ITPD20080220A1 - Materiali nanocompositi formati da una matrice polisaccaridica e nanoparticelle metalliche, loro preparazione ed uso - Google Patents
Materiali nanocompositi formati da una matrice polisaccaridica e nanoparticelle metalliche, loro preparazione ed usoInfo
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Description
Descrizione dell'invenzione industriale dal titolo:
“MATERIALI NANOCOMPOSITI FORMATI DA UNA MATRICE POLISACCARIDICA E NANOPARTICELLE METALLICHE, LORO PREPARAZIONE ED USOâ€
Campo dell'invenzione
La presente invenzione à ̈ relativa a materiali nanocompositi formati da una matrice polimerica consistente in una composizione polisaccaridica tra polisaccaridi neutri o anionici e polisaccaridi cationici ramificati, in cui nanoparticelle metalliche sono disperse uniformemente e stabilizzate, alla loro preparazione ed uso in campo biomedico, farmaceutico ed alimentare.
Stato della tecnica
I polisaccaridi naturali, essendo in generale polimeri biocompatibili, sono materiali molto studiati e già da tempo impiegati per applicazioni in campo biomedico, ad esempio nella veicolazione di composti biologicamente attivi o di cellule per l'ingegneria tissutale. Tra quelli più usati sia nell'industria farmaceutica che alimentare si possono citare gli alginati ed il chitosano per la loro abbondanza ed il relativo basso costo.
Questi polisaccaridi sono infatti particolarmente vantaggiosi dal punto di vista applicativo sia per il fatto che sono biocompatibili sia per il fatto che possono dare origine a matrici tridimensionali in forma di idrogel in opportune condizioni con elevati contenuti di acqua. Tuttavia, il chitosano mostra dei limiti applicativi legati alla dipendenza della solubilità in acqua dal pH, alla sua immiscibilità con altri polisaccaridi anionici come l'alginato, con i quali dà origine in soluzioni acquose a coacervati non utilizzabili ai fini applicativi, ed al fatto che non porta segnali specifici per le cellule. Per questo motivo si stanno studiando e sviluppando derivati del chitosano che possano superare i limiti sopra citati, essendo il chitosano un polisaccaride disponibile in grandi quantità e sicuramente biocompatibile.
Negli ultimi anni, diversi derivati del chitosano sono stati ottenuti attraverso modificazioni chimiche della catena polimerica. Comunemente, per queste modificazioni vengono sfruttate reazioni a carico dei residui amminici delle unità di glucosammina costituenti la catena lineare del chitosano. In particolare, l'introduzione di unità saccaridiche (mono- e oligosaccaridi) in catena laterale ha reso possibile l'ottenimento di derivati del chitosano solubili in acqua senza la necessità dell'abbassamento del pH a valori acidi, con possibili conseguenti problemi di degradazione del polimero, per ottenerla.
Nel brevetto US 4,424,346 (Hall, L.D. e Yalpani, M.) viene descritta, per la prima volta, la sintesi di questi derivati e ne viene descritta la solubilità in ambiente acquoso non acido. In particolare, nel brevetto US 4,424,346 viene menzionato che il derivato del chitosano con lattosio dà gel rigidi in soluzioni acquose a concentrazioni superiori al 3-5%, mentre non gelifica né precipita in miscela con sali o acidi (in particolare cloruri di Ca, Cr, Zn, cromato di K, acido borico) e loro combinazioni. Ancora, nel brevetto citato si menziona il fatto che il chitosano derivatizzato con un altro oligosaccaride, il cellobiosio, non forma di per sé gel in soluzioni acquose, mentre forma gel rigidi in miscela con alginato. Questa formazione di gel à ̈ dovuta alla forte interazione tra le cariche positive del policatione e quelle negative del polianione che porta alla coacervazione del sistema, processo che comunque costituisce un limite nel suo impiego ad esempio per la microincapsulazione di materiali biologici come cellule.
