ES2611105T3 - Materiales nanocompuestos tridimensionales que consisten en una matriz polisacárida y nanopartículas metálicas, preparación y uso de los mismos - Google Patents

Abstract

Un material nanocompuesto tridimensional que comprende una matriz polimérica que consiste en al menos un polisacárido liótropo, termótropo o termo-liótropo, neutro o aniónico, y un nanocompuesto a base de metal que consiste en al menos un polisacárido ramificado catiónico que atrapa uniformemente nanopartículas metálicas, en el que el polisacárido neutro o aniónico se gelifica por medio de agentes de gelificación químicos o físicos adecuados.

Description

DESCRIPCION

Materiales nanocompuestos tridimensionales que consisten en una matriz polisacarida y nanoparticulas metalicas, preparacion y uso de los mismos.

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Campo de la invencion

[0001] La presente invencion se refiere a materiales nanocompuestos tridimensionales que comprenden una matriz polimerica compleja que consiste en una composicion polisacarida de polisacaridos neutros o anionicos y de

10 polisacaridos cationicos ramificados, en la que las nanoparticulas metalicas se dispersan uniformemente y se estabilizan, formando asi dichos polisacaridos cationicos ramificados un nanocompuesto a base de metal. La invencion se refiere adicionalmente a la preparacion y uso de dichos materiales nanocompuestos tridimensionales en los campos biomedico, farmaceutico y alimentario.

15 Estado de la tecnica

[0002] Los polisacaridos naturales se han reconocido generalmente como polimeros biocompatibles; como tales, son materiales ya estudiados empleados desde hace mucho tiempo para aplicaciones en el campo biomedico, por ejemplo como portadores de compuestos biologicamente activos o celulas para la ingenieria tisular. Entre los mas

20 utilizados en la industria farmaceutica y alimentaria, pueden mencionarse alginatos y quitosano por su abundancia, coste relativamente bajo, alta biocompatibilidad y capacidad para producir, en condiciones apropiadas, matrices tridimensionales en forma de hidrogeles con alto contenido de agua. Sin embargo, el quitosano presenta algunos limites de aplicacion ligados a su marcada dependencia de su solubilidad en agua frente al pH, su no miscibilidad en soluciones acuosas con polisacaridos anionicos tales como alginato, con los que produce coacervados no utilizables 25 con fines de aplicacion, tal como, por ejemplo, en ingenieria tisular. El quitosano comparte con los alginatos un limite adicional en la medida en que no lleva ninguna senal especifica de celula que carezca de bioactividad. Por estas razones, los derivados de quitosano, que pueden superar los limites que se han mencionado anteriormente, se estudian y desarrollan actualmente.

30 [0003] En los ultimos anos, se han obtenido diferentes derivados de quitosano mediante modificacion quimica de la cadena polimerica. Para estas modificaciones, se utilizan ampliamente reacciones que implican el residuo amino de las unidades de D-glucosamina, que forman la cadena lineal de quitosano. En particular, la introduccion de unidades sacaridas (mono y oligosacaridos) como cadena lateral unida a N, permitio obtener derivados de quitosano solubles en agua sin necesidad de reducir el pH hasta valores acidos, evitando de esta manera tambien los posibles 35 problemas resultantes de la degradacion del polimero debido a la acidez de las soluciones acuosas.

[0004] En el documento US 4.424.346 (Hall, L.D. y Yalpani, M.), se describio por primera vez la sintesis de estos derivados, asi como la solubilidad acuosa de los mismos en un medio acuoso no acido. En particular, el documento US 4.424.346 desvelo que el derivado de quitosano con lactosa produce geles rigidos en soluciones acuosas a

40 concentraciones superiores al 3-5 %, mientras que no gelifica ni precipita en sales o mezclas de acidos (en particular, con cloruros de Ca, Cr, Zn, cromato de K, acido borico), y combinaciones de los mismos. Ademas, la patente que se ha mencionado anteriormente menciona el hecho de que el quitosano derivatizado con otro oligosacarido, es decir, celobiosa, no forma geles en soluciones acuosas per se, mientras que forma geles rigidos cuando se mezcla con alginato. Esta formacion de gel se debe a la fuerte interaccion entre las cargas policationicas 45 positivas y las cargas polianionicas negativas, lo que conduce a una coacervacion del sistema, proceso que de otro modo tiene un uso limitado, por ejemplo, para la microencapsulacion de material biologico, tal como celulas.

[0005] La Solicitud de Patente WO2007/135116 (Paoletti S. y col.) describe metodos para preparar soluciones polimericas que contienen mezclas de polisacaridos anionicos y cationicos para superar el problema de la

50 coacervacion y el uso de los mismos en el campo biomedico.

[0006] Ademas, la Solicitud de Patente WO2007/135114 (Paoletti S. y col.) describe estructuras tridimensionales, tanto hidratadas como no hidratadas, y metodos para prepararlas a partir de las mezclas polimericas que se han mencionado anteriormente de polisacaridos anionicos y cationicos gelificados con agentes gelificantes apropiados,

55 utiles para el fin de encapsular moleculas y celulas farmacologicamente activas.

[0007] Otra area de investigacion notablemente interesante relacionada con las nanotecnologias y con un gran interes topico por los polisacaridos es su posible uso para preparar materiales nanocompuestos, comprendiendo, en particular, nanoparticulas metalicas. De hecho, con el fin de estabilizar las nanoparticulas, las soluciones

polisacaridas, que permiten obtener sistemas nanocompuestos en los que las particulas metalicas estan dispersadas homogeneamente debido a las interacciones con las cadenas polimericas, podrian utilizarse ventajosamente. Por lo tanto, el papel de los polisacaridos esta relacionado con la formacion y la estabilizacion de las nanoparticulas metalicas esperando la posibilidad de aprovechar sus propiedades particulares; de hecho, se 5 sabe que las nanoparticulas metalicas estan dotadas de propiedades opticas, cataliticas y antimicrobianas particulares. De hecho, el uso de metales, tales como la plata, el oro, el cobre, el zinc y el niquel, en el campo de los materiales antimicrobianos, tiene un gran impacto en el mercado, especialmente para el tratamiento de heridas de la piel. Companias tales como Johnson&Johnson© y Convatec© han comercializado recientemente medicamentos basados en las propiedades antibacterianas de las nanoparticulas de plata. Pueden encontrarse aplicaciones

10 similares mediante los materiales nanocompuestos apropiados a base de polisacaridos para explotar la actividad antimicrobiana ya conocida de estos metales, por ejemplo, para el desarrollo de gasas, vendajes, parches. Estos ultimos productos podrian estar dotados de una actividad antimicrobiana de amplio espectro o geles de alto contenido en agua con actividad bactericida. De hecho, sigue existiendo la necesidad de auxiliares terapeuticos novedosos para el tratamiento de lesiones cutaneas o de las mucosas, tales como quemaduras y ulceraciones.

15 Estas lesiones son a menudo muy resistentes a las terapias antibioticas actualmente adoptadas; ademas, tambien necesitan efectos biologicos adicionales para la reparacion tisular, por ejemplo, potenciar la proliferacion celular y/o la hidratacion tisular apropiada. La estructura de hidrogel tridimensional puede ser particularmente ventajosa especialmente para este ultimo aspecto, pudiendo asegurar un entorno apropiado para la replicacion celular sin interferir con el fenotipo celular.

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[0008] Ademas, la posibilidad de obtener estructuras hidratadas tridimensionales es tambien particularmente interesante para aplicaciones de ingenieria de tejidos, donde es deseable combinar propiedades bioactivas tipicas de polisacaridos con actividad antimicrobiana.

25 [0009] En el campo de la ingenieria tisular, se esta realizando un gran esfuerzo para producir revestimientos antimicrobianos sobre biomateriales a implantar en el cuerpo humano; en este caso, el principal factor de riesgo esta relacionado con la posible citotoxicidad de los propios agentes antimicrobianos. Por ejemplo, en el campo de la cirugia ortopedica, las operaciones de reemplazo protesico de las articulaciones y la osteosintesis de las fracturas no expuestas representan un tipo de cirugia limpia con respecto a las infecciones quirurgicas (Tucci G. y col.,

30 Giornale Italiano di Ortopedia e Traumatologia, 2005; 31: 121-129). Sin embargo, la implantacion de biomateriales dentro de los tejidos del huesped puede promover la aparicion y subsistencia de infecciones incluso con cargas bacterianas algo bajas. A pesar del progreso en la profilaxis perioperatoria, las infecciones bacterianas y fungicas siguen siendo muy comunes; esto se debe a un riesgo prolongado de adhesion de estos microorganismos al dispositivo ortopedico (Zimmerli W. y col., New England J. Med., 2004; 351(16): 1645-54). Estos datos apoyan la

35 importancia de desarrollar agentes antimicrobianos alternativos para asociarse con biomateriales de nueva generacion.

[0010] El documento US 7255881 (Gillis y col.) proporciona una posible solucion a los problemas que se han mencionado anteriormente. De hecho, la patente desvela revestimientos a base de plata formados sobre diversos

40 tipos de sustrato a traves de tecnicas tales como deposiciones quimicas y fisicas de una fase de vapor ("deposicion quimica en fase vapor" CVD, "deposicion fisica en fase vapor" PVD) y en una fase liquida para aplicaciones antimicrobianas. Respecto a los sustratos polisacaridos, en los que se deposita plata, se mencionan quitosano, alginato y acido hialuronico. Se observa que estas tecnicas no estan dirigidas a la formacion de nanoparticulas metalicas homogeneamente dispersas dentro de matrices apropiadas, sino que abordan la formacion de capas

45 continuas de plata de superficie (nanocristalinas, policristalinas o amorfas). Ademas, las condiciones de temperatura y presion requeridas para estas tecnicas de deposicion no son compatibles con la estabilidad del polisacarido ni de las biomoleculas bioactivas (como peptidos o proteinas) que pudieran ser deseables para formar parte del soporte, ni siquiera con aplicaciones de ingenieria de tejidos que implican celulas vivas.

