ES2602460T3 - Derivados de bacterioclorofila catiónicos y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un derivado de bacterioclorofila de la fórmula I:**Fórmula** en donde M representa 2H, un átomo de metal divalente seleccionado entre Pd, Pt, Co, Sn, Ni, Cu, Zn o Mn, o un átomo de metal trivalente seleccionado entre el grupo que consiste en Fe, Mn, Co, Au, Al, Gd, Er, Yb y Cr; R1 es Y-R8, -NR9R'9 o -N+R9R'9R"9A-; Y es O o S; R2 es H, OH o COOR9; R3 es H, OH, alquilo C1-C12 o alcoxi C1-C12; R4 es -CH>=CR9R'9, -CH>=CR9Hal, -CH>=CH-CH2-NR9R'9, -CH>=CH-CH2- N+R9R'9R"9A-, - CHO, -CH>=NR9, -CH>=N+R9R'9 A-, -CH2-OR9, -CH2-SR9, -CH2-Hal, -CH2-R9, -CH2-NR9R'9, -CH2-N+R9R'9R"9 A-, -CH2-CH2R9, -CH2- CH2Hal, -CH2-CH2OR9, -CH2-CH2SR9, -CH2-CH2-NR9R'9,-CH2-CH2-N+R9R'9R"9A-, -COCH3, C(CH3)>=CR9R'9, - C(CH3)>=CR9Hal, -C(CH3)>=NR9,-CH(CH3)>=N+R9R'9A-, -CH(CH3)-Hal, -CH(CH3)-OR9, -CH(CH3)-SR9, -CH(CH3)- NR9R'9, CH(CH3)-N+R9R'9 R"9A- o -C>=CR9; R5 es >=O, >=S, >=N-R9, >=N+R9R'9A-, >=CR9R'9 o >=CR9-Hal; cada R8, R9, R'9 y R"9 es independientemente: (a) H; (b) hidrocarbilo C1-C25, preferiblemente alquilo C1-C25, más preferiblemente alquilo C1-C10 o C1-C6, sin sustituir o sustituido con uno o más radicales seleccionados entre: (i) un grupo funcional seleccionado entre halógeno, nitro, oxo, OR, SR, epoxi, epitio, aziridina, -CONRR', -COR, COOR, -OSO3R, -SO3R, -SO2R, -NHSO2R, - SO2NRR' >=N-OR, >=N-NRR', -(CH2)nNR-COR', -(CH2)n-CO-NRR', -O-(CH2)n-OR, -O-(CH2)n-O-(CH2)n-R, -PRR', -OPO3RR', -PO2HR o -PO3RR', en donde n es un número entero de 1 a 6; (ii) unos grupos cargados positivamente seleccionados entre: un grupo onio; un catión derivado de un grupo que contiene N seleccionado entre O← N+(RR')-, >C>=N+(RR'),-N+(RR'R"), -(R)N-N+(RR'R"), -(R)NC(>= HN)-N+RR'R", -C(>=NH)-N+(RR'R"); un catión derivado de un compuesto heteroaromático que contiene uno o más átomos de N y opcionalmente átomos de O o S; (iii) un grupo cargado negativamente seleccionado entre COO-, COS-, -OSO3 -, -SO3 -, -OPO3R-, -PO2H-, -PO3 2- o -PO3R-; (iv) un grupo básico que se convierte en unos grupos cargados positivamente en condiciones fisiológicas seleccionado entre -NRR', -C(>=NR)-NR'R", -NR-NR'R", -(R)N-C(>=NR)-NR'R", O← NR-, >C>=NR o un radical heteroaromático que contiene N; (v) un grupo ácido que se convierte en unos grupos cargados negativamente en condiciones fisiológicas seleccionado entre -COOH, -COSH, -SO3H y -PO3H2; o (vi) un residuo de un aminoácido, un péptido, una proteína, un monosacárido, un oligosacárido o un polisacárido; (c) hidrocarbilo C1-C25, preferiblemente alquilo C1-C25, más preferiblemente alquilo C1-C10 o C1-C6, que contiene uno o más heteroátomos y/o uno o más restos carbocíclicos o heterocíclicos, opcionalmente sustituido adicionalmente con uno o más radicales según se han definido en (b); o (d) un residuo de un aminoácido, un péptido, una proteína, un monosacárido, un oligosacárido o un polisacárido; en donde cada uno de R, R' y R" es independientemente H, hidrocarbilo, preferiblemente alquilo C1-C25, más preferiblemente alquilo C1-C10 o C1-C6, o heterociclilo, o dos de R, R' y R" junto con el átomo de N al que están unidos forman un anillo saturado de 3-7 miembros, que contiene opcionalmente uno o más heteroátomos seleccionados entre O, S o N y está opcionalmente sustituido adicionalmente en el átomo de N adicional con alquilo opcionalmente sustituido con halógeno, hidroxilo o amino; R8 puede ser adicionalmente H+ o un catión R+ 10 cuando R1 es Y-R8; R+ 10 es amonio, un catión de un metal, preferiblemente de un metal alcalino o alcalinotérreo, tal como Na, K, Li, Ca, Ba o un catión derivado de un grupo que contiene N según se ha definido en (ii) anteriormente; A es un anión fisiológicamente aceptable; m es 0 o 1; y sales farmacéuticamente aceptables e isómeros ópticos del mismo; con la condición de que, cuando R2 y R3 sean ambos H, R5 no sea >=N-R9 y/o R4 no sea -C(CH3)>=NR9; y con la condición adicional de que el derivado de bacterioclorofila de fórmula I tenga al menos un grupo cargado positivamente y/o al menos un grupo básico que se convierta en un grupo cargado positivamente en condiciones fisiológicas.

Description

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DESCRIPCION
Derivados de bacterioclorofila cationicos y usos de los mismos Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a nuevos derivados cationicos solubles en agua de bacterioclorofila, a su preparacion y a su uso en metodos de diagnostico y terapia fotodinamica in vivo de tumores y diferentes enfermedades vasculares tales como degeneracion macular asociada a la edad, asf como a metodos in-vivo y ex- vivo para matar virus y microorganismos.
Definiciones y abreviaturas: AMD: degeneracion macular asociada a la edad; Bchl: bacterioclorofila a (7,8,17,18- tetrahidroporfirina pentadclica con un 5° anillo isodclico, un atomo central de Mg, un grupo fitilo o geranilgeranilo en la posicion 173, un grupo COOCH3 en la posicion 132, un atomo de H en la posicion 132, grupos metilo en las posiciones 2, 7, 12, 18, un grupo acetilo en la posicion 3 y un grupo etilo en la posicion 8); Bclorin: bacterioclorina (7,8,17,18-tetrahidroporfirina); Bphe: bacteriofeofitina a (Bchl en que el atomo central de Mg se reemplaza por dos atomos de H); Bpheid: bacteriofeoforbida a (el acido carboxflico con C-172 libre derivado de Bphe); Pd-Bpheid: Pd- bacteriofeoforbida a (el acido carboxflico con C-172 libre derivado de Bphe con un atomo central de Pd); PDT: terapia fotodinamica; Rodobacterioclorina: Bclorina que tiene un grupo -CH2CH2COOH en la posicion 17, un grupo COOh en la posicion 13, grupos metilo en las posiciones 2, 7, 12, 18 y grupos etilo en las posiciones 3 y 8.
Se usa la numeracion IUPAC de los derivados de Bchl a lo largo de la memoria descriptiva. Usando esta nomenclatura, las Bchl portan dos esteres de acido carboxflico en las posiciones 132 y 172, sin embargo, estan esterificadas en las posiciones 133 y 173
Antecedentes de la invencion
La terapia fotodinamica (PDT) es una tecnica no quirurgica para el tratamiento de canceres y otras enfermedades en las que la administracion de un agente fotosensibilizante no toxico (un farmaco que se activa mediante luz), que es captado por y retenido en un tumor u otro tejido que se vaya a tratar, va seguida de una irradiacion no peligrosa con luz de una longitud de onda concreta que genera especies de oxfgeno reactivo citotoxicas (oxfgeno singlete) in situ. Esta tecnica es mas selectiva que la quimioterapia y radioterapia convencional debido a la acumulacion preferencial de compuestos fotoactivables en el tejido tumoral y debido al suministro controlado de luz dirigido hacia el tumor que da lugar a efectos fotodinamicos confinados espacialmente.
Las porfirinas se han empleado como los principales agentes fotosensibilizantes en la clmica. La penetracion optima en tejidos de la luz se produce aparentemente a entre 650-800 nm, pero el porffmero sodico (Photofrin®, una marca comercial de Axcan Pharma Inc.), el primer agente de terapia fotodinamica aprobado en el mundo que se obtiene a partir de hematoporfirina-IX por tratamiento con acidos, y que ha recibido la aprobacion de la FDA para los canceres no microdticos esofagicos y endobronquiales, absorbe solo debilmente a aproximadamente 620 nm y es una mezcla compleja e inseparable de monomeros, dfmeros y oligomeros superiores. Ademas, Photofrin® y otros agentes fotosensibilizantes ensayados adolecen de varias deficiencias que limitan su aplicacion, incluyendo principalmente: (1) una absorcion relativamente debil en el intervalo espectral visible, lo que limita el tratamiento a tumores superficiales; (2) acumulacion y retencion del sensibilizante a largo plazo en la piel del paciente, dando lugar a una fototoxicidad prolongada en la piel (de dfas a meses); y (3) una diferenciacion pequena o incluso nula entre el efecto de la PDT en tejidos tumorales y no tumorales iluminados. Estos inconvenientes y problemas inherentes han dado como resultado grandes cantidades de trabajo dedicadas a la smtesis de compuestos puros individuales, los denominados sensibilizantes de "segunda generacion", que absorben a una longitud de onda larga, tienen estructuras bien definidas y muestran una mejor diferenciacion entre su retencion en celulas tumorales y su retencion en la piel u otros tejidos normales.
En la busqueda de moleculas sensibles a la luz adecuadas, o fotosensibilizantes, la bacterioclorofila parece tener ciertas ventajas frente a Photofrin®, el fotosensibilizante mas comun para terapia PDT. La bacteriofila, cuando se ilumina, puede hacer que la luz penetre mas hondo en el tejido, siendo de este modo mas eficaz para tumores mayores. El espectro, la fotoffsica y la fotoqmmica de Bchls nativa ha hecho que sean moleculas recolectoras de luz optimas con ventajas claras frente a otros agentes fotosensibilizantes usados en la actualidad o ensayados en el tratamiento PDT. En particular, estas moleculas tienen un elevadfsimo coeficiente de extincion a longitudes de onda largas (Amax=760-780 nm, e=(4-10)*104 M'1cm'1), donde la luz penetra profundamente en los tejidos. Tambien generan especies de oxfgeno reactivo (ROS) con un elevado rendimiento cuantico (dependiendo del metal central).
Se han estudiado la captacion biologica y la eficacia de la PDT de derivados sin metal de Bchl con el objetivo de manipular la afinidad de los sensibilizantes por el compartimento celular tumoral. Para esta estrategia, es crucial el uso de sustituyentes altamente lipofilos que, por un lado, pueden aumentar la acumulacion del farmaco en las celulas tumorales pero que, por otra parte, pueden dificultar su suministro a las celulas tumorales. Ademas, se debe evitar la acumulacion de niveles significativos de farmaco fototoxico en tejidos no tumorales durante periodos prolongados despues de administrar el farmaco.
En las Patentes de los Estados Unidos anteriores de los solicitantes US 5.726.169, US 5.955.585 y US 6.147.195,
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los inventores adoptaron un enfoque diferente. Se sintetizaron sensibilizantes antivasculares, que no se extravasan de la circulacion despues de la administracion y que tienen una corta vida en la sangre. Se esperaba que la diferencia inherente entre vasos de tejidos normales y anormales, tales como los tumores u otros tejidos que se apoyan en neovasos, posibilitana una destruccion relativamente selectiva del tejido anormal. Por lo tanto, se pretendfa sintetizar derivados de Bchl que sean mas polares y que por tanto tengan mayores probabilidades de permanecer en el compartimento vascular, donde transmiten el efecto fotodinamico primario. La manipulacion en el sitio 17 del resto de acido propionico de la Bchl nativa proporciono conjugados con diversos restos, tales como aminoacidos, peptidos o protemas, que potencian la hidrofilidad sensibilizante. Asimismo, se estudio la actividad de direccionamiento vascular de uno de estos derivados, la bacterioclorofilserina, debido a su rapida eliminacion de la circulacion y de todo el cuerpo del animal, la ausencia de fototoxicidad en la piel y su alto potencial curativo (Rosenbach-Belkin et al, 1996; Zilberstein et al., 1997; Zilberstein et al., 2001). Sin embargo, se observo que estos compuestos que contienen Mg son inadecuados para uso farmaceutico, debido a su baja estabilidad tras su almacenamiento prolongado.
Para aumentar la estabilidad de los derivados de Bchl, se reemplazo el atomo central de Mg por Pd en la ultima Publicacion PCT WO 00/33833 y la correspondiente Patente de los Estados Unidos n.° 6.569.846 del solicitante. Previamente se habfa demostrado que este atomo aumenta de manera destacada el potencial de oxidacion del macrociclo de Bchl y, a la vez, potencia en gran medida la tasa de cruzamiento intersistema (ISC) de la molecula con su estado de triplete. El reemplazo del metal se realizo mediante la incorporacion directa del ion Pd2+ en una molecula de Bpheid, tal como se describe en el documento WO 00/33833. Se observo que el primer derivado de Bchl sustituido con Pd, paladio-bacteriofeoforbida o Pd-Bpheid (Tookad®, una marca comercial de Steba Biotech), era altamente eficaz frente a diversos tumores solidos en estudios preclmicos (Schreiber et al., 2002; Gross et al., 2003; Koudinova et al., 2003; documento WO 03/094695) incluso contra tumores que comprenden celulas tumorales resistentes (Preise et al., 2003). La actividad antivascular de Pd-Bpheid posibilito la destruccion del tejido glandular prostatico en modelos de perro sin comprometer su continencia (Chen et al., 2002). Los ensayos clmicos de fase I/II demostraron que Pd-Bpheid es seguro para su uso en terapia fotodinamica de cancer de prostata en pacientes que fracasaron en la radioterapia (Elhilali, 2004) e induce necrosis y la reduccion del PSA (antfgeno espedfico de prostata) del tejido glandular vascularizado en pacientes de prostata tratados con luz terapeutica y dosis de farmaco (Trachtenberg, 2003).
Debido a su baja solubilidad en soluciones acuosas, el uso clmico de Pd-Bpheid requiere el uso de agentes solubilizantes, tales como Cremophor que pueden provocar efectos secundarios a altas dosis. Esto impulso a los inventores a concebir una nueva familia de derivados de Bchl, descritos en el documento PCT/IL03/00973 (WO 2004/045492), que consisten en el macrociclo de Bclorina que contiene un atomo de metal central di o trivalente y al menos dos restos anionicos. Estos compuestos de Bchl anionicos pueden administrarse por via intravenosa despues de su solubilizacion en soluciones acuosas sin excipientes anadidos. Su corto tiempo de vida en la circulacion, combinado con su accion relativamente rapida y una actividad antivascular elevadamente eficaz, demuestra su potencial como agentes de PTD antivasculares. De hecho, uno de estos derivados anionicos de Bchl se encuentra actualmente en estudios preclmicos para la PTD de la degeneracion macular asociada a la edad (AMD) y de tumores hepaticos, por ejemplo, hepatoma.
El documento DE 10154436 describe compuestos de pirobacteriofeoforbida para su uso en terapia fotodinamica, en que al menos uno de los grupos ceto en la posicion 3a o 13' del sistema de porfirina esta derivatizado a una imina correspondiente.
El documento WO 03/028629 describe derivados de clorofila que pueden contener grupos amonio o iminio cargados positivamente para terapia o diagnostico fotodinamico.
El documento WO 03/028628 describe macrociclos tetrapirrolicos que estan sustituidos con al menos un grupo funcional que comprende un grupo carbamato de la formula - OCON< u -OCON=C< y contienen opcionalmente grupos amonio o iminio cargados positivamente para terapia o diagnostico fotodinamico. Aunque las formulas generales desveladas en dicha publicacion incluyen derivados de bacterioclorofila, cabe destacar que no se han desvelado derivados de bacterioclorofila espedficos y la memoria descriptiva tampoco ensena la preparacion de derivados de bacterioclorofila.
El documento US 2003/0203888 desvela cromoforos de porfirina y basados en porfirina, tales como clorina y bacterioclorina. El documento WO 03/055887 desvela porfirina, clorina o bacterioclorina que contiene meso sustituyentes de conjugacion. El documento US 5.744.598 desvela iminas o porfirinas. El documento US 5.864.035 desvela derivados de isoimida de clorinas y bacterioclorinas. El documento US 2003/0050296 desvela porfirinas cargadas positivamente con nitrogenos cuaternizados. El documento WO 01/40232 desvela derivados de clorofila y bacterioclorofila. El documento WO 97/19081 desvela bacterioclorofilas metaladas.
Sena elevadamente deseable proporcionar nuevos derivados de bacterioclorofila que pudieran ser estables y que pudieran tener una afinidad potenciada para las celulas endoteliales para su uso en terapia fotodinamica y, en particular, en la fototerapia vascular dirigida (VTP).
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Compendio de la invencion
La presente invencion se refiere a un derivado de bacterioclorofila que contiene al menos un grupo cargado positivamente y/o al menos un grupo basico que se convierte a un grupo cargado positivamente en condiciones fisiologicas, siempre que dicho derivado de bacterioclorofila no tenga un grupo funcional que comprenda un grupo carbamato y, cuando el derivado de bacterioclorofila es una pirobacteriofeoforbida, el al menos un grupo basico que se convierte en un grupo cargado positivamente en condiciones fisiologicas no es un grupo imina en la posicion 3a o 131 de la molecula de bacterioclorofila.
El derivado de bacterioclorofila de la presente invencion es un compuesto de formula I desvelado anteriormente en la presente memoria en la memoria descriptiva.
La presente invencion tambien se refiere a composiciones farmaceuticas que comprenden un derivado de Bchl de formula I y un vetnculo farmaceuticamente aceptable, siendo estas composiciones utiles para terapia fotodinamica (PDT), particularmente para PDT vascular dirigida, por ejemplo para la PDT de tumores asf como para usos no oncologicos en el tratamiento de la degeneracion macular asociada a la edad (AMD), enfermedades cardiovasculares y enfermedades de la piel, tales como acne y psoriasis. Ademas, las composiciones pueden usarse para eliminar agentes infecciosos que comprenden bacterias Gram-negativas o Gram-positivas y virus in vivo o in vitro, asf como para fines diagnosticos.
La presente invencion se refiere ademas a un metodo mejorado de terapia fotodinamica usando un fotosensibilizante, en donde la mejora consiste en usar como fotosensibilizante un derivado de Bchl de formula I de la invencion. De acuerdo con este aspecto, la memoria descriptiva desvela un metodo de tratamiento mediante PDT que comprende administrar a un individuo que lo necesite una cantidad eficaz de un derivado de Bchl de la invencion, seguido de irradiacion local.
En una realizacion, el metodo de tratamiento mediante PDT puede comprender administrar a un individuo que padece un tumor una cantidad eficaz de un derivado de Bchl de la invencion, seguido de irradiacion local.
En otra realizacion, el metodo de tratamiento mediante PDT puede comprender administrar a un individuo que padece degeneracion macular asociada a la edad una cantidad eficaz de un derivado de Bchl de la invencion, seguido de irradiacion local.
En una realizacion mas, un metodo para prevenir o reducir la restenosis dentro de un stent puede comprender administrar a un individuo que padece una enfermedad cardiovascular que se ha sometido a angiograffa coronaria una cantidad eficaz de un derivado de Bchl de la invencion, seguido de irradiacion local.
La invencion se refiere ademas a un metodo mejorado para el diagnostico de tumores usando un fotosensibilizante, usando como fotosensibilizante un derivado de Bchl de la invencion. De acuerdo con este aspecto, un metodo de diagnostico de tumores puede comprender administrar a un individuo sospechoso de tener un tumor una cantidad eficaz de un derivado de Bchl de la invencion, seguido de irradiacion local, por ejemplo, alteracion con radiacion electromagnetica de diferentes longitudes de onda, incluyendo corta (por ejemplo, rayos X), media (por ejemplo, UV/VIS/IR cercano) para permitir una radiacion de frecuencia optica, o larga (por ejemplo, radiacion por radiofrecuencia) para posibilitar, por ejemplo, senales de resonancia paramagnetica nuclear o electronica.
La invencion proporciona ademas un metodo mejorado para eliminar celulas o agentes infecciosos que comprenden bacterias y virus, usando como fotosensibilizante un derivado de Bchl de la invencion. De acuerdo con este aspecto, la invencion se refiere a un metodo de esterilizacion de productos biologicos, por ejemplo, sangre, que comprende anadir a dicho producto biologico, por ejemplo, sangre, una cantidad eficaz de un derivado de Bchl de la invencion, seguido de irradiacion.
Breve descripcion de las figuras
Los diferentes compuestos ensayados en los Ejemplos de Referencia se representan en la siguiente descripcion de los dibujos por un numero en negrita y subrayado. Su identificacion completa se encuentra en la Lista de compuestos, al inicio de la seccion qrnmica en los ejemplos y en el apendice posterior.
La Fig. 1 muestra el espectro de emision de fluorescencia del compuesto 5 en metanol.
La Fig. 2 ilustra los espectros de absorcion del compuesto 5 en suero salino tamponado con fosfato (PBS) con concentraciones crecientes de seroalbumina humana (HSA). (Aex = 520 nm).
Las Figs. 3A-3C son graficas que muestran la fototoxicidad de los compuestos 5, 7, 9 y 11 en celulas endoteliales H5V. Fig. 3A: fototoxicidad despues de 90 min de incubacion de las celulas con concentraciones crecientes de los compuestos 5 y 11. Fig. 3B: fototoxicidad despues de 2 horas de incubacion con concentraciones crecientes de los compuestos 5, 7 y 9. Fig. 3C: fototoxicidad despues de 1-10 min de incubacion con el compuesto 5 (50 |jM). Las celulas se incubaron en la oscuridad con las concentraciones indicadas de los compuestos, se lavaron y se iluminaron durante 10 min (formas abiertas en las Fig. 3A-B, forma
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cerrada en la Fig. 3C) o mantenidas en la oscuridad (control de oscuridad, formas cerradas en las Fig. 3A-B). Se efectuaron determinaciones por triplicado y se muestran los experimentos representativos.
La Fig. 4 es una grafica que muestra la farmacocinetica del compuesto 5 en sangre de ratas Wistar. Despues de la inyeccion intravenosa (i.v.) del compuesto 5 (0,6 mg/kg), se recogieron muestras de sangre de la misma rata a los 0, 5, 10, 15, 20, 30, 45 min y a las 1, 2, 6, 24 h despues de la inyeccion y se registraron los espectros de emision de fluorescencia. Cada instante representa la media de tres ratas ± DTM.
Las Fig. 5A-5B muestran la biodistribucion del compuesto 5 en ratas Wistar. Las ratas se sacrificaron a los 30 min (Fig. 5A) o a las 24 horas (Fig. 5B) despues de la inyeccion i.v. del compuesto 5 (0,6 mg/kg), y se registraron los espectros de emision de fluorescencia de los organos indicados y se normalizaron a los datos farmacocineticos.
