en diversas condiciones de cultivo y/o potenciar adicionalmente la producción de alcoholes grasos y/o aldehídos grasos. Tales operones sintéticos contienen uno o más genes de biosíntesis. El operón ifab138, por ejemplo, es un operón modificado por ingeniería que contiene genes de biosíntesis de ácidos grasos opcionales, incluyendo fabV de Vibrio cholera, fabH de Salmonella typhimurium, fabD de S. typhimurium, fabG de S. typhimurium, fabA de S. typhimurium y/o fabF de Clostridium acetobutylicum que pueden usarse para facilitar la sobreexpresión de derivados de ácido graso para someter a prueba condiciones de cultivo específicas. Una ventaja de tales operones sintéticos es que la tasa de producción de derivados de ácido graso puede aumentarse o potenciarse adicionalmente.

En algunas realizaciones, las células huésped o microorganismos que se usan para expresar ACP y enzimas de biosíntesis (por ejemplo, TE, ES, CAR, AAR, ADC, etc.) expresarán además genes que engloban determinadas actividades enzimáticas que pueden aumentar la producción para uno o más derivados de ácido graso particulares tales como alcoholes grasos, aldehídos grasos, ésteres grasos, aminas grasas, derivados bifuncionales de ácido graso, diácidos y similares. En una realización, la célula huésped tiene actividad tioesterasa (E.C.3.1.2.* o E.C.3.1.2.14 o E.C.3.1.1.5) para la producción de ácidos grasos que puede aumentarse mediante la sobreexpresión del gen. En otra realización, la célula huésped tiene actividad éster sintasa (E.C.2.3.1.75) para la producción de ésteres grasos. En otra realización, la célula huésped tiene actividad acil-ACP reductasa (aAr) (E.C.1.2.1.80) y/o actividad alcohol deshidrogenasa (E.C. 1.1.11.) y/o actividad alcohol graso acil-CoA reductasa (FAR) (E.C.1.1.1.*) y/o actividad ácido carboxílico reductasa (CAR) (EC 1.2.99.6) para la producción de alcoholes grasos. En otra realización, la célula huésped tiene actividad acil-ACP reductasa (AAR) (E.C.1.2.1.80) para la producción de aldehídos grasos. En otra realización, la célula huésped tiene actividad acil-ACP reductasa (AAR) (E.C.1.2.1.80) y actividad descarbonilasa (ADC) para la producción de alcanos y alquenos. En otra realización, la célula huésped tiene actividad acil-CoA reductasa (E.C.1.2.1.50), actividad acil-CoA sintasa (FadD) (E.C.2.3.1.86) y actividad tioesterasa (E.C.3.1.2.* o E.C.3.1. 2.14 o E.C.3.1.1.5) para la producción de alcoholes grasos. En otra realización, la célula huésped tiene actividad éster sintasa (E.C.2.3.1.75), actividad acil-CoA sintasa (FadD) (E.C.2.3.1.86) y actividad tioesterasa (E.C.3.1.2.* o E.C.3.1. 2.14 o E.C.3.1.1.5) para la producción de ésteres grasos. En otra realización, la célula huésped tiene actividad OleA para la producción de cetonas. En otra realización, la célula huésped tiene actividad OleBCD para la producción de olefinas internas. En otra realización, la célula huésped tiene actividad acil-ACP reductasa (AaR) (E.C.1.2.1.80) y actividad alcohol deshidrogenasa (E.C.1.1.1.1.) para la producción de alcoholes grasos. En otra realización, la célula huésped tiene actividad tioesterasa (E.C.3.1.2.* o E.C.3.1.2.14 o E.C.3.1.1.5) y actividad descarboxilasa para producir olefinas terminales. La expresión de actividades enzimáticas en microorganismos y células microbianas se enseña en las patentes estadounidenses número 8.097.439; 8.110.093; 8.110.670; 8.183.028; 8.268.599; 8.283.143; 8.232.924; 8.372.610; y 8.530.221. En otras realizaciones, las células huésped o microorganismos que se usan para expresar ACP y otras enzimas de biosíntesis incluirán determinadas actividades enzimáticas nativas que están reguladas por incremento o sobreexpresadas para producir uno o más derivados de ácido graso particulares tales como aldehídos grasos y/o alcoholes grasos. En una realización, la célula huésped tiene una actividad tioesterasa nativa (E.C.3.1.2.* o E.C.3.1. 2.14 o E.C.3.1.1.5) para la producción de ácidos grasos que puede aumentarse mediante la sobreexpresión del gen de tioesterasa.

La presente divulgación incluye cepas huésped o microorganismos que expresan genes que codifican para AAR y otras enzimas de biosíntesis (véase antes). Las células huésped recombinantes producen derivados de ácido graso tales como aldehídos grasos y alcoholes grasos y composiciones y mezclas de los mismos. Los derivados de ácido

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graso se recuperan normalmente del medio de cultivo y/o se aíslan de las células huésped. En una realización, los derivados de ácido graso tales como aldehídos grasos y alcoholes grasos se recuperan del medio de cultivo (extracelular). En otra realización, los derivados de ácido graso tales como aldehídos grasos y alcoholes grasos se aíslan de las células huésped (intracelular). En otra realización, los derivados de ácido graso tales como aldehídos grasos y alcoholes grasos se recuperan del medio de cultivo y se aíslan de las células huésped. La composición de derivados de ácido graso producida por una célula huésped puede analizarse usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, CG-FID, para determinar la distribución de derivados de ácido graso particulares así como longitudes de cadena y grado de saturación de los componentes de la composición de derivados de ácido graso tales como composiciones de aldehído graso y alcohol graso.

Los ejemplos de células huésped que funcionan como microorganismos (por ejemplo, células microbianas), incluyen pero no se limitan a células del género Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Zymomonas, Rhodococcus, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces, Stenotrophamonas, Schizosaccharomyces, Yarrowia o Streptomyces. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula bacteriana Gram-positiva. En otras realizaciones, la célula huésped es una célula bacteriana Gram- negativa. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula de E. coli. En alguna realización, la célula huésped es una célula B de E. coli, una célula C de E. coli C, una célula K de E. coli o una célula W de E. coli. En otras realizaciones, la célula huésped es una célula de Bacillus lentus, una célula de Bacillus brevis, una célula de Bacillus stearothermophilus, una célula de Bacillus lichenoformis, una célula de Bacillus alkalophilus, una célula de Bacillus coagulans, una célula de Bacillus circulans, una célula de Bacillus pumilis, una célula de Bacillus thuringiensis, una célula de Bacillus clausii, una célula de Bacillus megaterium, una célula de Bacillus subtilis o una célula de Bacillus amyloliquefaciens. En todavía otras realizaciones, la célula huésped es una célula de Trichoderma koningii, una célula de Trichoderma viride, una célula de Trichoderma reesei, una célula de Trichoderma longibrachiatum, una célula de Aspergillus awamori, una célula de Aspergillus fumigates, una célula de Aspergillus foetidus, una célula de Aspergillus nidulans, una célula de Aspergillus niger, una célula de Aspergillus oryzae, una célula de Humicola insolens, una célula de Humicola lanuginose, una célula de Rhodococcus opacus, una célula de Rhizomucor miehei o una célula de Mucor michei. En aún otras realizaciones, la célula huésped es una célula de Streptomyces lividans o una célula de Streptomyces murinus. En aún otras realizaciones, la célula huésped es una célula de Actinomycetes. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula de Saccharomyces cerevisiae. En otras realizaciones, la célula huésped es una célula de una planta eucariota, alga, cianobacteria, bacteria verde de azufre, bacteria verde no de azufre, bacteria púrpura de azufre, bacteria púrpura no de azufre, extremófila, levadura, hongo, un organismo modificado por ingeniería de los mismos, o un organismo sintético. En algunas realizaciones, la célula huésped depende de la luz o fija carbono. En algunas realizaciones, la célula huésped tiene actividad autótrofa. En algunas realizaciones, la célula huésped tiene actividad fotoautótrofa, tal como en presencia de luz. En algunas realizaciones, la célula huésped es heterótrofa o mixótrofa en ausencia de luz. En determinadas realizaciones, la célula huésped es una célula de Arabidopsis thaliana, Panicum virgatum, Miscanthus giganteus, Zea mays, Botryococcuse braunii, Chlamydomonas reinhardtii, Dunaliela salina, Synechococcus Sp. PCC 7002, Synechococcus Sp. PCC 7942, Synechocystis Sp. PCC 6803, Thermosynechococcus elongates BP-1, Chlorobium tepidum, Chlorojlexus auranticus, Chromatiumm vinosum, Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter capsulatus, Rhodopseudomonas palusris, Clostridium ljungdahlii, Clostridium thermocellum, Penicillium chrysogenum, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pseudomonas fluorescens o Zymomonas mobilis. En una realización particular, la célula microbiana es de una cianobacteria incluyendo, pero sin limitarse a, Prochlorococcus, Synechococcus, Synechocystis, Cianothece y Nostoc punctiforme. En otra realización, la célula microbiana es de una especie cianobacteriana específica incluyendo, pero sin limitarse a, Synechococcus elongatus PCC7942, Synechocystis sp. PCC6803 y Synechococcus sp. PCC7001.