50 Resumen

[0011] Es un primer objeto de la presente invencion proporcionar sistemas nanocompuestos tridimensionales, en los que las nanoparticulas metalicas controladas por tamano se dispersan homogeneamente en matrices polisacaridas, estando dichas matrices en forma de gel o en forma solida, y cuyas propiedades son particularmente

55 adecuadas para aplicaciones biologicas en el campo biomedico.

[0012] Es un objeto adicional que tal nanocompuesto tridimensional pueda obtenerse mediante un enfoque quimico simple y economicamente conveniente, y en particular, pero no exclusivamente, produciendo hidrogeles biocompatibles y bioactivos y hidrogeles deshidratados.

[0013] Es un objeto adicional mejorar estos sistemas empleando polisacaridos facilmente disponibles en el mercado y sin que estos polisacaridos sean sometidos a manipulaciones quimicas, asi como sin la necesidad de manipulaciones preparativas complejas de estos sistemas.

5

[0014] Con el fin de cumplir los objetivos que se han mencionado anteriormente, los inventores desarrollaron sistemas polisacaridos adecuados basados en composiciones al menos binarias que comprenden polisacaridos neutros o anionicos, preferiblemente derivados de fuentes vegetales o bacterianas, y polisacaridos cationicos ramificados, permitiendo que los ultimos polisacaridos atrapen nanoparticulas metalicas, y siendo los polisacaridos

10 neutros o anionicos capaces de formar matrices solidas tridimensionales hidratadas o no hidratadas (por ejemplo, hidrogeles con diversas formas, microesferas, soportes, matrices fibrosas) y/o matrices de alta relacion superficie/volumen (membranas humedas o deshidratadas y peliculas). De esta manera, el sistema formado por polisacaridos cationicos ramificados, que atrapan uniformemente nanoparticulas metalicas, es en si mismo un nanocompuesto.

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[0015] Por lo tanto, en un primer aspecto, el objeto de la invencion consiste en materiales nanocompuestos tridimensionales que comprenden una matriz polimerica que consiste en al menos un polisacarido neutro o anionico (liotropo, termotropo o termo-liotropo), y un nanocompuesto a base de metal que consiste en al menos un polisacarido cationico ramificado en el que las nanoparticulas metalicas estan uniformemente dispersadas y

20 estabilizadas, donde el polisacarido neutro o anionico se gelifica por medio de gelificantes fisicos o quimicos adecuados, dependiendo del tipo del propio polisacarido neutro o anionico.

[0016] Se pudo mezclar soluciones de polisacaridos ramificados cationicos que contenian nanoparticulas metalicas con soluciones de polisacaridos neutros o anionicos y trabajar con un valor de pH y una fuerza ionica

25 adecuados, para no causar formacion de coacervados. Aprovechando la capacidad del polisacarido neutro o acido para formar geles ionotropicos o termotropos, por medio de agentes gelificantes adecuados, fue posible obtener entonces matrices tridimensionales, hidratadas o no hidratadas, que consistian en mezclas de estos polisacaridos neutros o anionicos y polisacaridos basicos ramificados, atrapando estas ultimas nanoparticulas metalicas uniformemente dispersas y estabilizadas a traves del propio polisacarido basico ramificado. Por lo tanto, en un 30 segundo aspecto, es un objeto de la invencion un metodo de preparacion de materiales nanocompuestos tridimensionales que comprende una matriz polimerica que comprende una matriz polimerica que consiste en al menos un polisacarido liotropo, termotropo o termo-liotropo, neutro o anionico, y un nanocompuesto a base de metal que consiste en al menos un polisacarido cationico ramificado en el que las nanoparticulas metalicas se dispersan uniformemente y se estabilizan, caracterizado por que dichos materiales nanocompuestos tridimensionales pueden 35 obtenerse a partir de soluciones acuosas de al menos un polisacarido liotropo, termotropo o termo-liotropo, neutro o anionico, y de un nanocompuesto a base de metal que consiste en al menos un polisacarido cationico ramificado que atrapa las nanoparticulas metalicas, en el que estas soluciones acuosas tienen una fuerza ionica de al menos 50 mM y no superior a 350 mM y un pH de al menos de 7, y en el que estas soluciones acuosas se tratan con agentes gelificantes fisicos o quimicos capaces de causar la gelificacion de los polisacaridos liotropos, termotropos o 40 termo-liotropos, neutros o anionicos. Estas soluciones acuosas tienen preferiblemente una osmolaridad comprendida en el intervalo de 250 a 300mM.

[0017] Por lo tanto, los materiales nanocompuestos tridimensionales que pueden obtenerse con tal metodo de preparacion son aun un objeto de la invencion.

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[0018] Ademas, los materiales nanocompuestos tridimensionales de acuerdo con la invencion mostraron tener una fuerte actividad antimicrobiana de amplio espectro y ningun efecto citotoxico.

[0019] Por lo tanto, es un objeto adicional de la invencion el uso de estos materiales nanocompuestos 50 tridimensionales en el campo biomedico, en particular para aplicaciones antimicrobianas. De hecho, los materiales

compuestos tridimensionales objeto de la presente invencion, prometen aplicaciones utiles como biomateriales, tanto en el campo terapeutico dermatologico (por ejemplo, ulceraciones cutaneas vasculares-metabolicas) como ortopedico (por ejemplo, revestimientos de protesis oseas), dental (tratamiento de infecciones de patogenos periodontales), cardiologico, urologico (revestimientos de endoprotesis) y de la cirugia general.

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Breve descripcion de las figuras

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Figura 1: la figura muestra un material nanocompuesto tridimensional en forma de hidrogel que comprende un nanocompuesto a base de metal formado por un derivado de quitosano con nanoparticulas de plata a base de lactosa (C: en lo sucesivo en el presente documento denominado como Chitlac: numero de registro CAS 85941-43-1) (nAg) en una matriz de alginato (A) (gel AC-nAg). La composicion es: Chitlac al 0,2 % (p/v), alginato al 1,5 % (p/v), AgNO3 0,5 mM, C6H8O6 0,25 mM, tampon Hepes 10 mM, CaCO3 30 mM, GDL 60 mM (D-glucono-5-lactona). La preparacion del hidrogel se describe en el ejemplo 8.

Figura 2: La figura muestra un material nanocompuesto tridimensional en forma de hidrogel que comprende un nanocompuesto a base de metal formado por nanoparticulas de oro a base de Chitlac (nAu) en una matriz de Alginato (gel AC-nAu). La composicion es: Chitlac al 0,2 % (p/v), alginato al 1,5 % (p/v), HAuCL 0,5 mM, tampon Hepes 10 mM, CaCO3 30 mM, GDL 60 mM. La preparacion se describe en el ejemplo 9. Figura 3: La figura muestra microesferas de gel AC-nAg de material nanocompuesto tridimensional (Chitlac al 0,2 % (p/v), alginato al 1,5 % (p/v), AgNO3 0,5 mM, C6H8O6 0,25 mM, tampon Hepes 10 mM, CaCO3 30 mM, GDL 60 mM). La preparacion se describe en el ejemplo 13.

Figura 4: La figura muestra un ensayo de crecimiento bacteriano de E. coli ATCC 25922 en el material nanocompuesto tridimensional en forma de hidrogel de Alginato-Chitlac (gel AC, ejemplo 6, a la izquierda) en comparacion con un material nanocompuesto tridimensional en forma de hidrogel de Alginato-Chitlac- nAg (gel AC-nAg, ejemplo 8, a la derecha).

Figura 5: La figura muestra un ensayo de recuento de colonias de bacterias de E. coli ATCC 25922 en contacto con una suspension que contiene microesferas AC-nAg de material nanocompuesto tridimensional durante 240 min. La preparacion de microesferas se describe en el ejemplo 13. El control se representa por el crecimiento en medio Mueller-Hinton al 20 % (T 0 y 240 min).

Figura 6: La figura muestra un ensayo de crecimiento bacteriano bacterial de E. coli ATCC 25922 en hidrogel de Alginato-Chitlac de material nanocompuesto tridimensional (gel AC, ejemplo 6, a la izquierda) en comparacion con un hidrogel de Alginato-Chitlac-nAu de material nanocompuesto tridimensional (gel AC- nAg, ejemplo 9, a la derecha).

Figura 7: La figura muestra un ensayo de citotoxicidad sobre lineas celulares de fibroblasto (NIH-3T3), evaluado como liberacion de LDH (deshidrogenasa lactica), de geles AC-nAg de material nanocompuesto tridimensional (ejemplo 8, lineas diagonales) por contacto, y el extracto relacionado despues de 24 y 72 horas en un medio a 37 °C. Los controles se representan por i) celulas adherentes (control, confluentes), ii) celulas en contacto con gel de Alginato-Chitlac sin nanoparticulas de plata (gel AC, ejemplo 6, lineas horizontales), iii) celulas en contacto con el medio de cultivo liquido mantenido en contacto con el material durante un tiempo determinado (24 horas) (en lo sucesivo aqui denominado como "extracto") de geles de Alginato-Chitlac sin nanoparticulas de plata (extracto de gel AC, malla ortogonal).