Las Fig. 6A-6C son fotograffas que muestran el efecto local de la PDT en ratones que portan xenoinjertos de glioma C6 y se trataron por via i.v. con el compuesto 5. Se trato a ratones desnudos CD1 macho con 0,3 mg/kg de 5 y se les ilumino con un laser de 755 nm (80 mW/cm2) durante 15 min. Fig. 6A: fotograffas del sitio tumoral en un animal tratado con PDT en los dfas 0, 4, 14, 21 y 32. Fig. 6B: fotograffas del sitio tumoral de ratones de control de oscuridad (a los que se inyecta 5 pero no se les ilumina) (n=3) en los dfas 0 y 10; Fig. 6C: fotograffas del sitio tumoral de ratones de control iluminados (a los que se inyecta un volumen de suero salino equivalente a la solucion de 5 y se les ilumina) (n=2) en los dfas 0 y 10.
La Fig. 7 muestra la probabilidad de supervivencia de ratones que portan xenoinjertos de glioma C6 tratados mediante PDT con compuesto 5. Se inyecto por via i.v. a ratones portadores de xenoinjertos de glioma C6 (n=17) con compuesto 5 (0,3 mg/g) y se les ilumino durante 15 min con una intensidad de luz de 80 mW/cm2 (grupo de tratamiento completo, n=12, cuadrados). Grupos de control: ratones portadores de tumores no tratados (n=2, drculos), control de oscuridad (n=3, rombos), control de luz (n=2, triangulos). * probabilidad de volumen tumoral <2 ml.
Las Fig. 8A-8D son graficas que muestran la fototoxicidad de un derivado de bacterioclorofila cargado negativamente (vease el Ejemplo 22) y compuesto 5 en bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Se incubaron bacterias Gram-positivas (St. albus, Fig. 8A, 8B) y Gram-negativas (E. coli, Fig. 8C, 8D) durante 1 hora con las concentraciones indicadas del derivado de bacterioclorofila cargado negativamente (Fig. 8A, 8C) o con compuesto 5 (Fig. 8B, 8D), y se iluminaron durante 15 min con 70 mW/cm2. La supervivencia bacteriana se determino mediante recuento de colonias. Se efectuaron determinaciones por triplicado y se muestran los experimentos representativos.
Las Fig. 9A-9E son graficas que muestran la biodistribucion de los compuestos 28, 32, 10, 36 y 75, respectivamente, en varios organos de ratones desnudos que portan xenoinjertos de carcinoma de celulas renales (RCC). Se inyecto a las ratas con una solucion del compuesto de ensayo en manitol isotonico (1,5 mg/kg) en diferentes momentos.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion proviene de la observacion por parte de los presentes inventores de que estudios precffnicos con Tookad® (Pd-Bpheid) y con un derivado hidrosoluble anionico de Bchl (descrito en el documento WO 2004/045492) demostro una alta eficacia en la PDT de varios tumores solidos, tales como xenoinjertos de melanoma, glioma y de prostata humana, prostata canina normal y sarcoma DS en modelos animales (Chen et al., 2002; Schreiber et al., 2002; Gross et al., 2003; Kelleher et al., 2003; Koudinova et al., 2003; Kelleher et al., 2003; Plaks et al, 2004) e indicaron que las celulas endoteliales, la matriz extracelular y posiblemente las plaquetas son candidatos probables para la accion fotodinamica primaria.
Con los derivados de Bchl anteriormente mencionados, no pudieron encontrarse pruebas de una accion directa de las especies de oxfgeno reactivo (ROS) formadas durante la iluminacion en las celulas tumorales (Gross et al., 2003). Por lo tanto, la elevada tasa de curacion parecfa indicar que la lesion fotodinamica del endotelio tumoral podna ser suficiente para proporcionar una respuesta tumoral completa. Siguiendo esta observacion, los inventores investigaron como potenciar la afinidad del fotosensibilizante por las celulas endoteliales y, en particular, a las celulas neoendoteliales, que son caractensticas de enfermedades tumorales y otras enfermedades dependientes de la vasculatura. Las dianas adecuadas se identificaron como cargas negativas elevadamente densas en el endotelio, incluyendo en las fenestraciones endoteliales, vesfculas recubiertas, la membrana plasmatica en sf y vesfculas (Simionescu et al., 1981; Ghinea y Simionescu, 1985; Hamblin et al., 1999), receptores de factor de crecimiento de fibroblastos (Segev et al., 2002), el glucocaliz endotelial (una malla altamente hidratada de proteoglucanos, glucosaminoglucanos, glucoprotemas y glucoffpidos cargados negativamente unidos a membrana, conteniendo algunos grupos sulfonicos), y celulas endoteliales angiogenicas (Thurston et al., 1998; Dellian et al., 2000). Ademas, publicaciones recientes indicaron que la exposicion aumentada de fosfoffpidos anionicos en la superficie del endotelio tumoral, por ejemplo, linfoma de Hodgkin, carcinoma de pulmon no microcftico humano, fibrosarcoma de raton, carcinoma de mama humano y melanoma (Ran et al., 2002). El numero aumentado de sitios anionicos en el endotelio tumoral proporciona una diana atractiva para la terapia tumoral.
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La presente invencion proporciona un derivado de bacterioclorofila de formula I:
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en donde
M representa 2H, un atomo de metal divalente seleccionado entre Pd, Pt, Co, Sn, Ni, Cu, Zn o Mn, o un atomo de metal trivalente seleccionado entre Fe, Mn, Co, Au, Al, Gd, Er, Yb o Cr;
R1 y R'2 cada uno independientemente es Y-R8, -NRgR'g o -N+RgR'gR"g A";
Y es O o S; R2 es H, OH o COORg;
R3 es H, OH, alquilo C1-C12 o alcoxi C1-C12;
R4 es -CH=CRgR'g, -CH=CRgHal, -CH=CH-CH2-NRgR'g, -CH=CH-CH2-N+RgR'gR"gA", -CHO, -CH=NRg, -CH=N+RgR'gA", -CH2-ORg, -CH2-SRg, -CH2-Hal, -CH2-Rg, -CH2-NRgR'g, -CH2-N+RgR'gR"gA", -CH2-CH2Rg, -CH2- CH2Hal,-CH2-CH2ORg, -CH2-CH2SRg, -CH2-CH2-NRgR'g, -CH2-CH2-N+RgR'gR"gA", -COCH3, C(CH3)=CRgR'g, -C(CH3)=CRgHal, -C(CH3)=NRg, -CH(CH3)=N+RgR'gA", -CH(CH3)-Hal, -CH(CH3)-ORg, -CH(CH3)-SRg, -CH(CH3)- NRgR'g, -CH(CH3)-N+RgR'g R'gA" o -CECRg; R5 es =O, =S, =N-Rg, =N+RgR'g A", =CRgR'g o =CRg-Hal;
cada R8, Rg, R'g y R"g es independientemente:
(a) H;
(b) hidrocarbilo C1-C25; preferiblemente alquilo C1-C25, mas preferiblemente alquilo C1-C10 o alquilo C1-C6, sin sustituir o sustituido con uno o mas radicales seleccionados entre:
(i) un grupo funcional seleccionado entre halogeno, nitro, oxo, OR, SR, epoxi, epitio, aziridina, -CONRR', -COR, COOR, -OSO3R, -SO3R, "SO2R, -NHSO2R, - SO2NRR', =N-OR, =N-NRR', -(CH2)n-NR-COR', -(CH2)n-CO-NRR', -O-(CH2)n-OR, -O-(CH2)n-O-(CH2)n-R, -PRR', -OPO3RR', "PO2HR o "PO3RR', en donde n es un numero entero de 1 a 6;
(ii) unos grupos cargados positivamente seleccionados entre: un grupo onio; un cation derivado de un grupo que contiene N seleccionado entre O-^N+(RR')-, >C=N+(RR'), -N+(RR'R"), -(R)N-N+(RR'R"), -(R)N- C(=HN)-N+RR'R", -C(=NH)-N+(RR'R"); un cation derivado de un compuesto heteroaromatico que contiene uno o mas atomos de N y opcionalmente atomos de O o S;
(iii) un grupo cargado negativamente seleccionado entre COO-, COS', -OSO3', -SO3', -OPO3R', -PO2H', -PO32' o -PO3R-;
(iv) un grupo basico que se convierte en unos grupos cargados positivamente en condiciones fisiologicas seleccionados entre -NRR', -C(=NR)-NR'R", -NR-NR'R", -(R)N-C(=NR)-NR'R", O^NR-, >C=NR o un radical heteroaromatico que contiene N;
(v) un grupo acido que se convierte en unos grupos cargados negativamente en condiciones fisiologicas seleccionados entre -COOH, -COSH, -SO3H y -PO3H2; o
(vi) un residuo de un aminoacido, un peptido, una protema, un monosacarido, un oligosacarido o un polisacarido;
(c) hidrocarbilo C1-C25, preferiblemente alquilo C1-C25, mas preferiblemente alquilo C1-C10 o C1-C6, que contiene uno o mas heteroatomos y/o uno o mas restos carbodclicos o heterodclicos y esta sustituido con uno o mas grupos funcionales como se ha definido en (b); o
(d) un residuo de un aminoacido, un peptido, una protema, un monosacarido, un oligosacarido o un
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polisacarido;
en donde cada R, R' y R" es independientemente H, hidrocarbilo, preferiblemente alquilo C1-C25, mas preferiblemente alquilo C1-C10 o C1-C6, o heterociclilo, o dos de R, R' y R" junto con el atomo de N al que estan unidos forman un anillo saturado de 3-7 miembros, que contiene opcionalmente uno o mas heteroatomos seleccionados entre O, S o N y estan opcionalmente sustituidos adicionalmente en el atomo de N adicional con alquilo opcionalmente sustituido con halogeno, hidroxilo o amino;
R8 puede ser adicionalmente H+ o un cation R+10 cuando R1 es Y-R8;
R+10 es amonio, un cation de un metal, preferiblemente de un metal alcalino o alcalinoterreo, tal como Na, K, Li, Ca, Ba o un cation derivado de un grupo que contiene N como se ha definido en (ii) anteriormente;
A" es un anion fisiologicamente aceptable;
m es 0 o 1; y
sales fisiologicamente aceptables e isomeros opticos del mismo;
con la condicion de que, cuando R2 y R3 son ambos H, R5 no sea =N-Rg y/o R4 no sea -C(CH3)=NRg; y con la condicion adicional de que el derivado de bacterioclorofila de formula I tenga al menos un grupo cargado positivamente y/o al menos un grupo basico que se convierta en un grupo cargado positivamente en condiciones fisiologicas.
Como de define en la presente memoria, A- es un anion fisiologicamente aceptable, tal como cloruro, bromuro, yoduro, perclorato, sulfato, fosfato o un anion organico, tal como acetato, benzoato, caprilato, citrato, lactato, malonato, mandelato, mesilato, oxalato, propionato, succinato, tosilato, y similares.
El termino "halogeno" se refiere a fluor, cloro, bromo o yodo.
La expresion "hidrocarbilo C1-C25", como se define para R8, Rg, R'g y R"g, representa un radical hidrocarbilo lineal o ramificado, saturado o insaturado, adclico o dclico, incluyendo aromatico, de 1-25 atomos de carbono, preferiblemente de 1 a 20, mas preferiblemente de 1 a 6, atomos de carbono.
En una realizacion preferida, el hidrocarbilo C1-C25 es un radical alquilo C1-C25 lineal o ramificado, preferiblemente C1-C10, y mas preferiblemente alquilo C1-C6, por ejemplo metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, terc- butilo, pentilo y hexilo. En otra realizacion, el grupo alquilo tiene 10 atomos de carbono o mas, por ejemplo -C10H21, - C15H31, -C16H33, -C17H35, -C18H37, -C20H41 y similares. Cuando R1 es -OR8, entonces R8 tambien puede ser el radical geranilgeranilo (2,6-dimetil-2,6-octadienilo) o fitilo (2,6,10,14-tetrametil-hexadec-14-en-16-ilo), grupos alquenilo que estan presentes en la posicion 173 de un compuesto de clorofila natural o bacterioclorofila.
El hidrocarbilo C1-C25 tambien puede ser un radical alquenilo o alquinilo C2-C25 lineal o ramificado, preferiblemente de 2-6 atomos de carbono, por ejemplo vinilo, prop-2-en-1-ilo, but-3-en-1-ilo, pent-4-en-1-ilo, hex-5-en-1-ilo, etinilo, propargilo, y similares.
El hidrocarbilo C1-C25 puede ser adicionalmente un cicloalquilo C3-C25 monodclico o polidclico, preferiblemente C3- C14, mas preferiblemente cicloalquilo C3-C7, tal como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y cicloheptilo;
un radical arilo monodclico o polidclico, preferiblemente un C6-C18, mas preferiblemente un arilo C6-C14, tal como fenilo, naftilo, carbazolilo, antrilo, fluorenilo, indanilo y fenantrilo; o
un radical aralquilo, en el que el radical arilo radical es preferiblemente un arilo C6-C18, mas preferiblemente un C6- C14, tal como fenilo o naftilo, y es mas preferiblemente bencilo o fenetilo.
Como se usa en la presente memoria, la expresion "resto carbodclico" se refiere a un compuesto monodclico o polidclico que contiene unicamente atomos de carbono en el anillo o anillos. El resto carbodclico puede ser saturado, es decir un cicloalquilo como se ha definido anteriormente, o insaturado, es decir cicloalquenilo, o aromatico, es decir un arilo como se ha definido anteriormente.
El termino "alcoxi", como se usa en la presente memoria, se refiere a un grupo alquil (C1-C25)-O-, en donde alquilo C1-C25 es como se ha definido anteriormente. Son ejemplos de alcoxi, metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, butoxi, isobutoxi, terc-butoxi, pentoxi, hexoxi, -OC15H31,-OC16H33, -OC17H35, -OC18H37, y similares. El termino "ariloxi", como se usa en la presente memoria, se refiere a un grupo aril (C6-C18)-O-, en donde arilo C6-C18 es como se ha definido anteriormente, por ejemplo, fenoxi y naftoxi.
Las expresiones "heteroarilo” o "resto heterodclico" o "heteroaromatico" o "heterociclilo", como se usa en la presente memoria, significan un radical derivado de un anillo heteroaromatico mono o polidclico que contiene de uno a tres heteroatomos seleccionados entre el grupo que consiste en O, S y N. Son ejemplos particulares pirrolilo, furilo, tienilo, pirazolilo, imidazolilo, oxazolilo, tiazolilo, piridilo, quinolinilo, pirimidinilo, 1,3,4-triazinilo, 1,2,3-triazinilo, 1,3,5-
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triazinilo, benzofurilo, isobenzofurilo, indolilo, imidazo[1,2-a]piridilo, benzoimidazolilo, benzotiazolilo y benzoxazolilo.
Cualquier "carbodclico", "arilo” o "heteroarilo” puede estar sustituido con uno o mas radicales, tales como halogeno, arilo C6-C14, alquilo C1-C25, nitro, OR, SR, -COR, -COOR, -SO3R, -SO2R, -NHSO2R, -NRR', -(CH2)n-NR-COR' y - (CH2)n-CO-NRR'. Debe apreciarse que cuando un anillo heteroaromatico polidclico esta sustituido, las sustituciones pueden estar en cualquiera de los anillos carbodclicos y/o heterodclicos.
Un "grupo cargado positivamente" como se usa en la presente memoria representa un cation derivado de un grupo que contiene N o de un grupo onio que no contiene N.
Un "cation derivado de un grupo que contiene N" como se emplea en esta memoria representa, por ejemplo, pero sin limitacion, un grupo amonio -N+(RR'R"), hidrazinio -(R)N-N+(R'R"), amoniooxi O-^N+(RR')-, iminio >C=N+(RR'), amidinio - C(=RN)-N+R'R" o guanidinio -(R)N-C(=NR)-N+R'R", donde cada uno de R, R' y R" es independientemente H, hidrocarbilo, preferiblemente alquilo C1-C6 segun se define en la presente memoria, fenilo o bencilo, o heterociclilo, o en el grupo amonio uno de R, R' y R" puede ser OH, o dos de R, R' y R" en el grupo amonio o R y R' en los grupos hidrazinio, amoniooxi, iminio, amidinio o guanidinio, junto con el atomo de N al que estan unidos, forman un anillo saturado de 3-7 miembros, que contiene opcionalmente uno o mas heteroatomos seleccionados entre el grupo que consiste en O, S o N y esta opcionalmente sustituido adicionalmente en el atomo de N adicional, o dicho cation se deriva de un compuesto que contiene uno o mas atomos de N en un anillo heteroaromatico.
En una o mas realizaciones preferidas, el derivado de bacterioclorofila contiene un grupo amonio de la formula - N+(RR'R"), en donde cada uno de R, R' y R" es independientemente H o hidrocarbilo opcionalmente sustituido o heterociclilo, segun se define en la presente memoria, o uno de ellos puede ser OH. El -N+(RR'R"), grupo amonio puede ser un amonio secundario, en donde dos cualesquiera de los radicales R, R' o R" son H; un amonio terciario, en donde solo uno de R, R' o R" es H; o un amonio cuaternario, en donde cada uno de R, R' o R" es un grupo hidrocarbilo o heterociclilo opcionalmente sustituido segun se define en la presente memoria. Cuando uno de R, R' o R" es OH, el grupo es un grupo hidroxilamonio. Preferiblemente, el grupo amonio es un grupo amonio cuaternario donde cada R, R' y R" es alquilo C1-C6, tal como metilo, etilo, propilo, butilo, hexilo. Como se ha mencionado anteriormente en la presente memoria, el grupo amonio puede ser un grupo terminal en la molecula o puede encontrarse dentro de una cadena de alquilo en la molecula.
En los grupos hidrazinio -(R)N-N+(R'R"), amidinio -C(=NR)-N+R'R" y guanidinio -(R)N-C(=NR)-N+R'R", cada R, R' y R" puede ser independientemente H o hidrocarbilo o heterociclilo, o R' y R" junto con el atomo de N al que estan unidos, forman un anillo saturado de 3-7 miembros, segun se define en la presente memoria. Los ejemplos de tales grupos incluyen aquellos donde R es H, y cada R' y R" es alquilo C1-C6, tal como metilo, etilo, propilo, butilo, hexilo.
En los grupos amoniooxi O^N+(RR')- e iminio >C=N+(RR'), cada R y R' puede ser independientemente H o hidrocarbilo, preferiblemente alquilo C1-C6 o heterociclilo, o R y R', junto con el atomo de N al que estan unidos, forman un anillo saturado de 3-7 miembros, segun se define en la presente memoria.
En otra realizacion preferida, el derivado de bacterioclorofila contiene un grupo amonio dclico de la formula - N+(RR'R"), en donde dos de R, R' y R" junto con el atomo de N forman un anillo saturado de 3-7 miembros definido mas adelante en la presente memoria.
Segun se define en esta memoria, "un anillo saturado de 3-7 miembros" formado por dos de los R, R' y R" junto con el atomo de N al que estan unidos puede ser un anillo que contiene unicamente N, tal como aziridina, pirrolidina, piperidina, piperazina o azepina, o puede contener un heteroatomo adicional seleccionado entre O y S, tal como morfolina o tiomorfolina. El atomo de N adicional en el anillo de piperazina puede estar opcionalmente sustituido con alquilo, por ejemplo alquilo C1-C6, que puede estar sustituido con halo, OH o amino. Los grupos onio derivados de dichos anillos saturados incluyen aziridinio, pirrolidinio, piperidinio, piperazinio, morfolinio, tiomorfolinio y azepinio.
Segun se define en la presente memoria "un cation derivado de un radical heteroaromatico que contiene N" representa un cation derivado de un compuesto N-heteroaromatico que puede ser un compuesto mono o polidclico que contiene opcionalmente O, S o atomos de N adicionales. El anillo del cual se deriva del cation debe contener al menos un atomo de N y ser aromatico, pero el otro anillo o anillos, si los hubiera, pueden estar parcialmente saturados. Los ejemplos de cationes N-heteroaromaticos incluyen pirazolio, imidazolio, oxazolio, tiazolio, piridinio, pirimidinio, quinolinio, isoquinolinio, 1,2,4-triazinio, 1,3,5-triazinio y purinio.
El al menos un grupo cargado positivamente tambien puede ser un grupo onio que no contiene nitrogeno, tal como, pero si limitacion, un grupo fosfonio [-P+(RR'R")], arsonio [-As+(RR'R")], oxonio [-O+(RR')], sulfonio [-S+(RR')], selenonio [-Se+(RR')], teluronio [-Te+(RR')], estibonio [-Sb+(RR'R")], o bismutonio [-Bi+(RR'R")], en donde cada uno de R, R' y R" es independientemente H, hidrocarbilo o heterociclilo, preferiblemente alquilo C1-C6, tal como metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo o hexilo, o arilo, preferiblemente, fenilo.
Los ejemplos de grupos fosfonio de la formula -P+(RR'R") incluyen grupos donde cada R, R' y R" es metilo, etilo, propilo, butilo o fenilo, o R es metilo, etilo, propilo, butilo o hexilo y R' y R" son ambos fenilo. Los ejemplos de grupos arsonio de la formula -As+(RR'R") incluyen grupos donde cada R, R' y R" es metilo, etilo, propilo, butilo o fenilo. Los ejemplos de grupos sulfonio de la formula -S+(Rr') incluyen grupos donde cada R y R' es metilo, etilo, propilo, butilo,
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fenilo, bencilo, fenetilo o un grupo hidrocarbilo sustituido.
Segun se define en la presente memoria, "un grupo basico que se convierte en un grupo cargado positivamente en condiciones fisiologicas" es, al menos teoricamente, cualquier grupo basico que generara en condiciones fisiologicas un grupo cargado positivamente segun se define en la presente memoria. Debe senalarse que las condiciones fisiologicas, como se usan en la presente memoria, no se refieren unicamente al suero, sino a diferentes tejidos y compartimentos celulares en el cuerpo.
Los ejemplos de tales grupos basicos que contienen N incluyen, sin limitacion, cualquier grupo amino que generara un grupo amonio, cualquier grupo imina que generara un grupo imino, cualquier grupo hidrazina que generara un grupo hidrazinio, cualquier grupo aminooxi que generara un grupo aminooxi, cualquier grupo amidina que generara un grupo amidinio, cualquier grupo guanidina que generara un grupo guanidinio, todos segun se definen en la presente memoria. Otros ejemplos incluyen grupos fosfino y mercapto.
Por lo tanto, el derivado de bacterioclorofila de la invencion puede contener al menos un grupo basico que se convierte en un grupo cargado positivamente en condiciones fisiologicas, tal como -NRR', -C(=NR)-NR'R", -NR- NR'R", -(R)N-C(=NR)-NR'R", O-^NR- o >C=NR, en donde cada uno de R, R' y R" es independientemente H, hidrocarbilo, preferiblemente alquilo C1-C25, mas preferiblemente alquilo C1-C10 o C1-C6, o heterociclilo, o dos de R, R' y R" junto con el atomo de N forman un anillo saturado de 3-7 miembros, que contiene opcionalmente un atomo de O, S o N y esta opcionalmente sustituido adicionalmente en el atomo de N adicional, o el grupo basico es un radical heteroaromatico que contiene N.
El anillo saturado de 3-7 miembros puede ser aziridina, pirrolidina, piperidina, morfolina, tiomorfolina, azepina o piperazina opcionalmente sustituido en el atomo de N adicional con alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con halo, hidroxilo o amino, el radical heteroaromatico que contiene N puede ser pirazolilo, imidazolilo, oxazolilo, tiazolilo, piridilo, quinolinilo, isoquinolinilo, pirimidilo, 1,2,4-triazinilo, 1,3,5-triazinilo o purinilo.
