ES2606765T3 - Bacterias del ácido láctico para reducir la inflamación en mamíferos - Google Patents

Bacterias del ácido láctico para reducir la inflamación en mamíferos Download PDF

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Abstract

Cultivo biológicamente puro de Lactobacillus reuteri ATCC PTA-6475.

Description

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DESCRIPCION
Bacterias del acido lactico para reducir la inflamacion en mamiferos Antecedentes de la invencion Campo de la invencion
Esta descripcion se refiere al uso de un metodo para la deteccion de cepas bacterianas antiinflamatorias no patogenas, y a productos y metodos que usan tales cepas para el tratamiento y la profilaxis de la inflamacion no deseada provocada por determinadas bacterias u otros agentes que provocan inflamacion.
Descripcion de la tecnica relacionada
Los monocitos abandonan la medula osea y se desplazan a traves de los vasos sanguineos perifericos hasta que llegan a la mucosa/serosa del tracto gastrointestinal. Estos supuestos macrofagos son clave para la interaccion y propagacion de las senales necesarias para regular el sistema inmunitario del GI.
En el tracto gastrointestinal, hay un nivel constante de respuesta inmunitaria en los macrofagos del epitelio mucoso frente a las bacterias en la luz intestinal y unidas a la mucosa intestinal. En estado normal, esta respuesta implica la generacion senales de citocinas para restringir y contener una respuesta inflamatoria innecesaria. Sin embargo, cuando se presenta un patogeno o una toxina a estas celulas, forman la primera linea de defensa y reaccionan produciendo una cantidad creciente de citocinas proinflamatorias, que propagan la respuesta inflamatoria hasta que se elimina la amenaza. La generacion de citocinas relevantes para las interacciones con bacterias comensales (que no representan una amenaza) asi como las implicadas en la respuesta inflamatoria completa frente a patogenos, esta sujeta a la intervencion de las propias bacterias del acido lactico (incluyendo antigenos de superficie) o de sustancias producidas por estas bacterias del acido lactico y esta claro que la flora comensal tiene una extensa interaccion con los macrofagos de la mucosa para mantener una reaccion equilibrada con respecto a la flora intestinal y mantener asi una salud optima (Rook GA, Adams V, Hunt J, Palmer R, Martinelli R, Brunet LR. Mycobacteria and other environmental organisms as immunomodulators for immunoregulatory disorders. Springer Semin Immunopathol 2004; 25:237-255).
Se sabe que diversos patogenos pueden provocar inflamacion, por ejemplo en el tracto gastrointestinal. Tal inflamacion, por ejemplo, en el estomago y en el tracto gastrointestinal, esta mediada por proteinas de senal intercelular conocidas como citocinas que las producen los macrofagos y las celulas dendriticas en el epitelio en respuesta a un estimulo antigenico tal como el producido por un patogeno. Tras el contacto entre el epitelio y el antigeno de un patogeno o endotoxinas producidas por el mismo, tales como LPS, las celulas presentadoras de antigeno (incluyendo celulas dendriticas) en el epitelio propagan la senal hasta macrofagos no expuestos que responden a continuacion segun una respuesta denominada de tipo Th-1 en las que los macrofagos producen citocinas proinflamatorias incluyendo TNFa, IL-1, IL-6, IL-12. Estas citocinas estimulan a su vez linfocitos citoliticos naturales, celulas T y otras celulas para producir interferon y (IFNy), que es el mediador clave de la inflamacion. El IFNy conduce a una intensificacion de la respuesta inflamatoria y las reacciones descritas anteriormente que conducen a citotoxicidad. Los macrofagos no expuestos tambien pueden responder a antigenos con una respuesta de tipo Th-2. Esta respuesta la suprime IFNy. Estas celulas de tipo Th-2 producen citocinas antiinflamatorias tales como IL-4, IL-5, IL-9 e IL-10.
Se sabe que IL-10 inhibe la produccion de IFNy y por tanto amortigua la respuesta inmunitaria. El equilibrio entre las celulas de tipo Th-1 y de tipo Th-2 y su respectiva produccion de citocinas define la extension de la respuesta inflamatoria frente a un antigeno dado. Las celulas de tipo Th-2 tambien pueden estimular la produccion de inmunoglobulinas por el sistema inmunitario. La actividad antiinflamatoria en el tracto gastrointestinal, donde hay un nivel reducido de TNFa, se correlaciona con celulas epiteliales mejoradas (integridad del revestimiento de la pared intestinal) y por tanto con una reduccion de los efectos negativos provocados por toxinas y patogenos gastrointestinales.
