ES2608938T3

ES2608938T3 - Elementos reguladores de plantas y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2608938T3
Application number: ES12710857.9T
Authority: ES
Inventors: Stanislaw Flasinski
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 2011-03-25
Filing date: 2012-03-21
Publication date: 2017-04-17
Anticipated expiration: 2032-03-21
Also published as: US20230145023A1; PY1214097A; CL2015001413A1; ES2637862T3; CN103534267B; AU2017235957B2; PH12018501396A1; CA3004022C; KR20180119169A; JP2016163583A; KR102003175B1; UY33974A; AR116445A2; JP2014509866A; WO2012134921A2; UY39166A; PH12018501395A1; EP2733152A1; PL2733151T3; CA3004030A1

Abstract

Una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN que se selecciona de entre: (a) una secuencia con al menos un 95 por ciento de identidad de secuencia con la longitud completa de SEQ ID NO: 8, en la que la secuencia tiene actividad de promotor; y (b) una secuencia que comprende cualquiera de la SEQ ID NO: 8 o 9; en la que dicha secuencia está unida operativamente a una molécula de polinucleótido que se puede transcribir heteróloga.

Description

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efectúan la transcripción de genes a los que se unen operativamente. Se cree que muchos elementos amplificadores de promotor se unen a proteínas de unión a ADN y/o afectan la topología del ADN, produciendo conformaciones locales que permiten o restringen selectivamente el acceso de la ARN polimerasa a la matriz de ADN o que facilitan selectivamente la apertura de la doble hélice en el sitio de inicio de la transcripción. Un elemento amplificador puede funcionar uniéndose a factores de la transcripción que regulan la transcripción. Algunos elementos amplificadores se unen a más de un factor de transcripción, y los factores de transcripción pueden interactuar con diferentes afinidades con más de un dominio amplificador. Los elementos amplificadores se pueden identificar por distintas técnicas, incluyendo el análisis de eliminación, es decir, eliminando uno o más nucleótidos del extremo 5’ o internos de un promotor; el análisis de proteínas de unión a ADN utilizando la huella de DNasa I, metilación de interferencia, ensayos de cambio de movilidad en electroforesis, huella genómica in vivo por PCR mediada por ligadura, y otros ensayos convencionales; o por análisis de similitud de secuencia de ADN utilizando elementos de motivos cis conocidos o elementos amplificadores como una secuencia diana o un motivo diana con procedimientos de comparación de secuencia de ADN convencionales, tales como BLAST. La estructura fina de un dominio amplificador se puede estudiar adicionalmente por mutagénesis (o sustitución) de uno o más nucleótidos o por otros procedimientos convencionales. Los elementos amplificadores se pueden obtener por síntesis química o por aislamiento a partir de los elementos reguladores que incluyen dichos elementos, y se pueden sintetizar con nucleótidos flanqueantes adicionales que contienen sitios de enzimas de restricción útiles para facilitar la modificación posterior. Por lo tanto, el diseño, construcción y uso de los elementos amplificadores de acuerdo con los procedimientos desvelados en el presente documento para modular la expresión de moléculas de polinucleótido que se puede transcribir a las que están unidos operativamente se engloban en la presente invención.

En las plantas, la inclusión de algunos intrones en las construcciones genéticas da lugar a un aumento de ARNm y acumulación proteica con respecto a las construcciones que carecen de intrón.

Este efecto se ha denominado “aumento mediado por intrón” (IME) de la expresión genética (Mascarenhas y col., (1990) Plant Mol. Biol. 15:913-920). Los intrón que se sabe que estimulan la expresión en plantas se han identificado en los genes de maíz (por ejemplo, tubA1, Adh1, Sh1, Ubi1 (Jeon y col. (2000) Plant Physiol. 123:1005-1014; Callis y col. (1987) Genes Dev. 1:1183-1200; Vasil y col. (1989) Plant Physiol. 91:1575-1579; Christiansen y col. (1992) Plant Mol. Biol 18:675-689) y en genes de arroz (por ejemplo, salt, tpi: McElroy y col., Plant Cell 2:163-171 (1990); Xu y col., Plant Physiol. 106:459-467 (1994)). De manera similar, se ha descubierto que los intrones de genes de plantas dicotiledóneas como los de petunia (por ejemplo, rbcS), patata (por ejemplo, st-ls1) y de Arabidopsis thaliana (por ejemplo, ubq3 y pat1) elevan las tasas de expresión genética (Dean y col. (1989) Plant Cell 1:201-208; Leon y col. (1991) Plant Physiol. 95:968-972; Norris y col. (1993) Plant Mol Biol 21:895-906; Rose y Last (1997) Plant J.11:455-464). Se ha demostrado que las eliminaciones o mutaciones en los sitios de empalme de un intrón reducen la expresión genética, indicando que el corte y empalme puede ser necesario para el IME (Mascarenhas y col. (1990) Plant Mol Biol. 15:913-920; Clancy y Hannah (2002) Plant Physiol. 130:918-929). Sin embargo, se ha demostrado que ese corte y empalme per se no es necesario para un cierto IME en plantas dicotiledóneas por mutaciones puntuales en los sitios de corte y empalme del gen pat1 de A. thaliana (Rose y Beliakoff (2000) Plant Physiol. 122:535-542).

El aumento de la expresión genética por los intrones no es un fenómeno general debido a que algunas inserciones de intrones en los casetes de expresión recombinantes fallan para aumentar la expresión (por ejemplo, los intrones de genes dicot (gen rbcS de guisante, gen faseolin de alubia y el gen stls-1 de Solanum tuberosum) y los intrones de genes de maíz (el noveno intrón del gen adh1, el primer intrón del gen hsp81)) (Chee y col. (1986) Gene 41:47-57; Kuhlemeier y col. (1988) Mol Gen Genet 212:405-411; Mascarenhas y col. (1990) Plant Mol. Biol. 15:913-920; Sinibaldi y Mettler (1992) En WE Cohn, K Moldave, eds, Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, Vol. 42. Academic Press, New York, pp 229-257; Vancanneyt y col. 1990 Mol. Gen. Genet. 220:245-250). Por lo tanto, no se puede emplear cada intrón con el fin de modificar el nivel de expresión genética de genes no endógenos

o genes endógenos en plantas transgénicas. No se conocen en la técnica anterior las características o distintivos específicos de secuencia que deben estar presentes en una secuencia de intrón con el fin de aumentar la tasa de expresión de un gen determinado y por lo tanto a partir de la técnica precedente no es posible predecir si un intrón vegetal determinado, cuando se utiliza de manera heteróloga, producirá un aumento de la expresión del nivel de ADN o a nivel de transcripto (IME).

Como se utiliza en el presente documento, el término “quimérico” se refiere a una única molécula de ADN que se produce fusionando una primera molécula de ADN a una segunda molécula de ADN, donde ni la primera ni la segunda molécula de ADN se encontraría normalmente en esa configuración, es decir, fusionada una con la otra. La molécula quimérica de ADN por lo tanto es una nueva molécula de ADN que de otra manera no se encuentra normalmente en la naturaleza. Como se utiliza en el presente documento, el término “promotor quimérico” se refiere a un promotor producido por medio de dicha modificación de moléculas de ADN. Un promotor quimérico puede combinar dos o más fragmentos de ADN; un ejemplo sería la fusión de un promotor con un elemento amplificador. Por lo tanto, el diseño, construcción, y uso de promotores quiméricos de acuerdo con los procedimientos desvelados en el presente documento para modular la expresión de moléculas de polinucleótido que se pueden transcribir a las que se unen operativamente están englobados en la presente invención.

Como se utiliza en el presente documento, el término “variante” se refiere a una segunda molécula de ADN que está en una composición similar, pero no idéntica a, una primera molécula de ADN y aun así, la segunda molécula de

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ADN sigue manteniendo la funcionalidad general, es decir, el mismo o similar patrón de expresión, de la primera molécula de ADN. Una variante puede ser una versión más corta o truncada de la primera molécula de ADN y/o una versión alterada de la secuencia de la primera molécula de ADN, tal como una con diferentes sitios de enzimas de restricción y/o eliminaciones, sustituciones, y/o inserciones internas. Una “variante” también puede englobar un elemento regulador que tenga una secuencia de nucleótido que comprende una sustitución, eliminación y/o inserción de uno o más nucleótidos de una secuencia de referencia en la que el elemento regulatorio derivado tiene más o menos o equivalente actividad transcripcional o traduccional que la molécula reguladora parental correspondiente. Las “variantes” del elemento regulador también comprenderá variantes que aparecen por mutaciones que se producen naturalmente en la transformación de células bacterianas y vegetales. En la presente invención, se puede utilizar una secuencia como se proporciona en las SEQ ID NO: 8 y 9 para crear variantes que tienen una composición similar, pero no idéntica a, la secuencia de polinucleótido del elemento regulador original, aunque sigue manteniendo la funcionalidad general, es decir, el mismo o similar patrón de expresión, del elemento regulador original. Las “variantes” del elemento regulador quimérico comprenden los mismos elementos constitutivos que una secuencia de referencia pero los elementos constitutivos que comprenden el elemento regulador quimérico puede estar unido operativamente por varios procedimientos conocidos en la técnica como, digestión y unión por enzimas de restricción, clonación independiente de la unión, ensamblaje modular de productos de PCR durante la amplificación, o síntesis química directa del elemento regulador así como otros procedimientos conocidos en la técnica. La “variante” de elemento regulador quimérico resultante puede estar compuesto por los mismos, o variantes de los mismos, elementos constituyentes de la secuencia de referencia pero se separan en la secuencia o secuencias que comprende la secuencia de unión o las secuencias que permiten que las partes constituyentes estén unidas operativamente. En la presente invención, una secuencia de polinucleótido proporcionada como SEQ ID NO: 8 y 9 proporcionan una secuencia de referencia en la que los elementos constituyentes que comprenden la secuencia de referencia se pueden unir por procedimientos conocidos en la técnica y pueden comprender sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de uno o más nucleótidos o mutaciones que se producen naturalmente en la transformación de células bacterianas y vegetales.

Construcciones

Como se utiliza en el presente documento, el término “construcción” significa cualquier molécula de polinucleótido recombinante tal como un plásmido, cósmido, virus, molécula de polinucleótido replicante autónomamente, fago, o molécula de polinucleótido de ADN o ARN de cadena sencilla o doble, derivado de cualquier fuente, capaz de la integración genómica o replicación autónoma, que comprende una molécula de polinucleótido en la que una o más moléculas de polinucleótido se ha unido de manera funcionalmente operativa, es decir, unida operativamente. Como se utiliza en el presente documento, el término vector” significa cualquier construcción de polinucleótido recombinante que se puede utilizar con el fin de transformar, es decir, introducir un ADN heterólogo en una célula huésped. El término incluye un casete de expresión aislado de cualquiera de las moléculas mencionadas anteriormente.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “unido operativamente” se refiere a una primera molécula que se une a una segunda molécula, en la que las moléculas se disponen de manera que la primera molécula afecta a la función de la segunda molécula. Las dos moléculas pueden ser parte o no de una única molécula contigua y pueden estar adyacentes o no. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a una molécula de polinucleótido que se puede transcribir si el promotor modula la transcripción de la molécula de polinucleótido que se puede transcribir de interés en una célula. Un líder, por ejemplo, está unido operativamente a la secuencia codificante cuando es capaz de funcionar como líder del polipéptido codificado por la secuencia codificante.

Las construcciones de la presente invención se pueden proporcionar, en una realización, como construcciones de ADN en plásmido Ti de doble límite que tienen las regiones limítrofe derecha (RB o AGRtu.RB) y limítrofe izquierda (LB o AGRtu.LB) del plásmido Ti aislado de Agrobacterium tumefaciens que comprende un ADN-T, que junto con las moléculas de transferencia proporcionadas por las células de A. tumefaciens, permiten la integración del ADN-T en el genoma de una célula vegetal (véase, por ejemplo, la Patente de EE. UU. 6.603.061). Las construcciones también pueden contener segmentos de armazón de ADN que proporcionan la función de replicación y selección por antibiótico en células bacterianas, por ejemplo, un origen de replicación de Escherichia coli tal como ori322, un origen de replicación con un amplio intervalo de huéspedes tales como oriV u oriRi, y una región codificante para un marcador genético tal como Espec/Estrp que codifica una aminoglucósido adeniltransferasa Tn7 (aadA) que confiere una resistencia a la espectinomicina o estreptomicina, o un gen marcador genético de gentamicina (Gm, Gent). Para la transformación de plantas, la cepa bacteriana huésped a menudo es A. tumefaciens ABI, C58, o LBA4404; sin embargo, pueden funcionar otras cepas conocidas por los expertos en la técnica de transformación de plantas en la presente invención.

Se conocen en la técnica procedimientos para ensamblar e introducir construcciones en una célula de tal manera que la molécula de polinucleótido que se puede transcribir se transcribe en una molécula de ARNm funcional que se traduce y expresa como un producto proteico. Para la práctica de la presente invención, se conocen bien composiciones convencionales y procedimientos para preparar y utilizar construcciones y células huésped por el experto en la técnica, véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª edición Volúmenes 1, 2, y 3 (2000) J. Sambrook, D.W. Russell, y N. Irwin, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Los procedimientos para producir vectores recombinantes adecuados particularmente para la transformación en planteas incluyen los

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En las plantas, no se conocen secuencias de señal de poliadenilación claramente definidas. Hasegawa y col., Plant J 33:1063-1072, (2003)) no fueron capaces de identificar secuencias de señal de poliadenilación conservado en sistemas tanto in vitro como in vivo en Nicotiana sylvestris y para determinar la longitud actual de la trascripción primaria (no adenilada). Una 3’ UTR débil tiene el potencial de generar una lectura previa, que puede afectar la expresión de los genes localizados en la vecindad de los casetes de expresión (Padidam y Cao, BioTechniques 31:328-334 (2001)). El control apropiado de la terminación de la transcripción puede evitar la lectura previa en secuencias (por ejemplo, otros casetes de expresión) localizados corriente abajo y puede además permitir el reciclado eficaz de ARN polimerasa, para mejorar la expresión genética. La terminación eficaz de la transcripción (liberación de ARN polimerasa II a partir de ADN) es un pre-requisito para el reinicio de la transcripción y por lo tanto afecta el nivel de transcripción total. Posteriormente a la terminación de la transcripción, el ARNm maduro se libera del sitio de síntesis y matriz hacia el citoplasma. Los ARNm en eucariotas se acumulan como formas poliA in vivo, de manera que es difícil detectar sitios de terminación transcripcional por procedimientos convencionales. Sin embargo, la predicción de 3’ UTR funcionales y eficaces por procedimientos bioinformáticos es difícil ya que no tienen secuencias conservadas que permitirían la predicción fácil de una 3’UTR eficaz.

Desde una perspectiva práctica, normalmente es beneficioso que una 3’ UTR que se utiliza en un casete transgénico posee las siguientes características. La 3’ UTR debería ser capaz de terminar eficiente y eficazmente la transcripción del transgén y evitar la lectura previa de la transcripción en cualquier secuencia de ADN contigua que puede comprender otro casete transgénico como en el caso de múltiples casetes que residen en un ADN-T, o el ADN cromosómico vecino en el que se inserta el ADN-T. La 3’ UTR no debería producir una reducción en la actividad transcripcional impartida por el promotor, líder e intrones que se utilizan para dirigir la expresión de un transgén. En la tecnología vegetal, la 3’ UTR a menudo se utiliza para cebar reacciones de amplificación de ARN transcrito inversamente extraído de la planta transformada y que se utiliza para (1) evaluar la actividad transcripcional o expresión de un casete transgénico una vez que se integra en el cromosoma de la planta; (2) evaluar el número de copias de inserciones en el ADN de la planta; y (3) evaluar la cigosidad de la semilla resultante tras el cruce. La 3’ UTR también se utiliza en reacciones de amplificación de ADN extraído de la planta transformada para caracterizar la intactilidad del casete insertado.

Las 3’ UTR útiles para proporcionar la expresión de un transgén en plantas se puede identificar basándose en la expresión de marcadores de secuencia expresados (EST) en bibliotecas de ADNc producidos a partir del ARN mensajero aislado de semillas, flores y otros tejidos derivados de Tallo azul grande (Andropogon gerardii), hierba pluma (Saccharum ravennae (Eriantus ravennae)), cola de zorro verde (Setaria viridis), Maíz cimarrón (Zea mays subesp. mexicana), mijo cola de zorro (Setaria itálica), o Coix (Coix lacryma-jobi). Las bibliotecas de ADNc se producen a partir de tejidos aislados de especies vegetales seleccionadas utilizando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica a partir de tejidos florales, de semillas, hojas y raíces. Los ADNc resultantes se secuencias utilizando varios procedimientos de secuenciación conocidos en la técnica. Los EST resultantes se ensamblan en agrupamientos utilizando software bioinformático tal como clc_ref assemble_complete versión 2.01.37139 (CLC bio USA, Cambridge, Massachusetts 02142). La abundancia de transcripción de cada agrupamiento se determina contando el número de lecturas de ADNc de cada agrupamiento. Las 3’ UTR identificadas pueden estar comprendidas por la secuencia derivada de una secuencia de ADNc así como una secuencia derivada de ADN genómico. La secuencia de ADNc se utiliza para diseñar cebadores, que se utilizan entonces con las bibliotecas construidas con GenomeWalker™ (Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA) siguiendo el protocolo del fabricante para clonar la región 3’ de la secuencia correspondiente del ADN genómico para proporcionar una secuencia de terminación más larga. El análisis de la abundancia relativa de transcriptos por recuento directo o recuentos normalizados de las lecturas de secuencia observadas para cada biblioteca de tejidos se puede utilizar para deducir las propiedades de patrones de expresión. Por ejemplo, algunas 3’ UTR se pueden encontrar en transcriptos que se ven con mayor abundancia en el tejido de la raíz en comparación con las hojas. Esto sugiere que el transcripto se expresa altamente en la raíz y que las propiedades de la expresión en la raíz pueden atribuirse a la regulación transcripcional del promotor, el líder, los intrones o la 3’ UTR. El ensayo empírico de las 3’ UTR identificadas por las propiedades de expresión en órganos, tejidos y tipos celulares específicos pueden dar como resultado las 3’ UTR que aumentan la expresión en esos órganos, tejidos y tipos celulares específicos.

