ES2600890T3 - Moléculas de ácido nucleico de gripe y vacunas preparadas a partir de estas - Google Patents

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Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una o más secuencias de ácido nucleico que codifican, cada una, un antígeno de hemaglutinina de gripe B (BHA) consenso adecuado para inducir una respuesta inmunitaria contra múltiples serotipos de gripe, en la que las una o más secuencias de ácido nucleico se seleccionan entre el grupo que consiste en: a) una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en: la SEQ ID NO: 13, una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 95 % idéntica, al menos el 98 % idéntica o al menos el 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 13; un fragmento de la SEQ ID NO: 13 que comprende al menos 60 nucleótidos, y una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 95 % idéntica, al menos el 98 % idéntica o al menos el 99 % idéntica a un fragmento de la SEQ ID NO: 13 que comprende al menos 60 nucleótidos; y b) una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en: la SEQ ID NO: 15, una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 95 % idéntica, al menos el 98 % idéntica o al menos el 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 15; un fragmento de la SEQ ID NO: 15 que comprende al menos 60 nucleótidos, y una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 95 % idéntica, al menos el 98 % idéntica o al menos el 99 % idéntica a un fragmento de la SEQ ID NO: 15 que comprende al menos 60 nucleótidos.

Description

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k. Fragmento
“Fragmento”, tal como se usa en el presente documento, con respecto a secuencias de ácido nucleico significa una secuencia de ácido nucleico o una parte de la misma, que codifica un polipéptido capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria en un mamífero que reacciona de forma cruzada con un antígeno de gripe de cepa de tipo silvestre de longitud completa, incluyendo, por ejemplo, una hemaglutinina H1 de gripe A, una hemaglutinina H2 de gripe A o una hemaglutinina de gripe B. Los fragmentos pueden ser fragmentos de ADN seleccionados entre al menos una de las diversas secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos consenso y construcciones que comprenden dichas secuencias, incluyendo las SEQ ID NO: 1, 3, 6, 9, 11 13 y 15. Los fragmentos de ADN pueden comprender secuencias codificantes para el líder de inmunoglobulina tales como secuencias de IgE o IgG. Los fragmentos de ADN pueden tener 30 o más nucleótidos de longitud, 45 o más, 60 o más, 75 o más, 90 o más, 120 o más, 150 o más, 180 o más, 210 o más, 240 o más, 270 o más, 300 o más, 360 o más, 420 o más, 480 o más, 540 o más, 600 o más, 660 o más, 720 o más, 780 o más, 840 o más, 900 o más, 960
o más, 1020 o más, 1080 o más, 1140 o más, 1200 o más, 1260 o más, 1320 o más, 1380 o más, 1440 o más, 1500
o más, 1560 o más, 1620 o más, 1680 o más, 1740 o más, 1800 o más, 1860 o más, 1820 o más, 1880 o más, 1940
o más, 2000 o más, 2600 o más, 2700 o más, 2800 o más, 2900 o más, 2910 o más, 2920 o más, 2930 o más, 2931
o más, 2932 o más, 2933 o más, 2934 o más, 2935 o más, 2936 o más, 2937 o más, o 2938 o más de longitud. Los fragmentos de ADN pueden ser de menos de 10 nucleótidos, menos de 20, menos de 30, menos de 40, menos de 50, menos de 60, menos de 75, menos de 90, menos de 120, menos de 150, menos de 180, menos de 210, menos de 240, menos de 270, menos de 300, menos de 360, menos de 420, menos de 480, menos de 540, menos de 600, menos de 660, menos de 720, menos de 780, menos de 840, menos de 900, menos de 960, menos de 1020, menos de 1080, menos de 1140, menos de 1200, menos de 1260, menos de 1320, menos de 1380, menos de 1440, menos de 1500, menos de 1560, menos de 1620, menos de 1680, o menos de 1740 nucleótidos, menos de 1800, menos de 1860, menos de 1820, menos de 1880, menos de 1940, menos de 2000, menos de 2600, menos de 2700, menos de 2800, menos de 2900, menos de 2910, menos de 2920, menos de 2930, menos de 2931, menos de 2932, menos de 2933, menos de 2934, menos de 2935, menos de 2936, menos de 2937, o menos de 2938.
“Fragmento”, con respecto a secuencias polipeptídicas, significa un polipéptido capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria en un mamífero que reacciona de forma cruzada con un antígeno de gripe de cepa de tipo silvestre de longitud completa, incluyendo, por ejemplo, una hemaglutinina H1 de gripe A, una hemaglutinina H2 de gripe A o una hemaglutinina de gripe B. El fragmento puede ser un fragmento polipeptídico seleccionado entre al menos una de las diversas secuencias polipeptídicas de la presente invención, incluyendo las SEQ ID NO: 2, 4, 7, 10, 12, 14 y 16. Los fragmentos polipeptídicos pueden analizarse para contactar con al menos un epítopo antigénico según lo proporcionado por una base de datos disponible al público tal como la Base de datos de secuencias de Ha del Los Alamos National Laboratory. Los fragmentos de HA polipeptídicos pueden comprender además secuencias de aminoácidos para el líder de inmunoglobulina tales como IgE o IgG. Los fragmentos polipeptídicos pueden tener 30 o más aminoácidos de longitud, 45 o más, 60 o más, 75 o más, 90 o más, 120 o más, 150 o más, 180 o más, 210 o más, 240 o más, 270 o más, 300 o más, 360 o más, 420 o más, 480 o más, 540 o más, 600 o más, 660 o más, o 710 aminoácidos o más de longitud. Los fragmentos polipeptídicos pueden tener menos de 10 aminoácidos, menos de 20, menos de 30, menos de 40, menos de 50, menos de 60, menos de 75, menos de 90, menos de 120, menos de 150, menos de 180, menos de 210, menos de 240, menos de 270, menos de 300, menos de 360, menos de 420, menos de 480, menos de 540, menos de 600, menos de 660, menos de 700, menos de 701, menos de 702, menos de 703, menos de 704, menos de 705, menos de 706, menos de 707, menos de 708, menos de 709, o menos de 710 aminoácidos de longitud.