Nella domanda di brevetto WO2007/135116 (Paoletti S. et al.) vengono descritte miscele polimeriche di polisaccaridi anionici e cationici, le metodologie di preparazione delle stesse per ovviare al problema della coacervazione tra i polisaccaridi acidi e basici dovuta alla forte interazione tra le cariche prima menzionati ed il loro impiego applicativo in campo biomedico, in particolare nel campo delle patologie articolari.
Inoltre, nella domanda di brevetto WO2007/135114 (Paoletti S. et al.) vengono descritti idrogeli e le relative metodologie di preparazione degli stessi dalle miscele polimeriche di polisaccaridi anionici e cationici summenzionate gelificate con opportuni agenti gelificanti allo scopo di incapsulare cellule e molecole farmacologicamente attive (in soluzione o in sospensione) per l'uso in campo biomedico e farmaceutico.
Un'altra area di ricerca di notevole interesse nanotecnologico e di grande attualità per i polisaccaridi à ̈ il loro impiego per la preparazione di materiali nanocompositi comprendenti nanoparticelle metalliche. Infatti al fine di stabilizzare le nanoparticelle si possono utilizzare soluzioni di polisaccaridi che permettono di ottenere sistemi nanocompositi in cui le particelle metalliche risultano essere omogeneamente disperse grazie alle interazioni con le catene polimeriche. Il ruolo dei polisaccaridi à ̈ quindi legato alla formazione e stabilizzazione delle nanoparticelle metalliche in previsione di poterne sfruttare le particolari proprietà ; à ̈ infatti noto che le nanoparticelle metalliche sono dotate di particolari proprietà ottiche, catalitiche ed antimicrobiche.
Infatti, l'utilizzo di metalli come argento, oro, rame, zinco e nichel nel campo dei materiali antimicrobici sta avendo un forte impatto sul mercato soprattutto per il trattamento di lesioni topiche. Aziende come Johnson&Johnson<©>e Convatec<©>hanno recentemente commercializzato medicazioni che si basano sulle proprietà antibatteriche di nanoparticelle di argento.
Materiali nanocompositi basati su polisaccaridi idonei a garantire l'attività antimicrobica acclarata di questi metalli, ed adatti ad esempio per lo sviluppo di garze, bendaggi, cerotti con attività antimicrobica ad ampio spettro o gel ad elevato contenuto di acqua con attività battericida, potrebbero trovare analoghe applicazioni. Infatti, il bisogno di disporre di nuovi presidi terapeutici per il trattamento di lesioni della cute o delle mucose, come ustioni e ulcere, à ̈ un bisogno ancora sentito, essendo queste lesioni molto spesso resistenti alle terapie antibiotiche correntemente in uso e necessitando anche di ulteriori effetti biologici di tipo riparativo tissutale ad esempio di promozione della proliferazione cellulare e/o opportuna idratazione del tessuto. La struttura tridimensionale di un idrogel può essere particolarmente vantaggiosa soprattutto per questo secondo aspetto potendo garantire un adeguato ambiente per la replicazione cellulare senza interferire con il fenotipo cellulare.
Infatti, la possibilità di ottenere strutture idratate tridimensionali risulta particolarmente allettante anche per applicazioni di ingegneria tissutale dove à ̈ desiderabile associare proprietà bioattive tipiche dei polisaccaridi ad attività antimicrobica. Nel settore dell'ingegneria tissutale si sta effettuando molta ricerca per realizzare rivestimenti antimicrobici su biomateriali da introdurre all'interno del corpo umano; in questo caso il maggior fattore di rischio à ̈ legato alla possibile citotossicità degli agenti antimicrobici stessi. Nel campo della chirurgia ortopedica, ad esempio, gli interventi di sostituzione articolare protesica e l'osteosintesi di fratture non esposte rappresentano un tipo di chirurgia per definizione pulita per quanto concerne le infezioni chirurgiche (Tucci G. et al., Giornale Italiano di Ortopedia e Traumatologia, 2005;31:121-129). Tuttavia il posizionamento di biomateriali all'interno di tessuti dell'ospite à ̈ in grado di favorire l'insorgenza ed il mantenimento di infezioni anche per cariche batteriche piuttosto modeste. Nonostante i progressi nella profilassi perioperatoria, restano molto frequenti contaminazioni batteriche e fungine nei pazienti impiantati; ciò à ̈ dovuto al rischio protratto nel tempo di un'adesione di questi microrganismi al dispositivo ortopedico (Zimmerli W. et al., New England J. Med., 2004; 351(16):1645-54). Questi dati dimostrano l'importanza dello sviluppo di agenti antimicrobici alternativi da associare a biomateriali di nuova generazione.