Las construcciones y vectores también pueden incluir una secuencia codificante de un péptido de tránsito que expresa un péptido unido que es útil para dirigir producto proteico, particularmente a un cloroplasto, leucoplasto, u otro orgánulo plástido; mitocondrias; peroxisoma; vacuola; o una localización extracelular. Para las descripciones del uso de péptidos de transito al cloroplasto, véase la Patente de EE. UU. Nº 5.188.642 y la Patente de EE. UU. Nº

5.728.925. Muchas proteínas localizadas en el cloroplasto se expresan a partir de genes nucleares como precursores que son dirigidos al cloroplasto por un péptido de tránsito al cloroplasto (CTP). Ejemplos de dichas proteínas de cloroplasto aisladas incluyen los que se asocian con la subunidad pequeña (SSU) de ribulosa-1,5, bifosfato carboxilasa, ferredoxina, ferredoxina oxidorreductasa, el complejo proteína I y proteína II de recolección de luz, tiorredoxina F, enolpiruvil shikimato fosfato sintasa (EPSPS), y los péptidos de tránsito descritos en la Patente de EE. UU. Nº 7.193.133. Se ha demostrado in vivo e in vitro que las proteínas no del cloroplasto pueden ser dirigidas al cloroplasto mediante el uso de fusiones proteicas con un CTP heterólogo y que el CTP es suficiente para dirigir una proteína al cloroplasto. La incorporación de un péptido de tránsito al cloroplasto adecuado tal como el CTP EPSPS de Arabidopsis thaliana (CTP2) (véase, Klee y col., Mol. Gen. Genet. 210:437-442 (1987)) o el CTP EPSPS Petunia hybrida (CTP4) (véase, della-Cioppa y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA 83:6873-6877 (1986)) ha

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demostrado dirigir secuencias de proteína EPSPS heterólogas a los cloroplastos en plantas transgénicas (véase, las Patentes de EE. UU. Nº 5.627.061; 5.633.435; y 5.312.910 y los documentos EP 0218571; EP 189707; EP 508909; y EP 924299).

Moléculas de polinucleótidos que se pueden transcribir

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “molécula de polinucleótido que se puede transcribir” se refiere a cualquier molécula de ADN capaz de ser transcrita en una molécula de ARN, incluyendo, pero sin limitarse a, las que tienen secuencias codificantes de proteína y las que producen moléculas de ARN que tienen secuencias útiles para la supresión genética. Un “transgén” se refiere a una molécula de polinucleótido que se puede transcribir heteróloga para una célula huésped al menos con respecto a su localización en el genoma y/o una molécula de polinucleótido que se puede transcribir incorporada artificialmente en el genoma de la célula huésped en la generación actual o una anterior de la célula.

Un promotor de la presente invención puede estar unido operativamente a una molécula de polinucleótido que se puede transcribir que es heteróloga con respecto a la molécula de promotor. Como se utiliza en el presente documento el término “heterólogo” se refiere a la combinación de dos o más moléculas de polinucleótido cuando dicha combinación no se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, las dos moléculas se pueden derivar de diferentes especies y/o las dos moléculas se pueden derivar de genes diferentes, por ejemplo genes diferentes de la misma especie o los mismos genes de especies diferentes. Un promotor por lo tanto es heterólogo con respecto a una molécula de polinucleótido que se puede transcribir al que se une operativamente si dicha combinación no se encuentra normalmente en la naturaleza, es decir, que la molécula de polinucleótido que se puede transcribir no se encuentra naturalmente unida operativamente en combinación con esa molécula promotora.

La molécula de polinucleótido que se puede transcribir puede ser en general cualquier molécula de ADN para la cual se desea la expresión de un transcrito de ARN. Dicha expresión de un transcrito de ARN puede dar como resultado la traducción de la molécula de ARNm resultante y por lo tanto la expresión proteica. De manera alternativa, por ejemplo, una molécula de polinucleótido que se puede transcribir se puede diseñar para producir en último término la disminución de la expresión de un gen o proteína específicos. En una realización, se puede conseguir utilizando una molécula de polinucleótido que se puede transcribir que se orienta en dirección antisentido. Un experto en la técnica está familiarizado con el uso de dicha tecnología antisentido. En resumen, según se transcribe la molécula de polinucleótido que se puede transcribir antisentido, el producto ARN se hibrida y secuestra una molécula de ARN complementaria dentro de la célula. Este dúplex de moléculas de ARN no puede traducirse en una proteína por la maquinaria de traducción de la célula y es degradada por la célula. Cualquier gen se puede regular negativamente de esta manera.

Por lo tanto, una realización de la invención es un elemento regulador de la presente invención, tal como los que se proporcionan como SEQ ID NO: 8 y 9, que se une operativamente a una molécula de polinucleótido que se puede transcribir de manera que modula la transcripción de la molécula de polinucleótido que se puede transcribir a un nivel deseado o con un patrón deseado cuando la construcción se integra en el genoma de una célula vegetal. En una realización, la molécula de polinucleótido que se puede transcribir comprende una región codificante de una proteína de un gen, y el promotor afecta la transcripción de una molécula de ARN que se transfiere y expresa como un producto proteico. En otra realización la molécula de polinucleótido que se puede transcribir comprende una región antisentido de un gen, y el promotor afecta a la transcripción de una molécula de ARN antisentido, un ARN de doble cadena u otra molécula de ARN inhibidora similar con el fin de inhibir la expresión de una molécula de ARN específica de interés en una célula huésped diana.

Genes de interés agronómico

Las moléculas de polinucleótido que se puede transcribir pueden ser genes de interés agronómico. Como se utiliza en el presente documento, la expresión “gen de interés agronómico” se refiere a una molécula de polinucleótido que se puede transcribir que cuando se expresa en un tejido, célula, o tipo celular de una planta confiere una característica deseable, tal como las que se asocian con la morfología, fisiología, crecimiento desarrollo, rendimiento, producción, perfil nutricional, resistencia a enfermedades y plagas, y/o tolerancia ambiental o química de la planta. Los genes de interés agronómico incluyen los que codifican una proteína de rendimiento, una proteína de resistencia al estrés, una proteína de control del desarrollo, una proteína de diferenciación tisular, una proteína del meristemo, una proteína sensible al entorno, una proteína de senescencia, una proteína sensible a hormonas, una proteína de abscisión, una proteína fuente, una proteína de sedimentación, una proteína de control de la floración, una proteína de semilla, una proteína de resistencia a herbicidas, una proteína de resistencia a la enfermedad, una enzima biosintética de ácidos grasos, una enzima biosintética de tocoferol, una enzima biosintética de aminoácidos, una proteína plaguicida, o cualquier otro agente tal como una molécula antisentido o ARNi que se dirige a un gen en particular para suprimirlo. El producto de un gen de interés agronómico puede actuar en la planta con el fin de producir un efecto en la fisiología o metabolismo de la planta o puede actuar como un agente plaguicida en la dienta de una plaga que se alimenta de la planta.

En una realización de la invención, un promotor de la presente invención se incorpora en una construcción tal como el promotor que se une operativamente a una molécula de polinucleótido que se puede transcribir que es un gen de

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interés agronómico. La expresión del gen de interés agronómico es deseable con el fin de conferir un rasgo agronómicamente deseable. Un rasgo agronómico beneficioso puede ser, por ejemplo, tolerancia a herbicidas, control de insectos, rendimiento modificado, resistencia a una enfermedad fúngica, resistencia vírica, resistencia a nematodos, resistencia a una enfermedad bacteriana, desarrollo y crecimiento de la planta, producción de almidón, producción de aceites modificados, alta producción de aceites, contenido en ácidos grasos modificados, alta producción proteica, maduración de frutas, aumento de nutrición animal y humana, biopolímeros, resistencia a estrés ambiental, péptidos farmacéuticos y péptidos que se pueden secretar, rasgos de procesamiento mejorados, digestibilidad mejorada, producción enzimática, sabor, fijación de nitrógeno, producción de semillas híbridas, producción de fibra, y producción de biocombustible. Ejemplos de genes agronómicos de interés conocidos en la técnica incluyen los de resistencia a herbicidas (Patente de EE. UU. Nº 6.803.501; 6.448.476; 6.248.876; 6.225.114; 6.107.549; 5.866.775; 5.804.425; 5.633.435; y 5.463.175), aumento de rendimiento (Patente de EE. UU. Nº USRE38.446; 6.716.474; 6.663.906; 6.476.295; 6.441.277; 6.423.828; 6.399.330; 6.372.211; 6.235.971; 6.222.098; y 5.716.837), control de insectos (Patente de EE. UU. Nº 6.809.078; 6.713.063; 6.686.452; 6.657.046; 6.645.497; 6.642.030; 6.639.054; 6.620.988; 6.593.293; 6.555.655; 6.538.109; 6.537.756; 6.521.442; 6.501.009; 6.468.523; 6.326.351; 6.313.378; 6.284.949; 6.281.016; 6.248.536; 6.242.241; 6.221.649; 6.177.615; 6.156.573; 6.153.814; 6.110.464; 6.093.695; 6.063.756; 6.063.597; 6.023.013; 5.959.091; 5.942.664; 5.942.658. 5.880.275; 5.763.245; y 5.763.241), resistencia a una enfermedad fúngica (Patente de EE. UU. Nº 6.653.280; 6.573.361; 6.506.962; 6.316.407; 6.215.048; 5.516.671; 5.773.696; 6.121.436; 6.316.407; y 6.506.962), resistencia a virus (Patente de EE. UU. Nº 6.617.496; 6.608.241; 6.015.940; 6.013.864; 5.850.023; y 5.304.730), resistencia a nematodos (Patente de EE. UU. Nº resistencia a enfermedad bacteriana (Patente de EE. UU. Nº 5.516.671), crecimiento y desarrollo de la planta (Patente de EE. UU. Nº 6.723.897 y 6.518.488), producción de almidón (Patente de EE. UU. Nº 6.538.181; 6.538.179; 6.538.178; 5.750.876; 6.476.295), producción de aceites modificada (Patente de EE. UU. Nº 6.444.876; 6.426.447; y 6.380.462), alta producción de aceite (Patente de EE. UU. Nº 6.495.739; 5.608.149; 6.483.008; y 6.476.295), contenido modificado en ácidos grasos (Patente de EE. UU. Nº 6.828.475; 6.822.141; 6.770.465; 6.706.950; 6.660.849; 6.596.538; 6.589.767; 6.537.750; 6.489.461; y 6.459.018), alta producción proteica (Patente de EE. UU. Nº 6.380.466), maduración de frutos (Patente de EE. UU. Nº 5.512.466), aumento de nutrición animal y humana (Patente de EE. UU. Nº 6.723.837; 6.653.530; 6.5412.59; 5.985.605; y 6.171.640), biopolímeros (Patente de EE. UU. Nº USRE37.543; 6.228.623; y 5.958.745, y 6.946.588), resistencia a estrés ambiental Patente de EE. UU. Nº 6.072.103), péptidos farmacéuticos y péptidos que se pueden secretar (Patente de EE. UU. Nº 6.812.379; 6.774.283; 6.140.075; y 6.080.560), rasgos de procesamiento mejorados (Patente de EE. UU. Nº 6.476.295), digestibilidad mejorada (Patente de EE. UU. Nº 6.531.648), baja rafinosa (Patente de EE. UU. Nº 6.166.292), producción enzimática industrial (Patente de EE. UU. Nº 5.543.576), sabor mejorado (Patente de EE. UU. Nº 6.011.199), fijación de nitrógeno (Patente de EE. UU. Nº 5.229.114), producción de semillas híbridas (Patente de EE. UU. Nº 5.689.041), producción de fibra (Patente de EE. UU. Nº 6.576.818; 6.271.443; 5.981.834; y 5.869.720) y producción de biocombustibles (Patente de EE. UU. Nº 5.998.700).

De manera alternativa, un gen de interés agronómico puede afectar las características o fenotipo de la planta que se ha mencionado anteriormente codificando una molécula de ARN que produzca una modulación dirigida de la expresión del gen de un gen endógeno, por ejemplo, por medio de antisentido (véase, por ejemplo, la Patente de EE. UU. Nº 5.107.065); ARN inhibidor (“ARNi”, incluyendo la modulación de la expresión genética por medio de mecanismos mediados por miARN, ARNip, ARNip trans-actuante, y sARN en fase, por ejemplo como se describe en las solicitudes publicadas US 2006/0200878 y US 2008/0066206, y en la solicitud de patente de EE. UU. 11/974.469); o mecanismos mediados por co-supresión. El ARN también podría ser una molécula de ARN catalítico (por ejemplo, una ribozima o riboswitch, véase, por ejemplo US 2006/0200878) modificada para escindir una producto de ARNm deseado. Por lo tanto, cualquier molécula de polinucleótido que se puede transcribir que codifique una molécula de ARN transcrita que afecte a un fenotipo agronómicamente importante o cambio morfológico de interés puede ser útil para la práctica de la presente invención. Se conocen procedimientos en la técnica para construir e introducir construcciones en una célula de tal manera que la molécula de polinucleótido que se puede transcribir se transcribe en una molécula que es capaz de producir supresión genética. Por ejemplo, la supresión genética post-transcripcional utilizando una construcción con una molécula de polinucleótido que se puede transcribir orientada anti-sentido para regular la expresión genética en células vegetales se desvela en las Patentes de EE. UU. Nº 5.107.065 y 5.759.829, y la supresión genética post-transcripcional utilizando una construcción con una molécula de polinucleótido que se puede transcribir orientada en sentido para regular la expresión genética en plantas se desvela en las Patentes de EE. UU. Nº 5.283.184 y 5.231.020. La expresión de un polinucleótido que se puede transcribir en una célula vegetal se puede utilizar también para suprimir las plagas de las plantas que se alimentan de la célula vegetal, por ejemplo, composiciones aisladas de plagas de coleópteros (Publicación de Patente de EE. UU. Nº US20070124836) y composiciones aisladas de plagas por nematodos (Publicación de Patente de EE. UU. Nº US20070250947). Las plagas de las plantas incluyen plagas por artrópodos, plagas por nematodos, y plagas fúngicas o microbianas. Las moléculas de polinucleótido que se puede transcribir ejemplares para la incorporación en construcciones de la presente invención incluyen, por ejemplo, moléculas de ADN o genes de una especie distinta de la especie diana o genes que se originan con o están presentes en la misma especie, pero que se incorporan en células receptoras por procedimientos de modificación genética más que por técnicas clásicas de reproducción o cruzamiento. El tipo de molécula de polinucleótido puede incluir una molécula de polinucleótido que ya está presente en la célula vegetal, una molécula de polinucleótido de otra planta, una molécula de polinucleótido de un organismo diferente, o una molécula de polinucleótido generada externamente, tal como una molécula de polinucleótido que contienen un mensaje antisentido de un gen, o una molécula de polinucleótido que

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codifica una versión artificial, sintética o modificada de otra manera de un transgén.