I. Construcción genética
Tal como se usa en el presente documento, la expresión “construcción genética” se refiere a las moléculas de ADN
o ARN que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína. La secuencia codificante incluye señales de iniciación y terminación unidas de forma operativa a elementos reguladores que incluyen un promotor y una señal de poliadenilación capaces de dirigir la expresión en las células del individuo al que se le administra la molécula de ácido nucleico. Tal como se usa en el presente documento, la expresión “forma expresable” se refiere a construcciones génicas que contienen los elementos reguladores necesarios unidos de forma operativa a una secuencia codificante que codifica una proteína de modo que, cuando está presente en la célula del individuo, la secuencia codificante se expresará.
m.
Idéntico/a
“Idéntico/a” o “identidad”, tal como se usan en el presente documento, en el contexto de dos o más ácidos nucleicos
o secuencias polipeptídicas, significan que las secuencias tienen un porcentaje de residuos especificados que son iguales en una región especificada. El porcentaje puede calcularse alineando de forma óptima las dos secuencias, comparando las dos secuencias en la región especificada, determinando el número de posiciones en las que el residuo idéntico aparece en ambas secuencias para dar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la región especificada, y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia. En casos en los que las dos secuencias son de diferentes longitudes o el alineamiento produce uno o más extremos escalonados y la región especificada de comparación
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seleccionarse para ser de aproximadamente 5-10 °C más bajas que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a un pH de fuerza iónica definida. La Tm puede ser la temperatura (a fuerza iónica, pH y concentración nucleica definidas) a la que el 50 % de las sondas complementarias a la diana hibridan con la secuencia diana en equilibrio (dado que las secuencias diana están presentes en exceso, a Tm, el 50 % de las sondas están ocupadas en equilibrio). Condiciones rigurosas pueden ser aquellas en las que la concentración de sales es menor de aproximadamente ion sodio 1,0 M, tal como concentración de ion sodio (u otras sales) aproximadamente 0,01-1,0 M a pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30 °C para sondas cortas (por ejemplo, de aproximadamente 10-50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60 °C para sondas largas (por ejemplo, mayores de aproximadamente 50 nucleótidos). Las condiciones rigurosas también pueden conseguirse con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Para hibridación selectiva o específica, una señal positiva puede ser al menos de 2 a 10 veces la hibridación de fondo. Condiciones de hibridación rigurosas ejemplares incluyen las siguientes: formamida al 50 %, 5x SSC, y SDS al 1 %, incubación a 42 °C, o, 5x SSC, SDS al 1 %, incubación a 65 °C, con lavado en 0,2x SSC, y SDS al 0,1 % SDS a 65 °C.
t. Sustancialmente complementaria
“Sustancialmente complementaria”, tal como se usa en el presente documento, significa que una primera secuencia es al menos el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica al complemento de una segunda secuencia en una región de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540, 630, 720, 810, 900, 990, 1080, 1170, 1260, 1350, 1440, 1530, 1620, 1710, 1800, 1890, 1980, 2070 o más nucleótidos o aminoácidos, o que las dos secuencias hibridan en condiciones de hibridación rigurosas.
u. Sustancialmente idéntica
“Sustancialmente idéntica”, tal como se usa en el presente documento, significa que una primera y segunda secuencias son al menos el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas en una región de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540, 630, 720, 810, 900, 990, 1080, 1170, 1260, 1350, 1440, 1530, 1620, 1710, 1800, 1890, 1980, 2070 o más nucleótidos o aminoácidos, o con respecto a ácidos nucleicos, si la primera secuencia es sustancialmente complementaria al complemento de la segunda secuencia.
v. Subtipo o serotipo
“Subtipo” o “serotipo”, tal como se usan en el presente documento, indistintamente, y en referencia a virus de la gripe, significan variantes genéticas de un virus de la gripe, de modo que un subtipo sea reconocido por un sistema inmunitario aparte de un subtipo diferente.
w. Variante
“Variante”, usada en el presente documento con respecto a un ácido nucleico, significa (i) una parte o fragmento de una secuencia de nucleótidos referenciada; (ii) el complemento de una secuencia de nucleótidos referenciada o una parte de la misma; (iii) un ácido nucleico que es sustancialmente idéntico a un ácido nucleico referenciado o el complemento del mismo; o (iv) un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con el ácido nucleico referenciado, el complemento del mismo, o una secuencia sustancialmente idéntica al mismo.
