ES2329020T3 - Procedimiento para potenciar la funcion inmunitaria en mamiferos usando cepas de lactobacillus reuteri. - Google Patents
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Abstract
El uso del Lactobacillus reuteri ATCC55730 que a. exhibe un buen enlace con las toxinas y un buen efecto neutralizador de las mismas; b. exhibe un buen reclutamiento de células CD4+ para la producción de una composición para potenciar la función inmunitaria en mamíferos.
Description
Procedimiento para potenciar la función
inmunitaria en mamíferos usando cepas de Lactobacillus
reuteri.
\global\parskip0.930000\baselineskip
La presente invención versa acerca del uso de la
cepa ATCC55730 del Lactobacillus reuteri como agente
potenciador inmunitario.
Se han formulado probióticos que contienen una
amplia variedad de distintos microorganismos gastrointestinales,
fundamentalmente debido al aumento de los patógenos resistentes a
los antibióticos. Se han usado cepas de una amplia variedad de
especies de Lactobacillus, incluyendo el L. reuteri,
en formulaciones probióticas. El Lactobacillus reuteri es
uno de los habitantes que se dan de forma natural en el tracto
gastrointestinal de los animales, y se encuentra de forma rutinaria
en los intestinos de animales sanos. Se sabe que posee actividad
antibacteriana. Véanse, por ejemplo, las patentes U.S. Nos
5.439.678, 5.458.875, 5.534.253, 5.837.238 y 5.849.289. Cuando se
cultivan células de L. reuteri bajo condiciones anaerobias en
presencia de glicerol, producen la sustancia antimicrobiana
denominada reuterina
(\beta-hidroxi-propionaldehído).
Con el L. reuteri también se ha asociado
una actividad inmunomoduladora. Véase, por ejemplo,
"Biotherapeutic effects of probiotic bacteria on candidiasis in
immunodeficient mice", de Wagner RD, et al, Infect Immune
1997 Oct 65:4165-72; sin embargo, existen
diferencias de eficacia entre cepas y se precisan procedimientos
para seleccionar las cepas más efectivas, por ejemplo el
procedimiento que selecciona cepas reclutando células CD4+,
proporcionado en la presente invención.
El documento
WO-A-9 400 139 revela un
procedimiento para estimular el sistema inmunitario de aves de
corral.
Además, aunque se sabe que el L. reuteri
se utiliza como un probiótico que aporta beneficios generales, la
investigación anterior solo se ha percatado hasta cierto extremo de
la importancia de utilizar las mejores cepas de
Lactobacillus que neutralizan las toxinas producidas por los
patógenos ya presentes en el tracto gastrointestinal. Véase, por
ejemplo, "Removal of common Fusarium toxins in vitro by
strains of Lactobacillus and Propionibacterium", de
El-Nezami HS, et al, Food Addit Contam 2002
Jul 19: 680-6. De tal neutralización de toxinas,
que incluye el enlace, no solo hay informes de que es importante
para mejorar los efectos directos causados por estos patógenos
productores de toxinas, sino también para reducir la carga general
del sistema inmunitario, conforme a la presente invención.
Existen muchas causas diferentes de problemas
gastrointestinales causados por microorganismos patógenos. Por
ejemplo, la Helicobacter pylori causa úlceras gástricas y
duodenales, cáncer gástrico y linfoma del tejido linfoide asociado
a la mucosa gástrica. Ciertas cepas patógenas de Escherichia
coli producen toxinas como la toxina Vero (VT), producida por
la E. coli O157:H7, contra la cual los antibióticos son cada
vez menos efectivos.
Por lo tanto, es un objeto de la invención
proporcionar un procedimiento para potenciar la función inmunitaria
en mamíferos usando cepas de Lactobacillus reuteri que se ha
detectado que son efectivas tanto en el reclutamiento de
células CD4+ como en la neutralización de toxinas,
proporcionar procedimientos para seleccionar tales cepas de L.
reuteri potenciadoras del sistema inmunológico, y proporcionar
productos que contienen tales cepas. Es un objeto adicional de la
presente invención proporcionar un procedimiento para utilizar
sobrenadantes de cultivos de cepas de L. reuteri efectivos
para reducir la carga inmunitaria de estas toxinas.