Marcador genético

Como se utiliza en el presente documento, el término “marcador” se refiere a cualquier molécula de polinucleótido que se puede transcribir cuya expresión, o falta de la misma, se puede explorar o valorar de alguna manera. Los marcadores genéticos para su uso en la práctica de la presente invención incluyen moléculas de polinucleótido que se puede transcribir que codifican la β-glucuronidasa (GUS descrita en la Patente de EE. UU. Nº 5.599.670), proteína fluorescente verde y variantes de la misma (GFP, descrita en las Patentes de EE. UU. Nº 5.491.084 y 6.146.826), proteínas que confieren resistencia a antibióticos, o proteínas que confieren resistencia a herbicidas. Los marcadores de resistencia a antibióticos, que incluyen los que codifican proteínas que confieren resistencia a kanamicina (nptII), higromicina B (aph IV), estreptomicina o espectinomicina (aad, espec/estrep) y gentamicina (aac3 y aacC4) se conocen en la técnica. Los herbicidas para los que se ha demostrado tolerancia en las plantas transgénicas y se puede aplicar el procedimiento de la presente invención, incluyen. ácido amino-metil-fosfónico, glifosato, glufosinato, sulfonilureas, imidazolinonas, bromoxinil, dalapon, dicamba, ciclohexanodiona, inhibidores de la pro-toporfirinogeno oxidasa, y herbicidas isoxasflutol. Las moléculas de polinucleótido que se puede transcribir que codifican proteínas implicadas en la tolerancia a herbicidas se conocen en la técnica, e incluyen una molécula de polinucleótido que se puede transcribir que codifican la 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS para la tolerancia la glifosato descrita en la Patente de EE. UU. Nº 5.627.061; 5.633.435; 6.040.497; y 5.094.945); una molécula de polinucleótido que se puede transcribir que codifica una glifosato oxidorreductasa y una glifosato-Nacetil transferasa (GOX descrita en la Patente de EE. UU. Nº 5.463.175; GAT descrita en publicación de Patente de EE. UU. Nº 20030083480, y dicamba monooxigenasa publicación de Patente de EE. UU. Nº 20030135879); una molécula de polinucleótido que se puede transcribir que codifica la bromoxinil nitrilasa (Bxn para la tolerancia al Bromoxinil descrita en la Patente de EE. UU. Nº 4.810.648); una molécula de polinucleótido que se puede transcribir que codifica la fitoeno desaturasa (crtI) descrita en Misawa, y col., Plant Journal 4:833-840 (1993) y Misawa, y col., Plant Journal 6:481-489 (1994) para la tolerancia a norflurazona; una molécula de polinucleótido que se puede transcribir que codifica acetohidroxiácido sintasa (AHAS, aka ALS) descrita en Sathasiivan, y col., Nucl. Acids Res. 18:2188-2193 (1990) para la tolerancia a los herbicidas sulfonilurea; y el gen bar descrito en DeBlock, y col., EMBO Journal 6:2513-2519 (1987) para la tolerancia a glufosinato y bialafós. Las moléculas promotoras de la presente invención pueden expresar moléculas de polinucleótido que se puede transcribir a las que se unen que codifican fosfinotricina acetiltransferasa, EPSPS resistente a glifosato, aminoglucósido fosfotransferasa, hidroxifenil piruvato deshidrogenasa, higromicina fosfotransferasa, neomicina fosfotransferasa, dalapón deshalogenasa, nitrilasa resistente a bromoxinil, antranilato sintasa, ariloxialkanoato dioxigenasa, acetil CoA carboxilasa, glifosato oxidorreductasa, y glifosato-N-acetil transferasa.

También se incluyen en la expresión “marcadores genéticos” genes que codifican marcadores genéticos cuya secreción se puede detectar como un medio para identificar o seleccionar las células transformadas. Los ejemplos incluyen marcadores que codifican un antígeno que secreta que se puede identificar por interacción con anticuerpos,

o incluso enzimas que se secretan que se pueden detectar catalíticamente. Las proteínas marcadoras que se pueden seleccionar se encuentran en varias clases, que incluyen proteínas pequeñas, difusibles que son detectables (por ejemplo, por ELISA), enzimas pequeñas activas que se detectan en solución extracelular (por ejemplo, alfa-amilasa, beta-lactamasa, fosfinotricina transferasa), o proteínas que se insertan o atrapan en la pared celular (tal como proteínas que incluyen una secuencia líder tal como la que se encuentran en la unidad de expresión de extensión o proteínas relacionadas con la patogénesis del tabaco también conocidas como PR-S del tabaco). Otros marcadores genéticos posibles serán evidentes para los expertos en la técnica y se engloban en la presente invención.

Transformación celular

La invención también se refiere a un procedimiento para producir células y plantas transformadas que comprenden un promotor unido operativamente a una molécula de polinucleótido que se puede transcribir.

El término “transformación” se refiere a la introducción de un ácido nucleico en un huésped receptor. Como se utiliza en el presente documento, el término “huésped” se refiere a bacterias, hongos o plantas, incluyendo cualquier célula, tejido, órgano, o progenie de las bacterias, hongos o plantas. Los tejidos y células vegetales de interés particular incluyen los protoplastos, callos, raíces, tubérculos, semillas, ramas, hojas, plantones, embriones y polen.

Como se utiliza en el presente documento, el término “transformado” se refiere a una célula, tejido, órgano, u organismo en el que se ha introducido una molécula de polinucleótido ajena, tal como una construcción. La molécula de polinucleótido se puede integrar en el ADN genómico de la célula, tejido, órgano u organismo receptor de manera que la molécula de polinucleótido introducida se hereda en la progenie posterior. Una célula u organismo “transgénico” o “transformado” también incluye la progenie de la célula u organismo y la progenie producida en un programa de cruzamiento que emplea dicho organismo transgénico como parental en un cruzamiento y que presenta un fenotipo alterado que es el resultado de la presencia de una molécula de polinucleótido ajena. El término “transgénico” se refiere a una bacteria, hongo, o planta que contiene una o más moléculas de ácido polinucleico heterólogo.

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Hay muchos procedimientos para introducir moléculas de ácido polinucleico en células vegetales. El procedimiento comprende en general las etapas de seleccionar una célula huésped adecuada, transformar la célula huésped con un vector recombinante, y obtener la célula huésped transformada. Los procedimientos adecuados incluyen la infección bacteriana (por ejemplo, por Agrobacterium), vectores cromosómicos artificiales bacterianos binarios, suministro directo de ADN (por ejemplo, por transformación mediada por PEG, captación de ADN mediada por desecación/inhibición, electroporación, agitado con fibras de carburo de silicio, y aceleración de partículas revestidas con ADN, etc. (revisado en Potrykus, y col., Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 205 (1991)).

La tecnología para la introducción de una molécula de ADN en las células es bien conocida por los expertos en la técnica. Los procedimientos y materiales para transformar células vegetales introduciendo una construcción de ADN vegetal en un genoma vegetal en la práctica de esta invención puede incluir cualquiera de los procedimientos demostrados y bien conocidos. Cualquier procedimiento de transformación se puede utilizar para transformar una célula huésped con uno de los promotores y/o construcciones de la presente invención. Las células huéspedes pueden ser cualquier célula u organismo tal como una célula vegetal, célula de alga, célula fúngica, hongo, célula bacteriana. o célula de insecto. Los huéspedes y células transformadas preferidas incluyen células de: plantas, Aspergilllus, levaduras, insectos, bacterias y algas.

Las plantas transgénicas regeneradas se pueden autopolinizar para proporcionar plantas transgénicas homocigotas. De manera alternativa, el polen obtenido de las plantas transgénicas regeneradas se puede cruzar con plantas no transgénicas, preferentemente líneas endogámicas de especies agronómicamente importantes. Las descripciones de los procedimientos de cruzamiento que se utilizan habitualmente para los diferentes rasgos y mazorcas se pueden encontrar en uno de varios libros de referencia, véase, por ejemplo, Allard, Principles of Plant Breeding, John Wiley y Sons, NY, U. of CA, Davis, CA, 50-98 (1960); Simmonds, Principles of crop improvement, Longman, Inc., NY, 369-399 (1979); Sneep y Hendriksen, Plant breeding perspectives, Wageningen (ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation (1979); Fehr, Soybeans: Improvement, Production and Uses, 2ª Edición, Monograph,

16:249 (1987); Fehr, Principles of variety development, Theory and Technique, (Vol. 1) y Crop Species Soybean (Vol 2), Iowa State Univ., Macmillan Pub. Co., NY, 360-376 (1987). Por el contrario, se puede utilizar el polen de plantas no transgénicas para polinizar las plantas transgénicas regeneradas.

Las plantas transformadas se pueden analizar en cuanto a la presencia de los genes de interés y el nivel de expresión y/o el perfil conferido por los elementos reguladores de la presente invención. los expertos en la técnica son conscientes de numerosos procedimientos para el análisis de plantas transformadas. Por ejemplo, los procedimientos para el análisis de plantas incluyen transferencias de Southern o transferencias de Northern, estrategias basadas en PCR, análisis bioquímicos, procedimientos de exploración de fenotipo, evaluaciones de campo, y ensayos inmunodiagnósticos. La expresión de una molécula de polinucleótido que se puede transcribir puede medirse utilizando reactivos y procedimientos TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA) como describe el fabricante y los tiempos de ciclos de PCR utilizando la Matriz de Ensayo TaqMan®. De manera alternativa, se puede utilizar la expresión transgénica con los reactivos y procedimientos Invader® (Third Wave Technologies, Madison, WI) como describe el fabricante.

Las semillas de las plantas de la presente invención se pueden recolectar de las plantas transgénicas fértiles y se pueden utilizar para cultivar generaciones de progenie de plantas transformadas de la presente invención incluyendo líneas de plantas híbridas que comprenden la construcción de la presente invención y que expresan un gen de interés agronómico.

La presente invención también proporciona partes de las plantas de la presente invención. Las partes de plantas incluyen hojas, tallos, raíces, tubérculos, semillas, endospermos, óvulos, y polen. La invención incluye también y proporciona células vegetales transformadas que comprenden una molécula de ácido nucleico de la presente invención.

La planta transgénica puede pasar la molécula de polinucleótido transgénica a su progenie. La progenie incluye cualquier parte de la planta regenerable o semilla que comprende el transgén derivado de una planta ancestral. La planta transgénica es preferentemente homocigota para la molécula de polinucleótido transformada y transmite eta secuencia a toda la descendencia como resultado de reproducción sexual. La progenie se puede cultivar a partir de semillas producidas por la planta transgénica. Estas plantas adicionales se pueden entonces autopolinizar para generar una línea de cruzamiento verdadera de plantas. La progenie de estas plantas se evalúa, entre otras cosas, en cuanto a la expresión genética. La expresión genética se puede detectar por varios procedimientos comunes tales como transferencia de western, transferencia de Northern, inmunoprecipitación, y ELISA.

Productos comerciales

Se desvela adicionalmente productos comerciales que comprenden las moléculas de ADN de acuerdo con la invención. Como se utiliza en el presente documento, un “producto comercial” se refiere a cualquier composición o producto que está compuesto de un material derivado de una planta, semilla, célula vegetal, o parte vegetal que comprende una molécula de ADN de la invención. Los productos comerciales se pueden vender a los consumidores y pueden ser viables o no viables. Los productos comerciales no viables incluyen semillas y granos no viables; semillas procesadas, partes de semilla, y partes de plantas; tejidos de plantas deshidratados, tejidos de plantas

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congelados, y tejidos de plantas procesados; semillas y partes de plantas procesados para la alimentación animal para el consumo de animales terrestres y/o acuáticos, aceites, carne, harinas, copos, salvado, fibra, leche, queso, papel, nata, vino y otros alimentos para el consumo humano, y productos de biomasa o combustibles. Los productos comerciales viables incluyen pero no se limitan a semillas y plantas celulares. Las plantas que comprenden una molécula de ADN de acuerdo con la invención se pueden por lo tanto utilizar para fabricar cualquier producto comercial que se adquiere normalmente a partir de plantas o partes de las mismas.

Habiendo descrito ya en general la invención, la misma se entenderá fácilmente mediante la referencia a los siguientes ejemplos. Los ejemplos no cubiertos por el ámbito de las reivindicaciones son con fines ilustrativos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Identificación y clonación de elementos reguladores

Se identificaron y aislaron nuevos elementos reguladores de la transcripción, o secuencias de un grupo de elementos de expresión reguladores de la transcripción a partir del ADN genómico de las especies monocotiledóneas tallo azul grande (Andropogon gerardii), hierba pluma (Saccharum ravennae (Erianthus ravennae), cola de zorro verde (Setaria viridis), maíz cimarrón (Zea mays subesp. mexicana), mijo cola de zorro (Setaria italica) y lágrima de Job (Coix lacryma-jobi).

Se identificaron las secuencias de la transcripción de ubiquitina 1 de cada una de las especies anteriores. La región no traducida 5’ (5’ UTR) de cada una de las transcripciones de ubiquitina 1 se utilizaron para diseñar cebadores para amplificar los elementos reguladores de la transcripción correspondientes para el gen de ubiquitina identificado, que comprende un promotor, un líder (5’ UTR)y un primer intrón unido operativamente. Los cebadores se utilizaron con bibliotecas GenomeWalker™ (Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA) construidas siguiendo el protocolo del fabricante para clonar la región 5’ de la secuencia de ADN correspondiente. Los elementos reguladores de la transcripción de ubiquitina también se aislaron de las monocotiledónea Sorghum bicolor utilizando las secuencias públicas que son homólogas para los genes de ubiquitina 4, 6, y 7 de Zea mays.

Utilizando las secuencias identificadas se llevó a cabo un análisis informático para identificar los elementos reguladores en el ADN amplificado. Utilizando los resultados de este análisis se definieron los elementos reguladores en las secuencias de ADN y se diseñaron los cebadores para amplificar los elementos reguladores. La molécula de ADN correspondiente de cada elemento regulador se amplificó utilizando las condiciones de reacción en cadena de la polimerasa convencional con cebadores que contenían sitios de enzimas de restricción únicos y el ADN genómico aislado de A. gerardii, S. ravennae, S. viridis, Z mays subesp. mexicana, S. italica, C. lacryma-jobi, y

S. bicolor. Los fragmentos de ADN resultantes se ligaron en vectores de expresión basados en plantas y se secuenciaron. Se hizo entones un análisis del elemento regulador TSS y las uniones de corte y empalme intrón/exón utilizando protoplastos vegetales transformados. En resumen, se transformaron los protoplastos con los vectores de expresión vegetales que comprendían los fragmentos de ADN clonados unidos operativamente a una molécula de polinucleótido que se puede transcribir y se utilizó el sistema 5’ RACE para la Amplificación Rápida de extremos de ADNc, Versión 2.0 (Invitrogen, Carlsbad, California 92008) para confirmar el elemento regulador TSS y las uniones de corte y empalme intrón/exón analizando la secuencia de los ARNm transcritos producidos de esta manera.

Se proporcionan en el presente documento las secuencias de los grupos de elementos reguladores de expresión de la transcripción identificados (“EXP”) como SEQ ID NO: 1, 5, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 22, 25, 27, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 45, 49, 53, 55, 59, 63, 65, 69, 73, 75, 77, 79, 83, 85, 87, 90, 93, 95, 97, 98, 99, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 115, 116, 117, 119, 121, 123, 124, 125, 126, 128, 130, 132, 133, 134, 136, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 180, 181 y 183, que se enumeran en la Tabla 1 posterior. Las secuencias de promotor se proporcionan en el presente documento como SEQ ID NO: 2, 6, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 23, 26, 28, 30, 32, 34, 38, 40, 42, 46, 50, 56, 60, 64, 66, 70, 74, 76, 78, 80, 84, 86, 88, 91, 96 y 135. Las secuencias líderes se proporcionan en el presente documento como SEQ ID NO: 3, 20, 35, 43, 47, 51, 57, 61, 67, 71 y 81. Las secuencias de intrón se proporcionan en el presente documento como SEQ ID NO: 4, 7, 21, 24, 36, 44, 48, 52, 54, 58, 62, 68, 72, 82, 92, 94, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 118, 120, 122, 127, 129, 131, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 y 182. Se proporciona una secuencia de amplificador como SEQ ID NO: 89.

Tabla 1. Grupos de elementos reguladores de la expresión de la transcripción, promotores, amplificadores, líderes e intrones aislados de varias especies herbáceas.

Anotación: SEQ ID NO: Tamaño (pb) Fuente Género/especie Descripción y/o Elementos reguladores de EXP unidos en la dirección in 5’ → 3’ (SEQ ID NO): Construcción de Plásmido y Amplicones que comprenden EXP

EXP-ANDge.Ubq1:1:9: 1 3741 A. gerardii EXP: P-ANDge.Ubq11:1:11 (SEQ ID NO: 2); L-ANDge.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 3); IANDge.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 4).

P-ANDge.Ubq1-1:1:11: 2 2603 A. gerardii promotor

L-ANDge.Ubq1-1:1:2: 3 99 A. gerardii líder

I-ANDge.Ubq1-1:1:3: 4 1039 A. gerardii intrón

EXP-ANDge.Ubq1:1:7: 5 3255 A. gerardii EXP: P-ANDge.Ubq11:1:9 (SEQ ID NO: 6); LANDge.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 3); IANDge.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 7). pMON136264, PCR0145892, pMON140896, PCR41

P-ANDge.Ubq1-1:1:9: 6 2114 A. gerardii promotor

I-ANDge.Ubq1-1:1:4: 7 1042 A. gerardii intrón

EXP-ANDge.Ubq1:1:8: 8 2785 A. gerardii EXP: P-ANDge.Ubq11:1:10 (SEQ ID NO: 9); L-ANDge.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 3); IANDge.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 7). pMON140917, PCR42

P-ANDge.Ubq1-1:1:10: 9 1644 A. gerardii promotor

EXP-ANDge.Ubq1:1:10: 10 2613 A. gerardii EXP: P-ANDge.Ubq11:1:12 (SEQ ID NO: 11); L-ANDge.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 3); IANDge.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 7). PCR0145815, PCR43

P-ANDge.Ubq1-1:1:12: 11 1472 A. gerardii promotor

EXP-ANDge.Ubq1:1:6: 12 2255 A. gerardii EXP: P-ANDge.Ubq11:1:8 (SEQ ID NO: 13); L-ANDge.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 3); IANDge.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 7). pMON136259, PCR0145893, pMON140898, PCR44

P-ANDge.Ubq1-1:1:8: 13 1114 A. gerardii promotor

(continuación)

EXP-ANDge.Ubq1:1:11: 14 1912 A. gerardii EXP: P-ANDge.Ubq11:1:13 (SEQ ID NO: 15); L-ANDge.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 3); IANDge.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 7). PCR0145817, pMON140899, PCR45

P-ANDge.Ubq1-1:1:13: 15 771 A. gerardii promotor

EXP-ANDge.Ubq1:1:12: 16 1623 A. gerardii EXP: P-ANDge.Ubq11:1:14 (SEQ ID NO: 17); L-ANDge.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 3); IANDge.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 7). PCR0145819, pMON 140900, PCR46

P-ANDge.Ubq1-1:1:14: 17 482 A. gerardii promotor

EXP-ERIra.Ubq1: 18 3483 E. ravennae EXP: P-ERIra.Ubq11:1:10 (SEQ ID NO: 19); L-ERIra.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 20); IERIra.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 21).