Los resultados de varios estudios de investigacion indican que el ADN puede ejercer una accion antiinflamatoria en las celulas epiteliales intestinales, o puede estimular el sistema inmunitario (Madsen et al. y Rachmilewitz et al, respectivamente, presentaciones de la Digestive Disease Week, 19-22 de mayo de 2002, The Moscone Center, San Francisco).
La inflamacion esta involucrada en muchas enfermedades en mamiferos tanto de manera externa en la piel, ojos, etc., como de manera interna por ejemplo en diversas membranas mucosas; en la boca, el tracto GI, la vagina, etc. pero tambien en los musculos, las articulaciones oseas y en el tejido cerebral. En el tracto GI hay muchas enfermedades relacionadas con la inflamacion, por ejemplo, gastritis, ulcera y enfermedad inflamatoria del intestino (EII). EII es un trastorno cronico que provoca inflamacion e hinchazon en el tracto digestivo o en la pared intestinal. Cuando el tracto digestivo se inflama o se hincha con EII, se forman llagas (ulceras) y sangran. Esto puede provocar
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a su vez dolor abdominal, diarrea liquida, sangre en las heces, fatiga, reduccion del apetito, perdida de peso o fiebre. Por tanto, la inflamacion en EII conduce a dano tisular tal como ulceras y enfermedad agravada en el paciente.
Las dos formas mas comunes de EII son la colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn (CD, Crohn's disease). La enfermedad de Crohn es una enfermedad cronica caracterizada por lesiones inflamatorias recurrentes de toda la pared intestinal de la mucosa a la serosa y puede afectar a muchos sitios en el intestino. La enfermedad se ha relacionado con desequilibrios en la microflora intestinal y una reaccion inflamatoria sobreexpresada frente a componentes de la flora intestinal normal y esta reaccion se trata actualmente con escaso exito usando una serie de diferentes farmacos, uno de los cuales se basa en la terapia anti-TNFa disenada para reducir los niveles de TNFa en la mucosa gastrointestinal. Por tanto, las personas con tal enfermedad forman un grupo de estudio ideal y de hecho un grupo objetivo para el uso de lactobacilos inmunomoduladores, atenuantes de la inflamacion.
Los ratones desarrollan espontaneamente colitis cronica, lo que no se produce en animales libres de germenes. La colitis del raton es similar a la enfermedad de Crohn humana, una enfermedad inflamatoria cronica grave del tracto gastrointestinal. La enfermedad de Crohn se produce generalmente en el intestino, pero tambien puede producirse en cualquier lugar del tracto gastrointestinal. Estos estados requieren la presencia de bacterias entericas y son ambas formas de colitis dependientes de IL-12 y mediadas por Th1.
Debido a las similitudes de las causas y de los sintomas, los modelos de raton de colitis y otros modelos de raton se usan a menudo para estudiar directamente las componentes de la respuesta inflamatoria, y, como se supone que se aplican los mismos mecanismos en el hombre, a menudo se aceptan para usarse como modelos para desarrollar tratamientos para la enfermedad gastrointestinal humana. Sin embargo, hay algunas cuestiones sobre la relevancia de los modelos derivados de animales para los seres humanos, de modo que existe la necesidad de disponer de metodos alternativos para estudiar los mecanismos humanos y confirmar los resultados de otros modelos, en mas sistemas basados en humanos. El proposito de la invencion en el presente documento es el de proporcionar un metodo basado en celulas humanas para seleccionar bacterias del acido lactico que muestren caracteristicas antiinflamatorias y luego usar tales bacterias del acido lactico seleccionadas para la profilaxis y el tratamiento de diversas enfermedades inflamatorias.
Lactobacillus reuteri es uno de los habitantes que se producen de manera natural del tracto gastrointestinal de los animales y se encuentra rutinariamente en el intestino de los animales sanos y a pesar del bajo pH, ocasionalmente tambien en el estomago de los seres humanos. Se sabe que tiene actividad antibacteriana. Veanse, por ejemplo las patentes estadounidenses n.os 5.439.678, 5.458.875, 5.534.253, 5.837.238 y 5.849.289. Cuando las celulas de L. reuteri estan creciendo en condiciones anaerobias en presencia de glicerol, producen la sustancia antimicrobiana conocida como reuterina (P-hidroxi-propionaldehfdo). Tambien se sabe que determinadas cepas de lactobacilos incluyendo L. reuteri tienen propiedades antiinflamatorias tal como se encuentra en las solicitudes de patente estadounidense 20040208863 y 20040067573. Tambien se ha asociado otra actividad inmunomoduladora con otros lactobacilos diversos.