Il brevetto US 7255881 (Gillis et al.) fornisce una possibile soluzione ai problemi sopra evidenziati. Nel brevetto sono descritti infatti rivestimenti a base di argento formati su vari tipi di substrato attraverso tecniche quali le deposizioni chimiche e fisiche da fase vapore (“chemical vapour deposition†CVD, “physical vapour deposition†PVD) e in fase liquida per applicazioni antimicrobiche. Circa i substrati polisaccaridici menzionati, su cui l'argento à ̈ depositato, vi sono chitosano, alginato ed acido ialuronico. Si nota che queste tecniche non sono volte alla formazione di nanoparticelle metalliche omogeneamente disperse all'interno di opportune matrici, ma riguardano la formazione di strati superficiali continui di argento (nanocristallino, policristallino o amorfo). Inoltre le condizioni di temperatura e pressione necessarie per queste tecniche di deposizione non sono compatibili con la stabilità dei polisaccaridi in questione.
Sommario
Un primo scopo della presente invenzione à ̈ l'ottenimento di sistemi nanocompositi tridimensionali, in cui nanoparticelle metalliche di dimensione controllata siano omogeneamente disperse all'interno di matrici polisaccaridiche e le cui proprietà si prestino particolarmente ad applicazioni biologiche in campo biomedico.
Un ulteriore scopo à ̈ che tale nanocomposito sia ottenibile attraverso un approccio chimico non complesso ed economicamente conveniente, ed in particolare, ma non esclusivamente, mediante la realizzazione di idrogeli biocompatibili e bioattivi.
È un ulteriore scopo mettere a punto tali sistemi con l'impiego di polisaccaridi facilmente disponibili in commercio e senza che tali polisaccaridi siano soggetti a manipolazioni chimiche, come pure senza che siano necessarie complesse manipolazioni preparative di tali sistemi.
Per il conseguimento degli scopi sopra menzionati gli inventori hanno sviluppato opportuni sistemi polisaccaridici basati su composizioni almeno binarie comprendenti polisaccaridi neutri o anionici, preferibilmente di origine algale, e polisaccaridi cationici a struttura ramificata che consentono di intrappolare nanoparticelle metalliche in cui tali polisaccaridi formano matrici solide tridimensionali (idrogeli di diverse forme, microsfere, scaffold), fibrose e/o a sviluppo superficiale (film umidi o disidratati).
Pertanto in un primo aspetto sono oggetto dell'invenzione materiali nanocompositi comprendenti una matrice polimerica formata da almeno un polisaccaride neutro o anionico, liotropico, termotropico o termo-liotropico, e da almeno un polisaccaride cationico a struttura ramificata, comprendente nanoparticelle metalliche uniformemente disperse e stabilizzate, in cui il polisaccaride neutro o anionico à ̈ gelificato con opportuni agenti gelificanti, fisici o chimici a seconda del tipo di polisaccaride neutro o anionico stesso.
E' stato possibile miscelare questi sistemi di polisaccaridi cationici allo stato liquido contenenti nanoparticelle con soluzioni di polisaccaridi neutri o anionici lavorando ad un opportuno valore del pH e forza ionica al fine di non causare la formazione di coacervati; sfruttando poi la capacità del polisaccaride neutro o acido di formare gel ionotropici o termotropici con opportuni agenti gelificanti si à ̈ riusciti ad ottenere matrici tridimensionali, anche in forma di idrogeli, formati da miscele di tali polisaccaridi neutri o anionici e di quelli basici a struttura ramificata contenenti nanoparticelle metalliche uniformemente disperse e stabilizzate nel polisaccaride basico a struttura ramificata stesso.