P-ERIra.Ubq1-1:1:10: 19 2536 E. ravennae promotor

L-ERIra.Ubq1-1:1:2: 20 94 E. ravennae líder

I-ERIra.Ubq1-1:1:1: 21 1041 E. ravennae intrón

EXP-ERIra.Ubq1:1:9: 22 3152 E. ravennae EXP: P-ERIra.Ubq11:1:9 (SEQ ID NO: 23); L-ERIra.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 20); IERIra.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 24). pMON136263, PCR0145896, pMON 140904, PCR50

P-ERIra.Ubq1-1:1:9: 23 2014 E. ravennae promotor

I-ERIra.Ubq1-1:1:2: 24 1044 E. ravennae intrón

EXP-ERIra. Ubq 1:1:10: 25 2663 E. ravennae EXP: P-ERIra.Ubq11:1:11 (SEQ ID NO: 26); L-ERIra.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 20); IERIra.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 24). PCR0145820, pMON 140905, PCR51

P-ERIra.Ubq1-1:1:11: 26 1525 E. ravennae promotor

(continuación)

EXP-ERIra. Ubq 1:1:8 8: 27 2182 E. ravennae EXP: P-ERIra.Ubq11:1:8 (SEQ ID NO: 28); L-ERIra.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 20); IERIra.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 24). pMON136258, PCR0145897, pMON140906, PCR52, pMON142864, pMON 142862

P-ERIra.Ubq1-1:1:8: 28 1044 E. ravennae promotor

EXP-ERIra. Ubq 1:1:11: 29 1934 E. ravennae EXP: P-ERIra.Ubq11:1:12 (SEQ ID NO: 30); L-ERIra.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 20); IERIra.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 24). PCR0145821, pMON140907, PCR53

P-ERIra.Ubq1-1:1:12: 30 796 E. ravennae promotor

EXP-ERIra. Ubq 1:1:12: 31 1649 E. ravennae EXP: P-ERIra.Ubq11:1:13 (SEQ ID NO: 32); L-ERIra.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 20); IERIra.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 24). PCR0145822, pMON 140908, PCR54

P-ERIra.Ubq1-1:1:13: 32 511 E. ravennae promotor

EXP-Sv.Ubq1:1:2: 33 2631 S. viridis EXP: P-Sv.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 34); LSv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 35); I-Sv.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 36). pMON140878, PCR0145909, pMON129203, pMON131958

P-Sv.Ubq1-1:1:1: 34 1493 S. viridis promotor

L-Sv.Ubq1-1:1:2: 35 127 S. viridis líder

I-Sv.Ubq1-1:1:1: 36 1011 S. viridis intrón

EXP-Sv.Ubq1:1:3: 37 2173 S. viridis EXP: P-Sv.Ubq1-1:1:2 (SQ ID NO: 38); LSv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 35); I-Sv.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 36). PCR0145929, pMON129204

P-Sv.Ubq1-1:1:2: 38 1035 S. viridis promotor

(continuación)

EXP-Sv.Ubq1:1:5: 39 1819 S. viridis EXP: P-Sv.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 40); LSv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 35); I-Sv.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 36). pMON129205, pMON131959

P-Sv.Ubq1-1:1:3: 40 681 S. viridis promotor

EXP-Zm.UbqM1:1:1 (Alelo-1): 41 1922 Z. mays subesp. mexicana EXP: P-Zm.UbqM1-1:1:1 (SEQ ID NO: 42); LZm.UbqM1-1:1:1 (SEQ ID NO: 43); IZm.UbqM1-1:1:5 (SEQ ID NO: 44). pMON140881, PCR0145914, pMON129210, pMON131961

P-Zm.UbqM1-1:1:1 (Alelo1): 42 850 Z. mays subesp. mexicana promotor

L-Zm.UbqM1-1:1:1 (Alelo1): 43 78 Z. mays subesp. mexicana líder

I-Zm.UbqM1-1:1:5 (Alelo1): 44 994 Z. mays subesp. mexicana intrón

EXP-Zm.UbqM1:1:4 (Alelo-2): 45 1971 Z. mays subesp. mexicana EXP: P-Zm.UbqM1-1:1:4 (SEQ ID NO: 46); LZm.UbqMl-1:1:5 (SEQ ID NO: 47); I-Zm.UbqM11:1:4 (SEQ ID NO: 48). pMON140882, PCR0145915, pMON129212

pMON131963

P-Zm.UbqM1-1:1:4 (Alelo2): 46 887 Z. mays subesp. mexicana promotor

L-Zm.UbqM1-1:1:5 (Alelo2): 47 77 Z. mays subesp. mexicana líder

I-Zm.UbqM1-1:1:4 (Alelo2): 48 1007 Z. mays subesp. mexicana intrón

EXP-Zm.UbqM1:1:2 (Alelo-3): 49 2005 Z. mays subesp. mexicana EXP: P-Zm.UbqM1-1:1:5 (SEQ ID NO: 50); LZm.UbqM1-1:1:4 (SEQ ID NO: 51); IZm.UbqM1-1:1:11 (SEQ ID NO: 52). PCR0145916, pMON129211, pMON131962, pMON132047

P-Zm.UbqM1-1:1:5 (Alelo3): 50 877 Z. mays subesp. mexicana promotor

(continuación)

L-Zm.UbqM1-1:1:4 (Alelo3): 51 78 Z. mays subesp. mexicana líder

I-Zm.UbqM1-1:1:11 (Alelo-3): 52 1050 Z. mays subesp. mexicana intrón

EXP-Zm.UbqM1:1:5 (Alelo-3): 53 2005 Z. mays subesp. mexicana EXP: P-Zm.UbqM1-1:1:5 (SEQ ID NO: 50); LZm.UbqM1-1:1:4 (SEQ ID NO: 51); IZm.UbqM1-1:1:12 (SEQ ID NO: 54).

I-Zm.UbqM1-1:1:12 (Alelo-3): 54 1050 Z. mays subesp. mexicana intrón

EXP-Sb.Ubq4:1:1: 55 1632 S. bicolor EXP: P-Sb.Ubq4-1:1:1 (SEQ ID NO: 56); LSb.Ubq4-1:1:1 (SEQ ID NO: 57); I-Sb.Ubq4-1:1:1 (SEQ ID NO: 58). pMON140886, PCR0145921, pMON129219, pMON132932

P-Sb.Ubq4-1:1:1: 56 401 S. bicolor promotor

L-Sb.Ubq4-1:1:1: 57 154 S. bicolor líder

I-Sb.Ubq4-1:1:1: 58 1077 S. bicolor intrón

EXP-Sb.Ubq6: 59 2000 S. bicolor EXP: P-Sb.Ubq6-1:1:2 (SEQ ID NO:60); LSb.Ubq6-1:1:1

(SEQ ID NO: 61); ISb.Ubq6-1:1:1 (SEQ ID NO: 62).

P-Sb.Ubq6-1:1:2: 60 791 S. bicolor promotor

L-Sb.Ubq6-1:1:1: 61 136 S. bicolor líder

I-Sb.Ubq6-1:1:1: 62 1073 S. bicolor intrón

EXP-Sb.Ubq6:1:1: 63 2064 S. bicolor EXP: P-Sb.Ubq6-1:1:1 (SEQ ID NO: 64); LSb.Ubq6-1:1:1 (SEQ ID NO: 61); I-Sb.Ubq6-1:1:1 (SEQ ID NO: 62). pMON140887, PCR0145920, pMON129218

P-Sb.Ubq6-1:1:1: 64 855 S. bicolor promotor

(continuación)

EXP-Sb.Ubq7:1:1: 65 2000 S. bicolor EXP: P-Sb.Ubq7-1:1:1 (SEQ ID NO: 66); LSb.Ubq7-1:1:1 (SEQ ID NO: 67); I-Sb.Ubq7-1:1:1 (SEQ ID NO: 68). pMON132974

P-Sb.Ubq7-1:1:1: 66 565 S. bicolor promotor

L-Sb.Ubq7-1:1:1: 67 77 S. bicolor líder

I-Sb.Ubq7-1:1:1: 68 1358 S. bicolor intrón

EXP-SETit.Ubq1:1:1: 69 2622 S. italica EXP: P-SETit.Ubq11:1:1 (SEQ ID NO: 70); L-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 71); ISETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 72). pMON140877, PCR0145900, pMON129200

P-SETit.Ubq1-1:1:1: 70 1492 S. italica promotor

L-SETit.Ubq1-1:1:1: 71 127 S. italica líder

I-SETit.Ubq1-1:1:1: 72 1003 S. italica intrón

EXP-SETit.Ubq1:1:4: 73 2622 S. italica EXP: P-SETit.Ubq11:1:4 (SEQ ID NO: 74); L-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 71); ISETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 72). pMON132037

P-SETit.Ubq1-1:1:4: 74 1492 S. italica promotor

EXP-SETit.Ubq1:1:2: 75 2164 S. italica EXP: P-SETit.Ubq11:1:2 (SEQ ID NO: 76); L-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 71); ISETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID N0:72).

P-SETit.Ubq1-1:1:2: 76 1034 S. italica promotor

EXP-SETit.Ubq1:1:3: 77 1810 S. italica EXP: P-SETit.Ubq11:1:3 (SEQ ID NO: 78); L-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 71); ISETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 72). PCR0145905, pMON129202, pMON131957

P-SETit.Ubq1-1:1:3: 78 680 S. italica promotor

(continuación)

EXP-Cl.Ubq1:1:1: 79 1940 C. lacryma-jobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 80); LC1.Ubq1-1:1:1 NO: 81); I-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 82). pMON140889, PCR0145922, pMON140913, PCR19, pMON129221, pMON146795, pMON146796, pMON146797, pMON146798, pMON146799, pMON132047, pMON146800, pMON146801, pMON146802

P-Cl.Ubq1-1:1:1: 80 837 C. lacryma-jobi promotor

L-Cl.Ubq1-1:1:1: 81 86 C. lacryma-jobi líder

I-Cl.Ubq1-1:1:1: 82 1017 C. lacryma-jobi intrón

EXP-Cl.Ubq1:1:3: 83 1845 C. lacryma-jobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 84); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 81); I-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 82). PCR0145945, pMON140914, PCR20

P-Cl.Ubq1-1:1:4: 84 742 C. lacryma-jobi promotor

EXP-Cl.Ubq1:1:4: 85 1504 C. lacryma-jobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 86); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 81); I-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 82). PCR0145946, pMON140915, PCR21

P-Cl.Ubq1-1:1:3: 86 401 C. lacryma-jobi promotor

EXP-Cl.Ubq1:1:5: 87 1157 C. lacryma-jobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:5 (SEQ ID NO: 88); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 81); I-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 82). PCR0145947, pMON140916, PCR22

P-Cl.Ubq1-1:1:5: 88 54 C. lacryma-jobi promotor

E-Cl.Ubq1-1:1:1: 89 798 C. lacryma-jobi amplificador

EXP-Cl.Ubq1:1:12: 90 3393 C. lacryma-jobi EXP:P-Cl.Ubq1-1:1:9 (SEQ ID NO: 91); LCl.Ubq1-1:1:1 pMON142729

(SEQ ID NO:81); ICl.Ubq1-1:1:7 (SEQ ID NO: 92)

(continuación)

P-Cl.Ubq1-1:1:9: 91 2287 C. lacryma-jobi Promotor

I-Cl.Ubq1-1:1:7: 92 1020 C. lacryma-jobi Intrón

EXP-Cl.Ubq1:1:16: 93 3393 C. lacryma-jobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:9 (SEQ ID NO: 91); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO:81); I-Cl.Ubq1-1:1:6 (SEQ ID NO: 94) pMON146750, pMON142748

I-Cl.Ubq1-1:1:6: 94 1020 C. lacryma-jobi Intrón

EXP-Cl.Ubq1:1:11: 95 2166 C. lacryma-jobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:10 (SEQ ID NO: 96); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO:81); I-Cl.Ubq1-1:1:7 (SEQ ID NO: 92) pMON142730

P-Cl.Ubq1-1:1:10: 96 1060 C. lacryma-jobi Promotor

EXP-Cl.Ubq1:1:17: 97 2166 C. lacryma-jobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:10 (SEQ ID NO: 96); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO:81); I-Cl.Ubq1-1:1:6 (SEQ ID NO: 94) pMON146751, pMON142749

EXP-Cl.Ubq1:1:10: 98 1943 C. lacryma-jobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 80); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO:81); I-Cl.Ubq1-1:1:6 (SEQ ID NO: 94) pMON140889, PCR0145922, pMON140913, PCR19, pMON129221

EXP-Cl.Ubq1:1:18: 99 1943 C. lacryma-jobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 80);LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID N0:81); I-Cl.Ubq1-1:1:7 (SEQ ID NO: 92) pMON146795

EXP-Cl.Ubq1:1:19: 100 1943 C. lacryma-jobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 80); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO:81); I-Cl.Ubq1-1:1:8 (SEQ ID NO: 101) pMON146796

I-Cl.Ubq1-1:1:8: 101 1020 C. lacryma-jobi Intrón

(continuación)

EXP-Cl.Ubq1:1:20: 102 1943 C. lacryma-jobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 80); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO:81); I-Cl.Ubq1-1:1:9 (SEQ ID NO: 103) pMON146797

I-Cl.Ubq1-1:1:9: 103 1020 C. lacryma-jobi Intrón

EXP-Cl.Ubq1:1:21: 104 1943 C. lacryma-jobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 80); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO:81); I-Cl.Ubq1-1:1:10 (SEQ ID NO: 105) pMON146798

I-Cl.Ubq1-1:1:10: 105 1020 C. lacryma-jobi Intrón

EXP-Cl.Ubq1:1:22: 106 1943 C. lacryma-jobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 80); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO:81); I-Cl.Ubq1-1:1:11 (SEQ ID NO: 107) pMON146799

I-Cl.Ubq1-1:1:11: 107 1020 C. lacryma-jobi Intrón

EXP-Cl.Ubq1:1:23: 108 1943 C. lacryma-jobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 80); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO:81); I-Cl.Ubq1-1:1:12 (SEQ ID NO: 109) pMON132047, pMON146800

I-Cl.Ubq1-1:1:12: 109 1020 C. lacryma-jobi Intrón

EXP-Cl.Ubq1:1:24: 110 1943 C. lacryma-jobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 80); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO:81); I-Cl.Ubq1-1:1:13 (SEQ ID NO: 111) pMON146801

I-Cl.Ubq1-1:1:13: 111 1020 C. lacryma-jobi Intrón

EXP-Cl.Ubq1:1:25: 112 1943 C. lacryma-jobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 80); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO:81); I-Cl.Ubq1-1:1:14 (SEQ ID NO: 113) pMON146802

I-Cl.Ubq1-1:1:14: 113 1020 C. lacryma-jobi Intrón

(continuación)

EXP-Cl.Ubq1:1:13: 114 1848 C. lacryma-jobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 84); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO:81); I-Cl.Ubq1-1:1:6 (SEQ ID NO: 94) PCR0145945, pMON140914, PCR20

EXP-Cl.Ubq1:1:14: 115 1507 C. lacryma-jobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 86); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO:81); I-Cl.Ubq1-1:1:6 (SEQ ID NO: 94) PCR0145946, pMON140915, PCR21

EXP-Cl.Ubq1:1:15: 116 1160 C. lacryma-jobi EXP: P-Cl.Ubq1-1:1:5 (SEQ ID NO: 88); LCl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO:81); I-Cl.Ubq1-1:1:6 (SEQ ID NO: 94) PCR0145947, pMON140916, PCR22

EXP-SETit.Ubq1:1:5: 117 2625 S. italica EXP: P-SETit.Ubq11:1:1 (SEQ ID NO: 70); L-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 71); ISETit.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 118) pMON140877, PCR0145900, pMON129200

I-SETit.Ubq1-1:1:2: 118 1006 S. italica Intrón

EXP: P-SETit.Ubq1

1:1:4 (SEQ ID NO: 64);

EXP-SETit.Ubq1:1:10: 119 2625 S. italica L-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 71);I pMON132037

SETit.Ubq1-1:1:3 (SEQ

ID NO: 120)

I-SETit.Ubq1-1:1:3: 120 1006 S. italica Intrón

EXP: P-SETit.Ubq1

1:1:4 (SEQ ID NO: 64);

EXP-SETit.Ubq1:1:12: 121 2625 S. italica L-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 71); I

SETit.Ubq1-1:1:4 (SEQ

ID NO: 122)