La presente invención versa acerca del uso de la
cepa ATCC55730 del Lactobacillus reuteri como agente
potenciador inmunitario, y con procedimientos para potenciar la
función inmunitaria en mamíferos usando cepas de Lactobacillus
reuteri en productos que contienen células de tales cepas. Esta
cepa muestra un buen enlace con toxinas y buena neutralización de
las mismas; y muestra buen reclutamiento de CD4+. Otros objetos y
otras características de las invenciones serán más plenamente
evidentes a partir de la siguiente revelación y de las
reivindicaciones adjuntas.
Figura 1. Confirmación de la capacidad
inhibidora contra el enlace de la citotoxina Vero (VT) y el receptor
Gb_{3} en un sobrenadante de un cultivo de L. reuteri
mediante ELISA competitiva. Cada uno reaccionó como sigue, en
planchas recubiertas con Gb_{3}, seguido por la realización de
ELISA usando acm contra VT.
Control: VT + caldo de soja tríptico (CST)
VT + G: VT + 250 mM de solución de glicerol
VT + LRS: VT + un sobrenadante de un cultivo de
L. reuteri incubado en solución de 250 mM de glicerol
\global\parskip1.000000\baselineskip
La presente invención versa acerca del uso de la
cepa ATCC55730 del Lactobacillus reuteri, que exhibe un buen
enlace con toxinas y un buen efecto neutralizador de las mismas; y
exhibe buen reclutamiento de células CD4+ para la producción de una
composición para potenciar la función inmunitaria en mamíferos.
También versa acerca del uso de tal cepa de Lactobacillus
reuteri en productos y con un procedimiento para potenciar la
función inmunitaria en mamíferos usando tal cepa de Lactobacillus
reuteri.
Las citoquinas son proteínas del sistema
inmunitario que son modificadores de la respuesta biológica.
Coordinan las interacciones del sistema inmunitario de los
anticuerpos y las células T y amplifican la reactividad inmunitaria
(10). Las citoquinas incluyen monoquinas sintetizadas por macrófagos
y linfoquinas producidas por linfocitos T activados y células
asesinas naturales (NK). El subconjunto CD4+, tanto en seres humanos
como en ratones, se basa en la producción de citoquinas y en las
funciones efectoras. Las células Th1 sintetizan interferón gamma
(INF-\gamma), IL-2 y factor de
necrosis tumoral (FNT). Son fundamentalmente responsables de la
inmunidad celular contra los microorganismos intracelulares y de
las reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado. Afectan a la
síntesis de inmunoglobulina G 2a (IgG2a) y a la citotoxicidad
celular mediada dependiente de anticuerpos. El
INF-\gamma que producen activa los macrófagos y,
en consecuencia, la fagocitosis. Las células Th2 sintetizan
interleucina-4 (IL-4),
interleucina-5 (IL-5),
interleucina-6 (IL-6),
interleucina-9 (IL-9),
interleucina-10 (IL-10) e
interleucina-13 (IL-13). Inducen las
respuestas de los anticuerpos IgE e Ig G1, y la inmunidad de las
mucosas por síntesis de mastocitos y desarrollo de eosinófilos y
factores de diferenciación, y facilitación de la síntesis de
IgA.
Incluidos en la invención hay procedimientos con
diversos pasos ejemplares que confirman: la administración de la
cepa de L. reuteri, el análisis de la cepa y la eficacia de
la cepa usada tanto en el reclutamiento de células CD+4 como en la
neutralización de toxinas. Los datos indican que, por ejemplo, una
formulación para tabletas que contiene L. reuteri da niveles
de colonización gastrointestinal similares a los producidos con la
administración directa de cultivos celulares. La colonización con
L. reuteri está relacionada con la ingestión de L.
reuteri, y el periodo de lavado (el tiempo que tardan los
niveles de L. reuteri en descender a los niveles previos a
la ingestión) es de al menos 28 días tras la administración de la
tableta, lo que muestra que la invención del presente documento es
aplicable para cultivos celulares de L. reuteri, al igual
que para productos formulados para que contengan tales cultivos de
L. reuteri.
Preferentemente, la invención versa acerca del
uso de productos que comprenden cepas de L. reuteri, como
probiótico para la mejora profiláctica de la función inmunitaria en
mamíferos. Tales productos pueden ser diversos productos
alimenticios, como un suplemento dietético, productos de confitería
o tabletas que contienen células de la cepa seleccionada.