“Variante”, con respecto a un péptido o polipéptido que difiere en secuencia de aminoácidos mediante la inserción, deleción, o sustitución conservativa de aminoácidos, pero conserva al menos una actividad biológica. Variante también puede significar una proteína con una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a una proteína referenciada con una secuencia de aminoácidos que conserva al menos una actividad biológica. Una sustitución conservativa de un aminoácido, es decir, que sustituye a un aminoácido con un aminoácido diferente de propiedades similares (por ejemplo, hidrofilia, grado y distribución de regiones cargadas) se reconoce en la técnica que normalmente implica un cambio menor. Estos cambios menores pueden identificarse, en parte, considerando el índice hidropático de aminoácidos, tal como se entiende en la técnica. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982). El índice hidropático de un aminoácido se basa en una consideración de su hidrofobia y carga. En la técnica se conoce que aminoácidos de índices hidropáticos similares pueden sustituirse y seguir conservando la función de la proteína. En un aspecto, se sustituyen aminoácidos que tienen índices hidropáticos de ±2. La hidrofilia de los aminoácidos también puede usarse para revelar sustituciones que darían como resultado proteínas que conservan la función biológica. Una consideración de la hidrofilia de aminoácidos en el contexto de un péptido permite el cálculo de la mayor hidrofilia promedio local de ese péptido, una medida útil que se ha descrito que se correlaciona bien con antigenicidad e inmunogenicidad. Patente de Estados Unidos N.º 4.554.101. La sustitución de aminoácidos que tienen valores de hidrofilia similares puede dar como resultado péptidos que conservan la actividad biológica, por ejemplo inmunogenicidad, tal como se entiende en la técnica. Pueden realizarse sustituciones con aminoácidos que tienen valores de hidrofilia dentro de ±2 entre sí. Tanto el índice de hidrofobia como el valor de hidrofilia de aminoácidos están influidos por la cadena lateral particular de ese aminoácido. Coherente con esa observación, se entiende que las sustituciones de aminoácidos que son compatibles con la función biológica dependen de la similitud
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relativa de los aminoácidos, y particularmente las cadenas laterales de esos aminoácidos, tal como se revela mediante la hidrofobia, hidrofilia, carga, tamaño y otras propiedades.
x. Vector
“Vector”, tal como se usa en el presente documento, significa una secuencia de ácido nucleico que contiene un origen de replicación. Un vector puede ser un vector, bacteriófago, cromosoma artificial bacteriano o cromatografía artificial de levadura. Un vector puede ser un vector de ADN o ARN. Un vector puede ser un vector extracromosómico auto-replicante, y preferentemente, es un plásmido de ADN.
2. Antígeno de gripe
En el presente documento se proporcionan antígenos capaces de desencadenar una respuesta inmunitaria en un mamífero contra uno o más serotipos de gripe. El antígeno puede ser capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria en un mamífero contra uno o más serotipos de gripe, incluyendo contra una o más cepas pandémicas, tal como gripe de origen porcino 2009 H1N1. El antígeno puede ser capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria en un mamífero contra uno o más serotipos de gripe, incluyendo contra una o más cepas de gripe humana de origen porcino. El antígeno puede comprender epítopos que le hacen particularmente eficaz como inmunógeno contra el que pueden inducirse respuestas inmunitarias anti-gripe.
El antígeno puede comprender el producto de traducción de longitud completa HA0, subunidad HA1, subunidad HA2, una variante del mismo, un fragmento del mismo o una combinación de los mismos. El antígeno de hemaglutinina de gripe puede ser una secuencia consenso derivada de múltiples cepas de gripe A serotipo H1, una secuencia consenso derivada de múltiples cepas de gripe A serotipo H2, una secuencia híbrida que contiene partes de dos secuencias consenso diferentes derivadas de diferentes conjuntos de múltiples cepas de gripe A serotipo H1
o una secuencia consenso derivada de múltiples cepas de gripe B. El antígeno de hemaglutinina de gripe puede ser de gripe B. El antígeno puede contener al menos un epítopo antigénico que puede ser eficaz contra inmunógenos de gripe particulares contras los que puede inducirse una respuesta inmunitaria. El antígeno puede proporcionar un completo repertorio de sitios inmunógenos y epítopos presentes en un virus de la gripe intacto. El antígeno puede ser una secuencia de antígeno de hemaglutinina consenso que puede derivarse de secuencias de antígeno de hemaglutinina de una pluralidad de cepas de virus de la gripe A de un serotipo tal como una pluralidad de cepas de virus de la gripe A de serotipo H1 o de serotipo H2. El antígeno puede ser una secuencia de antígeno de hemaglutinina consenso híbrida que puede derivarse de combinar dos secuencias de antígeno de hemaglutinina consenso diferentes o partes de las mismas. Cada una de dos secuencias de antígeno de hemaglutinina consenso diferentes puede derivarse de un conjunto diferente de una pluralidad de cepas de virus de la gripe A de un serotipo tal como una pluralidad de cepas de virus de la gripe A de serotipo H1. El antígeno puede ser una secuencia de antígeno de hemaglutinina consenso que puede derivarse de secuencias de antígeno de hemaglutinina de una pluralidad de cepas de virus de la gripe B.
El antígeno de hemaglutinina consenso puede ser una proteína que comprende la SEQ ID NO: 2 (la secuencia de aminoácidos de H1 consenso) en la que los aminoácidos 1-343 corresponden a la subunidad HA1 de la secuencia de aminoácidos H1 consenso HA0 precursora y los aminoácidos 344-566 corresponden a la subunidad HA2 de la secuencia de aminoácidos H1 consenso HAO precursora. El antígeno de hemaglutinina consenso puede ser una proteína que comprende la SEQ ID NO: 7 (la secuencia de aminoácidos de H2 consenso). El antígeno de hemaglutinina consenso puede ser una secuencia H1 consenso híbrida sintética que comprende partes de dos secuencias H1 consenso diferentes que se derivan, cada una, de un conjunto diferente de secuencias de la otra. Un ejemplo de un antígeno HA consenso que es una proteína H1 consenso híbrida sintética es una proteína que comprende la SEQ ID NO: 10 (la secuencia de aminoácidos de U2). El antígeno de hemaglutinina consenso puede ser una proteína hemaglutinina consenso derivada de secuencias de hemaglutinina de cepas de gripe B, tal como una proteína que comprende la SEQ ID NO: 14 (la secuencia de aminoácidos de BHA consenso).
