ES2604329T3 - Enzimas que tienen actividad de alfa amilasa y métodos de uso de las mismas - Google Patents
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Abstract
Un ácido nucleico aislado, sintético o recombinante que comprende: (A) (i) una secuencia que codifica un polipéptido que tiene actividad de alfa amilasa, en la que dicha secuencia tiene por lo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 77 o fragmentos enzimáticamente activos de la misma, en la que el fragmento tiene actividad de alfa amilasa, o (ii) la secuencia de (i), en la que se determina la identidad de secuencia mediante análisis con un algoritmo de comparación de secuencia, o se determina mediante inspección visual, o (iii) la secuencia de (ii), en la que el algoritmo de comparación de secuencia comprende un algoritmo 3.0t78 de versión FASTA con parámetros predeterminados; (B) un ácido nucleico que comprende (i) una secuencia que codifica un polipéptido que tiene actividad de alfa amilasa, en la que la secuencia de aminoácidos del polipéptido tiene por lo menos 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 78 o fragmentos enzimáticamente activos de la misma, en la que el fragmento tiene actividad de alfa amilasa, o (ii) la secuencia de (i), en la que se determina la identidad de secuencia mediante análisis con un algoritmo de comparación de secuencia, o se determina mediante inspección visual, o (iii) la secuencia de (ii), en la que el algoritmo de comparación de secuencia comprende un algoritmo 3.Ot78 de versión FASTA con parámetros predeterminados; (C) un ácido nucleico que comprende una secuencia de cualquiera de (A) a (B) que codifica un polipéptido que carece de una secuencia de señal; (D) un ácido nucleico que comprende: (i) una secuencia de cualquiera de (A) a (C) que codifica un polipéptido que comprende adicionalmente una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga; (ii) la secuencia de (i), en la que la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga codifica una secuencia de señal; (iii) la secuencia de (ii), en la que la secuencia de señal heteróloga comprende una secuencia de señal de amilasa; o (E) una secuencia de ácidos nucleicos completamente complementaria a cualquier secuencia de ácidos nucleicos de (A) a (D).
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A/C/T, A C/G, o E, donde E es cualquier base que no es A, C, G, o T (E se puede denominar como un oligo diseñador).
En un sentido general, la mutagénesis de saturación se compone de mutagénesis de un grupo completo de casetes mutagénicos (en la que cada casete tiene preferiblemente aproximadamente 1 a 500 bases de longitud) en la secuencia de polinucleótidos definida que se va a mutagenizar (en la que la secuencia que se va a mutagenizar tiene preferiblemente de aproximadamente 15 a 100,000 bases de longitud). Por lo tanto, un grupo de mutaciones (que varía de 1 a 100 mutaciones) se introduce en cada casete que se va a mutagenizar. Una agrupación de mutaciones que se va a introducir en un casete puede ser diferente o el mismo de una segunda agrupación de mutaciones que se va a introducir en un segundo casete durante la aplicación de una ronda de mutagénesis de saturación. Dichas agrupaciones se ejemplifican por supresiones, adiciones, agrupaciones de codones particulares y agrupaciones de casetes de nucleótidos particulares.
Las secuencias definidas que se van a mutagenizar incluyen un gen completo, ruta, cADN, un marco de lectura abierta completo (ORF), y promotor completo, potenciador, represor/transactivador, origen de replicación, intrón, operador, o cualquier grupo funcional de polinucleótido. En general, unas "secuencias definidas" para este propósito pueden ser cualquier polinucleótido de una secuencia de polinucleótidos de 15 bases, y secuencias de polinucleótidos de longitudes entre 15 bases y 15,000 bases (esta divulgación específicamente nombra cada entero entre ellos). Consideraciones en la elección de agrupaciones de codones incluyen tipos de aminoácidos codificados por un casete mutagénico degenerado.
En una ejemplificación particularmente preferida una agrupación de mutaciones se puede introducir en un casete mutagénico, esta divulgación se proporciona específicamente para sustituciones de codones degenerados (utilizando oligos degenerados) que codifican 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, y 20 aminoácidos en cada posición, y una colección de polipéptidos codificados por los mismos.