Cultivo de células huésped recombinantes y fermentación

Tal como se usa en el presente documento, el término fermentación se refiere ampliamente a la conversión de materiales orgánicos en sustancias diana por células huésped, por ejemplo, la conversión de una fuente de carbono por células huésped recombinantes en ácidos grasos o derivados de los mismos mediante la propagación de un cultivo de las células huésped recombinantes en un medio que comprende la fuente de carbono. Las condiciones permisivas para la producción se refieren a cualesquiera condiciones que permiten que una célula huésped produzca un producto deseado, tal como un aldehído graso o un alcohol graso. De manera similar, la condición o condiciones en las que se expresa la secuencia de polinucleótido de un vector significan cualesquiera condiciones que permiten que una célula huésped sintetice un polipéptido. Las condiciones adecuadas incluyen, por ejemplo, condiciones de fermentación. Las condiciones de fermentación pueden incluir muchos parámetros incluyendo, pero sin limitarse a, intervalos de temperatura, niveles de aireación, tasas de alimentación y composición de medios. Cada una de estas condiciones, individualmente y en combinación, permiten que crezca la célula huésped. La fermentación puede ser aerobia, anaerobia, o variaciones de las mismas (tales como microaerobias). Los medios de cultivo a modo de ejemplo incluyen caldos o geles. Generalmente, el medio incluye una fuente de carbono que puede metabolizarse por una célula huésped directamente. Además, pueden usarse enzimas en el medio para facilitar la movilización (por ejemplo, la despolimerización de almidón o celulosa para dar azúcares fermentables) y el metabolismo posterior de la fuente de carbono.

Para la producción a pequeña escala, las células huésped modificadas por ingeniería pueden hacerse crecer en

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lotes de, por ejemplo, aproximadamente 100 |il, 200 |il, 300 |il, 400 |il, 500 |il, 1 ml, 5 ml, 10 ml, 15 ml, 25 ml, 50 ml,

75 ml, 100 ml, 500 ml, 1 l, 2 l, 5 l, o 10 l; fermentarse; e inducirse para expresar una secuencia de polinucleótido deseada, tal como una secuencia de polinucleótido que codifica para una ACP y/o polipéptido de biosíntesis. Para la producción a gran escala, las células huésped modificadas por ingeniería pueden hacerse crecer en lotes de aproximadamente 10 l, 100 l, 1000 l, 10.000 l, 100.000 l y 1.000.000 l o más; fermentarse; e inducirse para expresar una secuencia de polinucleótido deseada. Alternativamente, puede llevarse a cabo fermentación semicontinua a gran escala. Las composiciones de derivados de ácido graso descritas en el presente documento se encuentran en el entorno extracelular del cultivo de célula huésped recombinante y pueden aislarse fácilmente del medio de cultivo. Un derivado de ácido graso tal como un aldehído graso o alcohol graso puede secretarlo la célula huésped recombinante, transportarse al entorno extracelular o transferirse de manera pasiva al entorno extracelular del cultivo de célula huésped recombinante. El derivado de ácido graso se aísla de un cultivo de célula huésped recombinante usando métodos de rutina conocidos en la técnica.

Productos derivados de células huésped recombinantes

Tal como se usa en el presente documento, la fracción de carbono moderno o fM tiene el mismo significado definido por los materiales de referencia patrón del Instituto Nacional de Normas y Tecnología (NIST) (SRMs4990B y 4990C, conocidos como patrones de ácidos oxálicos HOxI y HOxII, respectivamente). La definición fundamental se refiere a 0,95 veces la razón isotópica 14C/12C HOxI (a la que se hace referencia como AD 1950). Esto es aproximadamente equivalente a la madera previa a la Revolución Industrial corregida para la desintegración. Para la biosfera viva actual (material vegetal), fM es de aproximadamente 1,1. Los bioproductos (por ejemplo, los derivados de ácido graso incluyendo aldehídos grasos y/o alcoholes grasos producidos según la presente divulgación) incluyen compuestos orgánicos producidos biológicamente. En particular, los derivados de ácido graso producidos usando la ruta de biosíntesis de ácidos grasos en el presente documento, no se han producido a partir de fuentes renovables y, como tal, son nuevas composiciones de materia. Estos nuevos bioproductos pueden distinguirse de compuestos orgánicos derivados de carbono petroquímico basándose en la obtención de huella isotópica de carbono o la datación mediante 14C. Adicionalmente, la fuente específica de carbono de fuente biológica (por ejemplo, glucosa frente a glicerol) puede determinarse mediante obtención de huella isotópica de carbono dual (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.169.588). La capacidad para distinguir bioproductos de compuestos orgánicos basados en el petróleo es beneficiosa en la trazabilidad de estos materiales en el comercio. Por ejemplo, pueden distinguirse compuestos orgánicos o químicos que incluyen perfiles isotópicos de carbono tanto de base biológica como de base en el petróleo de compuestos orgánicos y químicos que se componen sólo de materiales basados en el petróleo. Así, los bioproductos en el presente documento pueden someterse a seguimiento o trazabilidad en el comercio basándose en su perfil isotópico de carbono único. Los bioproductos pueden distinguirse de compuestos orgánicos basados en el petróleo comparando la razón isotópica de carbono estable (13C/12C) en cada muestra. La razón 13C/12C en un bioproducto dado es consecuencia de la razón 13C/12C en el dióxido de carbono atmosférico en el momento en que se fija el dióxido de carbono. También refleja la ruta metabólica precisa. También se producen variaciones regionales. El petróleo, las plantas C3 (las de hoja caduca), las plantas C4 (las hierbas) y carbonatos marinos muestran todos diferencias significativas en 13C/12C y los valores de 813C correspondientes. Además, la materia lipídica de plantas C3 y C4 se analiza de manera diferente que en materiales derivados de los componentes de hidrato de carbono de las mismas plantas como consecuencia de la ruta metabólica. Dentro de la precisión de medición, 13C muestra grandes variaciones debido a efectos de fraccionamiento isotópico, siendo el más significativo de ellos para bioproductos el mecanismo de fotosíntesis. La principal causa de las diferencias en la razón isotópica de carbono en plantas se asocia estrechamente con diferencias en la ruta de metabolismo de carbono por fotosíntesis en las plantas, particularmente la reacción que se produce para la carboxilación primaria (es decir, la fijación inicial de CO2 atmosférico). Dos grandes clases de vegetación son las que incorporan el ciclo de fotosíntesis C3 (o de Calvin-Benson) y las que incorporan el ciclo de fotosíntesis C4 (o de Hatch-Slack). En plantas C3, la fijación primaria de CO2 o reacción de carboxilación implica la enzima ribulosa-1,5-difosfato carboxilasa, y el primer producto estable es un compuesto de 3 carbonos. Las plantas C3, tales como frondosas y coníferas, son predominantes en las zonas de climas templados. En plantas C4, una reacción de carboxilación adicional que implica otra enzima, fosfoenol-piruvato carboxilasa, es la reacción de carboxilación primaria. El primer compuesto carbonado estable es un ácido de 4 carbonos que se descarboxila posteriormente. El CO2 así liberado vuelve a fijarse mediante el ciclo C3. Ejemplos de plantas C4 son hierbas tropicales, maíz y caña de azúcar. Las plantas tanto C4 como C3 muestran un intervalo de razones isotópicas 13C/12C, pero valores típicos son de aproximadamente -7 a aproximadamente -13 por cada mil para plantas C4 y de aproximadamente -19 a aproximadamente -27 por cada mil para plantas C3 (véase, por ejemplo, Stuiver et al. (1977) Radiocarbon 19:355). El carbón y el petróleo se encuentran generalmente en este último intervalo. La escala de medición de 13C se definió originariamente por un cero establecido por la piedra caliza belemnita de Pee Dee (PDB), facilitándose los valores en partes por mil desviaciones con respecto a este material. Los valores de 813C se expresan en partes por miles (por mil), abreviado como, %o, y se calculan de la siguiente manera:

813C (%) = [(13C/12C) muestra - (13C/12C) patrón]/ (13C/12C) patrón x 1000

Puesto que el material de referencia (RM) de PDB se ha agotado, una serie de RM alternativos se han desarrollado en cooperación con IAEA, USGS, NIST, y otros laboratorios de isótopos internacionales seleccionados. Las notaciones para las desviaciones por mil con respecto a PDB es 813C. Se realizan las mediciones con CO2 mediante

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espectrometría de masas de razón estable de alta precisión (IRMS) con iones moleculares de masas 44, 45 y 46. Las composiciones descritas en el presente documento incluyen bioproductos producidos mediante cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, productos derivados de ácido graso. Específicamente, el bioproducto puede tener un 813C de aproximadamente -28 o mayor, aproximadamente -27 o mayor, -20 o mayor, -18 o mayor, -15 o mayor, -13 o mayor, -10 o mayor, o -8 o mayor. Por ejemplo, el bioproducto puede tener un 813C de aproximadamente -30 a aproximadamente -15, de aproximadamente -27 a

aproximadamente -19, de aproximadamente -25 a aproximadamente -21, de aproximadamente -15 a

aproximadamente -5, de aproximadamente -13 a aproximadamente -7 o de aproximadamente -13 a

aproximadamente -10. En otros casos, el bioproducto puede tener un 813C de aproximadamente -10, -11, -12 o -12,3. Los bioproductos producidos según la divulgación en el presente documento, también pueden distinguirse de compuestos orgánicos basados en el petróleo comparando la cantidad de 14C en cada compuesto. Dado que el 14C tiene una semivida nuclear de 5730 años, los combustibles basados en el petróleo que contienen carbono más antiguo pueden distinguirse de bioproductos que contienen carbono más nuevo (véanse, por ejemplo, Currie, Source Apportionment of Atmospheric Particles, Characterization of Environmental Particles, J. Buffle y H. P. van Leeuwen, eds., 1 de vol. I de IuPaC Environmental Analytical Chemical Series (Lewis Publishers, Inc.) 3-74, (1992)). La suposición básica en la datación por radiocarbono es que la constancia de la concentración de 14C en la atmósfera conduce a la constancia de 14C en organismos vivos. Sin embargo, debido a las pruebas nucleares atmosféricas desde 1950 y el quemado de combustibles fósiles desde 1850, el 14C ha adquirido una segunda característica temporal geoquímica. Su concentración en el CO2 atmosférico, y así en la biosfera viva, se duplicó

