RS56086B1 - Regulatorni elementi biljke i korišćenja istih - Google Patents

Regulatorni elementi biljke i korišćenja istih

Info

Publication number
RS56086B1
RS56086B1 RS20170562A RSP20170562A RS56086B1 RS 56086 B1 RS56086 B1 RS 56086B1 RS 20170562 A RS20170562 A RS 20170562A RS P20170562 A RSP20170562 A RS P20170562A RS 56086 B1 RS56086 B1 RS 56086B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
exp
seq
ubq1
expression
sequence
Prior art date
Application number
RS20170562A
Other languages
English (en)
Inventor
Stanislaw Flasinski
Original Assignee
Monsanto Technology Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Monsanto Technology Llc filed Critical Monsanto Technology Llc
Publication of RS56086B1 publication Critical patent/RS56086B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
    • C12N15/8225—Leaf-specific, e.g. including petioles, stomata
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
    • C12N15/8227—Root-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
    • C12N15/8231—Male-specific, e.g. anther, tapetum, pollen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
    • C12N15/8234—Seed-specific, e.g. embryo, endosperm
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)

Description

OBLAST PRONALASKA
Ovaj pronalazak se odnosi na polje molekularne biologije biljki i genetički inženjering biljki, i DNK molekule korisne za moduliranje ekspresije gena kod biljaka.
STANJE TEHNIKE
Regulatorni elementi su genetički elementi koji regulišu aktivnost gena moduliranjem transkripcije radno povezanog transkriptabilnog polinukleotid molekula. Takvi elementi uključuju promotere, lidere, introne, i 3’ neprevedene regiona i korisni su na polju molekularne biologije biljke i genetičkog inženjeneringa biljaka.
SUŠTINA PRONALASKA
Sadašnji pronalazak obezbeđuje nove regulatorne elemente gena za korišćenje u biljkama. Sadašnji pronalazak takođe obezbeđuje DNK konstrukte koji sadrže ove regulatorne elemente. Sadašnji pronalazak takođe obezbeđuje transgene ćelije biljke, biljke, i seme koji sadrže ove regulatorne elemente. Sekvence mogu biti obezbeđene radno povezane za transkriptabilni polinukleotid molekul. U jednoj realizaciji, transkriptabilni polinukleotid molekul može biti heterolog u pogledu regulatorne sekvence koja se nalazi u njemu. Regulatorni element sekvence obezbeđen ovim pronalaskom tako može, u određenim realizacijama, biti definisan kao radno povezan za heterologi transkriptabilni polinukleotid molekul. Sadašnji pronalazak takođe obezbeđuje postupke pravljenja i korišćenja regulatornih elemenata, DNK konstrukte koji sadrže ove regulatorne elemente, i ćelije transgene biljke, biljke i seme koji sadrže ove regulatorne elemente radno povezane za transkriptabilni polinukleotid molekul.
Tako, u jednom aspektu, sadašnji pronalazak obezbeđuje DNK molekul koji sadrži DNK sekvencu odabranu od grupe koja se sastoji od: a) sekvence sa bar 95 procenata identičnosti sa bilo kojom od SEQ ID NOs: 27-28 (napomena: SEQ ID NO znači sekvenca sa identifikacionim brojem); b) sekvence koja sadrži jednu od SEQ ID NOs: 27-28, i c) fragmenta koji sadrži bar 500 susednih nukleotida od SEQ ID NO: 27, pri čemu fragment ima promoter aktivnost od SEQ ID NO: 27, pri čemu je ova sekvenca radno povezana za heterologi transkriptabilni polinukleotid molekul. U specifičnoj realizaciji, DNK molekul sadrže bar 98 procenta, ili bar 99 procenata identičnosti sekvence sa DNK sekvencom bilo koje od SEQ ID NOs: 27-28. U određenim realizacijama DNK molekula, DNK sekvenca sadrži regulatorni element. U nekim realizacijama ovaj regulatorni element sadrži promoter. U određenim realizacijama, heterologi transkriptabilni polinukleotid molekul sadrži gen od agronomskog interesa, kao što je to gen sposoban da obezbedi otpornost u biljkama na herbicide, ili gen sposoban da obezbedi otpornost u biljkama na štetočine.
Pronalazak takođe obezbeđuje ćeliju transgene biljke koja sadrži heterologi DNK konstrukt obezbeđen ovim pronalaskom, uključujući sekvencu bilo koje od SEQ ID NOs: 27-28, ili njihov fragment ili varijantu kako je u gornjem tekstu opisano, pri čemu je navedena sekvenca radno povezana za heterologi transkriptabilni polinukleotid molekul. U određenim realizacijama, ćelija transgene biljke je ćelija monokotiledone biljke. U drugim realizacijama, ćelija transgene biljke je ćelija dikotiledone biljke.
Dalje je obezbeđena ovim pronalaskom transgena biljka, ili njen deo, koja sadrži DNK molekul kako je to ovde dato, uključujući DNK sekvencu odabranu od grupe koja se sastoji od: a) sekvence sa identičnom sekvencom od bar 95 procenata sa bilo kojom od SEQ ID NOs: 27-28; b) sekvence koja sadrži bar jednu od SEQ ID NOs: 27-28; i c) fragmenta koji sadrži bar 500 susednih nukleotida od SEQ ID NO: 27, pri čemu fragment ima promoter aktivnost; pri čemu je sekvenca radno povezana za heterologi traskriptabilni polinukleotid molekul. U specifičnim realizacijama, transgena biljka može biti progena biljka bilo koje generacije koja sadrži DNK molekul, u odnosu na početnu transgenu biljku koja sadrži DNK molekul. Dalje je obezbeđeno transgeno seme koje sadrži DNK molekul u skladu sa ovim pronalaskom.
U još jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak ekspresije transkriptabilnog polinukleotid molekula koji se sastoji od dobijanja transgene biljke prema ovom pronalasku, kao što je to biljka koja sadrži DNK molekul kako je ovde opisan, i kultivisanja biljke, pri čemu je transkriptabilni polinukleotid u DNK molekulu ekspresovan.
KRATAK OPIS SLIKA
Slike 1a-1h opisuju ravnanje varijanti veličina promotera koje korespondiraju sa elementima promotera izolovanih iz vrste trave Andropogon gerardii. Naročito, Slike 1a-1h prikazuju ravnanje 2603 bp promoter sekvence P-ANDge.Ubq-1:1:11 (SEQ ID NO: 2), pronađene u grupi transkripcionog regulatornog elementa ekspresije EXP-ANDge.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 1), sa promoter sekvencama izvedenim putem analize brisanjem P-ANDge.Ubq-1:1:11. Brisanje, na primer 5’ kraja P-ANDge.Ubq-1:1:11, proizvodi promoter P-ANDge.Ubq-1:1:9 (SEQ ID NO: 6), 2114 bp sekvencu koja je pronađena u okviru EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5). Ostale promoter sekvence na Slici 1 uključuju P-ANDge.Ubq1-1:1:10 (SEQ ID NO: 9), 1644 bp sekvencu koja se sadrži u okviru EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8); P-ANDge.Ubq1-1:1:12 (SEQ ID NO: 11, 1472 bp sekvencu koja se sadrži u okviru EXPANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10); P-ANDge.Ubq1-1:1:8 (SEQ ID NO: 13), 1114 bp sekvencu koja se sadrži u okviru EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), P-ANDge.Ubq1-1:1:13 (SEQ ID NO: 15), 771 bp sekvencu koja se sadrži u okviru EXP-ANDge.Ubg1:1:11 (SEQ ID NO: 14); i P-ANDge.Ubq1-1:1:14 (SEQ ID NO: 17), 482 bp sekvencu koja se sadrži u okviru EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16).
Slike 2a-2g opisuju ravnanje varijanti promotera izolovanih iz trave Saccharum ravennae (Erianthus ravennae). Naročito, Slike 2a-2g prikazuju ravnanje 2536 bp promoter sekvence P-ERIra.Ubq1-1:1:10 (SEQ ID NO: 19) (pronađenu, na pirmer, u okviru grupe transkripcionog regulatornog elementa ekspresije EXP-ERIra.Ubq1 (SEQ ID NO: 18)) sa promoter sekvencama izvedenim iz analize brisanjem P-ERIra.Ubq1-1:1:10; 2014 bp promoter sekvencom P-ERIra.Ubq1-1:1:9 (SEQ ID NO: 23); 1525 bp promoter sekvencom P-ERIra.Ubq1-1:1:11 (SEQ ID NO: 26); 1044 bp promoter sekvencom P-ERIra.Ubq1-1:1:8 (SEQ ID NO: 28); 796 bp sekvencom P-ERIra.Ubq1-1:1:12 (SEQ ID NO: 30); i 511bp sekvencom P-ERIra.Ubq1-1:1:13 (SEQ ID NO: 32).
Slike 3a-3c opisuju ravnanje varijanti veličine promotera koje korespondiraju sa promoter elementima izolovanim iz vrste trave Setaria viridis. Naročito, Slike 3a-3c prikazuju ravnanje 1493 bp promoter sekvence, P-Sv.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 34) sa promoterima izvedenim iz analize brisanjem 5’ kraja P-Sv.Ubq1-1:1:1; promoterom veličine 1035 bp P-Sv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 38); i 681 bp promoter sekvencom P-Sv.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 40).
Slike 4a-4e opisuju ravnanje varijanti grupe transkripcionog regulatornog elementa ekspresije izvedenih iz trave Zea mays podvrsta, mexicana. Naročito, Slike 4a-4e upoređuju 2005 bp grupu transkripcionog regulatornog elementa ekspresije nazvanu EXP-Zm.UbqM1:1:2 (SEQ ID NO: 49) sa alelnom varijantom EXP-Zm.UbqM1:1:5 (SEQ ID NO: 53), kao i sa varijantama veličine EXP-Zm.UbqM1:1:1 (SEQ ID NO: 41), koja je dužine 1922 bps, EXP-Zm.UbqM1:1:4 (SEQ ID NO: 45), koja je dužine 1971 bps.
Slike 5a-5b opisuju ravnanje varijanti veličine promotera izolovanog iz trave Sorghum bicolor. Naročito, Slike 5a-5b prikazuju ravnanje promoter elementa veličine 791 bp, P-Sb.Ubq6-1:1:2 (SEQ ID NO: 60) koja se sadrži u okviru grupe transkripcionog regulatornog elementa ekspresije EXP-Sb.Ubq6 (SEQ ID NO: 59), sa 855 bp promoter elementom P-Sb.Ubq6-1:1:1 (SEQ ID NO: 64) koji se nalazi u okviru EXP-Sb.Ubq6:1:1 (SEQ ID NO: 63).
Slike 6a-6c opisuju ravnanje varijanti veličine promotera koje korespondiraju sa elementima promotera izolovanim iz trave Setaria italica. Naročito, Slike 6a-6c prikazuju ravnanje 1492 bp promoter varijante P-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 70) sa 1492 bp promoter varijantom P-SETit.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 74), 1034 bp promoter elementom P-SETit.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 76), i 680 bp promoter elementom P-SETit.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 78).
Slike 7a-7b opisuju ravnanje varijanti veličine promotera i pojačivačkog elementa koji korespondira sa elementima promotera izolovanih iz vrste trava Coix lachryma-jobi. Naročito, Slike 7a i 7b prikazuju ravnanje 837 bp varijante promotera, P-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 80) pronađenu u okviru grupe transkricionog regulatornog elementa ekspresije EXP-Cl-Ubq1:1:1 (SEQ ID NO: 79), sa pojačivačkim fragmentom izvedenim iz P-Cl.Ubq1-1:1:1, nazvanim E-Cl-Ubq1:1:1 (SEQ ID NO: 89) koji je dužine 798 bp, kao i sa tri 5’ kraja varijanti brisanja P-Cl.Ubq1-1:1:1; 742 bp elementom P-Cl.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 84); 401 bp elementom P-Cl.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 86); i 54 bp minimalnim promoter elementom P-Cl-Ubq1-1:1:5 (SEQ ID NO: 88).
Slika 8 opisuje konfiguracije transgene kasete sadašnjeg pronalaska.
KRATAK OPIS SEKVENCI
SEQ ID NOS: 1, 5, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 22, 25, 27, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 45, 49, 53, 55, 59, 63, 65, 69, 73, 75, 77, 79, 83, 85, 87, 90, 93, 95, 97, 98, 99, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 115, 116, 117, 119, 121, 123, 124, 125, 126, 128, 130, 132, 133, 134, 136, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 180, 181 i 183 su sekvence grupa transkripcionog regulatornog elementa ekspresije ili EXP sekvence koja sadrže promoter sekvencu radno povezanu 5’ za lider sekvencu koja radno povezana 5’ za intron sekvencu.
SEQ ID NOS: 2, 6, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 23, 26, 28, 30, 32, 34, 38, 40, 42, 46, 50, 56, 60, 64, 66, 70, 74, 76, 78, 80, 84, 86, 88, 91, 96 i 135 su promoter sekvence.
SEQ ID NOS: 3, 20, 35, 43, 47, 51, 57, 61, 67, 71 i 81 su lider sekvence.
SEQ ID NOS: 4, 7, 21, 24, 36, 44, 48, 52, 54, 58, 62, 68, 72, 82, 92, 94, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 118, 120, 122, 127, 129, 131, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 i 182 su intron sekvence.
SEQ ID NO: 89 je sekvenca pojačivača.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
Ovde opisan pronalazak obezbežuje polinukleotid molekule koji imaju korisnu ragulatornu aktivnost gena iz vrsti biljaka. Dizajn, konstrukcija i korišćenje ovih polinukleotid molekula su dati ovim pronalaskom. Nukleotid sekvence ovih polinukleotid molekula su date među SEQ ID NOs: 27 i 28. Ovi polinukleotid molekuli su, na primer, sposobni da utiču na ekspresiju radno povezanih transkriptabilnih polinukleotid moelkula u tkivima biljke, i da prema tome selektivno regulišu ekspresiju gena, ili aktivnost kodiranog genskog proizvoda, u transgenim biljkama. Sadašnji pronalazak takođe obezbeđuje postupke modifikovanja, proizvodnje i korišćenja istih. Pronalazak takođe obezbeđuje kompozicije, transformisane ćelije domaćina, transgene biljke i seme koji sadrže promotere i/ili ostale opisane nukleotidne sekvence, i postupke za pripremanje i korišćenje istih.
Sledeće definicije i postupci su dati kako bi se bolje definisao sadašnji pronalazak i navodili stručnjaci iz ove oblasti nauke u praktičnoj primeni sadašnjeg pronalaska. Osim ukoliko nije drugačije naglašeno, pojmovi se imaju razumeti prema konvencionalnom korišćenju stručnjaka iz ove oblasti nauke.
DNK molekuli
Kako se to ovde koristi pojam „DNK“ ili „DNK molekul“ upućuje na dvolančani DNK molekul genomskog ili sintetičkog porekla, odnosno, polimer deoksiribonukleotid baza ili polinukleotid molekul, čitan od 5’ (uzvodno) kraja do 3’ (nizvodno) kraja. Kako se to ovde koristi, pojam „DNK sekvenca“ upućuje na nukleotidnu sekvencu DNK molekula. Nomenklatura koja se ovde koristi korespondira sa onom datom u Title 37 of the United States Code of Federal Regulations § 1.822, a dato u tabelama WIPO Standard ST.25 (1998), Appendix (Prilog) 2, Tabele 1 i 3.
Kako se to ovde koristi, pojam „izolovani DNK molekul“ upućuje na DNK molekul bar delimično odvojen od drugih molekula normalno povezanih sa njim u njegovom matičnom ili prirodnom stanju. U jednoj realizaciji, pojam „izolovan“ upućuje na DNK molekul koji je bar delimično odvojen od nekih nukleinskih kiselna koje normalno flankiraju DNK molekul u njegovom matičnom ili prirodnom stanju. Tako se, DNK molekuli spojeni za regulatorne ili kodirajuće sekvence sa kojim nisu normalno povezani, na primer kao rezultat rekombinantnih tehnika, ovde smatraju izolovanim. Takvi molekuli se smatraju izolovanim kada su integrisani u hromozom ćelije domaćina ili prisutni u rastvoru nukleinske kiseline sa drugim DNK molekulima, time što se ne nalaze u njihovom matičnom stanju.
Bilo koji broj postupaka dobro poznatih stručnjacima iz ove oblasti nauke može biti upotrebljen da se izoluje i manipuliše DNK molekul, ili njegov fragment, opisan u sadašnjem pronalasku. Na primer, PCR (polimeraza lančana reakcija) tehnologija može biti korišćena da se pojača određeni početni DNK molekul i/ili da se proizvedu varijante originalnog molekula. DNK molekuli, ili njihov fragment, mogu takođe biti dobijeni drugim tehnikama kao što je to direktnim sintetisanjem fragmenta hemijskim sredstvima, kako se to uobičajeno praktikuje korišćenjem automatizovanog oligonukleotid sintesajzera.
Kako se to ovde koristi, pojam „identičnost sekvence“ upućuje na obim u kom su dve optimalno poravnate polinukleotidne sekvence ili dve optimalno poravnate polipeptidne sekvence identične. Optimalno ravnanje sekvenci se kreira manualnim ravnanjem dve sekvence, na primer, referentne sekvence i druge sekvence, da se maksimizira broj nukleotidnih poklapanja u ravnanju sekvenci sa odgovarajućim internim nukleotidnim umetanjima, izacivanjima ili razmacima. Kako se to ovde koristi, pojam „referentna sekvenca“ upućuje na sekvencu datu kao polinukleotidne sekvence od SEQ ID NOs: 27 i 28.
Kako se to ovde koristi, pojam „procenat identičnosti sekvence“ ili „procenat identičnosti“ ili „% identičnosti“ je frakcija identičnosti puta 100. „Identičnost frakcije“ za sekvencu optimalno poravnatu sa referentnom sekvencom je broj nukleotida koji se poklapaju u optimalnom ravnanju, podeljeno sa ukupnim brojem nukleotida u referentnoj sekvenci, na primer, ukupan broj nukleotida u punoj dužini celokupne referentne sekvence. Tako, jedna realizacija ovog pronalaska je DNK molekul koji sadrži sekvencu kaoj kada je optimalno poravnata za referentnom sekvencom, data ovde kao SEQ ID NOs: 27 ili 28, ima bar 95 procenata identičnosti, bar 96 procenata identičnosti, bar 97 procenata identičnosti, bar 98 procenata identičnosti, ili bar 99 procenata identičnosti sa referentnom sekvencom. U određenim realizacijama takve sekvence mogu biti definisane kao one koje imaju genregulatornu aktivnost.
Regulatorni elementi
Regulatorni element je DNK molekul koji ima gensku regulatornu aktivnost, odnosno, onaj koji ima sposobnost da utiče na transkripciju i/ili translaciju radno povezanog transkriptabilnog polinukleotid molekula. Pojam „genska regulatorna aktivnost“ tako upućuje na sposobnost da se utiče na obrazac ekspresije radno povezanog transkriptabilnog polinukleotid molekula uticanjem na transkripciju i/ili translaciju radno transkriptabilnog polinukleotid molekula. Kako se to ovde koristi, grupa transkripcionog regulatornog elementa ekspresije ili „EXP“ sekvenca se mogu sadržati od elemenata ekspresije, kao što su pojačivači, promoteri, lideri i introni, radno povezani. Tako grupa transkripcionog regulatornog elementa ekspresije može da se sastoji od, na primer, promotera radno poveznaog 5’ za lider sekvencu, što je povratno radno povezan 5’ za intron sekvencu. Intron sekvenca može se sastojati od sekvence koja započinje u tački prvog intron/ekson razvodnog spleta matične sekvence i dalje se može sastojati od malog lider fragmenta koji sadrži drugi intron/ekson razvodni splet kako bi se obezbedilo pravilna intron/ekson obrada da se olakša transkripcija i pravilna obrada rezultirajućeg transkripta. Lideri i introni mogu pozitivno da utiču na transkripciju radno povezanog transkriptabilnog polinukleotid molekula kao i na translaciju rezultirajuće transkribovane RNK. Prethodno obrađen RNK molekul sadrži lidere i introne, koji mogu da utiču na post-transkripcionu obradu transkribovane RNK i/ili eksport transkribovanog RNK molekula iz ćelijskog jezgra u citoplazmu. Nakon post-transkripcione obrade transkribovanog RNK molekula, lider sekvenca može biti zadržana kao deo konačne mesindžer RNK i moe pozitivno uticati na translaciju mesindžer RNK molekula.
Regulatorni elementi kao što su promoteri, lideri, introni i transkripcioni terminalni regioni (ili 3’ UTR-ovi) su DNK molekuli koji imaju gensku regulatornu aktivnost i igraju integralnu ulogu u sveukupnoj ekspresiji gena u živim ćelijama. Pojam „regulatorni element“ upućuje na DNK molekul koji ima gensku regulatornu aktivnost, odnosno, onaj koji ima sposobnost da utiče na transkripciju i/ili translaciju radno povezanog transkriptabilnog polinukleotid molekula. Izolovani regulatorni elementi, kao što su promoteri i lideri koji funkcionišu u biljkama su prema tome korisni za modifikovanje fenotipova biljke kroz postupke genetskog inžinjeringa.
Regulatorni elementi mogu biti karakterisani dejstvima njihovog obrazca ekspresije (kvalitativno i/ili kvantitativno), na primer, pozitivnim i negativnim dejstvima i/ili konstitutivni ili drugim dejstvima kao što je to po njihovom vremenskom, prostornom, razvojnom, tkivnom, prema okruženju, fiziološkom, patološkom, u vezi sa ćelijskim ciklusom, i/ili hemijskim odzivom obrazca ekspresije, i bilo koje od tih kombinacija, kao i po kvantitativnim ili kvalitativnim indikacijama. Promoter je koristan kao regulatorni element radi moduliranja ekspresije radno povezanog transkriptabilnog polinukleotid molekula.
Kako se to ovde koristi, „obrazac ekspresije gena“ je bilo koji obrazac transkripcije radno povezanog DNK molekula u transkribovani RNK molekul. Transkribovani RNK molekul može biti preveden da proizvede molekul proteina ili može da obezbedi antisens ili drugi regulatorni RNK molekul, kao što su dsRNK, tRNK, rRNK i miRNK.
Kako se to ovde koristi, pojam „ekspresija proteina“ je bilo koji obrazac translacije transkribovanog RNK molekula u molekul proteina. Ekspresija proteina može biti karakterisana svojim vremenskim, prostornim, razvojnim ili morfološkim kvalitetima kao kvantitativnim ili kvalitativnim indikacijama.
Kako se to ovde koristi, pojam „promoter“ generalno upućuje na DNK molekul koji je uključen u prepoznavanje i vezivanje RNK polimeraze II i drugih proteina (trans-delujućih transkripcionih faktora) da se inicira transkripcija. Promoter može biti inicijalno izolovan iz 5’ neprevedenog regiona (5’ UTR) genomske kopije gena. Alternativno, promoteri mogu biti sintetički proizvedeni ili manipulisani DNK molekuli. Promoteri mogu takođe biti himerni, tačniej promoter proizveden kroz spajanje dva ili više heterologa DNK molekula. Promoteri korisni u praksi sadašnjeg pronalaska uključuju SEQ ID NO: 28 ili njen fragmente ili varijante. U specifičnim realizacijama ovog pronalaska, takvi molekuli i bilo koje njihove varijante ili derivati kako su ovde opisani, su dalje definisani ka oni koji sadrže promoter aktivnost, odnosno, koji su sposobni da rade kao promoter u ćeliji domaćina, kao što je to u transgenoj biljci. U još dalji specifičnim realizacijama, fragment može biti definisan da prikazuje promoter aktivnost koju poseduje početni promoter molekul iz koga je izveden, ili fragment moeć sadržati „minimalni promoter“ koji obezbeđuje osnovni nivo transkripcije i sastoji se od TATA boksova ili ekvivalentne sekvence za prepoznavanje i vezivanje RNK polimeraza II kompleksa radi iniciranja transkripcije.
U jednoj realizaciji fragmenti su dati kao promoter sekvenca koja je ovde opisana. Promoter fragmenti mogu imitai promoter aktivnost, kako je u gornjem tekstu opisano, i mogu biti korisni sami ili u kombinaciji sa drugim promoterima i promoter fragmentima, kao što je to u konstruisanju himernih promotera. U specifičnim realizacijama, fragmenti promotera su dati da sadrže bar 500, 750 ili bar 1000 susednih nukleotida, ili duže, polinukleotidnog molekula koji ima promoter aktivnost koja je ovde opisana.
Kompozicije izvedene iz bilo kog od promotera predstavljenog kao SEQ ID NO: 28, kao što su interna ili 5’ delecije, mogu biti proizvedene korišćenjem poznatih postupaka u nauci kako bi se poboljšala ili izmenila ekspresija, uključujući uklanjanje elemenata koji imaju bilo pozitivna ili negativna dejstva na ekspresiju; dupliciranje elemenata koji imaju potivna ili negativna dejstva na ekspresiju; i/ili dupliciranje ili uklanjanje elemenata koji imaju specifična dejstva na ekspresiju u tkivu ili čeliji. Kompozicije izvedene iz bilo kog od promotera predstavljenog kao SEQ ID NO: 28 koje se sastoje od 3’ delecija u kojima se TATA boks element ili njegova ekvivalentan sekvenca i nizvodna sekvenca uklanjaju se mogu koristiti, naprimer, da se naprave pojačivači. Dalja brisanja mogu biti učinjena da se uklone bilo koji elementi koji imaju potivina ili negativna; tkivo specifična; ćelijski specifična; ili vremenski specifična (kao što su, ali ne i ograničena na, biološki ritmovi) dejstva na ekspresiju. Bilo koji od promotera predstavljen kao SEQ ID NO: 28 i pojačivači izvedeni iz njih mogu biti korišćeni da se naprave kompozicije himernog transkripcionog regulatornog elementa koje se sastoje od bilo kog od promotera predstalvjenog kao SEQ ID NO: 28 i pojačivača izvedenih iz njih radno povezanih za druge pojačivače i promotere. Efikasnost ovde opisanih modifikacija, duplikacija i delecija na željene aspekte ekspresije određenog transgena mogu biti testirane empirijski u ogledima stabilne i prolazne biljke, kao što su oni opisani u ovde datim radnim primerima, kako bi se vilidirali rezultati, koji mogu da variraju u zavisnosti od učinjenih promena i cilja promena u početnom molekulu.
Kako se to ovde koristi, pojam „lider“ upućuje na DNK molekul izolovan iz neprevedenog 5’ regiona (5’ UTR) genomske kopije gena i generalno definisan kao nukleotid segment između transkripcionog početnog položaja (TSS) i početnog položaja sekvence koja kodira protein. Alternativno, lideri mogu biti sintetički proizvedeni ili manipulisani DNK elementi. Lider može da se koristi kao 5’ regulatorni element za moduliranje ekspresije radno povezanog transkriptabilnog polinukleotid molekula. Lider molekuli mogu biti korišteni sa heterologim promoterom ili sa njegovim matičnim promoterom. Promoter molekuli sadašnjeg pronalaska mogu tako biti radno povezani za nijoh matični lider ili mogu biti radno povezani za heterologi lider. Lideri korisni u praksi sadašnjeg pronalaska uključuju SEQ ID NO: 20 ili njene varijante. U specifičnim realizacijama, takve sekvence mogu biti obezbeđene definisane kao sposobne da rade kao lider u ćeliji domaćinu, uključujući, na primer, ćeliju transgene biljke. U jednoj realizaciji takve sekvence su dekodirane kao one koje imaju lider aktivnost.
Lider sekvence (5’ UTR) predstavljene sa SEQ ID NO: 20 mogu se sastojati od regulatornih elemenata ili mogu prisvojiti sekundarne strukture koje imaju dejstvo na transkripciju ili translaciju transgena. Lider sekvence predstavljene kao SEQ ID NO: 20 mogu biti korišćeene u skladu sa ovim pronalaskom kako bi se napravili himerni regulatorni elementi koji utiču na transkripciju ili translaciju transgena. Dodatno tome, lider sekvence predstavljene kao SEQ ID NO: 20 mogu biti korišćene da se naprave himerne lider sekvence koje utiču na transkripciju ili translaciju transgena.
Uvođenje stranog gena u novu biljku domaćina ne rezultira uvek u visokoj ekspresiji dolaznog gena. Šta više, ukoliko se radi sa kompleksnim osobinama, ponekad je neophodno modulirati nekoliko gena sa prostorno ili vremenski različitim obrazcem ekspresije. Introni u principu mogu da obezbede takvu modulaciju. Ipak za višestruko korišćenje istog introna u jednoj biljci je pokazano da prikazuje nedostatke. U ovim slučajevima je neophodno da se ima kolekcija baznih kontrolnih elemenata za konstrukciju odgovarajućih rekombinantnih DNK elemenata. Kako je dostupna kolekcija introna poznatih u nauci sa pojačanim osobinama ekspresije limitirana, neophodne su alternative.
(0043) Kompozicije izvedene iz bilo kog od introna predstaljenih kao SEQ ID NO: 24 mogu se sastojati od internih delecija ili duplikacija cis regulatornih elemenata; i/ili prepravke 5’ i 3’ sekvenci koje sadrže intron/ekson razvodni splet mogu biti iskorišćene da se poboljša ekspresija ili specifičnost ekspresije kada su radno povezane za promoter lider ili himerni promoter lider i kodirajuću sekvencu. Prepravke 5’ i 3’ regiona koje sadrže intron/ekson razvodni splet mogu takođe biti učinjene da smanje potencijal za uvođenje lažnih kodona započinjanja i zaustavljanja koji se proizvode u rezultirajućem transkriptu nakon obrade i spajanja mesindžer RNK. Introni mogu biti testirani empirijski kako je opisano u radnim primerima kako bi se utvrdilo dejstvo introna na ekspresiju transgena.
U skladu sa ovim pronalaskom promoter ili promoter fragment mogu biti analizirani na prisustvo poznatih elemenata promotera, odnosno, karakteristike DNK sekvence, kao što su TATA-boks i ostale poznati motivi transkripcionog faktora za položaj vezivanja. Identifikacija takvih poznatih elemenata promotera mogu biti upotrebljeni od strane stručnjaka iz ove oblasti nauke kako bi dizajnirao varijante promotera koji ima sličan obrazac ekspresije kao originalni promoter.
Kako se to ovde koristi pojam „pojačivač“ ili „pojačivački element“ upućuje na cis-radni transkripcioni regulatorni element, ili ti cis-element, koji dodeljuje aspekt sveukupnog obrazca ekspresije, ali je uobičajeno nedovoljan sam da pokrene transkripciju radno povezane polinukleotid sekvence. Za razliku od promotera, pojačivački elementi uobičajeno ne uključuju traskripcioni početni položaj (TSS) ili TATA boks ili ekvivalentnu sekvencu. Promoter može prirodno da sadrži jedan ili više pojačivačkih elemenata koji utiču na transkripciju radno povezane sekvence polinukleotida. Izolovani pojačivački element može takođe biti spojen za promoter kako bi proizveo himerni promoter cis-element, koji dodeljuje aspekt sveukupne modulacije genske ekspresije. Promoter ili promoter fragment mogu da sadrže jedan ili više pojačivačkih elemenata koji utiču na transkripciju radno povezanih gena. Za mnoge element pojačivača promotera se veruje da vezuju DNK-vezujuće proteine i/ili utiču na DNK topologiju, proizvodeći lokalne konformacije koje selektivno dopuštaju ili ograničavaju pristup RNK polimeraze DNK šablonu ili koje olakšavaju selektivno otvaranje dvostruke spirale na položaju transkripcione inicijacije. Pojačivački element može da funkcioniše tako što vezuje faktore transkripcije koji regulišu transkripciju. Neki pojačivački elementi vezuju više od jednog faktora transkripcije, i faktori transkripcije mogu da međusobno reaguju sa različitim afinitetima sa više od jednog pojačivačkog domena. Pojačivački elementi mogu biti identifikovani brojnim tehnikama, uključujući analizu brisanja, odnosno deleciju jednog ili više nukleotida sa 5’ kraja interno ka promoteru; analizu DNK vezujućeg proteina korišćenjem Dnase I otiskivanja, ometanje metilacijom, oglede promene mobilnosti elektroforezom, in vivo genomsko otiskivanje putem vezivanjemposredovanog PCR, i druge konvencionalne oglede; ili putem analize sličnosti DNK sekvence korišćenjem poznatih cis-element motiva ili pojačivačkih elemenata kao ciljane sekvence ili ciljanog motiva sa konvencionalnim postpcima upoređivanja DNK sekvence, kao što je to BLAST. Fina struktura pojačivačkog domena može dalje biti proučavana mutagenezom (ili supstitucijom) jednog ili više nukleotida ili drugim konvencionalnim postupcima. Pojačivački elementi se mogu dobiti hemijskom sintezom ili izolovanjem iz regulatornih elemenata koji uključuju takve elemente, i mogu biti sintetisani sa dodatnim nukleotidima flankiranja koji sadrže korisne položaje restrikcije enzima kako bi se olakšala manipulacija subsekvence. Tako su, dizajn, konstrukcija i korišćenje pojačivačkih elemenata prema postupcima koji su ovde otkriveni za moduliranje ekspresije radno poveznih transkriptabilnih polinukleotid molekula takođe obuhvaćeni sadašnjim pronalaskom.
Kod biljaka, uključivanje nekih introna u konstrukte gena vodi do povećane mRNK i akumulacije proteina u odnosu na konstrukte kojima nedostaje intron.
Ovo dejstvo je nazvano „intronom posredovano pojačavanje“ (IME) ekspresije gena (Mascarenhas et al., (1990) Plant Mol. Biol.15:913-920). Introni za koje se zna da stimulišu ekspresiju u biljkama su identifikovani u genima kukuruza (n.pr. tubA1, Adh1, Sh1, Ubi1 (Jeon et al. (2000) Plant Physiol. 123:1005-1014; Callis et al. (1987) Genes Dev. 1:1183-1200; Vasil et al. (1989) Plant Physiol. 91:1575-1578; Christiansen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689) i u genima pirinča (n.pr., so, tpi: McElroy et al., Plant Cell 2:163-171 (1990); Xu et al., Plant Physiol. 106:459-467 (1994)). Na sličan način, za introni iz gena dikotiledonih biljaka kao što su oni iz petunije (n.pr. rbcS), krompira (n.pr., st-1s1) i iz Arabidopsis thaliana (n.pr., ubq3 i pat1) je pronađeno da povišuju brzine ekspresije gena (Dean et a., (1989) Plant Cell 1:201-208; Leon et al. (1991) Plant Physiol.95:968-972; Norris et al. (1993) Plant Mol Biol. 21:895-906; Rose and Last (1997) Plant J. 11:455-464). Pokazano je da delecije ili mutacije u okviru položaja uplitanja introna smanjuje ekspresiju gena, ukazujući da je uplitanje može biti potrebno za IME (Mascarenhas et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:913-920; Clancy and Hannah (2002) Plant Physiol. 130:918-929). Ipak, da uplitanje samo po sebi se ne zahteva za određene IME u dikotiledonim biljkamaje pokazano tačkom mutacija u okviru položaja uplitanja pat1 gena iz A. thaliana (Rose and Beliakoff (2000) Plant Physiol.122:535-542).
Pojačavanje ekspresije gena intronima nije generalni fenomen pošto neka umetanja introna u rekombinantne kasete ekspresije ne uspevaju da pojačaju ekspresiju (n.pr., introni iz dikot gena (rbcS gen graška, fazeolin gen iz pasulja i stls-1 gen iz Solanum tuberosum) i introni iz gena kukuruza (adh1 gen deveti intron, hsp81 gen prvi intron)) (Chee et al., (1986) Gene 41:47-57; Kuhlemeier et al., (1988) ol Gen Genet 212:405-411; Mascarenhas et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:913-920; Sinibaldi and Mettler (1992) u WE Cohn, K Moldave, eds, Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, Vol 42, Academic Press, New York, pp 229-257; Vancanneyt et al.1990 Mol. Gen. Genet.220:245-250). Prema tome, neće svaki intron biti uposlen da bi se manipulisalo novoom ekspresije gena ne-endogenih gena ili endogenih gena u transgenim biljkama. Koje karakteristike ili specifične osobine sekvence moraju biti prisutne u intron sekvenci kako bi pojačala brzinu ekspresije datog gena nije poznato u stanju tehnike pa prema tome iz stanja tehnike nije moguće predvideti da li će dati intron biljke, kada se koristi heterologo, izazvati pojačavanje ekspresije na DNK nivou ili na nivou transkripta (IME).
Kako se to ovde koristi, pojam „himerni“ upućuje na jedan DNK molekul proizveden spajanje prvog DNK molekula za drugi DNK molekul, gde ni privi ni drugi DNK molekul ne bi normalno bili pronađeni u toj konfiguraciji, odnosno spojeni jedan za drugog. Himerni DNK molekul je tako novi DNK molekul koji se inače normalno ne može naći u prirodi. Kako se to ovde koristi, pojam „himerni promoter“ upućuje na promoter proizveden kroz takvu manipulaciju DNK molekula. Himerni promoter može kombinovati dva ili više DNK fragmenta; primer bi bio spajanje promotera za pojačivački element. Tako su, dizajn, konstrukcija i korišćenje himernih promotera prema postupcima koji su ovde otkriveni za moduliranje ekspresije radno povezanih transkriptabilnih polinukleotid molekula obuhvaćeni sadašnjim pronalaskom.