Figura 8: La figura muestra un ensayo de citotoxicidad (LDH) sobre lineas celulares de osteoblasto (MG63), evaluado como liberacion de LDH (deshidrogenasa lactica), de geles AC-nAu de material nanocompuesto tridimensional (ej. 9, Cont. de AC-nAu) por contacto, y el extracto relacionado (Est. AC-nAu) despues de 24 y 72 horas en un medio a 37 °C. Los controles se representan por celulas adherentes (adhesion), celulas en contacto con geles de Alginato-Chitlac sin nanoparticulas metalicas (ejemplo 6, Cont. de AC), extracto de geles de Alginato-Chitlac sin nanoparticulas metalicas (Est. de AC), celulas en contacto con discos de poliestireno (PS, control negativo de los sistemas en contacto), celulas en contacto con discos de poliuretano con ZnDBC (PU, control positivo del sistema en contacto de acuerdo con la Norma ISO 109935), celulas con una solucion de Triton (control positivo del extracto).

Descripcion detallada de la invencion

Definiciones

[0021] Estructura tridimensional: La definicion indica para el proposito de la presente solicitud una estructura, tanto hidratada como no hidratada, capaz de mantener la forma y el tamano cuando no se somete a deformacion.

[0022] La estructura tridimensional desvelada en la presente solicitud es un material nanocompuesto formado por una matriz de polisacaridos neutros o anionicos que comprende un material formado por nanoparticulas metalicas dispersadas uniformemente y permanentemente en polisacaridos ramificados policationicos descritos en detalle en lo sucesivo en el presente documento. Por lo tanto, en primera instancia, la definicion de "nanocompuesto tridimensional" se utiliza para indicar el material nanocompuesto de la invencion.

[0023] Hidrogel: Generalmente, el termino "hidrogel" indica estructuras semisolidas tridimensionales altamente hidratadas capaces de mantener la forma y el tamano cuando no se someten a deformacion. Pueden obtenerse a partir de soluciones semi-diluidas de polisacaridos adecuadamente reticulados.

[0024] En la siguiente descripcion, tambien se pueden usar "hidrogeles nanocompuestos" para indicar, cuando se hidratan, las estructuras nanocompuestas tridimensionales de la invencion como se han definido previamente.

5 [0025] Nanocompuesto: Generalmente, el termino "nanocompuesto" indica un sistema que consiste en particulas con tamano nanometrico (cargas) a traves de un material macroscopico (matriz). Al ser la invencion un nanocompuesto tridimensional derivado de la inclusion en una matriz polisacarida neutra o anionica de un material nanocompuesto (por ejemplo, nanoparticulas metalicas dispersadas uniformemente y permanentemente en polisacaridos cationicos ramificados), este ultimo material se indica en el presente documento principalmente como

10 "nanocompuesto a base de metal". En particular, el nanocompuesto a base de metal consiste en nanoparticulas metalicas formadas por la reduccion de iones metalicos por o en derivados polisacaridos alditolicos o aldonicos de quitosano. Por lo tanto, en la siguiente descripcion, ademas de "nanocompuesto a base de metal", se utiliza "nanocompuesto a base de nanoparticulas metalicas" con referencia a este material.

15 [0026] Solucion coloidal (o coloide): Sistema en el que las particulas con tamanos de 1 y 1.000 nm se dispersan en un medio de disolvente continuo.

[0027] Gelificacion "in situ”: Metodo de gelificacion en el que hay una liberacion controlada del agente gelificante (por ejemplo, ion Ca2+ para alginato). Esto se logra utilizando una forma inactivada del agente gelificante (por

20 ejemplo, CaCOs) que despues se libera tras la adicion de un segundo componente (por ejemplo, glucono-5-lactona, GDL).

[0028] Los objetos y ventajas del material nanocompuesto tridimensional que se describe en la presente invencion se comprenderan mejor a partir de la siguiente descripcion detallada donde se describiran, a modo de ejemplo no

25 limitante de la invencion, algunos ejemplos de preparacion de nanocompuestos tridimensionales y su caracterizacion biologica para evaluar la actividad antibacteriana y la citotoxicidad.

Descripcion

30 [0029] Para los objetos perseguidos, se ha abordado el aspecto relacionado con la preparacion y caracterizacion de un sistema nanocompuesto basado en polisacaridos en el que se explotan las propiedades relacionadas con una nanoescala de nanoparticulas metalicas. De acuerdo con la invencion, los materiales nanocompuestos tridimensionales estan formados a partir de una matriz polimerica que consiste en una composicion de al menos un polisacarido liotropo, termotropo o termo-liotropo, neutro o anionico, y un nanocompuesto a base de metal que

35 consiste en al menos un polisacarido cationico ramificado que atrapa nanoparticulas metalicas uniformemente dispersas y estabilizadas en tal polisacarido cationico ramificado. Los polisacaridos cationicos ramificados tienen una doble funcion en el material nanocompuesto tridimensional de acuerdo con la invencion: i) principalmente por un lado, atrapando y estabilizando adecuadamente las nanoparticulas metalicas, y ii) adicionalmente, por otro lado, contribuyendo en la formacion de la matriz, que es sustancialmente una composicion de polisacaridos (por ejemplo,

40 al menos un polisacarido liotropo, termotropo o termo-liotropo, neutro o anionico, y al menos un polisacarido cationico ramificado), en la medida en que la matriz tridimensional se debe principalmente a la capacidad de los polisacaridos neutros o anionicos para formar geles con agentes gelificantes apropiados. Por lo tanto, tal composicion de polisacaridos esta en una posible realizacion binaria y formada por un polisacarido neutro o acido y un polisacarido cationico ramificado.

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[0030] Los polisacaridos neutros o acidos utiles para el proposito de la invencion son: a) polisacaridos acidos, capaces de formar geles liotropos, seleccionados del grupo que consiste en alginatos, pectatos, pectinatos; b) polisacaridos neutros capaces de dar lugar a geles termotropos y, en este caso, se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en agarosa, escleroglucano, esquizofilano, curdlan; c) polisacaridos acidos capaces de dar lugar

50 a geles termo-liotropos y, en este caso, se seleccionan preferentemente del grupo que consiste en sulfato de agarosa, I- y K-carragenano, sulfato de celulosa, goma gellan, goma rhamsan, goma whelan (tambien conocida como goma de welan), goma xantana.

[0031] El peso molecular medio (PM) de los polisacaridos neutros o acidos puede ser de hasta 2.000 kDa y

55 preferiblemente de 100 kDa a 1.000 kDa y se usan mas preferiblemente pesos moleculares medios de 200 kDa.

[0032] Como se conoce bien, estos polisacaridos neutros o anionicos tienen la caracteristica de formar estructuras tridimensionales (tipo gel o hidrogeles, cuando se hidratan), en las condiciones adecuadas. De hecho, el aspecto relacionado con la formacion de hidrogel esta sustancialmente relacionado con la capacidad de estos polisacaridos

neutros o acidos para formar instantaneamente hidrogeles cuando se ponen en contacto con soluciones de iones para polisacaridos liotropos, o con soluciones enfriadas para polisacaridos termotropos. En el caso de los polisacaridos termo-liotropos acidos, los agentes de gelificacion pueden ser tanto ffsicos como qmmicos y, por lo tanto, ser iones o estar a las temperaturas apropiadas o ambos.

5

[0033] Por el contrario, el aspecto relacionado con la formacion y el transporte de nanoparticulas metalicas esta sustancialmente relacionado con el segundo componente polisacarido, es decir, los polisacaridos cationicos ramificados. Para los fines de la presente invencion, se trata de derivados alditolicos o aldonicos ramificados de quitosano, en los que las unidades de D-Glucosamina que forman la cadena lineal de quitosano unen, por medio del 10 grupo funcional -NH del atomo de carbono C2, residuos mono- u oligo-sacaridos de polioles alditolicos o aldonicos,

imagen1

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- R es -CH2- o -CO-;

- Ri es hidrogeno o un monosacarido, o un oligosacarido;

- R2 es -OH o -NHCOCH3.

20 [0034] Para los fines representativos, las unidades de D-Glucosamina sustituidas con residuos mono u oligosacaridos de polioles alditolicos o aldonicos en los derivados ramificados de quitosano se representan por la formula general (II), donde "n" se refiere al numero total de unidades de D-Glucosamina que constituyen una cadena de quitosano lineal:

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[0035] Para los fines de la presente invencion, en los derivados ramificados preferidos de quitosano, cuando Ri es un monosacarido, dicho monosacarido se selecciona del grupo que consiste en galactosa, glucosa, manosa, N-acetil glucosamina, y N-acetil galactosamina, y, cuando Ri es un oligosacarido, dicho oligosacarido puede comprender 2 unidades glicosfdicas.

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[0036] Los residuos alditolicos o aldonicos mono u oligosacaridos de formula general (I) son preferiblemente mono u oligosacaridos que comprenden de 1 a 3 unidades glicosfdicas y, de acuerdo con un aspecto mas preferido, estos residuos de polioles alditolicos o aldonicos son residuos de oligosacaridos que comprenden de 2 a 3 unidades glicosfdicas y aun mas preferiblemente, se seleccionan del grupo de residuos de oligosacaridos que consisten en

35 lactosa, celobiosa, celotriosa, maltosa, maltotriosa, quitobiosa, quitotriosa, manobiosa, asf como de sus acidos aldonicos correspondientes. Para los fines de la presente invencion, el derivado oligosacarido mas preferido de

quitosano es el derivado con lactosa (Chitlac; numero de registro CAS 85941-43-1). Ademas, para dispersar uniformemente y estabilizar las nanopartfculas metalicas, el grado de sustitucion qufmica de los grupos amino de quitosano con estos mono u oligosacaridos de formula general (I) debe ser de al menos el 40 %. El grado de sustitucion de los grupos amino de quitosano con dichos mono u oligosacaridos esta preferiblemente comprendido 5 en el intervalo del 50 % al 80 %, y mas preferiblemente es del 70 %.