Ensayos clinicos en seres humanos y estudios en animales han demostrado que Lactobacillus puede prevenir o mejorar la inflamacion en colitis cronica. Se plantea la hipotesis de que los lactobacilos pueden regular por disminucion las respuestas de citocinas proinflamatorias inducidas por bacterias entericas. J. Pena et al (2003) investigaron si los lactobacilos disminuyen la produccion de factor de necrosis tumoral alfa (TNFa)por una linea de macrofagos murinos. Se demostro que la produccion de TNF-a por macrofagos murinos incubados con Lactobacillus rhamnosus GG y lipopolisacaridos se inhibio significativamente en comparacion con los controles.
El mismo grupo de trabajadores investigo si Lactobacillus spp. podrian ser eficaces para mejorar la inflamacion inducida por Helicobacter in vivo. Para ello, se realizaron experimentos de coinoculacion con L. reuteri y L. paracasei en el modelo de colitis de raton por H. hepaticus. Se observo una disminucion significativa de las puntuaciones de patologia en los ratones hembra que han recibido tanto H. hepaticus como Lactobacillus spp. en comparacion con los animales a los que solo se les administro H. hepaticus. Se demostro que el efecto probiotico de Lactobacillus spp. en este modelo era independiente de la exclusion de las bacterias H. hepaticus, pero que dependia de la regulacion postranscripcional de la expresion de TNF-a. Los datos sugieren la existencia de un mecanismo novedoso por el cual Lactobacillus spp. pueden regular por disminucion la produccion de citocinas proinflamatorias inducida por Helicobacter en macrofagos.
La patente WO2004/031368A1 describe cepas de Lactobacillus seleccionadas por su capacidad para reducir la inflamacion gastrointestinal asociada con la infeccion por H. pylori en mamiferos usando un ensayo de macrofagos de raton para determinar la actividad de TNF-a.
El resumen de la reunion de Pena Jeremy A. et al., Digestive Disease Week Abstracts and Itinerary Planner, vol. 2003 & Digestive Disease 2003; Fl, Orlando, EE.UU.; 17-22 de mayo de 2003 da a conocer que algunas cepas de Lactobacillus reuteri disminuyen la produccion de TNF-alfa en macrofagos estimulados con LPS. Se sugiere que la inhibicion mediada por Lactobacillus enterico de la produccion de citocinas proinflamatorias tiene un efecto inmunomodulador en el tracto gastrointestinal.
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La solicitud de patente US20040057943A1 se refiere a un procedimiento para la seleccion de una nueva cepa probiotica de L. coryniformis, L. salivarius, L. acidofilus, L. gasseri y L. fermentum que pueden sobrevivir en la leche materna y/o en el liquido amniotico.
S. Menard et al. (2003) investigaron si las bacterias del acido lactico secretaban metabolitos que conservaban propiedades antiinflamatorias despues del transporte intestinal. Se realizo un analisis de la union de LPS a promonocitos THP-1 en presencia de medio condicionado de bacterias (CM) para ver si el LPS tiene que unirse a la proteina de union a LPS (LPB) antes de que LPS-LPB pueda reconocer el receptor CD14. La union se midio mediante citometria de flujo. Se demostro que Bifidobacterium y Streptococcus thermofilus CM inhibian completamente la union de LPS dependiente de LDB a celulas THP-1 liberando metabolitos que ejercian un efecto anti TNF-a que puede atravesar la barrera intestinal.
Aunque se conocen las diferencias en la capacidad de varios lactobacilos para reducir la inflamacion, incluyendo la inflamacion gastrointestinal, previamente no se sabia que estas diferencias se predicen mejor usando un modelo basado en celulas humanas y que se prefiere un modelo de este tipo para seleccionar tales cepas por su posible efecto en seres humanos.
Por tanto, un objeto de la invencion es proporcionar una cepa de bacterias del acido lactico, que se ha seleccionado usando lineas celulares humanas, por su capacidad para reducir la inflamacion, tal como la debida a EII. Es un objeto adicional de la invencion proporcionar productos que contienen dicha cepa incluyendo agentes para el tratamiento o la profilaxis de la inflamacion, por ejemplo asociados con EII para la administracion a seres humanos, incluyendo medios condicionados en los que se ha hecho crecer dicha cepa. Por tanto, la invencion se usa para tratar inflamacion o ulceras provocadas por EII que conducen a dano tisular y enfermedad agravada en un paciente.
Otros objetos y ventajas resultaran mas evidentes a partir de la siguiente descripcion y de las reivindicaciones adjuntas.