Pertanto in un secondo aspetto, l'invenzione ha per oggetto un metodo di preparazione di materiali nanocompositi comprendenti una matrice polimerica formata da almeno un polisaccaride neutro o anionico, liotropico, termotropico o termo-liotropico, e da almeno un polisaccaride cationico a struttura ramificata comprendente nanoparticelle metalliche uniformemente disperse e stabilizzate, caratterizzato dal fatto che detti materiali nanocompositi sono ottenibili miscelando soluzioni acquose di almeno un polisaccaride neutro o anionico, liotropico, termotropico o termo-liotropico, e di almeno un polisaccaride cationico ramificato comprendente le nanoparticelle metalliche, in cui tali soluzioni acquose in miscela hanno una forza ionica di almeno 50 mM e non superiore a 350 mM ed un pH almeno di 7 ed in cui tali soluzioni acquose in miscela sono trattate con agenti gelificanti chimici o fisici capaci di gelificare i polisaccaridi neutri o anionici liotropici, termotropici o termo-liotropici. Preferibilmente tali soluzioni acquose hanno una una osmolarità compresa tra 250 e 300mM.
Sono ancora oggetto dell'invenzione quindi i materiali nanocompositi ottenibili con tale metodo di preparazione.
Inoltre, i materiali nanocompositi secondo l'invenzione hanno dimostrato di possedere una marcata attività antimicrobica ad ampio spettro e di non avere effetti di tipo citotossico.
Pertanto, sono un ulteriore oggetto dell'invenzione l'uso di tali materiali nanocompositi in campo biomedico, in particolare per applicazioni antimicrobiche. Per i materiali compositi a struttura tridimensionale oggetto della presente invenzione si prospettano infatti utili applicazioni come biomateriali in campo terapeutico sia dermatologico (ad esempio ulcerazioni cutanee di ordine vascolare-metabolico) che ortopedico (ad esempio rivestimenti di protesi ossee), odontoiatrico (trattamento di infezioni da patogeni paradontali), cardiologico, urologico (rivestimenti di stent) e di chirurgia generale.
Breve descrizione delle figure
Figura 1: la figura mostra un idrogel contenente nanoparticelle di argento (nAg) a base di Alginato (A) e derivato del chitosano con lattosio (C: di seguito indicato come Chitlac) (AC-nAg gel). La composizione à ̈: Chitlac 0,2% (p/V), alginato 1,5% (p/V), AgNO30,5mM, C6H8O60,25 mM, Hepes 10mM, CaCO330mM, GDL (D-glucono-Î ́-lattone) 60mM. La preparazione à ̈ descritta nell'esempio 8.
Figura 2: la figura mostra un test di crescita batterica di E. coli ATCC 25922 su idrogel di Alginato-Chitlac (AC gel, esempio 6, sinistra) in confronto a idrogel di Alginato-Chitlac-nAg (AC-nAg gel, esempio 8, destra).
Figura 3: la figura mostra un test di citotossicità su linee di fibroblasti (NIH-3T3), espresso come rilascio di LDH (lattico deidrogenasi), di AC-nAg gels, (esempio 8, rette diagonali) per contatto, e del relativo estratto dopo 24 e 72 ore in terreno a 37°C. I controlli sono rappresentati dalle cellule in adesione (controllo, pieno), cellule in contatto con gel di Alginato-Chitlac privi di nanoparticelle di argento (AC GEL, esempio 6, rette orizzontali), estratto da gel di Alginato-Chitlac privi di nanoparticelle di argento (AC GEL Estratto, maglie ortogonali).