El antígeno de hemaglutinina consenso puede comprender además uno o más elementos de secuencia de aminoácidos adicionales. El antígeno de hemaglutinina consenso puede comprender además en su extremo N una secuencia de aminoácidos líder de IgE o IgG. La secuencia de aminoácidos líder de IgE puede ser la SEQ ID NO:
17. El antígeno de hemaglutinina consenso puede comprender además una marca inmunógena que es un epítopo inmunógeno único que puede ser detectado por anticuerpos disponibles fácilmente. Un ejemplo de dicha marca inmunógena es la marca HA de gripe de 9 aminoácidos que puede estar unida en el extremo C de hemaglutinina consenso. La secuencia de aminoácidos de la marca HA puede ser la SEQ ID NO: 18. En algunas realizaciones, el antígeno de hemaglutinina consenso puede comprender además en su extremo N una secuencia de aminoácidos líder de IgE o IgG y en su extremo C una marca HA.
El antígeno de hemaglutinina consenso puede ser una proteína hemaglutinina consenso que consiste en secuencias de aminoácidos de gripe consenso o fragmentos y variantes de las mismas. El antígeno de hemaglutinina consenso puede ser una proteína hemaglutinina consenso que comprende secuencias de proteínas no de gripe y secuencias de proteínas de gripe o fragmentos y variantes de las mismas.
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La construcción genética también puede ser parte de un genoma de un vector viral recombinante, que incluye adenovirus recombinante, virus asociado a adenovirus recombinante y vaccinia recombinante. La construcción genética puede ser parte del material genético en microorganismos vivos atenuados o vectores microbianos recombinantes que viven en células.
Las construcciones genéticas pueden comprender elementos reguladores para la expresión génica del ácido nucleico de hemaglutinina. Los elementos reguladores pueden ser un promotor, un promotor, un codón de iniciación, un codón de terminación, o una señal de poliadenilación.
Las composiciones pueden comprender una primera secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno de hemaglutinina consenso seleccionado entre el grupo que consiste en uno o más de: antígeno H1 de hemaglutinina consenso de gripe A, antígeno H2 de hemaglutinina consenso de gripe A, antígeno U2 de hemaglutinina consenso de gripe A, y proteína hemaglutinina consenso BHA de gripe B, y puede comprender además una o más secuencias de ácido nucleico adicionales que codifica una o más proteínas seleccionadas entre el grupo que consiste en: proteínas hemaglutinina de gripe A H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, neuraminidasa de gripe A N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, hemaglutinina de gripe B (BHA) y neuraminidasa de gripe B (BNA). Las primera y adicionales secuencias de ácido nucleico pueden estar presentes en la misma molécula de ácido nucleico o diferentes moléculas de ácido nucleico. La primera y adicionales secuencias de ácido nucleico puede estar bajo el control de elementos reguladores que funcionan en una célula humana. La secuencia codificante adicional puede codificar una o más de H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, BHA y BNA de una o más cepas of influenza, o ser un consenso derivado de una pluralidad de cepas que tienen el serotipo, o ser un híbrido que incluye secuencias de dos o más secuencias consenso.
Las secuencias de ácido nucleico pueden componer una construcción genética que puede ser un vector. El vector puede ser capaz de expresar un antígeno de hemaglutinina consenso en la célula de un mamífero en una cantidad eficaz para desencadenar una respuesta inmunitaria en el mamífero. El vector puede ser recombinante. El vector puede comprender un ácido nucleico heterólogo que codifica el antígeno de hemaglutinina consenso. El vector puede ser un plásmido. El vector puede ser útil para transfectar células con un ácido nucleico que codifica un antígeno de hemaglutinina consenso, que la célula huésped transformada se cultive y se mantenga en condiciones en las que la expresión del antígeno de hemaglutinina consenso tiene lugar.
El vector puede comprender un ácido nucleico heterólogo que codifica un antígeno de hemaglutinina consenso y puede comprender además un codón de iniciación, que puede estar cadena arriba de la secuencia codificante de hemaglutinina consenso, y un codón de terminación, que puede estar cadena abajo de la secuencia codificante de hemaglutinina consenso. El codón de iniciación y terminación pude estar en marco con la secuencia codificante de hemaglutinina consenso. El vector también puede comprender un promotor que está unido de forma operativa a la secuencia codificante de hemaglutinina consenso. El promotor unido de forma operativa a la secuencia codificante de hemaglutinina consenso puede ser un promotor de virus de simio 40 (SV40), un promotor de virus tumoral mamario de ratón (MMTV), un promotor del virus de inmunodeficiencia humana (HIV) tal como el promotor de repetición terminal larga del virus de inmunodeficiencia bovina (BIV), un promotor de virus de Moloney, un promotor de virus de leucosis aviar (ALV), un promotor de citomegalovirus (CMV) tal como el promotor inmediato temprano de CMV, promotor del virus Epstein Barr (EBV), o un promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV). El promotor también puede ser un promotor de un gen humano tal como actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina del músculo humano, o metalotioneína humana. El promotor también puede ser un promotor específico de tejido, tal como un promotor específico de músculo o e piel, natural o sintético. Los ejemplos de dichos promotores se describen en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.º US20040175727.
El vector también puede comprender una señal de poliadenilación, que puede estar cadena abajo de la secuencia codificante de HA. La señal de poliadenilación puede ser una señal de poliadenilación de SV40, señal de poliadenilación de LTR, señal de poliadenilación de hormona del crecimiento bovina (bGH), señal de poliadenilación de hormona del crecimiento humana (hGH), o señal de poliadenilación de -globina humana. La señal de poliadenilación de SV40 puede ser una señal de poliadenilación de una vacuna pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA).