Las cepas de L. reuteri conforme a la
invención pueden ser usadas también para la preparación de un
fármaco para el tratamiento de diversos microorganismos que
producen toxinas, como Escherichia coli. Así pueden tratarse
el E. coli enterohemorrágico y las toxinas VT.
Conforme a la invención, tanto las células de
cepas de L. reuteri como un supernadante de un cultivo de
las mismas pueden usarse para la producción de una composición
profiláctica de tipo probiótico y farmacéutica.
Conforme a la invención, puede usarse cualquier
cepa de L. reuteri que exhiba buen reclutamiento de células
CD4+ y/o buen enlace con toxinas. Que estén presentes células CD4+
puede analizarse usando anticuerpos contra CD4, por ejemplo con
procedimientos inmunohistoquímicos (como en el ejemplo 5) o
inmunofluorescentes. En enlace con toxinas puede confirmarse
poniendo en contacto células o sobrenadante de L. reuteri con
toxinas y haciendo ensayos para encontrar la diferencia en toxinas
disponibles, como se hace, por ejemplo en el ejemplo 1.
Los productos probióticos, profilácticos y
farmacéuticos conforme a la invención pueden comprender aditivos y
excipientes aceptables para su uso nutricional o farmacéutico.
Las características de la presente invención
serán entendidas más fácilmente con referencias a los siguientes
ejemplos, que no han de interpretarse como si limitasen la
invención.
Ejemplo
1
En este experimento se emplearon cepas de tres
bacterias del ácido láctico: L. reuteri ATCC 55730; L.
bulgaricus, cepa LBS12 (CHR, Horsholm, Dinamarca); y L.
casei, cepa 0 1, (CHR, Horsholm, Dinamarca). Se incubó L.
reuteri en una condición de fijación aerotrópica a 37ºC durante
24-48 horas después de inocular caldo MRS (más 20
mM de glucosa). En algunos casos, esta incubación inicial fue
seguida por centrifugación a 2.500 rpm durante 30 minutos, lavando
con tampón fosfato salino (TFS) dos veces para eliminar componentes
del medio, suspensión en una solución de glicerol de 250 mM, seguida
por incubación en una condición de fijación aerotrópica a 37ºC
durante 24-48 horas. Se empleó cada bacteria del
ácido láctico de la prueba siguiendo al ajuste a 2 g/30 ml (peso en
seco), a la centrifugación a 2.500 rpm durante 30 minutos tras la
incubación, a la recuperación del sobrenadante, al ajuste del pH a
7,0 con NaOH para inocular células Vero (véase más abajo) y a la
filtración mediante un filtro de 2,0 \mum. Sirvieron de control
una solución de glicerol y caldo MRS ajustados a un pH de 7,0,
siguiendo a su filtración por un filtro de 2,0 \mum.
Se incubaron células Vero (células renales del
cercopiteco verde africano, ATCC - CCL81) en un medio esencial
mínimo (MEM, Sigma) suplementado con un 10% de suero fetal bovino
(SFB, Sigma) at 25 g/ml de gentamicina (Sigma) a 37ºC en una
incubadora de CO_{2} al 10% durante 48 horas, y se usaron después
de confirmar la formación de monocapas.
Se empleó Escherichia coli 0157:H7 (ATCC
43894), que segrega tanto VT1 como VT2, siguiendo a la inoculación
en caldo de soja tríptico (CST), a la incubación durante 24 horas
mientras se remueve en una incubadora agitadora a 37ºC, a la
centrifugación a 2.500 rpm durante 30 minutos, y al filtrado del
sobrenadante del cultivo.