Un aspecto de la invención es un ácido nucleico aislado que comprende una de las secuencias de secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, las secuencias complementarias de las mismas, o un fragmento que comprende por lo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, o 500 bases consecutivas de una de las secuencias de una secuencia de ácidos nucleicos del Grupo A (o las secuencias complementarias de las mismas). Los ácidos nucleicos aislados, pueden comprender ADN, que incluyen cADN, ADN genómico y ADN sintético. El ADN puede ser de cadena doble o de cadena sencilla, y si es de cadena sencilla puede ser la cadena codificante o cadena no codificante (antisentido). Alternativamente, los ácidos nucleicos aislados pueden comprender ARN.
Como se discute en más detalle a continuación, los ácidos nucleicos aislados de una de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, se pueden utilizar para preparar uno de los polipéptidos de una secuencia de aminoácidos del Grupo B, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, o fragmentos enzimáticamente activos de uno de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas.
De acuerdo con lo anterior, otro aspecto de la invención es un ácido nucleico aislado que codifica uno de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas,
- o fragmentos enzimáticamente activos de uno de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B. Las secuencias de codificación de estos ácidos nucleicos pueden ser idénticas a una de las secuencias de codificación de uno de los ácidos nucleicos de secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, o un fragmento del mismo o pueden ser diferentes secuencias de codificación que codifican uno de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, y fragmentos enzimáticamente activos de uno de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, como resultado de la redundancia
- o degeneración del código genético. El código genético es bien conocido por aquellos expertos en la técnica y se puede obtener, por ejemplo, en la página 214 de B. Lewin, Genes VI, Oxford University Press, 1997.
El ácido nucleico aislado que codifica uno de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, puede incluir, pero no se limita a: sólo la secuencia de codificación de una de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas y secuencias de codificación adicionales, tales como secuencias líder o secuencias de proproteína y secuencias sin sentido, tales como intrones o secuencias no codificantes 5 'y/o 3' de la secuencia de codificación. Por lo tanto, como se utiliza aquí, el término "polinucleótido que codifica un polipéptido" abarca un polinucleótido que incluye sólo la secuencia de codificación del polipéptido así como un polinucleótido que incluye secuencia de codificación adicional y/o secuencia de no codificación.
Alternativamente, las secuencias de ácidos nucleicos de secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, se pueden mutagenizar utilizando técnicas convencionales, tales como mutagénesis dirigida a sitio u otras técnicas familiares para aquellos expertos en la técnica, para introducir cambios silenciosos en los polinucleótidos de secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, y secuencias sustancialmente
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pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL (Pharmacia). Sin embargo, se puede utilizar cualquier otro vector siempre que sea replicable y viable en la célula anfitriona.
La célula anfitriona puede ser cualquiera de las células anfitrionas familiares para aquellos expertos en la técnica, que incluyen células procariotas, células eucariotas, células de mamífero, células de insecto, o células de plantas. Como ejemplos representativos de anfitriones apropiados, se pueden mencionar: células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y varias especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus, células fúngicas, tales como levaduras, células de insectos tales como Drosophila S2 y Espodóptera Sf9, células de animales tales como CHO, COS o melanoma de Bowes y adenovirus. La selección de un anfitrión apropiado está dentro de las capacidades de aquellos expertos en la técnica.
Se puede introducir el vector en células anfitrionas utilizando cualquiera de una variedad de técnicas, que incluyen transformación, transfección, transducción, infección viral, pistolas de genes o transferencia de genes mediada por Ti. Métodos particulares incluyen transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, o electroporación (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).
Cuando sea apropiado, las células anfitrionas manipuladas por ingeniería se pueden cultivar en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes de la invención. Luego de transformación de una cepa anfitriona adecuada y el crecimiento de la cepa anfitriona hasta una densidad celular apropiada, se puede inducir el promotor seleccionado por medios apropiados (por ejemplo, cambio de temperatura o inducción química) y las células se pueden cultivar durante un período adicional para que puedan producir el polipéptido o fragmento deseado del mismo.