El vector también puede comprender un potenciador cadena arriba de la secuencia codificante de hemaglutinina consenso. El potenciador puede ser necesario para la expresión de ADN. El potenciador puede ser actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina del músculo humana o un potenciador viral tal como uno de CMV, HA, RSV o EBV. Potenciadores de la función de polinucleótidos se describen en las Patentes de Estados Unidos N.º 5.593.972, 5.962.428 y WO94/016737.
El vector también puede comprender un origen de replicación de mamífero con el fin de mantener el vector de forma extracromosómica y producir múltiples copias del vector en una célula. El vector puede ser pVAX1 (figura 1), pCEP4
o pREP4 de Invitrogen (San Diego, CA), que puede comprender el origen de replicación del virus Epstein Barr y región codificante EBNA-1 del antígeno nuclear, que puede producir replicación episómica de copias elevadas sin integración. El vector puede ser pVAX1 con cambios tales como los descritos en el párrafo que se refiere a la figura 1 en la sección de Breve descripción de las figuras, anteriormente. La estructura principal del vector puede ser
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a aproximadamente 250 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas contienen de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas contienen de aproximadamente 15 a aproximadamente 150 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas contienen de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas contienen de aproximadamente 25 a aproximadamente 75 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas contienen de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas contienen de aproximadamente 35 a aproximadamente 40 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas contienen de aproximadamente 100 a aproximadamente 200 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden de aproximadamente 10 microgramos a aproximadamente 100 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden de aproximadamente 20 microgramos a aproximadamente 80 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden de aproximadamente 25 microgramos a aproximadamente 60 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden de aproximadamente 30 nanogramos a aproximadamente 50 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden de aproximadamente 35 nanogramos a aproximadamente 45 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 500 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen de aproximadamente 1 a aproximadamente 350 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen de aproximadamente 25 a aproximadamente 250 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen de aproximadamente 100 a aproximadamente 200 microgramos de ADN.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención se formulan de acuerdo con la vía de administración a usar. En casos en los que composiciones farmacéuticas son composiciones farmacéuticas inyectables, estas son estériles, libres de pirógenos y libres de partículas. Una formulación isotónica se usa preferentemente. Generalmente, los aditivos para isotonicidad pueden incluir cloruro sódico, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa. En algunos casos, se prefieren soluciones isotónicas tales como solución salina tamponada con fosfato. Los estabilizantes incluyen gelatina y albúmina. En algunas realizaciones, se añade un agente de vasoconstricción a la formulación.
Preferentemente, la composición farmacéutica es una vacuna, y más preferentemente una vacuna de ADN.
En el presente documento se proporciona una vacuna capaz de generar en un mamífero una respuesta inmunitaria contra uno o más serotipos de gripe. La vacuna puede comprender la construcción genética tal como se ha descrito anteriormente. La vacuna puede comprender una pluralidad de los vectores dirigidos, cada uno, a uno o más serotipos de gripe A tales como hemaglutinina de gripe B H1-H16 o combinaciones de las mismas. Las vacunas pueden comprender una o más secuencias de ácido nucleico que codifican uno o más antígenos de hemaglutinina consenso. Cuando la vacuna comprende más de una secuencia de ácido nucleico de hemaglutinina consenso, todas dichas secuencias pueden estar presentes en una única molécula de ácido nucleico o cada una de dichas secuencias pueden estar presentes en una molécula de ácido nucleico diferente. Como alternativa, vacunas que comprenden más de una secuencia de ácido nucleico de hemaglutinina consenso pueden comprender moléculas de ácido nucleico con una única secuencia de ácido nucleico de hemaglutinina consenso y moléculas de ácido nucleico con más de una secuencia de ácido nucleico de hemaglutinina consenso. Además, las vacunas que comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de hemaglutinina consenso pueden comprender además secuencias codificantes para una o más proteínas seleccionadas entre el grupo que consiste en H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9 y neuraminidasa de gripe B.
En algunas realizaciones, las vacunas pueden comprender proteínas. Algunas vacunas pueden comprender uno o más antígenos de hemaglutinina consenso tales como H1, H2, U2 y BHA. Las vacunas pueden comprender una o más otras proteínas seleccionadas entre el grupo que consiste en H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9 y neuraminidasa de gripe B. Las vacunas pueden comprender uno o más antígenos de hemaglutinina consenso en combinación con una o más otras proteínas seleccionadas entre el grupo que consiste en H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, hemaglutinina y neuraminidasa de gripe B.
La vacuna puede ser una vacuna de ADN. La vacuna de ADN puede comprender una pluralidad de los mismos o diferentes plásmidos que comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de hemaglutinina consenso. La vacuna de ADN puede comprender una o más secuencias de ácido nucleico que codifican uno o más antígenos de hemaglutinina consenso. Cuando la vacuna de ADN comprende más de una secuencia de ácido nucleico de hemaglutinina consenso, todas dichas secuencias pueden estar presentes en un único plásmido, o cada una de dichas secuencias puede estar presente en un plásmido diferente, o algunos plásmidos pueden comprender una única secuencia de ácido nucleico de hemaglutinina consenso mientras que otros plásmidos tienen más de una secuencia de ácido nucleico de hemaglutinina consenso. Además, las vacunas de ADN pueden comprender además una o más secuencias codificantes consenso para una o más proteínas seleccionadas entre el grupo que consiste
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El vector de la vacuna puede suministrarse al mamífero mediante varias tecnologías bien conocidas que incluyen inyección de ADN (también denominada vacunación con ADN) con y sin electroporación in vivo, mediada por liposomas, mediada por nanopartículas, vectores recombinantes tales como adenovirus recombinante, virus asociado a adenovirus recombinante y vaccinia recombinante. El antígeno de HA puede suministrarse mediante inyección de ADN y junto con electroporación in vivo.