Fueron inoculadas 500 células Vero (2 \times
10^{5} células/ml) a una placa de 96 pocillos y se incubaron a
37ºC en una incubadora de CO_{2} al 10% durante 48 horas para
confirmar la formación de una monocapa, seguido por la realización
del experimento usando los siguientes tratamientos: A: VT únicamente
(control positivo); B: CST (medio de cultivo de Escherichia
coli 0157:H7); C: caldo MRS (bacterias de ácido láctico de
ensayo); D: solución de glicerol (medio de cultivo de L.
reuteri); E: VT + caldo MRS; F: VT + solución de glicerol; G:
VT + sobrenadante del cultivo de L. reuteri en la solución de
glicerol; H: VT + sobrenadante del cultivo de L. bulgaricus
en el caldo MRS; I: VT + sobrenadante del cultivo de L.
bulgaricus; y J: VT + sobrenadante del cultivo de L.
casei. Los tratamientos B, C y D son para determinar si cada
fluido de cultivo por sí mismo causa citotoxicidad a las células
Vero; y E y F son para determinar si los medios de cultivo de las
bacterias del ácido láctico del ensayo tienen capacidad
neutralizante contra la VT por sí mismos. Cada sobrenadante de los
cultivos de bacterias del ácido láctico de ensayo en G, H, I y J fue
sometido a una disolución en serie 2\times, después de que cada
uno de los sobrenadantes de cultivos diluidos de bacterias del ácido
láctico de ensayo y la VT se combinaron en cantidades de 400 ml +
100 ml; 300 ml + 200 ml; 200 ml + 300 ml; and 100 ml + 400 ml,
respectivamente, y luego se incubaron a 37ºC en una incubadora de
CO_{2} al 10% durante 18 horas para determinar si aparecía un
efecto citopático (ECP).
Se añadieron 300 mM de clorhidrato de
semicarbazida (Sigma), que inhibe la producción de reuterina, a un
fluido de cultivo de L. reuteri en una solución de glicerol
de 250 mM para contener la producción de reuterina, y el
supernadante se recogió igual que anteriormente. Se inocularon
células Vero de 100 \mul a una placa de 96 pocillos y se
incubaron a 37ºC en una incubadora de CO_{2} al 10% durante 24
horas para examinar si se formaban monocapas, siguiendo por la
realización de los siguientes tratamientos: A: VT únicamente; B: VT
+ 25 mM de solución de glicerol; C: VT + sobrenadante del cultivo de
L. reuteri en la solución de glicerol; y D: VT +
sobrenadante del cultivo de L. reuteri en la solución de
glicerol incubado después del tratamiento con inhibidor de la
reuterina (véase arriba). Cada fluido de cultivo de L.
reuteri tratado con o sin solución de glicerol e inhibidor de
la reuterina en B, C y D fue combinado con VT en cantidades de 20 +
80; 30 + 70; 40 + 60; 50 + 50; 60 + 40; 70 + 30; y 80 + 20 \mul,
respectivamente, y luego se incubó a 37ºC en una incubadora de
CO_{2} al 10% durante 18 horas para examinar si aparecía un efecto
citopático (ECP). Tras la observación al microscopio, los fluidos
de cultivo fueron teñidos con violeta cristal y fueron leídos sus
valores de D.O. (densidad óptica) a 490 nm.
Se recubrieron placas de 96 pocillos con
Gb_{3} (globotriaosilceramida) (Sigma) bloqueados con albúmina de
suero bovino (ASB) al 5% y se hicieron reaccionar con sobrenadante
de cultivo de L. reuteri que se incubó en VT o en VT + una
solución de glicerol de 250 mM. Después, se usó un anticuerpo
monoclonal (acm) contra VT como anticuerpo primario, al que se
añadió IgG de cabra antirratón conjugada con peroxidasa de rábano
(PR), y, siguiendo al desarrollo de
O-fenilendiamina, se leyó su densidad óptica (D.O.)
a 490 nm por medio de un lector ELISA. Este experimento confirmaba
la presencia de cualquier material inhibidor de la reacción entre
el L. reuteri y el receptor
Gb_{3}.
Gb_{3}.
A partir de los resultados de interacción entre
la VT y la solución de glicerol de 250 mM y entre la VT y un
sobrenadante de cultivo de L. reuteri incubado en solución de
glicerol tras recubrimiento con Gb_{3}, se verificó que una
combinación de VT y de un sobrenadante de cultivo de L.
reuteri producía un valor reducido de D.O. a niveles
significativos en comparación con el de la VT únicamente, como en la
Figura 1. Esto significa que podía detectarse indirectamente la
presencia de un material que inhibía el enlace de la VT y del
receptor Gb_{3} en un sobrenadante de cultivo de L.
reuteri.