Kako se to ovde koristi, pojam „varijanta“ upućuje na drugi DNK molekul koji je po kompoziciji (sastavu) sličan, ali ne identačan, sa prvim DNK molekulom pa ipak drugi DNK molekul i dalje zadržava generalnu funkcionalnost, odnosno isti ili sličan obrazan ekspresije, prvog DNK molekula. Varijanta može biti kraća ili okrnjena verzija prvog DNK molekula i/ili izmenjena verzija sekvence prvog DNK molekula, kao što je ona sa različitim položajima restrikcije enzima i/ili internim delecijama, supstitucijama i/ili umetanjima. „Varijanta“ može takođe da obuhvati regulatorni element koji ima sekvencu nukleotida koja sadrži supstituciju, deleciju i/ili umetanje jednog ili više nukleotida referentne sekvence, pri čemu izvedeni regulatorni element ima više ili manje ili jednako transkripcione ili translacione aktivnosti od korespondirajućeg matičnog regulatornog molekula. „Varijante“ regulatornog elementa takođe obuhvataju varijante koje proističu iz mutacija do kojih prirodno dolazi u transformaciji bakterijske ili biljne ćelije. U sadašnjem pronalasku, sekvenca polinukleotida data kao SEQ ID NOs: 27 i 28 mogu biti korišćene da se kreiraju varijante koje su po sastavu slične, ali ne i identične, sa sekvencom polinukleotida originalnog regulatornog elementa, dok istovremeno zadržava generalnu funkcionalnost, odnosno isti ili sličan obrazac ekspresije, originalnog regulatornog elementa. Proizvodnja takvih varijanti sadašnjeg pronalaska je u okviru znanja stručnjaka iz ove oblasti nauke u svetlu otkrića i obuhvaćena je sadašnjim pronalaskom. „Varijante“ himernog regulatornog elementa sadrže iste konstitutivne elemente kao referentna sekvenca ali konstitutivni elementi koji sadrže himerni regulatorni element mogu biti radno povezani različitim postupcima poznatim u nauci kao što su, varenje i vezivanje restrikconog enzima, vezivanje nezavisnog kloniranja, mokularno sklapanje PCR proizvoda tokom pojačavanja, ili direktna hemijska sinteza regulatornog elementa kao i drugi postupci poznati u nauci. Rezultirajuća „varijanta“ himernog regulatornog elementa može se sastojati od istih, ili varijanti istih, konstitutivnih elemenata referentne sekvence ali se razlikovati u sekvenci ili sekvencama koje sadrže sekvencu ili sekvence povezivanja koje dopuštaju konstitutivnim delovima da budu radno povezani. U sadašnjem pronalasku, sekvenca polinukleotida kao što su SEQ ID NOs: 27 i 28 daje referentnu sekvencu pri čemu konstitutivni elementi koje sadrži referentna sekvenca mogu biti praćeni postupcima poznatim u nauci i mogu sadržati supstitucije, delecije i/ili umetanja jednog ili više nukleotida ili mutacija koje prirodno nastaju transformacijom bakterijske ili biljne ćelije.
Konstrukti
Kako se to ovde koristi, pojam „konstrukt“ znači bilo koji rekombinantni polinukleotid molekul kao što su plazmid, kozmid, virus, autonomno replicirajući polinukleotid molekul, faga ili linearni ili kružni jednostruko-lančani ili dvostruko-lančani DNK ili RNK polinukleotid molekul, izvedeni iz bilo kog izvora, sposobni za genomsku integraciju ili autonomnu replikaciju, koji sadrži polinukleotid molekul gde je jedan ili više polinukleotid molekula povezan na funkcionalno radni način, odnosno, radno povezan. Kako se to ovde koristi, poja „vektor“ znači bilo koji rekombinantni polinukleotid konstrukt koji se može koristiti u svrhu transformacije, odnosno uvođenje heterologe DNK u ćeliju domaćina. Pojam uključuje ekspresionu kasetu izolovanu iz bilo kog od prethodno pomenutih molekula.
Kako se to ovde koristi, pojam „radno povezan“ upućuje na prvi molekul spojen sa drugim molekulom, pri čemu su molekuli raspoređeni na takav način da prvi molekul utiče na funkciju drugog molekula. Dva molekula mogu ili mogu da ne budu deo jednog graničnog molekula i mogu ili mogu da ne budu susedni. Na primer, promoter je radno povezan za transkriptabilni polinukleotid molekul ukoliko promoter modulira transkripciju transkriptabilnog polinukleotid molekula od interea u ćeliji. Lider, na primer, je radno povezan za kodirajuću sekvencu kada je sposoban da služi ka lidier polipeptida kodiranog od strane skevence kodiranja.
Konstrukti sadašnjeg pronalaska mogu biti dati, u jednoj realizaciji, kao dvostruki Ti plazmid granični DNK konstrukti koji imaju regione desne granice (RB ili AGRtu.RB) i leve granice (LB ili AGRtu.LB) Ti plazmida izolovane iz Agrobacterim tumefaciens koja sadrži T-DNK, koji zajedno sa transfer molekulom datom od strane A. tumefaciens ćelija, dopuštaju integraciju T-DNK u genom ćelije biljke (videti, na primer, US Patent 6,603,061). Konstrukti mogu takođe da sadrže segmente plazmid kičme DNK koji obezbeđuju funkciju replikacije i antibiotičku selekciju bakterijskih ćelija, na primer, Escherichia coli porekla replikacije kakva je ori322, porekla širokog raspona domaćina replikacije kakkve su oriV ili oriRi, i kodirajući region za selektabilni marker kakav je Spec/Strp koji kodira za Tn7 aminoglukozid adeniltransferazu (aadA) dodeljujući otpornost na spektinomicin ili streptomicin, ili gentamicin (Gm, Gent) selektabilne marker gene. Za transformaciju biljke, bakterijski soj domaćina je često A. tumefaciens ABI, C58 ili LBA4404; ipak, i drugi sojevi poznati stručnjacima iz ove oblasti nauke o transformaciji biljaka mogu da funkcionišu u sadašnjem pronalasku.
Poznati su postupci u nauci za sklapanje i uvođenje konstrukata u ćeliju na takav način da se transkriptabilni polinukleotid molekul transkribuje u funkcionalni mRNK molekul koji se prevodi i ekspresuje kao protein proizvod. Radi praktikovanje sadašnjeg pronalaska, konvencionalne kompozicije i postupci pripremanja i korišćenja konstrukata i ćelija domaćina su dobro poznati stručnjaku iz ove oblasti nauke, videti, na primer, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition Volumes 1, 2, and 3 (2000) J. Sambrook, D.W. Russel, and N. Irwin, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Postupci pravljenja rekombinantnih vektora koji su posebno pogodni za transformaciju biljke uključuju one opisane u U.S. Patent No.
4,971,908; 4,940,835; 4,769,061; i 4,757,011. Ovi tipovi vektora su takođe pregledani u naučnoj literaturi (videti, na primer, Rodrigueq, et al., Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston, (1988) i Glick, et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton, Fl. (1993)). Tipični vektori korisni za ekspresiju nukleinskih kiselina kod viših biljaka su dobro poznati u nauci i uključuju vektore izvedene iz tumor-izazivajućeg (Ti) plazmida Agrobacterium tumefaciens (Rogers, et al, Methods in Enzymology 153: 253-277 (1987)). Drugi rekombinantni vektori korisni za transformaciju biljke, uključujući pCaMVCN vektor transfera kontrole, su takođe opisani u naučnoj literaturi (videti, na primer, Fromm, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5824-5828 (1985)).
Različiti regulatorni elementi mogu biti uključeni u konstrukt uključujući bilo koji od onih koji su ovde dati. Svaki takav regulatorni element može biti dat u kombinaciji sa drugim regulatornim elementima. Takve kombinacije mogu biti dizajnirane ili modifikovane da proizvedu poželjne regulatorne karakteristike. U jednoj realizaciji, konstrukti sadašnjeg pronalaska sadrže bar jedan regulatorni element radno povezan za transkriptabilni polinukleotid molekul operativno povezan za 3’ UTR.
Konstrukti sadašnjeg pronalaska mogu da uključe bilo koji promoter ili lider koji je ovde dat ili je poznat u nauci. Na primer, promoter sadašnjeg pronalaska može biti radno povezan za heterologi ne-prevedeni 5’ lider kao što je to onaj izveden iz gena toplotni udar proteina (videti, na primer, U.S. Patent No. 5,659,122 i 5,362,865). Alternativno, lider sadašnjeg pronalaska može biti radno povezan za heterologi promoter kao što je transkript promoter Mozaik Virus 35S karfiola (videti, U.S. Patent No.5,352,605).
Kako se to ovde koristi, pojam „intron“ upućuje na DNK molekul koji može biti izolovan ili identifikovan iz genomske kopije gena i može biti generalno definisan kao region upleten tokom obrade mRNK pre translacije. Alternativno, intron može biti sintetički proizveden ili manipulisani DNK element. Intron može da sadrži pojačivačke elemente koji utiču na transkripciju radno povezanih gena. Intron može da se koristi kao regulatorni element za moduliranje ekspresije radno povezanog transkriptabilnog polinukleotid molekula. DNK konstrukt može da sadrži intron, i intron može ili ne mora da bude heterologi u odnosu na sekvencu transkriptabilnog polinukleotid molekula. Primeri introna u nauci uključuju pirinčani aktin intron (U.S. Patent No. 5,641,876) i HSP70 intron kukuruza (U.S. Patent No.
5,859,347). Introni korisni u praktikovanju sadašnjeg pronalaska uključuju SEQ ID NO:24. Dalje, kada se modifikuju intron/ekson granične sekvence, može biti poželjno da se izbegne korišćenje nukleotidne sekvence AT ili nukleotida A neposredno pre 5’ kraja položaja uplitanja (GT) i nukleotida G ili nukleotidne sekvence TG neposredno nakon 3’ kraja položaja uplitanja (AG) da se eliminiše potencijalni neželjeni početak formiranja kodona tokom obrade mesindžer RNK u konačni transkript. Sekvenca oko položaja uplitanja čvora 5’ i 3’ krajeva introna tako može biti modifikovana na ovaj način.
Kako se to ovde koristi, pojam „3’ molekul prekida transkripcije“ ili „3’ UTR“ upućuje na DNK molekul koji se koristi tokom transkripcije da se proizvede 3’ neprevedeni region (3’ UTR) mRNK molekula. 3’ neprevedeni region mRNK molekula može biti generisan specifičnim cepanjem i 3’ poliadenilacijom, odnosno poliA repom. 3’ UTR može biti radno povezan za i lociran nizvodno od transkriptablinog polinukleotid molekula i može da uključi polinukleotide koji daju signal poliadenilacije i druge regulatorne signale sposobne da utiču na transkripciju mRNK obrade ili na ekspresiju gena. Za poliA repove se smatra da funkcionišu u mRNK stabilnosti i u inicijaciji translacije (prevođenja). Primeri 3’ molekula prekida transkripcije u nauci su nopalin sintaza 3’ region (viddeti, Fraley, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 4803-4807 (1983); pšenični hsp17 3’ region; region rubisco male podjedinice 3’ graška; E6 3’ region pamuka (U.S. Patent 6,096,950); 3’ regioni otkriveni u WO0011200A2; i coixin 3’ UTR (U.S. Patent No.6,635,806).
3’ UTR-ovi se tipično na koristan način koriste za rekombinantnu ekspresiju specifičnih gena. U životinjskim sistemima, mašinerija 3’ UTR-ova je vrlo dobro definisana (n.pr., Zhao et al., Microbiol Mol Biol Rev 63:405-445 (1999); Proudfoot, Nature 322:562-565 (1986); Kim et al., Biotechnology Progress 19:1620-1622 (2003); Yonaha and Proudfoot, EMBO J.19:3770-3777 (2000); Cramer et al., FEBS Letters 498:179-182 (2001); Kuerstem and Goodwin, Nature Reviews Genetics 4:626-637 (2003)). Efektivan prekid RNK transkripcije se zahteva da se spreči neželjena transkripcija sekvenci sa neželjenim svojstvima(nizvodno), koja može da se umeša izvođenjem takvog svojstva. Raspored kaseta za višestruku ekspresiju gena u lokalno blizu jedan drugoj (n.pr., u okviru jedne T-DNK) može da izazove potiskivanje (supresiju) genske eksprecije jednog ili više gena u navedenom konstruktu u poređenju sa nazavisnim umetcima (Padidam and Cao, BioTechniques 31:328-334 (2001)). Ovo može da ometa postizanje adekvatnih nivoa ekspresije, na primer u slučajevima gde se želi jaka ekspresija gena iz svih kaseta.
Kod biljaka, jasno definisane sekvence signala poliadenilacije nisu poznate. Hasegawa et al., Plant J. 33:1063-1072, 2003) nije bio u stanju da identifikuje sekvence sa konzervisanim signalom poliadenilacije kako u in vitro tako i u in vivo sistemima u Nicotiana sylvestris i da utvrdi stvarnu dužinu primarnog (ne-poliadenilovanog) transkripta. Slab 3’ UTR ima potencijal da generiše iščitavanje, što može da utiče na ekspresiju gena lociranih u susednim ekspresionim kasetama (Padidam and Cao, BioTechniques 31:328-334 (2001)). Odgovarajuća kontrola prekida transkripcije može da spreči iščitavanje u sekvencama (n.pr., drugim ekspresionim kasetama) lokalizovanim nizvodno i može dalje da dopusti efikasno recikliranje RNK polimeraze, kako bi poboljšala ekspresiju gena. Efikasan prekid transkripcije (oslobađanje RNK Polimeraze II od DNK) je prethodan uslov za re-inicijaciju transkripcije i prema tome direktno utiče na sveukupni nivo transkripta. Nakon prekida transkripcije, zrela mRNK se oslobađa sa položaja sinteze i šablon odlazi u citoplazmu. Eukariotske mRNKs se akumuliraju kao poli(A) oblici in vivo, tako da je teško detektovati položaje transkripcionog prekida konvencionalnim postupcima. Ipak, predviđanje funkcionalnosti i efikasnosti 3’ UTR-ova bioinformatičkom postupcima je teško zbog toga što nema konzerviranih sekvenci koji bi dopustile lako predviđanje efektivnog 3’ UTR.
Sa praktičnog stanovišta, tipično je korisno da 3’ UTR koji se koristi u transgenoj kaseti poseduje sledeće karakteristike. 3’ UTR treba da bude sposoban da efikasno i efektivno prekine transkripciju transgena i spreči iščitavanje transkripta u bilo kojoj susednoj DNK sekvenci koja može da se sadrži u drugoj transgenoj kaseti kao što je to u slučaju višestrukih kaseta koje su smeštene u jednoj T-DNK, ili susednoj hromozomskoj DNK u koju je T-DNK umetnut. 3’ UTR ne treba da izazove redukciju u transkripcionoj aktivnosti saopštenoj od strane promotera, lidera ili introna koji se koriste da se vodi ekspresija transgena. U biotehnologiji biljaka, 3’ UTR se često koristi za prajmovanje reakcija amplifikacije reversne transkribovane RNK ekstrakovane iz transformisane biljke i koristi se da (1) proceni transkripcionu aktivnost ili ekspresiju transgene kasete jednom kada se integriše u hromozom biljke; (2) proceni broj komipa umetanja u okviru DNK biljke; i (3) proceni zigocitet rezultirajućeg semena nakon uzgajanja. 3’ UTR se takođe koristi u reakcija amplifikacije DNK ekstrakovanih iz transformisane biljke da karakteriše netaknutost umetnute kasete.
3’ UTR-ovim korisni u obezbeđivanju ekspresije transgena u biljke mogu biti identifikovani na osnovu ekspresije ekspresovanih oznaka sekvence (EST-ovi) u cDNK bibliotekama sačinjenim od mesindžer RNK izolovane iz semena, cveta i drugih tkiva izvedenih iz andropogona (Andropogon gerardii), šećerne trske (Saccharum ravennae (Erianthus ravennae)), zelenog muhara (Setaria viridis), zee (Zea mays podvrsta mexicana), italijanskog prosa (Setaria italica), ili jovove suze (Coix lacryma-jobi). Biblioteke cDNK su učinjene iz tkiva izolovanog od selektiranih vrsta biljaka korišćenjem postupaka poznatih stručnjacima iz ove oblasti nauke iz tkiva cveta, semena, lista i korena. Rezultirajuće cDNK su sekvencirane korišćenjem različitih postupak sekvenciranja poznatih u nauci. Rezultirajući EST-ovi su sakupljeni u klastere (grupe) korišćenjem bioinformatičkog softvera kao što je clc_ref_assemble_complete version 2.01.37139 (CLC bio USA, Cambridge, Massachusetts 02142). Zastupljenost transkripta svakog klastera se utvrđuje računanjem broja cDNK čitanja za svaki klaster. Identifikovani 3’ UTR-ovi mogu se sastojati od sekvence izvedene iz cDNK sekvence kao i iz sekvence izvedene iz genomske DNK. cDNK sekvenca se koristi da se dizajniraju prajmeri, koji se onda koriste sa Genome Walker<TM>(Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA) bibliotekama konstruisanih sledećim proizvođačkim protokolom da se klonira 3’ region korespondirajuće genomske DNK sekvence da se obezbedi duža sekvenca prekida. Analiza relativne zastupljenosti transkripta bilo direktnim računanjem ili normalizovanim računanjem primećenih čitanja sekvence za svaku biblioteku tkiva može biti korišćeno da se izvede zaključak o osobinama svih obrazaca ekspresije. Na primer, neki 3’ UTR-ovi mogu biti pronađeni u transkriptima koji se vide u višoj zastupljenosti u tkviu korena nasuprot listu. Ovo sugeriše da je trankript krajnje ekspresovan u korenu i da osobine expresije u korenu mogu biti pridavane transkripcionoj regulatiji promotera, lidera, introna ili 3’ UTR. Empirijsko testiranje 3’ UTR-ova identifikovanih osobinama ekspresije u specifičnim organima, tkivima ili tipovima ćelija može da rezultira u identifikaciji 3’ UTR-ova koji pojačavaju ekspresiju u tim specifičnim organima, tkivima ili tipovima ćelija.
Konstrukti i vektori mogu takođe da uključe kodirajuću sekvencu tranzitnog peptida koji vrši ekspresiju povezanog peptida koji je koristan za targetiranje (ciljanje) protein proizvoda, posebno posebno u hloroplastu, leukoplastu, ili drugim plastid organelama; mitohondriji; peroksizomu; vakuoli; ili ekstracelularnoj lokaciji. Za opise korišćenja hloroplast tranzitnih peptida, videti U.S. Patent No. 5,188,642 i U.S. Patent No. 5,728,925. Mnogi hloroplastlokalizovani proteini se ekspresuju iz nuklearnih gena kao prekursori i usmereni su na hloroplast hloroplast tranzitnim peptidom (CTP). Primeri tako izolovanih hloroplast proteina uključuju one povezane sa malim podjedinicama (SSU) ribuloza-1,5,-bisfosfat karboksilaze, feredoksina, feredoksin oksidoreduktaze, kompleksa žetve svetlosti protein I i protein II, tioredoksina F, enolpiruvil šikimat fosfat sintaze (EPSPS), i tranzitnih peptida opisanih u U.S. Patent No.7,193,133. Demonstrirano je in vivo i in vitro da ne-hloroplast proteini mogu biti usmereni ka hloroplastu korišćenjem fuzija (spajanja) proteina sa heterologim CTP a da je CTP dovoljan da usmeri protein ka hloroplastu. Za inkorporaciju odgovarajućeg hloroplast tranzitnog peptida kao što su Arabidopsis thaliana EPSPS CTP (CTP2) (Videti, Klee et al., Mol. Gen. Genet. 210:437-442 (1987) ili Petunia hybrida EPSPS CTP (CTP4) (Videti, della-Cioppa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6873-6877 (1986)) je pokazano da usmerava heterologe EPSPS protein sekvence ka hloroplastima u transgenim biljkama (Videti, U.S. Patent Nos. 5,627,061; 5,633,435; i 5,312,910 i EP 0218571; EP 189707; EP 508909; i EP 924299).
Transkriptabilni polinukleotid molekuli
Kako se to ovde koristi, pojam „transkriptabilni polinukleotid molekul“ upućuje na bilo koji DNK molekul sposoban da bude transkribovan u RNK molekul, uključujući, ali ne ograničavajući na, one koji imaju kodirajuću sekvencu proteina i one koji proizvode RNK molekule koji imaju sekvence korisne za supresiju (potiskivanje) gena. „Transgen“ upućuje na transkriptabilni polinukleotid molekul heterolog za ćeliju domaćina bar u pogledu njegove lokacije u genomu i/ili transkriptabilni polinukleotid molekul veštački inkorporisan u genom ćelije domaćina u trenutnoj i prethodnoj generacijei ćelije.
Promoter sadašnjeg pronalaska može biti radno povezan za transkriptabilni polinukleotid molekul koji je heterolog u vezi sa promoter molekulom. Kako se to ovde koristi, pojam „heterolog“ upućuje na kombinaciju dva ili više polinukleotid molekula kada se takva kombinacije normalno ne može naći u prirodi. Na primer, dva molekula mogu biti izvedena iz različitih vrsta i/ili dva molekula mogu biti izvedena iz različitih gena, n.pr., različitih gena iste vreste ili istih gena različitih vrsta. Promoter je tako heterolog u vezi sa radno povezanim transkriptabilnim polinukleotid molekulom ukoliko se takva kombinacije normalno ne nalazi u prirodi, odnosno da transkriptabilni polinukleotid molekul ne nastaje prirodno radno povezan u kombinaciji sa tim promoter molekulom.
Transkriptabilni polinukleotid molekul može generalno biti bilo koji DNK molekul za koji je ekspresija RNK transkripta željena. Takva ekspresija RNK transkripta može biti rezultat translacije rezultirajućeg mRNK molekula i tako ekspresije proteina. Alternativno, na primer, transkriptabilni polinukleotid molekul može biti dizajniran da konačno izazove smanjenje ekspresije specifičnog gena ili proteina. U jednoj realizaciji, ovo može biti postignuto korišćenjem transkriptabilnog polinukleotid molekula koji je orijentisan u antisens pravcu. Stručnjak iz ove oblasti nauke je upoznat sa korišćenjem takve antisens tehnologije. Ukratko, kako je antisens transkriptabilni polinukleotid molekul transkribovan, RNK proizvod hibridizuje i sekvestira komplementarni RNK molekul u ćeliji. Ovaj dupleks RNK molekul ne može biti preveden u pretein ćelijskom translacionom mašinerijom pa se degradira u ćeliji. Bilo koji gen može na ovaj način biti negativno regulisan.
Tako, jedna realizacija ovog pronalaska je regulatorni element sadašnjeg pronalaska, kao što su oni koji su dati kao SEQ ID NOs: 27 i 28, radno povezan za transkriptabilni polinukleotid molekul tako da modulira transkripciju transkriptabilnog polinukleotid molekula na željenom nivou ili u željenom obrazcu kada se konstrukt integriše u genom ćelije biljke. U jednoj realizaciji, transkriptabilni polinukleotid molekul sadrži region gena koji kodira protein, i promoter utiče na transkripciju RNK milekula koji se preveden i ekspresovan kao protein proizvod. U drugoj realizaciji, transkriptabilni polinukleotid molekul sadrži antisens region gena, i promoter utiče na transkripciju antisens RNK molekula, dvolančane RNK ili drugog sličnog inhibitornog RNK molekula kako bi se inhibirala ekspresija specifičnog RNK molekula od interesa u ciljanoj ćeliji domaćina.
Geni od agronomskog interesa
Transkriptabilni polinukleotid molekuli mogu biti geni od agronomskog interesa. Kako se to ovde koristi, pojam „geni od agronomskog interesa“ upućuje na transkriptabilni polinukleotid molekul koji kada se ekspresije u određenom biljnom tkivu, ćeliji ili tipu ćelije dodeljuje željenu karakteristiku, kao što je ona povezana sa biljnom morfologijom, fiziologijom, rastom, razvojem, prinosom, proizvodom nutricionim profilom, bolešću ili otpornošću na štetočine i/ili ekološkom ili hemijskom tolerancijom. Gene od agronomskog interesa uključuju one koji kodiraju prinos proteina, otpornost na stres proteina, razvojnu kontrolu proteina, diferencijaciju tkiva proteina, meristem proteina, ekološku odgovornost proteina, starenje proteina, odgovor na hormon proteina, uveok proteina, izvor proteina, propadanje proteina, proteinsku kontrolu cveta, seme proteina, otpornost na herbicide proteina, otpornost na bolest proteina, biosintetički enzim za masne kiseline, tokoferol biosintetički enzim, biosintetički enzim amino kiselina, posticidni protein, ili bilo koje drugo sredstvo kao što je antisens ili RNKi molekul koji targetira određeni gen za supresiju (potiskivanje). Proizvod gena od agronomskog interesa može da radi u okviru biljke kako bi izazvao dejstvo na fiziologiju ili metabolizam biljke ili može da radi kao pesticidno sredstvo u ishrani štetočina koje se hrane na biljci.
U jednoj realizaciji ovog pronalaska, promoter sadašnjeg pronalaska je inkorporisan u konstrukt na takav način da je promoter radno povezan za transkriptabilni polinukleotid molekul koji je gen od agronomskog interesa. Ekspresija gena od ekonomskog interesa je poželjna da bi se dodelila agronomski korisna crta (osobina). Korisna agronomska crta može biti, na primer, tolerancija na herbicide, kontrola insekata, modifikovani prinos, otpornost na gljivične bolesti, otpornost na viruse, otpornost na nematode, otpornost na bakterijske bolesti, rast i razvoj biljke, proizvodnja skroba, proizvodnja modifikovanih ulja, velika proizvodnja ulja, modifikovani sadržaj masnih kiselina, velika proizvodnja proteina, sazrevanje ploda, povećana životinska i humana ishrana, biopolimeri, otpornost na ekološki stres, farmaceutski peptidi i sekretabilni peptidi, poboljšane crte (osobine) obrade, poboljšana svarljivost, proizvodnja enzima, aroma (ukus), fiksacija azota, proizvodnja hibridnog semena, proizvodnja vlakna i proizvodnja biogoriva. Primeri gena od agronomskog interesa poznati u nauci uključuju one za otpornost na herbicide (U.S. Patent No. 6,803,501; 6,448,476; 6,248,876; 6,225,114; 6,107,549; 5,866,775; 5,804,425; 5,633,435; i 5,463,175), povećani prinos (U.S. Patent Nos. USRE38,446; 6,716,474; 6,663,906; 6,476,295; 6,441,277; 6,423,828; 6,399,330; 6,372,211; 6,235,971; 6,222,098; i 5,716,837), kontrolu insekata (U.S. Patent Nos. 6,809,078; 6,713,063; 6,686,452; 6,657,046; 6,645,497; 6,642,030; 6,639,054; 6,620,988; 6,593,293; 6,555,655; 6,538,109; 6,537,756; 6,521,442; 6,501,009; 6,468,523; 6,326,351; 6,313,378; 6,284,949; 6,281,016; 6,248,536; 6,242,241; 6,221,649; 6,177,615; 6,156,573; 6,153,814; 6,110,464; 6,093,695; 6,063,756; 6,063,597; 6,023,013; 5,959,091; 5,942,664; 5,942,658, 5,880,275, 5,763,245; i 5,763,241), otpornost na gljivične bolesti (U.S. Patent Nos. 6,653,280; 6,573,361, 6,506,962; 6,316,407; 6,215,048; 5,516,671; 5,773,696; 6,121,436; 6,316,407; i 6,506,962), otpornost na viruse (U.S. Patent Nos. 6,617,496; 6,608,241; 6,015,940; 6,013,864; 5,850,023; i 5,304,730), otpornost na nematode (U.S. Patent No. 6,228,992), otpornost na bakterijske bolesti (U.S. Patent No. 5,516,671), rast i razvoj biljke (U.S. Patent Nos. 6,723,897 i 6,518,488), proizvodnju skroba (U.S. Patent Nos.
6,538,181; 6,538,179; 6,538,178; 5,750,876; 6,476,295), proizvodnju modifikovanih ulja (U.S. Patent Nos. 6,444,876; 6,426,447; i 6,380,462), veliku proizvodnju ulja (U.S. Patent Nos. 6,495,739; 5,608,149; 6,483,008; i 6,476,295); sadržaj modifikovanih masnih kiselina (U.S. Patent Nos. 6,828,475; 6,822,141; 6,770,465; 6,706,950; 6,660,849; 6,596,538; 6,589,767; 6,537,750; 6,489,461; i 6,459,018), veliku proizvodnju proteina (U.S. Patent No.
6,380,466), sazrevanje plodova (U.S. Patent No. 5,512,466), povećanu životinjsku i ljudsku ishranu (U.S. Patent Nos. 6,723,837; 6,653,530; 6,5412,59; 5,985,605; i 6,171,640), biopolimere (U.S. Patent Nos. USRE37,543; 6,228,623; i 5,958,745, i 6,946,588), otpornost na ekološki stres (U.S. Patent No. 6,072,103), farmaceutske peptide i sekretabilne peptide (U.S. Patent Nos. 6,812,379, 6,774,283; 6,140,075; i 6,080,560), poboljšane osobine obrade (U.S. Patent No. 6,476,295), poboljšanu svarljivost (U.S. Patent No. 6,531,648), niske rafinoze (U.S. Patent No. 6,166,292), industrijsku proizvodnju enzima (U.S. Patent No.
5,543,576), poboljšanu aromu (ukus) (U.S. Patent No.6,011,199), fiksaciju azota (U.S. Patent No. 5,229,114), proizvodnju hibridnog semena (U.S. Patent No. 5,689,041), proizvodnju vlakna (U.S. Patent Nos. 6,576,818; 6,271,443; 5,981,834; i 5,869,720) i proizvodnju biogoriva (U.S. Patent No.5,998,700).
Alternativno, gen od agronomskog interesa može da utiče na kore pomenute karakteristike ili fenotip biljke kodiranjem RNK molekula koji izaziva ciljanu modulaciju genske ekspresije endogenog gena, na primer putem anisens (videti, n.pr., US Patent 5,107,065); inhibitorne RNK („RNKi“, uključujući modulaciju genske ekspresije putem miRNK-, siRNK-, transradne siRNK-, i faznih sa sRNK-posredovanih mehanizama, n.pr., kako je to opisano u objavljenim prijavama US 2006/0200878 i US 2008/0066206, i u US patentnoj prijavi 11/974,469), ili kosupresivno-posredovanih mehanizama. RNK može takođe da bude katalitički RNK molekul (n.pr., ribozom ili ribosvič; videti, n.pr. US 2006/0200878) projektovana da cepa željeni endogeni mRNK proizvod. Tako, bilo koji transkriptabilni polinukleotid molekul koji kodira transkribovani RNK molekul koji utiče na agronomski važnu promenu fenotipa ili morfologije od interesa može biti koristan za praktikovanje sadašnjeg pronalaska. Poznati su postupci u nauci za konstruisanje i uvođenje konstrukata u ćeliju na takav način da se transkriptabilni polinukleotid molekul transkribovan u molekul koji je sposoban za izazivanje supresije (potiskivanja ) gena. Na primer, posttranskripciona supresija gena korišćenjem konstrukta sa anti-sens orijentisanim transkriptabilnim polinukleotid molekulom da se reguliše genska ekspresija u ćeljama biljke je otkrivena u U.S. Patent Nos.5,107,065 i 6,759,829, a posttranskripciona supresija gena korišćenjem konstrukta sa sens-orijentisanim transkriptabilnim polinukleotid molekulom da se reguliše genska ekspresija u ćeljama biljke je otkrivena u U.S. Patent Nos.5,283,184 i 5,231,020. Ekspresija transkriptabilnog polinukleotida u ćeliji biljke može takođe biti korištena da se potisne hranjenje biljnih štetočina na ćeliji biljke, na primer, kompozicije izolovane iz štetočina tvrdokrilaca (Coleoptera) (U.S. Patent Publication No. US20070124836) i kompozicije izolovane iz štetočina nematoda (U.S. Patent Publication No. US20070250947). Biljne štetočine uključuju štetočine artropode, štetočine nematode, i gljivične i mikrobske štetočine. Primeri za transkriptabilne polinukleotid molekule za inkorporaciju u konstrukte sadašnjeg pronalaska uključuju, na primer, DNK molekul ili gene vrsta koje nisu ciljane vrste ili geni koji vode poreklo od ili su prisutne u istim vrstama, ali su inkorporisane u ćelije primaoca postupcima genetičkog inžinjeringa a ne klasičnom reprodukcijom iz tehnikama uzgoja. Ovaj tip polinukleotid molekula može da uključi, ali nije ograničen na, polinukleotid molekul koji je već prisutan u ćeliji biljke, polinukleotid molekul sa druge biljke, polinukleotid molekul iz različitog organizma ili polinukleotid molekul generisan eksterno, kao što je to polinukleotid molekul koji sadrže antisens poruku gena, ili polinukleotid molekul koji kodira veštačku, sintetičku ili na neki drugi način modifikovanu verziju transgena.
Selektivni markeri
Kako se to ovde koristi pojam „marker“ upućuje na bilo koji transkriptabilni polinukleotid molekul čija ekspresija, ili njen nedostatak, može biti pretraživana ili ocenjena na neki način. Marker geni koji se koriste u praktikovanju sadašnjeg pronalaska uključuju transkriptabilne polinukleotid molekul koji kodiraju β-glukoronidazu (GUS opisan u U.S. Patent No.
5,599,670), zeleni fluorescentni protein i njegove varijante (GFP opisan u U.S. Patent No.
5,491,084 i 6,146,826), proteine koji dodeljuju antibiotičku otpornost, ili proteini koji dodeljuju herbicidnu toleranciju. Poznati su u nauci korisni markeri antibiotičke otpornosti, uključujući one koji kodiraju proteine koji dodeljuju otpornost na kanamicin (nptII), higromicin B (aph IV), sterptomicin ili spektinomicin (aad, spec/strep) i gentamicin (aac3 i aacC4). Herbicidi za koje je tolerancija transgene biljke demonstrirana i postupak sadašnjeg pronalaska može biti primenjen, uključuju: amino-metil-fosfonsku kiselinu, glifozat, glufosinat, sulfoniluree, imadozolinone, bromoksinil, dalapon, dikamba, cikloheksandion, protoporfirinogen oksidaza inhibitore i izoksasfluotol herbicide. Poznati su u nauci transkriptabilni polinukleotid molekuli koji kodiraju proteine uključene u toleranciju herbicida i uključuju transkriptabilni polinukleotid molekul koji kodira 5-enolpiruvilšikimat-3-fosfat sintazu (EPSPS za toleranciju glifosfata opisanu u U.S. Patent No. 5,627,061; 5,633,435; 6,040,497; i 5,094,945); transkriptabilni polinukleotid molekul koji kodira glifozat oksidoreduktazu i glifozat-N-acetil transferazu (GOX opisan u U.S. Patent No. 5,463,175; GAT opisan u U.S. Patent publication No. 20030083480, i dikamba monooksigenaza U.S. Patent Publication No. 20030135879); transkriptabilni polinukleotid molekul koji kodira bromoksinil nitrilazu (Bxn za toleranciju Bromoksinila opisan u U.S. Patent No. 4,810,648); transkriptabilni polinukleotid molekul koji kodira fitoen desaturazu (crtI) opisan kod Misawa, et al, Plant Journal 4:833-840 (1993) i Misawa, et al, Plant Journal 6:481-489 (1994) za toleranciju norflurazona; transkriptabilni polinukleotid molekul koji kodira sintazu acetohidroksi kiseline (AHAS, odnosno ALS) opisano kod Sathasiivan, et al., Nucl. Acids Res. 18:2188-2193 (1990) za toleranciju sulfonilurea herbicida; i bar gen opisan u DeBlock, et al., EMBO Journal 6:2513-2519 (1987) za toleranciju glufosinata i bialafosa. Promoter molekuli sadašnjeg pronalska moku da ekspresiju povezane transkriptabilne polinukleotid molekule koji kodiraju fosfinotricin acetiltransferazu, glifozat otproni EPSPS, aminoglukozid fosfotransferazu, dalapon dehalogenazu, bromoksinil otpornu nitrilazu, antranilat sintazu, ariloksialkanoat dioksigenaze, acetil CoA karboksilazu, glifozat oksidoreduktazu i glifozat-N-acetil transferazu.
Takođe su u okvir pojma „selektivni markeri“ uključeni geni koji kodiraju sekretabilne markere šija sekrecija može biti detektovana kao sredstvo identifikovanja ili selektiranja za transformisane ćelije. Primeri uključuju markere koji kodiraju sekretabilni antigen koji može biti identifikovan antitelo interakcijom, ili čak sekretabilne enzime koji ogu biti detektovani katalitički. Selektivno izlučeni marker proteini spadau u brojne klase, uključujući male, proteine koji se mešaju difuzijom koji se mogu detektovati, (n.pr., ELISA-om), male aktivne enzime koji se mogu detektovati ekstracelularnim rastvorom (n.pr., alfa-amilaza, betalaktamaza, foafinotricin transferaza), ili proteini koji su umetnuti ili zarobljeni u ćelijskom zidu (kao što su proteini koji uključuju lider sekvencu kaka je ona pronađena u ekspresiji jedinice ekstenzije duvan patogeneze u vezi sa proteinima takođe poznata kao duvan PR-S). Drugi mogući selektivni marker geni će biti očigledni stručnjacima iz ove oblasti nauke i obuhvaćeni su sadašnjim pronalaskom.
Ćelijska transformacija
Pronalazak je takođe usmeren na postupak proizvodnje transformisanih ćelija i biljaka koje sadrže promoter radno povezan za transkriptabilni polinukleotid molekul.
Pojam „transformacija“ upućuje na uvođenje nukleinske kiseline u primaoca domaćina. Kako se to ovde koristi, pojam „domaćin“ upućuje na bakteriju, gljivu ili biljku, uključujući bilo koju ćeliju, tkivo, organ ili progen bakterije, gljive ili biljke. Biljna tkiva i ćelije od posebnog interesa uključuju protoplaste, kvrge, korenje, krtole, seme, stabljike, lišće, sadnice, embrione i polen.
Kako se to ovde koristi, pojam „transformisano“ upućuje na ćeliju, tkivo, organ ili organizam u koji je strani polinukleotid molekul, kao što je konstrukt, uveden. Uvedeni polinukleotid molekul može biti integrisan u genomsku DNK ćelije, tkiva, organa ili organizma primaoca tako da uvedeni polinukleotid molekul bude nasleđen od potonjeg potomstva. „Transgena“ ili „transformisana“ ćelija ili organizam takođe uključuju potomstvo ćelije ili organizma i potomstvo proizvedeno iz programa uzgoja koji upošljava takve transgene organizme kao matične u ukrštanju i prikazivanju izmenjenog fenotipa rezultirajućeg iz prisustva stranog polinukleotid molekula. Pojam „trangeni“ upućuje na bakteriju, gljivu ili biljku koje sadrže jedan ili više molekula polinukleinske kiseline.
Postoje mnogi postupci za uvođenje molekula polinukleinske kiseline u ćelije biljke. Postupak se generalno sastoji od koraka odabiranja pogodne ćelije domaćina, transformisanja ćelije domaćina sa rekombinantnim vektorom, i dobijanja transformisane ćelije domaćina. Odgovarajući postupci uključuju bakterijsku infekciju (n.pr., Agrobacterium), binarne veštačke hromozom vektore, direktnu isporuku DNK (n.pr., putem PEG-posredovane transformacije, isušivanje/inhibicija-posredovanog DNK unosa, elektroporacije, agitacije sa silikon karbid vlaknima, i akceleracije DNK obloženih čestica, itd (pregledano kod Potrykus, et al., Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.42: 205 (1991)).
Tehnologija uvođenja DNK molekula u ćelije je vrlo dobro poznata stručnjacima iz ove oblasti nauke. Postupci i materijali za transformisanje biljnih ćelija uvođenjem biljnog DNK konstrukta u genom biljke u praksi ovog pronalaska može da uključi bilo koji dobro poznati i demonstrirani postupak. Bilo koji postupak transformacije moeže biti iskorišten da se transformišće ćelija domaćina sa jednim ili više promotera i/ili konstrukta sadašnjeg pronalaska. Ćelije domažina mogu biti bilo koja ćelija ili organizam kao što su biljna ćelija, ćelija alge, alge, ćelija gljiva, gljive, bakterijska ćelija, ili ćelija insekta. Poželjni domaćini i transformisane ćelije uključuju ćelije iz: biljaka, Aspergillus, kvasaca, insekata, bakterija i algi.