Las células se recogen normalmente mediante centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos, y el extracto crudo resultante se retiene para una purificación adicional. Las células microbianas empleadas para la expresión de proteínas se pueden romper mediante cualquier método conveniente, que incluyen ciclos de congelacióndescongelación, sonicación, rotura mecánica o uso de agentes de lisis celular. Dichos métodos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. El polipéptido o fragmento expresado del mismo se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes por métodos que incluyen precipitación de sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía de lectina. Se pueden utilizar etapas de replegamiento de proteína, según sea necesario, para completar la configuración del polipéptido. Si se desea, la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se puede emplear para las etapas finales de purificación.
También se pueden emplear diversos sistemas de cultivo de células de mamífero para expresar la proteína recombinante. Ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos incluyen las estirpes COS-7 de fibroblastos de riñón de mono (descritas por Gluzman, Cell, 23: 175, 1981), y otras estirpes celulares capaces de expresar proteínas a partir de un vector compatible, tales como estirpes celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK.
Se pueden utilizar construcciones en células anfitrionas de una manera convencional para producir el producto génico codificado por la secuencia recombinante. Dependiendo del anfitrión empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos producidos por las células anfitrionas que contienen el vector pueden estar glicosilados o pueden estar no glicosilados. Los polipéptidos de la invención también pueden o no incluir un residuo inicial del aminoácido metionina.
Alternativamente, los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, o fragmentos que comprenden por lo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o 150 de aminoácidos consecutivos de las mismas se pueden producir sintéticamente mediante sintetizadores de péptidos convencionales. En otras realizaciones, se pueden emplear fragmentos o porciones de polipéptidos para producir el correspondiente polipéptido de longitud completa mediante síntesis de péptidos; por lo tanto, se pueden emplear fragmentos como intermedios para producir los polipéptidos de longitud completa.
También se pueden emplear sistemas de traducción libres de células para producir uno de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, y las secuencias sustancialmente idénticas de las mismas , o fragmentos que comprenden por lo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o 150 aminoácidos consecutivos de las mismas utilizando mARN transcrito de una construcción de ADN que comprende un promotor ligado operativamente a un ácido nucleico que codifica el polipéptido o fragmento del mismo. En algunas realizaciones, la construcción de ADN puede ser linealizada antes de conducir una reacción de transcripción in vitro. El mARN transcrito luego se incuba con un extracto de traducción libre de células adecuado, tal como un extracto de reticulocitos de conejo, para producir el polipéptido o fragmento deseado del mismo.
La invención también se relaciona con variantes de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, o enzimáticamente activas de las mismas. El término
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"variante" incluye derivados o análogos de estos polipéptidos. En particular, las variantes pueden diferir en la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, y las secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, por una o más sustituciones, adiciones, supresiones, fusiones y truncamientos, que pueden estar presentes en cualquier combinación.
Las variantes pueden ser de origen natural o creadas in vitro. En particular, se pueden crear dichas variantes utilizando técnicas de ingeniería genética tales como mutagénesis dirigida a sitio, mutagénesis química aleatoria, procedimientos de supresión con exonucleasa III, y técnicas de clonación estándar. Alternativamente, dichas variantes, fragmentos, análogos, o derivados se pueden crear utilizando procedimientos de síntesis química o de modificación.
Otros métodos de fabricación de variantes también son familiares para aquellos expertos en la técnica. Estos incluyen procedimientos en los que las secuencias de ácidos nucleicos obtenidss a partir de aislados naturales se modifican para generar ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que tienen características que mejoran su valor en aplicaciones industriales o de laboratorio. En dichos procedimientos, un gran número de secuencias variantes que tienen una o más diferencias de nucleótidos con respecto a la secuencia obtenida a partir del aislado natural son generados y caracterizados. Normalmente, estas diferencias de nucleótidos dan como resultado cambios de aminoácidos con respecto a los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos de los aislados naturales.