aproximadamente en el apogeo de las pruebas nucleares, a mediados de los años 1960. Desde entonces se ha vuelto gradualmente a la tasa isotópica (14C/12C) inicial cosmogénica (atmosférica) de estado estacionario de aproximadamente 1,2 x 10'12, con una “semivida” de relajación aproximada de 7-10 años. Esta última semivida no ha de tomarse literalmente; más bien, debe usarse la función de entrada/desintegración nuclear atmosférica detallada para rastrear la variación de 14C atmosférico y de la biosfera desde el comienzo de la era nuclear. Es esta última característica temporal de 14C de la biosfera la que mantiene la promesa de datación anual de carbono reciente de la biosfera. Puede medirse el 14C mediante espectrometría de masas con acelerador (AMS), facilitándose los resultados en unidades de fracción de carbono moderno (fM). fM se define por los materiales de referencia patrón 4990B y 4990C del Instituto Nacional de Normas y Tecnología (NIST). Tal como se usa en el presente documento, la fracción de carbono moderno o fM tiene el mismo significado definido por los materiales de referencia patrón del Instituto Nacional de Normas y Tecnología (NIST) (SRMs4990B y 4990C, conocidos como patrones de ácidos oxálicos HOxI y HOxII, respectivamente). La definición fundamental se refiere a 0,95 veces la razón isotópica 14C/12C HOxI (a la que se hace referencia como AD 1950). Esto es aproximadamente equivalente a la madera previa a la Revolución Industrial corregida para la desintegración. Para la biosfera viva actual (material vegetal), fM es de aproximadamente 1,1. Las composiciones descritas en el presente documento incluyen bioproductos que pueden tener un fM14C de al menos aproximadamente 1. Por ejemplo, el bioproducto de la divulgación puede tener un fM14C de al menos aproximadamente 1,01, un fM14C de aproximadamente 1 a aproximadamente 1,5, un fM14C de aproximadamente 1,04 a aproximadamente 1,18, o un fM14C de aproximadamente 1,111 a aproximadamente 1,124.

Otra medición de 14C se conoce como el tanto por ciento de carbono moderno (pMC). Para un arqueólogo o geólogo que usa dataciones por 14C, AD 1950 es igual a una edad de cero años. Esto también representa 100 pMC. El carbono de bombas en la atmósfera alcanzó casi el doble del nivel normal en 1963 en el apogeo de las armas termonucleares. Su distribución dentro de la atmósfera se ha aproximado desde su aparición, mostrando valores que son mayores de 100 pMC para plantas y animales que viven desde AD 1950. Ha disminuido gradualmente a lo largo del tiempo, siendo el valor de hoy en día próximo a 107,5 pMC. Esto significa que un material de biomasa reciente, tal como maíz, proporcionaría una firma de 14C próxima a 107,5 pMC. Los compuestos basados en el petróleo tendrán un valor de pMC de cero. La combinación de carbono fósil con carbono de hoy en día dará como resultado una dilución del contenido de pMC de hoy en día. Suponiendo que 107,5 pMC representa el contenido de 14C de materiales de biomasa de hoy en día y 0 pMC representa el contenido de 14C de productos basados en el petróleo, el valor de pMC medido para ese material reflejará las proporciones de los dos tipos de componente. Por ejemplo, un material derivado al 100% de soja de hoy en día proporcionará una firma de radiocarbono próxima a 107,5 pMC. Si ese material se diluyera al 50% con productos basados en el petróleo, proporcionaría una firma de radiocarbono de aproximadamente 54 pMC. Se deriva un contenido de carbono de base biológica asignando el 100% igual a 107,5 pMC y el 0% igual a 0 pMC. Por ejemplo, una muestra que mide 99 pMC proporcionará un contenido de carbono de base biológica equivalente del 93%. Este valor se denomina el resultado de carbono de base biológica medio y supone que todos los componentes dentro del material analizado se originan o bien a partir de material biológico de hoy en día o bien a partir de material basado en el petróleo. Un bioproducto que comprende uno o más derivados de ácido graso tal como se describe en el presente documento puede tener un pMC de al menos aproximadamente 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ó 100. En otros casos, un derivado de ácido graso descritos en el presente documento puede tener un pMC de entre aproximadamente 50 y aproximadamente 100; entre aproximadamente 60 y aproximadamente 100; entre aproximadamente 70 y aproximadamente 100; entre aproximadamente 80 y aproximadamente 100; entre aproximadamente 85 y aproximadamente 100; entre aproximadamente 87 y aproximadamente 98; o entre aproximadamente 90 y aproximadamente 95. En aún otros casos, un derivado de ácido graso descrito en el presente documento puede tener un pMC de aproximadamente 90, 91, 92, 93, 94 ó 94,2.

Composiciones de aldehído graso y alcohol graso y su uso

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Se usan aldehidos para producir muchos productos químicos especializados. Por ejemplo, se usan aldehidos para producir polímeros, resinas (por ejemplo, resina BAKELITE), colorantes, saborizantes, plastificantes, perfumes, productos farmacéuticos, y otros productos químicos, algunos de los cuales pueden usarse como disolventes, conservantes o desinfectantes. Además, determinados compuestos naturales y sintéticos, tales como vitaminas y hormonas, son aldehídos, y muchos azúcares contienen grupos aldehído. Los aldehídos grasos pueden convertirse en alcoholes grasos mediante reducción química o enzimática. Los alcoholes grasos también tienen múltiples usos comerciales. Las ventas anuales a nivel mundial de alcoholes grasos y sus derivados son superiores a mil millones de USD. Los alcoholes grasos de cadena más corta se usan en las industrias cosmética y alimentaria como emulsionantes, emolientes y espesantes. Debido a su naturaleza anfífila, los alcoholes grasos se comportan como tensioactivos no iónicos, que son útiles en productos para el cuidado personal y de uso doméstico, tales como, por ejemplo, detergentes. Además, se usan alcoholes grasos en ceras, gomas, resinas, pomadas y lociones farmacéuticas, aditivos de aceites lubricantes, agentes textiles antiestáticos y de acabado, plastificantes, cosméticos, disolventes industriales y disolventes para grasas.

La divulgación también proporciona una composición de tensioactivo o una composición de detergente que incluye un alcohol graso producido mediante cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. Un experto habitual en la técnica apreciará que, dependiendo del fin previsto de la composición de tensioactivo o detergente, pueden producirse y usarse diferentes alcoholes grasos. Por ejemplo, cuando los alcoholes grasos descritos en el presente documento se usan como materia prima para la producción de tensioactivos o detergentes, un experto habitual en la técnica apreciará que las características de la materia prima de alcohol graso afectarán a las características de la composición de tensioactivo o detergente producida. Así, las características de la composición de tensioactivo o detergente pueden seleccionarse para producir alcoholes grasos particulares para su uso como materia prima. Una composición de detergente y/o tensioactivo basado en alcohol graso descrita en el presente documento puede mezclarse con otros tensioactivos y/o detergentes bien conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, la mezcla puede incluir al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 15%, al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 60%, o un intervalo delimitado por dos cualesquiera de los valores anteriores, en peso del alcohol graso. En otros ejemplos, puede producirse una composición de tensioactivo o detergente que incluye al menos aproximadamente el 5%, al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 40%, al menos

aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70%, al menos

aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos

aproximadamente el 95%, o un intervalo delimitado por dos cualesquiera de los valores anteriores, en peso de un alcohol graso que incluye una cadena de carbonos que tiene 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ó 22 carbonos de longitud. Tales composiciones de tensioactivo o detergente también pueden incluir al menos un aditivo, tal como una microemulsión o un tensioactivo o un detergente de fuentes no microbianas tales como aceites vegetales o petróleo, que pueden estar presentes en la cantidad de al menos aproximadamente el 5%, al menos

aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 15%, al menos aproximadamente el 20%, al menos

aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 50%, al menos

aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos

aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, o un intervalo delimitado por dos cualesquiera de los valores anteriores, en peso del alcohol graso.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos específicos pretenden ilustrar la divulgación y no deben interpretarse como limitativos del alcance de las reivindicaciones.

Protocolos y métodos

Examen de una biblioteca

Todos los protocolos descritos en el presente documento se basan en un sistema de 2 ml de bloque maestro de placa de 96 pocillos (Greiner Bio-One, Monroe, NC o Corning, Ámsterdam, Países Bajos) para cultivos de crecimiento, y placas (Costar, Inc.) para extraer especies de ácido graso del caldo de cultivo. Los protocolos proporcionados a continuación son ejemplos de condiciones de fermentación. Pueden usarse protocolos alternativos para evaluar la producción de especies de ácido graso.

Protocolo de cultivo a 32°C (4NBT)

Se usaron 20 |il de cultivo LB (de un cultivo LB que se hizo crecer en una placa de 96 pocillos) para inocular 400 |il de medios 2NBT (tabla 2), lo que se incubó luego durante aproximadamente 16 horas con agitación a 32°C. Se usaron 20 |il de la simiente durante la noche para inocular 400 |il de 4NBT con nitrógeno o bien 1 o bien 2 g/l (NBT_1N o NBT_2N). Después de crecimiento a 32°C durante 6 horas, se indujeron los cultivos con IPTG (concentración final de 1 mM) (tabla 2). Entonces se incubaron los cultivos a 32°C con agitación durante 18 horas, después de lo cual se extrajeron siguiendo el protocolo de extracción convencional detallado a continuación.