[0037] El peso molecular medio (en lo sucesivo en el presente documento denominado PM) del quitosano util para obtener los derivados oligosacaridos mencionados es de hasta 1.500 kDa y esta comprendido preferiblemente en el intervalo de 400 kDa a 700 kDa.

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[0038] Las nanopartfculas metalicas incorporadas en la matriz polimerica que consisten en estos derivados ramificados mono u oligosacaridos de quitosano estan hechas de metales seleccionados preferiblemente de plata, oro, platino, paladio, cobre, cinc, nfquel, y mezclas de los mismos.

15 [0039] Las nanopartfculas incluidas en la matriz polimerica que consisten en derivados ramificados mono u oligosacaridos de quitosano tienen un tamano en el intervalo de 5 nm a 150, y en particular, un tamano de nanopartfcula metalica medio controlado entre 30 y 50 nm.

[0040] Una caracterfstica esencial de estas nanopartfculas es que estas nanopartfculas son en su mayorfa metales 20 en su forma reducida, ademas, sin excluir la presencia residual de grupos de pocos atomos con un caracter ionico, y

que en su dispersion/estabilizacion en la matriz polisacarida, estan implicadas cadenas laterales mono u oligosacaridas proximas a los grupos amino del propio quitosano.

[0041] Sin desear unirse a estas, las relaciones preferidas de matriz polisacarida cationica y metales se refieren a 25 nanocompuestos a base de metal en forma de soluciones coloidales, aunque dicho nanocompuesto a base de metal

pueden estar tambien en forma de pelfculas o polvos deshidratados, e incluso se dializan para eliminar los contraiones residuales de la preparacion de los propios materiales. En los nanocompuestos a base de metal en forma de soluciones coloidales acuosas, la relacion de la concentracion del polisacarido (expresada como % p/v) sobre la concentracion de la sal metalica de partida (expresada como molaridad) es de 0,0025 a 20 y 30 preferiblemente es de 0,2.

[0042] Por lo tanto, la masa metalica expresada en mg, que puede incorporarse por gramo de polisacarido cationico, puede ser de 3.000 mg/g a 0,3 mg/g y preferiblemente es 50 mg del metal incorporado por gramo de polisacarido.

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[0043] Tal componente de los materiales nanocompuestos tridimensionales de acuerdo con la invencion puede prepararse en las condiciones apropiadas con soluciones acuosas de polisacaridos basicos en presencia o ausencia de agentes reductores exogenos.

40 [0044] El metodo para preparar este componente de los materiales nanocompuestos tridimensionales de acuerdo con la invencion comprende al menos:

a) preparar soluciones acuosas de polisacaridos cationicos ramificados en una concentracion de hasta el 2 % (p/v);

45 b) preparar soluciones acuosas de sales metalicas en una concentracion de 0,1 mM a 20 mM;

c) anadir estas soluciones salinas a las soluciones de polisacaridos y mezclar hasta obtener soluciones coloidales donde las nanopartfculas metalicas se dispersan homogeneamente.

[0045] Opcionalmente se anade un agente reductor a las soluciones coloidales obtenidas.

50

[0046] La formacion de las nanopartfculas metalicas en presencia de polisacaridos cationicos ramificados produce un sistema de nanopartfculas de metal excepcionalmente bien dispersado y estabilizado, evitando la tendencia bien conocida de la nanopartfcula de metal preformada a dar grandes grupos de aglomerados en solucion, lo que generalmente conduce a perder los beneficios relacionados con la escala nanometrica.

55

[0047] En sus caracterfsticas generales, el metodo de preparacion del nanocompuesto a base de metal es como se indica a continuacion: se preparan soluciones acuosas de estos derivados ramificados de quitosano con mono u oligosacaridos a diferentes concentraciones (hasta el 2 % (p/v), preferiblemente en el intervalo del 0,05 % (p/v) al 1 % (p/v) y mas preferentemente del 0,2 % Las soluciones de polisacarido se mezclan entonces con soluciones de

sales metalicas elegidas entre plata, oro, platino, paladio, cobre, cinc, nfquel, preferiblemente seleccionadas entre cloruros, percloratos y nitratos (por ejemplo, AgNO3, HAuCL, CUSO4, ZnCy NiCy, para obtener concentraciones finales de estos metales de 0,1 mM a 20 mM, mas preferiblemente de 1 mM a 14 mM, y aun mas preferiblemente de 1 mM. Se pueden anadir opcionalmente agentes reductores conocidos, preferiblemente seleccionados de entre 5 acido ascorbico, citrato sodico, borohidruro sodico y cianoborohidruro sodico a las soluciones para obtener nanoparticulas en estado metalico. El agente reductor se anade a concentraciones de 0,05 mM a 10 mM, y preferiblemente la concentracion es de 0,5 mM.

[0048] Sin embargo, se descubrio que de otro modo para otros sistemas polimericos, los nanocompuestos a base 10 de metal formados a partir de derivados ramificados de quitosano con mono u oligosacaridos y nanoparticulas

metalicas tambien se pueden preparar en ausencia de agentes reductores, ya que las cadenas mono u oligosacaridas actuan como agente reductor de iones metalicos per se, y permiten formar in situ nanoparticulas dispersas en la matriz polimerica. En este caso, las nanoparticulas metalicas pueden obtenerse mezclando simplemente las soluciones derivadas de quitosano con soluciones salinas del metal seleccionado a 15 concentraciones apropiadas. Tambien en este caso, las concentraciones de polisacarido y sal metalica son como se ha indicado previamente.

[0049] Sin embargo, en ambos casos debido a las propiedades quimicas y ffsico-qufmicas de los atomos de nitrogeno y los sustituyentes laterales existentes en el derivado ramificado mono u oligosacarido del quitosano, los

20 iones metalicos interaccionan con macromoleculas mediante interacciones de coordinacion, mientras que la presencia de las cadenas laterales de mono u oligosacaridos, por ejemplo lactosa, ofrece un impedancia esterica eficaz para obstaculizar la tendencia natural de las nanoparticulas a agregarse. La posterior reduccion de iones, ya sea causada por un agente reductor exogeno o por las cadenas mono u oligosacaridas de los derivados ramificados de quitosano, conduce a la formacion de nanoparticulas estabilizadas por cadenas polisacaridas.

25

[0050] En ambos casos, la relacion de masa de plata que puede incorporarse y la del polisacarido, que se indica como mg por gramo, es como se ha indicado previamente. Inesperadamente, se descubrio que la mezcla en soluciones acuosas del componente polimerico que consiste en los polisacaridos neutros o acidos que se han mencionado anteriormente, y en particular los alginatos, y el componente polimerico polisacarido basico, es decir, los

30 derivados ramificados del quitosano con los polioles alditolicos o aldonicos de formula general (I), que comprenden las nanoparticulas metalicas, que ya son un material nanocompuesto en la naturaleza (por ejemplo, el nanocompuesto a base de metal), los materiales nanocompuestos obtenidos son matrices tridimensionales o hidrogeles estables y no son coacervados en la naturaleza, a pesar de la presencia de nanoparticulas metalicas, asi como las nanoparticulas permanecen uniformemente dispersas en los derivados ramificados de quitosano.

35

[0051] De hecho, la formacion de hidrogel o matriz tridimensional de acuerdo con la invencion se puede obtener mezclando los dos componentes (por ejemplo, polisacaridos neutros o acidos y el nanocompuesto metalico) en soluciones acuosas que tienen las caracteristicas apropiadas por medio de un tratamiento posterior del mismo con agentes adecuados capaces de gelificar el polisacarido anionico o neutro.

40

[0052] En particular, los materiales nanocompuestos tridimensionales que comprenden una matriz polimerica que consiste en al menos un polisacarido neutro o anionico, liotropo, termotropo o termo-liotropo, y un nanocompuesto a base de metal que consiste en al menos un polisacarido cationico ramificado que atrapa nanoparticulas metalicas uniformemente dispersas y estabilizadas, pueden obtenerse a partir de soluciones acuosas de los dos componentes

45 que tienen las soluciones con una fuerza ionica al menos de 50 mM y no superior a 350 mM y un pH de al menos 7, y tratando estas soluciones con agentes gelificantes quimicos o fisicos capaces de gelificar los polisacaridos neutros o anionicos, liotropos, termotropos o termo-liotropos.

[0053] Las condiciones preferidas (concentraciones sustanciales, pH, fuerza ionica) para obtener las matrices o 50 hidrogeles tridimensionales de estos dos componentes son tipicamente soluciones acuosas que tienen un pH en un

intervalo fisiologico, y en particular entre 7 y 8, y mas preferiblemente el pH es de 7,4, y una osmolaridad de 250 a 300 mM, con una fuerza ionica de 50 mM a 350 mM, y preferentemente de 150 mM, preferiblemente obtenidas anadiendo NaCl a concentraciones de 0,05 M a 0,35 M, y mas preferiblemente de 0,15 M .