Se recubrieron placas de 96 pocillos con
sobrenadante de cultivo de L. reuteri, que se incubó en VT/VT
+ una solución de glicerol de 250 mM bloqueada con 3% de ASB y
hecha reaccionar con VT. Después, se usó un anticuerpo monoclonal
contra VT como anticuerpo primario, al que se añadió IgG de cabra
antirratón conjugada con peroxidasa de rábano (PR) (H + L), y,
siguiendo al desarrollo de O-fenilendiamina, se leyó
su densidad óptica (D.O.) a 490 nm por medio de un lector ELISA.
Este experimento confirmaba la presencia de un material interactivo
con VT en el sobrenadante de L. reuteri.
Ejemplo
2
Cuando se añadieron CST, caldo MRS y una
solución de glicerol a las células Vero, no se vio efecto
citopático. Además, cuando se añadieron tanto VT como caldo
MRS/solución de glicerol a las células Vero se observó ECP en las
células Vero, lo que demuestra que los propios fluidos de cultivo
carecían de capacidad neutralizante contra la VT.
Cuando se sometió a cada sobrenadante de los
cultivos de las bacterias del ácido láctico de ensayo al ajuste a
un pH de 7,0, al filtrado y a la combinación con VT, se encontraron
los resultados mostrados en la Tabla 1. Para el L.
bulgaricus y el L. casei, apareció ECP en todo el
intervalo de concentraciones, mientras que para el L.
reuteri no apareció ECP en muchos de los sobrenadantes del
glicerol, salvo en la proporción de bacterias del ácido láctico de
ensayo a VT de 4:1, donde había mucho menos ECP. Así, había una
discernible capacidad neutralizante contra la VT del sobrenadante
del cultivo incubado en una solución de glicerol de 250 mM. Para la
incubación en caldo MRS (+ 20 mM de glucosa), aparecía ECP a todas
las concentraciones.
Los resultados de la prueba ELISA competitiva y
del ensayo de enlace entre la VT y el sobrenadante del cultivo de
L. reuteri fueron sometidos a la prueba t de Student usando
un programa Microcal Origin 6.1 (Microcal Software, Inc., Boston,
Massachusetts).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
En este ejemplo, a los sujetos se les dieron dos
tabletas masticables dos veces al día, conteniendo cada tableta 1
\times 10^{8} UFC (unidades formadoras de colonias) de L.
reuteri (SD2112: ATCC 55730), para dar una dosis diaria total
de 4 \times 10^{8} UFC de L. reuteri. Todos los demás
excipientes usados en las tabletas eran bien conocidos y cumplían
las farmacopeas internacionales. El estudio se llevó a cabo en dos
partes: una sesión de gastroscopia, con investigación del tracto
gastrointestinal superior, y una sesión de ileoscopia, con
investigación del intestino delgado distal (detalles más abajo). Los
criterios de exclusión fueron: la toma de antibióticos dos semanas
antes y durante el estudio; la toma de probióticos tres semanas
antes y durante el estudio; tratamiento en curso con fármacos de
tipo gastrointestinal; y enfermedades orgánicas serias con
necesidad de tratamiento regular (por ejemplo, el cáncer). El
protocolo para el tratamiento de los pacientes fue aprobado por el
Comité Ético Danés y estaba en conformidad con la declaración de
Helsinki. El estudio se realizó en Dinamarca.
Se usó la prueba de rangos con signo de Wilcoxon
para comparar síntomas, valores de los análisis sanguíneos,
contenido de L. reuteri en las heces y diferencias
histológicas antes y después de la ingesta de L. reuteri. P
< 0,05 se consideró significativo.
Todos los sujetos completaron el estudio. En la
sesión de gastroscopia, fueron estudiados diez voluntarios sanos,
con edades superiores a los 18 años, con hábitos alimenticios
normales. Se llevó a cabo una gastroduodenoscopia tras un ayuno
desde la tarde anterior en el día 0, antes de la ingesta de L.
reuteri, y en el día 28, al final del estudio. Se tomaron
biopsias del corpus y del antrum del estómago y de la tercera parte
del duodeno, tanto para el cultivo de L. reuteri como para
el examen histológico. El tamaño medio de la biopsia fue de 33 mg.
Las biopsias se pusieron inmediatamente en TFS (2:1 vol/peso de
muestra), almacenadas en hielo y transportadas a los Laboratorios
Biogaia AB, de Lund, Suecia, para un análisis de los recuentos de
Lactobacillus reuteri. El tiempo desde el aislamiento del
tejido hasta el análisis estuvo dentro de 36 horas.