I-SETit.Ubq1-1:1:4: 122 1006 S. italica Intrón

(continuación)

EXP-SETit.Ubq1:1:7: 123 2167 S. italica EXP: P-SETit.Ubq11:1:2 (SEQ ID NO: 71); L-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 71); ISETit.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: PCR0145928, pMON129201

118)

EXP: P-SETit.Ubq1

1:1:3 (SEQ ID NO: 73);

EXP-SETit.Ubq1:1:6: 124 1813 S. italica L-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 71); I- PCR0145905. pMON129202

SETit.Ubq1-1:1:2 (SEQ

ID NO: 118)

EXP: P-SETit.Ubq1

1:1:3 (SEQ ID NO: 73);

EXP-SETit.Ubq1:1:11: 125 1813 S. italica L-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 71); I pMON131957

SETit.Ubql-1:1:3 (SEQ

ID NO: 120)

EXP: P-SETit.Ubq1

1:1:3 (SEQ ID NO: 73);

EXP-SETit.Ubq1:1:13: 126 1813 S. italica L-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 71); I

SETit.Ubq1-1:1:5 (SEQ

ID NO: 127)

I-SETit.Ubq1-1:1:5: 127 1006 S. italica Intrón

EXP: P-Sv.Ubql-1:1:1

(SEQ ID NO: 34); L: pMON140878,

EXP-Sv.Ubq1:1:7: 128 2634 S. viridis Sv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID PCR0145909,

NO: 35); I-Sv.Ubq1-1:1:2: pMON129203

(SEQ ID NO: 129)

I-Sv.Ubq1-1:1:2: 129 1014 S. viridis Intrón

EXP: P-Sv.Ubq1-1:1:1

(SEQ ID NO: 34); L

EXP-Sv.Ubql:1:11: 130 2634 S. viridis Sv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID pMON131958

NO: 35); I-Sv.Ubq1-1:1:3

(SEQ ID NO: 131)

I-Sv.Ubq1-1:1:3: 131 1014 S. viridis Intrón

(continuación)

EXP-Sv.Ubq1:1:8: 132 2176 S. viridis EXP: P-Sv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 38); LSv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 35); I-Sv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 129) PCR0145929, pMON129204

EXP: P-Sv.Ubql-1:1:3

(SEQ ID NO: 40); L

EXP-Sv.Ubq1:1:9: 133 1822 S. viridis Sv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID pMON129205

NO: 35); I-Sv.Ubq1-1:1:2

(SEQ ID NO: 129)

EXP: P-Sv.Ubq1-1:1:4

(SEQ ID NO: 135); L

EXP-Sv.Ubql:1:10: 134 1822 S. viridis Sv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID PCR0145911

NO: 35); I-Sv.Ubq1-1:1:2

(SEQ ID NO: 129)

P-Sv.Ubq1-1:1:4: 135 681 S. viridis Promotor

EXP: P-Sv.Ubq1-1:1:3

(SEQ ID NO: 40); L

EXP-Sv.Ubq1:1:12: 136 1822 S. viridis Sv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID pMON131959

NO: 35); I-Sv.Ubq1-1:1:3

(SEQ ID NO: 131)

EXP-Zm.UbqM1:1:6 (Alelo-1): 137 1925 Z. mays subesp. Mexicana EXP: P-Zm.UbqM1-1:1:1 (SEQ ID NO: 42); LZm.UbqM1-1:1:1 (SEQ ID NO: 43); IZm.UbqM1-1:1:13 (SEQ ID NO: 138) pMON140881, PCR0145914, pMON129210

I-Zm.UbqM1-1:1:13 (Alelo-1): 138 997 Z. mays subesp. Mexicana Intrón

EXP: P-Zm.UbqM1-1:1:1

(SEQ ID NO: 42); L

EXP-Zm.UbqM1:1:10 (Alelo-1): 139 1925 Z. mays subesp. Mexicana Zm.UbqM1-1:1:1 (SEQ ID NO: 43); I pMON131961

Zm.UbqM1-1:1:17 (SEQ

ID NO: 140)

I-Zm.UbqM1-1:1:17 (Alelo-1): 140 997 Z. mays subesp. Mexicana Intrón

(continuación)

EXP-Zm.UbqM1:1:7 (Alelo-2): 141 1974 Z. mays subesp. Mexicana EXP: P-Zm.UbqM1-1:1:4 (SEQ ID NO: 46); LZm.UbqM1-1:1:5 (SEQ ID NO: 47); IZm.UbqM1-1:1:14 (SEQ ID NO: 142) pMON140882, PCR0145915, pMON129212

I-Zm.UbqM1-1:1:14 (Alelo-2): 142 1010 Z. mays subesp. Mexicana Intrón

EXP: P-Zm.UbqM1-1:1:4

(SEQ ID NO: 46); L

EXP-Zm.UbqM1:1:12 (Alelo-2): 143 1974 Z. mays subesp. Mexicana Zm.UbqM1-1:1:5 (SEQ ID NO: 47); I pMON131963

Zm.UbqM1-1:1:19 (SEQ

ID NO: 144)

I-Zm.UbqM1-1:1:19 (Alelo-2): 144 1010 Z. mays subesp. Mexicana Intrón

EXP: P-Zm.UbqM1-1:1:5

(SEQ ID NO: 50); L

EXP-Zm.UbqM1:1:8 (Alelo-3): 145 2008 Z. mays subesp. Mexicana Zm.UbqM1-1:1:4 (SEQ ID NO: 51); I- PCR0145916, pMON129211

Zm.UbqM1-1:1:15 (SEQ

ID NO: 146)

I-Zm.UbqM1-1:1:15 (Alelo-3): 146 1053 Z. mays subesp. Mexicana Intrón

EXP: P-Zm.UbqM1-1:1:5

(SEQ ID NO: 50); L

EXP-Zm.UbqM1:1:9 (Alelo-3): 147 2008 Z. mays subesp. Mexicana Zm.UbqM1-1:1:4 (SEQ ID NO: 51); I

Zm.UbqM1-1:1:16 (SEQ

ID NO: 148)

I-Zm.UbqM1-1:1:16 (Alelo-3): 148 1053 Z. mays subesp. Mexicana Intrón

EXP: P-Zm.UbqM1-1:1:5

(SEQ ID NO: 50); L

EXP-Zm.UbqM1:1:11 (Alelo-3): 149 2008 Z. mays subesp. Mexicana Zm.UbqM1-1:1:4 (SEQ ID NO: 51); I pMON131962, pMON132047

Zm.UbqM1-1:1:18 (SEQ

ID NO: 150)

I-Zm.UbqM1-1:1:18 (Alelo-3): 150 1053 Z. mays subesp. Mexicana Intrón

(continuación)

EXP-Sb.Ubq4:1:2: 151 1635 S. bicolor EXP: P-Sb.Ubq4-1:1:1 (SEQ ID NO: 56); LSb.Ubq4-1:1:1 (SEQ ID NO: 57); I-Sb.Ubq4-1:1:2 (SEQ ID NO: 152) pMON140886, PCR0145921,

pMON129219, pMON132932

I-Sb.Ubq4-1:1:2: 152 1080 S. bicolor Intrón

EXP-Sb.Ubq6:1:2: 153 2067 S. bicolor EXP: P-Sb.Ubq6-1:1:1 (SEQ ID NO: 64); LSb.Ubq6-1:1:1 (SEQ ID NO: 57); I-Sb.Ubq6-1:1:2 (SEQ ID NO: 154) pMON140887, PCR0145920, pMON129218, pMON132931

I-Sb.Ubq6-1:1:2: 154 1076 S. bicolor Intrón

EXP-Sb.Ubq6:1:3: 155 2067 S. bicolor EXP: P-Sb.Ubq6-1:1:1 (SEQ ID NO: 64); LSb.Ubq6-1:1:1 (SEQ ID NO: 57); I-Sb.Ubq6-1:1:3 (SEQ ID NO: 1569) pMON132931

I-Sb.Ubq6-1:1:3: 156 1076 S. bicolor Intrón

EXP-Sb.Ubq7:1:2: 157 2003 S. bicolor EXP: P-Sb.Ubq7-1:1:1 (SEQ ID NO: 66); LSb.Ubq7-1:1:1 (SEQ ID NO: 67); I-Sb.Ubq7-1:1:A (SEQ ID NO: 158) pMON132974

I-Sb.Ubq7-1:1:2: 158 1361 S. bicolor Intrón

EXP-SETit.Ubq1:1:E: 180 2625 S. italica EXP: P-SETit.Ubq11:1:4 (SEQ ID NO: 64); L-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 71); ISETit.Ubq1-1:1:5 (SEQ ID NO: 127)

EXP-Zm.UbqM1:1:13 (Alelo-3): 181 2008 Z. mays subesp. Mexicana EXP: P-Zm.UbqM1-1:1:5 (SEQ ID NO: 50); LZm.UbqM1-1:1:4 (SEQ ID NO: 51); IZm.UbqM1-1:1:20 (SEQ ID NO: 182)

(continuación)

I-Zm.UbqM1-1:1:20 (Alelo-3): 182 1053 Z. mays subesp. Mexicana Intrón

EXP-SETit.Ubq1:1:9: 183 2625 S. italica EXP: P-SETit.Ubq11:1:4 (SEQ ID NO: 64); L-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 71); ISETit.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 118)

Como se muestra en la Tabla 1, por ejemplo, la secuencia EXP reguladora de la transcripción que se designa EXPAND-ge.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 1), con componentes aislados de A. gerardii, comprende un elemento promotor, PAND-ge.Ubq1-1:1:11 (SEQ ID NO: 2), unido operativamente 5’ a un elemento líder, L-ANDge.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID

5 NO: 3), unido operativamente 5’ a un elemento de intrón, I-ANDge.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 4). Otros EXP se unen similarmente, como se define en la Tabla 1.

Como se muestra en la Tabla 1, el listado de secuencias y las FIG. 1-7, se modificaron variantes de secuencias promotoras de las especies A. gerardii, E. ravennae, Z. mays subesp. Mexicana, S. bicolor, C. lacryma-jobi, S. italica, y S. viridis que comprenden fragmentos de promotor más cortos de, por ejemplo, P-ANDge.Ubql-1:1:11 (SEQ 10 ID NO:2), P-ERIra.Ubq1-1:1:10 (SEQ ID NO:19) u otros promotores respectivos de otras especies, y por ejemplo dan como resultado P-ANDge.Ubq1-1:1:9 (SEQ ID NO: 6), P-ERIra.Ubq1-1:1:9 (SEQ ID NO: 23), P-Cl.Ubq1-1:1:10 (SEQ ID NO: 96), P-SETit.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 76) y P-Sv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 38), así como otros fragmentos de promotor. P-SETit.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 74) comprende un cambio de un único nucleótido respecto a P-Sv.Ubq1

1:1:4 (SEQ ID NO: 135).

15 En algunos casos, las variantes de intrones específicos se crearon alterando los últimos 3 nucleótidos de cada intrón respectivo siguiente a la secuencia 5’-AG-3’ de la unión de corte y empalme del intrón 3’. Estas variantes de intrón se muestran en la Tabla 2 a continuación.

Tabla 2. Secuencia 3’ de variantes de intrón

Anotación: SEQ ID NO: Nucleótidos del extremo 3’ del intrón inmediatamente a continuación del sitio 3’ de corte y empalme AG

I-Cl.Ubq1-1:1:7: 92 GTG

I-Cl.Ubq1-1:1:6: 94 GTC

I-Cl.Ubq1-1:1:8: 101 GCG

I-Cl.Ubq1-1:1:9: 103 GAC

I-Cl.Ubq1-1:1:10: 105 ACC

I-Cl.Ubq1-1:1:11: 107 GGG

I-Cl.Ubq1-1:1:12: 109 GGT

I-Cl.Ubq1-1:1:13: 111 CGT

I-Cl.Ubq1-1:1:14: 113 TGT

I-SETit.Ubq1-1:1:2: 118 GTG

I-SETit.Ubq1-1:1:3: 120 GGT

I-SETit.Ubq1-1:1:4: 122 ACC

I-SETit.Ubq1-1:1:5: 127 GGC

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Las construcciones de plásmidos enumeradas como matrices de amplicón en la Tabla 7 servían como matrices para la amplificación de los casetes de expresión transgénica que comprenden las secuencias EXP enumeradas en la Tabla 7. Los plásmidos de control utilizados para generar amplicones transgénicos GUS para la comparación se construyeron como se ha descrito anteriormente con secuencias EXP constitutivas conocidas descritas en el

5 Ejemplo 2. También se utilizaron controles negativos para la determinación del fondo de GUS y luciferasa, un control no ADN, y una muestra de control en la que se utilizaron los dos plásmidos de luciferasa se utilizaron en la transformación junto con un plásmido ADN que no expresa una secuencia codificante. Los plásmidos pMON19437 y pMON63934, que se exponen en el Ejemplo 2, también se emplearon para la co-transformación y normalización de los datos.

10 Los cloroplastos foliares de maíz se transformaron utilizando un procedimiento de transformación basado en PEG como se ha descrito en el Ejemplo 2, anteriormente. La Tabla 8 posterior muestra los valores medios de expresión de GUS y luciferasa determinados para cada casete transgénico.

Tabla 8. Actividad media de GUS y Luciferasa en células de protoplasto foliar de maíz transformadas

Secuencia EXP: SEQ ID NO: GUS RLuc FLuc

EXP-Os.Act1:1:9: 179 1540,3 105416,8 2671,8

P-CAMV.35S-ENH-1:1:102/L-CAMV.35S-1:1:2: 169 10426,3 344088,6 8604,1

EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1: 163 12530,8 137722,6 3067,1

EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1: 170 61036,1 208125,3 5787,6

EXP-ANDge.Ubq1:1:7: 5 59447,4 84667,6 2578,4

EXP-ANDge.Ubq1:1:10: 10 40123,3 76753,8 2419,8

EXP-ANDge.Ubq1:1:6: 12 42621,0 121751,3 3974,8

EXP-ANDge.Ubq 1:1:11: 14 44358,5 87105,8 2687,1

EXP-ANDge.Ubq1:1:12: 16 48219,0 107762,1 3279,6

EXP-ERIra.Ubq1:1:9: 22 31253,0 171684,1 6476,1

EXP-ERIra.Ubq1:1:10: 25 7905,8 21235,6 462,4

EXP-ERIra.Ubq1:1:8: 27 39935,8 173766,6 5320,3

EXP-ERha.Ubq1:1:11: 29 34141,3 111626,8 3377,6

EXP-ERIra.Ubq1:1:12: 31 11540,3 42362,1 1045,3

EXP-SETit.Ubq1:1:5: 117 20496,5 88695,8 2358,8

EXP-SETit.Ubq1:1:7: 123 75728,5 185223,8 4723,1

EXP-SETit.Ubq1:1:6: 124 44148,3 161216,3 4962,1

EXP-Sv.Ubq1:1:7: 128 15043,8 74670,6 1888,3

EXP-Sv.Ubq1:1:8: 132 31997,8 113787,1 3219,8

EXP-Sv.Ubq1:1:10: 134 38952,8 220208,6 7011,3

EXP-Zm.UbqM1:1:6: 137 30528,3 90113,1 2453,6

EXP-Zm.UbqM1:1:7: 141 34986,3 105724,7 2553,8

EXP-Sb.Ubq4:1:2: 151 9982,3 72593,8 2171,6

EXP-Sb.Ubq6:1:2: 153 33689,0 114709,6 3879,6

EXP-C1.Ubq1:1:10: 98 50622,3 107084,3 2621,3

Para comparar la actividad relativa de cada secuencia EXP los valores GUS se expresaron como una relación de

15 actividad de GUS respecto a luciferasa y se normalizó con respecto a los niveles observados para EXP-Os.Act1:1:1 y EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1. La Tabla 9 posterior muestra las relaciones GUS/RLuc normalizadas con respecto a la expresión dirigida por EXP-Os.Act1:1:1 y EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 en protoplastos de maíz. La Tabla 10 posterior muestra las relaciones GUS/FLuc de expresión normalidades con respecto a la expresión dirigida por EXP-Os.Act1:1:1 y EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 en protoplastos

20 de maíz.