55 [0054] Los agentes gelificantes se pueden seleccionar dependiendo del tipo de polisacarido anionico liotropo de iones monovalentes, bivalentes o trivalentes adecuados, y para los polisacaridos termotropos entre temperaturas no superiores a 50 °C o no inferiores a 10 °C. Como se sabe, para los polisacaridos termo-liotropos, los agentes de gelificacion pueden ser tanto agentes quimicos, tales como iones, como agentes fisicos, tales como la temperatura. La eleccion entre los dos tipos de agentes gelificantes depende sustancialmente, como se conoce bien en la tecnica,

del polisacarido termo-liotropo acido a gelificar.

[0055] Para polisacaridos tales como alginato y pectato, estos iones son iones alcalinoterreos, excluyendo magnesio, y metales de transicion, y preferiblemente se seleccionan de entre calcio, bario, estroncio, plomo, cobre,

5 manganeso y mezclas de los mismos, o son iones de tierras raras y preferiblemente se seleccionan del grupo que consiste en gadolinio, terbio, europio y mezclas de los mismos.

[0056] Las concentraciones de la solucion acuosa de estos iones adaptados para la gelificacion son superiores a 10 mM y preferiblemente de 10 mM a 100 mM y mas preferiblemente de 50 mM. La solucion gelificante contiene

10 preferiblemente una concentracion de CaCl2 de 50 mM y una fuerza ionica de 0,15 M.

[0057] En el caso de los carragenanos, pueden usarse iones alcalinos elegidos preferiblemente del grupo que consiste en potasio, rubidio y cesio, a concentraciones no inferiores a 50 mM y preferiblemente de 50 mM a 200 mM y mas preferiblemente de 0,1 M.

15

[0058] En el caso de soluciones polisacaridas, que conducen a hidrogeles termotropos, tales como por ejemplo agarosa, la preparacion de hidrogeles se realiza enfriando por debajo de la temperatura de formacion del gel. Las soluciones polisacaridas se preparan a una temperatura por encima de la temperatura a la que tiene lugar la formacion de hidrogel por el polisacarido termotropo. A esta temperatura, el polisacarido termotropo no forma

20 hidrogeles. La temperatura a la que se preparan las soluciones polisacaridas, preferiblemente esta en el intervalo de 50 °C a 30 °C, y mas preferiblemente es de 37 °C. La formacion de hidrogel se produce por goteo de la solucion polisacarida en un bano de gelificacion enfriado a una temperatura por debajo de la temperatura de formacion del gel. Esta temperatura esta preferiblemente en el intervalo de 10 °C a 40 °C y mas preferiblemente es de 20 °C.

25 [0059] Para los fines de la presente invencion, las mezclas al menos binarias de polisacarido neutro o anionico y de polisacarido basico ramificado que comprenden las nanoparticulas metalicas tienen concentraciones polimericas totales de polisacarido neutro o anionico de hasta el 4 % (p/v). Estas concentraciones polimericas totales estan preferiblemente en el intervalo de 1,5 % a 3 % (p/v) y mas preferiblemente son del 2 % (p/v).

30 [0060] Para los fines de la presente invencion, las relaciones en peso de polisacaridos acidos y polisacaridos cationicos, en los que las nanoparticulas metalicas estan atrapadas, son de 8:1 a 1:1 (polisacarido neutro o anionico:polisacarido cationico), y preferiblemente de 8:1 a 5:1, y mas preferiblemente de 7,5:1. Por lo tanto, los materiales nanocompuestos tridimensionales de la invencion pueden obtenerse de acuerdo con un metodo de preparacion que comprende al menos las siguientes etapas:

35

i. preparar una solucion acuosa de una mezcla de al menos un polisacarido neutro o anionico, liotropo, termotropo o termo-liotropo y de un nanocompuesto a base de metal que consiste en al menos un derivado mono u oligosacarido de quitosano que atrapa las nanoparticulas metalicas (preparadas como se ha descrito previamente), teniendo dicha solucion acuosa una fuerza ionica de al menos 50 mM y no superior a

40 350 mM, y al menos un pH de 7;

ii. gelificar el polisacarido neutro o anionico, liotropo, termotropo o termo-liotropo, tratando la solucion acuosa de la mezcla preparada en la etapa anterior por medio de agentes de gelificacion quimicos o fisicos adecuados.

45 [0061] En particular, esta ultima etapa puede realizarse por goteo a traves de una aguja en una solucion que contiene el ion de reticulacion para los polisacaridos anionicos liotropos, o en una solucion a una temperatura adecuada para los polisacaridos termotropos, o mediante gelificacion "in situ”. Para los polisacaridos termo-liotropos pueden emplearse tanto soluciones ionicas como soluciones a las temperaturas apropiadas para el proceso de gelificacion 50

[0062] Con el metodo que se ha descrito anteriormente, se obtienen materiales nanocompuestos, en los que la matriz polimerica hecha de polisacaridos es tridimensional y en forma de hidrogel o no hidratada si se somete a procesos de deshidratacion posteriores. Ademas, estas matrices pueden adoptar diversas formas como cilindros, microesferas, discos, peliculas secas, polvos, o pueden extruirse para producir fibras.

55

[0063] En el caso del alginato, los cilindros se pueden preparar anadiendo un ion reticulante en la forma inactiva, por ejemplo CaCO3 o el complejo Ca-EDTA, a la solucion polisacarida. A continuacion, se anade una sustancia hidrolizante lentamente, tal como, por ejemplo, GDL (D-glucono-5-lactona). Por ejemplo, esta suspension se transfiere dentro de los recipientes en forma de cilindro o discoide y se mantiene durante 24 h. Despues, los cilindros

de gel de las soluciones polisacaridas se extraen de los recipientes. La formacion in situ de los cilindros se debe a la liberacion de iones de calcio.

[0064] Para ensayar la actividad antimicrobiana de nanocompuestos tridimensionales de la invencion, se realizan 5 ensayos de crecimiento bacteriano sobre un soporte semisolido y un ensayo de recuento de colonias bacterianas en

presencia de microesferas de nanocompuestos tridimensionales; se ha mostrado que, debido a la presencia de nanoparticulas de metal, las bacterias no crecen ni en dicha superficie de gel ni en una suspension puesta en contacto con las microesferas de gel de nanocompuestos tridimensionales, subrayando asi una fuerte actividad antibacteriana.

10

[0065] Los ensayos de citotoxicidad en diferentes lineas celulares eucariotas demuestran que estos geles nanocompuestos tridimensionales no son citotoxicos, ni siquiera manteniendo un efecto bactericida eficaz.

[0066] A titulo ilustrativo y no limitativo, se describen en lo sucesivo en el presente documento la preparacion no 15 hidratada de hidrogel o matriz 3D de acuerdo con la invencion, asi como la actividad biologica de tipo

antimicrobiano.

Preparacion de hidrogenes de nanocompuesto tridimensional a partir de una solucion de un polisacarido anionico y un nanocompuesto a base de metal que consiste en un derivado oligosacarido de quitosano con nanoparticulas 20 metalicas

Ejemplo 1: Sintesis de derivados de quitosano con lactosa (en lo sucesivo en el presente documento "Chitlac")

[0067] Se disuelve quitosano (1.5 g, grado de acetilacion al 11 %) en 110 ml de una solucion de metanol (55 ml) y 25 tampon de acido acetico al 1 %, pH 4,5 (55 ml). Se anaden 60 ml de una solucion de metanol (30 ml) y tampon de

acido acetico al 1 %, pH 4,5 (30 ml) que contiene lactosa (2,2 g) y cianoborohidruro sodico (900 mg). La mezcla se deja agitar durante 24 horas, se transfiere a tubos de dialisis (corte 12.000 Da) y se dializa contra NaCl 0,1 M (2 cambios) y contra agua desionizada hasta que se consigue una conductividad de 4 pS a 4 °C. Finalmente, la solucion se filtra en filtros Millipore de 0,45 pm y se liofiliza.

30

Ejemplo 2: Sintesis de derivados quitosano con celobiosa (en lo sucesivo en el presente documento "Chitcell")

[0068] Se disolvio quitosano (1,5 g, grado de acetilacion al 11 %) en 110 ml de una solucion de metanol (55 ml) y tampon de acido acetico al 1 %, pH 4,5 (55 ml). Se anaden 60 ml de una solucion de metanol (30 ml) y tampon de

35 acido acetico al 1 %, pH 4,5 (30 ml) que contiene celobiosa (2,2 g) y cianoborohidruro sodico (900 mg). La mezcla se deja agitar durante 24 horas, se transfiere a tubos de dialisis (corte 12.000 Da) y se dializa contra NaCl 0,1 M (2 cambios) y contra agua desionizada hasta que se consigue una conductividad de 4 pS a 4 °C. Finalmente, la solucion se filtra en filtros Millipore de 0,45 pm y se liofiliza.

40 Ejemplo 3: Preparacion de nanocompuesto a base de metal con nanoparticulas de plata en Chitlac.

[0069] La nanoparticulas se obtienen tras la reduccion de iones metalicos con acido ascorbico en soluciones de Chitlac de acuerdo con el siguiente procedimiento: Se prepara una solucion acuosa de Chitlac a una concentracion del 0,4 % (p/v). Despues, las soluciones de Chitlac se mezclan con soluciones de nitrato de plata, para obtener una

45 concentracion final de AgNC>3 de 1 mM. Despues, se anade una solucion de acido ascorbico para obtener una concentracion final de 0,5 mM.