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Tabla 2: Nombres y formulaciones de medios

Nombre de medio: Formulación

2NBT: 1 X 5x disol. salina con NH4Cl

1: g/l NH4Cl 100 g/l

1: mg/l Tiamina 10 mg/ml

1: mM MgSO4 1 M

0,1: mM CaCl2 1 M

20: g/l glucosa 500 g/l

1: X 1000x TM2

10: mg/l citrato de Fe 10 g/l

100: ig/ml espectinomicina100 mg/ml

100: mM BisTris 2 M (pH 7,0)

4NBT 1N: 1 X disol. salina con NH4O 5x

1: mg/l Tiamina 10 mg/ml

1: mM MgSO4 1 M

0,1: mM CaCl2 1 M

40: g/l glucosa 500 g/l

1: X 1000x TM2

10: mg/l citrato de Fe 10 g/l

100: ig/ml espectinomicina100 mg/ml

100: mM BisTris 2 M (pH 7,0)

4NBT_2N: 1 X 5x disol. salina con NH4Cl

1: g/l NH4Cl 100 g/l

1: mg/l Tiamina 10 mg/ml

1: mM MgSO4 1 M

0,1: mM CaCl2 1 M

40: g/l glucosa 500 g/l

1: X 1000x TM2

10: mg/l citrato de Fe 10 g/l

100: ig/ml espectinomicina100 mg/ml

100: mM BisTris 2 M (pH 7,0)

Protocolo de extracción convencional de especies de ácido graso

A cada pocillo que iba a extraerse, se le añadieron 40 |il de HCl 1 M, seguido por 300 |il de acetato de butilo (con 500 mg/l de C11-FAME como patrón interno). Entonces se termosellaron las placas de 96 pocillos usando un sellador de placas (calefactor ALPS-300; Abgene, ThermoScientific, Rockford, IL), y se agitaron durante 15 minutos a 2000 rpm usando el mezclador MIXMATE (Eppendorf, Hamburgo, Alemania). Después de la agitación, se centrifugaron las placas durante 10 minutos a 4500 rpm a temperatura ambiente (Allegra X-15R, rotor SX4750A, Beckman Coulter, Brea, CA) para separar las fases acuosa y orgánica. Se transfirieron 50 |il de la fase orgánica a una placa de 96 pocillos (polipropileno, Corning, Ámsterdam, Países Bajos), que posteriormente se termoselló y se almacenó a -20°C hasta que se evaluó mediante CG-FID usando el método FALC_Broth.met. Se llevó a cabo el método FALC_Broth.met de la siguiente manera: se inyectó 1 |il de muestra sobre una columna analítica (DB-1, 10 m x 180 |im x 0,2 |im de grosor de película, disponible de JW 121-101A) en un dispositivo Agilent 7890A CG Ultra (Agilent, Santa Clara, CA) con un detector de ionización de llama (FID). Se configuró el instrumento para detectar y cuantificar alcoholes grasos C6 a C18. El protocolo detallado anteriormente representa condiciones convencionales, que pueden modificarse según sea necesario para optimizar los resultados analíticos.

Especies de ácido graso - Protocolo de ensayo con rojo Nilo convencional

Después de 24 horas de fermentación, se realizó un ensayo con rojo Nilo añadiendo 70 |il de caldo de fermentación a 130 |il de rojo Nilo 1,54 |ig/ml en disolución del 84,6% de agua y el 15,4% de acetonitrilo para una concentración de ensayo final de rojo Nilo 1 |ig/ml en una placa Greiner MicrolonFluotrac 200, y se mezcló mediante aspiración y liberación con pipeta. Se midieron las unidades relativas de fluorescencia a excitación de 540 nm y emisión de 630 nm usando la unidad SpectraMax M2.

Construcción de bibliotecas de propensión a error

Se usaron técnicas convencionales que conocen los expertos en la técnica para preparar bibliotecas de propensión a error. En un ejemplo, se preparó la estructura principal de vector usando endonucleasas de restricción en el vector, mientras que se generó la creación de diversidad en el inserto de ADN mediante amplificación por PCR a partir de un molde de ADN en condiciones que favorecían la incorporación de nucleótidos de apareamiento incorrecto. En un enfoque, se realizó la clonación de la estructura principal de vector y un inserto de ADN usando el sistema de

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clonación INFUSION (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA), según el protocolo del fabricante. Construcción de bibliotecas de saturación

Se usaron técnicas convencionales que conocen los expertos en la técnica para preparar bibliotecas de saturación. En un ejemplo, se preparó la estructura principal de vector usando endonucleasas de restricción en el vector, mientras que se generó la creación de diversidad en el inserto de ADN usando cebadores degenerados. En un enfoque, se realizó la clonación de la estructura principal de vector y un inserto de ADN usando el sistema de clonación INFUSION (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA) según el protocolo del fabricante.

Construcción de bibliotecas de combinación

Se combinaron mutaciones identificadas como beneficiosas para proporcionar variantes de AAR con mejoras adicionales en la producción de especies de alcohol graso. Se usaron técnicas convencionales que conocen los expertos en la técnica para preparar las bibliotecas de combinación. En un ejemplo, se preparó la estructura principal de vector usando endonucleasas de restricción en el vector, mientras que se generó la creación de diversidad en el inserto de ADN usando cebadores para introducir las mutaciones deseadas. Tal como se describió anteriormente, en un enfoque, se realizó la clonación de la estructura principal de vector y un inserto de ADN usando el sistema de clonación INFUSION (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA), según el protocolo del fabricante. Pueden generarse bibliotecas de combinación usando el protocolo de PCR de transferencia (tPCR) (Erijman et al. (2011) J. Structural Bio.175:171-177).

Examen de bibliotecas

Una vez que se generó la diversidad de bibliotecas en una biblioteca de saturación o biblioteca de combinación, de propensión a error, se examinó usando uno de los métodos descritos anteriormente. Se identificaron dos tipos de coincidencias: (1) aumento de la cantidad de alcohol graso (título de FALC); y/o (2) aumento de la cantidad de FALC de cadena media tal como dodecanol (C12) o tetradecanol (C14). También se identificaron hexadecanol (C16) y octadecanol (C18). Se identificaron las mutaciones en las variantes de AAR dentro de cada coincidencia mediante secuenciación usando técnicas convencionales empleadas de manera rutinaria por los expertos en la técnica. Las tablas 4, 5 y 6 enumeran las mutaciones (coincidencias) identificadas como beneficiosas en bibliotecas de saturación y bibliotecas de combinación.

EJEMPLO 1: Producción mejorada de alcoholes grasos usando AAR_7942 mediante un aumento del flujo mediado por la proteína transportadora de acilo (ACP) a través de la ruta de síntesis de ácidos grasos

Cuando se expresan en E. coli enzimas de rutas terminales de fuentes distintas de E. coli como el huésped heterólogo para convertir las acil graso-ACP en productos, pueden existir limitaciones en el reconocimiento, la afinidad y/o el recambio de la enzima de ruta recombinante hacia las acil graso-ACP de E. coli. Aunque las proteínas ACP se conservan en cierta medida en todos los organismos, su secuencia primaria puede diferir incluso dentro de una especie dada. Para someter a prueba esta hipótesis, se clonaron los genes acp de varias cianobacterias en el sentido de 3' de la acil-ACP reductasa de Synechococcus elongatus PCC7942 (AAR_7942) presente en el plásmido pLS9-185, que es un derivado de pCL1920 (3-5 copias/célula). Además, se clonó el gen sfp (n.° de registro X63158; SEQ ID NO: 11) de Bacillus subtilis, que codifica para una fosfopanteteinil transferasa con amplia especificidad de sustrato, en el sentido de 3' de los genes acp respectivos. Esta enzima está implicada en la conversión de la apo- ACP inactiva en la holo-ACP activa. Los plásmidos construidos se describen en la tabla 3.

Tabla 3: Plásmidos que coexpresan ACP de cianobacterias con y sin sfpc de B. subtilis en el sentido de 3' con respecto a AAR de S. elongatus PCC7942

Plásmido base: Fuente de ACP ACP - SEQ ID N.° (NA/AA*) Sin sfp Con sfp

pLS9-185: Synechococcus elongatus 7942 7/8 pDS168 pDS168S

pLS9-185: Synechocystis sp. 6803 3/4 pDS169 no disponible

pLS9-185: Prochlorococcus marinus MED4 5/6 pDS170 SDS170S

pLS9-185: Nostoc punctiforme 73102 1/2 pDS171 pDS171S

pLS9-185: Nostoc sp. 7120 9/10 pDS172 pDS172S

*NA = secuencia de ácido nucleico; AA = secuencia de aminoácidos/secuencia de polipéptido

Se clonaron todos los genes acp con un RBS sintético en el sitio EcoRI inmediatamente en el sentido de 3' del gen aar en pLS9-185 usando la tecnología INFUSION. Se reconstruyó el sitio EcoRI en el sentido de 3' del gene acp. De manera similar, se clonó mediante la tecnología INFUSION el gen sfp de B. subtilis en este sitio EcoRI junto con un con RBS sintético. Se transformaron todos los plásmidos en MG1655 DV2 de E. coli. El control durante estos experimentos fue la expresión de AAR sola (pLS9-185).

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Los resultados de experimentos de fermentación en matraz de agitación convencionales se muestran en la figura 5. Se observaron mejoras significativas en los títulos de alcoholes grasos en cepas que contenían los plásmidos pDS171S, pDS172S, pDS168 y pDS169, demostrando que la sobreexpresión de ACP puede ser beneficiosa durante la producción de alcoholes grasos. Aunque no desea limitarse por la teoría, se plantea la hipótesis de que la sobreexpresión de ACP puede ser beneficiosa durante la producción de alcoholes grasos ayudando en el reconocimiento, la afinidad y/o el recambio de acil-ACP mediante la enzima de la ruta terminal heteróloga (véase la tabla 3 (anteriormente) para la fuente de las ACP y la presencia o ausencia de sfp.)

EJEMPLO 2: Producción mejorada de alcoholes grasos usando AAR_7942 mediante el aumento del flujo mediado por acetil-CoA carboxilasa (ACC) a través de la síntesis de ácidos grasos

Los principales precursores durante la biosíntesis de ácidos grasos son malonil-CoA y acetil-CoA. Se ha sugerido que estos precursores limitan la tasa de la biosíntesis de ácidos grasos en E. coli. En este ejemplo, se expresó un operón sintético de acetil-CoA carboxilasa, acc [accDCAB+birA de Corynebacterium glutamicum; SEQ ID NO: 45 ó 46, 48 y 50 también denominado D+] junto a acil-ACP reductasa (aAr) de Synechococcus elongatus PCC7942 (AAR_7942). Se clonó el operón accD+ en el sentido de 3' del gen de AAR_7942 en el plásmido pLS9-185. Se transformaron el plásmido resultante y el plásmido de control pLS9-185 en DV2 de E. coli. Se evaluaron las cepas durante la producción de alcoholes grasos en un protocolo en matraz de agitación convencional. Tal como se muestra en la figura 6, la coexpresión del operón acc sintético de Corynebacterium glutamicum condujo al aumento de la producción de alcoholes grasos.