Figura 4: la figura mostra microsfere AC-nAg gel (Chitlac 0,2% (p/V), alginato 1,5% (p/V), AgNO30,5mM, C6H8O60,25 mM, Hepes 10mM, CaCO330mM, GDL 60mM). La preparazione à ̈ descritta nell'esempio 13.
Figura 5: la figura mostra un test di conta delle colonie batteriche di E. coli ATCC 25922 in contatto con una sospensione contenente microsfere AC-nAg per 240min. La preparazione delle microsfere à ̈ descritta nell'esempio 13. Il controllo à ̈ rappresentato dalla crescita in terreno Mueller-Hinton 20% (T 0 e 240 min).
Figura 6: la figura mostra un idrogel contenente nanoparticelle d'oro (nAu) a base di Alginato e Chitlac (AC-nAu gel). La composizione à ̈: Chitlac 0,2% (p/V), alginato 1,5% (p/V), HAuCl40,5mM, Hepes 10mM, CaCO330mM, GDL 60mM). La preparazione à ̈ descritta nell'esempio 9.
Figura 7: la figura mostra un test di crescita batterica di E. coli ATCC 25922 su idrogel di Alginato-Chitlac (AC gel, esempio 6, sinistra) in confronto a idrogel di Alginato-Chitlac-nAu (AC-nAg gel, esempio 9, destra).
Figura 8: la figura mostra un test di citotossicità (LDH) su linee di osteoblasti (MG63), espresso come rilascio di LDH (lattico deidrogenasi), di AC-nAu gel (es.
9, AC-nAu Cont.) per contatto, e del relativo estratto (AC-nAu Est.) dopo 24 e 72 ore in terreno a 37°C. I controlli sono rappresentati dalle cellule in adesione (Adesione), cellule in contatto con gel di Alginato-Chitlac privi di nanoparticelle di argento (esempio 6, AC Cont.), estratto da gel di Alginato-Chitlac privi di nanoparticelle di argento (AC Est), cellule a contatto con dischi di polistirene (PS, controllo negativo del sistema in contatto), cellule a contatto con dischi di poliuretano (PU, controllo positivo del sistema in contatto), cellule con una soluzione di Triton (controllo positivo dell'estratto).
Descrizione dettagliata dell'invenzione
Definizioni
Idrogeli: strutture semisolide (o matrici tridimensionali) altamente idratate in grado di mantenere forma e dimensione quando non soggette a deformazione. Possono essere ottenute a partire da soluzioni concentrate di polisaccaridi opportunamente reticolati.
Nanocomposito: sistema costituito da particelle di dimensioni nanometriche (filler) all'interno di un materiale macroscopico (matrix). Nella presente domanda le nanoparticelle metalliche sono disperse in matrici polisaccaridiche cationiche costituite preferibilmente da derivati aldonici o alditolici oligosaccaridici del chitosano.
Soluzione colloidale (o colloide): sistema in cui particelle di dimensioni comprese tra 1 e 1'000 nm sono disperse in un mezzo solvente continuo.
Gelificazione “in situ†: metodo di gelificazione in cui c'à ̈ un rilascio controllato dell'agente gelificante (ad es. per l'alginato lo ione Ca<2+>). Ciò à ̈ ottenuto utilizzando una forma inattivata dell'agente gelificante (ad es. CaCO3) che viene poi liberato a seguito dell'aggiunta di un secondo componente (ad es. glucono- Î ́-lattone, GDL). Gli scopi e i vantaggi dei materiali nanocompositi descritti nella presente invenzione saranno meglio compresi nel corso della descrizione dettagliata seguente dove, a titolo esemplificativo ma non limitativo dell'invenzione, saranno descritti alcuni esempi di preparazione di idrogeli nanocompositi e la loro caratterizzazione biologica per valutare attività antibatterica e citotossicità .
Descrizione
Per gli scopi perseguiti si à ̈ affrontato l'aspetto relativo alla preparazione e caratterizzazione di un sistema nanocomposito a base di polisaccaridi in cui si sfruttano proprietà associate alla nano-scala di nanoparticelle metalliche.