Sumario de la invencion
La invencion en el presente documento proporciona una cepa de bacterias del acido lactico seleccionadas por su capacidad para reducir la inflamacion, tal como enfermedad del intestino, y productos que contienen una cepa de este tipo.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 es un grafico de barras que muestra el efecto de medios condicionados de Lactobacillus sobre la produccion de TNF-a por monocitos activados por LPS. Se incubaron tres cepas y los controles durante 24 horas.
La figura 2 es un grafico de barras que muestra el efecto de medios condicionados de Lactobacillus sobre la produccion de TNF-a por monocitos activados por LPS. Se incubaron tres cepas y los controles durante 9 horas.
La figura 3 es un grafico de barras que muestra la inhibicion de medios condicionados de Lactobacillus sobre la produccion de TNF-a por monocitos primarios activados por LPS. Se usaron monocitos primarios de pacientes CD- rem (remision) y de CD-act (activos). Se cultivaron las cepas y los controles durante 24 horas.
La figura 4 es un grafico de barras que muestra el efecto de medios condicionados de Lactobacillus sobre la produccion de TNF-a por monocitos primarios activados por LPS. Se usaron monocitos primarios de pacientes CD- act. Se cultivaron las cepas y los controles durante 24 horas.
Descripcion detallada de la invencion y realizaciones preferidas de la misma
La presente invencion en el presente documento comprende una cepa de bacterias del acido lactico que se han seleccionado por su capacidad para reducir la inflamacion, tal como en EII.
Una cepa de este tipo es Lactobacillus reuteri MM4-1A, ATCC PTA-6475. Pueden formularse productos tales como alimentos, formulaciones y aditivos nutricionales, productos farmaceuticos o dispositivos medicos que contienen celulas completas o componentes derivados de esta cepa, tal como se conoce en la tecnica, e incluyen generalmente un soporte ingerible tal como se conoce mas la cepa de Lactobacillus, o su componente derivado. Las cepas previamente conocidas, ahora identificadas como cepas que tienen una buena capacidad de reduccion de TNFa, tales como L. rhamnosus GG ATCC 53103, L. reuteri MM2-3, ATCC PTA-4659 y otras, tambien pueden usarse en las formulaciones anteriores.
Se usan sistemas modelo que usan las citocinas apropiadas para determinar factores que reducen o aumentan la inflamacion. En la invencion proporcionada en el presente documento, se usa un ensayo basado en celulas
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humanas.
Las celulas THP-1 son una linea celular monocitica humana derivada de un paciente con leucemia y que se mantienen en la Coleccion Americana de Cultivos Tipo. El origen de estas celulas de un huesped humano hace que sean particularmente relevantes para estudiar las interacciones del sistema inmunitario gastrointestinal humano con las bacterias comensales humanas.
Los datos de esta invencion dan a conocer una indicacion de una potente inhibicion de la produccion de TNFa por las cepas especificas L. reuteri ATCC PTA 4659 y L. reuteri ATCC PTA 6475 y que esta inhibicion esta mediada por una sustancia liberada en el medio de crecimiento por estas dos cepas especificas durante la fase de crecimiento logaritmica/estacionaria tardia. Por el contrario, otras dos cepas de L. reuteri, no solo no pudieron inhibir la respuesta inflamatoria de las celulas frente a toxina de E. coli, sino que tampoco inducian una respuesta inflamatoria por si mismas. Este sorprendente hallazgo indica posibles propiedades antiinflamatorias de las cepas L. reuteri ATCC PTA 4659 y L. reuteri ATCC PTA 6475 que no pudo predecirse.
Para confirmar la posible relevancia clinica de estos hallazgos se realizaron estudios adicionales en celulas derivadas de la sangre de pacientes con enfermedades inflamatorias del intestino, especificamente la enfermedad de Crohn (CD).
Para estudiar las interacciones entre las bacterias del acido lactico y las celulas inmunitarias mucosas, se considera que los macrofagos diferenciados son un mejor modelo que los monocitos indiferenciados. Es mas probable que tales macrofagos diferenciados se asemejen a la poblacion de celulas de macrofagos in vivo del tracto gastrointestinal que responde a las bacterias del acido lactico y provoca los cambios reguladores o inflamatorios del sistema inmunitario innato en el huesped. Por ejemplo, la produccion de la interleucina-8 proinflamatoria por celulas THP-1 en respuesta a endotoxinas aumento notablemente tras la induccion de la diferenciacion (Baqui et at., 1999) y ademas, la produccion de TNFa por estas celulas aumenta significativamente despues de la diferenciacion (Klegeris et at., 1997).
Las caracteristicas de la presente invencion se entenderan mas claramente con referencia a los siguientes ejemplos. Ejemplo 1. Seleccion de cepas antiinflamatorias.