c. Electroporación
La administración de la vacuna mediante electroporación de los plásmidos de la vacuna puede conseguirse usando dispositivos de electroporación que pueden estar configurados para suministro a un tejido deseado de un mamífero un pulso de energía eficaz para hacer que se formen poros reversibles en membranas celulares, y preferentemente el pulso de energía es una corriente constante similar a una corriente preestablecida introducida por un usuario. El dispositivo de electroporación puede comprender un componente de electroporación y un conjunto de electrodos o conjunto de mango. El componente de electroporación puede incluir e incorporar uno o más de los diversos elementos de los dispositivos de electroporación, incluyendo: controlador, generador de forma de onda de corriente, testador de impedancia, registrador de forma de onda, elemento de entrada, elemento notificador de estado, puerto de comunicación, componente de memoria, fuente de alimentación, y conmutador de alimentación. La electroporación pueden conseguirse usando un dispositivo de electroporación in vivo, por ejemplo sistema de EP CELLECTRA® (VGX Pharmaceuticals, Blue Bell, PA) o electroporador Elgen (Genetronics, San Diego, CA) para facilitar la transfección de células por el plásmido.
El componente de electroporación puede funcionar como un elemento de los dispositivos de electroporación, y los otros elementos son elementos (o componentes) independientes en comunicación con el componente de electroporación. El componente de electroporación puede funcionar como más de un elemento de los dispositivos de electroporación, que puede estar en comunicación con otros elementos más de los dispositivos de electroporación independientes del componente de electroporación. Los elementos de los dispositivos de electroporación que existen como partes de un dispositivo electromecánico o mecánico pueden no estar limitados, dado que los elementos pueden funcionar como un dispositivo o como elementos independientes en comunicación entre sí. El componente de electroporación puede ser capaz de suministrar el pulso de energía que produce la corriente constante en el tejido deseado, e incluye un mecanismo de retroalimentación. El conjunto de electrodos puede incluir una matriz de electrodos que tiene una pluralidad de electrodos en una disposición espacial, en la que el conjunto de electrodos recibe el pulso de energía del componente de electroporación y lo suministra al tejido deseado a través de los electrodos. Al menos uno de la pluralidad de electrodos es neutro durante el suministro del pulso de energía y mide la impedancia en el tejido deseado y comunica la impedancia al componente de electroporación. El mecanismo de retroalimentación puede recibir la impedancia medida y puede ajustar el pulso de energía suministrado por el componente de electroporación para mantener la corriente constante.
Una pluralidad de electrodos puede suministrar el pulso de energía en un patrón descentralizado. La pluralidad de electrodos puede suministrar el pulso de energía en el patrón descentralizado a través del control de los electrodos en una secuencia programada, y la secuencia programada es introducida por un usuario al componente de electroporación. La secuencia programada puede comprender una pluralidad de pulsos suministrados en secuencia, en la que cada pulso de la pluralidad de pulsos es suministrada por al menos dos electrodos activos con un electrodo neutro que mide la impedancia, y en la que un pulso posterior de la pluralidad de pulsos es suministrado por uno diferente de al menos dos electrodos activos con un electrodo neutro que mide la impedancia.
El mecanismo de retroalimentación puede realizarse mediante hardware o software. El mecanismo de retroalimentación puede realizarse mediante un circuito en bucle cerrado analógico. La retroalimentación se produce cada 50 s, 20 s, 10 s o1 s, pero es preferentemente una retroalimentación en tiempo real o instantánea (es decir, sustancialmente instantánea según lo determinado mediante técnicas disponibles para determinar el tiempo de respuesta). El electrodo neutro pude medir la impedancia en el tejido deseado y comunica la impedancia al mecanismo de retroalimentación, y el mecanismo de retroalimentación responde a la impedancia y ajusta el pulso de energía para mantener la corriente constante a un valor similar a la corriente preestablecida. El mecanismo de retroalimentación puede mantener la corriente constante continua e instantáneamente durante el suministro del pulso de energía.
Los ejemplos de dispositivos de electroporación y métodos de electroporación que pueden facilitar el suministro de las vacunas de ADN de la presente invención, incluyen los descritos n la Patente de Estados Unidos N.º 7.245.963 de Draghia-Akli, et al., la publicación de patente de Estados Unidos 2005/0052630 presentada por Smith, et al. Otros dispositivos de electroporación y métodos de electroporación que pueden usarse para facilitar el suministro de las vacunas de ADN incluyen aquellas proporcionadas en la solicitud de patente de Estados unidos pendiente de tramitación y de titularidad conjunta N.º de serie 11/874072, presentada el 17 de octubre de 2007, que reivindica el beneficio según 35 USC 119(e) de las solicitudes provisionales de Estados Unidos N.º de serie 60/852.149, presentada el 17 de octubre de 2006, y 60/978.982, presentada el 10 de octubre de 2007.
La patente de Estados Unidos N.º 7.245.963 de Draghia-Akli, et al., describe sistemas de electrodos modulares y su uso para facilitar la introducción de una biomolécula en células de un tejido seleccionado en un cuerpo o planta. Los
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sistemas de electrodos modulares pueden comprender una pluralidad de electrodos de aguja; una aguja hipodérmica; un conector eléctrico que proporciona una unión conductora desde un controlador de pulsos de corriente constante programable a la pluralidad de electrodos de aguja; y una fuente de alimentación. Un operador puede agarrar la pluralidad de electrodos de aguja que están montados sobre una estructura de soporte e insertarlos firmemente en el tejido seleccionado en un cuerpo o planta. Las biomoléculas son suministradas a continuación mediante el agua hipodérmica al interior del tejido seleccionado. El controlador de pulsos de corriente constante programable se activa y un pulso eléctrico de corriente constante se aplica a la pluralidad de electrodos de aguja. El pulso eléctrico de corriente constante aplicado facilita la introducción de la biomolécula en la célula entre la pluralidad de electrodos.