Segun se define en la presente memoria, R+10 puede ser amonio, un cation de un metal, preferiblemente de un metal alcalino o alcalinoterreo, tal como Na, K, Li, Ca, Ba, o un cation organico segun se define en la presente memoria para "un cation derivado de un grupo que contiene N".
Segun se define en la presente memoria, "un grupo cargado negativamente" es un anion derivado de un acido e incluye carboxilato (COO-), tiocarboxilato (COS'), sulfonato (SO3') y fosfonato (PO32'), y el "grupo acido que se convierte en un grupo cargado negativamente en condiciones fisiologicas" incluye los grupos de acido carboxflico (- COOH), tiocarboxflico (-COSH), sulfonico (-SO3H) y fosfonico (-PO3H2). Se han descrito derivados de bacterioclorofila con estos radicales en el documento WO 2004/045492 del mismo solicitante.
Segun se define en la presente memoria, cada R8, R9 y R'9 puede ser independientemente un hidrocarbilo C1-C25 que contiene opcionalmente uno o mas heteroatomos, restos carbodclicos o heterodclicos. Por ejemplo, el hidrocarbilo C1-C25 puede ser un alquilo C1-C25 o alquenilo C2-C25 lineal o ramificado que puede estar interrumpido por uno o mas heteroatomos seleccionados entre O, S y/o N, y/o puede estar interrumpido y/o sustituido con uno o mas restos carbodclicos, por ejemplo cicloalquilo C3-C7 o arilo C6-C14, o heterodclicos, como se ha definido anteriormente.
Segun se define en la presente memoria, el hidrocarbilo C1-C25 definido para R8, R9 y R'9 puede estar opcionalmente sustituido con uno o mas grupos funcionales seleccionados entre halogeno, nitro, oxo, OR, SR, epoxi, epitio, aziridina, -CONRR', -COR, COOR, -OSO3R,-SO3R, -SO2R, -NHSO2R, - SO2NRR' -NRR', =N-OR, =N-NRR', - C(=NR)-NRR',-NR-NRR', -(R)N-C(=NR)-NRR', O^NR-, >C=NR, -(CH2)n-NR-COR', -(CH2)n-CO-NRR', -O-(CH2)n-OR, -O-(CH2)n-O-(CH2)n-R, -PRR', -OPO3RR', -PO2HR, - PO3RR'; uno o mas grupos cargados negativamente, tales como COO-, COS-, -OSO3- - SO3-, -OPO3R-, -PO2H -PO32 y -PO3R-; y/o uno o mas grupos cargados positivamente, tales como -P+(RR'R"), -As+(RR'R"), -O+(RR'), -S+(RR'),-Se+(RR'), -Te+(RR'), -Sb+(RR'R"), -Bi+(RR'R"), O^N+(RR')-, >C=N+(RR'), - N+(RR'R"), -(R)N-N+(RR'R"), -(R)N-C(=HN)-N+RR'R", -C(=NH)-N+(RR'R"), o un cation N- heteroaromatico, tal como pirazolio, imidazolio, oxazolio, tiazolio, piridinio, quinolinio, pirimidinio, 1,2,4-triazinio, 1,3,5-triazinio y purinio; en donde n es un numero entero de 1 a 6, cada R, R' y R" es independientemente H, hidrocarbilo o heterociclilo, o dos de R, R' y R" junto con el atomo de N al que estan unidos, forman un anillo saturado de 3-7 miembros, que contiene opcionalmente uno o mas heteroatomos seleccionados entre el grupo que consiste en O, S o N y esta opcionalmente sustituido adicionalmente en el atomo de N adicional. El hidrocarbilo C1- C25 definido para R8, R9 y R'9 tambien puede estar sustituido con el residuo de un mono, oligo o polisacarido, tal como glicosilo, o de un aminoacido, peptido o protema. Ademas, cada R8, R9 y R'9 puede ser independientemente un residuo de un mono, oligo o polisacarido, tal como glicosilo, o de un aminoacido, peptido o protema.
En los grupos OR y SR, cuando R es H, estan representados los grupos hidroxi y mercapto, respectivamente, y cuando R es distinto de H, estan representados eteres y sulfuros. En el grupo -PRR', se representa el grupo fosfino cuando R y R' son H. En el grupo -COR, cuando R es H, se representa el grupo formilo -CHO de un aldehudo, mientras que cuando R es distinto de H, este es el residuo de una cetona, tal como grupos alquilcarbonilo y arilcarbonilo. En el grupo COOR, cuando R no es H, este es un grupo ester de acido carboxflico, tal como los grupos alcoxicarbonilo y ariloxicarbonilo. De forma analoga, se representan esteres en los grupos -OSO3R, -SO3R, -SO2R, -
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OPO3RR', -PO2HR y -PO3RR' cuando R y R' son distintos de H.
En una realizacion preferida, R1 en el compuesto de formula I, es un grupo -OR8 donde R8 es un alquilo C1-C6 sustituido con un grupo funcional terminal cargado positivamente, mas preferiblemente, un grupo -N+RR'R", lo mas preferiblemente, - N+(CH3)3.
En una realizacion de la invencion, R8, Rgy/o R'9 pueden ser el residuo de un aminoacido, un peptido o una protema. En una realizacion preferida, R1 en la posicion 173 es -OR8, donde R8 es el residuo de un aminoacido que contiene un grupo hidroxi libre, tal como serina, treonina o tirosina o un alquilo, por ejemplo metilo, ester del mismo, o un peptido que contiene tal aminoacido o derivado del mismo, estando unidos dicho aminoacido hidroxilado o derivados del mismo o peptido al grupo -COO" del derivado de Bchl a traves de su grupo hidroxi. Son ejemplos de tales derivados de aminoacidos y peptidos, metil ester de L-serina, metil ester de L-tirosina y metil ester de seril serina.
En otra realizacion preferida, el grupo -NR9R9 es el residuo de un aminoacido que contiene un grupo amino libre, tal como arginina y lisina, o un peptido que los contiene, o un derivado de alquil ester de dicho aminoacido o peptido, unido al -CO en la posicion 133 y/o 173 de la molecula de Bchl a traves de un enlace de amida. En estos compuestos, el atomo de N del grupo -NR9R9 se obtiene a partir del grupo amino libre del aminoacido.
En una realizacion mas, el grupo hidrocarbilo C1-C25 puede estar sustituido con un residuo de aminoacido y, si el grupo amino terminal del aminoacido esta libre, el residuo de aminoacido puede ser la fuente del grupo cargado positivamente en condiciones fisiologicas.
R+10 puede ser un cation monovalente o divalente derivado de un metal alcalino o alcalinoterreo, tal como K+, Na+, Li+, NH4+, Ca+, mas preferiblemente K+; o este es un cation derivado de una amina.
Como se usa en la presente memoria, la expresion "derivado cationico de bacterioclorofila" significa una bacterioclorofila que contiene uno o mas grupos cargados positivamente y/o uno o mas grupos basicos que se convierten en grupos cargados positivamente en condiciones fisiologicas. La molecula de bacterioclorofila tambien puede tener grupos neutros y/o uno o mas grupos cargados negativamente y/o uno o mas grupos acidos que se convierten en grupos cargados negativamente en condiciones fisiologicas. La carga total de la molecula de bacterioclorofila no es importante.
En una realizacion mas preferida, la invencion proporciona un derivado de Bchl de la formula I en donde M es Pd, R2 es -COOCH3, R3 es H, R4 es -COCH3, R5 es =O, y Ri es -OR8, en donde R8 es un residuo de un aminoacido que contiene un grupo hidroxi, preferiblemente serina, o un derivado del mismo, preferiblemente un alquilo, mas preferiblemente metilo, ester o un peptido que contiene dicho aminoacido o derivado del mismo, residuo de aminoacido en el cual el grupo amino puede estar cuaternizado en forma de un grupo trimetilamonio. Un ejemplo de tal derivado de formula I es el compuesto desginado en la presente memoria 13.
Los compuestos de la invencion; tambien denominados en la presente memoria algunas veces mediante los terminos "pigmentos" y "sensibilizantes", presentan una polaridad lo suficientemente alta como para ser hidrosolubles e inyectarse en soluciones acuosas sin tensioactivos anadidos. Estos compuestos forman pequenos agregados en soluciones de H2O/PBS pero sufren monomerizacion en presencia de seroalbumina al ser adsorbidos sobre la protema (Mazor et al, 2003). Por lo tanto, el transito de los compuestos al interior y exterior de diferentes celulas es dependiente de la seroalbumina.
Como un ejemolo de referencia, se muestran en la presente memoria la farmacocinetica y la biodistribucion para el compuesto preferido 5 y, basandose en estas, se supone que estos y otros derivados de la invencion permanecen en la circulacion y durante un periodo de tiempo muy corto. Ademas, tal como se muestra en la Fig. 3C en la presente memoria, el compuesto 5 alcanza una eficacia de PDT muy elevada tras menos de 5 minutos de incubacion con cultivos de celulas endoteliales. Por lo tanto, los derivados de la invencion son buenos sensibilizantes para la PTD vascular dirigida. El tratamiento de xenoinjertos de glioma C6 en ratones, tal como se muestra en la presente memoria en las Fig. 6 y 7, demuestra que 5 es fotodinamicamente activo y provoca la erradicacion tumoral a concentraciones 10 veces menores que Pd-Bpheid (desvelado en el documento WO 00/33833) o la sal de 13'-(2-sulfoetil)amida dipotasica de Pd 31-oxo-l5-metoxicarbonilmetil-Rhodobacterioclorina cargada negativamente (desvelado en el documento WO 2004/045492). El protocolo sugerido con el compuesto 5 tomo en consideracion el corto tiempo de eliminacion del farmaco (Fig. 4). Basandose en su elevada fototoxicidad y su efecto selectivo en la vasculatura tumoral, estos compuestos pueden usarse para el tratamiento de tumores asf como otras anomalfas tisulares que dependen de la neovascularizacion y tambien contra bacterias Gram-positivas y Gram-negativas.
La presente invencion proporciona adicionalmente una composicion farmaceutica que comprende un derivado de BChl de la invencion o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo y un vehmulo farmaceuticamente aceptable.
Los nuevos compuestos de Bchl de la invencion tienen caractensticas de absorcion optica y fotoffsicas similares a las de Pd-Bchls cargado negativamente, desvelado en el documento PCT/IL03/00973 (wO 2004/045492) y muy similares a las de Pd-Bpheid (WO 00/33833) y por lo tanto, una vez que residen en el tejido tratado, se espera que sean agentes fotodinamicos eficaces. Por lo tanto, pueden ser utiles como fotosensibilizantes y como agentes
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terapeuticos y diagnosticos en muchas indicaciones.
En una realizacion, los compuestos de la invencion son utiles en el campo oncologico para el tratamiento mediante PDT de estados precancerosos y de varios tipos de canceres, tales como, pero sin limitacion, melanoma, de prostata, cerebro, colon, ovario, mama, tumores de la pared toracica que surgen a partir de canceres de mama, piel, pulmon, esofago y vejiga y otros tumores sensibles a hormonas. Los compuestos son utiles para el tratamiento de tumores tanto primarios como metastasicos.
En otra realizacion, los compuestos de la invencion son utiles en areas no oncologicas. Aparte de la destruccion eficaz de celulas no deseadas, tales como neoplasias y tumores, mediante PDT, los compuestos de la invencion tambien pueden usarse contra celulas y bacterias en proliferacion. Las celulas en proliferacion y los vasos sangumeos son la causa principal de la arteriosclerosis, la artritis, la psoriasis y la degeneracion macular. Ademas, los compuestos pueden usarse en el tratamiento de tumores no malignos, tales como la hipertrofia benigna de prostata.
En una realizacion preferida, los compuestos de la invencion pueden usarse en PDT para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, principalmente para la oclusion de vasos y la trombosis en enfermedades de las arterias coronarias, la hiperplasia de la mtima, la restenosis y las placas ateroscleroticas. En una realizacion mas preferida, los compuestos de la invencion son para su uso para prevenir o reducir la restenosis dentro de un stent en un individuo que padece una enfermedad cardiovascular que se ha sometido a una angiograffa coronaria. En otra realizacion preferida, los compuestos de la invencion son para su uso en un metodo para el tratamiento de la aterosclerosis mediante la destruccion de la placa ateromatosa en un vaso sangumeo enfermo.
En otra realizacion preferida, los compuestos de la invencion pueden usarse en PDT para el tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones dermatologicas, tales como acne, cicatrices por acne, psoriasis, pie de atleta, verrugas, queratosis actmica y manchas en vino de Oporto (malformaciones de pequenos vasos sangumeos que conectan las venas a las arterias (capilares) localizados en los niveles superiores de la piel).
En otra realizacion preferida, los compuestos de la invencion pueden usarse en PDT para el tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones oftalmicas, tales como la neovascularizacion corneal y coroidal y, mas preferentemente, en la degeneracion macular asociada a la edad (AMD).
En una realizacion preferida adicional, los compuestos de la invencion pueden usarse en PDT para la eliminacion de microorganismos, incluyendo virus, hongos y bacterias en muestras y tejidos vivos. Por ejemplo, pueden usarse para la esterilizacion de productos biologicos, tales como la sangre y es plasma sangumeo para transfusion, seguido de destruccion por irradiacion de agentes infecciosos. Tal como se muestra en la presente memoria, el compuesto de referencia 5 es activo frente a bacterias Gram-positivas y Gram-negativas (Fig. 8).
Los nuevos derivados de Bchl hidrosolubles segun la invencion sensibilizan a las celulas endoteliales y/o neoplasicas o a otros tejidos anormales y provocan su destruccion mediante la irradiacion ya sea in vivo o ex vivo usando luz de una longitud de onda adecuada. Se cree que la energfa de fotoactivacion se transfiere al oxfgeno endogeno y lo convierte en oxfgeno singlete y/u otras especies reactivas de oxfgeno (ROS), tales como radicales superoxido e hidroxilo, que se consideran responsables del efecto citotoxico. Ademas, las formas fotoactivadas de algunas de estas Bchl fluorescen, ayudando dicha fluorescencia en la localizacion de tumores u otro sitios a los que se administran las Bchl.
Debido a su tiempo de retencion relativamente corto en la circulacion, los compuestos de la invencion son particularmente adecuados para la PDT vascular dirigida (VTP), tal como se ha descrito anteriormente para Pd- Bpheid (Tookad®, una marca comercial de Steba Biotech) por los inventores y por otros (documento WO 03/094695; Borle et al. 2003) y por los inventores para bacterioclorofila-serina (Zilberstein et al., 2001). En la VTP, la actividad antitumoral del derivado de bacteriofila no depende de la fotointoxicacion directa de celulas endoteliales individuales sino de la respuesta del tejido vascular a la lesion por la VTP. Por lo tanto, con Tookad, los inventores han demostrado que la fotosensibilizacion de Tookad mediante iluminacion transcutanea guiada por fibra optica poco tiempo despues de su inyeccion intravenosa da como resultado un dano vascular tumoral oxidativo y el agotamiento de oxfgeno, dando lugar a la detencion del suministro sangumeo y a la erradicacion del tumor.
En este aspecto, la invencion tambien preve el uso de los compuestos de la invencion en hipertermia y PDT combinadas para el tratamiento de tumores, tal como se ha descrito anteriormente (Kelleher et al., 2003).
Las cargas positivas de los compuestos de la invencion potencian significativamente la absorcion de las nuevas Bchl en el endotelio tumoral tal como se conoce en la tecnica para otros farmacos cargados positivamente que se usan para terapia o para la obtencion de imagenes de tumores (Dellian et al. 2000; Hashizume et al. 2000; Campbell et al. 2002). La afinidad potenciada reduce drasticamente la concentracion necesaria para la induccion de la muerte celular con tiempos cortos de incubacion, segun sea necesario para la PDT vascular dirigida. Por lo tanto, estos compuestos permiten la generacion de especies de oxfgeno reactivo (ROS) tras la excitacion que estan limitadas a los vasos internos y, de este modo, causan la respuesta selectiva de los vasos anormales, tales como aquellos presentes en tumores y en la degeneracion macular asociada a la edad.
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Los derivados de Bchl de la presente invencion tienen elevada afinidad por la seroalbumina. Un porcentaje significativo de las moleculas de compuesto estan unidas de manera no covalente a seroalbumina en el plasma. Por lo tanto, despues de la purificacion y antes de la inyeccion, les permiten interactuar con seroalbumina a una relacion de ~1:1 en solucion acuosa.
Para la preparacion de las composiciones farmaceuticas, las Bchl de la invencion pueden estar liofilizadas, por ejemplo, con manitol y el polvo seco se solubiliza en suero salino o cualquier otra solucion acuosa farmaceuticamente aceptable para la inyeccion i.v. a un paciente (en la sangre, el compuesto se adsorbe a la seroalbumina) o para la aplicacion en una muestra diana in vitro. La preparacion de las composiciones se lleva a cabo mediante tecnicas bien conocidas en la tecnica, por ejemplo, tal como se resume en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., Easton, Pa, 1990.
Para fines diagnosticos, los derivados de Bchl pueden usarse solos o pueden marcarse con un radioisotopo u otro medio de deteccion, tal como metales paramagneticos, tal como se conoce en la tecnica. En una realizacion, el derivado de Bchl se marca radiactivamente mediante procedimientos convencionales, por ejemplo, usando 67Ga,
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In, Tl, mTc, y se administra al paciente, preferentemente, mediante inyeccion i.v. Pueden obtenerse imagenes de la ubicacion del cancer mediante procedimientos convencionales, durante un determinado intervalo de tiempo despues de su administracion.
La cantidad de derivado de Bchl que se va a administrar para la terapia PDT se establecera por el medico experto segun la experiencia acumulada con otros derivados de Bchl usados en PDT y variara dependiendo de la eleccion del derivado usado como principio activo, de la afeccion que se vaya a tratar, del modo de administracion, de la edad y estado del paciente y del criterio del medico.
La longitud de onda de la luz irradiante se selecciona preferentemente para que coincida con la absorbancia maxima del fotosensibilizador de Bchl. Puede determinarse facilmente la longitud de onda adecuada para cualquiera de los compuestos a partir de su espectro de absorcion. En una realizacion preferida, se usa una fuente de luz fuerte, mas preferiblemente laseres a 720-790 nm.
Tambien se preve por la presente invencion la conjugacion de protemas, tales como seroalbumina, seroalbumina recombinante, incluyendo seroalbumina humana y estructuras quimericas de seroalbumina humana (tal como se describe en Tuan et al. 2002), hormonas, factores de crecimiento o sus derivados, anticuerpos, peptidos que se unen espedficamente a receptores de celulas diana, en particular, receptores de celulas endoteliales y nutrientes, por ejemplo, tirosina, al resto de Bchl, con el fin de aumentar sus tiempos de retencion en tumores y sitios tratados. Al tener los derivados de Bchl la absorcion optica maxima en el infrarrojo cercano se posibilita una mayor profundidad de penetracion, a la vez que se mantiene la ubicuidad del sistema natural.
Se espera que el reemplazo del ion de Mg por otros iones metalicos optimice la estabilidad intrmseca y metabolica del resto de Bchl y su cruce intersistema al estado de triplete excitado, tambien expandiendo de este modo las posibilidades para nuevos procedimientos diagnosticos.
La combinacion de grupos perifericos cargados positivamente y/o de anticuerpos neoendoteliales y/o de peptidos que tienen elevada afinidad para las celulas endoteliales dirigira preferencialmente a los restos de Bchl al tumor o sitio tratado. Como resultado, se espera que la concentracion del fotosensibilizante en el compartimento vascular del tejido maligno aumente drasticamente en relacion a su concentracion en el tejido normal, donde las celulas estan mas dispersas, asegurando de este modo la amplificacion del efecto de la PDT en el sitio tumoral. Esto posibilita el uso eficaz de dosis de luz menores que el umbral de dano del tejido normal, reduciendo de este modo la necesidad de una irradiacion espacialmente bien definida.
En una realizacion mas preferida de la presente invencion, la diana para el tratamiento con los sensibilizantes de la invencion son los vasos sangumeos anormales, en particular, vasos sangumeos de tumores solidos, de la degeneracion macular asociada a la edad, la restenosis, la inflamacion aguda o la aterosclerosis (Dougherty y Levy, 2003), debido a la diferencia inherente de la sensibilidad de los vasos normales y anormales a los protocolos de PDT sugeridos descritos en la presente memoria.
Los derivados de Bchl de la invencion pueden usarse ademas en terapia fotodinamica como adyuvante para otra terapia actual usada para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afeccion, para hacerla mas eficaz. Por ejemplo, pueden usarse de manera intraoperatoria en combinacion con cirugfa para ayudar a prevenir la recurrencia del cancer en grandes areas superficiales, tales como la pleura (revestimiento del pulmon) y el peritoneo (revestimiento del abdomen), sitios comunes de diseminacion de algunos tipos de cancer, en el tratamiento intraoperatorio de los carcinomas de cabeza y cuello recidivantes o despues de la angioplastia de la arteria femoral para prevenir la restenosis. Los compuestos tambien pueden usarse en el diagnostico tumoral de PDT intraoperatoria, por ejemplo, de tumores cerebrales.
Otra posibilidad segun la invencion es usar los compuestos de la invencion en la PDT de grandes tumores solidos mediante terapia intersticial, una tecnica que implica introducir fibra optica directamente en tumores usando agujas guiadas por tomograffa computarizada (TC). Esto puede ser especialmente util en areas que requieran una cirugfa extensa, tales como en tumores de cabeza y cuello.
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La cantidad de compuesto que se va a administrar y la ruta de administracion se determinaran segun el tipo de enfermedad, el estado de la enfermedad, la edad y el estado de salud del paciente, pero sera mucho menor que la dosificacion usada actualmente de Photofrin II® (aproximadamente 5-40 mg HpD/kg de peso corporal) o Tookad® (aproximadamente 2-10 mg/kg de peso corporal).
Las composiciones farmaceuticas de la invencion se administran al paciente mediante procedimientos convencionales usados en PDT, por ejemplo, de manera sistemica, particularmente mediante inyeccion, mas preferentemente mediante inyeccion intravenosa, localmente mediante inyeccion directa en el tumor solido o topicamente para el tratamiento de enfermedades y afecciones cutaneas.
Ahora la invencion se ilustrara mediante los siguientes Ejemplos no limitantes.
Ejemplos
Por conveniencia y mejor comprension, la seccion de los Ejemplos se divide en dos subsecciones: (I) la Seccion Qrnmica, que describe la smtesis del derivado de Bchl cationico y basico 13 y los compuestos de referencia e intermedios 4-12 y 14-75, y (II) la Seccion Biologica, que describe la actividad biologica de los nuevos derivados de Bchl.
I SECCION QUiMICA
En los Ejemplo en la presente memoria, los derivativos (4-75) y los intermedios (1-3) se presentaran mediante sus numeros arabigos respectivos en negrita y subrayados de acuerdo con la siguiente Lista de Compuestos y el Apendice. Las formulas de algunos de los compuestos aparecen en los Esquemas 1 y 2.