EJEMPLO 3: Biblioteca de propensión a error, bibliotecas de combinación y de saturación limitada preparadas usando AAR_7942 como molde

A. Biblioteca de propensión a error

Se construyó una biblioteca de propensión a error de la acil-ACP reductasa de Synechococcus elongatus PCC7942 (AAR_7942) y se examinó para detectar variantes que mostrasen mejoras con respecto a la AAR_7942 silvestre. El plásmido usado para producir la biblioteca de propensión a error se designó como “pDS171S” (véase la tabla 3). Se examinó la biblioteca de propensión a error usando uno de los protocolos convencionales descritos anteriormente. Las mejoras se clasificaron como o bien que mejoran el título o bien que aumentan la fracción de alcoholes grasos C10-C14 producidos sin afectar significativamente al título (resultados no mostrados).

B. Bibliotecas de combinación y de saturación limitada

Se usaron técnicas convencionales que conocen los expertos en la técnica para preparar bibliotecas de combinación y bibliotecas de saturación basándose en las posiciones 17, 18 y 19. Las mutaciones sometidas a prueba en las bibliotecas de combinación y bibliotecas de saturación (tablas 4A y 4B) se identificaron originariamente en la biblioteca de propensión a error de AAR_7942 descrita anteriormente. Los plásmidos, las cepas y los protocolos de examen usados fueron los mismos descritos en el ejemplo 1. Los resultados del examen de la biblioteca de propensión a error se muestran en las tablas 4A y 4B. La tabla 4A muestra mutaciones de AAR_7942 que condujeron a un aumento de los títulos de alcoholes grasos y la tabla 4B muestra mutaciones que condujeron a un aumento de la fracción de alcohol graso C14 sin afectar significativamente al título global de alcoholes grasos.

Tabla 4A: Mutaciones de bibliotecas de combinación y de saturación limitada de AAR_7942 correlacionadas con un título mejorado de alcoholes grasos

Mutaciones: Combinación de bibliotecas a

Título de FALC (total*): FALC C14 (% de fracción) FALC normalizado (% con respecto al control) C14 normalizado (% con respecto al control)

S18T, C63Y, S96T, L177H, A281V: 2473 48% 251% 294%

S18T, C63Y, S96T, L177H, A281V E284K: 2202 50% 200% 229%

S18T, C63Y, S96T, L177H: 2088 43% 189% 197%

S18T, C63Y: 1798 39% 182% 241%

C63H, S967T, L177H, A281V: 2045 53% 180% 237%

S18T, C63Y, A281V, E283K: 1696 45% 172% 278%

S18T, C63Y: 1640 43% 166% 260%

S18T, L177H, A281V, E283K: 1618 44% 164% 270%

S18T, L177H, A281V, E283K: 1617 43% 164% 264%

S18T, S96T, L177H, E283K: 1814 43% 160% 194%

S18T, C63H, L177H: 1811 39% 160% 173%

S18T, L177H, A281V, E283K: 1503 39% 152% 237%

L65F, S96T, A281V, E283K: 1638 43% 144% 191%

C63Y, A281V, A282T: 1622 38% 143% 168%

L11F, C63Y, S96T, L177H, A281V: 1579 41% 143% 186%

A282T, E283K

L65F, S96T, L177H, A281V, E283K: 1585 42% 140% 189%

G22S, C63H, S96T, L177H, E283K: 1229 39% 125% 237%

C63H, L65F, S96T, A281V: 1178 41% 119% 252%

S18T, L65F, S96T, L177H, A281V: 1136 33% 115% 203%

C63R, L177H, A281V, E283K: 1275 44% 112% 196%

Bibliotecas de saturación

Mutaciones: Título de FALC (total*) FALC C14 (% de fracción) FALC normalizado (% con respecto al control) C14 normalizado (% con respecto al control)

S18M: 2809 40% 243% 212%

S18F: 2564 54% 222% 285%

S18Y: 2550 45% 221% 236%

S18W: 2530 55% 227% 314%

S18M: 2495 41% 224% 231%

S18Y: 2039 44% 188% 252%

S18Y: 1997 44% 179% 251%

S18T: 1729 31% 155% 177%

S18T: 1690 31% 152% 176%

S18T: 1683 31% 151% 176%

S18T: 1599 30% 143% 172%

S18L: 1568 48% 141% 271%

S18C: 1381 28% 120% 149%

S18C: 1372 26% 123% 147%

S18C: 1368 28% 118% 148%

S18L: 1359 47% 122% 266%

S18C: 1355 26% 121% 148%

S18V: 1344 30% 121% 170%

S18C: 1340 26% 120% 147%

S18L: 1326 47% 119% 268%

S18L: 1315 47% 118% 266%

S18C: 1313 26% 118% 149%

S18V: 1306 30% 121% 170%

S18C: 1305 26% 117% 148%

S18L: 1302 47% 117% 267%

V17L: 1188 23% 110% 130%

V17L: 1185 33% 103% 173%

V17L: 1175 32% 102% 171%

: Combinación de bibliotecas 3

S18W, S96T, E283K, R286Q, A324V: 3437 49% 246% 255%

S18W: 3286 53% 235% 275%

S18W, S96T, E283K: 3199 46% 229% 237%

S18W, C63Y, S96T: 3186 46% 228% 241%

S18W, C68Y, E2834K: 2949 50% 211% 260%

C63Y, E283K: 2680 36% 192% 189%

S18W, C63Y: 2675 54% 191% 280%

C63Y, S96T: 2583 38% 185% 196%

C63Y,E283K, Q316K: 2420 36% 173% 188%

S96T: 1605 23% 115% 121%

E283K: 1532 25% 110% 131%

Tabla 4B: Mutaciones de bibliotecas de combinación y de saturación limitada de AAR_7942 correlacionadas con un aumento de la fracción de alcohol graso C14