La publicación de patente de Estados Unidos 2005/0052630 presentada por Smith, et al., describe un dispositivo de electroporación que puede usarse para facilitar eficazmente la introducción de una biomolécula en células de un tejido seleccionado en un cuerpo o planta. El dispositivo de electroporación comprende un dispositivo electrocinético (“dispositivo EKD”) cuyo funcionamiento es especificado mediante software o firmware. El dispositivo EKD produce una serie de patrones de pulso de corriente constante programables entre electrodos en una matriz basándose en control y entrada por parte del usuario de los parámetros del pulso, y permite el almacenamiento y la adquisición de datos de forma de onda de corriente. El dispositivo de electroporación también comprende un disco de electrodo sustituible que tiene una matriz de electrodos de aguja, un canal de inyección central para una aguja de inyección, y un disco de guía amovible.
Las matrices de electrodos y los métodos descritos en la patente de Estados Unidos N.º 7.245.963 y la publicación de patente de Estados Unidos 2005/0052630 pueden adaptarse para penetración profunda en no solamente tejidos tales como músculos, sino también otros tejidos u órganos. Debido a la configuración de la matriz de electrodos, la aguja de inyección (para suministrar la biomolécula de elección) también es insertada completamente en el órgano diana, y la inyección se administra perpendicular al tejido diana, en la zona que es pre-delineada por los electrodos. Los electrodos descritos en la patente de Estados Unidos N.º 7.245.963 y la publicación de patente de Estados Unidos 2005/005263 son preferentemente de 20 mm de largo y de calibre 21.
Adicionalmente, contemplados en algunas realizaciones que incorporan dispositivos de electroporación y usos de los mismos, hay dispositivos de electroporación que son los descritos en las siguientes patentes: patente de Estados Unidos 5.273.525 presentada el 28 de diciembre de 1993, patentes de Estados Unidos 6.110.161 presentada el 29 de agosto de 2000, 6.261.281 presentada el 17 de julio de 2001, y 6,958,060 presentada el 25 de octubre de 2005, y la patente de Estados Unidos 6.939.862 presentada el 6 de septiembre de 2005. Además, patentes que abarcan el asunto proporcionado en la patente de Estados Unidos 6.697.669 presentada el 24 de febrero de 2004, que se refiere al suministro de ADN usando cualquiera de diversos dispositivos, y la patente de Estados Unidos 7.328.064 presentada el 5 de febrero de 2008, concebida como un método de inyección de ADN, están contemplados en el presente documento.
d. Método de preparación de una vacuna
En el presente documento se proporcionan métodos para preparar los plásmidos de ADN que comprenden las vacunas de ADN descritas en el presente documento. Los plásmidos de ADN, después de la etapa de subclonación final en el plásmido de expresión en mamíferos, pueden usarse para inocular un cultivo celular en un tanque de fermentación a gran escala, usando métodos conocidos en la técnica.
Los plásmidos de ADN para uso con los dispositivos de EP de la presente invención pueden formularse o fabricarse usando una combinación de dispositivos y técnicas conocidas, pero preferentemente se fabrican usando una técnica de fabricación de plásmidos optimizada que se describe en una solicitud provisional de Estados Unidos N.º de serie 60/939.792 cedida, pendiente de tramitación, que se presentó el 23 de mayo de 2007. En algunos ejemplos, los plásmidos de ADN usados en estos estudios pueden formularse a concentraciones mayores que o iguales a 10 mg/ml. Las técnicas de fabricación también incluyen o incorporan diversos dispositivos y protocolos que son conocidos comúnmente por los expertos en la materia, además de los descritos en la patente estadounidense N.º de serie 60/939792, incluyendo los descritos en una patente cedida, la patente de Estados Unidos No. 7.238.522, que se presentó el 3 de julio de 2007.
Ejemplos
La presente invención se ilustra adicionalmente en los siguientes ejemplos. Debe entenderse que estos ejemplos, aunque indican realizaciones preferidas de la invención, se dan a modo de ilustración solamente. A partir de la descripción anterior y estos ejemplos, un experto en la materia puede valorar las características esenciales de esta invención y, sin alejarse del alcance de la misma, puede realizar diversos cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a diversos usos y condiciones. Por lo tanto, diversas modificaciones de la invención además de las mostradas y descritas en el presente documento serán evidentes para los expertos en la materia a partir de la descripción anterior. Dichas modificaciones también pretenden estar dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
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Ejemplo 1
pGX2009 (pH1HA09) -Plásmido que codifica antígeno de hemaglutinina de gripe H1N1 2009 (gripe porcina)
La estructura principal de pGX2009 (H1HA09) es el vector de expresión modificado pVAX1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) bajo el control del promotor inmediato-temprano de citomegalovirus (CMV). El pVAX1 original se adquirió de Invitrogen (Número de catálogo V260-20) y se mantuvo a -20 °C. Tal como se ha indicado anteriormente, el análisis de secuencias reveló diferencias entre la secuencia de pVAX1 usada como la estructura principal de pGX2009 y la secuencia de pVAX1 disponible de Invitrogen. Las diferencias se han mostrado anteriormente.
El plásmido pGX2009, también denominado pH1HA09, comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de hemaglutinina de gripe H1N1 2009 consenso (gripe porcina). Las 79 secuencias primarias usadas para generar la secuencia consenso se seleccionaron de la base de datos The Influenza Sequence Database.