Se incubaron celulas THP-1 junto con o bien medios de control o bien medios condicionados (L-CM) a partir del cultivo de cepas seleccionadas de L. reuteri, L. reuteri ATCC PTA 4659, L. reuteri ATCC PTA 6475, L. reuteri ATCC 55730 y L. reuteri CF48-3A. Los medios condicionados (L-CM) son sobrenadantes libres de celulas de cultivos de 9 horas o 24 horas de cada uno de los cultivos de L. reuteri. Se estimularon celulas THP-1 o bien con medio de control o bien con LPS derivado de E. coti (que conduce a la generacion de TNFa en una respuesta inflamatoria normal) durante una incubacion de 3,5 horas tras lo cual se retiraron las celulas y se sometieron a ensayo los sobrenadantes para determinar los niveles de TNFa usando una tecnica ELISA.
Materiales:
Linea de celulas monociticas leucemicas THP-1 (ATCC, numero de cat. TIB202)
Medio RPMI 1640 (Gibco-Invitrogen)
Suero bovino fetal (Gibco-Invitrogen)
Disolucion de penicilina-estreptomicina (Sigma)
Lipopolisacarido de serotipo O127:B8 de E. coti (Sigma, numero de cat. L3137)
Kit de desarrollo de ELISA DuoSet humano de TNF-alfa/TNF-SFII (R&D Systems, numero de cat. DY210)
Metodo:
Usar la linea de celulas monociticas THP-1. Anadir el 5% (v/v) de medios MRS y el 5% (v/v) de medio condicionado de Lactobacittus en los pocillos adecuados. El medio condicionado de Lactobacillus es el sobrenadante de un cultivo de 24 horas de especies de Lactobacittus en medios MRS. A continuacion, se ajusta el pH del medio condicionado mediante secado por velocidad-vacio y se resuspende el sedimento en igual volumen de medio de cultivo. Aunque la camara humidificada esta disenada para minimizar la evaporacion de liquido, despues de 48 horas de incubacion, el volumen de la suspension celular en las placas de 24 pocillos se reduce hasta aproximadamente 475 ml.
Anadir 100 ng/ml de lipopolisacarido de serotipo O127:B8 de E. coti en los pocillos adecuados. Incubar en una camara del 5% de CO2, humidificada, a 37°C. Despues de 3,5 horas de incubacion, recoger los cultivos en tubos para centrifuga de 1,5 ml. Centrifugar a 1500 RCF durante 5 minutos a 4°C. Recoger los sobrenadantes.
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Prueba de expresion de citocinas mediante ELISA (DuoSet humano de TNF-alfa/ TNF-SFII Quantikine).
El medio de cultivo usado fue FBS al 10%, penicilina-estreptomicina al 2% en RPMI 1640.
Resultados--ejemplo 1
La incubacion de celulas THP-1 con L-CM durante 24 horas a partir de las cepas L. reuteri ATCC PTA 4659, L. reuteri ATCC PTA 6475 en ausencia de LPS no condujo a la generacion de TNFa en el medio de incubacion (figura 1). Sorprendentemente, L-CM a partir de L. reuteri ATCC 55730 y la cepa CF48-3A de L. reuteri estimularon la produccion de TNFa por las celulas THP-1 hasta niveles similares a los observados con LPS solo. Por tanto, las cepas de L. reuteri difieren en su capacidad para estimular la produccion de TNFa proinflamatorio por monocitos THP-1 en reposo.
La adicion de LPS a las celulas THP-1 en ausencia de L-CM condujo a la generacion de 138 pg/ml de TNFa durante el periodo de incubacion de 3,5 horas. Esta es la respuesta inflamatoria esperada de las celulas THP-1 a la toxina. La adicion del medio de crecimiento (MRS), que actua como control para las adiciones de L-CM, condujo a la generacion de 132 pg/ml de TNFa y por tanto MRS no interfirio en la respuesta a LPS. La adicion de L-CM de 24 horas a partir de L. reuteri ATCC PTA 4659 o L. reuteri ATCC PTA 6475 redujo drasticamente los niveles de TNFa estimulado por LPS hasta tan solo 14 y 10 pg/ml, respectivamente. Esto representa una inhibicion de la produccion de TNFa estimulada por LPS del 89 y el 92%, respectivamente. Por el contrario, en presencia de L-CM de 24 horas a partir de L. reuteri ATCC 55730 y la cepa CF48-3A de L. reuteri, LPS todavia pudo inducir un aumento significativo de TNFa en comparacion con los niveles en ausencia de LPS. La produccion de TNFa estimulada por LPS aumento en el 50% y el 38% a pesar de la presencia de L-CM a partir de L. reuteri ATCC 55730 y la cepa CF48-3A de L. reuteri, respectivamente.