: Combinación de bibliotecas a

C63H, S96T, L177H, A281V: 2045,36 53% 180% 237%

G22S, C63H, F64V, S96T, L177H A281V: 152,47 51% 14% 233%

S18T, C63H, S96T, L177H, A281V E283K: 2202,46 50% 200% 229%

S18T, C63Y, S96T, L177H, A281V: 2472,80 48% 251% 294%

S18T, C63Y, A281V, E283K: 1695,59 45% 172% 278%

S18T, L177H, A281V, E283K: 1618,20 44% 164% 270%

C63R, L177H, A281V, E283K: 1275,38 44% 112% 196%

S18T, C63H, L65F, S96T, L177F A281V, E283K: 912,50 44% 83% 199%

S18T, S96T, L177H, E283K: 1814,34 43% 160% 194%

S18T, L179H, A281V, E283K: 1616,51 43% 164% 264%

S18T, C63H, S96T, L177H: 2088,12 43% 189% 197%

L65F, S96T, A281V, E283K: 1638,28 43% 144% 191%

C63H, L65F, A281V, E283K: 632,66 43% 56% 190%

S18T, C63Y: 1640,33 43% 166% 260%

L65F, S96T, L177H, A281V, E283K: 1585,32 42% 140% 189%

C63Y, L65F, L177H: 639,46 41% 56% 184%

C63H, L65F, S96T, A281V: 1177,76 41% 119% 252%

L11F, C63Y, S96T, L177H, A281V A282T, E283K: 1578,54 41% 143% 186%

S18T, C63Y: 1797,99 39% 182% 241%

S18T, L178H, A282V, E284K: 1502,59 39% 152% 237%

G23S, C63H, S96T, L177H, E283K: 1229,34 39% 125% 237%

S18T, C63H, L177H: 1811,40 39% 160% 173%

C63Y, A281V, A282T: 1622,23 38% 143% 168%

S18T, C63Y, L65F, S96T, L177H A281V, E283K, M284I: 454,42 35% 41% 162%

S18T, L65F, S96T, L177H, A281V: 1135,95 33% 115% 203%

L65F, L178H, G180S, E283K: 151,40 33% 13% 146%

L66F, L177H, G180S, E283K: 143,83 31% 13% 138%

S18T, C63H, L65F, L177H: 103,21 30% 9% 133%

: Bibliotecas de saturación

S18W: 2530 55% 227% 314%

S18F: 2564 54% 222% 285%

V17N: 571 49% 49% 260%

S18L: 1568 48% 141% 271%

S18L: 1024 47% 92% 268%

S18L: 1326 47% 119% 268%

S18L: 1302 47% 117% 267%

S18L: 1106 47% 99% 267%

S18L: 1315 47% 118% 266%

S18L: 1359 47% 122% 266%

S18Y: 2550 45% 221% 236%

S18Y: 2039 44% 188% 252%

S18Y: 1997 44% 179% 251%

S18M: 2495 41% 224% 231%

S18M: 2809 40% 243% 212%

V17L: 1127 33% 97% 175%

V17L: 1185 33% 103% 173%

V17L: 1091 32% 94% 171%

V17L: 1175 32% 102% 171%

S18T: 1729 31% 155% 177%

S18T: 1690 31% 152% 176%

S18T: 1683 31% 151% 176%

S18T: 1599 30% 143% 172%

S18V: 1344 30% 121% 170%

S18V: 1306 30% 121% 170%

S18V: 1015 30% 91% 169%

S18C: 1381 28% 120% 149%

S18C: 1368 28% 118% 148%

R19H, R58S: 873 27% 81% 152%

V17C: 927 27% 80% 140%

V17C: 882 26% 76% 139%

S18C: 1313 26% 118% 149%

S18C: 1355 26% 121% 148%

S18C: 1305 26% 117% 148%

S18C: 1372 26% 123% 147%

S18C: 1340 26% 120% 147%

V17W: 849 25% 73% 134%

V17W: 815 25% 71% 133%

V17W: 831 25% 72% 132%

V17W: 840 25% 73% 131%

R19V: 844 24% 78% 139%

R19V: 813 24% 75% 136%

R19V: 821 24% 76% 135%

R19V: 862 24% 80% 135%

R19V: 814 24% 75% 135%

R19K, V117L: 1188 23% 110% 130%

R19S: 803 22% 74% 128%

R19T: 735 22% 68% 127%

R19S: 783 22% 72% 127%

R19S: 764 22% 75% 129%

R19I: 862 22% 80% 123%

R19A: 901 21% 83% 122%

R19A: 705 21% 65% 119%

R19M: 937 20% 86% 114%

: Combinación de bibliotecas 3

S18W: 3184 57% 228% 296%

S18W, C63Y: 2675 54% 191% 280%

S18W, C63Y, S95T: 2832 54% 203% 279%

S18W, S96T, E283K: 2874 54% 206% 278%

S18W, C63Y, E283K: 2915 51% 209% 263%

S18W, S96T, E283K, R286Q, A324V: 3437 49% 246% 255%

C63Y, S96T: 2583 38% 185% 196%

C63Y, E283K: 2176 38% 156% 195%

C63Y, E283K, Q316K: 2420 36% 173% 188%

E283K: 1474 25% 105% 132%

S96T: 1605 23% 115% 121%

: Combinación de bibliotecas 3

S18W: 2853 217% 51% 274%

Y23N: 954 72% 35% 191%

Y23N, Q238H: 892 68% 35% 190%

G150D, I274N: 766 62% 30% 162%

I274N: 1359 107% 29% 161%

I274N, A285V: 1317 103% 28% 155%

P38T, I274N, A285V: 587 46% 26% 143%

Q238H, M291V: 1383 109% 22% 119%

M291V: 1618 123% 22% 118%

G151D, M291V: 1302 105% 21% 114%

T135M, M291V: 1265 100% 18% 101%

EJEMPLO 4: Biblioteca de saturación preparada usando AAR (S18W) como molde

Se construyó una biblioteca de saturación completa de una variante de acil-ACP reductasa de Synechococcus elongatus PCC7942 (“'AAR(S18W)_7942”), y se examinó para detectar variantes que mostrasen mejoras con

respecto a AAR (S18W), identificada como variante de AAR significativamente mejorada en la primera tanda de examen (ejemplos 2 y 3). Los criterios de selección fueron un aumento en el título de FALC o un aumento en el tanto por ciento de fracción de C12. Los esfuerzos de modificación por ingeniería se centraron en mitigar la dependencia de AAR de la sobreexpresión de ACP con el fin de producir altos títulos. Aunque no desea limitarse por la teoría, se 5 planteó la hipótesis de que la ventaja observada en cepas que sobreexpresan ACP resultaba de una mayor

concentración de productos intermedios de biosíntesis de ácidos grasos disponibles durante la escisión por AAR. Mediante el examen de bibliotecas de saturación y de combinación construidas con AAR en una cepa que carecía de sobreexpresión de ACP (que tenía una menor concentración de productos intermedios de Fas), pudieron seleccionarse variantes con mayores afinidades por los productos intermedios de FAS.

10 El plásmido que se usó para producir la biblioteca de saturación completa se designó como pAAR-1. Es un derivado de pLS9-185 que alberga el gen de AAR que codifica para la variante (S18W) seguido por el gen de aldehído reductasa, AlrA, de Acinetobacter baylyi (sEq ID NO: 54). Se añadió AlrA para reducir totalmente los productos intermedios de aldehído graso generados por AAR y no reducidos totalmente por las aldehído graso endógenas de E. coli. Se examinó la biblioteca de saturación completa en la cepa Shu.002. La cepa Shu.002 es DV2 PT5-ifab138

15 PT5_ifadR (tabla 7, más adelante). Para ifab138 véase SEQ ID NO: 55 en la tabla 10. Se examinaron las bibliotecas

usando uno de los protocolos convencionales descritos anteriormente. Las mejoras se clasificaron como o bien que mejoran el título o bien que aumentan la fracción de alcoholes grasos C12 producidos por la acil-ACP reductasa sin afectar significativamente al título. Los resultados del examen de bibliotecas de saturación se muestran en la tabla 5 a continuación.

20 Tabla 5: Mutaciones de una biblioteca de saturación completa de AAR (S18W) 7942 correlacionadas con un aumento del título de alcoholes grasos y/o un aumento de la fracción de alcoholes grasos C12

Mutaciones de ARR: Título de FALC C12

(además de S18W): Total* FIOC** Fracción* FIOC**

T148V: 747 1,21 7,9% 0,99

A159V: 702 1,14 7,0% 0,87

T157V: 674 1,10 7,2% 0,90

A135S: 803 1,31 7,8% 0,98

A328S: 712 1,16 8,1% 1,02

Q191A: 780 1,27 7,7% 0,96

A285V, M291V: 837 1,36 8,0% 1,00

Q277V: 854 1,39 7,9% 0,99

Q155C: 626 1,02 8,3% 1,04

E210Y: 676 1,10 8,5% 1,06

T120S: 623 1,01 8,1% 1,02

T236C: 691 1,12 7,6% 0,95

Q335N: 763 1,24 6,8% 0,86

C172L: 700 1,14 7,7% 0,97

E283S: 858 1,39 8,0% 1,00

L209R: 837 1,36 7,6% 0,96

I153P: 606 0,99 8,0% 1,00

A211W: 797 1,30 6,9% 0,86

A324T: 909 1,48 4,0% 0,50

W34F: 817 1,22 7,5% 0,98

T187V: 825 1,23 6,9% 0,91

D24E: 737 1,10 7,1% 0,93

T188H: 862 1,29 8,6% 1,13

V18A: 798 1,19 6,4% 0,84

V18A, L338W: 732 1,27 7,6% 0,97

T188V: 775 1,34 7,4% 0,95

I168V: 731 1,27 8,1% 1,03

W35F: 666 1,15 7,5% 0,96

T148V: 836 1,45 6,2% 0,80

Q155L: 740 1,28 8,5% 1,08

T148C: 731 1,26 8,6% 1,10

T148E: 694 1,20 8,3% 1,06

A50Q, L337V: 800 1,38 7,2% 0,92

R118Q: 724 1,25 7,3% 0,94

L31V: 901 1,56 6,8% 0,87

A135S: 775 1,34 8,7% 1,12

D24Y: 890 0,93 19,1% 2,05

C63A: 895 0,94 16,1% 1,73

S113K: 812 0,85 13,3% 1,43

L31V: 645 0,68 15,7% 1,69

E283G: 917 0,96 14,3% 1,54

A112R: 918 0,96 10,7% 1,15

D43E: 1002 1,05 13,0% 1,39

Q116G: 894 0,94 14,0% 1,50

S86G: 849 0,89 13,4% 1,44

* Promedio de 4 réplicas

** FIOC = veces de aumento con respecto al control AAR (S18W)

Ejemplo 5: Bibliotecas de combinación preparadas usando AAR (S18W) como molde

Se usaron técnicas convencionales que conocen los expertos en la técnica para preparar bibliotecas de 5 combinación. Las mutaciones sometidas a prueba en bibliotecas de combinación (tablas 6A, 6B y 6C) se identificaron originariamente en la biblioteca de saturación completa (ejemplo 4). Se construyeron las bibliotecas de combinación en el mismo plásmido y se examinaron en la misma cepa tal como se describe en el ejemplo 3. Se examinaron las bibliotecas usando uno de los protocolos convencionales descritos anteriormente. Las mejoras se clasificaron como o bien que mejoran el título o bien que aumentan la fracción de alcoholes grasos C12 producidos 10 por la acil-ACP reductasa sin afectar significativamente al título. Los resultados del examen de bibliotecas de combinación de AAR se muestran en las tablas 6A, 6B y 6C a continuación.

Tabla 6A: Mutaciones de la 1a biblioteca de combinación de AAR(S18W)_7942 correlacionadas con un aumento del título de alcoholes grasos

Mutaciones de ARR (además de S18W): Título* de FALC C12

mg/l* FIOC**: Fracción* FIOC**

A281L: 1478 1,29 14,1% 1,11

A281Y: 1527 1,28 12,1% 0,96

T154A, A281L: 1550 1,28 14,3% 1,13

T154A, A281Y: 1384 1,19 13,3% 1,05

C63G, A281F: 1472 1,24 12,9% 1,02

C63G, A281L: 1432 1,19 18,2% 1,44

N83G, A281Y: 1428 1,23 10,7% 0,84

C63G, A281Y: 1419 1,21 15,6% 1,24

S10G, A281L: 1419 1,20 12,6% 1,00

S113K, Q155G: 1305 1,15 12,3% 0,97

D43E, A50Q, A281L: 1517 1,32 9,1% 0,72

M21L, N83G, A281Y: 1513 1,29 10,2% 0,81

M21L, S113K, A281L: 1392 1,20 20,4% 1,61

C63G, T154A, A281F: 1369 1,24 12,4% 0,98

C63G, N83G, A281Y: 1330 1,32 14,6% 1,16

Q155G, A281L, E283G: 1327 1,16 22,2% 1,76

A50Q, C63G, A281F: 1286 1,15 17,9% 1,41

S18W, D43E, A50Q, A281L: 1635 1,32 9,4% 0,77

M21L, C63G, S113K, T154A A281L: 1518 1,24 28,3% 2,23

M21L, L31V, N83G, Q116G A281L: 1353 1,18 15,3% 1,21

* Promedio de 4 réplicas

15 ** FIOC = veces de aumento con respecto al control (S18W)

Tabla 6B: Mutaciones de la 2a biblioteca de combinación de AAR(S18W)_7942 correlacionadas con un aumento del título de alcoholes grasos