En la sesión de ileoscopia, fueron estudiados
nueve sujetos con ileostomía siguiendo a una colectomía por colitis
ulcerosa (3 sujetos) o por la enfermedad de Crohn (6 sujetos). El
intestino delgado no tenía signos de inflamación en ningún sujeto.
Se llevó a cabo una ileoscopia en el día 0 y en el día 28. Se
tomaron biopsias como anteriormente dentro de los 20 cm distales
del intestino delgado para un cultivo de L. reuteri, al
igual que de otros lactobacilos y para el examen histológico.
Ejemplo
4
Se recogieron muestras de heces de cada sujeto
antes de la ingesta de L. reuteri (día 0) y al final del
estudio (día 28). Las heces en los sujetos de ileoscopia (explicado
más abajo) se tomaron del estoma. Siete voluntarios de la sesión de
gastroscopia y cuatro voluntarios de la sesión de ileoscopia
recogieron muestras de heces el día 42 (14 días después del final
de la toma de L. reuteri). Las muestras (no menos de 5 g) se
recogieron a un recipiente estéril y se colocaron inmediatamente en
una nevera. Dentro de 24 horas, se añadieron 20 ml (1:5 peso/vol)
de agua de peptona al 0,1%. La muestra se homogeneizó y se
distribuyeron alícuotas en viales criogénicos antes de congelar
inmediatamente a -70ºC. Las muestras fueron enviadas, congeladas en
hielo seco, al laboratorio Biogaia AB para su análisis de
Lactobacillus total y de L. reuteri. Allí, las
muestras se descongelaron, se diluyeron y se pusieron en placas
sobre agar MRS-3 que contenía vancomicina (50 mg/l)
para las placas de L. reuteri y de agar LBS (KEBOLAB AB,
Lund, Suecia) para el recuento de Lactobacillus total. El
MRS-3 es un agar MRS modificado (KEBOLAB AB, Lund,
Suecia) que contiene un 2% de acetato sódico (peso/vol). El agar
LBS se prepara según recomienda el fabricante, añadiendo 1,32 ml de
ácido acético glacial por litro. Las placas de agar se incubaron de
manera anaerobia (usando paquetes de gas BBL en tarros anaerobios)
a 37ºC durante 48 años. Se analizó el ADN de aislados seleccionados
del estudio (véase más abajo) mediante RCP usando un kit de
"huella dactilar" del ADN repPROTM de Bacterial Barcodes
(Bacterial BarCodes, Inc., Houston, Texas), y las "huellas
dactilares" fueron analizadas usando el software
Bionumerics (Applied Maths BVBA,
Saint-Martens-Latem, Bélgica).
Al inicio del estudio y antes de la
administración del Producto del Estudio, ninguno de los sujetos de
la sesión de gastroscopia tenía L. reuteri detectable en las
heces (Tabla 2). Después de 28 días de ingesta de L.
reuteri, todos ellos tenían L. reuteri en las heces en
cantidades que oscilaban entre 1,0 \times 10^{2} y 3,5 \times
10^{5} UFC (unidades formadoras de colonias por gramo de materia
fecal), con una media de 4,0 \times 10^{4} UFC/g, lo que indica
un aumento significativo de L. reuteri vivo en las heces
debido a la administración del Producto del Estudio. Cinco sujetos
eligieron entregar muestras fecales en los días 42 y 56 (es decir,
hasta 28 días después de la administración del Producto del
Estudio). En estos sujetos, el L. reuteri persistió en las
heces cuatro semanas después de la ingesta (Tabla 2).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Ejemplo
5
Para evaluar cualquier respuesta inmunológica
local, se determinaron los cambios en la cantidad de linfocitos B,
linfocitos T y macrófagos. Las biopsias de referencia y las biopsias
del día 28 se fijaron en formalina y se metieron en parafina.