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Tabla 10. Relaciones GUS/RLuc y GUS/FLuc de expresión normalizada respecto a EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) en protoplastos foliares de maíz

Secuencia EXP: SEQ ID NO: GUS/RLuc respecto aEXP-Os.Act1:1:9 GUS/FLuc respecto aEXP-Os.Act1:1:9

EXP-Os.Act1:1:9: 179 1,00 1,00

P-CAMV.35S-ENH-1:1:102/L-CAMV.35S-1:1:2: 169 2,07 2,10

EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1: 163 6,23 7,09

EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1: 170 20,07 18,29

EXP-ANDge.Ubq1:1:7: 5 48,05 39,99

EXP-ANDge.Ubq1:1:10: 10 35,78 28,76

EXP-ANDge.Ubq1:1:6: 12 23,96 18,60

EXP-ANDge.Ubq1:1:11: 14 34,85 28,64

EXP-ANDge.Ubq1:1:12: 16 30,62 25,50

EXP-ERIra.Ubq1:1:9: 22 12,46 8,37

EXP-ERIra.Ubq1:1:10: 25 25,48 29,66

EXP-ERIra.Ubq1:1:8: 27 15,73 13,02

EXP-ERha.Ubq1:1:11: 29 20,93 17,53

EXP-ERha.Ubq1:1:12: 31 18,64 19,15

EXP-SETit.Ubq1:1:5: 117 15,82 15,07

EXP-SETit.Ubq1:1:7: 123 27,98 27,81

EXP-SETit.Ubq1:1:6: 124 18,74 15,43

EXP-Sv.Ubq1:1:7: 128 13,79 13,82

EXP-Sv.Ubq1:1:8: 132 19,25 17,24

EXP-Sv.Ubq1:1:10: 134 12,11 9,64

EXP-Zm.UbqM1:1:6: 137 23,19 21,58

EXP-Zm.UbqM1:1:7: 141 22,65 23,76

EXP-Sb.Ubq4:1:2: 151 9,41 7,97

EXP-Sb.Ubq6:1:2: 153 20,10 15,06

EXP-Cl.Ubq1:1:10: 98 32,35 33,50

Como se puede apreciar en las Tablas 9 y 10, casi todas las secuencias EXP eran capaces de dirigir la expresión

5 del transgén GUS en células de maíz. La expresión media de GUS era mayor para EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-AND-ge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXPERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-SETit.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 117), EXP-SETit.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO:

10 123), EXP-SETit.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 124), EXP-Sv.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 128), EXP-Sv.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 132), EXP-Sv.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 134), EXP-Zm.UbqM1:1:6 (SEQ ID NO: 137), EXP-Zm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141), EXP-Sb.Ubq4:1:2 (SEQ ID NO: 151), EXP-Sb.Ubq6:1:2 (SEQ ID NO: 153) y EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98) cuando se comparaba con la expresión de GUS dirigida por EXP-Os.Act1:1:1 o EXP-CaMV.35Senh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1.

15 En un segundo grupo de experimentos, se comparó un casete de amplicón GUS que comprende la secuencia EXP, EXP-Zm.UbqM1:1:8 (SEQ ID NO: 145), con los amplicones de control PCR0145942 (EXP-Os.Act1:1:9, SEQ ID NO: 179) y PCR0145944 (EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1, SEQ ID NO: 170) con respecto a la expresión de GUS. La expresión de GUS dirigida por la secuencia EXP, EXP-Zm.UbqM1:1:8, era mayor que la de los controles. La tabla 11 posteriormente muestra los valores medios de GUS y Luciferasa determinados para cada amplicón. La Tabla 12

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Como se puede apreciar en la Tabla 18 anterior, las secuencias EXP, EXP-Zm.UbqM1:1:11 (SEQ ID NO: 149) y EXP-Cl.Ubq1:1:23 (SEQ ID NO: 108) eran capaces de dirigir la expresión de GUS en los protoplastos foliares de maíz. La expresión era similar a las del control, EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) y menor que la de EXPCaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 163).

5 La eficacia de los elementos reguladores que dirigen la expresión de GUS a partir de amplicones pueden ser estudiados de manera similar en protoplastos foliares de caña de azúcar. Por ejemplo, los protoplastos de caña de azúcar se pueden transformar con amplicones ADN derivados de vectores de expresión en plantas que contienen una secuencia EXP, que dirigen la expresión del transgén de β-glucuronidasa (GUS), y compararla con protoplastos foliares en los que la expresión de GUS se dirige por promotores constitutivos conocidos. Al igual, los elementos

10 reguladores que dirigen la expresión de CP4 a partir de amplicones en protoplastos de maíz o de trigo se pueden estudiar de manera similar.

Ejemplo 4. Análisis de elementos reguladores que dirigen GUS en protoplastos de trigo utilizando casetes transgénicos de amplicones GUS

Los protoplastos foliares de trigo se transformaron con amplicones ADN derivados de vectores de expresión en

15 plantas que contenían una secuencia EXP, que dirige la expresión del transgén de β-glucuronidasa (GUS), y se comparó con el protoplasto foliar en el que la expresión GUS dirigida por promotores constitutivos conocidos.

Las células de los protoplastos del trigo derivados del tejido foliar se transformaron utilizando procedimientos conocidos en la técnica con amplicones producidos a partir de la amplificación de casetes transgénicos GUS que comprenden vectores de expresión en plantas para comparar la expresión transgénica (GUS) dirigida por las 20 secuencias enumeradas en las Tablas 10-11 con la de promotores constitutivos conocidos con la metodología que se ha descrito en un ejemplo anterior (Ejemplo 3), utilizando los mismos amplicones del casete GUS que se utilizaron para el ensayo en el maíz del Ejemplo 3 anterior. Al igual, se utilizaron los controles negativos para la determinación de la GUS y luciferasa de fondo, como se ha descrito anteriormente. Los protoplastos foliares de trigo se transformaron utilizando el procedimiento de transformación basado en PEG, como se ha descrito en el Ejemplo

25 3 anterior. La Tabla 19 enumera la actividad media de GUS y LUC que se apreciaba en células transformadas de protoplastos foliares de trigo, y la Tabla 20 muestra las relaciones de expresión GUS/RLuc normalizadas en protoplastos de trigo.

Tabla 19. Actividad media de GUS y luciferasa en células transformadas de protoplastos foliares de trigo

Secuencia EXP: SEQ ID NO: GUS RLuc GUS/RLuc

EXP-Os.Act1:1:9: 179 2976,33 53334,8 0,0558047

P-CAMV.35S-ENH-1:1:102/L-CAMV.35S-1:1:2: 169 1431,33 55996,1 0,0255612

EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1: 163 29299,3 50717,4 0,5776973

EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1: 170 34294,3 63307,9 0,5417066

EXP-ANDge.Ubq1:1:7: 5 68444,3 60329,1 1,1345158

EXP-ANDge.Ubq1:1:10: 10 60606,3 60659,4 0,9991245

EXP-ANDge.Ubq1:1:6: 12 33386,3 56712,1 0,5886984

EXP-ANDge.Ubq1:1:11: 14 43237,3 48263,4 0,8958609

EXP-ANDge.Ubq1:1:12: 16 51712,7 64702,8 0,7992341

EXP-ERIra.Ubq1:1:9: 22 20998,3 60273,4 0,3483845

EXP-ERIra.Ubq1:1:10: 25 17268,3 25465,4 0,6781084

EXP-ERIra.Ubq1:1:8: 27 34635,7 59467,1 0,5824341

EXP-ERIra.Ubq1:1:11: 29 28979 56153,8 0,516065

EXP-ERIra.Ubq1:1:12: 31 41409,7 55152,4 0,7508221

EXP-SETit.Ubq1:1:5: 117 39427,7 57463,1 0,6861388

EXP-SETit.Ubq1:1:7: 123 108091 49330,4 2,191169

EXP-SETit.Ubq1:1:6: 124 58703 46110,1 1,2731047

EXP-Sv.Ubq1:1:7: 128 29330 43367,1 0,676319

EXP-Sv.Ubq1:1:8: 132 53359 40076,4 1,3314306

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Como se puede ver en la Tabla 26 anterior, las secuencias EXP, EXP-Zm.UbqM1:1:11 (SEQ ID NO: 149) y EXPCl.Ubq1:1:23 (SEQ ID NO: 108) eran capaces de dirigir la expresión de GUS en protoplastos foliares de trigo. La expresión era similar a las del control, EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) y menor que la de EXP-CaMV.35Senh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 163).

5 Ejemplo 5: Análisis de elementos reguladores que dirigen la GUS en protoplastos de caña de azúcar utilizando casetes transgénicos de amplicones GUS

Los protoplastos foliares de caña de azúcar se transformaron con amplicones ADN derivados de vectores de expresión en plantas que contienen una secuencia EXP, que dirige la expresión del transgén de la β-glucuronidasa (GUS), y se compararon con los protoplastos foliares en los que la expresión de GUS estaba dirigida por promotores

10 constitutivos conocidos.

Las células de protoplasto de caña de azúcar derivadas de tejidos foliares se transformaron utilizando un procedimiento de transformación basado en PEG, como se describe en el Ejemplo 3 anterior con amplicones producidos a partir de la amplificación de casetes transgénicos GUS que comprenden vectores de expresión en plantas para comparar la expresión de un transgén (GUS) dirigida por uno de EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 15 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXPERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXPCl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) y EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116) y presentada en la Tabla 27 posterior, con la

20 de promotores constitutivos conocidos.

Tabla 27. Amplicones de expresión de GUS en plantas y el correspondiente plásmido de matriz de amplicón y secuencia EXP

Amplicón ID: Matriz de Amplicón Secuencia EXP SEQ ID NO:

PCR0145942: pMON25455 EXP-Os.Act1:1:9 179

PCR0145944: pMON81552 EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 170

PCR0145892: pMON136264 EXP-ANDge.Ubq1:1:7 5

PCR0145815: pMON136264 EXP-ANDge.Ubq1:1:10 10

PCR0145893: pMON136259 EXP-ANDge.Ubq1:1:6 12

PCR0145817: pMON136264 EXP-ANDge.Ubq1:1:11 14

PCR0145819: pMON136264 EXP-ANDge.Ubq1:1:12 16

PCR0145896: pMON136263 EXP-ERIra.Ubq1:1:9 22

PCR0145820: pMON136263 EXP-ERIra.Ubq1:1:10 25

PCR0145897: pMON136258 EXP-ERIra.Ubq1:1:8 27

PCR0145821: pMON136263 EXP-ERIra.Ubq1:1:11 29

PCR0145822: pMON136263 EXP-ERIra.Ubq1:1:12 31

PCR0145922: pMON140889 EXP-Cl.Ubq1:1:10 98

PCR0145945: pMON140889 EXP-Cl.Ubq1:1:13 114

PCR0145946: pMON140889 EXP-Cl.Ubq1:1:14 115

PCR0145947: pMON140889 EXP-Cl.Ubq1:1:15 116

Los amplicones del casete GUS y plásmidos de luciferasa de control utilizados para la transformación de

25 protoplastos de caña de azúcar eran los mismos que los que se presentan en los Ejemplos 2 a 4 y se proporcionan en la Tabla 7 anterior en el Ejemplo 3. Al igual, se utilizaron controles negativos para la determinación de GUS y luciferasa de fondo, como se ha descrito anteriormente. La Tabla 28 enumera la actividad media de GUS y Luc vista en las células transformadas de protoplastos foliares de caña de azúcar, y la Tabla 29 muestra las relaciones de expresión GUS/RLuc en protoplastos foliares de caña de azúcar.

30

Tabla 28. Actividad media de GUS y luciferasa en células transformadas de protoplastos foliares de trigo

Secuencia EXP: SEQ ID NO: GUS RLuc FLuc

EXP-Os.Act1:1:9: 179 6667,5 3024,5 1129,25

EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1: 170 14872,8 5171 2019,5

EXP-ANDge.Ubq1:1:7: 5 15225 4618,25 1775,75

EXP-ANDge.Ubq1:1:10: 10 17275,3 4333 1678

EXP-ANDge.Ubq1:1:6: 12 17236 5633,25 2240

EXP-ANDge.Ubq1:1:11: 14 22487,8 6898,25 2878

EXP-ANDge.Ubq1:1:12: 16 22145,3 6240,25 2676,5

EXP-ERIra.Ubq1:1:9: 22 16796,5 7759,75 3179

EXP-ERIra.Ubq1:1:10: 25 16267,5 5632,75 2436,75

EXP-ERIra.Ubq1:1:8: 27 25351 9019,5 4313,5

EXP-ERIra.Ubq1:1:11: 29 16652,3 3672,25 1534

EXP-ERIra.Ubq1:1:12: 31 12654,5 3256,75 1261,5

EXP-Cl.Ubq1:1:10: 98 22383,8 7097,5 3109,25

EXP-Cl.Ubq1:1:13: 114 14532,3 2786,5 1198,25

EXP-Cl.Ubq1:1:14: 115 19244,5 3455,25 1475

EXP-Cl.Ubq1:1:15: 116 6676,5 3870,25 1497,75

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5

10

15

20

25

30

35

Como se puede apreciar en la Tabla 29 anterior, las secuencias EXP, EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXPAND-ge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) y EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116) eran capaces todas de dirigir la expresión transgénica en los protoplastos de caña de azúcar. Las secuencias EXP, EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXPANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-AND-ge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114) y EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) expresaban más GUS que EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170) en este experimento.

Ejemplo 6: Análisis de elementos reguladores que dirigen CP4 en protoplastos de maíz

Este ejemplo ilustra la capacidad de EXP-Sv.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 128), EXP-Sv.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 132), EXP-Sv.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 133), EXP-Zm.UbqM1:1:6 (SEQ ID NO: 137), EXP-Zm.UbqM1:1:8 (SEQ ID NO: 145), EXP-Zm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141), EXP-SETit.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 117), EXP-SETit.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 123), EXP-SETit.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 124), EXP-Sb.Ubq4:1:2 (SEQ ID NO: 151) y EXP-Sb.Ubq6:1:2 (SEQ ID NO: 153) para dirigir la expresión del gen de tolerancia a glifosato CP4 en protoplastos de maíz. Estas secuencias EXP se clonaron en construcciones plásmidos de transformación binarios de plantas utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Los vectores de expresión en plantas resultantes contenían una región limítrofe derecha de

A. tumefaciens, una secuencia EXP de ubiquitina unida operativamente 5’ a la 3’ UTR T-AGRtu.nos-1:1:13 y una región limítrofe izquierda de A. tumefaciens (B-AGRtu.left border). Las construcciones de plásmido resultantes para transformar las células de protoplastos foliares utilizando procedimientos conocidos en la técnica.

Se utilizaron las construcciones de plásmido enumeradas en la Tabla 30, con las secuencias EXP que se definen en la Tabla 1. Se construyeron tres plásmidos de control (pMON30098, pMON42410, y pMON30167), con elementos reguladores constitutivos conocidos que dirigen o CP4 o GFP, y se utilizaron para comparar los niveles de expresión relativos de CP4 por estas secuencias EXP con la expresión de CP4 dirigida por elementos de expresión constitutivos conocidos. Se utilizaron también dos plásmidos distintos (pMON19437 y pMON63934) como se ha descrito anteriormente para evaluar la eficacia y viabilidad de la transformación. Cada plásmido contiene una secuencia codificante específica de luciferasa dirigid por una secuencia EXP constitutiva.

Los protoplastos foliares de maíz se transformaron utilizando un procedimiento basado en PEG, como se describen en el Ejemplo 2 anterior. Las mediciones de CP4 y luciferasa se llevaron a cabo de manera similar al Ejemplo 2 anterior. Los niveles medios de la expresión de proteína CP4 se expresó como parte por millón (ppm) como se muestra en la Tabla 30, posteriormente.

Tabla 30. Expresión media de proteína CP4 en protoplastos foliares de maíz

Plásmido: Secuencia EXP SEQ ID NO: Media de CP4 ppm CP4 DESV. EST. ppm

No ADN
No ADN: 0 0

pMON30098: GFP 0 0

pMON42410: EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 163 34,1 15,6

pMON30167: EXP-Os.Act1:1:1 164 40,4 11,6

pMON129203: EXP-Sv.Ubq1:1:7 128 45,2 6,2

pMON129204: +EXP-Sv.Ubq1:1:8 132 101,9 13,8

pMON129205: EXP-Sv.Ubq1:1:9 133 71,1 8,7

pMON129210: EXP-Zm.UbqM1:1:6 137 137,1 14,8

pMON129211: EXP-Zm.UbqM1:1:8 145 136,5 12,3

pMON129212: EXP-Zm.UbqM1:1:7 141 170,2 18,1

pMON129200: EXP-SETit.Ubq1:1:5 117 44,3 9,5

pMON129201: EXP-SETit.Ubq1:1:7 123 105,1 8,4

pMON129202: EXP-SETit.Ubq1:1:6 124 124,9 33,7

pMON129219: EXP-Sb.Ubq4:1:2 151 14,3 1

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Tabla 31. Expresión media de proteína CP4 en protoplastos foliares de maíz

Matriz de Amplicón: Amplicón ID Secuencia EXP SEQ ID NO: Media de proteínaCP4 total ng/mg DESV. EST. de proteína CP4total ng/mg

no ADN: 0,0 0,0

pMON30098: GFP (control negativo) 0,0 0,0

pMON19469: PCR24 EXP-CaMV.35Senh+Zm.DnaK:1:1 170 605,5 27,6

pMON30167: PCR25 EXP-Os.Act1:1:1 164 50,6 14,2

pMON140896: PCR41 EXP-ANDge.Ubq1:1:7 5 459,0 60,9

pMON140917: PCR42 EXP-ANDge.Ubq1:1:8 8 258,2 38,4

pMON140897: PCR43 EXP-ANDge.Ubq1:1:10 10 324,8 21,6

pMON140898: PCR44 EXP-ANDge.Ubq1:1:6 12 394,9 66,4

pMON140899: PCR45 EXP-ANDge.Ubq1:1:11 14 508,7 89,6

pMON140900: PCR46 EXP-ANDge.Ubq1:1:12 16 329,3 14,5

pMON140904: PCR50 EXP-ERIra.Ubq1:1:9 22 148,6 24,4

pMON140905: PCR51 EXP-ERIra.Ubq1:1:10 25 215,8 22,6

pMON140906: PCR52 EXP-ERIra.Ubq1:1:8 27 376,6 44,1

pMON140907: PCR53 EXP-ERIra.Ubq1:1:11 29 459,9 104,7

pMON140908: PCR54 EXP-ERIra.Ubq1:1:12 31 221,6 15,9

pMON140913: PCR19 EXP-Cl.Ubq1:1:10 98 287,8 50,9

pMON140914: PCR20 EXP-Cl.Ubq1:1:13 114 585,8 47,9

pMON140915: PCR21 EXP-Cl.Ubq1:1:14 115 557,5 76,6

pMON140916: PCR22 EXP-Cl.Ubq1:1:15 116 33,2 9,5

Como se puede apreciar en la Tabla 31 anterior, las secuencias EXP, EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXPAND-ge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 5 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) y EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116) eran capaces de dirigir la expresión de CP4. Todas las secuencias EXP con la excepción de una EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO:

10 116) dirigían los niveles de expresión de CP4 a un nivel mucho más alto que el control constitutivo, EXP-Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 164). Los niveles de expresión eran menores que los de EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170).