Secondo l'invenzione i materiali nanocompositi sono formati da una matrice polimerica consistente in una composizione di almeno un polisaccaride neutro o anionico, liotropico, termotropico o termo-liotropico, ed almeno un polisaccaride cationico a struttura ramificata, nella quale nanoparticelle metalliche sono uniformemente disperse e stabilizzate in tale polisaccaride cationico a struttura ramificata. Tale composizione di polisaccaridi à ̈ preferibilmente binaria ed à ̈ formata da polisaccaridi acidi in grado di dare origine a gel liotropici scelti nel gruppo consistente in alginati, pectati, pectinati, o da polisaccaridi neutri in grado di dare origine a gel termotropici ed in questo caso sono preferibilmente scelti nel gruppo consistente in agarosio, scleroglucano, schizofillano, curdlano o da polisaccaridi acidi in grado di dare origine a gel termo-liotropici ed in questo caso sono preferibilmente scelti nel gruppo consistente in agarosio solfato, ι- e κcarragenano, cellulosa solfato, gellano, ramsano, welano, xantano.
Il peso molecolare medio (MW) dei polisaccaridi neutri o acidi può arrivare fino a 2'000kDa e preferibilmente essere compreso da 100kDa a 1'000kDa e più preferibilmente sono utilizzati pesi molecolari medi di 200kDa.
Come noto, tali polisaccaridi neutri o anionici hanno la caratteristica di formare gel in opportune condizioni. Infatti l'aspetto relativo alla formazione degli idrogel à ̈ sostanzialmente correlato alla capacità di tali polisaccaridi neutri o acidi di formare idrogeli istantaneamente a contatto con soluzioni di ioni per i polisaccaridi liotropici, o con soluzioni raffreddate per i polisaccaridi termotropici. Nel caso dei polisaccaridi acidi termo-liotropici, gli agenti gelificanti possono essere sia fisici che chimici e quindi essere o ioni o opportune temperature.
L'aspetto relativo alla formazione e veicolazione delle nanoparticelle metalliche invece à ̈ sostanzialmente legato alla seconda componente polisaccaridica e cioà ̈ ai polisaccaridi basici a struttura ramificata. Per gli scopi della presente invenzione questi sono derivati alditolici od aldonici del chitosano in cui unità di D-Glucosammina formanti la catena lineare del chitosano legano mediante il gruppo funzionale –NH– residui uguali o diversi tra di loro mono od oligosaccaridici rappresentati dalla formula generale (I)
in cui:
- R può essere –CH2– oppure –CO–;
- R1può essere idrogeno oppure un monosaccaride scelto tra galattosio, glucosio o N-acetilglucosammina oppure un oligosaccaride;
- R2può essere -OH oppure -NHCOCH3.
Allo scopo di rappresentazione le unità di D-Glucosammina sostituite con residui mono od oligosaccaridici nei derivati del chitosano oggetto dell'invenzione sono rappresentabili dalla formula generale (II)
Preferibilmente i residui mono od oligosaccaridici di formula generale (I) sono oligosaccaridi comprendenti preferibilmente da 1 a 3 unità glicosidiche e secondo un aspetto più preferito tali oligosaccaridi comprendono da 2 a 3 unità glicosidiche e ancora più preferibilmente sono scelti nel gruppo consistente in lattosio, cellobiosio, cellotriosio, maltosio, maltotriosio, maltotetraosio, chitobiosio, chitotriosio, mannobiosio nonché dei loro corrispondenti acidi aldonici. Per gli scopi della presente invenzione il derivato oligosaccaridico del chitosano più preferito à ̈ il derivato con il lattosio (Chitlac; CAS registry number 85941-43-1).
Inoltre, per poter disperdere in modo uniforme e stabilizzare le nanoparticelle metalliche il grado di sostituzione dei gruppi amminici del chitosano con tali oligosaccaridi deve essere almeno del 40%. Preferibilmente, il grado di sostituzione dei gruppi amminici del chitosano con gli oligosaccaridi à ̈ compreso nell'intervallo da 50% a 80% e più preferibilmente à ̈ del 70%.