Regenerisane transgene biljke mogu biti samo-oprašene da se dobiju homozigotne transgene biljke. Alternativno, polen dobijen iz regenerisanih transgenih biljaka može biti ukršten sa ne-transgenim biljkama, poželjno urođenim linijama agronomski važnih vrsta. Opisi postupak uzgoja koji se uobičajeno koriste za različite svojstva i useve mogu biti pronađeni u nekoliko referentnih knjiga, videti, na primer, Allard, Principles of Plant Breeding, John Wiley & Sons, NY, U. of CA, Davis, CA, 50-98 (1960); Simmonds, Principles of crop improvement, Longman, Inc., NY, 369-399 (1979); Sneep and Hendriksen, Plant breeding perspectives, Wageningen (ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation (1979); Fehr, Soybeans: Improvement, Production and Uses, 2nd Edition, Monograph, 16:249 (1987); Fehr, Principles of variety development, Theory and Technique, (Vol. 1) i Crop Species Soybean (Vol 2), Iowa State Univ., Macmillan Pub. Co., NY, 360-376 (1987). Suprotno tome, polen sa ne-transgenih biljaka može biti korišten za oprašivanje regenerisanih transgenih biljaka.
Transformisane biljke mogu biti analizirane na prisustvo gena od interesa i nivo i/ili profil ekspresije dodeljen od strane regulatornih elemenata sadašnjeg pronalaska. Stručnjaci iz ove oblasti nauke su svesni brojnih postupaka dostupnih za analizu transformisanih biljaka. Na primer, postupci analize biljke uključuju Southern blots ili Northern blots, PCR-zasnovane pristupe, biohemijske analize, postupke fenotipskog skrininga, evaluacije polja, i imunodijagnostički ogledi. Ekspresija transkriptabilnog polinukleotid molekula može biti merena korišćenjem TaqMan ® (Applied Biosystems, Foster City, CA) reagensa i postupaka kako je opisano od strane proizvođača i PCR vremenima ciklusa utvrđenim korišćenjem TaqMan ® Testing Matrix (matrica testiranja). Alternativno, Invader ® (Third Wave Technologies, Madison, WI) reagensi i postupci kako su opisani od strane proizvođača mogu biti korišćeni za ekspresiju transgena.
Semena biljaka ovog pronalaska mogu biti sakupljena sa fertilnih transgenih biljaka i korišćena da se uzgoje generacije potomstva transformisanih biljaka ovog pronalaska uključujući hibridne biljne linije koje sadrže konstrukt ovog pronalaska i ekspresiju gena od agronomskog interesa.
Sadašnji pronalazak takođe obezbeđuje delove biljaka sadašnjeg pronalaska. Deli biljaka uključuju listove, stabljike, korenje, krtole, seme, endosperm, ovule i polen. Pronalazak takođe uključuje i obezbeđuje transformisane ćelija biljaka koje sadrže molekul nukleinske kiseline sadašnjeg pronalaska.
Transgena biljka može da prenese transgeni polinukleotid molekul svom potomstvu. Potomstvo uključuje bilo koji deo biljke ili sem koji se mogu regenerisati koji sadrže transgen izveden iz biljke pretka. Transgena biljka je poželjno homozigotna za transformisani polinukleotid molekul i prenosi tu sekvencu na sve potomke kao rezultat seksualne reprodukcije. Potomstvo može biti uzgajano iz semena proizvedenog od strane transgene biljke. Ove dodatne biljke mogu onda biti samo-oprašene da generišu pravu linuju uzgoja biljki. Potomstvo ovih biljaka se procenjuje, između ostalog, na gensku ekspresiju. Genska ekspresija može biti detektovana putem nekolik uobičajenih postupaka kao što su western blotting, northern blotting, imuno-taloženje, i ELISA.
Robni proizvodi
Dalje se otkrivaju robni proizvodi koji sadrže DNK molekule prema ovom pronalasku. Kako se to ovde koristi, „robni proizvod“ upućuje na bilo koju kompoziciju ili proizvod koji se sastoji od materijala izvedenog iz biljke, semena, ćelije biljke ili dela biljke koji sadrži DNK molekul ovog pronalaska. Robni proizvodi mogu biti prodati potrošačima i mogu biti održive i neodrižive za život. Neodrživi robni proizvodi uključuju ali nisu ograničeni na neodrživo seme i zrnevlje; obrađeno seme, delove semena i delove biljke; dehidrirano tkivo biljke, smrznuto tkivo biljke, i obrađeno tkivo biljke; seme i delove biljaka obrađenih za potrošnju radi životinjske ishrane kopnenih i/ili vodenih životinja, ulje, obroke u obliku praška, brašno, pahuljice, mekinje, vlakno, mleko, sir, papir, krem (pavlaku), vino i bilo koju drugu hranu za humanu potrošnju; i biomase i proizvode goriva. Održivi robni proizvodi uključuju ali nisu ograničeni na seme i ćelije biljke. Biljke koje sadrže DNK molekul prema pronalasku tako mogu biti korišćenje za proizvodnju bilo kog robnog proizvoda koji se tipično dobija iz biljaka ili njihovih delova.
Kako smo sada generalno opisali ovaj pronalazak, isti će se očigledno razumeti kroz upućivanje na sledeće primere. Primeri koji nisu pokriveni obimom patentnih zahteva su dati samo u ilustrativne svrhe.
PRIMERI
Primer 1: Identifikacija i kloniranje regulatornih elemenata.
Novi ubikvitin transkripcioni regulatorni elementi, ili transkripciona grupa sekvenci regulatorne ekspresije elementa (EXP) su identifikovane i izolovane iz genomske DNK monokot vrsta andropogona (Andropogon gerardii), šećerne trske (Saccharum ravennae (Erianthus ravennae)), zelenog muhara (Setaria viridis), zee (Zea mays podvrsta mexicana), italijanskog prosa (Setaria italica), ili jovove suze (Coix lacryma-jobi).
Ubikvitin 1 transkript sekvence su identifikovane iz svako od gore navedenoh vrsta. 5’ neprevedeni region (5’ UTR) svakog od Ubikvitin 1 transkripata se koriste da se dizajniraju prajmeri koji pojačavaju korespondirajuće transkripcione regulatorne elemente za identifikovanje Ubikvitin gena, koji sadrži promoter, lider (5’ Utr) i prvi intron radno povezane. Prajmeri se koriste sa GenomeWalker<TM>(Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA) bibliotekama konstruisanim praćenjem proizvođačkog protokola da se klonira 5’ region korespondirajuće genomske DNK sekvence. Ubikvitin transkripcioni regulatorni elementi su takođe izolovani iz monokot Sorghum bicolor-a korišćenjem javnih sekvenci koje su homolozi za Ubikvitin 4, 6 i 7 gene Zea mays.
Korišćenjem identifikovanih sekvenci, obavlja se bioinformatička analiza da se identifikuju regulatorni elementi u okviru amplifikovane DNK. Korišćenjem rezultata ove analize, regulatorni elementi se definišu u okviru DNK sekvenci i prajmera dizajniranih da pojčaju regulatorne elemente. Korespondirajući DNK molekul za svaki regulatorni element je pojačan korišćenjem uslova standardne polimeraza lančane reakcije sa prajmerima koji sadrže jedinstvene položaje restrikcije enzima i genomsku DNK izolovanu iz A. gerardii, S. ravennae, S. viridis, Z. mays podvrsta mexicana, S. italica, C. lacryma-jobi, i S. bicolor. Rezultirajući DNK fragmenti se vezuju u bazne vektore ekspresije biljke i sekvenciraju. Onda se radi analiza regulatornog elementa TSS i intron/ekson upletenih čvorova korišćenjem transformisanih biljnih protoplasta. Ukratko, protoplasti se transformišu sa vektorima biljne ekspresije koji sadrže klonirane DNK fragmente radno povezane za heterologi transkriptabilni polinukleotid molekul i koristi se 5’ RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version 2.0 (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija 92008) da se potvrdi regulatorni element TSS i intron/ekson upleteni čvorovi analiziranjem sekvence mRNK transkripta time proizvedenih.
Sekvence identifikovanih grupa regulatorne ekspresije elementa („EXP-ovi“) su ovde date kao SEQ ID NOS: 1, 5, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 22, 25, 27, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 45, 49, 53, 55, 59, 63, 65, 69, 73, 75, 77, 79, 83, 85, 87, 90, 93, 95, 97, 98, 99, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 115, 116, 117, 119, 121, 123, 124, 125, 126, 128, 130, 132, 133, 134, 136, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 180, 181 i 183, kako je to dato u donjoj Tabeli 1. Promoter sekvence su ovde date kao SEQ ID NOS: 2, 6, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 23, 26, 28, 30, 32, 34, 38, 40, 42, 46, 50, 56, 60, 64, 66, 70, 74, 76, 78, 80, 84, 86, 88, 91, 96 i 135. Lider sekvence su ovde date kao SEQ ID NOS: 3, 20, 35, 43, 47, 51, 57, 61, 67, 71 i 81. Intron sekvence su ovde date kao SEQ ID NOS: 4, 7, 21, 24, 36, 44, 48, 52, 54, 58, 62, 68, 72, 82, 92, 94, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 118, 120, 122, 127, 129, 131, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 i 182. Pojačivačka sekvenca je data kao SEQ ID NO: 89.
Tabela 1. Transkripcione grupe regulatorne ekspresije elementa („EXP-ovi“), promoteri, pojačivači, lideri i introni izolovani od različitih vrsta trava.
Kao što je prikazano u Tabeli 1, na primer, transkripciona regulatorna EXP sekvenca označena kao EXP-ANDge.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 1), sa komponentama izolovanim iz A. gerardii, sadrži promoter element, P-ANDge.Ubq1-1:1:11 (SEQ ID NO: 2), radno povezani 5’ za lider, L-ANDge.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 3), radno povezani 5’ za intron, I-ANDge.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 4). Drugi EXP-ovi su povezani na sličan način, kako je to naglašeno u Tabeli 1.
Kao što je prikazano u Tabeli 1, liste sekvenci i Slike 1-7, projektovane su varijante promoter sekvenci od vrsta A. gerardii, E. ravennae, Z. mays podvrsta mexicana, S. bicolor, C. lacryma-jobi, S. italica i S. viridis koje sadrže kraće fragmente promotera, na primer, P-ANDge.Ubq1-1:1:11 (SEQ ID NO: 2), P-ERIra.Ubq1-1:1:10 (SEQ ID NO: 19) ili druge posebne promotere od drugih vrsta, i na primer rezultiraju u P-ANDge.Ubq1-1:1:9 (SEQ ID NO: 6), P-ERIra.Ubq1-1:1:9 (SEQ ID NO: 23), P-Cl.Ubq1-1:1:10 (SEQ ID NO: 96), P-SETit.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 76) i P-Sv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 38), kao i druge fragmente promotera. P-SEQit.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 74) sadrži jednu promenu nukleotida u odnosu na P-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 70). Na isti način, P-Sv.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 40) sadrže jednu promenu nukleotida u odnosu na P-Sv.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 135).
U nekim slučajevima, varijante specifičnih introna se kreiraju izmenom poslednja 3 nukleotida svako osebnog introna nakon sekvence 5’-AG-3’ 3’ intron čvora uplitanja. Ove varijante introna su prikazane u donjoj Tabeli 2.
Tabela 2. 3’ kraj sekvenca intron varijanti.
Takođe su date u Tabeli 1 tri alelne varijante izolovane korišćenjem istih setova prajmera za amplifikaciju (pojačavanje) genomske DNK iz Z. mays podvrsta mexicana. Alelne varijante EXP sekvenci se sastoje od sekvence koja deli određenu identičnost u okviru različitih regiona drugih sekvenci, ali umetci, delecije i nepoklapanja nukleotida mogu takođe biti očigledni u okviru svakog promotere, lidera i/ili introna svake od EXP sekvenci. EXP sekvenca označena kao EXP-Zm.UbqM1:1:1 (SEQ ID NO: 41) predstavlja prvi alel (Alel-1) Z. mays podvrsta mexicana Ubq1 grupe elemenata koja reguliše gensku ekspresiju na nivou transkripcije. EXP sekvence ozančene sa EXP-Zm.UbqM1:1:6 (SEQ ID NO: 137) i EXP-Zm.UbqM1:1:10 (SEQ ID NO: 139) predstavljaju prvi alel (Alel-1), sa jedinom razlikom između dva EXP-a do koje dolazi u poslednjim 3’ nukleotidima svakog posebnog introna nakon sekvence 5’-AG-3’ 3’ upletenog čvora introna. EXP sekvenca označena kao EXP-Zm.UbqM1:1:4 (SEQ ID NO: 45) predstavlja drugi alel (Alel-2) Z. mays podvrsta mexicana Ubq1 grupe elemenata koja reguliše gensku ekspresiju na nivou transkripcije. EXP sekvence ozančene sa EXP-Zm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141) i EXP-Zm.UbqM1:1:12 (SEQ ID NO: 143) predstavlja drugi alel (Alel-2), sa jedinom razlikom između dva EXP-a do koje dolazi u poslednjim 3’ nukleotidima svakog posebnog introna nakon sekvence 5’-AG-3’ 3’ upletenog čvora introna. EXP sekvence EXP-Zm.UbqM1:1:2 (SEQ ID NO: 49) i EXP-Zm.UbqM1:1:5 (SEQ ID NO: 53) predstavljaju treći alel (Alel-3) Z. mays podvrsta mexicana Ubq1 grupe elemenata koja reguliše gensku ekspresiju na nivou transkripcije i sadrži jednu razliku u nukleotidu na poziciji 1034 u okviru svakog posebnog introna (G za I-Zm.UbqM1-1:1:11, SEQ ID NO: 52 i T za I-Zm.UbqM1-1:1:12, SEQ ID NO: 54). EXP sekvence označene sa EXP-Zm-UbqM1:1:8 (SEQ ID NO: 145), EXP-Zm.UbqM1:1:9 (SEQ ID NO: 147), EXP-Zm.UbqM1:1:11 (SEQ ID NO: 149) i EXP-Zm.UbqM1:1:13 (SEQ ID NO: 181) takođe predstavljaju treći alel (Alel-3). Intron EXP-Zm.UbqM1:1:9, I-Zm.UbqM1-1:1:16 (SEQ ID NO: 148) sadrži timin ostatak na poziciji 1034, dok introni EXP-Zm.UbqM1:1:8, EXP-Zm-UbqM1:1:11 i EXP-Zm.UbqM1:1:13 (I-Zm.UbqM1-1:1:15, SEQ ID NO: 146; I-Zm.UbqM1-1:1:18, SEQ ID NO: 11 i; I-Zm.UbqM1-1:1:20, SEQ ID NO:182) svaki sadrže gvanin ostatak na poziciji 1034. Dodatno tome, poslednja tri 3’ krajnja nukleotida EXP-Zm.UbqM1:1:8 (SEQ ID NO: 145) i EXP-Zm.UbqM1:1:9 (SEQ ID NO: 147) se razlikuju od onih EXP-Zm.UbqM1:1:11 (SEQ ID NO: 149) i EXP-Zm.UbqM1:1:13 (SEQ ID NO: 181).
Primer 2: Analiza regulatornih elemenata koji vode GUS u protoplastima kukuruza.
Protoplasti lista kukuruza se transformišu vektorima ekspresije biljke koji sadrže EXP sekvencu koja vodi ekspresiju β-glukuronidaza (GUS) transgena i upoređuju sa GUS ekspresijom u protoplastima lista u kojima je ekspresija GUS vođena poznatim konstitutivnim promoterima.
Ekspresija transgena vođenog sa EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22) ili EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27) se upoređuje sa ekspresijom iz poznatih konstitutivnih promotera. Prethodne EXP sekvence se kloniraju u vektore ekspresije biljke kako je prikazano u donjoj Tabeli 3 da se dobije prinos vektora u kojima je EXP sekvenca radno povezana 5’ za β-glukuronidaza (GUS) reporter koji sadrže obradivi intron (upućuje se kao na GUS-2, SEQ ID NO: 160) izveden iz krompirovog ST-LS1 gena koji tkivo-specifično indukuje svetlost (GenBank Accession: X04753) ili susednu GUS kodirajuću sekvencu (GUS-1, SEQ ID NO: 159), koji su radno 5’ povezani za 3’ UTR izveden iz A. tumefaciens Nopalin sintaza gen (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 161) ili pšenični Hsp17 gen (T-Ta.Hsp17-1:1:1, SEQ ID NO: 162).
Tabela 3. Konstrukt GUS biljne ekspresije plazmida i korespondirajuća EXP sekvenca, GUS kodirajuća sekvenca i 3’ UTR koji se koriste za transformaciju protoplasta lista kukuruza. „SEQ ID NO:“ upućuje na datu EXP sekvencu.
Kontrolni plazmidi (pMON19469, pMON65328, pMON25455 i pMON122605) koji se koriste za upoređivanje su konstruisani kako je u gornjem tekstu opisana i sadrže poznatu EXP sekvencu: EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170), EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 163), EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) ili EXP-Os.TubA-3:1:1 (SEQ ID NO: 165), svaku posebno, radno 5’ povezanu za GUS kodirajuću sekvencu i 3’ UTR. Tri dodatne kontrole su date da se proceni pozadinska GUS i ekspresija luciferaze: ne DNK kontrola, prazan vektor koji nije označen za ekspresiju transgena i vektor ekspresije se koriste da se ekspresuje zeleni fluorescentni protein (GFP).
Dva plazmida, za korišćenje u ko-transformaciji i normalizaciji podataka, su takođe konstruisana korišćenjem postupaka poznatih u nauci. Svaki plazmid sadrži specifičnu luciferaza kodirajuću sekvencu koja se dovodi putem konstitutivne EXP sekvence. Biljni vektor pMON19437 sadrži transgenu kasetu sa konstitutivnim promoterom radno povezanim 5’ za intron, (EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1, SEQ ID NO: 170), radno povezanim 5’ sa luciferaza kodirajućom sekvencom svitca (Photinus pyralis) (LUCIFERASE:1:3, SEQ ID NO: 166), radno povezanim 5’ sa 3’ UTR gena Agrobacterium tumefaciens nopalin sintaze (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 161). Biljni vektor pMON63934 sadrže transgenu kasetu sa konstitutivnom EXP sekvencom (EXP-CaMV.35S-enh-Lhcb1, SEQ ID NO: 168), radno povezanom 5’ sa luciferaza kodirajućom sekvencom morskog korala (Renilla reniformis) (CR-Ren.hRenilla Lucife-0:0:1, SEQ ID NO: 167), radno povezanom 5’ za 3’ UTR gena Agrobacterium tumefaciens nopalin sintaze (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 161).
Protoplasti lista kukuruza se transformišu korišćenjem postupka PEG-bazirane transformacije, kako je to vrlo dobro poznato u nauci. Ćelije protoplasta se transformišu sa pMON19437 plazmidom DNK, pMON63934 plazmidom DNK, i ekvimolarnom količinom jednog od plazmida predstavljenog u Tabeli 3 i inkubira se preko noći u potpunoj tami (mrak). Merenja i GUS i luciferaze se obavljaju postavljanjem alikvota lizovanog preparata ćelija transformisanih kako je gore dato u dva različita platoa sa malim-bazenčićem. Jedan plato se koristi za GUS merenja, a drugi plato se koristi da se obavi dualni ogled luciferaze korišćenjem sistema dualnog luciferaza reporter ogleda (Promega Corp., Madison, WI; videti na primer, Promega Notes Magazine, No, 1996, p.02). Jedna ili dve transformacije za svaku EXP sekvencu se obavljaju i utvrđuju se srednje vrednosti ekspresije za svaku EXP sekvencu iz nekoliko uzoraka iz svakog eksperimenta transformacije. Merenja uzorka se čine korišćenjem četiri replikata svake transformacije konstrukta EXP sekvence, ili alternativno, tri replikata svakog konstrukta EXP sekvence po jednom od dva eksperimenta transformacije. Srednji nivoi ekspresije GUS i luciferaze su dati u Tabeli 4. U ovoj tabeli, vrednosti lucifeaze svitca (n.pr. iz ekspresije pMON19437) su dati u kolini označenoj sa „Fluc“ a vrednosti Renilla luciferaze su date u koloni označenoj sa „Rluc.“
Tabela 4. Srednja GUS i luciferaza aktivnost u transformisanim ćelijama protoplasta lista kukuruza.
Da se uporedi relativna aktivnost svake EXP sekvence, GUS vrednosti izražene kao odnos GUS rema luciferaza aktivnosti i normalizovane u pogldeu nivoa ekspresije primećenih za EXP sekvencu EXP-Os.TubA-3:1:1 (SEQ ID NO: 165). Donja Tabela 5 prikazuje GUS/Rluc odnose ekspresije normalizovane u odnosu na EXP-Os.TubA-3:1:1 ekspresijom u protoplastima kukuruza.
Kako se može videti u Tabeli 5, GUS ekspresija, vođena sa EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22) ili EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27) je 4,51 do 9,42 puta veća od GUS ekspresije vođene sa EXP-Os.TubA-3:1:1 (SEQ ID NO: 165). GUS ekspresija vođena sa EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22) ili EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27) je takođe veća od one od EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170), EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.ACT1:1:1 (SEQ ID NO: 163) ili EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179).
Tabela 5. GUS/Rluc višestruka ekspresija u odnosu na EXP-Os.TubA-3:1:1 ekspresiju u ćelijama protoplasta lista kukuruza.
Donja Tabela 6 prikazuje GUS/Fluc odnose ekspresije normalizovane u pogledu EXP-Os.TubA-3:1:1 ekspresijom u protoplastima kukuruza.
Tabela 6. GUS/Fluc višestruka ekspresija u odnosu na EXP-Os.TubA-3:1:1 ekspresiju u ćelijama protoplasta lista kukuruza.
Kako se može videti u Tabeli 6, GUS ekspresija vođena sa EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22) ili EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27) demonstrira isti generalni trend kada se izrazi kao odnos GUS/Fluc vrednosti i normalizovana je u odnosu na EXP-Os.TubA-3:1:1 (SEQ ID NO: 165). Ekspresija je 12,69 do 32,86 puta veća od GUS ekspresije vođene sa EXP-Os.TubA-3:1:1 (SEQ ID NO: 165). GUS ekspresija vođena sa EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22) ili EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27) je takođe veća u određenim upoređivanjima od one koja postoji sa EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170), EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.ACT1:1:1 (SEQ ID NO: 163) ili EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179).
Primer 3: Analiza regulatornih elemenata koji vode GUS u proroplastima kukuruza korišćenjem amplikona GUS transgene kasete.
Protoplasti lista kukuruza se transformišu sa DNK amplikonima iz biljnih vektora ekspresije koji sadrže EXP sekvencu, koja vodi ekspresiju β-glukuronidaza (GUS) transgena i upoređivanjem sa protoplastom lista u kome je ekspresija GUS vođena poznatim konstitutivnim promoterima u seriji eksperimenata koji su u donjem tekstu prezentovani.
U prvom setu eksperimenata, ćelije protoplasta kukuruza, izvedene iz tkiva lista se transformišu kao što je gore dato sa amplikonim proizvedenim iz amplifikacije GUS transgenih kaseta koje sadrže biljne vektore ekspresije da bi se uporedila ekspresija transgena (GUS) vođenog sa jednom od EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-SETit.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 117), EXP-SETit.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 123), EXP-SETit.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 124), EXP-Sv.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 128), EXP-Sv.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 132), EXP-Sv.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 134), EXP-Zm.UbqM1:1:6 (SEQ ID NO: 137), EXP-Zm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141), EXP-Sb.Ubq4:1:2 (SEQ ID NO: 151), EXP-Sb.Ubq6:1:2 (SEQ ID NO: 153 i EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98) u odnosu na onu od poznatih konstitutivnih promotera. Svaka EXP sekvenca koja sadrži šablon amplifikacije iz koje se proizvodi amplikon transgene kasete se klonira korišćenjem postupaka poznatih u nauci u biljni vektor ekspresije prikazano u donjoj Tabeli 7 pod naslovom „Amplikon šablon“. Rezultirajući biljni vektori ekspresije sadrže transgenu kasetu koja se sastoji od EXP sekvence, radno povezanog 5’ za kodirajuću sekvencu za β-glukuronizadu (GUS) koja bilo sadrži obradivi intron („GUS-2“ kako je to razmatrano u gornjem Primeru 2), ili susednu GUS kodirajuću sekvencu („GUS-1“, kako je razmatrano u gornjem tekstu), radno povezanog 5’ za 3’ UTR T-AGRtu.nos-1:1:13 ili T-Ta.Hsp17-1:1:1, kako je takođe dato u gornjem tekstu. Amplikoni se proizvode korišćenjem postupaka poznatih stručnjacima iz ove oblasti nauke korišćenjem šablona plazmid konstrukta prezentovanih u donjoj Tabeli 7. Ukratko, 5’ oligonukleotid prajmer je dizajniran da se sparuje sa promoter sekvencom i 3’ oligonukleotid prajmerom, čije se sparivanje na 3’ kraju 3’ UTR koristi za amplifikaciju svake transgene kasete. Sukcesivne 5’ delecije se uvode u promoter sekvence koja sadrže transgene kasete, pružajući podizanje do različitih EXP sekvenci, korišćenjem različitih oligonukleotid prajmera koji su dizajnirani da se sparuju na različitim pozicijama u okviru promoter sekvence koja sadrži svaki amplikon šablon.
Tabela 7. Amplikoni GUS biljne ekspresije i korespondirajući šabloni amplikona plazmid konstrukta, EXP sekvence, GUS kodirajuća sekvenca i 3’ UTR koji se koriste za transformaciju protoplasta lista kukuruza.
Plazmid konstrukti navedeni kao amplikon šabloni u Tabeli 7 služe kao šabloni za amplifikaciju transgenih kaseta ekspresije koje sadrže naveden EXP sekvence iz Tabele 7. Kontrolni plazmidi koji se koriste da generišu GUS transgen amplikone radi upoređivanja su konstruisani kako je prethodno opisano sa poznatim konstitutivnim EXP sekvencama opisanim u Primeru 2. Negativne kontrole za utvrđivanje GUS i luciferaza pozadine, ne DNK kontrola, i kontrola uzorka u kome su dva luciferaza plazmida korišćena u transformacije zajedno sa plazmid DNK koji ne vrši ekspresiju kodirajuće sekvence su takođe korišćeni. Plazmidi pMON19437 i pMON63934, kako je razmatrano u Primeru 2, takođe su uposleni za ko-transformaciju i normalizaciju podataka.
Protoplsati lista kukuruza se transformišu korišćenjem PEG-zasnovanog postupka transformacije kako je to opisano u gornje Primeru 2. Donja Tabela 8 prikazuje prosečne vrednosti GUS i luciferaza ekspresije utvrđene za svaku transgenu kasetu.
Tabela 8. Srednja vrednost GUS i luciferaza aktivnosti u transformisanim ćelijama protoplsata lista kukuruza.
Da se uporedi relativna aktivnost svake EXP sekvence GUS vrednosti se izražavaju kao odnos GUS prema luciferaza aktivnosti i normalizuju se u odnosu na nivoe ekspresije primećene za EXP-Os.Act1:1:1 i EXP-CaMV.35S-eng+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1. Donja Tabela 9 prikazuje odnose ekspresije GUS/Rluc normalizovane u odnosu na EXP-Os.Act1:1:1 i EXP-CaMV.358-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 vođenu ekspresiju u protoplastima kukuruza. Donja Tabela 10 prikazuje odnose ekspresije GUS/Fluc normalizovane u odnosu na EXP-Os.Act1:1:1 i EXP-CaMV.358-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 vođenu ekspresiju u protoplastima kukuruza.
Tabela 9. GUS/Rluc i GUS/Fluc odnosi ekspresije normalizovani u odnosu na EXP-CaMV.358-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 163) u protoplastima kukuruza.
Tabela 10. GUS/Rluc i GUS/Fluc odnosi ekspresije normalizovani u odnosu na EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) u protoplastima lista kukuruza.
Kao što se može videti iz Tabela 9 i 10, skoro sve EXP sekvence su sposobne da vode GUS ekspresiju transgena u ćelijama kukuruza. Prosečna GUS ekspresija je veća za EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-SETit.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 117), SETit.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 123), SETit.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 124), EXP-Sv.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 128), EXP-Sv.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 132), EXP-Sv.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 134), EXP-Zm.UbqM1:1:5 (SEQ ID NO: 137), EXP-Zm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141), EXP-Sb.Ubq4:1:2 (SEQ ID NO: 151), EXP-Sb.Ubq6:1:2 (SEQ ID NO: 153) i EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98) kada se uporedi sa GUS ekspresijom vođenom sa EXP-Os.Act1:1:1 ili EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb+Os.ACT1:1:1.
U drugom setu eksperimenata, amplikon GUS kasete koji sadrži EXP sekvencu EXP-Zm.UbqM1:1:8 (SEQ ID NO: 145) se upoređuje sa kontrolnim amplikonima, PCR0145942 (EXP-Os.Act1:1:9, SEQ ID NO: 179) i PCR0145944 (EXP.CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1, SEQ ID NO: 170) u pogledu GUS ekspresije. GUS ekspresija vođena od strane EXP sekvence EXP-Zm.UbqM1:1:8 je više od one od dve kontrole. Donja Tabela 11 prikazuje srednje GUS i luciferaza vrednosti utvrđena za svaki amplikon. Donja Tabela 12 prikazuj GUS/RLuc i GUS/Fluc odnose ekspresije normalizovano u odnosu na EXP-Os.Act1:1:9 i EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 vođenom ekspresijom u protoplastima kukuruza.
Tabela 11. Srednja vrednost GUS i luciferaza aktivnosti u transformisanim protoplast ćelijama lista kukuruza.
Tabela 12. GUS/Rluc i GUS/Fluc odnosi ekspresije normalizovani u odnosu na EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) i EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170) u protoplastima lista kukuruza.
U trećem setu eksperimenata, amplikon GUS transgenih kaseta se pravi kako je u gornjem tekstu opisano i vrše se ogledi za ekspresiju vođenu sa EXP sekvencama, EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115 i EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116). Amplikoni se sadrže u EXP sekvenci radno povezanu za GUS-1 kodirajuću sekvencu koja je radno povezana za T-AGRtu.nos-1:1:13 3’ UTR. Ekspresija se upoređuje sa kontrolama EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) i EXP-CaMv.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170). Donja Tabela 13 prikazuje srednje GUS i lucifaraza vrednosti utvrđena za svaki amplikon. Donja Tabela 14 prikazuje GUS/Rluc odnose ekspresije normalizovane u odnosu na EXP-Os.Act1:1:9 i EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 vođenu ekspresiju u protoplastima kukuruza.
Tabela 13. Srednja vrednost GUS i luciferaza aktivnosti u transformisanim ćelijama protoplasta lista kukuruza.
Tabela 14. GUS/Rluc i GUS/Fluc odnosi ekspresije normalizovani u odnosu na EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) i EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170) u protoplastima lista kukuruza.
Kako se može videti u gornjoj Tabeli 14, EXP sekvence EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) i EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116) su sposobne da vode ekspresiju transgena. Ekspresija vođena sa EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114) i EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) su veće od onih kod obe kontrole. Ekspresija vođena sa EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116) je manja od EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170) ali veća od one kod kontrole, EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179).
U četvrtom setu eksperimenata, amplikon GUS trangenih kaseta se pravi kako je u gornjem tekstu opisano i vrše se ogledi ekspresije vođene EXP sekvencama, EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO:98), EXP-Cl.Ubq1:1:16 (SEQ ID NO: 93) i EXP-Cl.Ubq1:1:17 (SEQ ID NO: 97). Ekspresija se upoređuje sa kontrolama EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) i EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170). Donja Tabela 15 prikazuje srednje GUS i luciferaza vrednosti utvrđene za svaki amplikon. Donja Tabela 16 prikazuje GUS/Rluc i GUS/Fluc odnose ekspresije normalizovane u odnosu na EXP-Os.Act1:1:9 i EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 vođenu ekspresiju u protoplastima kukuruza.
Tabela 15. Srednje vrednosti GUS i luciferaza aktivnosti u transformisanim ćelijama protoplasta lista kukuruza.
Tabela 16. GUS/Rluc i GUS/Fluc odnosi ekspresije normalizovane u odnosu na EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) i EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170) u protoplastima lista kukuruza.
Kao što se može videti u Tabeli 16, EXP sekvence EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:16 (SEQ ID NO: 93) i EXP-Cl.Ubq1:1:17 (SEQ ID NO: 97) su sposobne da vode ekspresiju transgena. Ekspresija vođena putem svake od EXP sekvenci je veća od one kod obe kontrole.
U petom setu eksperimenata, amplikon GUS transgenih kaseta se pravi kako je to u opisano u gornjem ogledu ekspresije vođenom od strane EXP sekvenci, EXP-Zm.UbqM1:1:11 (SEQ ID NO: 149) i EXP-Cl.Ubq1:1:23 (SEQ ID NO: 108). Ekspresija se upoređuje sa kontrolama EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) i EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb+Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 163). Donja Tabela 17 prikazuje srednje GUS i luciferaza vrednosti utvrđene za svaki amplikon. Donja Tabela 19 prikazuje GUS/Rluc odnose ekspresije normalizovane u odnosu na EXP-Os.Act1:1:9 i EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 vođenu ekspresiju u protoplastima kukuruza.
Tabela 17. Srednja vrednost GUS i luciferaza aktivnosti u transformisanim ćelijama protoplasta lista kukuruza.
Tabela 18. GUS/RLuc odnosi ekspresije normalizovani u odnosu na EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) i EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 163) u protoplastima lista kukuruza.
Kako se može videti u gornjoj Tabeli 18, EXP sekvence, EXP-Zm.UbqM1:1:11 (SEQ ID NO: 149) i EXP-Cl.Ubq1:1:23 (SEQ ID NO: 108) su sposobne da vode GUS ekspresiju u protoplastima lista kukuruza. Ekspresija je sličan onoj kod kontrole, EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) i manja od one kod EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 163).
Efikasnost regulatornih elemenata koji vode GUS ekspresiju iz amplikona može biti slično proučavana u protoplastima lista šećerne trske. Na primer, protoplasti šećerne trske mogu biti transformisani sa DNK amplikonima izvedenim iz biljnih vektora ekspresije kji sadrže EXP sekvence, koji vode ekspresiju β-glukuronidaza (GUS) transgena, i upoređeno sa protoplastom lista u kome je ekspresija GUS vođena poznatim konstitutivnim promoterima. Na isti način, regulatorni elementi koji vode CP4 ekspresiju iz amplikona u protoplastima kukuruza ili pšenice mogu biti na sličan način proučavani.
Primer 4. Analiza regulatornih elemenata koji vode GUS u protoplastima pšenice korišćenjem amplikona GUS transgene kasete.
Protoplasti lista pšenice se transformišu sa DNK amplikonima iz biljnih vektora ekspresije koji sadrže EXP sekvencu, koja vodi ekspresiju β-glukuronidaza (GUS) transgena i upoređivanjem sa protoplastom lista u kome je ekspresija GUS vođena poznatim konstitutivnim promoterima.
Ćelije protoplasta pšenice su izvedene iz tkiva lista transformisanog korišćenjem postupaka poznatih u nauci sa amplikonima proizvedenim iz amplifikacije GUS transgenih kaseta koje sadrže biljne vektore ekspresije da bi se uporedila ekspresija transgena (GUS) vođenog sa EXP sekvencama navedenim u Tabelama 10-11 sa onim od poznatih konstitutivnih promotera korišćenjem metodologije kako je opisana u prethodnom primeru (Primer 3), korišćenjem istih amplikona GUS kasete kao onih koji se koriste u gornjem ogledu sa kukuruzom u Primeru 3. Kontrolni amplikoni GUS kasete i Luciferaza plazmidi koji se koriste za transformaciju protoplasta pšenice su takođe isti kao oni prezentovani u prethodnom primeru i dati u gornjoj Tabeli 7 u Primeru 3. Na isti način, negativne kontrole se koriste za utvrđivanje GUS i luciferaza porekla, kako je u gornjem tekstu opisano. Protoplasti lista pšenice se transformišu korišćenjem PEG-baziranog postupka transformacije, kako je to opisano u gornjem Primeru 3. Tabela 19 daje srednju vrednost GUS i LUC aktivnosti viđene u ćelijama protoplasta lista pšenice, a Tabela 20 prikazuje normalizovane GUS/Rluc odnose ekspresije u protoplastima pšenice.
Tabela 19. Srednja vrednost GUS i luciferaza aktivnosti u transformisanim ćelijama protoplasta lista pšenice.
Tabela 20. GUS/RLuc odnosi ekspresije normalizovani u odnosu na EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) i EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 163) u protoplastima lista pšenice.