Mutaciones de ARR (además de S18W): Título de FALC* C12

mg/l* FIOC**: Fracción* FIOC**

S18W (control): 1034 1,00 10,0% 1,00

M21L, C63G, S113K, T154A, A281L: 1179 1,14 29,4% 2,94

D16L, M21L, C63G, S113K, T154A, A281L: 1221 1,18 19,4% 1,94

L8A, D24V,C63G,S113K,Q155L, A281L: 1414 1,37 10,4% 1,04

L8A, M21L, C63G, A77A***, S113K,: 1310 1,27 14,2% 1,42

T154A A281L

D24P, L31M, C63G, S113K, T154A, A281L: 1437 1,39 13,0% 1,30

L8A, D16L, D24V, C63G, S113K, T154A A281L: 1342 1,30 12,0% 1,20

D24E, C63G, S113K, T154A, A281L: 1425 1,38 14,3% 1,43

* Promedio de 4 réplicas

** FIOC = veces de aumento con respecto al control (S18W)

*** La mutación A77A es una mutación de codón silenciosa de gcc a gca

Tabla 6C: Mutaciones de las bibliotecas de combinación de AAR (S18W)_7942 correlacionadas con un aumento de 5 la fracción de alcoholes grasos C12

Mutaciones de AAR: C12 Título de FALC*

(además de S18W): Fracción* FIOC** FIOC**

S18W (control): 11,0% 1,00 1,00

M21L, C63G, S113K, T154A, A281L: 28,3% 2,57 1,24

M21L, Q155G, A281L: 24,8% 2,25 1,10

Q155G, A281L, E283G: 22,2% 2,02 1,16

M21L, S113K, A281L: 20,4% 1,85 1,20

C63G, A281L: 18,1% 1,65 1,18

A50Q, C63G, A281F: 17,9% 1,63 1,15

C63G: 17,7% 1,61 1,00

S10G, C63G, Q155G, S253N, A281F: 16,1% 1,46 1,03

D43E, C63G, S113K, A281L: 16,0% 1,46 0,98

A281L: 15,6% 1,42 1,20

M21L, L31V, N83G, Q116G, A281L: 15,3% 1,39 1,18

C63G, N83G, A281Y: 14,6% 1,33 1,32

A281L: 14,1% 1,28 1,29

* Promedio de 4 réplicas

** FIOC = veces de aumento con respecto al control (S18W)

Ejemplo 6: Aumento del flujo a través de la ruta de síntesis de ácidos grasos - producción de alcoholes grasos mediada por iFab e iFadR usando AAR

10 En este ejemplo, se mostró la producción mejorada de alcoholes grasos usando AAR aumentando el flujo a través de la ruta de biosíntesis de ácidos grasos mediada por la sobreexpresión de un operón sintético que comprende varias proteínas FAB (ifab138) y/o la sobreexpresión de la proteína FadR (ifad), un regulador del metabolismo de ácidos grasos. iFAB 138 (SEQ ID NO:55) incluye, en el siguiente orden, los genes fabV de Vibrio cholerae, FabH, fabD, fabG y fabA de Salmonella typhimurium, y FabF de Clostridium acetobutilicum, y se integra como operón 15 sintético controlado por el promotor o bien PlacUV5 o bien PT5. iFadR incluye el gen fadR de Escherichia coli (SEQ ID NO:56) controlado por el promotor T5. Los componentes presentes en las cepas de E. coli evaluadas en este ejemplo se muestran en la tabla 7, a continuación.

Tabla 7: Cepas de E. coli con iFAB138 o fadR

Componentes: DV2 BD061 BD064 Shu002

i(PlacUV5-fab138): - + + -

i(PTS-fab138): - - - +

i(PT5-fadR): - - + +

Se expresó AAR (S18W) a partir del plásmido pDS311, una variante de plásmido pDS171S, en la que el codón 18 20 de AAR especificaba un triptófano en vez de una serina (pCL-AAR(S18W)+ACP-sfp) y se clonó el gen de aldehído reductasa, alrA, de Acinetobacter baylyi (SEQ ID NO: 54) en el sentido de 3' del gen sfp de B. subtilis. Se transformó pDS311 en las cepas DV2, BD061, BD064 y Shu002. Se evaluaron las cepas en el protocolo 4NBT_2N (véase anteriormente). Tal como se muestra en la figura 7, la producción de alcoholes grasos aumentó significativamente como resultado de la presencia de ifab138 e ifadR, mostrando la cepa Shu002 el mayor título de alcoholes grasos.

25 Ejemplo 7: Variantes de AAR mejoradas en una cepa con aumento del flujo a través de la ruta de síntesis de ácidos grasos

En este ejemplo, se demostró la producción mejorada de alcoholes grasos en células huésped recombinantes transformadas con variantes de AAR de bibliotecas de combinación en Shu2, una cepa de E. coli con aumento del flujo a través de la ruta de biosíntesis de ácidos grasos mediada por la sobreexpresión de ifab138 y la

5

10

15

20

25

30

35

40

sobreexpresión de la proteína FadR (véase antes). Se evaluaron cuatro variantes de AAR de la segunda biblioteca de combinación (tabla 6B). Estas variantes albergan las siguientes mutaciones: Com2a: S18W, D24P, L31M, C63G, S113K, T154A, A281L; Comb2b: S18W, D16L, M21L, C63G, S113K, T154A, A281L; Com2c: S18W, L8A, M21L, C63G, A77A, S113K, T154A, A281L; Com2d: D24E, C63G, S113K, T154A, A281L (véase también la figura 8). Se clonaron estas variantes en la estructura principal del plásmido pJL104. Se creó pJL104 clonando el operón sintético accD+ de C. glutamicum (tal como se describe en el ejemplo 2, véase antes) en el sentido de 3' del gen alrA en pDS311. Se transformaron los plásmidos resultantes en la cepa Shu002 y se evaluaron las cepas en el protocolo 4NBT_1N (véase antes). Tal como se muestra en la figura 8, se observó una producción elevada de alcoholes grasos en todas las cepas. La cepa BD064 que alberga el plásmido pDS311, que expresa la variante de S18W de AAR_7942, también se evaluó en fermentaciones en tanque. La cepa produjo alcoholes grasos con un título máximo de 42 g/l, un rendimiento del 12,6% (con respecto a glucosa) y una productividad de 0,62 g/l/h tal como se muestra en la figura 9. La distribución de longitud de cadena de los alcoholes grasos fue de la siguiente manera: el 1,2% de Ce, el 7,7% de C10, el 26,9% de C12, el 44,7% de C14, el 16,0% de C16 y el 1,9% de C18. La fracción de alcoholes grasos saturados e insaturados fue del 72,6% y el 27,4%, respectivamente.

Ejemplo 8: Aumento de la actividad de acil aldehido reductasa (AAR) de MED4 y redistribución de la selectividad de longitud de cadena para la producción de alcoholes grasos C14

AAR es uno de los componentes esenciales para la biosíntesis de alcanos de cianobacterias, otro componente esencial es una aldehido descarbonilasa (ADC). Los inventores descubrieron que la MED4_AAR de Prochlorococcus marinus es inactiva catalíticamente sin la presencia de MED4_ADC, es decir, cuando sólo se expresa MED4_AAR en E. coli no se detectan productos, y cuando se coexpresan MED4_AAR y ADC en E. coli los únicos productos detectados son alcanos. Los inventores también descubrieron que cuando se coexpresa MED4_AAR en E. coli con una variante de MED4_ADC aparentemente inactiva catalíticamente en la que se reemplaza la histidina 156 por arginina (denominada posteriormente MED4_ADC (H165R)), se detectan alcoholes grasos, y no alcanos (véase la figura 10). Se concluyó a partir de estos datos que MED4_AAR requiere la interacción física con MED4_ADC para ser activa catalíticamente. Los inventores usaron este sistema para identificar variantes de MED4_ AAR con aumento de la actividad y/o alteración de la especificidad de sustrato para fines de producción de FALC.

Se expresó MED4_ADC(H156R) junto con una biblioteca de saturación completa de MED4_AAR. Se preparó la biblioteca de saturación de MED4_AAR en un derivado del plásmido pCL1920 (pLS9-195) y se introdujo en una cepa de producción que portaba el plásmido pGLAK-043 (que es el plásmido pACYC-Ptrc-MED4_ADC que alberga la mutación H156R en el gen de ADC). Se indujeron los clones y se seleccionaron variantes de AAR basándose en la producción de más alcohol graso que la enzima AAR silvestre o la capacidad para producir alcoholes grasos con un perfil alterado de longitud de cadena, por ejemplo, un aumento de la fracción de alcohol graso C14. Entonces volvieron a someterse a prueba clones seleccionados en una tanda de validación. Se hicieron crecer de nuevo todas las variantes que mostraron títulos constantes de FALC entre las fermentaciones primaria y secundaria, se aisló el ADN de plásmido, se secuenció y se introdujo de nuevo en la cepa de producción parental para pruebas adicionales. Entonces se sometieron estos nuevos transformantes a otra fermentación confirmatoria y análisis. La tabla 8 a continuación muestra datos representativos de 16 variantes de AAR que produjeron los mayores títulos de FALC (ordenadas de arriba abajo en actividad decreciente). Las variantes oscilaron entre 1,4 veces y 2,2 veces con respecto a la silvestre. Estas variantes mostraron la capacidad para aumentar la actividad de MED4_AAR usando técnicas de evolución dirigida y forman además la base para mejoras adicionales.

Tabla 8: Productividad de FALC de mutantes de MED4_AAR con relación a MED4_AAR silvestre (WT)

Mutación de AAR: Veces de aumento de FALC con respecto a silvestre

V346P: 2,2

Q40V: 2,2

A345R: 2,1

L344S: 2,1

D61E: 2,1

V346G: 2,0

L344D: 1,9

G52V: 1,9

A345*: 1,9

L344T: 1,8

K303G: 1,8

L344A: 1,8

H340P: 1,6

S588V: 1,5

K339L: 1,4

G273E: 1,4

* Variante truncada a la que le faltan los dos últimos aminoácidos.