Ejemplo 4: Preparacion del nanocompuesto a base de metal con nanoparticulas de plata en Chitcel

50 [0070] La nanoparticulas se obtienen tras la reduccion de iones metalicos con acido ascorbico en soluciones de Chitcel de acuerdo con el siguiente procedimiento: Se prepara una solucion acuosa de Chitcel a una concentracion del 0,4 % (p/v). Despues, las soluciones de Chitcel se mezclan con soluciones de nitrato de plata, para obtener una concentracion final de AgNO3 de 1 mM. Despues, se anade una solucion de acido ascorbico, para obtener una concentracion final igual a 0,5 mM.

55

Ejemplo 5: Preparacion de nanocompuesto a base de metal con nanoparticulas de oro en Chitlac

[0071] La nanoparticulas se obtienen tras la reduccion de iones metalicos por el polisacarido Chitlac de acuerdo con el siguiente procedimiento: Se prepara una solucion acuosa de Chitlac a una concentracion del 0,4 % (p/v).

Despues, la solucion de Chitlac se mezcla con un acido tetracloroaurico para obtener una concentracion final de HAuCl4 de 1 mM.

Ejemplo 6: Preparacion de hidrogeles cilindricos en base a alginato-Chitlac y por medio de gelificacion ”in situ”

5

[0072] A una solucion de Chitlac se le anade una solucion de alginato en presencia de NaCl y tampon Hepes, para obtener las siguientes concentraciones finales: Alginato al 1,5 % (p/v), Chitlac al 0,2 % (p/v), NaCl 0,15 M, tampon Hepes 0,01 M, pH 7,4. Despues, se anade una solucion de CaCO3 (concentracion 30 mM) y posteriormente se anade D-glucono-5-lactona (GDL) ([GDL]/[Ca2+] = 2) para permitir una gelificacion lenta. Para los ensayos

10 antibacterianos, se anade medio Mueller-Hinton al 20 % (4,2 g/l). La solucion final se transfiere a cilindros de plastico dimensionados segun se desee (por ejemplo, 16 mM (0) x 18 mM (h)) y se dejan gelificar en la oscuridad durante 24 horas.

Ejemplo 7: Preparacion de hidrogeles nanocompuestos tridimensionales basados en alginato-Chitlac y 15 nanoparticulas metalicas por medio de gelificacion ”in situ”

[0073] Se anade una solucion de Chitlac con nanoparticulas metalicas preparada de acuerdo con el ejemplo 3 a una solucion de alginato (concentraciones de alginato finales de hasta el 4 % (p/v) y preferiblemente en el intervalo del 1 % (p/v) al 2 % (p/v)) en presencia de CaCO3 (concentracion final de hasta 40 mM y preferiblemente de 15 mM

20 a 30 mM) y despues se anade D-glucono-5-lactona (GDL) ([GDL]/[Ca2+] = 2) para permitir una gelificacion lenta. Para los ensayos antibacterianos, se anade medio Mueller-Hinton final al 20 % (4,2 g/l). Ejemplo 8: Preparacion de hidrogeles nanocompuestos tridimensionales cilindricos basados en alginato-Chitlac y nanoparticulas de plata por medio de gelificacion "in situ” A una solucion de Chitlac con nanoparticulas de plata preparadas de acuerdo con el ejemplo 3, se le anade una solucion de alginato en presencia de NaCl y tampon Hepes para obtener las siguientes 25 concentraciones finales: Alginato al 1,5 % (p/v), Chitlac al 0,2 % (p/v), AgNO3 0,5 mM, C6H8O6 0,25 mM, NaCl 0,15 M, tampon Hepes 0,01 M, pH 7,4). Despues, se anade una solucion de CaCO3 (concentracion 30 mM) y posteriormente se anade D-glucono-5-lactona ([GDL]/[Ca2+] = 2) para permitir una gelificacion lenta. Para los ensayos antibacterianos, se anade medio Mueller-Hinton al 20 % (4,2 g/l). La solucion final se transfiere a cilindros de plastico dimensionados segun se desee (por ejemplo, 16 mM (0) x 18 mM (h)) y se dejan gelificar en la oscuridad 30 durante 24 horas.

[0074] Cabe mencionar que la agregacion de particulas o la separacion de fases polimericas estan ausentes tanto durante como despues de la gelificacion. Como se observa en la figura 1, el material nanocompuesto tridimensional obtenido es un hidrogel de color amarillo-naranja (el color varia dependiendo de la concentracion de plata).

35

Ejemplo 9: Preparacion de hidrogeles tridimensionales cilindricos basados en alginato-Chitlac y nanoparticulas de oro por medio de gelificacion ”in situ”

[0075] A una solucion de Chitlac con nanoparticulas de oro preparada de acuerdo con el ejemplo 5, se le anade 40 una solucion de alginato en presencia de NaCl y tampon Hepes, para obtener las siguientes concentraciones finales:

Alginato al 1,5 % (p/v), Chitlac al 0,2 % (p/v), HAuCU 0,5 mM, NaCl 0,15 M, tampon Hepes 0,01 M, pH 7,4). Despues, se anade una solucion de CaCO3 (concentracion 30 mM) y posteriormente se anade D-glucono-5-lactona (GDL) ([GDL]/[Ca2+] = 2) para permitir una gelificacion lenta. Para los ensayos antibacterianos, se anade medio Mueller-Hinton al 20 % (4,2 g/l). La solucion final se transfiere a cilindros de plastico dimensionados segun se desee 45 (por ejemplo, 16 mM (0) x 18 mM (h)) y se dejan gelificar en la oscuridad durante 24 horas.

[0076] Una muestra de hidrogel nanocompuesto tridimensional obtenido se muestra en la figura 2.

Ejemplo 10: Preparacion de esferas nanocompuestas tridimensionales por medio de una jeringa de soluciones de 50 alginato-Chitlac (en manitol) con nanoparticulas de plata.

[0077] Se preparo una solucion polisacarida con las siguientes concentraciones finales. Alginato al 1,5 % (p/v), Chitlac al 0,2 % (p/v), AgNO3 0,5 mM, C6H8O6 0,25 mM, NaCl 0,15 M, tampon Hepes 0,01 M, pH 7,4. La solucion se anadio por goteo usando una jeringa dotada de una aguja 23G, en una solucion que contenia CaCl2 50 mM y manitol

55 0,15 M, tampon Hepes 10 mM (pH 7,4) en agitacion por medio de una varilla magnetica. Las esferas se mantuvieron en agitacion en el bano de gelificacion durante 10 min antes de eliminarse y lavarse con agua desionizada.

Ejemplo 11: Preparacion de esferas nanocompuestas tridimensionales por medio de una jeringa de soluciones de alginato-Chitlac (en NaCl) con nanoparticulas de plat

[0078] Se preparo una solucion polisacarida con las siguientes concentraciones finales. Alginato al 1,5 % (p/v), Chitlac al 0,2 % (p/v), AgNO3 0,5 mM, C6H8O6 0,25 mM, NaCl 0,15 M, tampon Hepes 0,01 M, pH 7,4. La solucion se anadio por goteo usando una jeringa dotada de una aguja 23G, en una solucion que contenia CaCl2 50 mM y manitol 0,15 M, tampon Hepes 10 mM (pH 7,4) en agitacion por medio de una varilla magnetica. Las esferas se mantuvieron 5 en agitacion en el bano de gelificacion durante 10 min antes de eliminarse y lavarse con agua desionizada.

Ejemplo 12: Preparacion de esferas nanocompuestas tridimensionales por medio de una jeringa de soluciones de alginato-Chitlac con nanoparticulas de oro.

10 [0079] Se preparo una solucion polisacarida con las siguientes concentraciones finales. Alginato al 1,5 % (p/v), Chitlac al 0,2 % (p/v), HAuCU 0,5 mM, NaCl 0,15 M, tampon Hepes 0,01 M, pH 7,4. La solucion se anadio por goteo usando una jeringa dotada de una aguja 23G, en una solucion que contenia CaCl2 50 mM y manitol 0,15 M (bano de gelificacion) en agitacion por medio de una varilla magnetica. Las esferas se mantuvieron en agitacion en el bano de gelificacion durante 10 min antes de eliminarse y lavarse con agua desionizada.

15

Ejemplo 13: Preparacion de microesferas nanocompuestas tridimensionales por medio de un generador de perlas electrostatico a partir de soluciones de alginato-Chitlac con nanoparticulas de plata.

[0080] Se preparo una solucion polisacarida con las siguientes concentraciones finales. Alginato al 1,5 % (p/v), 20 Chitlac al 0,2 % (p/v), AgNO3 0,5 mM, C6H8O6 0,25 mM, NaCl 0,15 M, tampon Hepes 0,01 M, pH 7,4. La solucion se

anadio por goteo en un bano de gelificacion que contenia CaCl2 50 mM y manitol 0,15 nm en agitacion por medio de una varilla magnetica. El tamano de la microesfera se controla usando un generador electrostatico, que permite actuar sobre la tension superficial de las gotas para reducir el tamano de las mismas. Las condiciones empleadas fueron tipicamente: tension 5 kV, diametro interno de la aguja 0,7 mM, distancia entre el bano de gelificacion y la 25 aguja 4 cm, caudal de la solucion polimerica binaria 10 ml/min. Las microesferas se dejaron en la solucion gelificante en agitacion durante 10 min antes de eliminarse y lavarse con agua desionizada.

[0081] Las muestras de microesferas nanocompuestas tridimensionales obtenidas se muestran en la figura 3.