Subsiguientemente, se cortaron secciones de 4 \mum y se tiñeron
histoquímicamente usando técnicas estándar (Hematoxylineosin, van
Gieson, PeriodicAcidSciff-Alcain y
PeriodicAcidSciff-diastasa) e
inmunohistoquímicamente. Los anticuerpos principales, obtenidos en
DAKO, Glostrup, Dinamarca, lo fueron a: CD20 (linfocitos B), CD3,
CD4+, CD8 (linfocitos T), CD68 (histiocitos), Helicobacter
and Ki-67 (marcador de proliferación). La tinción
inmunohistoquímica fue realizada en el inmunoteñidor DAKO
TechMate^{TM} 500 para obtener una tinción uniforme.
Un patólogo evaluó las biopsias. Sobre la base
de la tinción histoquímica, se puntuaron (del 1 al 10) las lesiones
tisulares según Madsen et al. (Gastroenterol. 1999;
116:1107-1114). Esta puntuación representa la suma
numérica de cuatro criterios: ulceración, hiperplasia epitelial, la
cantidad de células mononucleares y los granulocitos neutrófilos en
la lámina propia. Sobre la base de la tinción inmunohistoquímica, se
evaluó semicuantitativamente el número de células positivas CD20,
CD3, CD4+, CD8 y CD68 en la lámina propia. Tres meses más tarde,
las biopsias de referencia y del día 28 fueron sometidas a un
proceso de cegamiento y reevaluadas por el mismo patólogo. Las
correlaciones globales entre células teñidas positivas de referencia
y las biopsias del día 28 se calcularon en cada evaluación y se
compararon.
En el estómago (corpus y antrum) de dos sujetos
se encontraron predominantemente células linfocitarias B el día 0 y
de dos sujetos el día 28. Un sujeto tenía células dispersas en el
estómago (antrum) el día 28. Cuatro sujetos tenían células sueltas
en el duodeno el día 0 y 8 sujetos tenían predominantemente células
sueltas en el duodeno el día 28. Ocho sujetos tenían células
predominantemente sueltas de CD3, CD4+ y CD8 (linfocitos T) en el
estómago (corpus y antrum) el día 0 y nueve sujetos tenían células
predominantemente sueltas en el ventrículo (corpus y antrum) el día
28 (Tabla 3). Se encontraron células dispersas en el duodeno de 8
sujetos el día 0, y se encontraron linfocitos T predominantemente
dispersos en el duodeno de 7 sujetos el día 28.
Se encontraron predominantemente células
histiocíticas sueltas en el estómago (corpus y antrum) en nueve
sujetos el día 0 y en 5 sujetos el día 28. Se encontraron células
predominantemente dispersas en el duodeno de 6 sujetos el día 0 y
el día 28 (no los mismos 6 sujetos).
Hubo una caída estadísticamente significativa en
el número de histiocitos (CD68) en las biopsias del corpus (p =
0,025) y antrum (p = 0,046), y un número significativamente
incrementado de células B (CD20) en el duodeno después de que los
sujetos hubieran recibido L. reuteri (p = 0,046; Tabla 3). No
se encontraron cambios significativos en la cantidad de linfocitos
T debida a la ingesta de L. reuteri. La concordancia entre
las dos investigaciones (la primera, un análisis no ciego, y la
segunda un análisis ciego de las muestras histológicas) fue del 76%
(Tabla 3). Para las células histiocíticas (CD68) del corpus y del
antrum, la concordancia fue únicamente del 40% y del 65%,
respectivamente. La concordancia de las células B (CD20) duodenales
fue del 60%. Así, hubo alguna incertidumbre en estos hallazgos. La
concordancia en los análisis de CD3, CD4+ y CD8 fue mucho más
elevada (hasta del 90%; Tabla 3).
En la sesión de ileoscopia, todas las biopsias
fueron histológicamente normales, y negativas para la
Helicobacter. Las células Ki positivas fueron normales en
todas las biopsias. Se encontraron células linfocitarias B
predominantemente sueltas en 6 sujetos y células dispersas en 2
sujetos el día 0. Se observaron células sueltas en todos los
sujetos el día 28. Se encontraron células CD3 (linfocitos B)
predominantemente dispersas en 7 sujetos tanto el día 0 como el día
28. Se encontraron células CD4+ predominantemente dispersas en 7
sujetos el día 0 y grupos de células predominantemente colindantes
en 7 sujetos el día 28. Se encontraron células CD8 predominantemente
dispersas en 7 sujetos el día 0 y en 9 sujetos el día 28 (Tabla 3).