También se exploró el conjunto de datos para detectar variantes de AAR que presentaban perfiles alterados de longitud de cadena. La especie más común producida por la AAR silvestre tiene una longitud de cadena de C16. Un aumento de la proporción de especies FALC con longitudes de cadena más cortas que C16 es de interés. Se identificaron dos clones variantes que mostraron un aumento de aproximadamente 3 veces en la cantidad de FALC 5 C14 (figura 10). La secuenciación de estos clones reveló que eran mutantes D61E idénticos con la misma secuencia de codones de nucleótidos. Se introdujo de nuevo el ADN de plásmido para la variante de D61E en la cepa parental que contiene H156R ADC. Los resultados muestran que la expresión de la variante de D61E de AAR en una célula huésped recombinante desvía la distribución de longitud de cadena de especies FALC hacia cadenas de carbonos más cortas. La tabla 9 a continuación ilustra la distribución de longitud de cadena de FALC producida por células 10 huésped recombinantes que expresan la variante de D61E de MED4_AAR en comparación con MED4_AAR silvestre (WT) y la variante de V346P de MED4_AAR que no produjo ningún producto con longitudes de cadena alteradas.

Tabla 9: Distribución de longitud de cadena para variantes de AAR y AAR silvestre

MED4 AAR/ADC: Alcohol graso % de C14 % de C16 % de C18

AAR WT/ADC(H156R): 6 92 2

AAR(D61E)/ADC(H156R): 14* 85 0

AAR(V346P)/ADC(H156R): 4 92 4

AAR WT/ADC WT: ND ND ND

AAR(D61E)/ADC: ND ND ND

AAR(V346P)/ADC WT: ND ND ND

ND = no detectado

15 * 1% de varianza atribuible a desviaciones debidas al promediado

Estas variantes pueden además recombinarse y examinarse para detectar mejoras en el fondo de MED4_ADC (H156R). La variante de MED4_AAR (D61E) y progenie mutada adicional pueden ser útiles para disminuir la longitud de cadena promedio tanto de alcoholes grasos como de alcanos. La variante de MED4_AAR (D61E) demuestra que la especificidad de longitud de cadena de MED4_AAR es moldeable y presenta la posibilidad para una mejora 20 adicional de esta actividad a través de esfuerzos de modificación por ingeniería de proteínas adicionales. Se secuenciaron todas las variantes descritas a partir de la progenie de pLS9-195 y contenían mutaciones de codones correspondientes a las sustituciones de aminoácidos enumeradas.

Tabla 10: Nombres relacionados con la lista de secuencias

SEQ ID NO: Tipo Nombre

1: sec. de ácido nucleico PCC 73102 acp de Nostoc punctiforme N.° de registro YP 001867863

2: sec. de aminoácidos PCC 73102 acp de Nostoc punctiforme N.° de registro YP 001867863

3: sec. de ácido nucleico PCC 6803 acp de Synechocystis sp. N.° de registro NP 440632.1

4: sec. de aminoácidos PCC 6803 acp de Synechocystis sp. N.° de registro NP 440632.1

5: sec. de ácido nucleico CCMP1986 acp de Prochlorococcus marinus subsp. pastoris str. N.° de registro NP 893725.1

6: sec. de aminoácidos CCMP1986 acp de Prochlorococcus marinus subsp. pastoris str. N.° de registro NP 893725.1

7: sec. de ácido nucleico PCC 7942 acp de Synechococcus elongatus N.° de registro YP 399555

8: sec. de aminoácidos PCC 7942 acp de Synechococcus elongatus N.° de registro YP 399555

9: sec. de ácido nucleico PCC 7120 acp de Nostoc sp. N.° de registro NP 487382.1

10: sec. de aminoácidos PCC 7120 acp de Nostoc sp. N.° de registro NP 487382.1

11: sec. de ácido nucleico sfp de B. subtilis (sintetizado) como en n.° de registro X63158.1

12: sec. de aminoácidos sfp de B. subtilis (sintetizado) como en n.° de registro X63158.1

13: sec. de cebador 168IFF

14: sec. de cebador 168IFR

15: sec. de cebador 169IFF

16: sec. de cebador 169IFR

17: sec. de cebador 170IFF

18: sec. de cebador 170IFR

19: sec. de cebador 171IFF

20: sec. de cebador 171IFR

21: sec. de cebador 172IFF

22: sec. de cebador 172IFR

23: sec. de cebador 168SIFF

Claims

10

15

20

25

30

35

40

1. Polipéptido de acil-ACP reductasa (AAR) variante que comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, en el que dicho polipéptido de AAR variante comprende un ácido glutámico en la posición de aminoácido 61, en el que dicho polipéptido de AAR cataliza la conversión de una acil-ACP en un aldehído graso.

2. Polipéptido de AAR variante según la reivindicación 1, en el que la expresión del polipéptido de AAR variante en una célula huésped recombinante da como resultado un mayor título de una composición de alcohol graso o aldehído graso en comparación con el título de una composición de alcohol graso o aldehído graso producida mediante la expresión de un polipéptido de AAR silvestre en una célula huésped silvestre correspondiente.

3. Polipéptido de AAR variante según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha composición de alcohol graso es una composición de alcohol graso C12, C14 o C16, o una combinación de los mismos.

4. Célula huésped recombinante que expresa el polipéptido de AAR variante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. Célula huésped recombinante según la reivindicación 4, en la que la célula huésped recombinante produce una composición de alcohol graso o aldehído graso con un título que es al menos el 10% mayor, al menos el 15% mayor, al menos el 20% mayor, al menos el 25% mayor o al menos el 30% mayor que el título de una composición de alcohol graso o aldehído graso producida por una célula huésped que expresa un polipéptido de AAR silvestre correspondiente, cuando se cultiva en medio que contiene una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar el polipéptido de AAR variante.

6. Célula huésped recombinante según la reivindicación 5, en la que la composición de alcohol graso se produce a un título de aproximadamente 30 g/l a aproximadamente 250 g/l.

7. Célula huésped recombinante según la reivindicación 5 ó 6, en la que la composición de alcohol graso se libera de la célula.

8. Cultivo celular que comprende la célula huésped recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 4-7.

9. Cultivo celular según la reivindicación 8, en el que la composición de un alcohol graso C6, C8, C10, C12, C13, C14, C15, C16, C17 y C18.

10. Cultivo celular según la reivindicación 9, en el que la composición de un alcohol graso insaturado Cm1, C12:1, C141 C^1 y C18:1.

11. Cultivo celular según la reivindicación 9, en el que la composición graso insaturado.

12. Cultivo celular según la reivindicación 9, en el que la composición graso que tiene un doble enlace en la posición 7 en la cadena de reducido del alcohol graso.

13. Cultivo celular según la reivindicación 9, en el que la composición graso saturado.

14. Método de producción de una composición de alcohol graso comprende:

i. cultivar la célula huésped según la reivindicación 4 con una fuente de carbono; y

ii. recoger una composición de alcohol graso.

15. Método según la reivindicación 14, en el que el título del alcohol graso es de al menos del 20% al 30% mayor que el título de una composición de alcohol graso producida por una célula huésped que expresa AAR silvestre.

16. Método según la reivindicación 14, en el que dicha composición de alcohol graso tiene una fracción aumentada de alcoholes grasos C14.

de alcohol graso comprende uno o más

de alcohol graso comprende un alcohol

de alcohol graso comprende un alcohol carbono entre C7 y C8 desde el extremo

de alcohol graso comprende un alcohol

que tiene un aumento del título, que

163

Malonil-ACP

Malonil-CoA-ACP Transacilasa (fabD)

Malonil-CoA

Acetil-CoA carboxilasa

(accABCD)

Acetil-CoA

Fuente de azúcar

---------------------------* Acil-ACP

Biosíntesis de ácidos grasos

(incluyendo iFAB)

Ti oeste rasa

(TE)

i1

Ácido graso

Acil-CoAsintetasa

(fadD)

Acil-CoA

Figura 1

NAD(I

A

imagen1

o

R'^t^^s-ACP

i

FabAJZ

FFA

imagen2

imagen3

165

imagen4

166

Acil-ACP

imagen5

Ácido graso

imagen6

Ácido carboxílico reductasa (CAR/lhomólogos)

Aldehido graso

Aldehido graso reductasa o alcohol deshidrogenasa

Alcohol graso

Alcohol graso (mg/L)

800 -r

imagen7

Cepa

imagen8

Alcohol (mg/L)

000

800

700

600

500

400

800

200

100

O

Producción de alcohol con D+

imagen9

i I

PLS9-1S5 D- 1 1: |)LS9-185D+ 2

¡ DV2: OV2

20,0: í

18,0: ■ :

16,0

14,0

12,0: 5

10,0

8,0: re Alcohol

6,0: m D.o.

4,0

2,0 0,0

imagen10

O) co

imagen11

AAR(S18W)+ACP

• '»«■

BD061: ------——------------------ BD064 i j Shu002 ¡

AAR(S18W)+ACP
AAR(S18W)+ACP
AAR(S18W)+ACP

o

imagen12

imagen13

2500 -

2000

bQ

JE 1500 O

£

o

O 1000

o

500

Shu2+acp+adh+acc i Shu2+acp+adh+acc AAR(S18W) | AAR Com2a

Shu2+acp+adh+acc AAR Com2b

Shu2+acp+adh+acc Shu2+acp+adh+acc AAR_Com2c AAR Com2d

¡

Figura 9

imagen14

Horas de ejecución

imagen15

Titulo de FAIc [mg/L)

Distribución de longitud de cadena de FAIc para AAR D62E

imagen16

so o

700

«00

500

^oo seo 20 o 0.00 o

El FAIC Gu

m pAlcC16

“ FAJc^

^ Especies FAIc totales

A A RwTMoC HlSSfl aAiÍ CtSZE/AQt HJ.56R AA R V347PMÜC H156fi

Figura 10