Lista de Compuestos
1. Bacterioclorofila a (Bchl a)
2. Bacteriofeoforbida a (Bpheid)
3. Pd-Bacteriofeoforbida a (Pd-Bpheid)
4. 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131,173-di(2-amino etil)amida [Ejemplo 1]
5. sal dicitrato de 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131,173-di(2=N3-tri-metilamonioetil)amida [Ejemplo 2]
6. 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131,173-di(3-aminopropil)amida [Ejemplo 3]
7. sal dicitrato de 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131,173-di(3-N3-trimetilamoniopropil)amida [Ejemplo 4]
8. 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131,173-di(6-aminohexil)amida [Ejemplo 5]
9. sal dicitrato de 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131,173-di(6-N3-trimetilamoniohexil)amida [Ejemplo 6]
10. Paladio 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131,173-di(2-aminoetil)amida [Ejemplo 7]
11. Sal difosfato de paladio 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131,173-di(2-N3- trimetilamonioetil)amida [Ejemplo 8]
12. Sal cloruro de paladio 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-N3-trimetilamonioetil)amida [Ejemplo 9]
13. Sal yoduro de ester metilico de O-[Pd-Bpheid]-[N3-trimetilamonio-2-metil]-Serina [Ejemplo 11]
14. Paladio 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131,173-di(2-guanidinoetil)amida [Ejemplo 12]
14a. Paladio 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131,173-di(2-trimetilguanidinioetil)amida [Ejemplo 12]
15. Sal citrato de Pd 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-S2-dimetilsulfoniumetil)amida [Ejemplo 13]
16. 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131,173-di(2-hidroxietil)amida [Ejemplo 14]
17. Sal dicitrato de 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131,173-di(2-P3-trimetilfosfonioetil)amida [Ejemplo 15]
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18. 31-Oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131,173-di(2-dimetilfosfinoetil)amida [Ejemplo 16]
19. Sal dicitrato de 31-Oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131,173-di(2-As3-trimetilarsonioetil)amida [Ejemplo 17]
20. 31-(aminoetilimino)-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacteriodorina 131,173-di(2-aminoetil)amida
21. Paladio 31-(aminoetilimino)-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131,173-di(2-aminoetil)amida
22. 31-(trimetilamonioetilimino)-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131,173-di(2-trimetilamonioetil)amida
23. Paladio 31-(trimetilamonioetilimino)-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131,173-di(2- trimetilamonioetil)amida
Materiales y Metodos
(i) Se preparo Bpheid, 2, como se ha descrito previamente (Wasielewski y Svec, 1980).
(ii) Se preparo Paladio bacteriofeoforbida (Pd-Bpheid, 3) como se ha descrito previamente (documento WO 00/33833) o se obtuvo de Steba Biotech Ltd. a traves de Negma-Lerads, Francia.
(iii) Se adquirieron diaminas (etilendiamina, 1,3-propilendiamina, 1,6-hexilendiamina) y trimetilfosfina (solucion 1 M) de Aldrich (Estados Unidos); Se adquirio N-hidroxisuccinimida (NHS) de Sigma (Estados Unidos); Se adquirieron 1,3-diciclohexilcarbodiimida (DCC) e hidrocloruro de 1-amidinopirazol de Fluka (Suiza); Se adquirio trimetil arsina de Sterm. Se preparo (2-aminoetil)dimetil fosfina de acuerdo con Suzuki et al. (1994) y Kinoshita et al. (1981). Se preparo diacetato de S,S-dimetilcisteamina de acuerdo con el documento US 3.793.370.
(iv) Generalmente se usaron productos qmmicos y disolventes de calidad analttica excepto al realizar HPLC, donde se aplicaron disolventes de calidad de HPLC.
(v) TLC: placas de sflice (Kieselgel-60, Merck, Alemania); cloroformo-metanol (4:1, v/v).
(vi) Se registraron espectros de resonancia magnetica nuclear de 1H (RMN) en un instrumento Avance DPX 250 (Bruker, Francia) y se indicaron en ppm (6) campo abajo a partir de tetrametilsilano, con picos de disolvente residual como patrones internos.
(vii) Los coeficientes de extincion de los derivados de Pd se determinaron correlacionando la concentracion de Pd (usando fotometna de llama con PdCl2 como patron) con la densidad optica de la solucion examinada a la longitud de onda particular.
(viii) Se registraron espectros de masas de ionizacion por electronebulizacion (ESI-MS) en un espectrometro a Platform LCZ (Micromass, Inglaterra).
(ix) Se realizo espectrometna de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) para la determinacion de concentraciones de Pd usando un instrumento ELAN-6000 (Perkin Elmer, CT).
(x) Se registraron espectros de absorcion optica (UV-VIS) de los diferentes complejo con espectrofotometros Genesis-2 (Milton Roy, Inglaterra) y V-570 (jAsCO, Japon).
(xi) Se realizo HPLC usando un instrumento LC-900 (JASCO, Japon) equipado con un detector de matriz de diodos UV-915.
Ejemplos quimicos
Ejemplo 1. [Compuesto de referencia] 31-Oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131,173-di(2- aminoetil)amida (compuesto 4)
Segun se representa en el Esquema I, para la smtesis del compuesto 4 (un derivado de rodobacterioclorina en el que el atomo de metal central esta ausente), se activo en primer lugar Bpheid 2 en el acido carboxflico C-173 mediante N-hidroxisuccinimida (NHS) de la siguiente manera: Se mezclaron 50 mg de Bpheid (compuesto 2), 80 mg de NHS y 65 mg de 1,3-diciclohexilcarbodiimida (DCC) en cloruro de metilo durante una noche a temperatura ambiente. Despues, el disolvente se evaporo a presion reducida, el residuo seco se disolvio en cloroformo (aprox. 50 ml), se retiro por filtracion del material y, despues de la evaporacion del disolvente, se obtuvo el producto, Bpheid- 173-(1-oxi-succinimida). La conversion fue aproximadamente un 95 % (TLC).
Se disolvieron ocho mg (8 mg) de Bpheid-173-(1-oxi-succinimida) en una mezcla de cloroformo y metanol (2:1, v:v), para posibilitar la apertura del anillo isodlico de Bpheid y se anadio etilendiamina (1 ml). La mezcla de reaccion se trato con argon durante 10 min y se agito a temperatura ambiente durante una noche la oscuridad, para posibilitar la union de etilendiamina en ambas posiciones 131 y 173. Despues, la mezcla de reaccion se evaporo a sequedad al vado, se redisolvio en cloroformo (50 ml) y se lavo una vez con agua (aproximadamente 50 ml) para desechar las
5
10
15
20
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30
35
trazas de etilendiamina. La solucion de cloroformo que contema el producto se recogio y se evaporo, obteniendo as^ el compuesto 4.
ESI-MS (+): 713,89 (M+1), 357,56 ([M+2]/2).
Absorcion optica en cloroformo, A (absorcion relativa): 753 (1,00), 522 (0,28), 354 (1,05) nm.
Ejemplo 2. [Compuesto de referencia] Sal dicitrato de 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina
131,173-di(2-N3-trimetilamomoetM)amida (compuesto 5)
El Compuesto 5 se preparo a partir del compuesto 4, como se representa en el Esquema I. Se anadieron diisopropiletilamina (DlEA) (27 pl) y yoduro de metilo (30 pl, CH3I) a una solucion de 4 (3 mg) en 2 ml de cloroformo. La mezcla de reaccion se trato con argon durante 10 min y se agito durante una noche a temperatura ambiente en la oscuridad. El producto se extrajo dos veces con agua (aproximadamente 50 ml). La capa acuosa se recogio y se evaporo, y el producto se purifico por HPLC (HPLC JAsCO, Japon). Columna: C-8 250*20 (YMC, Japon). Disolvente A: tampon citrato 0,05 M, pH 4,0. Disolvente B: acetonitrilo. En la Tabla 1 se describe el perfil de elucion del compuesto del tftulo 5 en forma de la sal dicitrato. El espectro de emision de fluorescencia del compuesto 5 en metanol se muestra en la Fig. 1.
Tabla 1. Perfil de purificacion en gradiente del compuesto 5
Tiempo (min)
Flujo (ml/min) % de A % de B
0
5 100
0
15
5 0 100
17
5 0 100
22
5 100 0
30
0,2 100 0
ESI-MS (+): 990,12 (M-citrato).
RMN en MeOH-d4: 9,33 (5-H, s), 8,92 (10-H, s), 8,75 (20-H, s), 5,35 y 4,95 (151-CH2, a), 4,0-4,4 (7,8, 1,7, 18-H, m), 3,80 (153-Me, s a), 3,52 (21-Me, s), 3,19 (121-Me, s), 3,09 (32-Me, s), 1,92-2,41, 1,60-1,75 (171, 172-CH2, m), 2,19 (8-
CH2, m), 1,91 (71-Me, d), 1,61 (181-Me, d), 1,09 (8 NHCH2CH2NMea)
-Me, t), 3,62, 3,05 (CH2 de NHC^C^NMea), 3,39 y 3,02 (Me de
Absorcion optica en agua, A (absorcion relativa): 753 (1,00), 519 (0,30), 354 (1,25) nm. La proporcion de reparto de octanol/agua es 40/60.
Ejemplo 3. [Compuesto de referencia] 31-Oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131,173-di (3- aminopropil)amida (compuesto 6)
El compuesto 6 se obtuvo como ha descrito en el Ejemplo 1 anterior por reaccion de Bpheid-173-(1-oxi-succinimida) con 1,3-propilenodiamina.
ESI-MS (+): 813,86 (M+NH2CH2CH2CH2NH2), 739,74 (M).
Absorcion optica en cloroformo, A (absorcion relativa): 753 (1,00), 522 (0,29), 354 (1,22) nm.
Ejemplo 4. [Compuesto de referencia] Sal dicitrato de 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina
131,173-di (3-N3-trimetilamoniopropil)amida (compuesto 7)
El compuesto 7 se obtuvo a partir del compuesto 6 por reaccion con DIEA y CH3I como se ha descrito en el Ejemplo 2 anterior.
ESI-MS (+): 413,62 ([M-2*citrato]/2). La proporcion de reparto de octanol/agua es 50/50.
Absorcion optica en agua, A (absorcion relativa): 753 (1,00), 519 (0,29), 354 (1,21) nm.
Ejemplo 5. [Compuesto de referencia] 31-Oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131,173-di(6- aminohexil)amida (compuesto 8)
El compuesto 8 se obtuvo como ha descrito en el Ejemplo 1 anterior por reaccion de Bpheid-173-(1-oxi-succinimida) con 1,6-hexilendiamina. Caractensticas del compuesto 8:
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20
25
30
35
40
45
ESI-MS (+): 826,20 (M+2), 413,62 ([M+2]/2)
Ejemplo 6. [Compuesto de referencia] Sal dicitrato de 31 *-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina l31,173 -di(6-N3-trimetilamoniohexil)amida (compuesto 9)
El compuesto 9 se obtuvo a partir del compuesto 8 por reaccion con DIEA y CH3I como se ha descrito en el Ejemplo 2 anterior.
ESI-MS (+): 455,89 ([M-2xcitrato]/2). La proporcion de reparto de octanol/agua es 75/25.
Absorcion optica en agua, A (absorcion relativa): 753 (1,00), 519 (0,30), 354 (1,31) nm.
Ejemplo 7. [Compuesto de referencia] Pd 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131,173-di(2- aminoetil)amida (compuesto 10)
El compuesto 10 se obtuvo por reaccion de Pd-Bpheid-173-(1-oxi-succinimida) con etilendiamina como se ha descrito en el Ejemplo 1 anteriormente.
ESI-MS (+): 817,59 (M+1), 409,26 ([M+2]/2)
Absorcion optica en MeOH (absorcion relativa): 747 (1,00), 516 (0,13), 384 (0,41), 330 (0,50) nm.
Ejemplo 8. [Compuesto de referencia] Sal difosfato de Pd 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina
131,173-di(2-N3-trimetilamonioetil)amida (compuesto 1_1)
El compuesto 1_1 se obtuvo a partir del compuesto 10 por reaccion con DIEA y CH3I como se ha descrito en el Ejemplo 2 anterior pero usando tampon fosfato (0,05 M, pH 5,0) como Disolvente A en la etapa de purificacion de HPLC.
ESI-MS (+): 451,38 ([M-2 x fosfato]/2).
Absorcion optica en agua, A (absorcion relativa): 747 (1,00), 516 (0,13), 384 (0,41), 330 (0,50) nm.
Ejemplo 9. [Compuesto de referencia] Sal cloruro de Pd 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-N3-trimetilamonioetil)amida (compuesto 12)
Segun se representa en el Esquema I, el compuesto 3, Pd-Bpheid (10 mg), se agito con sal hidrocloruro de cloruro de 2-N3-trimetilamonio-etilamina (15 mg) en DMF (2 ml), en presencia de trietilamina (0,5 ml) en una atmosfera de argon a temperatura ambiente durante una noche, abriendo asf el anillo isodclico de la molecula de Bpheid. Despues, la mezcla de reaccion se evaporo a sequedad y el producto se extrajo con acetonitrilo. Despues de la evaporacion del disolvente, el compuesto 12 se purifico por HPLc en condiciones similares a la purificacion de 5 en el Ejemplo 2.
ESI-MS (+): 839 (M-Cl + Na-H), 817,82 (M-Cl) m/z.
Absorcion optica en agua, A (absorcion relativa): 747 (1,00), 516 (0,13), 384 (0,41), 330 (0,50) nm.
Ejemplo 10. Ester metilico de O-[Pd-Bpheid]-serina
Este compuesto se sintetizo de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento US 6.333.319, de la siguiente manera: El compuesto 3, Pd-Bpheid (50 mg), N-Tritil-L-Ser metil ester (200 mg), DCC (16 mg, 0,08 mmol) y N-dimetilaminopiridina (DMAP) (10 mg) se disolvieron en 20 ml de diclorometano y se agitaron durante una noche a temperatura ambiente en condiciones atmosfericas inertes (argon). El ester resultante se purifico por cromatograffa en columna sobre sflice, con cloroformo como eluyente. El grupo protector de tritilo se retiro anadiendo acido trifluoroacetico a la solucion de cloroformo (a una concentracion final de 1 % vol) durante 1-3 min, la mezcla de reaccion se lavo con agua, se seco sobre sulfato sodico anhidro y se evaporo a sequedad. El producto desprotegido se purifico en una columna de sflice de la siguiente manera: primero, el subproducto principal se retiro por elucion con acetona a 5 % en cloroformo, y despues el producto, O-[Pd-Bpheid]-Ser metil ester, se eluyo con metanol a 2 % en cloroformo.
1H RMN en CDCh: 9,21 (s, 1H, H-a), 8,54 (s, 1H, H-P), 8,48 (s, 1H, H-8), 5,93 (s, 1H, H-10), 4,37 (m, 2H, H-3,8), 4,22 (m, 1H, Ser-CH), 4,10 (m, 2H, H-4,7), 3,88 (s, 3H, CH3-10b), 3,67 (s, 3H, Ser-OCH3), 3,63 (m, 2H, Ser-CH2), 3,48 (s, 3H, CH3-1a), 3,39 (s, 3H, CH3-5a), 3,09 (s, 3H, CH3-2b), 2,48 (m, 1H, Ser-OH), 2,15-2,30 (m, 4H, CH2- 7a,7b), 2,11 (m, 2H, CH2-4a), 1,78 (d, 3H, CH3-3a), 1,68 (d, 3H, CH3-8a), 1,08 (t, 3H, CH3-4b).
Ejemplo 11. Sal yoduro de ester metilico de O-[Pd-Bpheid]-[N3-trimetilamonio-2-metil]-serina (compuesto 13)
El ester medico de O-[Pd-Bpheid]-Ser obtenido en el Ejemplo 10 anteriormente (4 mg) se disolvio en cloroformo (3 ml) y se agito con yoduro de metilo (35 pl) y DIEA (30 pl) durante una noche a temperatura ambiente. El producto 13 se obtuvo mediante evaporacion de la mezcla de reaccion y purificacion sobre una columna de sflice con cloroformo-
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30
35
40
45
metanol (3:1, v:v) como eluyente.
ESI-MS (+): 872,75 (M-I) m/z.
Absorcion optica en agua, A (absorcion relativa): 747 (1,00), 516 (0,13), 384 (0,41), 330 (0,50) nm.
Ejemplo 12. [Compuesto de referencia] Pd 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131,173-di(2- guanidinoetil)amida (compuesto 14).
Segun se representa en el Esquema I, se mezclo Pd 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131,173-di(2- aminoetil)amida, compuesto 10 (8 mg), con DIEA (30 jl) y 1-amidinopirazol (6 mg) en cloroformo-metanol (1:1, 15 ml). Despues de agitar a temperatura ambiente durante 20 h, la mezcla de reaccion se evaporo y el compuesto del tftulo 14 se purifico por HPLC en condiciones similares a la purificacion del 4 en el Ejemplo 1.
ESI-MS (+): 451,69 ([M-2xcitrato]/2).
Mediante reaccion del compuesto 14 con yoduro de metilo, se obtiene la paladio 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil- Rodobacterioclorina 131,173-di(2-trimetilguanidinioetil)amida cargada positivamente (14a).
Ejemplo 13. [Compuesto de referencia] Sal citrato de Pd 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131-(2-S2-dimetilsulfoniumetil)amida (compuesto 15)
Se agito Pd-Bpheid, 3 (12 mg) con diacetato de S,S-dimetilcisteamina (20 mg) en DMF (2 ml), en presencia de trietilamina (0,5 ml) y en una atmosfera de argon. La mezcla de reaccion se evaporo a sequedad, y el compuesto del tftulo 15 se purifico por HPLC, en condiciones como se han descrito para el compuesto 5 en el Ejemplo 2.
ESI-MS (+): 844,78 (M - citrato + Na - H), 820,62 (M - citrato) m/z.
Ejemplo 14. [Compuesto de referencia] 31-Oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131,173-di(2- hidroxietil)amida (compuesto 16)
Se hizo reaccionar Bpheid-173-(1-oxi-succinimida) (10 mg), obtenida como se describe en el Ejemplo 1, con etanolamina (1 ml) en una mezcla de cloroformo-metanol (6 ml). La mezcla de reaccion se trato con argon durante 10 min y se agito a temperatura ambiente durante una noche en la oscuridad. El compuesto 16 se obtuvo tras purificacion sobre una columna de sflice y elucion con cloroformo-metanol (10:1, vol/vol).
ESI-MS (+): 737,88 (M+Na), 715,42 (M+H) m/z.
Ejemplo 15. [Compuesto de referencia] Sal dicitrato de 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina
131.173- di(2-P-trimetilfosfomoetil)amida (compuesto 17)
El compuesto 16 (8 mg) se disolvio en anhfdrido trifluoroacetico (1 ml) y la mezcla se evaporo a sequedad despues de 30 min. El producto seco se disolvio en una solucion de trimetilfosfina en tetrahidrofurano (0,5 mM, 2 ml), y la mezcla se agito en una atmosfera de argon a temperatura ambiente durante 24 h. La mezcla de reaccion se evaporo para retirar el exceso de trimetilfosfina y el compuesto del tftulo 17 se obtuvo tras purificacion por HPLC, en las condiciones descritas para la purificacion de 5 en el Ejemplo 2.
ESI-MS (+): 438,54 ([M-2 * citrato]/2+Na-H), 416,46 ([M-2 * citrato]/2) m/z.
Ejemplo 16. [Compuesto de referencia] 31-Oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina 131,173-di(2- dimetilfosfinoetil)amida (compuesto 18)
Se hizo reaccionar Bpheid-173-(1-oxi-succinimida) (10 mg), obtenida como se describe en el Ejemplo 1, con (2- aminoetil)dimetilfosfina (200 mg) en cloroformo (5 ml) a temperatura ambiente durante una noche. El compuesto del tftulo 18 se purifico sobre una columna de sflice y se eluyo con cloroformo-acetona (15:1, vol/vol).
ESI-MS (+): 825,34 (M+Na), 803,88 (M+H) m/z.
El tratamiento del compuesto 18 con yoduro de metilo en presencia de DIEA condujo a un producto que tema un grupo fosfonio cuaternario que, despues de purificacion por HPLC, se encontro identico al compuesto 17 obtenido en el Ejemplo 15 anteriormente.
Ejemplo 17. [Compuesto de referencia] Sal dicitrato de 31-Oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorina
131.173- di(2-As3-trimetilarsonioetil)amida (compuesto 19)
El compuesto 16 (8 mg) se disolvio en anhfdrido trifluoroacetico (1 ml) y la mezcla se evaporo a sequedad despues de 30 min. El producto seco se disolvio en una solucion de trimetilarsina en tetrahidrofurano (solucion 0,5 mM, 2 ml; preparado a partir de reactivo puro, N.° Cat. 33-3750, Strem), y la mezcla se agito en una atmosfera de argon a 45 °C, durante 3 dfas. Despues, la mezcla se evaporo para retirar el exceso de trimetilarsina, y el producto del tftulo 19 se purifico por HPLC, en condiciones como se han descrito para la purificacion de 5 en el Ejemplo 2.
5
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25
30
35
40
45
ESI = MS (+): 1133,94 ([M-citrato]+Na-H), 460,40 ([M-2 * citrato]/2) m/z.
de paladio 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil- mpuesto 24)
La sal cloruro de este compuesto se describe en el Ejemplo 9 (compuesto 12).
Para la preparacion del compuesto del tftulo, se agitaron 20 mg de Pd-Bpheid, 3 (28 pmol), 24 mg de hidrocloruro de cloruro de (2-aminoetil)trimetilamonio (137 pmol) y ascorbato sodico (1 pmol) a temperatura ambiente en 1 ml de una mezcla desgasificada al vado de 1:1 de trietilamina en DMF en una atmosfera de argon. Al final, la mezcla de reaccion se evaporo al vado a temperatura ambiente, se anadio 1 ml de agua y el producto se cargo en una columna Sep-Pak RP-18 (Waters), se lavo en primer lugar con 20 ml de agua, despues con 10 ml de una solucion a 10 % de acetonitrilo en agua, despues se luyo con una solucion a 50 % de acetonitrilo en agua y se evaporo. Todo el tratamiento se realizo en la caja de guantes en una atmosfera de nitrogeno para evitar la oxidacion.
Estructura de formula: C40H54N6O6Pd + 1 CH3COO"
Peso molecular: 821,3 + 59,0
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 13,05 min.
M.S (+): m/z = 821
espectro UV-Vis: 756 nm, 532 nm, 386 nm, 328 nm
Ejemplo 19. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetil-Rodobacterioclorin-131-(2-N2- dimetilaminoetil)amida (compuesto 25)
Se agitaron 20 mg de Pd-Bpheid, 3 (28 pmol) y 1 ml (8,66 mmol) de N,N-dimetil etilendiamina (95 %), a temperatura ambiente durante 2 horas en una atmosfera de argon. Al final de la reaccion, la mezcla se diluyo con 3 ml de agua y se neutralizo con acido acetico glacial. El producto se purifico por HPLC preparativa, columna C-18, fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min
Estructura de formula: C3gH50N6O6Pd + 1 CH3COOH
Peso molecular: 803,3 + 60,0
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 14,46 min.
M.S (+): m/z = 803
espectro UV-Vis (MeOH): 748 nm, 521 nm, 384 nm, 332 nm
Ejemplo 20. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetil-Rodobacterioclorin-131-(3-N2- dimetilaminopropil)amida (compuesto 26)
Se agitaron 20 mg de Pd-Bpheid, 3 (28 pmol) y 1 ml (7,88 mmol) de 3-dimetilamino-1-propilamina (99%), a temperatura ambiente durante 2 horas en una atmosfera de argon. Al final de la reaccion, la mezcla se diluyo con 5 ml de agua y se neutralizo con acido acetico glacial. El producto se purifico por HPLC preparativa, columna C-18, fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C40H52N6O6Pd + 1 CH3COOH
Peso molecular: 817,30 + 60,0
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 14,26 min.