30 Ejemplo 14: Preparacion de microesferas nanocompuestas tridimensionales por medio de un generador de perlas electrostatico a partir de soluciones de alginato-Chitlac con nanoparticulas de oro

[0082] Se preparo una solucion polisacarida con las siguientes concentraciones finales: Alginato al 1,5 % (p/v), Chitlac al 0,2 % (p/v), HAuCU 0,5 mM, NaCl 0,15 M, tampon Hepes 0,01 M, pH 7,4. La solucion se anadio por goteo

35 en un bano de gelificacion que contenia CaCl2 50 mM y manitol 0,15 nm en agitacion por medio de una varilla magnetica.

[0083] El tamano de la microesfera se controla usando un generador de perlas electrostatico, que permite actuar sobre la tension superficial de las gotas para reducir el tamano de las mismas. Las condiciones empleadas son

40 tipicamente: tension 5 kV, diametro interno de la aguja 0,7 mM, distancia entre el bano de gelificacion y la aguja 4 cm, caudal de la solucion polimerica binaria 10 ml/min. La microesferas se dejan en la solucion gelificante en agitacion durante 10 min antes de eliminarse y lavarse con agua desionizada.

Ejemplo 15: Preparacion de hidrogeles nanocompuestos tridimensionales con una alta relacion de 45 superficie/volumen en base a alginato-Chitlac y nanoparticulas de plata por medio de gelificacion ”in situ”.

[0084] A una solucion de Chitlac con nanoparticulas de plata preparadas de acuerdo con el ejemplo 3, se le anade una solucion de alginato en presencia de NaCl y tampon Hepes para obtener las siguientes concentraciones finales: Alginato al 1,5 % (p/v), Chitlac al 0,2 % (p/v), AgNO3 0,5 mM, C6^O6 0,25 mM, NaCl 0,15 M, tampon Hepes 0,01 M,

50 pH 7,4. Despues, se anade una solucion de CaCO3 (concentracion 30 mM) y posteriormente se anade D-glucono-5- lactona (GDL) ([GDL]/[Ca2+] = 2 para permitir una gelificacion lenta. Para los ensayos antibacterianos, se anade medio Mueller-Hinton final al 20 % (4,2 g/l). La solucion final se vierte sobre superficies lisas (portaobjetos, placas de Petri, etc.) y se dejan gelificar en la oscuridad durante 24 horas.

55 Ejemplo 16: Preparacion de peliculas deshidratadas nanocompuestas tridimensionales basadas en alginato-Chitlac y nanoparticulas de plata por medio de gelificacion "in situ”.

[0085] A una solucion de Chitlac con nanoparticulas de plata preparadas de acuerdo con el ejemplo 3, se le anade una solucion de alginato en presencia de NaCl y tampon Hepes para obtener las siguientes concentraciones finales:

Alginato al 1,5 % (p/v), Chitlac al 0,2 % (p/v), AgNO3 0,5 mM, CsHeOs 0,25 mM, NaCI 0,15 M, tampon Hepes 0,01 M, pH 7,4. Despues, se anade una solucion de CaCO3 (concentracion 30 mM) y posteriormente se anade D-glucono-5- lactona (GDL) ([GDL]/[Ca2+] = 2) para permitir una gelificacion lenta. Para los ensayos antibacterianos, se anade medio Mueller-Hinton final al 20 % (4,2 g/l). La solucion final se vierte sobre superficies lisas (portaobjetos, placas de 5 Petri, etc.) y se dejan gelificar en la oscuridad durante 24 horas. Despues, el gel nanocompuesto tridimensional se seca al aire para obtener una pelicula deshidratada solida de nanocompuesto tridimensional.

Ejemplo 17: Preparacion de hidrogeles nanocompuestos tridimensionales con una alta relacion de superficie/volumen en base a alginato-Chitlac y nanoparticulas de oro por medio de gelificacion "in situ”

10

[0086] A una solucion de Chitlac con nanoparticulas de oro preparada de acuerdo con el ejemplo 5, se le anade una solucion de alginato en presencia de NaCl y tampon Hepes para obtener las siguientes concentraciones finales: Alginato al 1,5 % (p/v), Chitlac al 0,2 % (p/v), hAuCU 0,5 mM, NaCl 0,15 M, tampon Hepes 0,01 M, pH 7,4. Despues, se anade una solucion de CaCO3 (concentracion 30 mM) y posteriormente se anade D-glucono-5-lactona (GDL)

15 ([GDL]/[Ca2+] = 2) para permitir una gelificacion lenta. Para los ensayos antibacterianos, se anade medio Mueller- Hinton final al 20 % (4,2 g/l). La solucion final se vierte sobre superficies lisas (portaobjetos, placas de Petri, etc.) y se dejan gelificar en la oscuridad durante 24 horas.

Ejemplo 18: Preparacion de peliculas nanocompuestas tridimensionales basadas en alginato-Chitlac y 20 nanoparticulas de oro por medio de gelificacion ”in situ”

[0087] A una solucion de Chitlac con nanoparticulas de oro preparada de acuerdo con el ejemplo 5, se le anade una solucion de alginato en presencia de NaCl y tampon Hepes para obtener las siguientes concentraciones finales: Alginato al 1,5 % (p/v), Chitlac al 0,2 % (p/v), hAuCU 0,5 mM, NaCl 0,15 M, tampon Hepes 0,01 M, pH 7,4. Despues,

25 se anade una solucion de CaCO3 (concentracion 30 mM) y posteriormente se anade D-glucono-5-lactona (GDL) ([GDL]/[Ca2+] = 2) para permitir una gelificacion lenta. Para los ensayos antibacterianos, se anade medio Mueller- Hinton final al 20 % (4,2 g/l). La solucion final se vierte sobre superficies lisas (portaobjetos, placas de Petri, etc.) y se dejan gelificar en la oscuridad durante 24 horas. Despues, el gel nanocompuesto tridimensional se seca al aire para obtener una pelicula solida nanocompuesta tridimensional.

30

Ejemplo 19: Preparacion de microesferas

[0088] Las microesferas de los ejemplos especificos 13 y 14 mencionados anteriormente se prepararon de acuerdo con metodos conocidos y en particular: a) usando jeringas, con las que las soluciones de un polisacarido

35 anionico y un derivado de nanocompuesto a base de metal mono u oligosacarido de quitosano con nanoparticulas metalicas se anaden por goteo en un bano de gelificacion adecuado, b) usando un generador de perlas electrostatico, desarrollado por el Prof. Gudmund Skjak-Br»k del Institute of Biotechnology de la NTNU University of Trondheim (Noruega) y descrito por Strand y col., 2002, J. of Microencapsulation 19, 615-630. Tal aparato consiste en un generador electrostatico de perlas con una tension ajustable (hasta 10 kV) por medio de un conmutador 40 adecuado, conectado a un soporte de aguja esterizable en autoclave contenido en un soporte de seguridad de Plexiglas.

[0089] Por medio de un sistema fuera del soporte, que consiste en una jeringa ajustada por una bomba y conectada a un tubo hecho de celosia que tiene un diametro interno de 1 mm, la solucion de inicio se vierte por

45 goteo en un cristalizador (dentro del soporte) que contiene la solucion gelificante, en la que se inserta un electrodo. El instrumento genera una diferencia de potencial constante entre la punta de la aguja y la superficie libre de la solucion gelificante, que se puede ajustar y oscila entre 0 y 10 kV. La diferencia de potencial provoca la separacion repentina de la gota de polimero (cargada negativamente) de la punta de la aguja y permite asi tener capsulas incluso con tamanos pequenos (<200 pm). Los tamanos de capsula pueden ajustarse incluso variando otros 50 factores, tales como el diametro interno de la aguja, la distancia de la aguja respecto a la superficie de la solucion gelificante, el caudal del polimero.

Ejemplo 20: Preparacion de cilindros

55 [0090] Los cilindros de gel y los discos de los ejemplos especificos 6, 8 y 9 mencionados anteriormente se prepararon vertiendo la solucion que contenia los polisacaridos y el nanocompuesto a base de metal en recipientes en forma de cilindro. El tamano cilindrico del hidrogel depende del tamano de estos ultimos. Las dimensiones del recipiente en forma de cilindro son tipicamente de 18 mm de altura y 16 mm de diametro interno, mientras que las de recipientes discoides tienen 8 mm de altura y 16 mm de diametro interno, incluso si se permiten totalmente tamanos

diferentes (altura y diametro interno).

Ejemplo 21: Caracterizaciones biologicas 5 A. Actividad antibacteriana

[0091] Para ensayar la actividad antibacteriana de geles nanocompuestos tridimensionales, se esparcieron diferentes cepas bacterianas a diversas concentraciones sobre las superficies de gel. Se ensayaron tanto cepas Gram negativas (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa) como cepas Gram positivas (Staphylococcus aureus,

10 Staphylococcus epidermidis). Los controles se representan por geles de agar y geles de alginato-Chitlac sin nanoparticulas (geles AC). Despues de una incubacion "nocturna", las colonias bacterianas son claramente evidentes en los controles pero estan completamente ausentes en los geles que contienen nanoparticulas (geles AC-nAg) (figura 4), demostrando asi la eficacia de la accion bactericida realizada por estos materiales.

15 [0092] Ademas, se preparan microesferas de gel nanocompuesto que contienen nanoparticulas de plata (AC-nAg) y se ponen en contacto con soluciones bacterianas (Escherichia coli); el control se representa por microesferas de gel de alginato-Chitlac (sin nanoparticulas de plata). Los resultados demuestran que la concentracion de colonias bacterianas aumenta el control pero disminuye en mas de tres unidades logaritmicas en el caso de microesferas con nanoparticulas de plata.