Experimentos similares realizados con LCM de 9 horas de L. reuteri ATCC PTA 4659 o L. reuteri ATCC PTA 6475 demostraron que el efecto inhibidor sobre la produccion de TNFa estimulada por LPS era considerablemente menor (el 52% y el 16%, respectivamente; figura 2) pero todavia estaba ahi. Por lo tanto, las incubaciones mas largas de las cepas de L. reuteri, con la recogida de L-CM en la fase de crecimiento logaritmica/estacionaria tardia, conducen a una eficacia mejorada en la inhibicion de la produccion de TNFa.
Ejemplo 2. Preparacion de seleccion negativa para celulas monociticas
El kit de aislamiento de monocitos II (Miltenyi Biotec, Inc. 12740 Earhart Avenue, Auburn, CA 95602 (800) 367-6227;
http://www.miltenyibiotec.com/index.php?, numero de pedido 130-091-153) es un sistema de marcaje magnetico indirecto para el aislamiento de monocitos no afectados de celulas mononucleares de sangre periferica humana (PBMC). Las celulas no monociticas, es decir, celulas T, celulas B, celulas NK, celulas dendriticas y basofilos se marcan magneticamente de manera indirecta usando un coctel de antibioticos conjugados con biotina contra CD3, CD7, CD16, CD19, CD56, CD123 y glicoforina A, y microperlas anti-biotina. Entre las dos etapas de marcaje, no se requieren etapas de lavado. Las celulas no monociticas marcadas magneticamente se reducen reteniendolas en una columna MACS® en el campo magnetico de un separador MACS, mientras que los monocitos no marcados pasan a traves de la columna. El aislamiento de monocitos no marcados relativamente enriquecidos se logra mediante la reduccion de las celulas marcadas magneticamente. Puede evaluarse o confirmarse el nivel de enriquecimiento mediante citometria de flujo.
Informacion sobre el kit: kit de aislamiento de monocitos II (numero de pedido 130-091-153). Contenido del kit: Reactivo de bloqueo de FcR (1 ml); coctel de anticuerpos anti-biotina (1 ml); microperlas anti-biotina (2 ml); materiales y equipos no suministrados en el kit: tubos para centrifuga de Corning de 15 ml; centrifuga refrigerada; pipetas y puntas de pipeta; pipeteadores serologicos y puntas de pipeta; cronometro; columna MACS® MS de Miltenyi Biotec; iman MACS® de Miltenyi Biotec; soporte de columna MACS® de Miltenyi Biotec; hemocitometro Bright-Line de Hausser Scientific; tampon de trabajo (WB): solucion salina tamponada con fosfato 1X esteril (PBS, pH 7,4, numero de catalogo Gibco 10010023) + albumina serica bovina al 0,5% (BSA, numero de catalogo Panvera P2489) + acido etilendiaminotetraacetico 2 mM (EDTA, numero de catalogo Gibco 15553-035)
Metodo (kit de aislamiento de monocitos II):
Determinar la densidad celular mediante recuento en un hemocitometro. Transferir la suspension celular a un tubo conico de Corning de 15 ml. Sedimentar las celulas a 300 RCF durante 10 minutos a 4°C. Retirar el sobrenadante usando una pipeta serologica de 10 ml. Resuspender el sedimento celular en 30 pl de WB por 107 celulas totales. Anadir 10 pl de reactivo de bloqueo de FcR por 107 celulas totales. Anadir 10 pl de coctel de anticuerpo anti-biotina por 107 celulas totales. Mezclar bien e incubar durante 10 minutos a 4° - 8°C. Anadir 30 pl de WB por 107 celulas totales. Anadir 20 pl de microperlas anti-biotina por 107 celulas totales. Mezclar bien e incubar durante 15 minutos adicionales a 4°- 8°C. Lavar las celulas anadiendo un volumen de marcaje 10 - 20X de WB. Centrifugar a 300 RCF durante 10 minutos a 4°C. Retirar el sobrenadante usando una pipeta serologica de 2 ml. Resuspender el sedimento
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celular en 500 pl de WB por 108 celulas. Colocar la columna MACS MS sobre el iman.
Lavar la columna con 500 pl de WB. Cargar la suspension de celulas en la columna. Dejar que drene a su traves y a un tubo de recogida (~ 4 min/ml). Lavar la columna con 3 x 500 pl de WB y dejar que drene a su traves al mismo tubo de recogida.