Il peso molecolare medio (di seguito codificato in MW) del chitosano impiegabile per l'ottenimento dei derivati oligosaccaridici menzionati può arrivare sino a 1'500kDa ed essere preferibilmente compreso nell'intervallo da 400kDa a 700kDa. Le nanoparticelle metalliche incorporate nella matrice polimerica costituita da tali derivati oligisaccaridici del chitosano sono di metalli scelti preferenzialmente tra argento, oro, platino, palladio, rame, zinco, nichel e miscele degli stessi.
Le nanoparticelle incluse nella matrice polimerica costituita dai derivati oligosaccaridici del chitosano possono avere una dimensione media controllata attorno a 50nm, ed in particolare la dimensione delle nanoparticelle metalliche à ̈ compresa tra 5nm e 150nm.
Una caratteristica essenziale di tali nanoparticelle à ̈ il fatto che tali nanoparticelle sono per lo più metalli nella loro forma ridotta, senza peraltro escludere la presenza residuale di cluster di pochi atomi con carattere ionico, e che nella loro dispersione/stabilizzazione nella matrice polisaccaridica sono coinvolte le catene laterali degli oligosaccaridi in prossimità dei gruppi amminici del chitosano stesso. Pur senza essere vincolati a questi, i rapporti preferiti tra polisaccaridi della matrice e metalli sono riferiti a nanocompositi in forma di soluzioni colloidali, benché questi materiali nanocompositi possano essere anche in forma di film o polvere disidratati ed anche dializzati per eliminare i contro-ioni residui della preparazione dei materiali stessi. Nei nanocompositi secondo l'invenzione in forma di soluzioni acquose colloidali i rapporti tra concentrazione, espressa in % (p/v) del polisaccaride e concentrazione, espressa in molarità , del sale metallico di partenza sono compresi tra 0,0025% (p/v)e 20% (p/v) e preferibilmente à ̈ di 0,2% (p/v).
Pertanto, la massa di metallo, espressa in mg, che si può incorporare per grammo di polisaccaride può essere compresa tra 3'000mg/g e tra 0,3 mg/g e preferenzialmente à ̈ di 50mg di metallo incorporati per grammo di polisaccaride. Tale componente dei materiali nanocompositi secondo l'invenzione può essere preparata in opportune condizioni con soluzioni acquose di tali polisaccaridi basici in presenza ed assenza di agenti riducenti esogeni.
Il metodo di preparazione di questa componente dei materiali nanocompositi secondo l'invenzione comprende almeno:
a) la preparazione di soluzioni acquose di polisaccaridi basici a struttura ramificata ad una concentrazione sino al 2% (p/v);
b) la preparazione di soluzioni acquose di sali di metalli ad una concentrazione compresa tra 0,1mM e 20mM;
c) addizione di tali soluzioni di sali alle soluzioni di polisaccaridi e miscelazione sino all'ottenimento di soluzioni colloidali in cui nanoparticelle metalliche sono omogeneamente disperse.
Opzionalmente alle soluzioni colloidali ottenute à ̈ aggiunto un agente riducente. Il metodo di preparazione à ̈ nelle sue caratteristiche generali il seguente: si preparano soluzioni acquose di tali derivati del chitosano a diverse concentrazioni (fino al 2% (p/v), preferibilmente comprese nell'intervallo da 0,05% (p/v) a 1% (p/v) e più preferibilmente sono dello 0,2%. Le soluzioni di polisaccaridi vengono in seguito miscelate a soluzioni di sali di metalli scelti tra argento, oro, platino, palladio, rame, zinco, nichel, preferibilmente scelti tra cloruri, perclorati e nitrati (ad esempio AgNO3, HAuCl4, CuSO4, ZnCl2, NiCl2), in modo da ottenere concentrazioni finali comprese nell'intervallo tra 0,1mM e 20mM, più preferibilmente comprese nell'intervallo 1mM – 14mM e ancora più preferibilmente di 1 mM di tali metalli. Opzionalmente si possono aggiungere alle soluzioni opportuni agenti riducenti noti, preferibilmente scelti tra acido ascorbico, citrato di sodio, sodio boroidruro e sodio cianoboroidruro, per ottenere nanoparticelle allo stato metallico. L'agente riducente à ̈ aggiunto a concentrazioni comprese tra 0,05mM e 10mM e preferibilmente la concentrazione à ̈ di 0,5mM.