Por ejemplo, se pueden crear las variantes utilizando PCR propensa a error. En la PCR propensa a error, la PCR se realiza bajo condiciones donde es baja la fidelidad de copia del ADN polimerasa, de tal manera que se obtiene una alta tasa de mutaciones de punto a lo largo de toda la longitud del producto de PCR. La PCR propensa a error se describe en Leung, DW, et al, Technique, 1 :11-15, 1989) and Caldwell, R. C. & Joyce G.F., PCR Methods Applic, 2:28-33, 1992. En pocas palabras, en dichos procedimientos, los ácidos nucleicos que se van a mutagenizar se mezclan con cebadores de PCR, regulador de reacción, MgCl2, MnCl2, polimerasa Taq y una concentración apropiada de dNTPs para lograr una alta tasa de mutación puntual a lo largo de toda la longitud del producto de PCR. Por ejemplo, la reacción se puede llevar a cabo utilizando 20 fmoles de ácido nucleico que se ha mutagenizado, 30pmole de cada cebador de PCR, un regulador de reacción que comprende KCl 50 mM, Tris HCl 10 mM (pH 8.3) y 0.01% de gelatina, MgCl2 7 mM, MnCl2 0.5 mM, 5 unidades de polimerasa Taq, dGTP 0.2 mM, dATP 0-2 mM, dCTP 1 mM, y dTTP 1 mM. Se puede realizar PCR durante 30 ciclos de 94°C durante 1 min, 45°C durante 1 min, y 72°C durante 1 min. Sin embargo, se apreciará que estos parámetros se pueden variar según sea apropiado. Los ácidos nucleicos mutagenizados se clonan en un vector apropiado y la actividad de los polipéptidos codificados por los se evalúa ácidos nucleicos mutagenizados.
También se pueden crear variantes utilizando mutagénesis dirigida por oligonucleótidos para generar mutaciones específicas del sitio en cualquier ADN clonado de interés. La mutagénesis dirigida a oligonucleótidos se describe en Reidhaar-Olson, J.F. & Sauer, R.T., et al., Science, 241:53-57, 1988. En pocas palabras, en dichos procedimientos se sintetiza una pluralidad de oligonucleótidos de cadena doble que llevan una o más mutaciones que se van a introducir en el ADN clonado y se inserta en el ADN clonado para ser mutagenizada. Los clones que contienen el ADN mutado se recuperan y se evalúan las actividades de los polipéptidos que los codifican.
Otro método para la generación de variantes es PCR de ensamble. El PCR de ensamble implica el ensamble de un producto de PCR a partir de una mezcla de pequeños fragmentos de ADN. Un gran número de diferentes reacciones de PCR se producen en paralelo en el mismo frasco, con los productos de una reacción que ceba los productos de otra reacción. El PCR de ensamble se describe en la Patente Estadounidense No. 5,965,408, presentada el 9 de julio de 1996, titulada "Método de Reensamblaje de ADN mediante Interrupción de Síntesis".