Kako se može videti u gornjoj Tabeli 20, gotovo sve EXP sekvence su sposobne da vode GUS ekspresiju transgena u ćelijama pšenice. GUS transgena ekspresija vođena od strane EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-SETit.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 117), EXP-SETit.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 123), EXP-SETit.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 124), EXP-Sv.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 128), EXP-Sv.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 132), EXP-Sv.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 134), EXP-Zm.UbqM1:1:6 (SEQ ID NO: 137), EXP-Zm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141), EXP-Sb.Ubq4:1:2 (SEQ ID NO: 151), EXP-Sb.Ubq6:1:2 (SEQ ID NO: 153) i EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98) je mnogo veća od GUS ekspresije vođene od strane EXP-Os.Act1:1:9. GUS ekspresija amplikona u ćelijama protoplasta lista pšenice u odnosu na EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 je blago različita od ekspresije primećene u ćelijama protoplasta kukuruza. Svaka od EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-SETit.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 117), EXP-SETit.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 123), EXP-SETit.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 124), EXP-Sv.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 128), EXP-Sv.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 132), EXP-Sv.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 134), EXP-Zm.UbqM1:1:6 (SEQ ID NO: 137), EXP-Zm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141) i EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98) demonstriraju veće nivoe GUS ekspresije u odnosu na EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1. EXP sekvence EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-Sb.Ubq4:1:2 (SEQ ID NO: 151) i EXP-Sb.Ubq6:1:2 (SEQ ID NO: 153) demonstrira niže nivoe GUS ekspresije u odnous na EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1.
U drugom setu eksperimenata, amplikon GUS transgene kasete su napravljene kako je opisano u gornjem tekstu i vrše se oglesi ekspresije vođene EXP sekvencama, EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXP.Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) i EXP.Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116). Amplikoni se sadrže u EXP sekvenci radno povezanoj za GUS-1 kodirajuću sekvencu koja je radno povezana za T-AGRtu.nos-1:1:13 3’ UTR. Ekspresija se upoređuje sa kontrolama EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) i EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170). Donja Tabela 21 prikazuje srednje GUS i luciferaza vrednosti utvrđena za svaki amplikon. Donja Tabela 22 prikazuje GUS/Rluc odnose ekspresije normalizovana u odnosu na EXP-Os.Act1:1:9 i EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 vođenu ekspresiju u protoplastima kukuruza.
Tabela 21. Srednja vrednost GUS i luciferaza aktivnosti u transformisanim ćelijama protoplasta lista pšenice.
Tabela 22. GUS/Rluc i GUS/Fluc odnosi ekspresije normalizovani u odnosu na EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) i EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170) u protoplastima lista pšenice.
Kao što se može videti iz gornje Tabele 22, EXP sekvence EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) i EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116) su sposobne da vode ekspresiju transgena. Ekspresija vođena sa EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114) i EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) je veća od one kod obe kontrole. Ekspresija vođena EXPCl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116) je niža od EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170) ali viša nego kod kontrole EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179).
U trećem setu eksperimenata, amplikon GUS transgenih kaseta je napravljen kako je opisano u gornjem ogledu ekspresije vođene EXP sekvencama, EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:16 (SEQ ID NO: 93) i EXP-Cl.Ubq1:1:17 (SEQ ID NO: 97). Ekspresija se upoređuje sa kontrolama EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) i EXP-CaMv.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170). Donja Tabela 23 prikazuje srednje GUS i luciferaza vrednosti utvrđene za svaki amplikon. Donja Tabela 24 prikazuje GUS/Rluc i GUS/Fluc odnose ekspresije normalizovane u odnosu na EXP-Os.ACT1:1:9 i EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 vođenom ekspresijom u protoplastima kukuruza.
Tabela 23. Srednja vrednost GUS i luciferaza aktivnosti u transformisanim ćelijama protoplasta lista pšenice.
Tabela 24. GUS/Rluc i GUS/Fluc odnosi ekspresije normalizovane u odnosu na EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) i EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170) u protoplastima lista pšenice.
Kao što se može videti u gornjoj Tabeli 24, EXP sekvence EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:16 (SEQ ID NO: 93) i EXP-Cl.Ubq1:1:17 (SEQ ID NO: 97) su sposobne da vode ekspresiju transgena. Ekspresija vođena putem svake od EXP sekvenci je veća od one kod obe kontrole.
U četvrtom setu eksperimenata, amplikon GUS transgenih kaseta se pravi kako je to u opisano u gornjem ogledu ekspresije vođenom od strane EXP sekvenci, EXP-Zm.UbqM1:1:11 (SEQ ID NO: 149) i EXP-Cl.Ubq1:1:23 (SEQ ID NO: 108). Ekspresija se upoređuje sa kontrolama EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) i EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb+Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 163). Donja Tabela 25 prikazuje srednje GUS i luciferaza vrednosti utvrđene za svaki amplikon. Donja Tabela 26 prikazuje GUS/Rluc odnose ekspresije normalizovane u odnosu na EXP-Os.Act1:1:9 i EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 vođenu ekspresiju u protoplastima kukuruza.
Tabela 25. Srednja vrednost GUS i luciferaza aktivnosti u transformisanim ćelijama protoplasta lista pšenice.
Tabela 26. GUS/RLuc odnosi ekspresije normalizovani u odnosu na EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) i EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 163) u protoplastima lista pšenice.
Kako se može videti u gornjoj Tabeli 26, EXP sekvence, EXP-Zm.UbqM1:1:11 (SEQ ID NO: 149) i EXP-Cl.Ubq1:1:23 (SEQ ID NO: 108) su sposobne da vode GUS ekspresiju u protoplastima lista pšenice. Ekspresija je slična onoj kod kontrole, EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) i manja od one kod EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 163).
Primer 5: Analiza regulatornih elemenata kji vode GUS u protoplastima šećerne trske korišćenjem amplikona GUS transgene kasete
Protoplasti šećerne trske se transformišu sa DNK amplikonima izvedenim iz biljnih vektora ekspresije koji sadrže EXP sekvencu, koja vodi ekspresiju β-glukuronidaza (GUS) transgena i upoređivanjem sa protoplastom lista u kome je ekspresija GUS vođena poznatim konstitutivnim promoterima.
Ćelije protoplasta šećerne trske izvedene i tkiva lista se transformišu korišćenjem PEG-baziranog postupka transformacije, kako je to opisano u gornjem Primeru 3 sa amplikonima proizvedenim od amplifikacije GUS transgenih kaseta koje sadrže biljne vektore ekspresije da se uporedi ekspresija transgena (GUS) vođenog sa jednom od EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) i EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116) koje su prezentovane u donjoj Tabeli 27, sa onim od poznatih konstitutivnih promotera.
Tabela 27. Amplikoni GUS biljne ekspresija i korespondirajući šablon plazmid konstrukt amplikona i EXP sekvence.
Kontrola amplikona GUS kasete i luciferaza plazmida koje se koriste za transformaciju protoplasta šećerne trske su takođe iste kao one prezentovane u Primerima 2 do 5 i date su u gornjoj Tabli 7 iz Primera 3. Na isti način, negativne kontrole se koriste za utvrđivanje GUS i luciferaza porekla, kako je to u gornjem tekstu opisano. Tabela 28 navodi GUS i Luc aktivnost viđenu u transformisanim ćelijama protoplasta lista šećerne trske, a Tabela 29 prikazuje normalizovane GUS/Rluc odnose ekspresije u protoplastima lista šećerne trske.
Tabela 28. Srednja vrednost GUS i luciferaza aktivnosti u transformisanim ćelijama protoplasta lista pšenice.
Tabela 29. GUS/Rluc i GUS/Fluc odnosi ekspresije normalizovani u odnosu na EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) i EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170) u protoplastima lista šećerne trske.
Kao što se može videti u gornjoj Tabeli 29, EXP sekvence EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) i EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116) su sve sposobne da vode ekspresiju transgena u protoplastima šećerne trske. EXP sekvence, EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114) i EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) ekspresuju GUS veću od EXP-CaMv.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170) u ovom eksperimentu.
Primer 6: Analiza regulatornih elemenata koji vode CP4 u protoplaste kukuruza.
Ovaj primer ilustruje sposobnost EXP-Sv.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 128), Exp-Sv.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 132), EXP-Sv.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 133), EXP-Zm.UbqM1:1:6 (SEQ ID NO: 137), EXP-Zm.UbqM1:1:8 (SEQ ID NO: 145), EXP-Zm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141), EXP-SETit.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 117), EXP-SETit.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 123), EXP-SETit.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 124), EXP-Sb.Ubq4:1:2 (SEQ ID NO: 151) i EXP-Sb.Ubq6:1:2 (SEQ ID NO: 153) u vođenju ekspresije gena CP4 glifozat tolerancije u protoplastima kukuruza. Ove EXP sekvence se kloniraju u biljne konstrukte plazmida binarne transformacije korišćenjem postupaka poznatih u nauci. Rezultirajući biljni vektori ekspresije sadrže granični region od A. tumefaciens, ubikvitin EXP sekvencu radno povezanog 5’ za plastid targetirane EPSPS kodirajuće sekvence tolerantne na glifozat (CP4, US RE39247), radno povezanog 5’ za T-AGRtu.nos-1:1:13 3’ UTR i levi granični region od A. tumefaciens (B-AGRtu.leva granica). Rezultirajući plazmid konstrukti se koriste da se transformišu ćelije protoplasta lista kukuruza korišćenjem postupaka poznatih u nauci.
Koriste se plazmid konstrukti dati u Tabeli 30, sa EXP sekvencama kako su definisane u Tabeli 1. Tri kontrolna plazmida (pMON30098, pMON42410 i pMON30167), sa poznatim konstitutivnim elementima koji vode ili CP4 ili GFP, se konstruišu i koriste da se uporede CP4 nivoi ekspresije vođene sa ovim EXP sekvencama u odnosu sa CP4 ekspresiju vođenu poznatim konstitutivnim elementima ekspresije. Dva druga plazmida (pMON19437 i pMON6393) se takođe koriste kako je to gore opisano da se proceni efikasnost i održivaost transformacije. Svaki plazmid sadrži specifičnu luciferaza kodirajuću sekvencu vođenu konstitutivnom EXP sekvencom.
Protoplasti lista kukuruza se transformišu korišćenjem PEG-baziranog postupka transformacije, kako je to prikazano u gornjem Primeru 2. Merenja i CP4 i luciferaze se obavljaju na sličan način kao u gronjem Primeru 2. Prosečni nivoi CP4 ekspresije proteina izražen kao deo po milionu (ppm) su prikazani u donjoj Tabeli 30.
Tabela 30. Prosečna CP4 ekspresija proteina u protoplaste lista kukuruza.
Kao što se može videti u Tabeli 30, EXP-Sv.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 128), EXP-Sv.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 132), EXP-Sv.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 133), EXP-Zm.UbqM1:1:6 (SEQ ID NO: 137), EXP-Zm.UbqM1:1:8 (SEQ ID NO: 145), EXP-Zm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141), EXP-SETit.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 117), EXP-SETit.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 123), EXP-SETit.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 124) i EXP-Sb.Ubq6:1:2 (SEQ ID NO: 153) vode ekspresiju CP4 transgena na nivoima bliskim ili višim od CP4 nivoa ekspresije vođene od strane EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 i EXP-Os.Act1:1:1. EXP sekvenca, EXP-Sb.Ubq4:1:2 (SEQ ID NO: 151) demonstrira sposobnost da vodi ekspresiju CP4, ali je nivo ekspresije niži od onog kod konstitutivnih kontrola.
Podaci slični gore pomenutim mogu takođe biti dobijeni iz biljaka koje su stailno transformisane sa gore opisanim plazmid konstruktima, na primer, biljke generacije(a) potomstva Ro, R1 ili F1 ili kasnije. Na isti način može biti proučavana ekspresija iz drugih plazmid konstrukata. Na primer pMON141619, sadrže EXP sekvencu EXP-ANDge.Ubq1:1:8, dok se pMON142862 sastoji od EXP sekvence EXP-ERIra.Ubq1:1:8. Ovi i drugi konstrukti mogu biti analizirani na ovaj način.
Primer 7: Analiza regulatornih elemenata koji vode CPR u protoplaste kukuruza korišćenjem Amplikon CP4 transgene kasete.
Ovaj primer ilustruje sposobnost EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXPANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115), EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116), EXP-Cl.Ubq1:1:16 (SEQ ID NO: 93) i EXP-Cl.Ubq1:1:17 (SEQ ID NO: 97) u vođenju ekspresije glifozit tolerancije gena CP4 u protoplastima kukuruza. Ove EXP sekvence se kloniraju u biljni plazmid konstrukte binarne transformacije. Rezultirajući biljni vektori ekspresije se koriste za amplifikaciju šablona da se proizvede amplikon transgene kasete koji se sastoji od ubikvitin EXP sekvence radno povezane 5’ za plastid koji targetira glifozat tolerantnu EPSPS kodirajuću sekvencu (CP4, US RE39247). radno povezanu 5’ za T-AGRtu.nos-1:1:13 3’ UTR i levi granični region od A. tumefaciens. Rezultirajući amplikoni se koriste da se transformišu ćelije protoplasta lista kukuruza.
Protoplasti lista kukuruza se transformišu korišćenje PEG-baziranog postupka transformacije, kako je to opisano u gornjem Primeru 2. Merenja oba CP4 se obavljaju korišćenjem ELISA-baziranog ogleda. Prosečni nivoi ekspresije CP4 proteina izraženi kao deo po milionu (ppm) su prikazani u donjim Tabelama 31 i 32.
U prvoj seriji eksperimenata, ekspresija CP4 vođena amplikonima koji sadrže EXP sekvence, EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) i EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116) se ogleda u transformisanim protoplastima lista kukuruza i upoređuje se sa nivoima ekspresije CP4 vođene od strane konstitutivnih kontrola, EXP-CaMV.35S-eng+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170) i EXP-Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO. 164), Prosečni nivoi ekspresije CP4 proteina izraženi kao deo po milionu (ppm) su prikazani u donjoj Tabeli 31.
Tabela 31. Prosečna ekspresija CP4 gena u protoplastima lista kukuruza.
Kao što se može videti u gornjoj Tabeli 31, EXP sekvence EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) i EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116) su sposobne da vode CP4 ekspresiju. Sve EXP sekvence uz izuzetak EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO. 116) vode CP4 nivoe ekspresije na mnogo višem nivou nego što to čini konstitutivna kontrola EXP-Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO. 164). Nivoi ekspresije su niži nego oni kod EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170).
U drugoj seriji eksperimenata, ekspresija CP4 vođena amplikonima sastavljenim od EXP sekvenci EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:16 (SEQ ID NO: 93) i EXP-Cl.Ubq1:1:17 (SEQ ID NO: 97) se ogledaju u transformisanim protoplastima lista kukuruza i upoređuju sa nivoima ekspresije CP4 vođenim od strane konstitutivne kontrole, EXP-Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 164). Prosečni nivoi ekspresije CP4 proteina izraženi su u deo po milionu (ppm) i prakazani su u donjoj Tabeli 32.
Tabela 32. Prosečna ekspresija CP4 proteina u protoplastima lista kukuruza.
Kao što se može videti u gornjoj Tabeli 32, EXP sekvence EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:16 (SEQ ID NO: 93) i EXP-Cl.Ubq1:1:17 (SEQ ID NO: 97) su sposobne da vode CP4 ekspresiju. Nivoi ekspresije vođeni od strane sve tri EXP sekvence su viši od one kod konstitutivne kontrole, EXP-Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 164).
Primer 8: Analiza regulatornih elemenata koji vode CP4 u protoplaste pšenice.
Ovaj primer ilustruje sposobnost EXP-Sv.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 128), EXP-Sv.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 132), EXP-Sv.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 133), EXP-Zm.UbqM1:1:6 (SEQ ID NO: 137), EXP-Zm.UbqM1:1:8 (SEQ ID NO: 145), EXP-Zm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141), EXP-SETit.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 117), EXP-SETit.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 123), EXP-SETit.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 124), EXP-Sb.Ubq4:1:2 (SEQ ID NO: 151) i EXP-Sb.Ubq6:1:2 (SEQ ID NO: 153) da vode CP4 ekspresiju u protoplastima lista pšenice. Ove EXP sekvence se kloniraju u biljne plazmid konstrukte binarne transformacije korišćenjem postupaka poznatih u nauci, i kako je to opisano u gornjim Primerima 2 i 5.
Tri kontrolna plazmida (pMON30098, pMON42410, kako su prethodno opisani, i pMON43647 koji sadrže desni granični region od Agrobacterim tumefaciens sa EXP-Os.Act+CaMv.35S.2xA1-B3+Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 138) radno povezanom 5’ za plastid koji targetira kodirajuću sekvencu glifozat tolerancije (CP4, US RE39247), radno povezan 5’ za T-AGRtu.nos-1:1:13, i levi granični region (B-AGRtu.leva granica) sa poznatim regulatornim elementima koji vode bilo CP4 ili GFP su konstruisani kako je to dato u Primeru 5.
Protoplasti lista pšenice se transformišu korišćenjem PEG-baziranog postupka transformacije kako je to opisano u prethodnim primerima uz izuzetak da se koristi 1,5 X 10<5>ćelija protoplasta po ogledu. Ogled ekspresije luciferaze i CP4 transgena se obavlja kako je to opisano u gornjem primeru 6. Srednja vrednost nivoa CP4 ekspresije utvđena sa CP4 ELISA je prezentovana u donjoj Tabeli 34.
Tabela 34. Srednja vrednost ekspresije CP4 proteina u ćelijama protoplasta lista pšenice.
Ukupna količina CP4 ekspresije u protoplastima pšenice vođene od strane EXP sekvenci i poznate kontitutivne EXP sekvence EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 demonstrira različite nivoe CP4 ekspresije u protoplastima pšenice kada se uporedi sa protoplastima kukuruza.
Nekoliko EXP sekvenci vode CP4 ekspresiju na nižim nivoima u protoplastima pšenice od poznatih konstitutivnih EXP sekvenci EXP-Os.Act1+CaMV.35S.2xA1-B3+Os.Act1:1:1 i EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1. Dve EXP sekvence, EXP-Zm.UbqM1:1:6 (SEQ ID NO: 137) i EXP-SETit.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 117), daju više nivoe CP4 ekspresije u protoplastima pšenice od poznatih konstitutivnih, EXP sekvenci u ovom ogledu. EXP-Zm.UbqM1:1:2 vodi ekspresiju CP4 na najvišem nivou, sa nivoima ekspresije koje su 2,2 do 3,4 puta više od EXP-Os.Act1+CaMV.35S.2xA1-B3+Os.Act1:1:1 i EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1, svake posebno. Sve EXP sekvence za koje se vrše ogledi demonstriraju kapacitet da vode ekspresiju CP4 u ćelijama pšenice.
Primer 9: Analiza regulatornih elemenata koji vode CP4 u protoplastima pšenice korišćenjem amplikona CP4 transgene kasete.
Ovaj primer ilustruje sposobnost EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115), EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116), EXP-Cl.Ubq1:1:16 (SEQ ID NO: 93) i EXP-Cl.Ubq1:1:17 (SEQ ID NO: 97) u vođenju ekspresije glifozat tolerancije gena CP4 u protoplastima pšenice. Ove EXP sekvence se kloniraju u biljni plazmid konstrukte binarne transformacije. Rezultirajući biljni vektori ekspresije se koriste za amplifikaciju šablona da se proizvede amplikon transgene kasete koji se sastoji od ubikvitin EXP sekvence radno povezane 5’ za plastid koji targetira glifozat tolerantnu EPSPS kodirajuću sekvencu (CP4, US RE39247). radno povezanu 5’ za T-AGRtu.nos-1:1:13 3’ UTR i levi granični region od A. tumefaciens. Rezultirajući amplikoni se koriste da se transformišu ćelije protoplasta lista kukuruza.
Protoplasti lista pšenice se transformišu korišćenje PEG-baziranog postupka transformacije, kako je to opisano u gornjem Primeru 2. Merenja oba CP4 se obavljaju korišćenjem ELISA-baziranog ogleda. Prosečni nivoi ekspresije CP4 proteina izraženi kao deo po milionu (ppm) su prikazani u donjim Tabelama 35 i 36.
U prvoj seriji eksperimenata, ekspresija CP4 vođena amplikonima koji se sastoje od EXP sekvenci EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) i EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116) se ogledaju u transformisanim protoplastima lista pšenice i upoređuje se sa nivoima CP4 ekspresije vođene od strane konstitutivnih kontrola, EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170) i EXP-Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 164), Prosečni nivoi ekspresije CP4 proteina izraženi kao deo po milionu (ppm) su prikazani u donjoj Tabeli 35.
Tabela 35. Prosečna ekspresija CP4 proteina u protoplastima lista pšenice.
Kao što se može videti u gornjoj Tabeli 31, EXP sekvence EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) i EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116) su sposobne da vode CP4 ekspresiju. Sve EXP sekvence u izuzetak jedne EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116) vode nivoe ekspresije CP4 na mnogo višim nivoima nego što je to kod konstitutivne kontrole, EXP-Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 164). Nivoi ekspresije su otprilike isti ili niši od one kod EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170) za najveći broj EXP sekvenci.
U drugoj seriji eksperimenata, ekspresija CP4 vođena amplikonima koji se sastoje od EXP sekvenci EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP.Cl.Ubq1:1:16 (SEQ ID NO: 93) i EXP-Cl.Ubq1:1:17 (SEQ ID NO: 97) se ogledaju u transformisanim protoplastima lista pšenice i upoređuju se sa nivoima CP4 ekspresije vođene od strane konstitutivne kontrole, EXP-Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 164). Prosečni nivoi ekspresije CP4 proteina izraženi kao deo po milionu (ppm) su prikazani u donjoj Tabeli 36.
Tabela 36. Prosečna ekspresija CP4 proteina u protoplastima lista pšenice.
Kao što se može videti iz gornje Tabele 36, EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP.Cl.Ubq1:1:16 (SEQ ID NO: 93) i EXP-Cl.Ubq1:1:17 (SEQ ID NO: 97) su sposobne da vode CP4 ekspresiju. Nivoi ekspresije vođeni sa sve tri EXP sekvence su viši od onih kod kontitutivne kontrole, EXP-Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 164).
Primer 10: Analiza regulatornih elemenata koji vode CP4 u protoplaste šećerne trske.
Ovaj primer ilustruje sposobnost EXP-Sv.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 128), Exp-Sv.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 132), EXP-Sv.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 133), EXP-Zm.UbqM1:1:6 (SEQ ID NO: 137), EXP-Zm.UbqM1:1:8 (SEQ ID NO: 145), EXP-Zm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141), EXP-SETit.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 117), EXP-SETit.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 123), EXP-SETit.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 124), EXP-Sb.Ubq4:1:2 (SEQ ID NO: 151), EXP-Sb.Ubq6:1:2 (SEQ ID NO: 153) i Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98) u vođenju ekspresije CP4 gena glifozat tolerancije u protoplastima lista šećerne trske. Ove EXP sekvence se kloniraju u biljnim konstruktima plazmida binarne transformacije. Rezultirajući vektori sadrže desni granični region od Agrobacterium tumefaciens, ubikvitin EXP sekvencu radno povezanu 5’ za plastid targetirane EPSPS kodirajuće sekvence tolerantne na glifozat (CP4, US RE39247), radno povezane 5’ za T-AGRtu.nos-1:1:13 (SEQ ID NO: 127) ili T-CaMV.35S-1:1:1 (SEQ ID NO: 140) 3’ UTR i levi granični region od A. tumefaciens (B-AGRtu.leva granica). Rezultirajući plazmid konstrukti se koriste da se transformišu ćelije protoplasta lista šećerne trske korišćenjem postupka PEG transformacije.
Plazmid konstruktu pMON129203, pMON12904, pMON12905, pMON129210, pMON129211, pMON129212, pMON129200, pMON129201, pMON129202, pMON129219 i pMON129218 su takođe opisani u gornjnj Tabeli 12.
Tri kontrolna plazmida (pMON30167 opisan u gornjem tekstu; pMON130803 koji takođe sadrže EXP-Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 164); i pMON132804 koji sadrži EXP-P-CaMV.35S-enh-1:1:13/l-CaMV.35S-1:1:2/I-Os.Act1-1:1:18 (SEQ ID NO: 139)), sa poznatim konstitutivnim regulatornim elementima koji vode CP4 su konstruisani i koriste se da se uporede u odnosu na nivoe CP4 ekspresije vođene od strane ubikvitin EXP sekvenci navedenih u donjoj Tabeli 37.
Protoplasti lista šećerne trske se transformišu korišćenjem PEG-baziranog postupka transformacije. Srednja vrednost nivoa CP4 ekspresije se utvrđeni sa CP4 ELISA su prezentovani u donjoj Tabeli 37.
Tabela 37. Srednja vrednost ekspresije CP4 proteina u ćelijama protoplasta lista šećerne trske.
Kao što se može videti u gornjoj Tabeli 37, EXP sekvence demonstriraju sposobnost da vode CP4 ekspresiju u protoplastima šećerne trske. Nivoi ekspresije su lični sa ili veći od one ekspresije vođene sa EXP-Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 164). Jedna EXP sekvenca, EXP-Zm.UbqM1:1:8 (SEQ ID NO: 145) je demonstrirala više nivoe ekspresije kada se uporede sa EXP-P-CaMV.35S-enh-1:1:13/L-CaMV.35S-1:1:2/I-Os.Act1-1:1:19 (SEQ ID NO: 139) u protoplastima šećerne trske.
Primer 11. Analiza regulatornih elemenata koji vode CP4 u protoplaste šećerne trske korišćenjem amplikona CP4 Transgene kasete.
Ovaj primer ilustruje sposobnost EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) i EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116) u vođenju ekspresije glifozat tolerancije gena CP4 u protoplastima šećerne trske. Ove EXP sekvence se kloniraju u biljne plazmid konstrukte binarne transformacije. Rezultirajući biljni vektori ekspresije se koriste za amplifikaciju šablona da se proizvede amplikon transgene kasete koji se sastoji od ubikvitin EXP sekvence radno povezane 5’ za plastid koji targetira glifozat tolerantnu EPSPS kodirajuću sekvencu (CP4, US RE39247). radno povezanu 5’ za T-AGRtu.nos-1:1:13 3’ UTR i levi granični region od A. tumefaciens. Rezultirajući amplikoni se koriste da se transformišu ćelije protoplasta lista šećerne trske.
Protoplasti lista šećerne trske se transformišu korišćenjem PEG-baziranog postupka transformacije, kako je to opisano u gornjem Primeru 2. Merenja oba CP4 se obavljaju korišćenjem ELISA-baziranog ogleda.
Ekspresija CP4 vođena amplikonima koji se sastoje od EXP sekvenci EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114), EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) i EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116) se ogleda u transformisanim protoplastima lista pšenice i upoređuje se sa nivoima CP4 ekspresije vođene sa konstitutivnim kontrolama, EXP-CaMV.35S-eng+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 170) i EXP-Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 164). Prosek nivoa ekspresije CP proteina izražen kao deo po milionu (ppm) je prikazan u donjoj Tabeli 38.
Tabela 38. Prosek ekspresije CP4 proteina u protoplastima lista šećerne trske.
Kao što se može videti u gornjoj Tabeli 38, EXP sekvence EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (SEQ ID NO: 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 31), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Cl.Ubq1:1:13 (SEQ ID NO: 114) i EXP-Cl.Ubq1:1:14 (SEQ ID NO: 115) su sposobne da vode CP4 ekspresiju. EXP-Cl.Ubq1:1:15 (SEQ ID NO: 116) ne izgleda da vodi izražava CP4 ekspresiju u ovom ogledu.
Primer 12. Analiza regulatornih elemenata koji vode GUS u transgenskom kukuruzu.
Biljke kukuruza se transformišu putem biljnih vektora ekspresije koji sadrže EXP sekvence koje vode ekspresiju β-glukuronidaza (GUS) transgena, i rezultirajuće biljke se analiziraju na ekspresiju GUS proteina. Ubikvitin EXP sekvence se kloniraju u biljne konstrukte plazmida binarne transformacije postupcima poznatim u nauci.
Rezultirajući biljni vektori ekspresije sadrže desni granični region od A. tumefaciens, prvu transgenu kasetu da se ogleda EXP sekvenca radno povezana za kodirajuću sekvencu za βglukuronidazu (GUS) koja poseduje obradivi intron GUS-2, koji je u gornjem tekstu opisan, radno povezan 5’ za 3’ UTR iz protein gena pirinča za transfer lipida (T-Os.LTP-1:1:1, SEQ ID NO: 141); drugu kasetu odabira transgena koja se koristi za odabir transformisanih biljnih ćelija koje dodeljuju otpornost na herbicid glifozat (vođeno od strane Actin 1 promotera pirinča), i levog graničnog regiona od A. tumefaciens. Rezultirajući plazmidi se koriste da se transformišu biljke kukuruza. Tabela 39 daje oznake plazmida, EXP sekvence i SEQ ID Nos, koji su takođe opisani u Tabeli 1.
Tabela 39. Binarni plazmidi za transformaciju biljke i povezane EXP sekvence.
Biljke se transformišu korišćenjem Agrobacterim-posredovanih transformacije, na primer kako je opisano u U.S.Patent Application Publication 20090138985.
Histohemijska GUS analiza se koristi za kvalitativnu analiz ekspresije transformisanih biljaka. Svi delovi tkiva se inkubiraju sa GUS rastvorom mrljanja X-Gluc (5-bromo-4-hloro-3-indolilb-glukuronid) (1 miligram/mililitar) tokom vremenskog perioda odgovarajuće dužine, isperu i vizuelno se izvrši inspekdija na plavu koloraciju (obojenost). GUS aktivnost se kvalitativno utvrđuje direktnom vizuelnom inspekcijom ili inspekcijom pod mikroskopom korišćenjem odabranih biljnih organa i tkiva. Vrši se inspekcija Ro biljaka za ekspresiju u korenju i listovima kao i prašnicima, svili (svilenkasta vlakna kao deo ušiju kukuruza) i razvojnom semenu i embrionu 21 dan nakon oprašivanja (21 DAP).
Za kvantitativnu analizu, ekstrakuje se ukupan protein iz odabranih tkiva transformisanih biljki kukuruza. Jedan mikrogram ukupnog proteina se koristi sa fluorogenskim supstratom 4-metileumbeliferil- β-D-glukuronidom (MUG) u ukupnoj zapremini reakcije od 50 mikrolitara. Proizvod reakcije, 4-metilumbeliferon (4-MU), je maksimalno fluorescentan pri visokom pH, dok se hidroksilan grupa jonizuje. Dodavanje baznog rastvora natrijum karbonata simultano zaustavlja ogled i podešava pH za kvantifikovanje fluorescentnog proizvoda. Fluorescencija se meri ekscitacijom na 365 nm, emisijom na 445 nm korišćenjem Fluoromax-3 (Horiba; Kyoto, Japan) sa Mikromax Reader-om (čitačem), sa širinom proreza podešenom na ekscitaciju od 2 nm i emisiju od 3 nm.
Prosečna RoGUS ekspresija primećena za svaku transformaciju je prezentovana u donjim Tabelama 40 i 41. RoGUS ogled koji se obavlja na transformantima transformisanim sa pMON131957 (EXP-SETit.Ubq1:1:11, SEQ ID NO: 125) ne prolazi standarde kvaliteta. Ovi transformanti su ogledani na F1 generaciji i prezentovani su dalje niže u ovom primeru.
Tabela 40. Prosečna Ro GUS ekspresija u tkivu korena i lista.
Tabela 41. Prosečna Ro GUS ekspresija u reproduktivnim organima kukuruza (prašnik, svila) i razvojnom semenu (embrion i endosperm).
U Rokorena biljaka, nivoi GUS ekspresije u listu i korenu su se razlikovali između ubikvitin EXP sekvenci. Dok su sve EXP sekvence demonstrirale sposobnost da vode GUS ekspresiju transgena i stabilno transformisanim biljkama, svak EXP sekvenca je demonstrirala jedinstven obrazac ekspresije u odnosu na druge. Na primer, visoki nivoi GUS ekspresije su primećeni u ranim fazama razvoja korena (V4 i V7) za EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8) i EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27) a opasi su za VT fazu. Ekspresija korena vođena sa EXP-Zm.UbqM1:1:10 (SEQ ID NO: 139) demonstrira da nema ekspresije u V3 ali je visoka za V7 a onda opada za VT fazu. Ekspresija korena vođena za EXP-Zm.UbqM1:1:11 (SEQ ID NO: 149) se održava na sličnom nivou kroz razvoj od faza, V3, V7 do VT. Za ekspresiju korena je primećeno da se povećava od rane razvojne (V3/V4) do V7 faze a onda pada od V7 do V8 faze u biljkama transformisanim sa EXP-Cl.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 90), EXP-Cl.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 95) i EXP-Cl.Ubq1:1:23 (SEQ ID NO: 108). Nivoi GUS ekspresije takođe pokazuju dramatične razlike u tkivu lista. Najviši nivoi ekspresije lista su dodeljene u ranom razvoju (V3/V4) sa EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8) i EXP-ERIra.1:1:8 (SEQ ID NO: 27) što opada za V7 do VT faze. GUS ekspresija je održana od V3 do VT faze korišćenjem EXP-Zm.UbqM1:1:10 (SEQ ID NO: 139), EXP-Zm.UbqM1:1:11 (SEQ ID NO: 149), EXP-Zm.UbqM1:1:12 (SEQ ID NO: 143) i EXP-Cl.Ubq1:1:23 (SEQ ID NO: 108); i u manjoj meri korišćenjem EXP-SETit.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 119) i EXP-Sb.Ubq6:1:3 (SEQ ID NO: 155). Ekspresija u listu se povećava od V3 do V7 do VT faze korišćenjem EXP-Cl.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 90), EXP-Cl.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 95) i EXP-Cl.Ubq1:1:23 (SEQ ID NO: 108) dok ekspresija opada od V3 do VT faze korišćenjem EXP-Sv.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 136) i EXP-Sb.Ubq4:1:2 (SEQ ID NO: 151).
Na isti način, u pogledu reproduktivnog tkiva (prašnik i svila) i razvojnog semena (21 DAP embrion i endosperm) primećeni su različiti obrazci ekspresije jedinstveni za svaku EXP sekvencu. Na primer, visoki nivoi ekspresije su primećeni za prašnik i svilu kao i za razvojno seme korišćenjem EXP-Zm.UbqM1:1:10 (SEQ ID NO: 139), EXP-Zm.UbqM1:1:11 (SEQ ID NO: 149), EXP-Zm.UbqM1:1:12 (SEQ ID NO: 143 i EXP-Cl.Ubq1:1:23 (SEQ ID NO: 108). Ekspresija je visoka u prašniku i svili ali niska kod razvojnog semena korišćenjem EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8) i EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27). Ekspresija vođena sa EXP-Sb.Ubq7:1:2 (SEQ ID NO: 157) je visoka u reproduktivnom tkivu i visoka u razvojnom embrionu ali je niža u razvojnom endospermu. EXP sekvena, EXP-Sb.Ubq4:1:2 (SEQ ID NO: 151) samo demonstrira ekspresiju u prašniku ali ne i u svili i mnogo nižu ekspresiju u razvojnom semenu. EXP-Sv.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 130) demonstrira sličan obrazak kao EXP-Sb.Ubq4:1:2 (SEQ ID NO: 151) u pogledu reproduktivnog tkiva i razvojnog semena, ali dok EXP-Sb.Ubq4:1:2 (SEQ ID NO: 151) pokazuje ekspresiju u tkivu korena i lista, EXP-Sv.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 130) pokazuje mnogo nižu ekspresiju u ovim istim tkivima.