Se encontraron células histiocíticas predominantemente dispersas en
7 sujetos tanto el día 0 como el día 28.
Hubo una cantidad significativamente mayor de
linfocitos CD4+ después del suplemento con L. reuteri durante
28 días (p = 0,046; Tabla 3). No se encontraron cambios
significativos en la cantidad de linfocitos B o de histiocitos
debidos a la administración de L. reuteri. La concordancia
entre las dos investigaciones fue generalmente elevada para todos
los tipos de células examinados y para los hallazgos de CD4+ fue del
78%, indicando una buena fiabilidad en estos datos (Tabla 3). Todas
las tinciones de Helicobacter fueron negativas.
Ejemplo
6
Las muestras sanguíneas se tomaron el día 0 y el
día 28, y se analizaron para estudiar la hemoglobina, el
hematocrito, los trombocitos, los leucocitos, la proteína C
reactiva, el potasio, el sodio, la creatinina, la urea b, la
glucosa p, el colesterol, las LAD (lipoproteínas de alta densidad,
HDL en inglés), las LBD (lipoproteínas de baja densidad, LDL en
inglés), las LMBD (lipoproteínas de muy baja densidad, VLDL en
inglés), los triglicéridos, la bilirrubina total, el urato, la
ALAT, la fosfatasa alcalina y el lactato.
La mayoría de los análisis sanguíneos fueron
normales, tanto antes como después de la ingesta de L.
reuteri. Hubo algunos valores marginales en las variables
sanguíneas, pero no se encontraron anormalidades clínicamente
significativas ni se observaron cambios sistemáticos tras el
tratamiento.
Ejemplo
7
Se llevó a cabo un análisis de "huella
dactilar" del ADN en aislados seleccionados de L. reuteri
del estudio. Así, se tomaron aislados fecales de tres sujetos que
habían consumido L. reuteri durante 28 días, así como un
aislado de una biopsia duodenal y un aislado de una biopsia ileal,
tomadas ambas el día 0, antes de la administración de L.
reuteri. Se encontró que todos los aislados tenían un 98% de
similitud genética entre sí. Todos estos aislados mostraban un 97%
de similitud con SD2112, la cepa incorporada en las tabletas.
Ejemplo
8
En este ejemplo se selecciona L. reuteri SD2112,
ATCC 55730 usando los procedimientos anteriores para la
neutralización de toxinas y reclutamiento de células CD4+ para
añadir a un yogur corriente. La cepa de L. reuteri se
cultiva y liofiliza usando procedimientos estándar para el
desarrollo del Lactobacillus en la industria láctea. Este
cultivo se añade después a leche previamente fermentada usando
cultivos de yogur tradicionales, a un nivel de 10E+7 UFC/gramo de
yogur, y el yogur es usado por seres humanos como forma de potenciar
su función inmunitaria.
Aunque la invención ha sido descrita con
referencia a realizaciones específicas, se apreciará que son
posibles numerosas variaciones, modificaciones y realizaciones y,
en consecuencia, ha de considerarse que todas tales variaciones,
modificaciones y realizaciones están dentro del espíritu y el
alcance de la presente invención.
Claims (7)
1. El uso del Lactobacillus reuteri
ATCC55730 que
- a.
- exhibe un buen enlace con las toxinas y un buen efecto neutralizador de las mismas;
- b.
- exhibe un buen reclutamiento de células CD4+ para la producción de una composición para potenciar la función inmunitaria en mamíferos.
2. El uso conforme a la reivindicación 1 en el
que se usa un sobrenadante de un cultivo de L. reuteri ATCC
55730 para neutralizar toxinas bacterianas.
3. El uso conforme a la reivindicación 1 en el
que el producto está formulado como un alimento que contiene células
de la cepa seleccionada.
4. El uso conforme a la reivindicación 3 en el
que el producto está formulado como una tableta que contiene células
de la cepa seleccionada.
5. El uso conforme a la reivindicación 3 en el
que el producto está formulado como un suplemento dietético que
contiene células de la cepa seleccionada.
6. El uso conforme a la reivindicación 3 en el
que el producto está formulado como un producto de confitería que
contiene células de la cepa seleccionada.
7. El uso conforme a la reivindicación 3 en el
que el producto está formulado como un fármaco que contiene células
de la cepa seleccionada.
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