Eluir las celulas capturadas en otro tubo de recogida mediante la colocacion de la columna en otro tubo, pipetear 1 ml de WB en la columna y purgar las celulas usando presion positiva con el embolo suministrado con la columna. Presionar a una velocidad de 2 segundos/pulgada.
En el protocolo anterior es importante trabajar rapido y usar solo disoluciones frias. Trabajar con hielo requiere un aumento de los tiempos de incubacion para las microperlas MACS. Incubar en una nevera a 4°- 8°C. Los tampones o medios no deben contener Ca2+ o Mg+. BSA puede reemplazarse por otras proteinas tales como gelatina, albumina serica humana o suero fetal de ternera. El tipo de anticoagulante usado no afecta al protocolo. Temperaturas mas altas y tiempos de incubacion mas largos pueden conducir a marcaje celular inespecifico.
Ejemplo 3. Bioensayo de monocitos primarios
Se aislaron monocitos humanos primarios de la sangre de pacientes con CD que estaban en una fase de inflamacion activa (CD-act) o estaban en remision (CD-rem) donde la inflamacion habia desaparecido. Se extrajo sangre de los pacientes con CD y se aislaron celulas mononucleares de sangre periferica. Se enriquecieron los monocitos de sangre periferica usando el metodo del ejemplo 2. Se permitio que las suspensiones de estos se diferenciaran durante 48 horas en una camara del 5% de CO2, humidificada, a 37°C. Despues de este procedimiento, las celulas se han desarrollado a macrofagos. A continuacion se anadieron medios de crecimiento (control) o L-CM o bien a los monocitos de sangre periferica o bien a los macrofagos diferenciados y se estimularon las celulas o bien con medio de control o bien con LPS derivado de E. coli y se incubaron durante 3,5 horas. Se analizo la produccion de TNFa en los sobrenadantes a partir de estas incubaciones.
Los materiales usados fueron: Monocitos primarios de sangre periferica; medio RPMI 1640 (Gibco-Invitrogen); suero bovino fetal (Gibco-Invitrogen); disolucion de penicilina-estreptomicina (Sigma); lipopolisacarido de serotipo O127:B8 de E. coli (Sigma, numero de cat. L3137); acido trans-retinoico (CalBioChem, numero de cat. 554720); Kit de desarrollo de ELISA DuoSet humano de TNF-alfa/TNF-SFII (R&D Systems, numero de cat. DY210).
se aislan los monocitos de sangre periferica tal como se describe en los protocolos: protocolo de aislamiento de celulas mononucleares de sangre periferica (descrito en el ejemplo 2) y protocolo de seleccion negativa de monocitos (descrito en el ejemplo 2). Cambiar el medio de suspension celular (PBS) a medios de cultivo celular (FBS al 10%, penicilina-estreptomicina al 2% en RPMI 1640).
Diluir las celulas hasta 1,0 x 105 celulas/ml. Sembrar en placa 500 pl de suspension celular en cada pocillo de una placa de microtitulacion de 24 pocillos. Permitir que las celulas se diferencien durante 48 horas en una camara del 5% de CO2, humidificada, a 37°C. Comenzar el bioensayo. Anadir el 5% (v/v) de medios MRS y el 5% (v/v) de medios condicionados de Lactobacillus en los pocillos apropiados. Los medios condicionados de Lactobacillus son el sobrenadante de un cultivo de 24 horas de especies de Lactobacillus en medios MRS. A continuacion, se ajusta el pH de los medios condicionados mediante secado por velocidad-vacio y se resuspende el sedimento en un volumen igual de medio de cultivo. Aunque la camara humidificada esta disenada para minimizar la evaporacion de liquido, despues de 48 horas de incubacion, el volumen de suspension celular en las placas de 24 pocillos se reduce hasta aproximadamente 475 - 485 pl. Anadir 100 ng/ml de lipopolisacarido de serotipo O127:B8 de E. coli en los pocillos adecuados. Incubar en una camara del 5% de CO2, humidificada, a 37°C. Despues de 3,5 horas de incubacion, recoger los cultivos en tubos para centrifuga de 1,5 ml. Centrifugar a 1500 RCF durante 5 minutos a 4°C. Recoger los sobrenadantes. Someter a prueba para determinar la expresion de citocinas mediante ELISA (DuoSet humano de TNF-alfa/TNF-SFII Quantikine).
Resultados--ejemplo 3
En monocitos primarios de pacientes CD-rem, LPS condujo a la elevacion esperada de TNFa y esta elevacion pudo inhibirse en el 43% en presencia de L-CM a partir de L. reuteri ATCC PTA 6475. En monocitos primarios de pacientes CD-act, el nivel de produccion de TNFa estimulada por LPS fue algo mayor y se inhibio en el mismo grado que L-CM a partir de L. reuteri ATCC PTA 6475 (figura 3).