(0165) Rogeneracija transformanta, odabrani za umetke pojedinačne kopije se ukrštaju sa netransgenom LH244 linijom (rezultira u F1) ili se samo-oprašuju (rezultira u R1) da bi se proizvela F1ili R1populacija semena. U oba slučaja, heterozigotne F1ili R1biljke se odabiraju za proučavanje. Nivoi GUS ekspresije se mere u odabranim tkivima tokom razvoja kako je prethodno opisan. F1 ili R1 tkiva koja se koriste za ovu studiju uključuju: natopljeni embrion semena, natopljeni endosperm semena, koren i koleoptil 4 dana nakon klijanja (DAG); list i korena u V3 fazi; koren i zreo list u V8 fazi; koren, zrelo lišće, VT faza (prilikom metličenja, pre reprodukcije) prašnik, polen, list i ostarelo lišće, R1 klip, svila, koren i internode; zrno 12 dana naokon oprašivanja (DAP) i; embrion i endosperm 21 i 38 DAP. Odabrani uzorci tkiva se takođe analiziraju na F1 biljke izložene uslovima suše i hladnog vremena za transformante koji sadrže pMON132037 (EXP-SETit.Ubq1:1:10, SEQ ID NO: 119), pMON131957 (EXP-SETit.Ubq1:1:11, SEQ ID NO: 125), pMON131958 (EXP-Sv.Ubq1:1:11, SEQ ID NO: 130) i pMON132974 (EXP-Sb.Ubq7:1:2, SEQ ID NO: 157). V3 tkiva korena i lista je uzorkovano nakon izlaganja hladnoći i suši.
Stres suše se izaziva u F1, V3 biljke se transformišu sa pMON132037 (EXP-SETit.Ubq1:1:10, SEQ ID NO: 119), pMON131957 (EXP-SETit.Ubq1:1:11, SEQ ID NO: 125), pMON131958 (EXP-Sv.Ubq1:1:11, SEQ ID NO: 130) i pMON132974 (EXP-Sb.Ubq7:1:2, SEQ ID NO: 157) uskraćivanjem zalivanja 4 dana dopuštajući vodenom sadržaju da bude smanjen bar za 50% od originalnog sadržaja vode u potpunosti zalivene biljke. Protokol suše se sastoji u osnovi od sledećih koraka. Biljke u V3 fazi su lišene vode. Kako biljka kukuruza doživi sušu, oblik lista će se promenti od uobičajenog zdravog i raširenog izgleda do lista koji demonstrira sklapanje na sredini trajnih tkiva i izgled V-oblika kada se gleda od vrha lista ka stabljici. Ova promena u morfologiji uobičajeno počinje da se pojavljuje oko 2 dana nakon prestanka zalivanja i pokazano je u ranijim eksperimentima da je povezana sa gubitkom vode od oko 50% izmereno težinom lonaca pre prestanka zalivanje i težinom lonaca kada se primeti morfologija savijenog lista u nezalivanim biljkama. Za biljke se smatra da se nalaze pod uslovima suše, kada lišće pokazuje da vene o čemu svedoči savijanje na unutra (V-oblik) lista. Za ovaj nivo stresa se smatra da formira stres koji se događa pred smrt. Onda kada svaka biljka demonstrira izazivanje suše kako je to gore definisano, biljka se uništi da se dobiju uzorci i korena i lista.
Dodatno suši, F1 V3 biljke transformisane sa pMON132037 (EXP-SETit.Ubq1:1:10, SEQ ID NO: 119), pMON131957 (EXP-SETit.Ubq1:1:11, SEQ ID NO: 125), pMON131958 (EXP-Sv.Ubq1:1:11, SEQ ID NO: 130) i pMON132974 (EXP-Sb.Ubq7:1:2, SEQ ID NO: 157) su takođe izložene uslovima hladnoće da se utvrdi da li regulatorni elementi demonstriraju hladnoćom-izazvanu ekspresiju GUS. Podvrgavaju se cele biljke ogledu na indukciju GUS ekspresije pod stresom hladnoće u V3 fazi. Biljke kukuruza u V3 fazi se izlažu temperaturi od 12°C u komori rasta tokom 24 sata. Biljke u komori rasta se uzgajaju pod fluencom bele svetlosti od 800 mikro mola po kvadratnom metru po sekundi sa ciklusom svetlosti od deset sati bele svetlosti i četrnaest sati u tami. Nakon izlaganja hladnoći, tkiva lista i korena se uzorkuju za kvantitativnu GUS ekspresiju.
GUS ekspresija se meri kako je to u gornjem tekstu opisano. Prosek F1 GUS ekspresije utvrđen za svaki uzorak tkiva je prezentovan u donjim Tabelama 42 i 43.
Tabela 42. Prosek F1 GUS ekspresije u biljkama transformisanim sa pMON142864 i pMON142865.
Tabela 43. Prosek F1 GUS ekspresije u biljkama transformisanim sa pMON132037, pMON131957, pMON131958 i pMON132974.
U F1 biljaka kukuruza, nivoi GUS ekspresije u različitim uzorkovanim tkivima se razlikuju među ubikvitin EXP sekvencama. Dok sve EXP sekvence demonstriraju sposobnost da vode ekspresiju GUS transgena u stabilno transformisanim F1 biljkama kukuruza, gde svaka EXP sekvenca demonstrira jedinstven obrazac ekspresije u odnosu na druge. Na primer, ekspresija R1 korena je oko dva puta za EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27) u odnosu na EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8). Gus ekspresija u razvojnom embrionu semena na 38 DAP je skoro tri puta viša za EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27) u odnosu na EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8). Za razliku od toga ekspresija lista i korena u V3 i V8 fazi je otprilike ista za EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27) u odnosu na EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8).
F1GUS ekspresije u natopljenom semenu (tkiva embriona i endosperma) je mnogo viša u biljkama transformisanim sa EXP-Sb.Ubq7:1:2 (SEQ ID NO: 157) nego u onim transformisanim sa EXP-SETit.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 119), EXP-SETit.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 125) i EXP-Sv.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 130). Suša je izazvala povećanje u ekspresiji V3 korena u biljkama transformisanim sa EXP-SETit.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 119), EXP-SETit.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 125), EXP-Sv.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 130) i EXP-Sb.Ubq7:1:2 (SEQ ID NO: 157), ali je samo povećala ekspresiju lista u biljkama transformisanim sa EXP-SETit.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 125), EXP-Sv.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 130) i EXP-Sb.Ubq7:1:2 (SEQ ID NO: 157). Suša koja je pojačala V3 ekspresiju je najveća korišćenjem EXP-Sb.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 125). Ekspresija polena je takođe mnogo viša u biljkama sa EXP-Sb.Ubq7:1:2 (SEQ ID NO: 157) nego u onim transformisanim sa EXP-SETit.Ubq1:1:19 (SEQ ID NO: 119), EXP-SETit.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 125) i EXP-Sv.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 130). Ekspresija u R1 internode je najveća sa EXP-SETit.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 119) i EXP-Sv.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 130) a najmanja u biljkama transformisanim sa EXP-SETit.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 125).
Svaka EXP sekvenca demonstrira sposobnost da vodi ekspresiju transgena u stabilno transformisanim biljkama kukuruza. Ipak, svaka EXP sekvenca ima jedinstven obrazac ekspresije za svako tkivo i nudi šansu da se odabere EXP sekvenca koja će najbolje dati ekspresiju specifičnog transgena u zavisnosti od strategije ekspresije tkiva neophodne da se postigne željeni rezultat. Ovaj primer demonstrira da se EXP sekvence izolovane iz homogih gena ne moraju neophodno ponašati ekvivalentno u transformisanoj biljci i da ekspresija može biti utvrđena samo kroz empirijsko istraživanje osobina svake EXP sekvence i ne može se predvideti na osnovu homologije gena iz koga je promoter izveden.
Primer 13: Analiza regulatornih elemenata koji vode CP4 u transgenskom kukuruzu.
Biljke kukuruza se transformišu sa vektorima biljne ekspresije koji sadrže EXP sekvence koje vode ekspresiju CP4 transgena i rezultirajuće biljke se analiziraju na ekspresiju CP4 proteina.
EXP sekvence EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Sv.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 133) i EXP-Zm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141) se kloniraju u plazmid konstruktima binarne transformacije biljke. Rezultirajući vektori sadrže desni granični region od Agrobacterium tumefaciens, ubikvitin EXP sekvencu radno povezanu 5’ za plastid koji targetuje glifozat tolerantnu EPSPS kodirajuću sekvencu (CP4, US RE39247), radno povezanu 5’ za T-AGRtu.nos-1:1:13 (SEQ ID NO: 127) 3’ UTR i levi granični region od A. tumefaciens. Donja Tabela 44 prikazuje plazmid konstrukte koji se koriste da transformišu kukuruz i korespondirajuće EXP sekvence.
Tabela 44. CP4 plazmid konstrukti i korespondirajuće EXP sekvence koji se koriste da se transformiše kukuruz.
Rezultirajući plazmidi se koriste da se transformišu biljke kukuruza. Transformisane biljke se odabiru za jednu ili dve kopije umetnute T-DNK i uzgajaju se u staklenoj bašti. Odabrana tkiva se uzorkuju iz Ro transformisanih biljaka u specifičnim fazama razvoja i nivoi CP4 proteina se mere u tim tkivima korišćenjem CP4 ELISA ogleda. Prosečna CP4 ekspresija primećena za svaku transformaciju je prikazana u donjim Tabelama 45 i 46 i grafički na Slici 7.
Tabela 45. Prosečna CP4 ekspresija lista i korena u Ro transformisanim biljkama kukuruza.
Tabela 46. Prosečna CP4 ekspresija u reproduktivnom tkuvu i razvojnom semenu u Ro transformisanim biljkama kukuruza.
Kao što se može videti u Tabelama 45 i 46, svaka od EXP sekvenci EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Sv.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 133) i EXP-Zm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141) je sposobna da vodi CP4 ekspresiju u svim tkivima koja su uzorkovana sa Rotransformisanih biljaka. Viša ekspresija CP4 u korenu i listu transformanata koji sadrže EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8) i EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27) koje vode CP4 od one kod EXP-Cl.Ubq1:1:10 (sEQ ID NO: 98) koja vodi CP4 može biti vezana za nivo vegetativne tolerancije na primenu glifozata kako je primećeno sa ove populacije transformanata (videti donji Primer 14).
Svaka EXP sekvenca prikazuje jedinstven obrazac ekspresije u pogledu nivoa ekspresije za svako tkivo koje je uzorkovano. Na primer, doke je CP4 ekspresija u listu, korenu i metlici slična za EXP sekvence, EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8) i EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), ekspresija u svili korišćenjem EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8) je pola od one ekspresije vođene sa ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27). Ovo može biti povoljno za ekspresiju transgena u u kojoj se želi konstitutivna ekspresija ali je poželjno manje ekspresije u tkivu svile. EXP sekvence demonstriraju jedinstvene obrazce CP4 konstitutivne ekspresije u Ro transformisanim biljkama kukuruza.
Ro transformisane biljke kukuruza se ukrštaju sa ne-transgeni LH244 varijetet da se proizvede F1seme. Rezultirajuća F1generacija semena se analizira na segregaciu transgene kasete i odabrane su analizu CP4 ekspresije heterozigotne biljke za CP4 kasetu. Seme se uzgaja u staklenoj bašti i proizvode se dve vrste biljaka, jedna grupa poprskana glifozatom dok je druga ostavljena ne poprskana. Ekspresija CP4 se analizira u odabranim tkivima korišćenjem standardnog ELISA baziranog ogleda. Prosečna CP4 ekspresija je prikazana u donjim Tabelama 47 i 48.
Tabela 47. Prosečna CP4 ekspresija u F1 transformisanim biljkama kukuruza.
Kao što se može videti u gornjoj Tabeli 47, CP4 ekspresija u listu i korenu je viša u F1transformantima transformisanim sa pMON141619 (EXP-ANDge.Ubq1:1:8, SEQ ID NO: 5) i pMON142862 (EXP-Erira.Ubq1:1:8, SEQ ID NO: 27) nego ona transformisana sa pMON129221 (EXP-Cl.Ubq1:1:10, SEQ ID NO: 98). Ekspresija u tkivu prašnika je slična za sve tri EXP sekvence dok je ekspresija u svili najviša korišćenjem EXP-Erira.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27). Ekspresija u razvojnom embrionu (21 DAP) je najviša u transformantima koji sadrže EXP-Erira.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27) i EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98) koje vode CP4. Ekspresija u razvojnom endospermu je viša u transformantima koji sadrže EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98) koja vodi CP4.
Tabela 48. Prosečna CP4 ekspresija u F1 transformisanim biljkama kukuruza.
Kao što se može videti u gornjim Tabelama 47-48, CP4 ekspresija je niža u svim tkivima F1 transformanata transformisanih sa pMON129205 (EXP-Sv.Ubq1:1:8, SEQ ID NO: 133) od onih transformisanih sa pMON141619 (EXP-ANDge.Ubq1:1:8, SEQ ID NO: 8), pMON142862 (EXP-ERIra.Ubq1:1:8, SEQ ID NO: 27) i pMON129221 (EXP-Cl.Ubq1:1:10, SEQ ID NO: 98).
Jedinstveni obrazci ekspresije dodeljeni od strane svake od EXP sekvenci za koje je vršen ogled daju mogućnost da se proizvede transgenska biljka u kojoj ekspresija može biti fino podešena da se učine mala podešavanje u ekspresiji transgena za optimalne performanse i efektivnost. Dodatno toma, empirijska testiranja ovih EXP sekvenci koje vode različitu ekspresiju transgena mogu da proizvedu rezultate u kojima je jedna određena EXP sekvenca najpogodnija za ekspresiju specifičnog transgena ili klase transgena dok je za drugu EXP sekvencu pronađeno da je najbolja za različiti transgen ili klasu transgena.
Primer 14. Analiza vegetativne glifozat tolerancije u Ro transgenskim biljkama kukuruza.
Biljke kukuruza se transformišu sa biljnim vektorima ekspresije koji sadrže EXP sekvence koje vode ekspresiju CP4 transgena, i rezultirajuće biljke se procenjuju na vegetativnu i reproduktivnu toleranciju primene glifozata.
F1 transformisane biljke kukuruza opisane u gornjem Primeru 13 transformisane sa pMON141619, pMON142862, pMON129221, pMON129205 i pMON129212 i koje sadrže EXP sekvence EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27), EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98), EXP-Sv.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 133) i EXP-Zm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141), gde svaka posebno vodi CP4 se procenjuju i na vegetativnu i na reproduktivnu toleranciju kada se poprskaju sa glifozatom. Deset F1 biljaka za svaki događaj se podele u dve grupe, gde se prva grupa sastoji od pet biljaka koje primaju glifozat sprej i u V4 i V8 fazi razvoja, a druga grupa od pet biljaka koje su ostavljene nepoprskane (odnosno kontrola). Glifozat se nanosi putem aplikacije prenosa folijarnog spreja korišćenjem Roundup WeatherMax ® pri brzini nanošenja od 1,5 a.e./jutru (a.e, ekvivalent kiseline). Nakon sedam do deset dana, na listovima svake od biljaka se procenjuje šteta. Vegetativna tolerancija (Veg Tol u Tabeli 49) se procenjuje upoređivanjem nepoprskanih i poprskanih biljaka za svaki događaj i skala ocene štete se koristi da dobije konačno ocenjivanje vegetativne tolerancije (T=tolerantno, NT=netolerantno). Dodatno tome na setu semena se vrši ogled za sve biljke u svakom od slučajeva. Mere seta semena između kontrolnih biljaka i poprskanih biljaka se upoređuje i dodeljivanje reproduktivne tolerancije (Repro Tol u Tabeli 49) je dato za svaki događaj bazirano na procentu seta semena poprskanih biljaka u odnosu na kontrole (T=tolerantno, NT=netolerantno). Donja Tabela 49 prikazuje ocene reproduktivne tolerancije za svaki događaj prskan u V4 i V8 fazama. Slovo „T“ označava tolerantno a „NT“ označava netolerantno.
Tabela 49. Ocene oštećenja lista individualno transformisanih slučajeva kukuruza u V4 i V8 fazama.
Iz gornje Tabele 49, svi transformisani slučajevi iz ogleda koji sadrže CP4 transgene kasete koje sadrže EXP sekvence EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27) i EXP-Zm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141) demonstriraju punu vegetativnu toleranciju zasnovanu na ocenama oštećenja koje ne prelaze ocenu deset. Četiri slučaja od devet koji sadrže EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8) i šest slučaja od devet koji sadrže EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 27) su i vegetativno i reproduktivno tolerantni na primenu glifozata. Za razliku od toga, slučajevi koji sadrže EXP-Cl.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 98) su bilo vegetativno tolerantni ili reproduktivno tolerantni ali ne i oba. Samo jedan slučaj koji sadrži EXP-Sv.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 133) demonstrira vegetativnu toleranciju a nijedan od slučajeva koji su testirani nije reproduktivno tolerantan. Svi slučajevi koji sadrže EXP-Zm.UbqM1:1:7 (SEQ ID NO: 141) demonstriraju vegetativnu toleranciju ali je procena reproduktivne tolerancije i dalje u toku.
Primer 15: Analiza ekspresije korišćenjem različitih sekvenci 3’ kraj Intron/Ekson upleteni čvor.
Ćelije protoplasta lista kukuruza i pšenice se transformišu sa biljnim konstruktima ekspresije koji sadrže EXP sekvence koje vode GUS ekspresiju koja sadrži isti promoter i lider ali različlit 3’ kraj nukleotida nakon sekvence intron/ekson upleteni čvor, 5’-AG-3’ da se vidi da li se na ekspresiju utiče blagom promenom u sekvenci. Ekspresija se takođe upoređuje sa ono od dva konstitutivna kontrolna plazmida.
Biljni konstrukti ekspresije su izgrađeni tako da sadrže GUS ekspresionu kasetu. Rezultirajući vektori se sastoje od Coix lacryma-job ubikvitin promotera, P-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 80) radno povezane 5’ za lider sekvencu, L-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 819, radno povezana 5’ za intron element prikazan u donjoj Tabeli 50 koji svaki ima različite nukleotide na 3’ kraju nakon sekvence intron/ekson upleteni čvor 5’-AG-3’, radno povezane 5’ za GUS kodirajuću sekvencu koja je radno povezana 5’ za T-AGRtu.nos-1:1:13 (SEQ ID NO: 127) 3’ UTR. Donja Tabela 50 prikazuje biljne konstrukte ekspresije i korespondirajuću 3’ kraj sekvencu.
Tabela 50. Biljni konstrukti ekspresije, introni i 3’ kraj sekvenca nakon intron/ekson upleteni čvor sekvence 5’-AG-3’.
Protoplasti kukuruza i pšenice se transformišu kako je prethodno opisano i ogledano na GUS i luciferaza ekspresiju. Donja Tabela 51 prikazuje prosečne GUS i RLuc vrednosti za protoplaste ekspresije i kukuruza i pšenice.
Tabela 51. Prosečne GUS i RLuc vrednosti za ćelje protoplasta kukuruza i pšenice.
GUS/RLuc vrednosti za svaku Coix lacryma-jobi ubikvitin EXP sekvencu iz Tabele 46 se koriste da se normalizuje ekspresija u odnosu na dve konstitutivne kontrole EXP-Os.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179) i EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 163) i prezentovane su u donjoj Tabeli 52.
Tabela 52. Normalizovane vrednosti ekspresije Coix lacryma-jobi ubikvitin EXP sekvenci u odnosu na EXP-OS.Act1:1:9 (SEQ ID NO: 179), i EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 (SEQ ID NO: 163).
Kao što je prikazano u gornjoj Tabeli 52, svako od Coix lacryma-jobi ubikvitin EXP sekvence obezbeđuju ekspresiju koja je veća od bilo koje konstitutivne kontrole u oba i kukuruzu i pšenici. Eskrespija u protoplaste kukuruza je relativno slična za sve Coix ubikvitin EXP sekvence. Ekspresija u pšenici je malo više promenjljiva. Korišćenje različitih 3’ kraj nukleotida nakon intron/ekson upleteni čvor sekvence, 5’-AG.30 ne izgleda da dramatično utiče na ekspresiju GUS uz izuzetak GUS vođenog sa EXP-Cl.Ubq1:1:20 (SEQ ID NO: 102). EXP-Cl.Ubq1:1:20 se sastoji od 3’ kraj nukleotidnih sekvenci, 5’-GAC-3’ nakon intron/ekson upleteni čvor 5’-AG-3’ sekvence i izaziva da ekspresija blago pada u odnosu na druge Coix ubikvitin EXP sekvence. Procena rezultirajuće spojene mesindžer RNK pokazuje da je otprilike 10% mRNK, ekspresovane korišćenjem EXP-Cl.Ubq1:1:20 (SEQ ID NO: 102) da se vodi GUS ekspresija, nepravilno spojeno. mRNK koja rezultira iz GUS ekspresije korišćenjem drugih Coix ubikvitin EXP sekvenci izgleda da obrađuje pravilno. Ovaj eksperiment pruža dokaz da bilo koji od 3’ kraj nukleotida za bilo koju od intron varijanti prezentovanih u Tabeli 2 iz primera 1 uz izuzetak 3’ kraj sekvence 5’-GAC-3’ za koju je pronađeno da je povezana samo sa intron elementom, I-Cl.Ubq1-1:1:19 (SEQ ID NO: 103) treba da bude pogodna za korišćenje u transgenim ekspresionim kasetama bez značajnog gubitka aktivnosti i obrade.
Primer 16: Pojačivači izvedeni iz regulatornih elemenata
Pojačivači su izvedeni iz promoter elemenata koji su ovde dati, kao što su oni prezentovani kao SEQ ID NOS: 2, 6, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 23, 26, 28, 30, 32, 34, 38, 40, 42, 46, 50, 56, 60, 64, 66, 70, 74, 76, 78, 80, 84, 86, 88, 91, 96 i 135. Pojačivač element se može sastojati od jednog ili više regulatornih elemenata koji , kada su radno povezani 5’ ili 3’ za promoter element, ili radno povezani 5’ ili 3’ za dodatne pojačivače koji su radno povezani za promoter, mogu da pojuačaju ili moguliraju ekspresiju transgena, ili da daju ekspresiju transgena u specifičnom tipu ćelije ili organu biljke ili u određenoj vremenskoj tački u razvoju ili u biološkom ritmu. Pojačivači su napravljeni uklanjenjem TATA boksa ili funkcionalno sličnih elemenata i bilo koje nizvodne sekvence sa promotera koji dopušta da se transkripcija inicira od promotera koji tu dati kako je opisano u gornjem tekstu, uključujući njihove fragmente, u kojem su uklonjeni TATA boks ili funkcionalno slični elementi i nizvodne sekvence od TATA boksa. Pojačivač, E-Cl.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 89) koji je izveden iz promotera, P-Cl.Ubq1-1:1:1, je ovde dat da demonstrira pojačivače izvedene iz promotera.
Pojačivači mogu biti izvedeni iz promotera koji su ovde dati i klonirani korišćenjem postupaka poznatih u nauci da budu radno povezani 5’ ili 3’ za promoter, ili radno povezani 5’ ili 3’ za dodatne pojačivače koji radno povezani za promoter. Alternativno, pojačivači se kloniraju, korišćenjem postupaka poznatih u nauci, da budu radno povezani za jednu ili više kopija pjačivača koje su radno povezane 5’ ili 3’ za promoter, ili radno povezane 5’ ili 3’ za dodatne pojačivače koji su radno povezani za promoter. Pojačivači mogu takođe biti klonirani da budu radno povezani 5’ ili 3’ za promoter izveden iz drugog roda organizama ili iz istog roda organizma koji su radno povezani za promoter izveden bilo iz istog ili različitog roda organizma, rezultirajući u himrnom regulatornom elementu. Biljni vektor GUS ekspresije transformacije biljke je konstruisan korišćenjem postupak poznatih u nauci na sličan način kao konstrukti opisani u prethodnim primerima u kojima rezultirajući biljni vektori ekspresije sadrže desni granični region od A. tumefaciens, prvu transgenu kasetu da se testira regulatorni ili himerni regulatirni element od koga se sadrž, regulatorni ili himerni regulatorni element, radno povezan za intron izveden iz HSP70 proteina toplotnog šoka Z. mays (I-Zm.DnaK-1:1:1 SEQ ID NO: 144) ili bilo kog od introna koji je ovde prezentovan ili bilo kog drugog introna, radno povezanog za kodirajuću sekvencu za β-glukuronidazu (GUS) koja bilo poseduje obradivi intron (GUS-2, SEQ ID NO: 160) ili ne intron (GUS-1, SEQ ID NO: 159), radno povezan za Nopalin sintaza 3’ UTR od A.tumefaciens (T-AGRru.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 161) ili 3’ UTR iz protein gena pirinča za transfer lipida (T-Os.LTP-1:1:1, SEQ ID NO: 175); drugu transgenu kasetu odabira koja se koristi za odabir transformisanih biljnih ćelija koja dodeljuje otpornost na herbicid glifozat (vođen Actin 1 promoterom pirinča), ili alternativno, antibiotik kanamicin (vođen od strane Actin 1 promotera pirinča) i levog graničnog regiona od A. tumefaciens. Rezultirajući plaznmidi se koriste da se transformišu biljke kukuruza ili drugi rod biljaka postupcima koji su u gornjem tekstu opisani ili putem drugih Agrobacterium-posredovanih ili bombardovanje česticama postupaka poznatih u nauci. Alternativno ćelije protoplasta izveden iz kukuruza ili drugog roda biljaka se transformišu postupcim poznatim u nauci da se izvedu prolazni ogledi.
GUS ekspresija vođena od strane regulatornog elementa koji sadrži jedan ili više pojačivača se procenjuje u stabilnim i prolaznim ogledima biljke da se utvrde dejstva pojačivača na ekspresiju transgena. Modifikacije jednog ili više pojačivača ili duplikacija jednog ili više pojačivača se obavlja korišćenjem svake kompozicije regulatornog elementa. Menjanje relativnih pozicija jednog ili više pojačivača u rezultirajućem regulatornom ili himernom regulatornom elementu može da utiče na transkripcionu aktivnost ili specifičnost regulatornog ili himernog regulatornog elementa i utvrđuje se empirijski da se identifikuju najbolji pojačivači za željeni profil ekspresije transgena u biljci kukuruza ili u biljci drugog roda.
Primer 17. Analiza intron pojačavanja GUS aktivnosti korišćenjem biljnih izvedenih protoplasta.
Intron je odabran na osnovu eksperimentisanja i upoređivanje se vrši sas kontrolni vektorom ekspresije bez introna da se empirijski odabere intron i konfiguracija u okviru rasporeda vektora T-DNK za optimalnu ekspresiju transgena. Na primer, u ekspresiji gena otpornog na herbicide, kakav je CP4 koji dodeljuje toleranciju na glifozat, poželjno je da seima ekspresija transgena u okviru reproduktivnih tkiva kao i vegetativnih tkiva, da se spreči gubitak prinosa kada se primenjuje herbicid. Intron će u ovom slučaju biti odabran prema svojoj sposobnosti kada je radno povezan za konstitutivni promoter, da pojača ekspresiju dodeljenog transgena otpornog na herbicid, posebno u okviru reproduktivnih ćelija i tkiva transgenske biljke i tako da obezbedi i vegetativnu i reproduktivnu toleranciju transgenskoj biljci, kada se poprska herbicidom. U najvećem broju ubikvitin gena, 5’ UTR se sastoji od lidera koji ima ugrađenu intron sekvencu u sebi. Elementi ekspresije izvedeni iz takvih gena se prema tome podvrgavaju ogledima korišćenjem celokupne 5’ UTR koja sadrži promoter, lider i intron. Da se postignu različiti profili ekspresije ili da se modulira nivo ekspresije transgena, intron iz takvog elementa ekspresije može biti uklonjen ili supstituisan sa heterologim intronom.
Introni koji su ovde prezentovani kao SEQ ID NOS: 4, 7, 21, 24, 36, 44, 48, 52, 54, 58, 62, 68, 72, 82, 92, 94, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 118, 120, 122, 127, 129, 131, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 i 182 su identifikovani korišćenjem genomskih DNK dodirnih sekvenci u poređenju sa ekspresovanom sekvenco tag klaster ili cDNK dodirnih sekvenci da se identifikuju ekson i intron sekvence u okviru genomske DNK. Dodatno tome, 5’ UTR ili lider sekvence se takođe koriste da definišu intron/ekson upleteni čvor jednog ili više introna pod uslovima kada sekvenca gena kodira lider sekvencu što je prekinuto sa jednim ili više introna. Introni se kloniraju korišćenjem postupaka poznatih u nauci u biljni vektor transformacije tako da bude radno povezan 3’ za transkripcioni regulatorni element i lider fragment i radno povezan 5’ za bilo drugi lider fragment ili za kodirajuću sekvencu, na primer kako je opisano u dve transgene kasete prezentovane na Slici 1.
Tako se, na primer, prva moguća transgena kaseta (Transgena kaseta konfiguracija 1 na Slici 8) sastoji od promotera ili himernog promotera [A], radno povezanog 5’ za lider [B], radno pozvezan 5’ za test intron [C], radno povezan za kodirajući region [D], koji je radno povezan za 3’ UTR [E]. Alternativno, druga moguća transgena kaseta (Transgena kaseta konfiguracija 2 na Slici 8) se sastoji od promotera ili himernog promotera [F], radno povezanog 5’ za prvi lider ili fragment prvog lidera [G], radno povezan 5’ za test intron [H], radno povezan 5’ za drugi lider ili drugi fragment prvog lidera [I], radno povezan za kodirajući region [J], koji je radno povezan za 3’ UTR [K]. Dalje, treća moguća transgena kaseta (Transgena kaseta konfiguracija 3 na Slici 8) se sastoji od promotera ili himernog promotera [L], radno povezanog 5+ za lider [M], radno povezanog 5’ za prvi fragment kodirajuće sekvnce [N], radno povezanog za 5’ za intron [O], radno povezanog 5’ za drugi fragment kodirajuće sekvence [P], koja je radno povezana za 3’ UTR [Q]. Transgena kaseta konfiguracija 3 je dizajnirana da dopusti spajanje introna na takav način da se proizvede kompletan ram otvorenog čitanja bez pomeranja rama između prvog i drugog fragmenta kodirajuće sekvence.
Prvih 6 nukleotida na 5’ kraju i poslednih 6 nukleotida na 3’ kraju introna prezentovani kao SEQ ID NOS: 4, 7, 21, 24, 36, 44, 48, 52, 54, 58, 62, 68, 72, 82, 92, 94, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 118, 120, 122, 127, 129, 131, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 i 182 predstavljaju nukleotide pre i nakon intron/ekson upletenog čvora, svaka posebno. Ove 6 kratke nukleotidne sekvence, na primer, mogu biti modifikovane kačenjem dodatne sekvence (odnosno, prirodne ili veštačke) da se olakša kloniranje introna u biljni vektor transformacije, sve dotle dok su prvi i drugi nukleotid sa 5’ kraja (GT) i četvrti i peti nukleotid sa 3’ kraja (AG) sa SEQ ID NOS: 4, 7, 21, 24, 36, 44, 48, 52, 54, 58, 62, 68, 72, 82, 92, 94, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 118, 120, 122, 127, 129, 131, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 i 182 sačuvani, tako čuvajući intron/ekson upleteni čvor introna. Kako je u gornjem tekstu razmatrano, može biti poželjno izbeći korišćenje nukleotidne sekvence AT ili nukleotida A neposredno pre 5’ kraja položaja spajanja (GT) i nukleotid G ili nukleotidnu sekvencu TG, svaki posebno neposredno pre 3’ kraja položaja spajanja (AG) da se eliminiše potencijal neželjenog početka kodona od toga da budu formirani tokom obrade mesindžer RNK u finalni transkript. Sekvenca oko 5’ ili 5’ kraja položaja uplitanja čvora introna bi tako mogla biti modifikovana.
Vrše se ogleda introna na pojačivačko dejstvo kroz njihovu sposobnost da pojačaju ekspresiju u prolaznom ogledu i ogledu stabilne biljke. Z prolazni ogled intron pojačavanja, bazni biljni vektor je konstruisan korišćenjem postupaka poznatih u nauci. Intron se klonira u bazni biljni vektor koji sadrže ekspresionu kasetu koja se sastoji od konstitutivnog promotera kao što je Karfiol mozaik virus promoter, P-CaMV.35.S-enh-1:1:9 (SEQ ID NO: 176), radno povezan 5’ za lider, L-CaMV.35S-1:1:15 (SEQ ID NO: 177), radno povezan 5’ za test intron (n.pr., jedna od SEQ ID NOS: 4, 7, 21, 24, 36, 44, 48, 52, 54, 58, 62, 68, 72, 82, 92, 94, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 118, 120, 122, 127, 129, 131, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 i 182), radno povezan za kodirajuću sekvencu β-glukuronidazu (GUS) koja bilo poseduje obradivi intron (GUS-2, SEQ ID NO: 160) ili ne intron (GUS-1, SEQ ID NO: 159), radno povezan za Nopalin sintaza 3’ UTR od A. tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 161). Ćelije protoplasta izvedene iz tkiva kukuruza ili biljke drugog roda se transformišu sa baznim biljnim vektorom i luciferaza kontrolnim vektorima kako je prethodno opisano u gornjem Primeru 2 i kako su izvršeni ogledi na aktivnost. Da se uporedi relativna sposobnost introna da pojača ekspresiju, GUS vrednosti se izražavaju kao odnos GUS prema lucifaraza aktivnosti i upoređuju se oni nivoi saopšteni od strane konstrukta koji sadrže konstitutivni promoter radno povezan za poznati intron standard kao što su oni od introna izvedeni iz HSP70 proteina toplotnog šoka od Zea mays. I-Zm.DnaK-1:1:1 (SEQ ID NO: 178) kao i konstrukta koji sadrže konstitutivni promoter ali bez introna radno povezanog za promoter.
Za ogled stabilne biljke introna prezentovanih kao SEQ ID NOS: 4, 7, 21, 24, 36, 44, 48, 52, 54, 58, 62, 68, 72, 82, 92, 94, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 118, 120, 122, 127, 129, 131, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 i 182, vektor transformacije GUS ekspresije biljke se konstruiše na sličan način kao konstrukti opisani u prethodnim pirmerima u kojima rezultirajući biljni vektor sadrži desni granični region od A. tumefaciens, prvu transgenu kasetu da se testira intron koji se sastoji od konstitutivnog promotera kao što je Karfiol mozaik virus promoter, P-CaMV.35.S-enh-1:1:9 (SEQ ID NO: 176), radno povezan 5’ za lider, L-CaMV.35S-1:1:15 (SEQ ID NO: 177), radno povezan 5’ za test intron koji je ovde dat, radno povezan za kodirajuću sekvencu za β-glukuronidazu (GUS) koja ili poseduje obradivi intron (GUS-2, SEQ ID NO: 160) ili ne intron (GUS-1, SEQ ID NO: 158), radno povezan za Nopalin sintaza 3’ UTR od A. tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 161); drugu transgenu kasetu odabira koja se koristi za odabir transformisanih biljnih ćelija koje dodeljuju otpornost na glifozat (vođeno od strane Actin 1 promotera pirinča) i levog graničnog regiona od A. tumefaciens. Rezultirajući plazmidi se koriste da se transformišu biljke kukuruza ili biljke drugog roda postupcima koji su opisani u gornjem tekstu ili putem Agrobacterium-posredovanih postupaka poznatih u nauci. Jedna kopija ili mali broj kopija transformanata se odabiru za upoređivanje jedne kopije ili malog broja kopija transformisanih biljaka, transformisanih sa biljnim vektorom transformacije koji je identičan test vektoru ali bez test introna da se utvrdi da li test intron daje intronom posredovano dejstvo pojačavanja.
Bilo koji od introna prezentovanih kao SEQ ID NOS: 4, 7, 21, 24, 36, 44, 48, 52, 54, 58, 62, 68, 72, 82, 92, 94, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 118, 120, 122, 127, 129, 131, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 i 182 može biti modifikovan brojnim načinima, kao što brisanje fragmenata u okviru intron sekvence, što može smanjiti ekspresiju ili duplikaciju fragmenata sa intronom koi može da pojača ekspresiju. Dodatno tome, sekvence u okviru introna koji mogu da utiču na specifičnost ekspresije bilo na određene tipove ćelija ili tkiva ili organa mogu biti duplicirane ili izmenjene ili izbrisane da se utiče na ekspresiju i obrazce ekspresije transgena. Dodatno tome, introni koji su ovde dati mogu biti modifikovani da se ukloni bilo koji potencijalni start kodona (ATG) koji može da izazove nenameravane transkripte da budu ekspresovani iz nepravilno spojenih introna kao različiti, duži i okrnjeni proteini. Jednom kada se intron empirijski istestira, ili kada se izmeni na osnovu eksperimentisanja, intron se koristi da pojača ekspresiju transgena u stabilno transformisanim biljkama koje mogu biti bilo kog roda monokot ili dikot biljke, sve dotle dok intron obezbeđuje pojačanje transgena. Intron takođe može da se koristi da pojača ekspresiju drugih organizama, kao što alge, ljive ili životinjske ćelije, sve dotle dok intron obezbeđuje pojačanje ili slabljenje ili specifičnost ekspresije transgena za koji je radno povezan.