Aún otro método de generación de variantes es mutagénesis de PCR sexual. En la mutagénesis de PCR sexual, se produce recombinación homóloga forzada entre moléculas de ADN de diferentes pero muy relacionadas secuencias de ADN in vitro, como resultado de la fragmentación aleatoria de la molécula de ADN con base en la homología de secuencia, seguido de fijación del filtro de cruce mediante extensión de cebador en una reacción de PCR. La mutagénesis de PCR sexual se describe en Stemmer, WP, PNAS, EE.UU., 91: 10747 a 10751, 1994. En resumen, en este tipo de procedimientos de una pluralidad de ácidos nucleicos que se van a recombinar se digiere con DNasa para generar fragmentos que tienen un tamaño promedio de 50 a 200 nucleótidos. Los fragmentos del tamaño promedio deseado se purifican y se resuspenden en una mezcla de PCR. Se realiza bajo condiciones que facilitan recombinación entre los fragmentos de ácido nucleico. Por ejemplo, se puede realizar PCR al resuspender los fragmentos purificados a una concentración de 10-30 ng/: 1 en una solución de 0.2 mM de cada dNTP, MgC12 2.2 mM, KCl 50 mM, Tris HCl10 mM, pH 9.0, y 0,1% de Triton X-100. Se agregan 2.5 unidades de polimerasa Taq por
100: 1 de mezcla de reacción y se realiza PCR utilizando el siguiente régimen: 94°C durante 60 segundos, 94°C durante 30 segundos, 50 a 55°C durante 30 segundos, 72°C durante 30 segundos (30-45 veces) y 72°C durante 5 minutos. Sin embargo, se apreciará que estos parámetros se pueden variar según sea apropiado. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos pueden estar incluidos en las reacciones de PCR. En otras realizaciones, se puede utilizar el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I en un primer grupo de reacciones de PCR y se puede utilizar polimerasa Taq en un grupo posterior de reacciones de PCR. Se aíslan las secuencias recombinantes y se evalúan las actividades de los polipéptidos que se van a codificar.
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secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, o fragmento de la misma. Después de un lavado para eliminar las proteínas unidas no específicamente, se eluyen los polipéptidos unidos específicamente.
La capacidad de las proteínas en una muestra biológica de unirse al anticuerpo se puede determinar utilizando cualquiera de una variedad de procedimientos familiares para aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, la unión se puede determinar al marcar el anticuerpo con un marcador detectable tal como un agente fluorescente, un marcador enzimático, o un radioisótopo. Alternativamente, se puede detectar la unión del anticuerpo a la muestra utilizando un anticuerpo secundario que tiene dicha una etiqueta detectable sobre el mismo. Los ensayos particulares incluyen ensayos de ELISA, ensayos tipo sándwich, radioinmunoensayos, y transferencias Western.
Los anticuerpos policlonales generados contra los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, o fragmentos enzimáticamente activos de las mismas se pueden obtener mediante inyección directa de los polipéptidos en un animal o al administrar los polipéptidos a un animal, por ejemplo, un no humano. El anticuerpo obtenido de esa manera luego se unirá al polipéptido en sí mismo. De esta manera, se puede utilizar incluso una secuencia que codifica solo un fragmento del polipéptido para generar anticuerpos que pueden unirse a todo el polipéptido nativo. Dichos anticuerpos se pueden utilizar luego para aislar el polipéptido a partir de células que expresan ese polipéptido.
Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se puede utilizar cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos continuos de estirpes celulares. Ejemplos incluyen técnica del hibridoma (Kohler and Milstein, Nature, 256: 495-497, 1975, y la técnica de hibridoma de células B humanas (Cole, et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96.
Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (Patente estadounidense No. 4,946,778) se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena sencilla a los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, o fragmentos enzimáticamente activos de las mismas. Alternativamente, se pueden utilizar ratones transgénicos para expresar anticuerpos humanizados a estos polipéptidos o fragmentos de los mismos.
Los anticuerpos generados contra los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, o fragmentos enzimáticamente activos de las mismas se pueden utilizar en el cribado de polipéptidos similares de otros organismos y muestras. En dichas técnicas, los polipéptidos del organismo se ponen en contacto con el anticuerpo y se detectan aquellos polipéptidos que se unen específicamente al anticuerpo. Se puede utilizar cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente para detectar la unión de anticuerpos. Uno de dichos ensayos de cribado se describe en "Methods for Measuring Cellulase Activities", Methods in Enzymology, Vol 160, pp. 87-116.