En comparacion con los controles de medio, la produccion de TNFa en respuesta a LPS en macrofagos diferenciados derivados de monocitos primarios de pacientes CD-act se inhibio significativamente en el 50% por L- CM a partir de L. reuteri ATCC PTA 4659 y en el 60% por L-CM a partir de L. reuteri ATCC PTA 6475 (figura 4). Confirmando los datos de las celulas THP-1, L-CM derivados de L. reuteri ATCC 55730 y la cepa CF48-3A de L. reuteri no pudieron inhibir la produccion de TNFa y por el contrario, aumentaron la produccion de TNFa en el 22% y el 30%, respectivamente, en comparacion con los controles relevantes (figura 4).
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Estos datos confirman el sorprendente hallazgo de que las diferentes cepas de L. reuteri tienen efectos variables sobre la produccion de TNFa por monocitos y macrofagos diferenciados y que las cepas de L. reuteri ATCC PTA 4659 y L. reuteri ATCC PTA 6475 son particularmente adecuadas para su uso en el tracto gastrointestinal de seres humanos con enfermedad inflamatoria del intestino.
Ejemplo 4. Uso del medio condicionado
Usando el metodo del ejemplo 1, se selecciono el medio condicionado de una cepa que disminuye TNFa eficazmente, en este experimento el medio de L. reuteri ATCC PTA-4659. Este medio se produjo a mayor escala haciendo crecer la cepa en medio de Man, Rogosa, Sharpe (MRS) (Difco, Sparks, MD). Se diluyeron cultivos de lactobacilos durante la noche hasta una DO600 de 1,0 (que representa aproximadamente 109 celulas/ml) y se diluyeron adicionalmente 1:10 y se hicieron crecer durante 24 horas adicionales. Se recogio el medio condicionado libre de celulas bacterianas mediante centrifugacion a 8500 rpm durante 10 minutos a 4°C. Se separo el medio condicionado del sedimento celular y luego se filtro a traves de una unidad de filtro de 0,22 pm de poro (Millipore, Bedford, Mass.). Luego se liofilizo el medio condicionado y se formulo, usando metodos convencionales, para producir un comprimido. Este comprimido se utilizo como farmaco en seres humanos para tratar eficazmente la ulcera provocada por EII.
Ejemplo 5. Uso de cepas de Lactobacillus reuteri antiinflamatorias seleccionadas
Usando el metodo del ejemplo 1, se selecciono el medio condicionado de una cepa que disminuye TNFa eficazmente, en este experimento el medio de L. reuteri ATCC PTA-4659. Luego se liofilizo la cepa de L. reuteri y se formulo, usando metodos convencionales, para producir una capsula. Esta capsula se utilizo como farmaco en seres humanos para reducir eficazmente la inflamacion de la mucosa en pacientes con EII provocada por EII.
Ejemplo 6. Caracterizacion de la proteina producida por cepas de Lactobacillus eficaces
Se trataron diferentes medios condicionados de Lactobacillus eficaces, incluyendo la cepa de L. reuteri ATCC PTA 4659, y el medio condicionado de L. reuteri ATCC PTA-6475, con diversos compuestos desnaturalizantes para determinar la naturaleza de las supuestas inmunomodulinas derivadas de las bacterias. Por tanto, se sometieron los medios condicionados a congelacion-descongelacion repetidas, tratamiento termico, digestion con enzimas de digestion de ADN, proteasas y proteasas inactivadas. Se determino de este modo que la supuesta inmunomodulina era una o mas proteinas o de naturaleza peptidica. Para determinar el tamano de la supuesta proteina inmunomodulina, se fracciono el medio condicionado mediante filtracion y se sometieron a prueba los filtrados para determinar su eficacia. De esta manera, se encontro que el componente activo de los medios condicionados de cepas de Lactobacillus eficaces era de aproximadamente 5 kDa de tamano o menos.

Claims (2)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Cultivo biologicamente puro de Lactobacillus reuteri ATCC PTA-6475.
    5 2. Producto que comprende medio condicionado de Lactobacillus reuteri ATCC PTA-6475.
  2. 3. Cultivo biologicamente puro segun la reivindicacion 1, o producto segun la reivindicacion 2, para uso en el tratamiento de ulceras provocadas por enfermedad inflamatoria del intestino en un paciente humano.
    10 4. Cultivo biologicamente puro segun la reivindicacion 1, o producto segun la reivindicacion 2, para uso en el
    tratamiento de inflamacion debido a enfermedad inflamatoria del intestino en un paciente humano.
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