M.S (+): m/z = 817
espectro UV-Vis (MeOH): 749 nm, 516 nm, 380 nm; 334 nm
Ejemplo 21. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetil-Rodobacterioclorin-131-(2-[(2- aminoetil)amino]etil)amida (compuesto 27)
Ejemplo 18. [Compuesto de referencia] Acetato Rodobacterioclorm-13-(2-N3-trimetilamomoetil)amida (sal) (
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Se agitaron 20 mg de Pd-Bpheid, 3 (28 pmol) y 2 ml (18,35 mmol) de dietilenotriamina (99%), a temperatura ambiente durante 3 horas en una atmosfera de argon. La mezcla se diluyo con 5 ml de agua y acido acetico glacial. El producto se purifico por HPLC preparativa, columna C-18, fase movil: A 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 %
Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C3gH5iN7O6Pd + 2 CH3COOH Peso molecular: 818,3 + 120,1
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 12,91 min.
M.S (+): m/z = 818.
espectro UV-Vis (MeOH): 752 nm, 519 nm, 380 nm, 334 nm.
Ejemplo 22. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetN-Rodobacterioclorm-131-([2- bis(2-aminoetil)amino]etil)amida (compuesto 28)
Se agitaron 20 mg (28 pmol) de Pd-Bpheid, 3 con 1 ml (6,7 mmol) de tris-(2-aminoetil)amina en 1 ml de N-metil-2- pirrolidona a temperatura ambiente en una atmosfera de argon durante 90 minutos. El producto se purifico por inyeccion en HPLC, que contema una columna C-18. Fase movil: A = acido acetico a 0,2% en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C41H56NsO6Pd+ 3 CH3COOH
Peso molecular: 861,4 + 180,1
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
M.S (+): m/z = 861.
espectro UV-Vis (MeOH): 750 nm, 516 nm, 354 nm.
Ejemplo 23. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetN-Rodobacterioclorm-131-(2- morfolmo-N-etN)amida (compuesto 29)
Se agitaron 20 mg de Pd-Bpheid, 3 (28 pmol) y 1 ml (7,5 mmol) de N-(2-aminoetil)morfolina (98 %), a temperatura ambiente durante 4 horas en una atmosfera de argon. Al final de la reaccion, la mezcla se diluyo con 3 ml de agua y se neutralizo con acido acetico glacial. El producto se purifico por HPLC preparativa, columna C-18, fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C41H52N6O7Pd + 1 CH3COOH
Peso molecular: 845,3 + 60,0
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 15,68 min.
M.S (+): m/z = 845.
espectro UV-Vis (MeOH): 749 nm, 516 nm, 383 nm, 331 nm.
Ejemplo 24. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetN-Rodobacterioclorm-131-(2- piperazino-N-etil)amida (compuesto 30)
Se agitaron 20 mg de Pd-Bpheid, 3 (28 pmol) y 0,5 ml (3,7 mmol) de 1-(2-aminoetil)piperazina (97 %), a temperatura ambiente durante 19 horas en una atmosfera de argon. Al final de la reaccion, la mezcla se diluyo con 1 ml de agua y se neutralizo con acido acetico glacial. El producto se purifico por HPLC preparativa, columna C-18, fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 30 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C41H53NzO6Pd + 2 CH3COOH
Peso molecular: 844,3 + 120,1
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
se neutralizo con = acido acetico a de B (30-33 min).
Tiempo de retencion: 14,37 min.
M.S (+): m/z = 844
espectro UV-Vis (MeOH): 747 nm, 516 nm, 380 nm, 330 nm
Ejemplo 25. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetil-Rodobacterioclorm-131-(2-[(2- 5 N-dietilammoetN)ammo]etM)amida (compuesto 31)
Se agitaron 20 mg de Pd-Bpheid, 3 (28 pmol) y 1 ml (2,66 mmol) de N,N-dietildietilenotriamina (98 %), a temperatura ambiente durante 4 horas en una atmosfera de argon. Al final de la reaccion, la mezcla se diluyo con 1 ml de agua y se neutralizo con acido acetico glacial. El producto se purifico por HPLC preparativa, columna C-18, fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 30 % de B (0-6 min) a 95 % de B 10 (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C43H5gNyO6Pd + 2 CH3COOH
Peso molecular: 874,4 + 120,1
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 13,77 min.
15 M.S (+): m/z = 874
espectro UV-Vis (MeOH): 742 nm, 513 nm, 380 nm, 330 nm
Ejemplo 26. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetil-Rodobacterioclorm-131-(3-[(3- aminopropil)amino]propil)amida (compuesto 32)
Se agitaron Pd-Bpheid 3 (30 mg, 420 pmol) y bis(3-aminopropil)amina (3 ml, 20,61 mmol) a temperatura ambiente 20 durante 2 horas en una atmosfera de argon. Despues de la finalizacion de la reaccion (TLC) la mezcla de reaccion se diluyo con agua (100 ml) y la solucion se extrajo con n-butanol (dos veces, con 100 y 50 ml, respectivamente) en un embudo de separacion. El extracto butanolico se lavo tres veces con 50 ml de agua. La separacion de fases se mejoro anadiendo porciones de 10 ml de una solucion acuosa a 25 % de NaCl. El extracto butanolico se seco con MgSO4 y se evaporo a presion reducida. El solido se redisolvio en acido acetico acuoso a 10 % (10 ml) y el producto 25 se precipito mediante la adicion de un volumen de diez veces de acetona. El precipitado se redisolvio en acido acetico acuoso a 0,5 % (13 ml) y se liofilizo.
Estructura de formula: C41R53N7O6Pd + 2 CH3COOH
Peso molecular: 846,5 +120,1
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
30 Tiempo de retencion: 13,63 min.
M.S (+): m/z = 846
espectro UV-Vis (MeOH): 752 nm, 519 nm, 380 nm, 334 nm.
Ejemplo 27. [Compuesto de referencia] Sal diacetato de paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetil- Rodobacterioclorin-131,173-di(2-N3-trimetilamonioetil)amida (compuesto 33)
35 La sal difosfato de este compuesto se describe en el Ejemplo 8 (compuesto 1_1)
Para la preparacion del compuesto del tftulo, se agitaron 101 mg de Pd-Bpheid, 3 (141 pmol) y 10 ml de etilendiamina (148 mmol), a temperatura ambiente durante 2 horas en una atmosfera de argon. Despues, se introdujo en la reaccion una solucion de 659 mg de reactivo de acoplamiento hexafluorofosfato de bromo-tris- pirrolidino-fosfonio (PyBroP) (1,4 mmol) en 2,3 ml de cloroformo. La mezcla se agito durante 2 horas mas a 40 temperatura ambiente en una atmosfera de argon. Despues, la reaccion se enfrio y el exceso de reactivo de acoplamiento se destruyo anadiendo 5 ml de agua. La mezcla se diluyo con 250 ml de cloroformo y se lavo con 200 ml de agua. La fase organica se seco sobre MgSO4, se filtro y se evaporo. Se obtuvieron aproximadamente 245 mg del compuesto 10.
El compuesto 10 (245 mg) se disolvio en 90 ml de cloroformo. La mezcla de reaccion se desgasifico con argon 45 durante aproximadamente 5 min antes de introducir diisopropiletil amina (DIEA) (2,6 ml, 14,88 mmol). Despues de una agitacion de 5 min, se introdujo CH3I (2 ml, 31,8 mmol) en la reaccion. Se paso una corriente lenta de argon durante 2 min mas. La reaccion se agito a temperatura ambiente en la oscuridad durante una noche.
5
10
15
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25
30
35
40
45
Despues de este periodo se paso una corriente moderada de argon a traves de la solucion de reaccion para retirar el CH3I sin reaccionar. El disolvente se evaporo y el producto restante se disolvio en 350 ml de agua y se lavo (4 x 100 ml) con acetato de etilo. La solucion acuosa se concentro por evaporacion de agua a un volumen final de 150 ml.
El producto se purifico con porciones de 50 ml de solucion acuosa en una columna Sep-Pack, se prelavo inicialmente con 120 ml de agua y 200 ml de acido acetico acuoso a 1 %, mediante elucion con 5 ml de acetonitrilo, que contema soluciones a 2 % de acido acetico en acetonitrilo de varias separaciones, se combinaron y el disolvente se evaporo. El producto purificado se redisolvio en 3 ml de agua y se liofilizo.
Formula: C45H66N8O5Pd + 2 CH3COO
Peso molecular: 904,4 + 118,1
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 11,35min.
M.S (+): m/z = 904
espectro UV-Vis (MeOH): 747 nm, 514 nm, 382 nm, 330 nm
Ejemplo 28. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetN-Rodobacterioclorm-131,173- di(3-aminopropil)amida (compuesto 34)
Se agitaron 20 mg de Pd-Bpheid, 3 (28 pmol) y 2 ml (23,7 mmol) de 1, 3-diaminopropano recien destilado, a temperatura ambiente durante 75 min, en una atmosfera de argon. Despues de este periodo, se introdujo en el recipiente de reaccion una solucion de 138,8 mg de PyBroP (297 pmol) en 200 pl de cloroformo. La mezcla se agito durante 30 min mas a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. Despues, la reaccion se enfrio y el exceso de reactivo de acoplamiento se destruyo anadiendo 1 ml de agua. La mezcla se diluyo con 50 ml de cloroformo y se lavo con 2 x 100 ml de agua: La fase organica se seco sobre MgSO4, se filtro y se evaporo. El producto final se purifico por HPLC preparativa, columna C-18, fase movil: A = acido acetico a 0,2% en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C4-iH54NaO5Pd + 2 CH3COOH
Peso molecular: 845,4 + 120,1
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 10,81 min.
M.S (+): m/z = 845
espectro UV-Vis (MeOH): 745 nm, 514 nm, 380 nm, 330 nm
Ejemplo 29. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetN-Rodobacterioclorm-131,173- di(4-aminobutil)amida (compuesto 35)
Se agitaron 20 mg de Pd-Bpheid, 3 (28 pmol) y 2 ml (19,7 mmol) de 1,4-diaminobutano, a 30 °C durante 1 hora en una atmosfera de argon. Despues de este periodo, se introdujo en el recipiente de reaccion una solucion de 133,4 mg de PyBroP (286 pmol) en 200 pl de cloroformo. La mezcla se agito durante 60 min mas a 30 °C en una atmosfera de argon. Despues, la reaccion se enfrio y el exceso de reactivo de acoplamiento se destruyo anadiendo 1 ml de agua. El exceso de amina se evaporo y el producto se purifico por HPLC preparativa, columna C-18, fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C43H58NsO3Pd + 2 CH3COOH
Peso molecular: 873,2 + 120,1
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 5,11 min.
M.S (+): m/z = 873
espectro UV-Vis (MeOH): 748 nm, 516 nm, 384 nm, 332 nm
Ejemplo 30. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetN-Rodobacterioclorm-131,173- di(2-aminoetil)amida (compuesto 10)
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30
35
40
Se agitaron 20 mg de Pd-Bpheid, 3 (28 pmol) y 2 ml (29,6 mmol) de etilendiamina, a temperatura ambiente durante 40 min en una atmosfera de argon. Despues de este periodo, se introdujo en el recipiente de reaccion una solucion de 136,8 mg de PyBroP (293 pmol) en 200 pl de cloroformo. La mezcla se agito durante 2 horas mas a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. Despues, la reaccion se enfrio y el exceso de reactivo de acoplamiento se destruyo anadiendo 2 ml de agua. La mezcla de reaccion se diluyo con 50 ml de cloroformo y se lavo dos veces con 100 ml de agua. El disolvente se evaporo y el producto final se purifico por HPLC preparativa, columna C-18, fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: CagHsQNsOsPd + 2 CH3COOH
Peso molecular: 817,3 + 120,1
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 10,13 min.
M.S (+): m/z = 817
espectro UV-Vis (MeOH): 750 nm, 516 nm, 384 nm, 332 nm
Ejemplo 31. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetN-Rodobacterioclorm-131,173- di(2-N2-dimetilaminoetil)amida (compuesto 36)
Se agitaron 20 mg de Pd-Bpheid, 3 (28 pmol) y 1,5 ml (13 mmol) de N,N-dimetiletilendiamina, a temperatura ambiente durante 1 hora en una atmosfera de argon. Despues de este periodo, se introdujo en el recipiente de reaccion una solucion de 131 mg de PyBroP (281 pmol) en 1,70 pl de cloroformo. La mezcla se agito durante 2 horas mas a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. Despues, la reaccion se enfrio y el exceso de reactivo de acoplamiento se destruyo anadiendo 1 ml de agua. La mezcla de reaccion se diluyo con 50 ml de acetato de etilo y se lavo dos veces con 100 ml de agua. El disolvente se evaporo y el producto final se purifico por HPLC preparativa, columna C-18, fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C43H58NsO5Pd + 2 CH3COOH
Peso molecular: 873,2 + 120,1
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 6,56 min.
M.S (+): m/z = 873
espectro UV-Vis (MeOH): 748 nm, 516 nm, 384 nm, 332 nm
Ejemplo 32. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetN-Rodobacterioclorm-131,173- di(3-N2-dimetilaminopropil)amida (compuesto 37)
Se agitaron 20 mg de Pd-Bpheid, 3 (28 pmol) y 1,5 ml (11,8 mmol) de 3-dimetilamino-1-propilamina, a temperatura ambiente durante 1 hora en una atmosfera de argon. Despues de este periodo, se introdujo en el recipiente de reaccion una solucion de 130,6 mg de PyBroP (280 pmol) en 170 pl de cloroformo. La mezcla se agito durante 2 horas mas a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. Despues, la reaccion se enfrio y el exceso de reactivo de acoplamiento se destruyo anadiendo 1 ml de agua. La mezcla de reaccion se diluyo con 50 ml de acetato de etilo y se lavo dos veces con 100 ml de agua. Las capas acuosas se lavaron con 100 ml de acetato de etilo. Ambas capas organicas se juntaron y se evaporaron. El producto final se purifico por HPLC preparativa, columna C- 18, fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (06 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C45H62NgO5Pd + 2 CH3COOH
Peso molecular: 901,2 + 120,1
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 12,9 min.
M.S (+): m/z = 901
espectro UV-Vis (MeOH): 746 nm, 516 nm, 384 nm, 332 nm
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40
Se agitaron 20 mg de Pd-Bpheid, 3 (28 pmol) y 2 ml (18,3 mmol) de dietilenotriamina, a temperatura ambiente durante 90 minutos en una atmosfera de argon. Despues de este periodo, se introdujo en el recipiente de reaccion una solucion de 130 mg de PyBroP (279 pmol) en 700 pl de cloroformo. La mezcla se agito durante 90 min mas a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. Despues, la reaccion se enfrio y el exceso de reactivo de acoplamiento se destruyo anadiendo 1 ml de agua. La mezcla de reaccion se neutralizo con acido acetico glacial y se diluyo con agua. El producto se purifico por HPLC preparativa, columna C-18, fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C43H60Ni0O5Pd + 4 CH3COOH Peso molecular: 904,1 + 240,2
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 1,95 min (agregado)
M.S (+): m/z = 904
espectro UV-Vis (MeOH): 745 nm, 514 nm, 382 nm, 330 nm
Ejemplo 34. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetN-Rodobacterioclorm-131,173-di- (2-[(2-N2-dietilaminoetil)amino]etil)amida (compuesto 39)
Se agitaron 20 mg de Pd-Bpheid, 3 (28 pmol) y 1 ml (5,33 mmol) de N,N-dietil-dietilenotriamina, a temperatura ambiente durante 4 horas en una atmosfera de argon. Despues de este periodo, se introdujo en el recipiente de reaccion una solucion de 130 mg de PyBroP (279 pmol) en 500 pl de cloroformo. La mezcla se agito durante 2,5 horas mas a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. Despues, la reaccion se enfrio y el exceso de reactivo de acoplamiento se destruyo anadiendo 1 ml de agua. La mezcla de reaccion se neutralizo con acido acetico glacial y se diluyo en agua. El producto se purifico por HPLC preparativa, columna C-18, fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C51H76N10O5Pd + 4 CH3COOH.
Peso molecular: 1015,5 + 240,2
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 5,3-6,6 min.
M.S (+): m/z = 1015
espectro UV-Vis (MeOH): 743 nm, 512 nm, 380 nm, 329 nm
Ejemplo 35. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetN-Rodobacterioclorm-131,173- di(2-morfolino-N-etil)amida (compuesto 40)
Se agitaron 20 mg de Pd-Bpheid, 3 (28 pmol) y 2 ml (15,2 mmol) de N-(2-aminoetil)morfolina, a temperatura ambiente durante 2 horas en una atmosfera de argon. Despues de este periodo, se introdujo en el recipiente de reaccion una solucion de 136 mg de PyBroP (291 pmol) en 700 pl de cloroformo. La mezcla se agito durante 2 horas mas a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. Despues, la reaccion se enfrio y el exceso de reactivo de acoplamiento se destruyo anadiendo 1 ml de agua. La mezcla de reaccion se neutralizo con acido acetico glacial y se diluyo en agua. La mezcla se disolvio en agua y se lavo con cloroformo, 3 x 100 ml. El disolvente organico se evaporo y el producto se purifico por HPLC preparativa, columna C-18, fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C47H62NsO7Pd + 2 CH3COOH Peso molecular: 958,4 + 120,1
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 11,6 min.
10
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25
30
35
40
espectro UV-Vis (MeOH): 745 nm, 513 nm, 381 nm, 330 nm.
Ejemplo 36. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetN-Rodobacterioclorm-131,173- di(2-piperazin-N-etil)amida (compuesto 41)
Se agitaron 20 mg de Pd-Bpheid, 3 (28 jmol) y 1 ml (7,4 mmol) de N-(2-aminoetil)piperazina (97 %), a temperatura ambiente durante 22 horas en una atmosfera de argon. Despues de este periodo, se introdujo en el recipiente de reaccion una solucion de 130 mg de PyBroP (279 jmol) en 500 |jl de cloroformo. La mezcla se agito durante 3,5 horas mas a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. Despues, la reaccion se enfrio y el exceso de reactivo de acoplamiento se destruyo anadiendo 1 ml de agua. La mezcla de reaccion se neutralizo con acido acetico glacial y se diluyo en agua. El producto se purifico por HPLC preparativa, columna C-18, fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 40 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C47H64N-i0O5Pd + 4 CH3COOH
Peso molecular: 955,5 + 240,2
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 11,4 min.
M.S (+): m/z = 955
espectro UV-Vis (MeOH): 744 nm, 513 nm, 380 nm, 329 nm.
Ejemplo 37. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetN-Rodobacterioclorm-131,173-di- (3-[(3-aminopropil)amino]propil)amida (compuesto 42)
Preparacion de ester activo- Tfpicamente, se disolvieron 25 mg de Pd-Bpheid, 3 (35 jmol) y 39,4 mg de N- hidroxisuccinimida (HOSu o NHS) (342 jmol) en 1 ml de DMF seca en una atmosfera de argon. Se anadieron 31 mg de 1;3-diciclohexilcarbodiimida (DCC) (150 jmol) en 500 jl de DMF seca. La reaccion se agito a temperatura ambiente durante una noche. Despues, la DMF se evaporo y el producto se purifico por cromatograffa lfquida de SiO2 con CHCl3 a 95 %:EtOH a 5 % como eluyente. Despues, el disolvente se evaporo para producir 55 mg de ester activado. Los experimentos mostraron que no era necesario aislar y purificar el ester activo.
Se agitaron 20 mg de Pd-Bpheid-OSu (24,7 jmol) a temperatura ambiente con 1 ml de bis(3-aminopropil)amina recien destilada durante 3 horas en una atmosfera de argon. Despues, la mezcla de reaccion se evaporo al vado a temperatura ambiente. Despues de la evaporacion, se anadio 1 ml de agua al residuo y el producto se purifico por HPLC preparativa en una C-18, Fase movil: A = acido acetico a 0,1 %, pH = 7,2, en agua. B = acido acetico a 0,1 %, pH = 7,2, en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-2 min) a 90 % de B (20-22 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C47H6sN10O5Pd + 4 CH3COOH
Peso molecular: 959,4 + 240,2
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 12,83 min.
M.S (+): m/z = 959
espectro UV-Vis: 750 nm, 516 nm, 386 nm, 330 nm, 268 nm
Ejemplo 38. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorin-131,173- di([2-bis(2-aminoetil)amino]etil)amida (compuesto 43)
Se agitaron 20 mg de Pd-Bpheid-OSu (24,7 jmol) preparado en el Ejemplo 38 anteriormente, a temperatura ambiente con 1 ml de tris(2-aminoetil)amina durante 3 horas en una atmosfera de argon. Despues, la mezcla de reaccion se evaporo al vacfo a temperatura ambiente. Despues, se anadio 1 ml de agua al residuo y el producto se purifico en una HPLC preparativa con una columna de sflice C-18, Fase movil: A = acido acetico a 0,1 %, pH = 7,2, en agua. B = acido acetico a 0,1 %, pH = 7,2, en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-2 min) a 90 % de B (20-22 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C47H70N-i2O5Pd + 6 CH3COOH Peso molecular: 989,4 + 360,3
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Tiempo de retencion: 114,15 min.
M.S (+): m/z = 989
espectro UV-Vis: 750 nm, 516 nm, 386 nm, 332 nm
Ejemplo 39. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetil-Rodobacterioclorm-131,173- di(2-N-(2'-piridil)aminoetil)amida (compuesto 44)
1) Se disolvieron 500 mg de 2-cloropiridina (4,40 mmol) en 3,0 ml de etilendiamina (44,0 mmol) y la mezcla se calento a reflujo durante 6 horas a 100 °C. Al final, el exceso de etilendiamina se evaporo al vado a temperatura ambiente. El producto N-(2-piridil)etilendiamina) se purifico sobre gel de sflice 60 (0,040-0,063 mm). Fase movil: 90 % de metanol, 10 % de solucion de amonio.
Analisis de TLC sobre la lamina de Gel de Sflice 60 F254 Fase movil: 90 % de metanol, 10 % de solucion de amonio. Fr de producto = 0,43.
2) Se anadieron 30 mg de Pd-Bpheid-OSu (0,037 mmol, preparado en el Ejemplo 38) a una solucion de 110 mg de N-(2-piridil)etilendiamina (0,80 mmol) en dimetilformamida seca. La solucion se agito durante 5 horas a temperatura ambiente en una atmosfera de argon.
El producto se purifico por HPLC preparativa, usando una columna C-18. Fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C49H56N-i0O5Pd + 4 CH3COOH Peso molecular: 971,5 + 240,2
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 13,96 min.
M.S (+): m/z = 971
espectro UV-Vis: 750 nm, 516 nm, 386 nm, 332 nm
Ejemplo 40. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetil-Rodobacterioclorm-131,173- di(2-N2-dietilaminoetil)amida (compuesto 45)
1) Se agitaron 30 mg de Pd-Bpheid, 3 (42 pmol) en 300 pl de 2-(dietilamino)etilamina (2,11 mmol) a temperatura ambiente durante 3 horas en una atmosfera de argon. El producto de aminolisis se analizo por HPLC-MS.
Tiempo de retencion: 15,49 min. M.S (+): m/z = 831
2) Una solucion de 40 mg de PyBroP (0,086 mmol) en 200 pl de DMF se anadio a la mezcla de reaccion previa. La solucion se agito a temperatura ambiente durante 3 horas en una atmosfera de argon.
El producto se purifico por HPLC preparativa, usando una columna C-18. Fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C47H66NsO5Pd + 2 CH3COOH Peso molecular: 931,5 + 120,1
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 12,81 min.