Claims (10)

PATENTNI ZAHTEVI
1. DNK molekul koji sadrži DNK sekvencu odabranu od:
(a) sekvence sa bar 95 posto identičnosti sekvence pune dužine bilo koje od SEQ ID NOs: 27-28, pri čemu sekvenca ima promoter aktivnost;
(b) sekvence koja sadrže bilo koju od SEQ ID NOs: 27-28; i
(c) fragmenta koji sadrže bar 500 susednih nukleotida SEQ ID NO: 27, pri čemu fragment ima promoter aktivnost SEQ ID NO: 27;
naznačen time, što je navedena sekvenca radno povezana za heterologi transkriptabilni polinukleotid molekul.
2. DNK molekul prema zahtevu 1, naznačen time, što heterologi transkriptabilni polinukleotid molekul sadrže gen od agronomskog interesa.
3. DNK molekul prema zahtevu 2, naznačen time, što gen od agronomskog interesa (i) dodeljuje toleranciju na herbicide u biljkama; ili
(ii) dodeljuje toleranciju na štetočine u biljkama.
4. Transgena biljna ćelija, naznačena time, što sadrži heterologi DNK molekul koji sadrži sekvencu odabranu od:
(a) sekvence sa bar 95 posto identičnosti sekvence sa punom dužinom bilo koje od SEQ ID NOs: 27-28, pri čemu sekvenca ima promoter aktivnost;
(b) sekvence koja sadrže bilo koju od SEQ ID NOs: 27-28; i
(c) fragmenta koji sadrže bar 500 susednih nukleotida SEQ ID NO: 27, pri čemu fragment ima promoter aktivnost SEQ ID NO: 27;
pri čemu je navedena sekvenca radno povezana za heterologi transkriptabilni polinukleotid molekul.
5. Transgena biljna ćelija prema zahtevu 4, naznačena time, što je navedena transgena biljna ćelija monokotiledona biljna ćelija.
6. Transgena biljna ćelija prema zahtevu 4, naznačena time, što je navedena transgena biljna ćelija dikotiledona biljna ćelija.
7. Transgena biljka ili njen deo, naznačeni time, što sadrže DNK molekul prema zahtevu 1.
8. Biljka potomak transgene biljke prema zahevu 7 ili njen deo, naznačeni time, što biljka potomak ili njen deo sadrže DNK molekul prema zahtevu 1.
9. Transgeno seme, naznačeno time, što ovo seme sadrže DNK molekul prema zahtevu 1.
10. Postupak ekspresije transkriptabilnog polinukleotid molekula, naznačen time, što se sastoji od dobijanja transgene biljke prema zahtevu 7 i kultivisanja biljke, pri čemu se vrši ekspresija transkriptabilnog polinukleotida.
RS20170562A 2011-03-25 2012-03-21 Regulatorni elementi biljke i korišćenja istih RS56086B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161467875P 2011-03-25 2011-03-25
EP14154965.9A EP2733151B1 (en) 2011-03-25 2012-03-21 Plant regulatory elements and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS56086B1 true RS56086B1 (sr) 2017-10-31