Los números de entrada para secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos para las diversas proteínas H1 hemaglutinina de gripe A así como las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de nucleótidos son, en la base de datos GenBank, correspondientes a los siguientes números de entrada. Los números de entrada no entre paréntesis desvelan secuencias de nucleótidos y enumeran secuencias de aminoácidos adicionales codificadas por ellas. Los números de entrada entre paréntesis son para entradas de la secuencia de aminoácidos correspondientes en la base de datos de proteínas GenBank. Los números de entrada son los siguientes: GQ323579.1 (ACS72657.1), GQ323564.1 (ACS72654.1), GQ323551.1 (ACS72652.1), GQ323530.1 (ACS72651.1), GQ323520.1 (ACS72650.1), GQ323495.1 (ACS72648.1), GQ323489.1 (ACS72647.1), GQ323486.1 (ACS72646.1), GQ323483.1 (ACS72645.1), GQ323455.1 (ACS72641.1), GQ323451.1 (ACS72640.1), GQ323443.1 (ACS72638.1), GQ293077.1 (ACS68822.1), GQ288372.1 (ACS54301.1), GQ287625.1 (ACS54262.1), GQ287627.1 (ACS54263.1), GQ287623.1 (ACS54261.1), GQ287621.1 (ACS54260.1), GQ286175.1 (ACS54258.1), GQ283488.1 (ACS50088.1), GQ280797.1 (ACS45035.1), GQ280624.1 (ACS45017.1), GQ280121.1 (ACS45189.1), GQ261277.1 (ACS34968.1), GQ253498.1 (ACS27787.1), GQ323470.1 (ACS72643.1), GQ253492.1 (ACS27780.1), FJ981613.1 (ACQ55359.1), FJ971076.1 (ACP52565.1), FJ969540.1 (ACP44189.1), FJ969511.1 (ACP44150.1), FJ969509.1 (ACP44147.1), GQ255900.1 (ACS27774.1),GQ255901.1 (ACS27775.1), FJ966974.1 (ACP41953.1), GQ261275.1 (ACS34967.1), FJ966960.1 (ACP41935.1),FJ966952.1 (ACP41926.1), FJ966082.1 (ACP41105.1),GQ255897.1 (ACS27770.1), CY041645.1 (ACS27249.1), CY041637.1 (ACS27239.1),CY041629 (ACS27229.1), GQ323446.1 (ACS72639.1),CY041597.1 (ACS27189.1), CY041581.1 (ACS14726.1),CY040653.1 (ACS14666.1), CY041573.1 (ACS14716.1),CY041565.1 (ACS14706.1), CY041541.1 (ACS14676.1),GQ258462.1 (ACS34667.1), CY041557.1 (ACS14696.1), CY041549.1 (ACS14686.1), GQ283484.1 (ACS50084.1), GQ283493.1 (ACS50095.1), GQ303340.1 (ACS71656.1), GQ287619.1 (ACS54259.1), GQ267839.1 (ACS36632.1), GQ268003.1 (ACS36645.1), CY041621.1 (ACS27219.1), CY041613.1 (ACS27209.1), CY041605.1 (ACS27199.1), FJ966959.1 (ACP41934.1), FJ966982.1 (ACP41963.1), CY039527.2 (ACQ45338.1), FJ981612.1 (ACQ55358.1), FJ981615.1 (ACQ55361.1), FJ982430.1 (ACQ59195.1), FJ998208.1 (ACQ73386.1), GQ259909.1 (ACS34705.1), GQ261272.1 (ACS34966.1), GQ287621.1 (ACS54260.1), GQ290059.1 (ACS66821.1), GQ323464.1 (ACS72642.1), GQ323473.1 (ACS72644.1), GQ323509.1 (ACS72649.1), GQ323560.1 (ACS72653.1), GQ323574.1 (ACS72655.1) y GQ323576.1 (ACS72656.1). Las secuencias de aminoácidos se descargaron de la base de datos NCBI Sequence Database, y una secuencia de alineamiento y consenso se generó usando Clustal X. Una secuencia líder altamente eficiente, el líder de IgE, se fusionó en marco cadena arriba del codón de iniciación para facilitar la expresión. Con el fin de tener un nivel más elevado de expresión, el uso de codones de este gen de fusión se adaptó al sesgo de codones de genes de Homo Sapiens. Además, también se realizó optimización de ARN: regiones de muy alto (>80 %) o muy bajo (<30 %) contenido de GC y los motivos de secuencia que actúan en cis tales como cajas TATA internas, sitios chi y sitios de entrada ribosómicos se evitaron. Toda la secuencia se produjo de forma sintética en Geneart (Regensburg, Alemania). El gen H1HA09 genomanipulado sintético tenía 1818 pb de longitud (SEQ ID NO: 1) y fue clonado en pVAX1 en sitios de BamHI y XhoI por Geneart (figura 2).
Ejemplo 2
Provocación de hurones inmunizados con pGX2009 de gripe con A/Mexico/InDRE4487/2009
Se llevaron a cabo experimentos de provocación usando hurones, un modelo preferido para gripe. Los hurones se inmunizaron usando el plásmido pGX2009.
Animales: 4 grupos x 5 animales/grupo, más un grupo de control con 4 animales = 24 hurones en total (macho) Duración: 18 semanas (incluyendo provocación) Dosis: 0,2 mg de plásmido
Resumen del protocolo: Se asignaron hurones aleatoriamente a grupos de vacuna de ADN. Los animales se inmunizaron el día 0, el día 28 y el día 56 del estudio. Los animales se anestesiaron con un cóctel de ketamina/midazolam, isoflurano o equivalente de acuerdo con protocolos de anestesia aprobados y se vacunaron IM con combinaciones de vacunas de ADN para gripe. Los grupos 1 y 2 fueron electroporados inmediatamente usando el dispositivo de electroporación (EP) a corriente constante CELLECTRA® a 0,5 Amp, pulsos de 52 milisegundos,

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