En una segunda serie de experimentos, la expresión de CP4 dirigida por amplicones que comprendían las secuencias EXP, EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:16 (SEQ ID NO: 93) y EXP-Cl.Ubq1:1:17

15 (SEQ ID NO: 97) se ensayaron en protoplastos foliares transformados de maíz y se compararon con los niveles de expresión dirigidos por el control constitutivo, EXP-Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 164). Los niveles medios de expresión de proteína CP4 expresados en partes por millón (ppm) se muestran en la Tabla 32 posterior.

Tabla 32. Expresión media de proteína CP4 en protoplastos foliares de maíz

Matriz de Amplicón: Amplicón ID Secuencia EXP SEQ ID NO: Media de CP4 foliar de maíz mg/ proteína total Desv. est. de CP4 foliar de maíz mg/ proteína total

pMON30167: PCR25 EXP-Os.Act1:1:1 164 12,2 1,69

pMON140913: PCR19 EXP-Cl.Ubq1:1:10 98 307,5 24,21

pMON142748
pMON142748: EXP-Cl.Ubq1:1:16 93 245,95 30,14

pMON142749
pMON142749: EXP-Cl.Ubq1:1:17 97 302,85 25,32

Como se puede apreciar en la Tabla 32 anterior, las secuencias EXP, EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXPCl.Ubq1:1:16 (SEQ ID NO: 93) y EXP-Cl.Ubq1:1:17 (SEQ ID NO: 97) eran capaces de dirigir la expresión de CP4. 5 Los niveles de expresión dirigida por las tres EXP eran mayores que las del control constitutivo, EXP-Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 164).

Ejemplo 8: Análisis de los elementos reguladores que dirigen CP4 en protoplastos de trigo

Este ejemplo ilustra la capacidad de EXP-Sv.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 128), EXP-Sv.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 132), EXP-Sv.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 133), EXP-Zm.UbqM1:1:6 (SEQ ID NO: 137), EXP-Zm.UbqM1:1:8 (SEQ ID NO:

10 145), EXP-Zm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141), EXP-SETit.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 117), EXP-SETit.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 123), EXP-SETit.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 124), EXP-Sb.Ubq4:1:2 (SEQ ID NO: 151) y EXP-Sb.Ubq6:1:2 (SEQ ID NO: 153) para dirigir la expresión de CP4 en protoplastos foliares de trigo. Estas secuencias EXP se clonaron en construcciones de plásmido de transformación binaria en plantas utilizando procedimientos conocidos en la técnica, y como se ha descrito en los Ejemplos 2 y 5 anteriores.

15 Se construyeron tres plásmidos de control (pMON30098, pMON42410, como se ha descrito anteriormente, y pMON43647 que comprende una región limítrofe derecha de Agrobacterium tumefaciens con EXPOs.Act1+CaMV.35S.2xA1-B3+Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 138) unida operativamente 5’ a una secuencia codificante de tolerancia a glifosato dirigida a un plástido (CP4, US RE39247), unida operativamente 5’ a T-AGRtu.nos-1:1:13, y una región limítrofe (B-AGRtu.left border) con elementos reguladores constitutivos conocidos que dirigen CP4 o GFP

20 como se define en el Ejemplo 5.

Los protoplastos foliares de trigo se transformaron utilizando procedimientos de transformación basados en PEG como se describe en los ejemplos previos con la excepción de que se utilizaron 1,5 x 105 células de protoplasto. Los ensayos de expresión transgénica de luciferasa y CP4 se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 6 anterior. Los niveles de expresión medios de CP4 que se determinaron por ELISA CP4 se presentan en la Tabla 34 posterior.

25 Tabla 34. Expresión media de proteína CP4 en células de protoplastos foliares de trigo

Plásmido: Secuencia EXP SEQ ID NO: Media de CP4 ppm DESV. EST. CP4 ppm

No ADN
No ADN: 0 0

pMON30098: GFP 0 0

pMON43647: EXP-Os.Act1+CaMV.35S.2xA1-B3+Os.Act1:1:1 172 656,2 124,5

pMON42410: EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 163 438,3 78,9

pMON30167: EXP-Os.Act1:1:1 164 583 107,4

pMON129203: EXP-Sv.Ubq1:1:7 128 156,9 25,1

pMON129204: EXP-Sv.Ubq1:1:8 132 39,5 7

pMON129205: EXP-Sv.Ubq1:1:9 133 154,5 56,5

pMON129210: EXP-Zm.UbqM1:1:6 137 1500 0

pMON129211: EXP-Zm.UbqM1:1:8 145 199,7 64,9

pMON129212: EXP-Zm.UbqM1:1:7 141 234,6 66,9

pMON129200: EXP-SETit.Ubq1:1:5 117 725,7 149,7

pMON129201: EXP-SETit.Ubq1:1:7 123 64,9 14,5

imagen32

(continuación)

Matriz de Amplicón: Amplicón ID Secuencia EXP SEQ ID NO: Media de proteínaCP4 total ng/mg DESV. EST. de proteína CP4 total ng/mg

pMON30167: PCR25 EXP-Os.Act1:1:1 164 3,83 0,73

pMON140896: PCR41 EXP-ANDge.Ubq1:1:7 5 103,46 16,31

pMON140917: PCR42 EXP-ANDge.Ubq1:1:8 8 61,48 1,99

pMON140897: PCR43 EXP-ANDge.Ubq1:1:10 10 62,65 4,58

pMON140898: PCR44 EXP-ANDge.Ubq1:1:6 12 48,74 3,09

pMON140899: PCR45 EXP-ANDge.Ubq1:1:11 14 54,91 3,50

pMON140900: PCR46 EXP-ANDge.Ubq1:1:12 16 42,81 5,97

pMON140904: PCR50 EXP-ERIra.Ubq1:1:9 22 31,26 1,69

pMON140905: PCR51 EXP-ERIra.Ubq1:1:10 25 49,82 5,96

pMON140906: PCR52 EXP-ERIra.Ubq1:1:8 27 37,43 4,52

pMON140907: PCR53 EXP-ERIra.Ubq1:1:11 29 27,17 0,96

pMON140908: PCR54 EXP-ERIra.Ubq1:1:12 31 17,41 4,13

pMON140913: PCR19 EXP-Cl.Ubq1:1:10 98 66,66 13,45

pMON140914: PCR20 EXP-Cl.Ubq1:1:13 114 79,42 10,74

pMON140915: PCR21 EXP-Cl.Ubq1:1:14 115 75,53 9,32

pMON140916: PCR22 EXP-Cl.Ubq1:1:15 116 0,00 0,00

Como se aprecia en la Tabla 35 anterior, las secuencias EXP, EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), 5 EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) y EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116) eran capaces de dirigir la expresión de CP4. Todas las secuencias EXP con la excepción de una, EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO:

10 116) dirigían niveles de expresión de CP4 a un nivel mucho más alto que el control constitutivo, EXP-Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 164). Los niveles de expresión eran más o menos al mismo nivel o menor que el de EXP-CaMV.35Senh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170) para la mayoría de las secuencias EXP.

En una segunda serie de experimentos, se ensayó la expresión de CP4 dirigida por amplicones comprendía las secuencias EXP, EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:16 (SEQ ID NO: 93) y EXP-Cl.Ubq1:1:17

15 (SEQ ID NO: 97) en protoplastos foliares transformados de trigo y se compararon con los niveles de expresión dirigidos por el control constitutivo, EXP-Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 164). Los niveles medios de expresión de proteína CP4 que se expresaron como partes por millón (ppm) se muestran en la Tabla 36 posterior.

Tabla 36. Expresión media de proteína CP4 en protoplastos foliares de trigo

Matriz de Amplicón: Amplicón ID Secuencia EXP SEQ ID NO: Media de CP4 foliar de Trigomg/ proteína total Desv. est. de CP4 foliar de Trigomg/ proteína total

pMON30167: PCR25 EXP-Os.Act1:1:1 164 15,84 2,12

pMON140913: PCR19 EXP-Cl.Ubq1:1:10 98 736,32 79,56

pMON142748
pMON142748: EXP-Cl.Ubq1:1:16 93 593,72 80,22

pMON142749
pMON142749: EXP-Cl.Ubq1:1:17 97 763,95 86,94

imagen33

imagen34

Como se puede apreciar en la Tabla 37 anterior, las secuencias EXP demostraban la capacidad para dirigir la expresión de CPR en protoplastos de caña de azúcar. Los niveles de expresión eran similares o mayores a los de la expresión de CP4 dirigida por EXP-Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 164). Una secuencia EXP, EXP-Zm.UbqM1:1:8 (SEQ ID NO: 145), demostraba niveles más altos de expresión en comparación con EXP-P-CaMV.35S-enh-1:1:13/L

5 CaMV.35S-1:1:2/I-Os.Act1-1:1:19 (SEQ ID NO: 139) en protoplastos de caña de azúcar.

Ejemplo 11: Análisis de elementos reguladores que dirigen CP4 en protoplastos de caña de azúcar utilizando casetes transgénicos de amplicones

Este ejemplo ilustra la capacidad de EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID 10 NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXPERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXPCl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) y EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116) para dirigir la expresión del gen CP4 de tolerancia al glifosato en protoplastos de caña de azúcar. Estas secuencias EXP se clonaron en construcciones de 15 plásmidos de transformación binaria en plantas. Los vectores de expresión en plantas resultantes se utilizaron como matrices de amplificación para producir un casete transgénico de amplicón compuesto por una secuencia EXP de ubiquitina unida operativamente 5’ a una secuencia codificante EPSPS tolerante a glifosato dirigida a un plástido (CP4, US RE39247), unida operativamente 5’ a la 3’ UTR T-AGRtu.nos-1:1:13 y una región limítrofe izquierda de A. tumefaciens. Los amplicones resultantes se utilizaron para transformar células de protoplastos foliares de caña de

20 azúcar.

Los protoplastos foliares de caña de azúcar se transformaron utilizando un procedimiento de transformación basado en PEG, como se describe en el Ejemplo 2 anterior. Se llevaron a cabo las mediciones de ambas CP4 utilizando un ensayo basado en ELISA.

Se ensayó la expresión de CP4 dirigida por los amplicones compuestos por las secuencias EXP, EXP

25 ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) y EXP-Cl.Ubq1:1:15

30 (SEQ ID NO: 116) en protoplastos foliares transformados de trigo y se compararon con los niveles de expresión dirigidos por los controles constitutivos, EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170) y EXP-Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 164). Los niveles de expresión media de proteína CP4 que se expresan como partes por millón (ppm) se muestra en la Tabla 38 posterior.

Tabla 38. Expresión media de proteína CP4 en protoplastos foliares de caña de azúcar

pMON19469: PCR24 EXP-CaMV.35Senh+Zm.DnaK:1:1 170 99,6 7,2

pMON30167: PCR25 EXP-Os.Act1:1:1 164 0,0 0,0

pMON140896: PCR41 EXP-ANDge.Ubq1:1:7 5 21,9 3,3

pMON140917: PCR42 EXP-ANDge.Ubq1:1:8 8 15,4 1,9

pMON140897: PCR43 EXP-ANDge.Ubq1:1:10 10 20,7 2,2

pMON140898: PCR44 EXP-ANDge.Ubq1:1:6 12 21,8 2,8

pMON140899: PCR45 EXP-ANDge.Ubq1:1:11 14 36,9 7,2

pMON140900: PCR46 EXP-ANDge.Ubq1:1:12 16 51,7 5,6

pMON140904: PCR50 EXP-ERIra.Ubq1:1:9 22 10,3 1,1

pMON140905: PCR51 EXP-ERha.Ubq1:1:10 25 25,3 4,7

pMON140906: PCR52 EXP-ERIra.Ubq1:1:8 27 29,9 4,6

pMON140907: PCR53 EXP-ERIra.Ubq1:1:11 29 44,0 7,1

pMON140908: PCR54 EXP-ERIra.Ubq1:1:12 31 37,0 5,4

(continuación)

pMON140913: PCR19 EXP-Cl.Ubq1:1:10 98 19,2 1,3

pMON140914: PCR20 EXP-Cl.Ubq1:1:13 114 20,5 2,1

pMON140915: PCR21 EXP-Cl.Ubq1:1:14 115 23,2 1,6

pMON140916: PCR22 EXP-Cl.Ubq1:1:15 116 0,0 0,0

Como se puede apreciar en la Tabla 38 anterior, las secuencias EXP, EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXPAND-ge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ

5 ID NO: 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114) y EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) eran capaces de dirigir la expresión de CP4. Parece que EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116) no expresa expresión de CP4 en este ensayo.

Ejemplo 12: Análisis de elementos reguladores que dirigen GUS en maíz transgénico

10 Se transformaron las plantas de maíz con vectores de expresión en plantas que contenían secuencias EXP que dirigen la expresión del transgén β-glucuronidasa (GUS), y se analizaron las plantas resultantes en cuanto a la expresión de la proteína GUS. Las secuencias EXP de ubiquitina se clonaron en construcciones de plásmido de transformación binaria de plantas utilizando procedimientos conocidos en la técnica.

Los vectores de expresión en plantas resultantes contenían una región limítrofe derecha de A. tumefaciens, un

15 primer casete transgénico para ensayar la secuencia EXP unida operativamente a una secuencia codificante de βglucuronidasa (GUS) que posee el intrón procesable GUS-2, descrito anteriormente, unido operativamente 5’ a la 3’ UTR del gen de proteína de transferencia lipídica de arroz (T-Os.LTP-1:1:1, SEQ ID NO: 141); un segundo casete de selección transgénico utilizado para la selección de células vegetales transformadas que confiere resistencia al herbicida glifosato (dirigido por el promotor Actina 1 de arroz), y una región limítrofe izquierda de A. tumefaciens. Los

20 plásmidos resultantes se utilizaron para transformar plantas de maíz. La Tabla 39 enumera las designaciones de los plásmidos, las secuencias EXP y los SEQ ID NO, que también se han descrito en la Tabla 1.

Tabla 39. Plásmidos de transformación binaria en plantas y las secuencias EXP asociadas

Construcción de plásmido: Secuencia EXP SEQ ID NO: Datos

pMON142865: EXP-ANDge.Ubq1:1:8 8 R0 y R1

pMON142864: EXP-ERIra.Ubq1:1:8 27 R0 y R1

pMON142729: EXP-Cl.Ubq1:1:12 90 R0

pMON142730: EXP-Cl.Ubq1:1:11 95 R0

pMON132047: EXP-Cl.Ubq1:1:23 108 R0

pMON132037: EXP-SETit.Ubq1:1:10 119 R0 y F1

pMON131957: EXP-SETit.Ubq1:1:11 125 F1

pMON131958: EXP-Sv.Ubq1:1:11 130 R0 y F1

pMON131959: EXP-Sv.Ubq1:1:12 136 R0

pMON131961: EXP-Zm.UbqM1:1:10 139 Ro

pMON131963: EXP-Zm.UbqM1:1:12 143 R0

pMON131962: EXP-Zm.UbqM1:1:11 149 R0

pMON132932: EXP-Sb.Ubq4:1:2 151 R0

pMON132931: EXP-Sb.Ubq6:1:3 155 R0

pMON132974: EXP-Sb.Ubq7:1:2 157 R0 y F1

Se transformaron las plantas utilizando transformaciones mediadas por Agrobacterium, por ejemplo como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. 20090138985.

Se utilizó el análisis histoquímico de GUS para el análisis de la expresión cualitativa de las plantas transformadas. Las secciones completas de tejidos se incubaron con solución de tinción de GUS X-Gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil

5 b-glucurónido) (1 miligramo/mililitro) durante un tiempo apropiado, se aclaró y se inspeccionó visualmente la coloración azul. Se determinó cualitativamente la actividad de GUS por inspección visual directa o inspección bajo el microscopio utilizando órganos y tejidos vegetales seleccionados. Las plantas R0 se inspeccionaron en cuanto a la expresión en raíces y hojas así como en la antera, seda y semillas en desarrollo y embriones de 21 días tras la polinización (21 DAP).