Family

ID=45888508

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20170562A RS56086B1 (sr) 2011-03-25 2012-03-21 Regulatorni elementi biljke i korišćenja istih

Country Status (24)

Country Link
US (10) US9062316B2 (sr)
EP (3) EP2733151B1 (sr)
JP (6) JP2014509866A (sr)
KR (5) KR102003177B1 (sr)
CN (1) CN103534267B (sr)
AP (1) AP2013007141A0 (sr)
AR (5) AR085571A1 (sr)
AU (5) AU2012237662B2 (sr)
CA (5) CA3004039C (sr)
CL (7) CL2013002707A1 (sr)
CO (1) CO6801642A2 (sr)
ES (3) ES2637862T3 (sr)
HU (1) HUE035893T2 (sr)
MX (5) MX383291B (sr)
PH (5) PH12013501978A1 (sr)
PL (2) PL2733151T3 (sr)
PT (2) PT2688906T (sr)
PY (1) PY1214097A (sr)
RS (1) RS56086B1 (sr)
RU (1) RU2644205C2 (sr)
UA (3) UA129006C2 (sr)
UY (5) UY39165A (sr)
WO (1) WO2012134921A2 (sr)
ZA (1) ZA201306899B (sr)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0794324B2 (ja) 1986-01-31 1995-10-11 三菱化学株式会社 ガリウムの回収方法
RU2644205C2 (ru) 2011-03-25 2018-02-08 Монсанто Текнолоджи Ллс Регуляторные элементы растений и их применение
CA2835817C (en) * 2011-05-13 2020-07-07 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
CA2895184C (en) 2012-12-19 2021-11-23 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
BR102014021309A2 (pt) * 2013-08-30 2015-09-22 Dow Agrosciences Llc construtos para expressão de transgenes usando elementos reguladores de genes de ubiquitina 1c de brachypodium
TW201527313A (zh) * 2013-12-31 2015-07-16 Dow Agrosciences Llc 新穎玉米泛素啓動子（二）
TW201527314A (zh) * 2013-12-31 2015-07-16 Dow Agrosciences Llc 新穎玉米泛素啓動子（三）
TW201527312A (zh) * 2013-12-31 2015-07-16 Dow Agrosciences Llc 新穎玉米泛素啓動子（一）
TW201527316A (zh) * 2013-12-31 2015-07-16 Dow Agrosciences Llc 新穎玉米泛素啓動子（五）
EP3119186B1 (en) 2014-03-20 2023-09-20 Monsanto Technology LLC Transgenic maize event mon 87419 and methods of use thereof
MX385929B (es) 2016-03-11 2025-03-18 Monsanto Technology Llc Elementos reguladores vegetales y sus usos.
CA3018384A1 (en) 2016-05-04 2017-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
JP7078551B2 (ja) * 2016-05-24 2022-05-31 モンサント テクノロジー エルエルシー 植物調節エレメント及びその使用
TW201805425A (zh) * 2016-06-16 2018-02-16 艾格里遺傳學股份有限公司 用於轉殖基因表現之植物啟動子與３’ｕｔｒ
CA2962852A1 (en) * 2017-03-31 2018-09-30 Chuanxin Sun Carbohydrate producing plant material
PL3717650T3 (pl) * 2018-02-02 2025-10-20 Monsanto Technology Llc Zdarzenie mon87429 kukurydzy i sposoby jego zastosowania
JP7164333B2 (ja) 2018-06-27 2022-11-01 株式会社日立製作所 個人情報分析システム
US11414669B2 (en) 2018-09-06 2022-08-16 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for genome editing in planta
CN109486818B (zh) * 2018-11-14 2021-06-01 中国热带农业科学院三亚研究院 狗尾草u6启动子基因及应用
MX2022013551A (es) * 2020-04-28 2022-11-30 Monsanto Technology Llc Elementos reguladores de plantas y sus usos.
CN111518807A (zh) * 2020-04-30 2020-08-11 深圳大学 抑制薇甘菊光捕获蛋白表达的寡核苷酸链、重组载体及构建方法
JP2023550323A (ja) * 2020-11-11 2023-12-01 モンサント テクノロジー エルエルシー 部位特異的組込み頻度を改善するための方法
WO2022209170A1 (ja) 2021-03-30 2022-10-06 日本碍子株式会社 スパッタリングターゲット