M.S (+): m/z = 931
espectro UV-Vis: 750 nm, 516 nm, 386 nm, 332 nm
Ejemplo 41. [Compuesto de referencia] Sal acetato de paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetil- Rodobacterioclorin-131-(2,3-dihidroxipropil)amida-173-(2-N3-trimetil amonioetil)amida (compuesto 46)
1) Se disolvio Pd-Bpheid, 3 (100 mg, 0,140 mmol) en 1,0 ml de N-metil-2-pirrolidona (NMP) y 3-amino-1,2-
propanodiol (405 mg, 4,45 mmol). La solucion se agito durante 3 horas a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. El producto obtenido (aducto de Pd-Bpheid-aminopropanodiol) se purifico sobre gel de sflice 60 (0,040-0,063
mm). Fase movil: 90 % de metanol -10 % de solucion de amonio.
10
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25
30
35
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Analisis de TLC sobre la lamina de Gel de S^lice 60 F254 Fase movil: 80 % de metanol, 20 % de solucion de amonio. Fr de producto = 0,86.
El producto se analizo por HPLC-MS. Tiempo de retencion: 18,42 min.
M.S (+): m/z = 805
2) El aducto de Pd-Bpheid-aminopropanodiol (37 mg, 0,052 mmol) se disolvio en 1,5 ml de NMP. Se anadieron un reactivo de acoplamiento hexafluorofosfato de benzotriazol-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU) (200 mg, 0,52 mmol), trietilamina (110pl, 0,78 mmol) e hidrocloruro de cloruro de (2-aminoetil)trimetilamonio (46 mg, 0,26 mmol). La solucion se agito durante 2 horas a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. El producto se purifico por HPLC, usando una columna RP-18. Fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C43H6-iNyOyPd + CH3COO'
Peso molecular: 892,4 + 59,0
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 13,34 min.
M.S (+): m/z = 892
Ejemplo 42. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetN-Rodobacterioclorm-131-(2,3- dihidroxipropil)amida-172 3-(2-aminoetil)amida (compuesto 47)
1) Se realizaron aminolisis de Pd-Bpheid con 3-amino-1,2-propanodiol y purificacion posterior como se describe en el Ejemplo 42 para el compuesto 46.
2) Se disolvieron 37 mg del aducto de Pd-Bpheid-aminopropanodiol (0,052 mmol) en 300 pl de NMP. Se anadieron 22 mg de PyBroP (0,046 mmol), 10 pl de etilendiamina (0,155 mmol). La solucion se agito durante 1 hora a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. El producto se purifico por HPLC usando una columna RP-18. Fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C40H53NyOyPd + CH3COOH
Peso molecular: 848,3 +60,0
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 13,15 min.
M.S (+): m/z = 848
Ejemplo 43. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetN-Rodobacterioclorm-131-(2- aminoetil)amida-173-(2,3-dihidroxipropil)amida (compuesto 48)
1) Se agitaron 30 mg de Pd-Bpheid, 3 (42 pmol) en 1 ml (15 mmol) de etilendiamina, durante 30 minutos a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. Al final, el exceso de etilendiamina se evaporo al vacfo a temperatura ambiente, y despues la solucion se congelo en nitrogeno lfquido y se liofilizo para eliminar las trazas de etilendiamina.
2) El producto de aminolisis se hizo reaccionar con 80 mg (0,17 mmol) de PyBroP disuelto en 100 pl de cloroformo y 80 mg (0,88 mmol) de 3-amino-1,2-propanodiol disuelto en 2 ml de NMP a temperatura ambiente, en una atmosfera de argon durante 16 horas. El producto se purifico por HPLC, usando una columna RP-18. Fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (3033 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C40H53NyOyPd + CH3COOH
Peso molecular: 848,3 + 60,0
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 8,43 min.
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10
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45
1) Se realizaron aminolisis de Pd-Bpheid con 3-amino-1,2-propanodiol y purificacion posterior como se describe para el compuesto 46 en el Ejemplo 42.
2) El aducto de Pd-Bpheid aminopropanodiol (25 mg, 0,031 mmol) se disolvio en 300 jl de NMP. Se anadieron HBTU (120 mg, 0,32 mmol), N,N-dimetiletilendiamina (14 mg, 0,16 mmol) y carbonato potasico (88 mg). Se anadio una solucion tampon a pH = 7. La solucion se agito durante 20 horas a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. El producto se purifico por HPLC usando una columna RP-18. Fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C42H57N7O7Pd + CH3COOH
Peso molecular: 876,3 +60,0
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 14,74 min.
M.S (+): m/z = 876
Ejemplo 45. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetil-Rodobacterioclorm-131-(2-N2- dimetilaminoetil)amida-173-(2,3-dihidroxipropil)amida (compuesto 50)
1) Se realizaron aminolisis de Pd-Bpheid con N,N-dimetil etilendiamina y purificacion posterior como se describe para el compuesto 25 en el Ejemplo 20.
2) El producto de aminolisis se hizo reaccionar con 80 mg (0,17 mmol) de PyBroP disuelto en 100 jl de cloroformo y 80 mg (0,88 mmol) de 3-amino-1,2-propanodiol disuelto en 2 ml de NMP a temperatura ambiente en una atmosfera de argon durante 16 horas. El producto se purifico por HPLC usando una columna RP-18. Fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (3033 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C42H57N7O7Pd + CH3COOH
Peso molecular: 876,3 + 60,0
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 12,31 min.
M.S (+): m/z = 876
Ejemplo 46. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetil-Rodobacterioclorm-131-(2,3- dihidroxipropil)amida-173-(2-[(2-aminoetil)amino]etil)amida (compuesto 51)
1) Se realizaron aminolisis de Pd-Bpheid con 3-amino-1,2-propanodiol y purificacion posterior como se describe para 46 en el Ejemplo 42.
2) Se disolvieron 12 mg del aducto de Pd-Bpheid aminopropanodiol (0,015 mmol) en 400 jl de DMF. Se anadieron 34 mg de HBTU (0,64 mmol), 21 jl de trietilamina (0,15 mmol) y 16 jl de dietilenotriamina (0,15 mmol). La solucion se agito durante 5 horas a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. El producto se purifico por HPLC usando una columna RP-18. Fase movil: A = acido acetico a 0,2% en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C42H58NsO7Pd + 2CH3COOH
Peso molecular: 891,4 + 120,1
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 12,42 min.
M.S (+): m/z = 891
Ejemplo 47. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorin-131-(2,3- dihidroxipropil)amida-173-(2-[(2-N2-dietil aminoetil)amino]etil)amida (compuesto 52)
1) Se realizaron aminolisis de Pd-Bpheid con 3-amino-1,2-propanodiol y purificacion posterior como se describe para
46 en el Ejemplo 42.
2) Se disolvieron 20 mg del aducto de Pd-Bpheid aminopropanodiol (0,025 mmol) en 1,0 ml de NMP. Se anadieron 94 mg de HBTU (0,25 mmol), 52 jl de trietilamina (0,375 mmol) y 23 jl de N,N-dietildietilenotriamina (0,125 mmol). La solucion se agito durante 3 horas a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. El producto se purifico por 5 HPLC usando una columna RP-18. Fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C46H66NsO7Pd + 2CH3COOH
Peso molecular: 947,5 + 120,1
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
10 Tiempo de retencion: 11,70 min.
M.S (+): m/z = 947
Ejemplo 48. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetN-Rodobacterioclorm-131-(2,3- dihidroxipropil)amida-173-(2-morfolino-N-etil)amida (compuesto 53)
1) Se realizo aminolisis de Pd-Bpheid con 3-amino-1,2-propanodiol y purificacion posterior como se describe para 46 15 en el Ejemplo 42.
2) Se disolvieron 50 mg del aducto de Pd-Bpheid aminopropanodiol (0,07 mmol) en 800 jl de DMF seca. Se anadieron 80 mg de HOSu (0,70 mmol) y 216 mg de DCC (1,04 mmol). La solucion se agito durante 90 minutos a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. El producto se purifico por inyeccion en HPLC, usando una columna RP-18. Fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente:
20 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
3) Se disolvieron 7,0 mg del Pd-Bpheid-aminopropanodiol-OSu-compuesto activado 7,77 * 10-3 mmol) en 200 jl de DMF seca. Se anadieron 25 jl de N-metil-morfolina seca (0,23 mmol) y 30 jl de N-(2-aminoetil)morfolina (0,23 mmol). La solucion se agito durante 75 minutos a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. El producto se purifico por HPLC usando una columna RP-18. Fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a
25 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min
Estructura de formula: C44H59N7OsPd + CH3COOH Peso molecular: 918,4 + 60,0
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 13,05 min.
30 M.S (+): m/z = 918
Ejemplo 49. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetN-Rodobacterioclorm-131-(2,3- dihidroxipropil)amida-173-(2-piperazino-N-etil)amida (compuesto 54)
1) Se realizo aminolisis de Pd-Bpheid con 3-amino-1,2-propanodiol y purificacion posterior como se describe para 46 en el Ejemplo 42.
35 2) Se disolvieron 23 mg del aducto de Pd-Bpheid aminopropanodiol (0,032 mmol) en 200 jl de DMF seca. Se
anadieron 5,55 mg de HOSu (0,048 mmol) y 10,85 mg de DcC (0,048 mmol). La solucion se agito durante 22 horas a temperatura ambiente en una atmosfera de argon.
3) En el recipiente de reaccion de (2), se anadieron 4 jl de 1-(2-aminoetil)piperazina (0,03 mmol) y 12 jl de trietilamina (0,09 mmol). La solucion se agito durante 4 horas a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. El 40 producto se purifico por HPLC usando una columna RP-18. Fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min
Estructura de formula: C44H60NSO7Pd + 2CH3COOH
Peso molecular: 917,4 + 120,1
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
45 Tiempo de retencion: 13,03 min.
5
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45
1) Se realizo aminolisis de Pd-Bpheid con dietilenotriamina como se describe para el compuesto 27 en el Ejemplo 22. El producto se purifico en una columna de s^lice con una solucion corriente de metanol a 80 % y amonio a 20 %.
2) El producto de aminolisis de Pd-Bpheid se hizo reaccionar con 80 mg (0,17 mmol) de PyBroP disuelto en 100 jl de cloroformo y 80 mg (0,88 mmol) de 3-amino-1,2-propanodiol disuelto en 2 ml de NMP a temperatura ambiente, en una atmosfera de argon durante 16 horas. El producto se purifico por HPLC usando una columna RP-18. Fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C42H58NsO7Pd + 2CH3COOH
Peso molecular: 890 + 120,1
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 11,90 min.
M.S (+): m/z = 890
Ejemplo 51. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetN-Rodobacterioclorm-131-(2,3- dihidroxipropil)amida-173-(2-N-(2'-piridil)aminoetil)amida (compuesto 56)
1) Se realizo aminolisis de Pd-Bpheid con 3-amino-1,2-propanodiol y purificacion posterior como se describe para 46 en el Ejemplo 42.
2) Se disolvieron 19 mg del producto de aminolisis de Pd-Bpheid (0,024 mmol) en 1,0 ml de NMP seca. Se anadieron 97 mg de N-(2-piridil)etilendiamina (0,142 mmol), preparada como se describe en el Ejemplo 40, 77 mg del reactivo de acoplamiento tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TBTU) (0,24 mmol) y 50 jl de trietilamina (0,36 mmol). La solucion se agito durante 90 minutos a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. El producto se purifico por HPLC usando una columna RP-18. Fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min
Estructura de formula: C45H56NsO7Pd + 2CH3COOH Peso molecular: 925,4 + 120,1
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 14,38 min.
M.S (+): m/z = 925
Ejemplo 52. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetN-Rodobacterioclorm-131-(2-N- (2'-piridil)aminoetil)amida-173-(2,3-dihidroxipropil)amida (compuesto 57)
1) Se mezclo N-(2-piridil)etilendiamina preparada como se describe en el Ejemplo 40 anterior (200 mg), con 40 mg de Pd-Bpheid durante una noche a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. El producto se purifico por HPLC usando una columna RP-18. Fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
2) El producto de aminolisis de Pd-Bpheid-2-(diaminoetil)-piridina (35 mg, 0,042 mmol) se disolvio en 200 jl de DMF seca. Se anadieron 10 mg de HOSu (0,086 mmol) y 22 mg de DCC (0,105 mmol). La solucion se agito durante 5 horas a temperatura ambiente en una atmosfera de argon.
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS. Tiempo de retencion: 18,91 min.
M.S (+): m/z = 949
2) Se disolvieron 28 mg del Pd-Bpheid-2-(diaminoetil)-piridina-OSu-ester activado (0,03 mmol) en 300 jl de dimetilformamida seca. Se anadieron 28 mg de 3-amino-1,2-propanodiol (0,31 mmol) y 41 jl de trietilamina anadieron. La solucion se agito durante 14 horas a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. El producto se purifico por HPLC usando una columna RP-18. Fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C45H56NsO7Pd + 2CH3COOH
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20
25
30
35
40
45
Peso molecular: 925,4 + 120,1
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 14,53min.
M.S (+): m/z = 925
Ejemplo 53. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetN-Rodobacterioclorm-131-(2,3- dihidroxipropil)-amida-172 3-([2-bis(2-aminoetil)amino]etil)amida (compuesto 58)
1) Se realizo aminolisis de Pd-Bpheid con 3-amino-1,2-propanodiol y purificacion posterior como se describe para 46 en el Ejemplo 42.
2) Todos los disolventes se desgasificaron al vado. El aminodiol purificado se disolvio en 2 ml de NMP y 200 jl de DMSO. A la solucion, se anadieron 100 mg (0,21 mmol) de PyBroP en 200 jl de cloroformo, y 160 jl (1 mmol) de tris(2-etilamino)amina lfquida. Los compuestos se agitaron en una atmosfera de argon a temperatura ambiente durante 16 h. El producto se purifico por HPLC usando una columna RP-18. Fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C44H63NgO7Pd+ 3CH3COOH Peso molecular: 933,2 + 180,2
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 10,86 min.
M.S (+): m/z = 933.
Ejemplo 54. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetN-Rodobacterioclorm-131-([2- bis(2-aminoetil)-amina]etil)amida-173-(2,3-dihidroxipropil)amida (compuesto 59)
1) Se disolvieron 25 mg de Pd-Bpheid, 3 (35 jmol) y 39,4 mg de HOSu (342 jmol) en 1 ml de DMF seca en una atmosfera de argon. Se introdujeron 31 mg de DCC (150 jmol) disueltos en 500 jl de DMF seca. La reaccion se agito a temperatura ambiente durante una noche. La DMF se evaporo y el producto se purifico por cromatograffa lfquida usando SO2 como fase estacionaria y CHCh a 95 %:EtOH a 5 % como eluyente. El producto se recibio en las primeras cuatro fracciones. El disolvente se evaporo; Se recibieron 55 mg de Pd-Bpheid-OSu.
2) Se disolvieron 25 mg del producto anterior, Pd-Bpheid-OSu, (30 jmol), en 1 ml de DMF seca. A esta solucion se anadieron 13 jl de N,N-diisopropiletilamina (DIPEA) (74 jmol). La mezcla de reaccion se agito en una atmosfera de argon durante un par de minutos. Se anadio 3-amino-1,2-propanodiol (97 jl, 37 jmol) en 1 ml de DMF en el recipiente de reaccion. La reaccion se agito a temperatura ambiente en una atmosfera inerte durante 5 horas. No se detecto producto de aminolisis.
3) Se anadieron 200 ml (1,28 mmol) de tris(aminoetil)amina al recipiente de reaccion de (2). Se paso argon a traves del recipiente de reaccion. La mezcla se agito durante una noche a temperatura ambiente. El producto se purifico diluyendo la mezcla de reaccion con 30 ml de agua y lavando la capa acuosa con 30 ml de n-butanol. Despues, la capa organica se lavo con 3 x 30 ml de agua. El butanol se evaporo y el producto se disolvio en 1,5 ml de agua acida y 300 jl de acetonitrilo. La solucion se dividio en alfcuotas y se liofilizo.
Estructura de formula: C44H63^O7Pd 3CH3COOH
Peso molecular: 933,2 + 180,2
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 12,46 min.
M.S (+): m/z = 934
Ejemplo 55. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetN-Rodobacterioclorma-131-(3- aminopropil)amida-173-(2,3-dihidroxipropil)amida (compuesto 60)
1) Se agitaron 30 mg de Pd-Bpheid, 3 (42 jmol) en 1 ml (11,8 mmol) de 1,3-diaminopropano, durante 60 minutos a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. El exceso de amina se evaporo a alto vacfo durante 16 h.
2) El producto se disolvio en 1 ml de DMSO y 1 ml de DMF, y se agito con una solucion de 100 mg (0,21 mmol) de
PyBroP en 500 jl de cloroformo y 100 mg de 3-amino-1,2-propanodiol a temperatura ambiente en una atmosfera de
5
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45
argon, durante 16 h. La purificacion del producto se realizo mediante precipitacion con agua, seguido de purificacion de HPLC usando una columna RP-18. Fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C4iH55N7O7Pd + CH3COOH
Peso molecular: 861,2 + 60,0
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 13,06 min.
M.S (+): m/z = 861
Ejemplo 56. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetN-Rodobacterioclorma-131-(4- aminobutil)amida-173-(2,3-dihidroxipropil) amida (compuesto 61.)
1) Se agitaron 20 mg de Pd-Bpheid, 3 (28 pmol) y 0,5 ml (4,9 mmol) de 1,4-diaminobutano (99 %), a 30 °C durante 4 horas en una atmosfera de argon, momento en el que se anadio 1 ml de agua al recipiente de reaccion y se agito durante un par de minutos. Despues, la solucion se liofilizo.
2) El producto de aminolisis de Pd-Bpheid se disolvio en 2 ml de DMF seca. Se anadio una solucion de 414 mg (4,4 mmol) de 3-amino-1,2-propanodiol (97%) en 400 pl de DMF a la mezcla. El recipiente de reaccion se lavo abundantemente con argon. Se introdujeron 130 mg de PyBroP (279 pmol) en 500 pl de cloroformo en el recipiente de reaccion. La mezcla se agito durante 90 min mas a 30 °C en una atmosfera de argon. Despues, la reaccion se enfrio y el exceso de reactivo de acoplamiento se destruyo anadiendo 1 ml de agua. La mezcla se diluyo con 100 ml de agua. El producto se extrajo cuatro veces con cloroformo, 100 ml y 3 x 50 ml. Los combinaron y se evaporaron. El producto se purifico por HPLC usando una columna RP-18. acetico a 0,2 % en agua. B = A = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C42H57N7O7Pd + CH3COOH
Peso molecular: 876,4 + 60,0
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 13,32 min.
M.S (+): m/z = 876
Ejemplo 57. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetN-Rodobacterioclorm-131-(2-N2- dietilaminoetil)amida-173-(2,3-dihidroxipropil)amida (compuesto 62)
1) Se disolvieron 30 mg de Pd-Bpheid, 3 (0,042 mmol) en 300 pl de 2-(dietilaminoetil)amina (2,11 mmol). La solucion se agito durante 3 horas a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. El exceso de 2-(dietilaminoetil)amina se evaporo a alto vacfo.
El producto se analizo por HPLC-MS. Tiempo de retencion: 15,49 min.
M.S (+): m/z = 831
2) Se anadieron 27 mg de 3-amino-1,2-propanodiol (0,3 mmol), 28 mg de PyBroP (0,06 mmol) y 300 pl de DMF a la solucion en la seccion 1. La solucion se agito durante 2 horas a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. El producto se purifico por HPLC usando una columna RP-18. Fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C44H61N7O7Pd + CH3COOH
Peso molecular: 906,4 + 60,0
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 13,93 min.
M.S (+): m/z = 904
Ejemplo 58. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorin-131-(2-N- etilaminoetil)amida-173-(2,3-dihidroxipropil)amida (compuesto 63)
lavados organicos se Fase movil: A = acido (0-6 min) a 95 % de B
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1) Se agitaron 30 mg de Pd-Bpheid, 3 (42 pmol) en 1 ml (9,5 mmol) de N-etiletilendiamina durante 60 minutos a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. Despues, el exceso de amina se evaporo a alto vado.
2) Despues, el producto se disolvio en 800 pl de DMF y se agito con una solucion de 70 mg (0,77 mmol) de 3-amino-
1.2- propanodiol en 200 pl de DMF y una solucion de 70 mg (0,15 mmol) de PyBroP en 200 pl de cloroformo, a temperatura ambiente en una atmosfera de argon durante 2 h. El producto se purifico por HPLC, usando una columna RP-18. Fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C42H57N7OyPd + CH3COOH
Peso molecular: 875,2 + 60,0
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 13,16 min.
M.S (+): m/z = 875
Ejemplo 59. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetil-Rodobacterioclorm-131-(3-N- metilaminopropil)amida-173-(2,3-dihidroxipropil)amida (compuesto 64)
1) Se agitaron 30 mg de Pd-Bpheid, 3 (42 pmol) en 1 ml (9,6 mmol) de N-metil-1,3-propanodiamina, durante 120 minutos a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. Despues, el exceso de amina se evaporo a alto vado.
2) Despues, el producto se disolvio en 800 pl de DMF y se agito con una solucion de 80 mg (0,88 mmol) de 3-amino-
1.2- propanodiol en 200 pl de DMF y una solucion de 75 mg (0,16 mmol) de PyBroP en 200 pl de cloroformo, a temperatura ambiente en una atmosfera de argon durante 2 h. El producto se purifico por HPLC usando una columna RP-18. Fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C42H57N7OyPd + CH3COOH
Peso molecular: 875,2 + 60,0
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 12,93 min.
M.S (+): m/z = 875
Ejemplo 60. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetil-Rodobacterioclorm-131-(2-N2- dimetilammoetil)amida-173-(2-hidroxietil)amida (compuesto 65)
1) Se agitaron 300 mg de Pd-Bpheid, 3 (420 pmol), 655 mg de PyBroP (1260 pmol), 30,78 pl de etanolamina (504 pl), 0,6 ml de DMF y 0,1 ml de trietilamina a temperatura ambiente durante 1 h en una atmosfera de argon. La mezcla de reaccion se evaporo al vado, el producto se purifico por extraccion con agua y cloroformo. La fase de cloroformo que contema el producto se seco sobre MgSO4 anhidro, se filtro y se evaporo.
2) Despues de la evaporacion, se anadieron 460 pl de N,N-dimetiletilendiamina (4,2 mmol) y la mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 1 h en una atmosfera de argon. El producto se purifico por extraccion con agua y n-butanol. La fase de n-butanol que contema el producto se seco (MgSO4 anhidro), se filtro y se evaporo.
Estructura de formula: C4-iH55N7O6Pd + CH3COOH
Peso molecular: 848,2 + 60,0
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
M.S (+): m/z (el mas abundante) = 846
espectro UV-Vis: 750 nm, 516 nm, 386 nm, 332 nm, 264 nm
Ejemplo 61. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetil-Rodobacterioclorm-131-(2-N2- dimetilaminoetil)amida-173-(3-hidroxi propil)amida (compuesto 66)
1) Se realizo aminolisis de Pd-Bpheid como se describe para el compuesto 25 en el Ejemplo 20.
2) Despues todo el producto obtenido en la etapa 1 anterior se disolvio en 6 ml de DMF. Se hizo reaccionar 1 ml de la solucion con 20 pl (0,26 mmol) de 3-amino-1-propanol, 70 mg (0,15 mmol) de PyBroP y 20 pl (0,18 mmol) de N-
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metil-morfolina. La mezcla se agito durante 90 minutos a temperature ambiente en una atmosfera de argon. El producto se purifico por HPLC, usando una columna RP-18. Fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C42H57N7O6Pd + CH3COOH
Peso molecular: 859,3 + 60,0
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 15,38 min.