Como se utiliza aquí, el término "secuencia de ácidos nucleicos como se estable en las SEQ ID Nos.: abarca las secuencias de nucleótidos de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, así como secuencias homólogas a secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y fragmentos de las mismas y secuencias complementarias a todas las secuencias anteriores. los fragmentos incluyen porciones de las SEQ ID Nos.: que comprende por lo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, o 500 nucleótidos consecutivos de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas. Las secuencias homólogas y fragmentos de secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, se refieren a una secuencia que tiene por lo menos 99%, 98%, 97%, 96%, 95% de homología con estas secuencias. Se puede determinar la homología utilizando cualquiera de los programas de ordenador y parámetros descritos aquí, que incluyen FASTA versión 3.0t78 con los parámetros predeterminados. Las secuencias homólogas también incluyen secuencias de ARN en la que las uridinas reemplazan las timinas en las secuencias de ácidos nucleicos como se establece en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A. Se pueden obtener secuencias homólogas utilizando cualquiera de los procedimientos descritos aquí o puede resultar de la corrección de un error de secuenciación. Se apreciará que las secuencias de ácidos nucleicos como se establecen en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, se pueden representar en el formato tradicional de carácter individual (Véase la contraportada interior de r, Lubert. Biochemistry, 3rd Ed., W. H Freeman & Co., New York.) o en cualquier otro formato que registra la identidad de los nucleótidos en una secuencia.
Como se utiliza aquí, el término "una secuencia de polipéptidos como se establece en la SEQ ID No: abarca la secuencia de polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, que se codifican por una secuencia como se establece en las SEQ ID Nos: secuencias de polipéptidos homólogas a los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, y secuencias sustancialmente idénticas de las mismas, o fragmentos de cualquiera de las secuencias anteriores. Las secuencias de polipéptidos homóloga se refieren a una secuencia de polipéptidos que tiene por lo menos 99%, 98%, 97% de homología con una de las secuencias de polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B. Se puede determinar la homología utilizando cualquiera de los programas de ordenador y parámetros descritos aquí, que incluyen FASTA versión 3.0t78 con los parámetros predeterminados o con cualesquier parámetros modificados. Se
30
estos contaminantes, se utiliza una técnica estéril al hacer 2% de soluciones de almidón rojo y almacenar las cepas ya sea a 4°C o en hielo.
Ejemplo 8
Análisis bioinformático
5 Un análisis bioinformático inicial se hizo con las secuencias de α-amilasa hipertermofílicas conocidas. La figura 14a muestra una alineación de las secuencias, algunas de los cuales se han depositado en la base de datos NCBI. Este análisis reveló el potencial para el diseño de cebadores degenerados para PCR, el gen entero menos su secuencia de señal (véase Figura 14a), produciendo potencialmente alfa amilasas de longitud completa novedosas a partir de una colección.
10 Las siguientes colecciones se cribaron por PCR a partir de ADN genómico:
Tabla 6
- Colección #
- Nombre Positivo a PCR Subclonado
- 5
- A.lithotropicus No
- 13
- Pyrodictium occultum No
- 17
- Pyrodictium TAG11 No Si
- 113
- Deep sea enrichme Si Si
- 170
- Deep sea enrichme Si Si
- 198
- Archaeglobus No
- 206
- Acidianus sp No
- 453
- Mixed iceland enrich No
- 455
- Mixed iceland enrich Si Si
La Figura 14b muestra una alineación de las secuencias identificadas y la tabla adelante sus porcentajes de identidad relativos.
Tabla 7: % de identidad de secuencias de nucleótidos
- SEQ ID NO.: 81
- pyro Pyro 2 thermo therm2 SEQ ID NO.: 75 SEQ ID NO.: 77 SEQ ID NO.: 83 SEQ ID NO.: 85 SEQ ID NO.: 79
- SEQ ID NO.: 81
- 100 91.7 75.1 82.1 80.1 82.5 82.6 82.1 82.6 83
- pyro
- 100 100 74.8 82.5 80.5 82 82.2 82.9 82.8 84
- Pyro2
- 100 71.5 71.1 74 74.2 77 77.1 73
- therm
- 100 81.7 83.5 83.8 82.8 83.2 83.8
- therm2
- 100 88.9 88.8 84.1 84.7 84
- SEQ ID NO.: 75
- 100 98.3 84.6 85.2 85.5
53
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-
imagen1 imagen2 imagen3 imagen4
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