20

[0093] Incluso las microesferas nanocompuestas obtenidas de acuerdo con el ejemplo 13 y los hidrogeles nanocompuestos obtenidos de acuerdo con los ejemplos 6 y 9 demostraron ser capaces de ejercer una accion antimicrobiana eficaz, como se muestra en las figuras 5 y 6, respectivamente.

25 B. Citotoxicidad

[0094] Se realizaron ensayos para evaluar la citotoxicidad del gel sobre lineas celulares eucariotas, tales como osteoblastos (MG63), hepatocitos (HEPG2) y fibroblastos (3T3). En el ensayo, se evalua la liberacion de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) por las celulas, que esta relacionada con el dano celular y la muerte. Los ensayos de

30 LDH demuestran que estos geles nanocompuestos tridimensionales no causan efectos citotoxicos en las celulas ensayadas, como puede observarse en la figura 7, por ejemplo, en el caso de fibroblastos. De hecho, despues de 24 y 72 horas no se encuentran diferencias significativas en la liberacion de lactato deshidrogenasa (LDH) entre las celulas tratadas con AC-nAg y los controles (es decir, celulas tratadas con geles de alginato-Chitlac y celulas no tratadas).

35

[0095] Se dan resultados comparables en el caso de geles a base de alginato-Chitlac de nanocompuestos tridimensionales similares que contienen nanoparticulas de oro (geles AC-nAu); como se observa en la figura 8, este tipo de gel no es citotoxico tampoco para las celulas eucariotas.

40 [0096] La combinacion de estos resultados permite concluir que el nanocompuesto tridimensional de acuerdo con la invencion, tal como hidrogeles a base de alginato-Chitlac que contienen nanoparticulas formadas y estabilizadas en Chitlac, se proporcionan con una estructura homogenea en la que las nanoparticulas no se agregan y tienen una fuerte actividad bactericida, sin ser toxicos para las celulas eucariotas. Estos nuevos sistemas nanocompuestos tridimensionales ofrecen las siguientes ventajas:

45

- el desarrollo de un sistema integrado que combina la capacidad de los derivados ramificados del quitosano de formar y estabilizar nanoparticulas metalicas con actividad bactericida, con las propiedades biologicas ya demostradas en la estimulacion celular por las cadenas laterales oligosacaridas de tales derivados de quitosano (Marsich y col., "Alginate/lactose-modified chitosan hydrogels: A bioactive

50 biomaterial for chondrocyte encapsulation", Journal of biomedical materials research-Part A, 2008 Feb;

84(2): 364-76). Este nuevo enfoque "Glico-Nanotecnologico" proporcionara nuevos instrumentos para el diseno de materiales, que exploten la bioactividad proporcionada por el componente "glicobiologico" y las propiedades especiales de las nanoparticulas;

- la posibilidad de preparar geles tridimensionales con una composicion mixta de i) polisacaridos neutros o

55 anionicos e ii) derivados cationicos ramificados mono o oligosacaridos de quitosano que atrapan

nanoparticulas metalicas, explotando la miscibilidad total en condiciones apropiadas entre dos polimeros que pertenecen por separado a cada una de las dos clases i) e ii), aunque tienen cargas opuestas (para los polianiones de la clase i) y a pesar de la presencia de nanoparticulas metalicas. Por otra parte, como se conoce, los fenomenos de coacervacion con polisacarido anionico, y en particular con alginato, se producen

usando otros polimeros cationicos no ramificados no oligosacaridos, tal como quitosano;

- se ha descubierto que los geles nanocompuestos obtenidos no son toxicos para las celulas eucariotas aunque tengan una fuerte actividad bactericida;

- el metodo de gelificacion utilizado permite obtener materiales con formas y tamanos que pueden ser

5 adecuados para las diferentes necesidades de aplicacion (por ejemplo, peliculas humedas y secas,

soportes, microesferas, fibras, etc.).

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un material nanocompuesto tridimensional que comprende una matriz polimerica que consiste en al menos un polisacarido liotropo, termotropo o termo-liotropo, neutro o anionico, y un nanocompuesto a base de metal que

   5 consiste en al menos un polisacarido ramificado cationico que atrapa uniformemente nanopartfculas metalicas, en el que el polisacarido neutro o anionico se gelifica por medio de agentes de gelificacion qufmicos o ffsicos adecuados.
2. 2. El material nanocompuesto tridimensional de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que los polisacaridos ramificados cationicos son derivados ramificados de quitosano, en el que las unidades de D-Glucosamina que

   10 forman la cadena lineal de quitosano unen, por medio del grupo funcional -NH- en el atomo de carbono C2, residuos

   imagen1

   15

   - R es -CH2- o -CO-;

   - Ri es hidrogeno, un monosacarido, o un oligosacarido;

   - R2 es -OH o -NHCOCH3.

   20 3. El material nanocompuesto tridimensional de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que los residuos de polioles alditolicos o aldonicos son residuos de mono u oligosacaridos que comprenden de 1 a 3 unidades glicosfdicas.
3. 4. El material nanocompuesto tridimensional de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que, cuando Ri es un monosacarido, dicho monosacarido se selecciona del grupo que consiste en galactosa, glucosa, manosa, N-acetil

   25 glucosamina, y N-acetil galactosamina.
4. 5. El material nanocompuesto tridimensional de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que los residuos de polioles alditolicos o aldonicos se seleccionan del grupo que consiste en residuos de lactosa, celobiosa, celotriosa, maltosa, maltotriosa, quitobiosa, quitotriosa, manobiosa y acidos aldonicos de los mismos.

   30
5. 6. El material nanocompuesto tridimensional de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que los derivados ramificados de quitosano tienen un grado de sustitucion qufmica del Grupo amina de la unidad de D-Glucosamina mayor del 40 % y hasta del 80 %.

   35 7. El material nanocompuesto tridimensional de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que las nanopartfculas metalicas comprendidas en el nanocompuesto a base de metal con polisacaridos ramificados cationicos son de metales seleccionados del grupo que consiste en plata, oro, platino, paladio, cobre, cinc, nfquel, y mezclas de los mismos.

   40 8. El material nanocompuesto tridimensional de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que las nanopartfculas tienen un tamano medio comprendido en el intervalo de 5 nm a 150 nm.
6. 9. El material nanocompuesto tridimensional de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la masa de metal en mg

   por g de polisacarido cationico esta comprendida en el intervalo de 3.000 mg/g a 0,3 mg/g.
7. 10. El material nanocompuesto tridimensional de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que las relaciones en peso de los polisacaridos neutros o anionicos con respecto a polisacaridos ramificados cationicos que comprenden las

   5 nanoparticulas metalicas estan comprendidas en el intervalo de 8:1 a 1:1 (polisacaridos neutros o anionicos:polisacaridos cationicos).
8. 11. Los materiales nanocompuestos tridimensionales de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-10, en los que las matrices polimericas son hidrogeles o matrices no hidratadas.

   10
9. 12. Los materiales nanocompuestos tridimensionales de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-11, en los que las matrices polimericas estan en diferentes formas seleccionadas de entre forma de cilindro, microesferas, soportes, placas de gel, peliculas y fibras.

   15 13. Un material nanocompuesto tridimensional de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-12, para su uso como un agente antimicrobiano.
10. 14. El material nanocompuesto tridimensional de acuerdo con la reivindicacion 13, para su uso en la cicatrizacion de heridas.

    20
11. 15. El material nanocompuesto tridimensional de acuerdo con la reivindicacion 13, para su uso en aplicaciones quirurgicas.
12. 16. El material nanocompuesto tridimensional de acuerdo con la reivindicacion 13, para su uso en aplicaciones 25 agricolas y alimentarias.
13. 17. Un metodo para preparar materiales nanocompuestos tridimensionales de acuerdo con las reivindicaciones 1-12, caracterizado por que dichos materiales nanocompuestos tridimensionales pueden obtenerse preparando soluciones acuosas de mezclas de al menos un polisacarido liotropo, termotropo o termo-liotropo, neutro o anionico,

    30 y de un nanocompuesto a base de metal que consiste en al menos un polisacarido ramificado cationico que atrapa uniformemente nanoparticulas metalicas, en el que dichas soluciones acuosas tienen una fuerza ionica de al menos 50 mM y no superior a 350 mM, y un pH de al menos 7, y tratando dichas soluciones acuosas con agentes quimicos o fisicos capaces de gelificar los polisacaridos liotropos, termotropos o termo-liotropos, neutros o anionicos.

    35 18. El metodo para preparar los materiales nanocompuestos tridimensionales de acuerdo con la reivindicacion 17, en el que las soluciones acuosas tienen una osmolaridad comprendida en el intervalo de 250 a 300 mM.
14. 19. El metodo para preparar los materiales nanocompuestos tridimensionales de acuerdo con la reivindicacion 17, en el que los agentes de gelificacion para los polisacaridos liotropos o termo-liotropos son soluciones acuosas de

    40 sales de iones seleccionados de iones monovalentes, divalentes o trivalentes que tienen concentraciones de 10 mM y hasta 100 mM.
15. 20. El metodo para preparar los materiales nanocompuestos tridimensionales de acuerdo con la reivindicacion 17, en el que los agentes de gelificacion para los polisacaridos termotropos o termo-liotropos tienen temperaturas

    45 comprendidas en el intervalo de 10 °C a 40 °C.
16. 21. El metodo para preparar los materiales nanocompuestos tridimensionales de acuerdo con la reivindicacion 17, en el que las concentraciones polimericas de polisacaridos neutros o anionicos son mayores del 1,5 % y hasta del 4 % (p/v).