Family Cites Families (158)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4535060A (en) 1983-01-05 1985-08-13 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use
US5094945A (en) 1983-01-05 1992-03-10 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase, production and use
US5352605A (en) 1983-01-17 1994-10-04 Monsanto Company Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters
US4757011A (en) 1983-09-30 1988-07-12 E. I. Du Pont De Nemours And Company Herbicide resistant tobacco
JPH074232B2 (ja) 1984-12-10 1995-01-25 モンサントコンパニー バチルスチユウリンゲンシス結晶蛋白遺伝子の植物上での集落形成能を有する微生物への挿入及びその用途
DE3587548T2 (de) 1984-12-28 1993-12-23 Bayer Ag Rekombinante DNA, die in pflanzliche Zellen eingebracht werden kann.
US6774283B1 (en) 1985-07-29 2004-08-10 Calgene Llc Molecular farming
US4940835A (en) 1985-10-29 1990-07-10 Monsanto Company Glyphosate-resistant plants
CA1313830C (en) 1985-08-07 1993-02-23 Dilip Maganlal Shah Glyphosate-resistant plants
US6617496B1 (en) 1985-10-16 2003-09-09 Monsanto Company Effecting virus resistance in plants through the use of negative strand RNAs
US6608241B1 (en) 1985-10-29 2003-08-19 Monsanto Technology Llc Protection of plants against viral infection
US4810648A (en) 1986-01-08 1989-03-07 Rhone Poulenc Agrochimie Haloarylnitrile degrading gene, its use, and cells containing the gene
US5453566A (en) 1986-03-28 1995-09-26 Calgene, Inc. Antisense regulation of gene expression in plant/cells
US5107065A (en) 1986-03-28 1992-04-21 Calgene, Inc. Anti-sense regulation of gene expression in plant cells
US5268463A (en) 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
TR27832A (tr) 1987-04-29 1995-08-31 Monsanto Co Zararli ucucu hasarata mukavim bitkiler.
US5312910A (en) 1987-05-26 1994-05-17 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase
US4971908A (en) 1987-05-26 1990-11-20 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase
US5229114A (en) 1987-08-20 1993-07-20 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Approaches useful for the control of root nodulation of leguminous plants
ATE112314T1 (de) * 1988-05-17 1994-10-15 Lubrizol Genetics Inc Pflanzliches ubiquitinpromotorsystem.
US5597718A (en) 1988-10-04 1997-01-28 Agracetus Genetically engineering cotton plants for altered fiber
AU638438B2 (en) 1989-02-24 1993-07-01 Monsanto Technology Llc Synthetic plant genes and method for preparation
US5231020A (en) 1989-03-30 1993-07-27 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5633441A (en) * 1989-08-04 1997-05-27 Plant Genetic Systems, N.V. Plants with genetic female sterility
US5689041A (en) 1989-08-10 1997-11-18 Plant Gentic Systems N.V. Plants modified with barstar for fertility restoration
US5641876A (en) 1990-01-05 1997-06-24 Cornell Research Foundation, Inc. Rice actin gene and promoter
US6426447B1 (en) 1990-11-14 2002-07-30 Monsanto Technology Llc Plant seed oils
US5543576A (en) 1990-03-23 1996-08-06 Mogen International Production of enzymes in seeds and their use
US5969214A (en) 1990-06-11 1999-10-19 Calgene, Inc. Glycogen biosynthetic enzymes in plants
EP0536293B1 (en) 1990-06-18 2002-01-30 Monsanto Technology LLC Increased starch content in plants
US5498830A (en) 1990-06-18 1996-03-12 Monsanto Company Decreased oil content in plant seeds
CA2083948C (en) 1990-06-25 2001-05-15 Ganesh M. Kishore Glyphosate tolerant plants
USRE38446E1 (en) 1990-07-20 2004-02-24 Calgene, Llc. Sucrose phosphate synthase (SPS), its process for preparation its cDNA, and utilization of cDNA to modify the expression of SPS in plant cells
US6483008B1 (en) 1990-08-15 2002-11-19 Calgene Llc Methods for producing plants with elevated oleic acid content
US5633435A (en) 1990-08-31 1997-05-27 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
US5866775A (en) 1990-09-28 1999-02-02 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthases
BR9107191A (pt) 1990-12-26 1994-06-14 Monsanto Co Controle de amadurecimento de frutos e senescência em plantas
FR2673643B1 (fr) 1991-03-05 1993-05-21 Rhone Poulenc Agrochimie Peptide de transit pour l'insertion d'un gene etranger dans un gene vegetal et plantes transformees en utilisant ce peptide.
US5304730A (en) 1991-09-03 1994-04-19 Monsanto Company Virus resistant plants and method therefore
US5763245A (en) 1991-09-23 1998-06-09 Monsanto Company Method of controlling insects
US5593874A (en) 1992-03-19 1997-01-14 Monsanto Company Enhanced expression in plants
US6015940A (en) 1992-04-07 2000-01-18 Monsanto Company Virus resistant potato plants
US6096950A (en) 1992-05-18 2000-08-01 Monsanto Company Cotton fiber-specific promoters
US5850023A (en) 1992-11-30 1998-12-15 Monsanto Company Modified plant viral replicase genes
US6011199A (en) 1992-12-15 2000-01-04 Commonwealth Scientific Method for producing fruiting plants with improved fruit flavour
US6013864A (en) 1993-02-03 2000-01-11 Monsanto Company Plants resistant to infection by luteoviruses
US5322687A (en) 1993-07-29 1994-06-21 Ecogen Inc. Bacillus thuringiensis cryet4 and cryet5 toxin genes and proteins toxic to lepidopteran insects
US5362865A (en) 1993-09-02 1994-11-08 Monsanto Company Enhanced expression in plants using non-translated leader sequences
EP0759170B1 (en) 1993-09-10 2008-07-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Uses of green fluorescent protein
US5491084A (en) 1993-09-10 1996-02-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Uses of green-fluorescent protein
AU7925094A (en) 1993-09-30 1995-04-18 Agracetus, Inc. Transgenic cotton plants producing heterologous peroxidase
JPH09506249A (ja) 1993-11-24 1997-06-24 モンサント・カンパニー 植物病原体の抑制方法
WO1998055632A1 (en) 1997-06-05 1998-12-10 Calgene Llc FATTY ACYL-CoA: FATTY ALCOHOL ACYLTRANSFERASES
US6828475B1 (en) 1994-06-23 2004-12-07 Calgene Llc Nucleic acid sequences encoding a plant cytoplasmic protein involved in fatty acyl-CoA metabolism
US6080560A (en) 1994-07-25 2000-06-27 Monsanto Company Method for producing antibodies in plant cells
US6140075A (en) 1994-07-25 2000-10-31 Monsanto Company Method for producing antibodies and protein toxins in plant cells
US5750876A (en) 1994-07-28 1998-05-12 Monsanto Company Isoamylase gene, compositions containing it, and methods of using isoamylases
US5716837A (en) 1995-02-10 1998-02-10 Monsanto Company Expression of sucrose phosphorylase in plants
GB9515941D0 (en) * 1995-08-03 1995-10-04 Zeneca Ltd DNA constructs
US6091002A (en) 1996-03-13 2000-07-18 Monsanto Company Polyhydroxyalkanoates of narrow molecular weight distribution prepared in transgenic plants
US6946588B2 (en) 1996-03-13 2005-09-20 Monsanto Technology Llc Nucleic acid encoding a modified threonine deaminase and methods of use
US5958745A (en) 1996-03-13 1999-09-28 Monsanto Company Methods of optimizing substrate pools and biosynthesis of poly-β-hydroxybutyrate-co-poly-β-hydroxyvalerate in bacteria and plants
US5773696A (en) 1996-03-29 1998-06-30 Monsanto Company Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi
US6166292A (en) 1996-04-26 2000-12-26 Ajinomoto Co., Inc. Raffinose synthetase gene, method of producing raffinose and transgenic plant
US5985605A (en) 1996-06-14 1999-11-16 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Dept. Of Agriculture & Agri-Food Canada DNA sequences encoding phytases of ruminal microorganisms
US5998700A (en) 1996-07-02 1999-12-07 The Board Of Trustees Of Southern Illinois University Plants containing a bacterial Gdha gene and methods of use thereof
US5750848A (en) 1996-08-13 1998-05-12 Monsanto Company DNA sequence useful for the production of polyhydroxyalkanoates
US6063756A (en) 1996-09-24 2000-05-16 Monsanto Company Bacillus thuringiensis cryET33 and cryET34 compositions and uses therefor
US6093695A (en) 1996-09-26 2000-07-25 Monsanto Company Bacillus thuringiensis CryET29 compositions toxic to coleopteran insects and ctenocephalides SPP
JP2002510961A (ja) 1996-10-29 2002-04-09 カルジーン エル エル シー 植物セルロースシンターゼおよびプロモーター配列
AP9901541A0 (en) 1996-11-20 1999-06-30 Ecogen Inc Broad-spectrum delta-endotoxins.
US6017534A (en) 1996-11-20 2000-01-25 Ecogen, Inc. Hybrid Bacillus thuringiensis δ-endotoxins with novel broad-spectrum insecticidal activity
US6713063B1 (en) 1996-11-20 2004-03-30 Monsanto Technology, Llc Broad-spectrum δ-endotoxins
US5942664A (en) 1996-11-27 1999-08-24 Ecogen, Inc. Bacillus thuringiensis Cry1C compositions toxic to lepidopteran insects and methods for making Cry1C mutants
US6121436A (en) 1996-12-13 2000-09-19 Monsanto Company Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi
US6040497A (en) 1997-04-03 2000-03-21 Dekalb Genetics Corporation Glyphosate resistant maize lines
US6171640B1 (en) 1997-04-04 2001-01-09 Monsanto Company High beta-conglycinin products and their use
US7105724B2 (en) 1997-04-04 2006-09-12 Board Of Regents Of University Of Nebraska Methods and materials for making and using transgenic dicamba-degrading organisms
US5972664A (en) 1997-04-11 1999-10-26 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
AR013633A1 (es) 1997-04-11 2001-01-10 Calgene Llc METODO PARA LA ALTERACIoN DE LA COMPOSICIoN DE ÁCIDOS GRASOS DE CADENA MEDIA EN SEMILLAS VEGETALES QUE EXPRESAN UNA TIOESTERASA QUE PREFIERE CADENA MEDIA VEGETAL HETERoLOGA.
US6372211B1 (en) 1997-04-21 2002-04-16 Monsanto Technolgy Llc Methods and compositions for controlling insects
US6380466B1 (en) 1997-05-08 2002-04-30 Calgene Llc Production of improved rapeseed exhibiting yellow-seed coat
US6441277B1 (en) 1997-06-17 2002-08-27 Monsanto Technology Llc Expression of fructose 1,6 bisphosphate aldolase in transgenic plants
US6716474B2 (en) 1997-06-17 2004-04-06 Monsanto Technology Llc Expression of fructose 1,6 bisphosphate aldolase in transgenic plants
US6072103A (en) 1997-11-21 2000-06-06 Calgene Llc Pathogen and stress-responsive promoter for gene expression
US6063597A (en) 1997-12-18 2000-05-16 Monsanto Company Polypeptide compositions toxic to coleopteran insects
US6060594A (en) 1997-12-18 2000-05-09 Ecogen, Inc. Nucleic acid segments encoding modified bacillus thuringiensis coleopteran-toxic crystal proteins
US6023013A (en) 1997-12-18 2000-02-08 Monsanto Company Insect-resistant transgenic plants
US6653530B1 (en) 1998-02-13 2003-11-25 Calgene Llc Methods for producing carotenoid compounds, tocopherol compounds, and specialty oils in plant seeds
US6107549A (en) 1998-03-10 2000-08-22 Monsanto Company Genetically engineered plant resistance to thiazopyr and other pyridine herbicides
US6706948B1 (en) 1998-03-19 2004-03-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Sugarcane UBI9 gene promoter and methods of use thereof
CA2324520A1 (en) 1998-03-19 1999-09-23 University Of Hawaii Plant promoter sequences and methods of use thereof
US6635806B1 (en) * 1998-05-14 2003-10-21 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for expression of transgenes in plants
US6284948B1 (en) 1998-05-18 2001-09-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genes and methods for control of nematodes in plants
US6444876B1 (en) 1998-06-05 2002-09-03 Calgene Llc Acyl CoA: cholesterol acyltransferase related nucleic acid sequences
CA2330024C (en) 1998-06-12 2012-01-24 Calgene Llc Polyunsaturated fatty acids in plants
JP4514952B2 (ja) 1998-07-02 2010-07-28 カルジーン エルエルシー ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼタンパク質
JP2002520019A (ja) 1998-07-10 2002-07-09 カルジーン エルエルシー 植物色素体における真核性ペプチドの発現
US6476294B1 (en) 1998-07-24 2002-11-05 Calgene Llc Plant phosphatidic acid phosphatases
CN1219064C (zh) 1998-08-04 2005-09-14 嘉吉有限公司 植物脂肪酸去饱和酶启动子
AU5346099A (en) 1998-08-10 2000-03-06 Monsanto Company Methods for controlling gibberellin levels
US6365802B2 (en) 1998-08-14 2002-04-02 Calgene Llc Methods for increasing stearate content in soybean oil
CZ301915B6 (cs) 1998-08-19 2010-07-28 Monsanto Technology Llc Rekombinantní molekula DNA, transformovaná bunka, rostlina a zpusob zlepšení genové exprese
US6468523B1 (en) 1998-11-02 2002-10-22 Monsanto Technology Llc Polypeptide compositions toxic to diabrotic insects, and methods of use
EP1135511B1 (en) 1998-11-17 2009-06-17 Monsanto Technology LLC Phosphonate metabolizing plants
US6531648B1 (en) 1998-12-17 2003-03-11 Syngenta Participations Ag Grain processing method and transgenic plants useful therein
US7932374B2 (en) 1999-03-25 2011-04-26 Arborgen, Inc. Compositions and methods for the modification of gene expression
US7518034B2 (en) 1999-03-25 2009-04-14 Arborgen Llc Compositions and methods for the modification of gene expression
US7211711B2 (en) 1999-03-25 2007-05-01 Arborgen, Llc Compositions and methods for the modification of gene expression
US6596925B1 (en) 1999-03-25 2003-07-22 Genesis Research & Development Corp. Ltd. Compositions and methods for the modification of gene expression
JP2003527077A (ja) 1999-04-15 2003-09-16 カルジーン エルエルシー トコフェロール合成に関与するタンパク質の核酸配列
US6555655B1 (en) 1999-05-04 2003-04-29 Monsanto Technology, Llc Coleopteran-toxic polypeptide compositions and insect-resistant transgenic plants
CN1350587A (zh) 1999-05-13 2002-05-22 孟山都技术有限公司 植物的获得性抗性基因
EP1190078A2 (en) 1999-06-08 2002-03-27 Calgene LLC Nucleic acid sequences encoding proteins involved in fatty acid beta-oxidation and methods of use
US6770465B1 (en) 1999-06-09 2004-08-03 Calgene Llc Engineering B-ketoacyl ACP synthase for novel substrate specificity
WO2001004314A2 (en) 1999-07-12 2001-01-18 Monsanto Technology, Llc. Nucleic acid molecules and proteins associated with sterol synthesis and metabolism
US7365185B2 (en) 2000-07-19 2008-04-29 Monsanto Technology Llc Genomic plant sequences and uses thereof
US6603061B1 (en) 1999-07-29 2003-08-05 Monsanto Company Agrobacterium-mediated plant transformation method
US20020192813A1 (en) 1999-08-18 2002-12-19 Timothy W. Conner Plant expression vectors
US6501009B1 (en) 1999-08-19 2002-12-31 Monsanto Technology Llc Expression of Cry3B insecticidal protein in plants
HU225171B1 (en) * 1999-09-09 2006-07-28 Monsanto Uk Ltd Modified ubiquitin regulatory system
US6593293B1 (en) 1999-09-15 2003-07-15 Monsanto Technology, Llc Lepidopteran-active Bacillus thuringiensis δ-endotoxin compositions and methods of use
JP2003511049A (ja) * 1999-10-11 2003-03-25 バク、キョン−ウァン プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子を利用した作物の収量またはバイオマスの増大方法
US6573361B1 (en) 1999-12-06 2003-06-03 Monsanto Technology Llc Antifungal proteins and methods for their use
MXPA02006752A (es) 2000-01-06 2004-09-10 Monsanto Technology Llc Preparacion de proteinas y permutenias desalergenizadas.
US6657046B1 (en) 2000-01-06 2003-12-02 Monsanto Technology Llc Insect inhibitory lipid acyl hydrolases
EP1261695B1 (en) 2000-03-09 2005-06-22 Monsanto Technology LLC Methods for making plants tolerant to glyphosate and compositions thereof
WO2001094394A2 (en) * 2000-06-09 2001-12-13 Prodigene, Inc. Plant ubiquitin promoter sequences and methods of use
US6518488B1 (en) 2000-07-21 2003-02-11 Monsanto Technology Llc Nucleic acid molecules and other molecules associated with the β-oxidation pathway
AU2001279007A1 (en) 2000-07-25 2002-02-05 Calgene Llc Nucleic acid sequences encoding beta-ketoacyl-acp synthase and uses thereof
EP1356066A2 (en) * 2000-10-24 2003-10-29 Syngenta Participations AG Control of gene expression in plants
CN102212534A (zh) 2000-10-30 2011-10-12 弗迪亚股份有限公司 新的草甘膦n-乙酰转移酶(gat)基因
US7462481B2 (en) * 2000-10-30 2008-12-09 Verdia, Inc. Glyphosate N-acetyltransferase (GAT) genes
KR20050090411A (ko) * 2002-12-27 2005-09-13 센트로 데 인제니에리아 제네티카 와이 바이오테크놀로지아 식물세포에서의 디엔에이 시퀀스의 발현을 위한 인공프로모터
WO2007112326A1 (en) 2006-03-24 2007-10-04 Ceres, Inc. Promoter, promoter control elements, and combinations, and uses thereof
US8344211B2 (en) 2008-08-13 2013-01-01 Ceres, Inc. Plant nucleotide sequences and corresponding polypeptides
BRPI0508518A (pt) 2004-03-08 2007-08-14 Syngenta Participations Ag proteìna e promotor de semente de milho rica em glutamina
JP4819037B2 (ja) 2004-05-04 2011-11-16 オーツー マイクロ， インコーポレーテッド 工具識別回路を備えるコードレス電動工具
ATE482281T1 (de) 2004-06-09 2010-10-15 Pioneer Hi Bred Int Plastiden transit peptide
US7750207B2 (en) * 2004-09-01 2010-07-06 Monsanto Technology Llc Zea mays ribulose bisphosphate carboxylase activase promoter
US20060200878A1 (en) 2004-12-21 2006-09-07 Linda Lutfiyya Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene expression
ATE480629T1 (de) * 2005-03-16 2010-09-15 Athenix Corp Auf cis einwirkende regulierende elemente aus tripsacum-dactyloiden
BRPI0615087A2 (pt) * 2005-08-24 2011-05-03 Pioneer Hi Bred Int métodos e composições para a expressão de um polinucleotìdeo de interesse
ATE548459T1 (de) 2005-09-16 2012-03-15 Monsanto Technology Llc Verfahren zur genetischen kontrolle von insektenbefall bei pflanzen und zusammensetzungen
WO2007095469A2 (en) 2006-02-10 2007-08-23 Monsanto Technology Llc Identification and use of target genes for control of plant parasitic nematodes
WO2008027592A2 (en) 2006-08-31 2008-03-06 Monsanto Technology, Llc Phased small rnas
WO2008064289A2 (en) * 2006-11-21 2008-05-29 The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. Biofuel production methods and compositions
BRPI0701172B1 (pt) 2007-02-05 2019-11-26 Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuaria Embrapa composições e métodos para modificar a expressão de genes usando o promotor do gene da proteína de conjugação à ubiquitina de plantas de soja
EP2450448B1 (en) 2007-03-09 2014-09-17 Monsanto Technology LLC Methods for plant transformation using spectinomycin selection
CN103333894B (zh) * 2008-04-07 2016-11-23 孟山都技术公司 植物调控元件及其应用
WO2009149304A2 (en) * 2008-06-04 2009-12-10 Edenspace Systems Corporation Plant gene regulatory elements
US8168859B2 (en) * 2008-08-27 2012-05-01 Pioneer Hi Bred International Inc Ubiquitin regulatory elements
US8604276B2 (en) * 2009-06-09 2013-12-10 University Of Tennessee Research Foundation Switchgrass ubiquitin promoter (PVUBI2) and uses thereof
EP2706065B1 (en) * 2009-06-11 2016-12-21 Syngenta Participations AG Expression cassettes derived from maize
BR112013015689A2 (pt) 2010-12-21 2017-07-04 Du Pont manipulação de dna recombinante, vegetal, sememnte e método para a modulação da expressão de um polinucleótido isolado de um vegetal
RU2644205C2 (ru) 2011-03-25 2018-02-08 Монсанто Текнолоджи Ллс Регуляторные элементы растений и их применение
CR20210046A (es) * 2018-07-30 2021-06-10 Monsanto Technology Llc Evento transgénico de maíz mon 95379 y métodos para su detección y usos
US11414669B2 (en) * 2018-09-06 2022-08-16 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for genome editing in planta

Also Published As

Publication number Publication date
RU2017145544A (ru) 2019-02-19
US9062316B2 (en) 2015-06-23
CN103534267B (zh) 2017-07-14
US20240425870A1 (en) 2024-12-26
RU2017145544A3 (sr) 2021-10-15
RU2644205C2 (ru) 2018-02-08
RU2017145549A3 (sr) 2021-10-15
US20150232866A1 (en) 2015-08-20
AU2017235957B2 (en) 2019-07-04
US10752910B2 (en) 2020-08-25
CL2013002707A1 (es) 2014-03-07
ES2608938T3 (es) 2017-04-17
ES2637862T3 (es) 2017-10-17
PT2688906T (pt) 2016-12-23
JP2016163583A (ja) 2016-09-08
KR102003175B1 (ko) 2019-07-24
PT2733151T (pt) 2017-07-12
AU2017235954B2 (en) 2019-06-27
CA3004033C (en) 2020-08-18
JP6316331B2 (ja) 2018-04-25
JP2016163582A (ja) 2016-09-08
CL2015001410A1 (es) 2015-07-31
CA3004033A1 (en) 2012-10-04
RU2017145548A3 (sr) 2021-10-14
AU2017235957A1 (en) 2017-11-02
PH12017500576A1 (en) 2017-11-20
PH12018501395B1 (en) 2022-10-26
AR116446A2 (es) 2021-05-12
US20180057833A1 (en) 2018-03-01
JP2014509866A (ja) 2014-04-24
US20150167012A1 (en) 2015-06-18
CA3004039A1 (en) 2012-10-04
PL2688906T3 (pl) 2017-05-31
WO2012134921A3 (en) 2012-12-27
CA3004030A1 (en) 2012-10-04
UY39165A (es) 2021-05-31
KR20180119171A (ko) 2018-11-01
US10538776B2 (en) 2020-01-21
MX356792B (es) 2018-06-12
AP2013007141A0 (en) 2013-09-30
CL2018000141A1 (es) 2019-01-25
JP6316333B2 (ja) 2018-04-25
EP2733152A1 (en) 2014-05-21
PY1214097A (es) 2015-07-01
EP2733151B1 (en) 2017-05-31
AR085571A1 (es) 2013-10-09
CL2015001411A1 (es) 2015-07-31
ES2666149T3 (es) 2018-05-03
PL2733151T3 (pl) 2017-10-31
US20120246763A1 (en) 2012-09-27
PH12018501396A1 (en) 2019-03-18
JP6316332B2 (ja) 2018-04-25
CA2831133A1 (en) 2012-10-04
AR119721A2 (es) 2022-01-05
US20160289693A1 (en) 2016-10-06
CA3004022A1 (en) 2012-10-04
RU2017145553A3 (sr) 2021-10-14
AR116448A2 (es) 2021-05-12
EP2733152B1 (en) 2018-01-17
HUE035893T2 (en) 2018-05-28
MX393723B (es) 2025-03-20
AU2017204435A1 (en) 2017-07-27
UY39167A (es) 2021-05-31
UA117555C2 (uk) 2018-08-27
MX344605B (es) 2016-12-20
PH12017500576B1 (en) 2021-03-26
KR20140020968A (ko) 2014-02-19
CL2018000143A1 (es) 2019-01-25
US10208314B2 (en) 2019-02-19
MX383291B (es) 2025-03-13
US20180105822A1 (en) 2018-04-19
US20230145023A1 (en) 2023-05-11
CA3004039C (en) 2020-08-18
US12071628B2 (en) 2024-08-27
US20180105823A1 (en) 2018-04-19
EP2733151A1 (en) 2014-05-21
BR112013024144A2 (pt) 2016-11-22
KR102003177B1 (ko) 2019-07-24
JP2018138024A (ja) 2018-09-06
KR20180119168A (ko) 2018-11-01
AU2017235954A1 (en) 2017-11-02
UY39166A (es) 2021-05-31
EP2688906A2 (en) 2014-01-29
CA3004030C (en) 2020-07-28
UY39164A (es) 2021-05-31
PH12018501395A1 (en) 2019-09-09
UY33974A (es) 2012-10-31
PH12017500577B1 (en) 2017-11-20
UA129006C2 (uk) 2024-12-25
RU2017145553A (ru) 2019-02-19
KR20180119170A (ko) 2018-11-01
CL2015001413A1 (es) 2015-07-31
AU2017204435B2 (en) 2017-09-14
RU2017145548A (ru) 2019-02-19
CA3004022C (en) 2020-07-28
KR102003176B1 (ko) 2019-07-24
CL2015001412A1 (es) 2015-07-31
PH12018501396B1 (en) 2019-03-18
US9771595B2 (en) 2017-09-26
UA128935C2 (uk) 2024-12-04
KR20180119169A (ko) 2018-11-01
RU2017145549A (ru) 2019-02-19
JP6689904B2 (ja) 2020-04-28
PH12013501978A1 (en) 2013-11-25
US9834777B2 (en) 2017-12-05
CA2831133C (en) 2019-10-15
US10731170B2 (en) 2020-08-04
CO6801642A2 (es) 2013-11-29
JP2016165295A (ja) 2016-09-15
JP2018121643A (ja) 2018-08-09
PH12017500577A1 (en) 2017-11-20
EP2688906B1 (en) 2016-09-28
WO2012134921A2 (en) 2012-10-04
KR101912967B1 (ko) 2018-10-30
AU2012237662B2 (en) 2017-06-15
CN103534267A (zh) 2014-01-22
US11466282B2 (en) 2022-10-11
ZA201306899B (en) 2014-05-28
JP6689905B2 (ja) 2020-04-28
AU2012237662A1 (en) 2013-09-26
MX2013010973A (es) 2013-12-06
AR116445A2 (es) 2021-05-12
US20200370061A1 (en) 2020-11-26
KR102003178B1 (ko) 2019-07-24
AU2017204438B2 (en) 2018-10-18
AU2017204438A1 (en) 2017-07-27
RU2013147604A (ru) 2015-04-27
MX383290B (es) 2025-03-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12071628B2 (en) Plant regulatory elements and uses thereof
EP2838996B1 (en) Plant regulatory elements and uses thereof
BR122020001085B1 (pt) Molécula de dna recombinante contendo elemento re-gulador de planta, e método para expressar uma mo-lécula de polinucleotídeo transcrevível
BR122020001115B1 (pt) Molécula de dna recombinante contendo elemento regulador de planta, e método para expressar uma molécula de polinucleotídeo transcrevível