10 Para los análisis cuantitativos, se extrajo la proteína total de los tejidos seleccionados de las plantas de maíz transformadas. Se utilizó un microgramo de proteína total con el sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-β-Dglucurónido (MUG) en un volumen de reacción total de 50 microlitros. El producto de reacción 4-metilumbeliferona (4-MU), es máximamente fluorescente a un pH alto, cuando se ioniza el grupo hidroxilo. La adición de una solución básica de carbonato sódico detiene simultáneamente el ensayo y ajusta el pH para la cuantificación del producto

15 fluorescente. Se midió la fluorescencia con una excitación a 365 nm, de emisión a 445 nm utilizando un Fluoromax-3 (Horiba; Kyoto, Japan) con un Lector Micromax, con amplitud de hendidura ajustado a una excitación de 2 nm y una emisión de 3 nm.

La media de expresión GUS en R0 que se observaba para cada transformación se presenta en las Tablas 40 y 41 posteriormente. El ensayo de GUS R0 que se llevó a cabo en los transformantes transformados con pMON131957

20 (EXP-SETit.Ubq1:1:11, SEQ ID NO: 125) no pasó los controles de calidad. Estos transformantes se ensayaron en la generación F1 y se presentan adicionalmente posteriormente en este ejemplo.

Tabla 40. Expresión media de GUS R0 en tejidos radicales y foliares

Secuencia EXP: SEQ ID NO: V3 de raíz V4 de raíz V7 de raíz VT de raíz V3 de hojas V4 de hojas V7 de hojas VT de hojas

EXP-ANDge.Ubq1:1:8: 8 nd 255 199 70 nd 638 168 130

EXP-ERIra.Ubq1:1:8: 27 nd 477 246 62 nd 888 305 242

EXP-Cl.Ubq1:1:12: 90 nd 27 147 52 nd 75 189 199

EXP-Cl.Ubq1:1:11: 95 nd 28 77 50 nd 101 177 223

EXP-Cl.Ubq1:1:23: 108 0 nd 75 34 201 nd 194 200

EXP-SETit.Ubq1:1:10: 119 0 nd 29 57 58 nd 37 46

EXP-Sv.Ubq1:1:11: 130 nd nd nd 9 20 nd 55 29

EXP-Sv.Ubq1:1:12: 136 63 nd 0 28 184 nd 27 16

EXP-Zm.UbqM1:1:10: 139 0 nd 237 18 221 nd 272 272

EXP-Zm.UbqM1:1:12: 143 0 nd 21 43 234 nd 231 196

EXP-Zm.UbqM1:1:11: 149 124 nd 103 112 311 nd 369 297

EXP-Sb.Ubq4:1:2: 151 125 nd 0 95 233 nd 150 88

EXP-Sb.Ubq6:1:3: 155 154 nd 13 128 53 nd 39 55

EXP-Sb.Ubq7:1:2: 157 37 nd 22 18 165 nd 89 177

Tabla 41. Expresión media de GUS R0 en órganos reproductores de maíz (antera, seda) y semillas endesarrollo (embrión y endospermo)

Secuencia EXP: SEQ ID NO: VT de antera VT/R1 deseda Embrión 21 DAP Endospermo21 DAP

EXP-ANDge.Ubq1:1:8: 8 247 256 24 54

EXP-ERIra.Ubq1:1:8: 27 246 237 36 61

EXP-Cl.Ubq1:1:12: 90 420 121 26 220

EXP-Cl.Ubq1:1:11: 95 326 227 41 221

imagen35

internodo, semillas 12 días tras la polinización (DAP) y; embrión y endospermo 21 y 38 DAP. Las muestras de tejido seleccionado se analizaron también en las plantas F1 expuestas a condiciones de estrés por sequía y frío en cuanto a transformantes que comprendían pMON132037 (EXP-SETit.Ubq1:1:10, SEQ ID NO: 119), pMON131957 (EXPSETit.Ubq1:1:11, SEQ ID NO: 125), pMON131958 (EXP-Sv.Ubq1:1:11, SEQ ID NO: 130) y pMON132974 (EXP

5 Sb.Ubq7:1:2, SEQ ID NO: 157). El tejido radical y foliar V3 se muestreó tras la exposición a sequía y frío.

El estrés a la sequía se indujo en plantas transformadas F1, V3, con pMON132037 (EXP-SETit.Ubq1:1:10, SEQ ID NO: 119), pMON131957 (EXP-SETit.Ubq1:1:11, SEQ ID NO: 125), pMON131958 (EXP-Sv.Ubq1:1:11, SEQ ID NO: 130) y pMON132974 (EXP-Sb.Ubq7:1:2, SEQ ID NO: 157) evitando el riego durante 4 días permitiendo que el contenido en agua se redujera en al menos un 50 % del contenido original de agua de la planta con riego completo. 10 El protocolo de sequía comprendía esencialmente las siguientes etapas. Las plantas en estadio V3 se privaron de agua. Según las plantas de maíz experimentaban la sequía, la forma de la hoja cambiará desde la apariencia habitual sana y sin plegamientos a una hoja que demostraba plegamientos en la vena media del haz vascular y tenía una apariencia de V cuando se miraba desde el ápice foliar hacia el tallo. Este cambio en la morfología habitualmente comenzaba a presentarse aproximadamente 2 días después de cesar el riego y se mostraba en los 15 experimentos anteriores asociado con la pérdida de agua de aproximadamente el 50 % según se midió por el peso de los tiestos antes del cese del riego y el peso de los tiestos cuando se observaba la morfología rizada de las hojas en plantas no regadas. Las plantas se consideraban en condiciones de sequía cuando las hojas mostraban marchitamiento como se ponía en evidencia por el rizado hacia dentro (forma de V) de la hoja. Este nivel de estrés se consideraba una forma de estrés sub-letal. Una vez que la planta demostraba inducción a sequía como se ha

20 definido anteriormente, se destruía la planta para adquirir las muestras de raíz y hojas.

Además de la sequía, las plantas F1 en estado V3 transformadas con pMON132037 (EXP-SETit.Ubq1:1:10, SEQ ID NO: 119), pMON131957 (EXP-SETit.Ubq1:1:11, SEQ ID NO: 125), pMON131958 (EXP-Sv.Ubq1:1:11, SEQ ID NO: 130) y pMON132974 (EXP-Sb.Ubq7:1:2, SEQ ID NO: 157) también se expusieron a condiciones de frío para determinar si los elementos reguladores demostraban una expresión de GUS inducida por frío. Las plantas

25 completas se ensayaron para la inducción de expresión de GUS bajo estrés por frío en el estadio V3. Las plantas de maíz en estadio V3 se expusieron a una temperatura de 12 C en una cámara de crecimiento durante 24 horas. Las plantas en la cámara de crecimiento se cultivaron con un flujo de luz blanca de 800 micromoles por metro cuadrado por segundo con un ciclo de luz de 10 horas de luz blanca y 14 horas de oscuridad. Tras la exposición al frío, se muestrearon los tejidos radicales y foliares en cuanto a la expresión de GUS cuantitativa.

30 La expresión de GUS se midió como se ha descrito anteriormente. La media de expresión GUS en F1 determinada para cada muestra de tejido se presenta en las Tablas 42 y 43 posteriores.

Tabla 42. Expresión media de GUS F1 en plantas transformadas con pMON142864 y pMON142865

Órgano: pMON142864 pMON142865

V3 de hojas: 86 74

V3 de raíz: 41 52

V8 de hojas: 109 123

V8 de raíz: 241 252

VT de flores, anteras: 168 208

VT de hojas: 158 104

Mazorca R1: 171 224

Seda R1: 314 274

Raíz R1: 721 308

Internodo R1: 428 364

Semillas R2-12DAP: 109 72

Semillas R3 -21DAP-Embrión: 45 32

Semillas R3 -21DAP-Endospermo: 175 196

Semillas R5 -38DAP-Embrión: 163 58

Semillas R5 -38DAP-Endospermo: 90 69

Tabla 43. Expresión media de GUS F1 en plantas transformadas con pMON132037, pMON131957, pMON131958 y pMON132974

Órgano: pMON132037 pMON131957 pMON131958 pMON132974

Semilla embebida Embrión: 536 285 288 1190

Semilla embebida Endospermo: 95 71 73 316

Coleoptilo-4 DAG: 218 60 143 136

Raíz-4 DAG: 74 33 101 48

V3 de hoja: 104 120 66 52

V3 de raíz: 74 71 81 194

V3 de hoja-frío: 73 15 72 N/A

V3 de raíz-frío: 113 44 89 49

V3 de hoja-sequía: 97 344 103 157

V3 de raíz-sequía: 205 153 129 236

V8 de hoja: 185 142 77 282

V8 de raíz: 33 16 61 28

VT de Flor-anteras: 968 625 619 888

VT de hoja: 138 89 132 268

VT de hojasenescente: 121 100 156 345

VT de polen: 610 1119 332 4249

Mazorca R1: 291 70 168 127

Seda R1: 164 124 167 101

Raíz R1: 36 39 39 21

Internodo R1: 255 89 232 141

Semilla R2 -12DAP: 138 170 165 169

Semilla R3 -21 DAP-Embrión: 94 97 489 389

Semilla R3 -21 DAP-Endospermo: 57 118 52 217

Semilla R5 -38 DAP-Embrión: 600 147 377 527

Semilla R5 -38 DAP-Endospermo: 58 36 57 106

En las plantas F1 de maíz, los niveles de expresión de GUS en los distintos tejidos muestreados se diferencian entre

5 las secuencias EXP de ubiquitina. Aunque todas las secuencias EXP demostraban la capacidad de dirigir la expresión transgénica de GUS en plantas de maíz F1 transformadas establemente, cada secuencia EXP demostraba un patrón de expresión único con respecto a las otras. Por ejemplo, la expresión en la raíz de R1 es aproximadamente de dos veces para EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27) que

EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8). La expresión de GUS en la semilla en embrión de 38 DAP es casi tres veces

10 mayor para EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27) que para EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8). Por el contrario la expresión foliar y radical en los estadios V3 y V8 es aproximadamente el mismo para EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ

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el rociado con glifosato y en estadio V4 y Vi de desarrollo; y un segundo grupo de cinco plantas que se dejaron sin rociar (es decir, el control). El glifosato se aplicó por aplicación de un pulverizado foliar diseminado utilizando Roundup WeatherMax® con una tasa de aplicación de 0,00025 e.a./m2 (e.a., equivalente ácido). Tras siete a diez días, las hojas de cada planta se evaluaron buscando daños. La tolerancia vegetativa (Tol Veg en la Tabla 49) se 5 evaluó comparando las plantas rociadas y no rociadas para cada evento y se utilizó una escala de clasificación de daños para proporcionar una clasificación final para tolerancia vegetativa (T = tolerante, NT = no tolerante). Además se ensayó un grupo de semillas para todas las plantas en cada caso. Las medidas del grupo de semillas entre las plantas de control y las plantas rociadas se comparó y se asignó una tolerancia reproductiva (Tol Repro en la Tabla 49) para cada caso basándose en el porcentaje del grupo de semillas de las plantas rociadas con respecto a los

10 controles (T = tolerante, NT = no tolerante). La Tabla 49 posterior muestra las clasificaciones de tolerancia vegetativa y reproductiva para cada case rociado en estadio V4 y V8. La letra “T” denota tolerante y “NT” denota no tolerante.

Tabla 49. Clasificaciones de daños en las hojas de maíz transformado en estadio V4 y V8 de casos individuales

Construcción de Plásmido: Secuencia EXP SEQ ID NO: Caso Tol Veg V4 Tol Veg V8 Tol Repro

pMON141619: EXP-ANDge.Ubq1:1:8 8 Caso 1 T T NT

Caso 2: T T T

Caso 3: T T NT

Caso 4: T T NT

Caso 5: T T T

Caso 6: T T NT

Caso 7: T T T

Caso 8: T T T

Caso 9: T T NT

pMON142862: EXP-ERIra.Ubq1:1:8 27 Caso 1 T T T

Caso 2: T T NT

Caso 3: T T T

Caso 4: T T T

Caso 5: T T NT

Caso 6: T T T

Caso 7: T T NT

Caso 8: T T T

Caso 9: T T T

pMON129221: EXP-Cl.Ubq1:1:10 98 Caso 1 T T NT

Caso 2: T T NT

Caso 3: NT NT T

Caso 4: NT NT T

Caso 5: T T NT

Caso 6: NT NT T

Caso 7: T T T

(continuación)

pMON129205: EXP-Sv.Ubq1:1:9 133 Caso 1 NT NT

Caso 2: NT NT NT

Caso 3: T T NT

Caso 4: NT NT

Caso 5: NT NT NT

Caso 6: NT NT NT

Caso 7: NT NT NT

pMON129212: EXP-Zm.UbqM1:1:7 141 Caso 1 T T

Caso 2: T T

Caso 3: T T

Caso 4: T T

Caso 5: T T

Caso 6: T T

Caso 7: T T

Caso 8: T T

Caso 9: T T

Caso: T T

10

En la Tabla 49 anterior, todos los casos transformados que se ensayaron comprendían casetes transgénicos GP4 que comprenden las secuencias EXP, EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27) 5 y EXP-Zm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141) demostraban una tolerancia vegetativa completa basándose en la clasificación de daños que no excedía una puntuación de 10. Cuatro casos de nueve que comprendían EXPANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8) y seis casos de nueve que comprendían EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27) eran tolerantes tanto vegetativa como reproductivamente a la aplicación de glifosato. Por el contrario, los casos que comprendían EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98) eran o vegetativamente tolerantes o reproductivamente tolerantes

10 pero no ambos. Solo un caso que comprendía EXP-Sv.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 133) demostraba tolerancia vegetativa y ninguno de los casos ensayados eran tolerantes reproductivamente. Todos los casos que contenían EXP-Zm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141) demostraban tolerancia vegetativa pero la evaluación de tolerancia reproductiva aún está en progreso.

Ejemplo 15: Análisis de la expresión utilizando diferentes secuencias de unión de empalme Intrón/Exón del 15 extremo 3’

Se transformaron células de protoplastos foliares de maíz y trigo con construcciones de expresión en plantas que comprendían secuencias EXP que dirigen la expresión de GUS que comprenden el mismo promotor y líder pero tienen diferentes nucleótidos en el extremo 3’ a continuación de la secuencia de unión de empalme intrón/exón, 5’AG-3’ para ver si la expresión estaba afectada por el cambio ligero de la secuencia. La expresión también se

20 comparó con la de dos plásmidos de control constitutivos.

Se construyeron construcciones de expresión en plantas que comprendían un casete de expresión de GUS. Los vectores resultantes estaban comprendidas por el promotor de ubiquitina de Coix lacryma-jobi, P-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 80) unido operativamente 5’ a la secuencia líder, L-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 81), unida operativamente 5’ a un elemento intrón que se muestra en la Tabla 50 posterior que comprenden cada uno 25 diferentes nucleótidos en el extremo 3’ justo después de la unión de empalme intrón/exón 5’-AG-3’, unida operativamente 5’ a una secuencia codificante de GUS que está unida operativamente 5’ a la 3’ UTR T-AGRtu.nos

1:1:13 (SEQ ID NO: 127). La Tabla 50 posterior muestra las construcciones de expresión en plantas y la correspondiente secuencia del extremo 3’.

Tabla 50. Construcciones de expresión en plantas, intrones y secuencia del extremo 3’ a continuación de launión de empalme intrón/exón 5’-AG-3’

Construcción de Plásmido: Secuencia EXP SEQ ID NO: Variante de Intrón Nucleótidos del extremo 3’ inmediatamente a continuación del 3’ del sitio de empalme de Intrón AG

pMON140889: EXP-Cl.Ubq1:1:10 98 I-Cl.Ubq1-1:1:6 (SEQ ID NO: 94) GTC

pMON146795: EXP-Cl.Ubq1:1:18 99 I-Cl.Ubq1-1:1:7 (SEQ ID NO: 92) GTG

pMON146796: EXP-Cl.Ubq1:1:19 100 I-Cl.Ubq1-1:1:8 (SEQ ID NO: 101) GCG

pMON146797: EXP-Cl.Ubq1:1:20 102 I-Cl.Ubq1-1:1:9 (SEQ ID NO: 103) GAC

pMON146798: EXP-Cl.Ubq1:1:21 104 I-Cl.Ubq1-1:1:10 (SEQ ID NO: 105) ACC

pMON146799: EXP-Cl.Ubq1:1:22 106 I-Cl.Ubq1-1:1:11 (SEQ ID NO: 107) GGG

pMON146800: EXP-Cl.Ubq1:1:23 108 I-Cl.Ubq1-1:1:12 (SEQ ID NO: 109) GGT

pMON146801: EXP-Cl.Ubq1:1:24 110 I-Cl.Ubq1-1:1:13 (SEQ ID NO: 111) CGT

pMON146802: EXP-Cl.Ubq1:1:25 112 I-Cl.Ubq1-1:1:14 (SEQ ID NO: 113) TGT

pMON25455: EXP-Os.Act1:1:9 179 Control Constitutivo

pMON65328: EXP-CaMV.35Senh+Ta.Lhcb 1+Os.Act1:1: 1 163 Control Constitutivo

Los protoplastos de maíz y trigo se transformaron como se ha descrito anteriormente y se ensayaron en cuanto a la expresión de GUS y luciferasa. La Tabla 51 a continuación muestra la media de los valores de GUS y RLuc para la expresión de ambos protoplastos de maíz y trigo.

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Claims

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