M.S (+): m/z = 859
Ejemplo 62. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetil-Rodobacterioclorm-131-(2-N2- dimetilaminoetil)amida-173-(2-hidroxi propil)amida (compuesto 67)
1) Se realizo aminolisis de Pd-Bpheid como se describe para el compuesto 25 en el Ejemplo 20.
2) Despues, el producto se disolvio en 6 ml de DMF. Se hizo reaccionar 1 ml de la solucion con 20 pl (0,25 mmol) de 1-amino-2-propanol, 70 mg (0,15 mmol) de PyBroP y 20 pl (0,18 mmol) de N-metil-morfolina. La mezcla se agito durante 90 minutos a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. El producto se purifico por HPLC usando una columna RP-18. Fase movil: A = acido acetico a 0,2% en agua. B = acido acetico a 0,2% en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C42H57N7O6Pd + CH3COOH
Peso molecular: 859,3 + 60,0
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 14,82 min.
M.S (+): m/z = 859.
Ejemplo 63. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetil-Rodobacterioclorm-131-(2-N2- dimetilaminoetil)amida-173-((R)-2-hidroxipropil)amida (compuesto 68)
La smtesis del compuesto 68 fue identica a la del compuesto 67 descrito en el Ejemplo 63 anterior, usando el isomero optico R del aminoalcohol.
Estructura de formula: C42H57N7O6Pd + CH3COOH
Peso molecular: 859,3 + 60,0
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 15,52 min.
M.S (+): m/z = 859.
Ejemplo 64. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetil-Rodobacterioclorm-131-(2-N2- dimetilaminoetil)amida-173-((S)-2-hidroxipropil)amida (compuesto 69)
La smtesis del compuesto 68 fue identica a la del compuesto 67 descrito en el Ejemplo 63 anterior, usando el isomero optico S del aminoalcohol.
Estructura de formula: C42H57N7O6Pd + CH3COOH
Peso molecular: 859,3 + 60,0
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 15,50 min.
M.S (+): m/z = 859.
Ejemplo 65. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil-Rodobacterioclorin-131-(2-N2- dimetilaminoetil)amida-173-(2-(2-hidroxietilamino)etil)amida (compuesto 70)
1) Se realizo aminolisis de Pd-Bpheid como se describe para el compuesto 25 en el Ejemplo 20.
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2) Despues, el producto se disolvio en 6 ml de DMF. Se hizo reaccionar 1 ml de la solucion con de N-(2-hidroxietil)- etilendiamina (20jl, 0,17 mmol), 70 mg (0,15 mmol) de PyBroP y 20 jl (0,18 mmol) de N-metil-morfolina. La mezcla se agito durante 90 minutos a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. El producto se purifico por HPLC usando una columna RP-18. Fase movil: A = acido acetico a 0,2% en agua. B = acido acetico a 0,2% en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C43H60NsO6Pd + 2CH3COOH
Peso molecular: 889,2 + 120,1
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 13,34 min.
M.S (+): m/z = 888.
Ejemplo 66. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbonMmetN-Rodobacteriodorm-131-(3-N- (2'-piridN)ammopropM)amida-172 3-(2,3-dihidroxipropN)amida (compuesto 71)
1) Se disolvieron 500 mg de 2-cloropiridina (8,73 mmol) en 3,6 ml de 1,3-diaminopropano (44 mmol). Se anadieron 100 mg de carbonato potasico y 200 jl de DMF. El compuesto se calento a reflujo durante 22 horas a 102 °C. El producto N-(2-piridil)propilendiamina se purifico sobre gel de sflice 60 (0,040-0,063 mm). Fase movil: 90 % de metanol, 10 % de solucion de amonio. El producto fue un aceite incoloro. Analisis de TLC sobre la lamina de Gel de Sflice 60 F254 Fase movil: 90 % de metanol, 10 % de solucion de amonio. Fr de producto = 0,38.
2) Se disolvieron 20 mg de Pd-Bpheid, 3 (28 jmol) en 300 jl de NMP y se anadieron 125 mg (0,83 mmol) de N-(2- piridil)propilendiamina. La solucion se agito durante 23 horas a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. El producto de aminolisis se purifico sobre gel de sflice 60 (0,040-0,063 mm). Fase movil: 90 % de metanol, 10 % de solucion de amonio.
El producto se analizo por HPLC-MS. Tiempo de retencion: 8,02 min.
M.S (+): m/z = 864.
3) El producto de aminolisis de Pd-Bpheid (30 mg, 0,023 mmol) se disolvio en 400 jl de NMP. Se anadieron 90 mg de HBTU (0,24 mmol), 50 jl de trietilamina (0,35 mmol) y 20 mg de 3-amino-1,2-propanodiol (0,23 mmol). La solucion se agito durante 4 horas a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. El producto se purifico por HPLC usando una columna RP-18. Fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C46H58NsO7Pd + 2 CH3COOH
Peso molecular: 941,4 + 120,1
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 18,89 min.
M.S (+): m/z = 941.
Ejemplo 67. Paladio 31-oxo-15-metoxicarbonMmetN-Rodobacteriodorm-131-(4-N-(2'-piridN)ammobutM)amida- 173-(2,3-dihidroxipropil)amida (compuesto 72)
1) Se disolvieron 0,835 ml de 2-cloropiridina (8,8 mmol) en 8,8 ml de 1,4-diaminobutano (88 mmol). La mezcla se calento a reflujo durante 4 horas a 128 °C. El producto se purifico sobre gel de sflice 60 (0,040-0,063 mm). Fase movil: 90 % de metanol, 10 % de solucion de amonio. El producto fue un aceite incoloro. TLC sobre lamina de Gel de Sflice 60 F254. Fase movil: 90 % de metanol, 10 % de solucion de amonio. Butildiamina: Fr = 0, Fr de producto = 0,42.
2) Se disolvieron 30 mg de Pd-Bpheid, 3 (42 jmol) en 700 jl de NMP y se anadieron 80 mg (0,48 mmol) de N-(2- piridil)butilendiamina. La solucion se agito durante 15 horas a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. El producto se purifico por HPLC usando una columna RP-18. Fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS
Tiempo de retencion: 22,36 min.
M.S (+): m/z = 877.
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3) Se disolvieron 17 mg del producto de aminolisis de Pd-Bpheid (0,019 mmol) en 400 |jl de NMP y 100 |jl de agua. Se anadieron 9 mg de HOSu (0,077 mmol), 17 mg de N-(3-dimetilamino propil)-N-etilcarbodiimida (EDC) (0,87 mmol) y 5 jl de solucion de amonio. Despues de 16 horas, se anadieron 200 mg de 3-amino-1,2-propanodiol (2,2 mmol). La solucion se agito durante 2 horas a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. El producto se purifico por HPLC preparativa usando una columna Rp-18. Fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C47H60NsO7Pd + 2CH3COOH
Peso molecular: 949,5 + 120,1
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 15,79 min.
M.S (+): m/z = 949
Ejemplo 68. Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetN-Rodobacterioclorm-131-(2,3-dihidroxipropM)amida-173-(3- N-(2'-piridil) aminopropil)amida (compuesto 73)
1) Se realizo aminolisis con 3-amino-1,2-propanodiol y purificacion posterior como se describe para el compuesto 46 en el Ejemplo 42.
2) Se disolvieron 32 mg del producto de aminolisis de Pd-Bpheid (0,04 mmol) en 800 jl de NMP. Se anadieron 152 mg de HBTU (0,4 mmol), 56 jl de trietilamina y 60 mg de N-(2-piridil)propilendiamina (preparada como se ha descrito anteriormente para el compuesto 72). La solucion se agito durante 16 horas a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. El producto se purifico por HPLC usando una columna RP-18. Fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C46H58NsO7Pd + 2 CH3COOH Peso molecular: 939,4 + 120,1
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 15,28 min.
M.S (+): m/z = 939.
Ejemplo 69. Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetN-Rodobacterioclorm-131-(2,3-dihidroxipropN)amida-173-(4- N-(2'-piridil)aminobutil)amida (compuesto 74)
1) Se realizo aminolisis con 3-amino-1,2-propanodiol y purificacion posterior como se describe para el compuesto 46 en el Ejemplo 42.
2) Se disolvieron 25 mg del producto de aminolisis de Pd-Bpheid (0,031 mmol) en 600 jl de NMP. Se anadieron 120 mg de HBTU (0,31 mmol), 45 jl de trietilamina y 50 mg de N-(2-piridil)butilendiamina (preparada como se ha descrito anteriormente para el compuesto 72). La solucion se agito durante 20 horas a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. El producto se purifico por HPLC usando una columna RP-18. Fase movil: A = acido acetico a 0,2 % en agua. B = acido acetico a 0,2 % en acetonitrilo. Gradiente: 20 % de B (0-6 min) a 95 % de B (30-33 min). Caudal: 4 ml/min.
Estructura de formula: C47H60NsO7Pd + 2CH3COOH Peso molecular: 953,5 + 120,1
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 15,43 min.
M.S (+): m/z = 953
Ejemplo 70. [Compuesto de referencia] Paladio 31-oxo-15-metoxicarbomlmetN-Rodobacterioclorm-131-(2-N2- dimetilaminoetil)amida-173-(glicosil) amida (compuesto 75)
1) Se disolvieron 300 mg de Pd-Bpheid, 3 (420 jmol) y 476 mg de HOSu (4,14 mmol) en 4 ml de DMF seca en una
atmosfera de argon. Se introdujeron 435,5 mg de DCC (2,1 mmol) disueltos en 2 ml de DMF seca. La reaccion se
agito a temperatura ambiente durante una noche. La TLC (CHCl3 a 92 %:MeOH a 8 %) no mostro ningun Pd-Bpheid sin reaccionar.
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2) Se introdujeron 926 mg de hidrocloruro de glicosilamina, 98 %, (4,28 mmol) y 2190 |jl de DIPEA (12,6 mmol) en el recipiente de reaccion anterior que contema el ester activo, Pd-Bpheid-OSu. La reaccion se agito en una atmosfera de argon a temperatura ambiente durante 24 horas. La TLC (CHCh a 8 %: MeOH a 92 %) no mostro ningun ester activo sin reaccionar restante en el recipiente de reaccion.
3) Se anadieron 3 ml de N,N-dimetiletilendiamina (26 mmol) en el recipiente de reaccion de la etapa (2) y se agito durante una noche a temperatura ambiente en una atmosfera de argon. La HPLC-MS mostro que el producto deseado su base de Schiff eran los productos principales. La mezcla de reaccion se diluyo con 100 ml de agua y se lavo con 4 x 50 ml de n-butanol. Fue necesario anadir a cada lavado un pequeno volumen de NaCl acuoso saturado para conseguir la separacion. Las capas organicas se combinaron y se lavaron con 50 ml de agua. Despues, el butanol se evaporo y la base de Schiff residual se hidrolizo usando acido acetico diluido. El producto evaporado se diluyo en 60 ml de agua que contema acido acetico a 1 %. La solucion acida se agito durante 1 hora en una atmosfera de argon a temperatura ambiente. La HPLC-MS mostro que la base de Schiff se habfa destruido por completo.
Estructura de formula: C45H6-iN7OgPd + CH3COOH Peso molecular: 948,4 + 60,0
El producto se analizo por HPLC y confirmacion de identidad por MS.
Tiempo de retencion: 13,81 min.
M.S (+): m/z = 948
Ejemplo 71. [Compuesto de referencia] Interacciones del compuesto dicationico 5 con seroalbumina humana (HSA)
La actividad fotodinamica de los diferentes derivados de Bchl depende cnticamente tanto de la biodisponibilidad de sus formas monomericas (dimericas) como del trafico transcelular, que puede modularse notablemente mediante union a seroalbumina.
Una solucion de 5 en PBS (3,2 x 10-4 M, 100 jl) se mezclo con diversas cantidades de seroalbumina humana (0,1, 0,5, 1, 2 y 5 mg). La agregacion, a altas concentraciones de 5 en soluciones acuosas, se refleja dividiendo el pico monomerico original a 747 nm en dos nuevos picos a 720 y 760 nm. El estado de agregacion se siguio espectofotometricamente a lo largo del intervalo de concentraciones de albumina a temperatura ambiente en una cubeta de 0,1 mm. Los valores de intensidad de absorbancia a las longitudes de onda pico se tomaron como una indicacion de la agregacion.
La adicion de la albumina provoco la disgregacion del sensibilizador 5 en PBS (Fig. 2). Los espectros de absorcion de las soluciones que contiene cantidades crecientes de albumina se parecen al espectro del pigmento monomerico 5 en metanol.
II.SECCION BIOLOGICA
Materiales y Metodos
(i) Cultivo celular. Se cultivaron celulas endoteliales de raton H5V en forma de monocapas en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)/F12 que contema HEPES 25 mM, pH 7,4, suero fetal de ternero (FCS) al 10 %, glutamina (2 mM), penicilina (0,06 mg/ml) y estreptomicina (0,1 mg/ml) (en lo sucesivo citado como el "medio de cultivo"). Las celulas se cultivaron a 37°C en una atmosfera humidificada con CO2 al 8 %.
(ii) Cultivos bacterianos. Se cultivaron bacterias de las cepas St. albus y E. coli XL en medio LB lfquido (E. coli en LB que contema 12,5 jg de tetraciclina/ml) a una densidad final DO600 nm = 0,5-0,9 (1 OD = 8 x 108 bacterias/ml). Las bacterias se centrifugaron (4000 * g, 5 min.) y se resuspendieron en PBS.
(iii) Preparacion de sensibilizantes para experimentos in vitro. Se prepararon soluciones madre de los compuestos 5, 7, 9 y 11 disolviendo los compuestos secos directamente en medio de cultivo a las concentraciones deseadas, antes de su uso.
(iv) Ensayo de fototoxicidad.
(a) Celulas. Para determinar la eficacia fotodinamica, las celulas se cultivaron en placas de 96 pocillos (40 x 103/pocillo) y se incubaron en la oscuridad en medio de cultivo que contema concentraciones crecientes de los sensibilizantes 5, 7, 9 y 1_1, durante un periodo de 1 min a 8 h. El sensibilizante no unido se retiro lavando las celulas una vez con medio de cultivo reciente. Las placas se iluminaron a temperatura ambiente, por su lado inferior, durante 10 min (650 < A < 800 nm, 12 J/cm2). La fuente de luz fue una lampara halogena de 100 W (Osram, Alemania) equipada con un corte de <650 nm y un filtro de agua de 4 cm. Los cultivos se colocaron en la incubadora de cultivo y se determino la supervivencia celular 24 h despues de la iluminacion,
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35
40
45
50
55
mediante el ensayo de viabilidad Neutral Red. La supervivencia celular se calculo como el porcentaje de colorante acumulado en los controles no tratados. Se efectuaron determinaciones por triplicado y se muestran los experimentos representativos. Se usaron tres tipos de controles: (i) control de luz: celulas iluminadas en ausencia de pigmentos; (ii) control de oscuridad: celulas tratadas con pigmentos pero mantenidas en la oscuridad; y (iii) celulas no tratadas que se mantuvieron en la oscuridad.
(b) Bacterias. Para determinar la eficacia fotodinamica, se diluyeron bacterias en alfcuotas de 300 pl que conteman aproximadamente 107 bacterias, y se incubaron con concentraciones crecientes de sensibilizante en tubos de ensayo de plastico en la oscuridad durante 1 h a temperatura ambiente, y despues se iluminaron a 70 mW/cm2 durante 15 min. Posteriormente se emplacaron las muestras de los cultivos bacterianos tratados a diferentes diluciones (50-200 bacterias/placa) en agar LB y se cultivaron durante 24 h a 37°C para la determinacion de la supervivencia bacteriana mediante recuento de colonias. Se efectuaron determinaciones por triplicado y se muestran los experimentos representativos.
(v) Animales. Se mantuvo a ratones desnudos CD1 macho (28-32g) y a ratas Wistar macho (250-300 g) con libre acceso a comida y agua en las instalaciones para animales del departamento acuerdo con las grnas del Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel.
(vi) Anestesia. Se anestesio a los ratones mediante inyeccion i.p. de 80 pl de mezcla de ketamina (100 mg/ml, Rhone-Merieux, Francia) y xilazina (2 %, Vitamed, Israel) (85:15, v:v). A las ratas se les anestesio con gas (2 % de isofluorano en un 98 % de O2).
(vii) Implante de tumores. Se desprendieron las monocapas de celulas de glioma C6 cultivadas en suero salino, se centrifugaron a 250 g durante 5 min, se resuspendieron en suero salino y se inyectaron por via subcutanea (2x106 celulas/raton) en el lomo de los ratones desnudos CD1. Los tumores alcanzaron un diametro de tratamiento de 6-8 mm a las 2 semanas. Entonces se sacrifico a los ratones (segun las grnas del Weizmann Institute of Science) cuando los tumores alcanzaron un diametro > 15 mm.
(viii) Preparacion de sensibilizantes para inyeccion. Se prepararon soluciones madre de los compuestos 5 y 11 antes de su uso disolviendo los compuestos secos directamente en PBS a la concentracion deseada para inyeccion.
(ix) Farmacocinetica. Se inyecto por via i.v. a ratas Wistar anestesiadas (n=3 por cada punto de tiempo) con el compuesto 5 de la invencion (0,6 mg/kg). Se extrajeron muestras de sangre (-100-200 pl) a los 0, 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 120, 360 y 480 min despues de la inyeccion, se transfirieron y pesaron en tubos de ensayo tarados de 2 ml que conteman 10 pl de heparina, y se mezclaron cuidadosamente. Se recogieron muestras de sangre de control de tres ratas no tratadas y se trataron de igual modo. Los tubos que conteman las muestras de sangre se pesaron de nuevo para calcular la masa exacta de la muestra. Despues, se congelaron las muestras de sangre en nitrogeno lfquido y se liofilizaron. Se extrajeron las muestras liofilizadas con metanol (1 ml cada una), se agitaron vorticialmente y se centrifugaron. El sobrenadante se recogio y se analizo mediante medicion de la fluorescencia (Espectrofluonmetro SLM-8000, Aminco EE.UU.). Se registraron los espectros de emision de fluorescencia en un intervalo de 650-850 nm con excitacion a 520 nm. Se uso como blanco la fluorescencia del metanol y de los extractos de sangre no tratados. Se preparo una curva de calibracion con concentraciones conocidas del sensibilizante.
(x) Biodistribucion. Se anestesio a ratas Wistar (n=2) y se inyecto en su vena caudal el compuesto 5 de la invencion (0,6 mg/kg). El grupo de control (n=2) no fue tratado con sensibilizante. A los 30 min y 24 h despues de la inyeccion, se sacrifico a las ratas (una para cada punto temporal), y se recogieron muestras de los organos o tejidos indicados (corazon, tngado, pulmon, bazo, rinon, cerebro, testfculos, piel, musculo y grasa) en viales tarados y se pesaron, inmediatamente se congelaron sobre hielo seco y se almacenaron a -20°C en la oscuridad hasta su analisis. Para su examen, se descongelo cada muestra, se peso de nuevo y se homogeneizo (Polytron, Kinematica GmbH o Ultra-Turrax) en agua enfriada en hielo. Despues, se congelaron los viales en nitrogeno lfquido y se liofilizaron. Las muestras liofilizadas se extrajeron con metanol (5-10 ml) en una cantidad equivalente al peso del tejido y entonces se agitaron vorticialmente y se centrifugaron. Se recogio el sobrenadante y se analizo y se midio la fluorescencia tal como se ha descrito en (ix) anteriormente. Como blanco se usaron la fluorescencia del metanol y de los extractos de tejido de los animales de control.
(xi) Protocolo de PDT. Se anestesio a ratones desnudos CD1 portadores de glioma de C6 (n=17) y se inyecto el compuesto 5 (0,3 mg/kg) a traves de la vena caudal. El area tumoral se ilumino inmediatamente (intervalo de tiempo de farmaco a luz (DLTI)=0) por via transcutanea durante 15 min mediante un laser de diodo de 755 nm (CeramOptec, Alemania) con una dosis de luz de 80 mW/cm2 (diametro de campo de luz - 14 mm). Despues de la iluminacion se coloco a los ratones (n=12) de nuevo en su jaula. La respuesta tumoral (usando la necrosis local en el dfa 8 despues de la PDT como criterio de valoracion) se registro fotograficamente y se evaluo el volumen tumoral (Gleave et al., 1992). La respuesta se considero parcial cuando solo una parte del tumor iluminado se volvio necrotica. Se considero que los ratones estaban curados cuando se encontraban libres de tumores 90 dfas despues del tratamiento. El crecimiento continuado del tumor despues de la PDT se puntuo como ausencia de respuesta. Se sacrifico a los ratones cuando el diametro tumoral alcanzo 15 mm. Se usaron
los siguientes controles: (i) control de oscuridad (n=3)- ratones portadores de tumores inyectados por via i.v. con sensibilizante pero no iluminados; (ii) control de luz (n=2)- ratones portadores de tumores no inyectados con sensibilizante pero iluminados; (iii) control no tratado (n=2)- ratones portadores de tumores no inyectados con sensibilizante y no iluminados.
5 Ejemplo 72. [Compuesto de referencia] Citofototoxicidad de los compuestos 5, 7, 9 y 11 en celulas endoteliales
Se determino la fototoxicidad de los compuestos 5, 7, 9 y 11 en celulas endoteliales H5V de raton tal como se ha descrito en la seccion (iv)(a) anterior. Las celulas se incubaron con concentraciones crecientes (0,001, 0,01, 0,1, 1 o
10 |jM) de los compuestos durante 1, 6, 60, 90, 120, 240 y 480 min, se lavaron y despues se iluminaron o se 10 mantuvieron en la oscuridad. Los resultados se muestran en las Fig. 3A-3C: la fototoxicidad de los compuestos 5 y
11 tras 90 min de incubacion se muestra en la Fig. 3A; la fototoxicidad de los compuestos 5, 7 y 9 despues de 2 horas de incubacion se muestra en la Fig. 3B; y la fototoxicidad del compuesto 5 (10 jM) despues de incubacion durante 1-10 min se muestra en la Fig. 3C. Tal como puede observarse en las figuras, los sensibilizantes son de rapida accion, su fototoxicidad es dependiente de la concentracion y de la luz y su DL50 es aproximadamente la
15 misma (3 y ~0,2 jM despues de ~ 3 min y 2 h de preincubacion, respectivamente). No se observo toxicidad en la oscuridad para el intervalo de concentracion ensayado.
Ejemplo 73. [Compuesto de referencia] Farmacocinetica y biodistribucion del compuesto 5
Se determinaron la farmacocinetica y la biodistribucion del sensibilizante 5 in vivo en ratas Wistar tal como se ha descrito en las secciones (ix) y (x) anteriores.
20 Los resultados de la farmacocinetica, tal como se ilustran en la Fig. 4, demuestran que aproximadamente un 60 % del sensibilizante 5 se elimino a los 30 min tras la inyeccion i.v. (0,6 mg/kg). La cinetica de eliminacion indica una distribucion bicompartimental 24 h despues de la administracion i.v. Los resultados de la biodistribucion, tal como se ilustra en las Fig. 5A-5B, demuestran que 30 min despues de la inyeccion, los niveles del sensibilizante 5 son relativamente elevados en la sangre, rinones y pulmones (Fig. 5A), y 24 h despues de la inyeccion, el nivel del 25 sensibilizante cae a un nivel practicamente de fondo en la sangre, pero se encontraron niveles significativos en los rinones, el tngado y el bazo (Fig. 5B).
Ejemplo 74. [Compuesto de referencia] Tratamiento fotodinamico de xenoinjertos de glioma C6 en ratones desnudos CD1 con compuesto 5
Basandose en los datos farmacocineticos descritos en el ejemplo 20 anterior, se ajusto el protocolo de tratamiento 30 para el compuesto 5 a 15 min de iluminacion inmediatamente despues de la inyeccion del sensibilizante, usando un laser medico especializado coincidente con el pico de absorcion de 5 (CeramOptec, Alemania, 755 nm). Para ensayar la eficacia del farmaco, se trato a ratones desnudos CD1 macho (n=12) con una dosis de 0,3 mg/kg de compuesto 5 y una intensidad de luz de 80 mW/cm2. Todos los animales en el grupo de tratamiento de luz y farmaco (completo) desarrollaron inflamacion y edema en el dfa 1 despues del tratamiento. La Fig. 6A muestra fotograffas 35 del sitio tumoral de un raton tratado mediante PDT en los dfas 0, 4, 14, 21 y 32. El desarrollo tumoral se observo en el dfa 4 y la necrosis tumoral se observo en el dfa 14. En el dfa 21, se observo un aplanamiento del tumor con una costra cubriendo la herida. En el dfa 32, la herida habfa sanado y el animal estaba curado. Las Fig. 6B-6C son fotograffas del sitio tumoral de un raton inyectado con compuesto 5 pero no iluminado y de un raton inyectado con suero salino e iluminado, respectivamente. En ambos casos, no se produjo necrosis del tumor.
40 La Fig. 7 ilustra una curva de supervivencia de Kaplan-Meier que muestra una supervivencia del 80 % para ratones tratados con compuesto 5 e iluminados (tratamiento, cuadrados).
Ejemplo 75. [Compuesto de referencia] Fototoxicidad del compuesto 5 frente a bacterias Gram-positivas y Gram-negativas
Se ensayo la fototoxicidad del compuesto 5 cargado positivamente en bacterias Gram-positivas St. albus y Gram- 45 negativas E. coli en comparacion con la sal de 131-(2-sulfoetil)amida dipotasica de Pd 31-oxo-15-metoxicarbonilmetil- Rodobacterioclorina cargada negativamente (descrita en el documento PCT/IL03/00973). Las bacterias se inocularon con concentraciones crecientes de los sensibilizantes durante 1 h y se iluminaron o mantuvieron en la oscuridad. Los resultados, ilustrados en las Fig. 8A-8D, demuestran que el compuesto sensibilizante 5 cargado positivamente era fototoxico tanto frente a la bacteria Gram-positiva St. albus (Fig. 8B) (Kd 0,02 jM) y la Gram- 50 negativa E. coli (Fig. 8D) (Kd 1,7 jM), mientras que el sensibilizador cargado negativamente de la tecnica anterior fue eficaz frente a la bacteria Gram-positiva St. albus (Fig. 8A) (Kd 0,3 jM), pero no contra la Gram-negativa E. coli (Fig. 8C). Se observo una muerte de aproximadamente el 100 % de E. coli con 10 jM del compuesto 5 (Fig. 8D). La bacteria Gram-positiva St. albus, fue 100 veces mas sensible al compuesto 5 que la Gram-negativa E. coli. No se observo fototoxicidad cuando se incubaron las bacterias y se trataron con el mismo intervalo de concentracion del 55 sensibilizante sin iluminacion (controles de oscuridad).
5
10
15
20
25
30
35
Ejemplo 76. [Compuesto de referencia] Ensayo de fototoxicidad
Los materiales y metodos son como se han descrito en la seccion biologica anterior.
Se cultivaron celulas H5V (40 x 103/pocillo) en placas de 96 pocillos durante 24 h a una confluencia de ~80 %. Para determinar la fototoxicidad, se reemplazo el medio de cultivo con 100 pl/pocillo de medio, en ausencia o presencia de sensibilizante de 10-8 a 10"6 M, y se incubaron en la oscuridad durante 15 min o 3 h en la incubadora de cultivos. Las placas (grupo de PDT) se colocaron entonces en el campo de luz a temperature ambiente y se iluminaron desde el fondo durante 10 min (800 > A > 650 nm, 12 J/cm2). Despues de la iluminacion, se cambio el medio de cultivo a medio de cultivo reciente. Los cultivos se colocaron en la incubadora de cultivos y se determino la supervivencia celular 24 horas despues usando el ensayo de supervivencia Neutral Red descrito anteriormente.
Se usaron los siguientes controles:
1. Control de luz: las celulas se iluminaron en ausencia de sensibilizante.
2. Control de oscuridad: las celulas se trataron con sensibilizante pero se mantuvieron en la oscuridad.
No tratadas: las celulas se mantuvieron en la oscuridad sin tratamiento alguno.
En las 24 h siguientes despues de la PDT, se reemplazo el medio de cultivo en los pocillos con 100 pl de medio reciente que conterna 40 pg/ml de Neutral Red. La paca se incubo durante 1,5 h en una incubadora de cultivos oscura. Se aspiro el medio y se lavaron las celulas con 100 pl de solucion que conterna un 1 % de CaCl2 y un 0,5 % de formaldel'ndo, que retira el colorante no incorporado y fija las celulas al sustrato. Entonces se extrajo el colorante de las celulas en el sobrenadante tras la adicion de 100 pl de acido acetico glacial al 1 % en etanol al 50 %. Despues de 1-2 min a temperatura ambiente, se determino la densidad optica de los pocillos en un espectrofotometro de microplacas usando un filtro de 570 nm. Despues de restar los blancos del ensayo, se calculo la nueva densidad optica como el valor medio de las determinaciones por triplicado. La supervivencia celular se calculo como el porcentaje del colorante acumulado en el control no tratado. Para determinar la supervivencia celular, los datos se representaron frente a la concentracion de sensibilizante. Entonces se usaron estas curvas para calcular los valores de DL50.
Despues de la smtesis, los compuestos descritos en los ejemplos 23 a 75 anteriores se purificaron, se dividieron en alfcuotas iguales y se liofilizaron para su almacenamiento (desecadas a -20°C). Se determino el contenido exacto del material mediante HPLC-deteccion de matriz de diodo y se evaluo la eficacia de la PDT en dos tiempos de incubacion, tal como se ha descrito en la seccion experimental. Los resultados se presentan en las tablas 1-3 a continuacion:
TABLA 1
Compuesto
CI50 (pM) 3 horas CI50 (pM) 15 min
24
1,2 2,4
25
0,75 1,1
26
0,45 1,0
2Z
0,45 1,5
28
0,38 1,3
29
1,9 1,9
30
0,61 1,7
31
0,60 2,6
32
0,25 0,60
Todos los compuestos preparados segun la invencion mostraron una mejor solubilidad en comparacion con Pd- Bpheid, 3. La mayona de los compuestos requieren bajos porcentajes de Cremophor en manitol isotonico para formar una solucion 100% monomerica a 2 mg/ml mientras que algunos de los compuestos requieren bajas concentraciones de propilenglicol o PEG-400 para obtener la misma solucion monomerica (se considera que el uso de ambos aditivos es muy seguro). La naturaleza zwitterionica de estos compuestos puede ser un factor que contribuye a la necesidad de Cremophor para generar una solucion monomerica.
La smtesis de los compuestos 25 -32 es mucho mas simple que la del monocation original tornado como referencia y reproducido en la presente memoria como 24. Son destacables las actividades de PDT de los compuestos 26, 28 y 32 (por ejemplo, 32 es aproximadamente 4-5 veces mas activo que 24 a ambos tiempos de incubacion).
TABLA 2
Compuesto
CI50 (pM) 3 horas CI50 (pM) 15 min
33*
0,45 0,75
34
0,20 0,48
35
0,21 1,23
10
0,24 0,74
36
0,15 0,37
37
0,21 0,75
38
0,16 0,44
39
1,10 2,44
40
0,35 0,70
41
0,46 1,13
42
0,28 0,68
43
0,18 0,60
44
0,17 1,41
45
0,18 0,20
5
La smtesis de los compuestos 34-45 es mucho mas simple que la del dication original tomado como referencia y reproducido en la presente memoria como 33. Son destacables las actividad de PDT con un corto tiempo de incubacion de 34, 36, 38 y 45 (por ejemplo, 36 es mas activo a los 15 min. de tiempo de incubacion que 33 a las 3 horas).
10 TABLA3
Compuesto
CI50 3 horas (pM) CI5015 min (pM)
46
0,60 1,33
4Z
0,25 0,45
48
0,20 0,60
49
0,57 1,15
50
0,17 0,47
51
0,40 0,78
52
0,89 0,83
53
0,90 2,00
54
0,27 0,75
55
0,43 1,07
56
0,32 0,79
5Z
0,60 1,33
Compuesto
CI50 3 horas (pM) CI5015 min (pM)
58
0,37 0,64
59
0,19 0,45
60
0,24 0,62
61
0,21 0,69
62
0,19 0,63
63
0,21 0,66
64
0,17 0,56
65
0,22 0,43
66
0,20 0,55
6Z
0,18 0,50
68(R)
0,16 0,50
69(S)
0,16 0,50
70
0,16 0,55
73
0,30 0,38
74
0,29 0,74
75
0,16 0,50
Todos los compuestos de la tabla anterior mostraron una mejor solubilidad en comparacion con Pd-Bpheid, 3. La mayona de los compuestos solo requieren bajos porcentajes de propilenglicol o de PEG-400 para formar una solucion monomerica al 100% a 2 mg/ml. Aunque la smtesis de la mayona de compuestos requiere dos o tres transformaciones qmmicas, la mayona de los compuestos pueden prepararse en reacciones en un solo recipiente 5 con mmimas purificaciones y aislamientos intermedios (en los ejemplos presentados en la presente memoria, se uso HPLC preparativa en muchas reacciones durante las etapas de purificacion intermedias y finales, simplemente por conveniencia. Tambien se han empleado extracciones y precipitaciones sencillas de manera satisfactoria para purificar estos compuestos, evitando de este modo la necesidad de la cara y tediosa purificacion HPLC a gran escala.
10 Ejemplo 77. [Compuesto de referencia] Biodistribucion de los compuestos
Los animales eran ratones desnudos CD1 macho que portaban xenoinjertos de RCC. Se usaron tres animales para cada punto temporal. Se usaron los compuestos 28, 32, 10, 36 y 75en los experimentos.
La anestesia se realizo con ketamina:xilazina (85:15, vol/vol).
Se inyecto a los animales anestesiados una solucion del compuesto de ensayo (2 mg/ml) en manitol isotonico a una 15 dosis de 1,5 mg/kg. Se sacrifico a tres animales en cada punto de tiempo y se recogieron muestras de sangre, corazon, pulmon, hngado, rinon, intestino, bazo, musculo, piel, tumor y cerebro. Los puntos de tiempo usados fueron 5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 5 dfas y 7 dfas despues de la inyeccion. Las muestras se pesaron con precision, se disolvieron en acido mtrico concentrado y se analizaron respecto de paladio mediante ICPMS.
Los resultados estan representados en los graficos anexos junto con la presente (Figs. 9A a 9E).
imagen2
co2ch3
l: M=Mg, R=fitilo o geranilgeranilo (Belli a) ' R=Serilo (Bchl-Ser)
N(CH3)3‘a-
H2N(CH2)„NH2
DIEA
metanol-clorofomio 111
co2ch3
0'~^0 COjCHj
N(CH3)j‘A-
N(CH3b*A-
S: M=2H, n=2 7: M=2H. n=3 9: M=2H, n=6 Tl: M=Pd. n=2
contranion
co2ch3
Esquema 1
n h2ch2ch>n(ci i,),+ci
DMF
Z: M=2H
3: M= Pd
imagen3
co2ch3
N(CH3h*A-
ico2ch3
N{CH3)3*A-
N(CH3)3^A-
4; M=2H
10: M=Pd
H2NCH2CH2NH2
CHJ
DIEA
20: M=2H
22: M=2H
21: M=Pd
23: M=Pd
Esquema 2
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Claims (12)

  1. 5
    10
    15
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    35
    REIVINDICACIONES
    1. Un derivado de bacterioclorofila de la formula I:
    imagen1
    en donde
    M representa 2H, un atomo de metal divalente seleccionado entre Pd, Pt, Co, Sn, Ni, Cu, Zn o Mn, o un atomo de metal trivalente seleccionado entre el grupo que consiste en Fe, Mn, Co, Au, Al, Gd, Er, Yb y Cr;
    R1 es Y-R8, -NRgR'g o -N RgR'gR"gA;
    Y es O o S;
    R2 es H, OH o COORg;
    R3 es H, OH, alquilo C1-C12 o alcoxi C1-C12;
    R4 es -CH=CRgR'g, -CH=CRgHal, -CH=CH-CH2-NRgR'g, -CH=CH-CH2- N+RgR'gR"gA‘, - CHO, -CH=NRg, -CH=N+RgR'g A', -CH2-ORg, -CH2-SRg, -CH2-Hal, -CH2-Rg, -CH2-NRgR'g, -CH2-N+RgR'gR"g A', -CH2-CH2Rg, -CH2- CH2Hal, -CH2-CH2ORg, -CH2-CH2SRg, -CH2-CH2-NRgR'g,-CH2-CH2-N+RgR'gR"gA‘, -COCH3, C(CH3)=CRgR'g, - C(CH3)=CRgHal, -C(CH3)=NRg,-CH(CH3)=N+RgR'gA', -CH(CH3)-Hal, -CH(CH3)-ORg, -CH(CH3)-SRg, -CH(CH3)- NRgR'g, CH(CH3)-N+RgR'g R"gA' o -C=CRg;
    R5 es =O, =S, =N-Rg, =N RgR'gA, =CRgR'g o =CRg-Hal;
    cada R8, Rg, R'g y R"g es independientemente:
    (a) H;
    (b) hidrocarbilo C1-C25, preferiblemente alquilo C1-C25, mas preferiblemente alquilo C1-C10 o C1-C6, sin sustituir o sustituido con uno o mas radicales seleccionados entre:
    (i) un grupo funcional seleccionado entre halogeno, nitro, oxo, OR, SR, epoxi, epitio, aziridina, -CONRR', -COR, COOR, -OSO3R, -SO3R, -SO2R, -NHSO2R, - SO2NRR' =N-OR, =N-NRR', -(CH2)nNR-COR', -(CH2)n-CO-NRR', -O-(CH2)n-OR, -O-(CH2)n-O-(CH2)n-R, -PRR', -OPO3RR', -PO2HR o -PO3RR', en donde n es un numero entero de 1 a 6;
    (ii) unos grupos cargados positivamente seleccionados entre: un grupo onio; un cation derivado de un grupo que contiene N seleccionado entre O-^N+(RR')-, >C=N+(RR'),-N+(RR'R"), -(R)N-N+(RR'R"), -(R)N- C(=HN)-N+RR'R", -C(=NH)-N+(RR'R"); un cation derivado de un compuesto heteroaromatico que contiene uno o mas atomos de N y opcionalmente atomos de O o S;
    (iii) un grupo cargado negativamente seleccionado entre COO-, COS-, -OSO3", -SO3", -OPO3R", -PO2H- -PO32 o -PO3R";
    (iv) un grupo basico que se convierte en unos grupos cargados positivamente en condiciones fisiologicas seleccionado entre -NRR', -C(=NR)-NR'R", -NR-NR'R", -(R)N-C(=NR)-NR'R", O^NR-, >C=NR o un radical heteroaromatico que contiene N;
    (v) un grupo acido que se convierte en unos grupos cargados negativamente en condiciones fisiologicas seleccionado entre -COOH, -COSH, -SO3H y -PO3H2; o
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    (vi) un residuo de un aminoacido, un peptido, una protema, un monosacarido, un oligosacarido o un polisacarido;
    (c) hidrocarbilo C1-C25, preferiblemente alquilo C1-C25, mas preferiblemente alquilo C1-C10 o C1-C6, que contiene uno o mas heteroatomos y/o uno o mas restos carbodclicos o heterodclicos, opcionalmente sustituido adicionalmente con uno o mas radicales segun se han definido en (b); o
    (d) un residuo de un aminoacido, un peptido, una protema, un monosacarido, un oligosacarido o un polisacarido;
    en donde cada uno de R, R' y R" es independientemente H, hidrocarbilo, preferiblemente alquilo C1-C25, mas preferiblemente alquilo C1-C10 o Ci-Ca, o heterociclilo, o dos de R, R' y R" junto con el atomo de N al que estan unidos forman un anillo saturado de 3-7 miembros, que contiene opcionalmente uno o mas heteroatomos seleccionados entre O, S o N y esta opcionalmente sustituido adicionalmente en el atomo de N adicional con alquilo opcionalmente sustituido con halogeno, hidroxilo o amino;
    R8 puede ser adicionalmente H+ o un cation R+10 cuando R1 es Y-R8;
    R+10 es amonio, un cation de un metal, preferiblemente de un metal alcalino o alcalinoterreo, tal como Na, K, Li, Ca, Ba o un cation derivado de un grupo que contiene N segun se ha definido en (ii) anteriormente;
    A es un anion fisiologicamente aceptable;
    m es 0 o 1; y
    sales farmaceuticamente aceptables e isomeros opticos del mismo;
    con la condicion de que, cuando R2 y R3 sean ambos H, R5 no sea =N-Rg y/o R4 no sea -C(CH3)=NRg; y con la condicion adicional de que el derivado de bacterioclorofila de formula I tenga al menos un grupo cargado positivamente y/o al menos un grupo basico que se convierta en un grupo cargado positivamente en condiciones fisiologicas.
  2. 2. El derivado de bacterioclorofila segun la reivindicacion 1, que contiene al menos un grupo cargado positivamente.
  3. 3. El derivado de bacterioclorofila segun la reivindicacion 2, en donde dicho al menos un grupo cargado positivamente se selecciona entre: (i) un grupo onio seleccionado entre -O+(RR'), -S+(RR'), -Se+(RR'), -Te+(RR'), -P+(RR'R"), -As+(RR'R"), -Sb+(RR'R") o -Bi+(RR'R"); (ii) un cation derivado de un grupo que contiene N segun se ha definido en la reivindicacion 1, preferiblemente un grupo amonio de la formula -N+(Rr'R"); o (iii) un cation derivado de un compuesto heteroaromatico que contiene uno o mas atomos de N y opcionalmente atomos de O o S, seleccionado entre pirazolio, imidazolio, oxazolio, tiazolio, piridinio, quinolinio, isoquinolinio, pirimidinio, 1,2,4- triazinio, 1,3,5-triazinio o purinio; en donde cada R, R' y R" es independientemente H, hidrocarbilo preferiblemente alquilo C1-C25, mas preferiblemente o alquilo CrCa, o heterociclilo, o R y R' junto con el atomo de N al que estan unidos forman un anillo saturado de 3-7 miembros, que contiene opcionalmente uno o mas heteroatomos seleccionados entre O, S o N y opcionalmente sustituido adicionalmente en el atomo de N adicional con alquilo opcionalmente sustituido con halogeno, hidroxilo o amino; y en donde dicho grupo cargado positivamente es un grupo terminal o un grupo situado dentro de una cadena de hidrocarbilo de la molecula de bacterioclorofila.
  4. 4. El derivado de bacterioclorofila segun la reivindicacion 1 o 3, en donde dicho anillo saturado de 3-7 miembros se selecciona entre aziridina, pirrolidina, piperidina, morfolina, tiomorfolina, azepina o piperazina opcionalmente sustituido en el atomo de N adicional con alquilo CrCa opcionalmente sustituido con halo, hidroxilo o amino.
  5. 5. El derivado de bacterioclorofila segun la reivindicacion 1, que contiene al menos un grupo basico que se convierte en un grupo cargado positivamente en condiciones fisiologicas.
  6. 6. El derivado de bacterioclorofila segun la reivindicacion 5, en donde dicho grupo basico que se convierte en un grupo cargado positivamente en condiciones fisiologicas es un radical heteroaromatico que contiene N seleccionado entre pirazolilo, imidazolilo, oxazolilo, tiazolilo, piridilo, quinolinilo, isoquinolinilo, pirimidilo, 1,2,4-triazinilo, 1,3,5- triazinilo o purinilo.
  7. 7. El derivado de bacterioclorofila segun la reivindicacion 1, en donde cada R8, Rg, R'g y R"g es independientemente hidrocarbilo C1-C25, preferiblemente una cadena de alquilo C1-C25 o alquenilo C2-C25 lineal o ramificada, mas preferiblemente alquilo C1-C10 o C1-Ca, que contiene opcionalmente uno o mas heteroatomos o uno o mas restos carbodclicos o heterodclicos.
  8. 8. El compuesto sal yoduro de ester metflico de O-[Pd-Bpheid]-[N3-trimetilamonio-2-metil]-serina, designado en la presente memoria compuesto 13.
  9. 9. Una composicion farmaceutica que comprende un derivado de bacterioclorofila de formula I segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y un vehmulo farmaceuticamente aceptable.
    5
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  10. 10. La composicion farmaceutica segun la reivindicacion 9, para su uso en las siguientes indicaciones:
    (a) terapia fotodinamica;
    (b) terapia fotodinamica vascular dirigida (VTP);
    (c) tratamiento de enfermedades cardiovasculares incluyendo oclusion de vasos y la trombosis en las enfermedades de la arteria coronaria, la hiperplasia de la mtima, la restenosis y las placas ateroscleroticas;
    (d) prevencion o reduccion en de restenosis dentro de stent tras angiograffa coronaria;
    (e) tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones dermatologicas seleccionadas entre acne, cicatrices por acne, psoriasis, pie de atleta, verrugas, queratosis acffnica y manchas en vino de Oporto;
    (f) tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones oftalmicas seleccionadas entre neovascularizacion corneal y coroidal y degeneracion macular asociada a la edad (AMD);
    (g) diagnostico de tumores;
    (h) eliminacion de celulas o agentes infecciosos que comprenden bacterias y virus, preferiblemente eliminacion in vitro de bacterias y virus en un producto biologico tras la iluminacion de dicho producto, preferiblemente en donde dicho producto biologico es sangre.
  11. 11. La composicion farmaceutica para su uso segun la reivindicacion 10, en donde dicha indicacion es terapia fotodinamica o terapia fotodinamica vascular dirigida de tumores no malignos, tales como hipertrofia de prostata benigna o de tumores malignos incluyendo tumores primarios y metastasicos, seleccionados entre melanoma tumores de prostata, de cerebro, de cabeza, de cuello, de colon, de ovario, de mama, de la pared toracica que surgen a partir del cancer de mama, canceres de piel, de pulmon, de esofago y de vejiga y otros tumores sensibles a hormonas.
  12. 12. Uso de un derivado de bacterioclorofila de formula I segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la fabricacion de una composicion farmaceutica para la siguiente indicacion:
    (a) terapia fotodinamica o terapia fotodinamica vascular dirigida (VTP) de:
    (i) tumores malignos incluyendo tumores primarios y metastasicos, seleccionados entre melanoma tumores de prostata, de cerebro, de cabeza, de cuello, de colon, de ovario, de mama, de la pared toracica que surgen a partir del cancer de mama, canceres de piel, de pulmon, de esofago y de vejiga y otros tumores sensibles a hormonas;
    (ii) tumores no malignos, tales como hipertrofia de prostata benigna;
    (iii) degeneracion macular asociada a la edad.
    (b) prevencion o reduccion dentro de stent en un individuo que padece de una enfermedad cardiovascular que se sometio a angiograffa coronaria;
    (c) tratamiento de aterosclerosis;
    (d) diagnostico de tumores;
    (e) eliminacion de celulas o agentes infecciones que comprenden bacterias y virus, preferiblemente eliminacion in vitro de bacterias y virus en un producto biologico tras iluminacion de dicho producto biologico, preferiblemente en donde dicho producto biologico es sangre.
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