Si à ̈ però trovato che diversamente che per altri sistemi polimerici i nanocompositi formati da derivati del chitosano e nanoparticelle metalliche possono essere preparati anche in assenza di agenti riducenti, poiché le catene laterali di oligosaccaride agiscono di per sé da agente riducente per gli ioni metallici e consentono la formazione di nanoparticelle disperse nella matrice polimerica. In questo caso le nanoparticelle metalliche sono ottenibili per semplice miscelazione di soluzioni di derivati del chitosano con soluzioni di sali del metallo scelto in opportune concentrazioni. Le concentrazioni di polisaccaridi e sali di metalli sono anche in questo caso come in precedenza riportato.
In entrambi i casi comunque grazie alle proprietà chimiche e chimico-fisiche degli atomi di azoto e dei sostituenti laterali presenti sul derivato oligosaccaridico del chitosano, gli ioni metallici interagiscono con le macromolecole tramite interazioni di coordinazione, mentre la presenza delle catene laterali degli oligosaccaridi, ad esempio lattosio, offre un efficace impedimento sterico tale da ostacolare la naturale tendenza delle nanoparticelle ad aggregare. La successiva riduzione degli ioni, sia dovuta ad un agente riducente esogeno sia dovuta alle catene di oligosaccaride, porta alla formazione di nanoparticelle stabilizzate dalle catene polisaccaridiche.
I rapporti tra la massa di argento che si può incorporare e quella del polisaccaride, espressi in mg per grammo, sono in entrambi i casi come riportato in precedenza. Inaspettatamente si à ̈ trovato che miscelando soluzioni acquose della componente polimerica costituita dai polisaccaridi neutri o acidi precedentemente menzionati, ed in particolare gli alginati, e della componente polimerica polisaccaridica basica comprendente le nanoparticelle metalliche avente già di per sé natura di materiale nanocomposito, i materiali che si ottengono sono matrici tridimensionali o idrogel stabili e non hanno natura di coacervati, nonostante la presenza delle nanoparticelle metalliche.
La formazione dell'idrogel o della matrice tridimensionale à ̈ ottenibile infatti dalla miscelazione dei due componenti polisaccaridici in soluzioni acquose aventi opportune caratteristiche mediante successivo trattamento delle stesse con opportuni agenti capaci di gelificare il polisaccaride anionico o neutro.
In particolare, i materiali nanocompositi comprendenti una matrice polimerica formata da almeno un polisaccaride neutro o anionico, liotropico, termotropico o tremo-liotropico, e da almeno un polisaccaride cationico a struttura ramificata comprendente nanoparticelle metalliche uniformemente disperse e stabilizzate, sono ottenibili da miscele di soluzioni acquose degli stessi aventi una forza ionica almeno di 50 mM e non superiore a 350 mM ed un pH almeno di 7 mediante trattamento di tali miscele con agenti gelificanti chimici o fisici capaci di gelificare i polisaccaridi neutri o anionici, liotropici, termotropici o tremo-liotropici, compresi nelle miscele stesse.
Le condizioni preferenziali (sostanzialmente concentrazioni, pH, forza ionica) per l'ottenimento delle matrici tridimensionali o degli idrogeli a partire da questi due componenti sono tipicamente soluzioni acquose aventi un pH compreso in un intervallo fisiologico, ed in particolare compreso tra 7 e 8 e più preferibilmente il pH à ̈ uguale a 7,4, ed una osmolarità compresa tra 250 e 300mM con una forza ionica compresa tra 50mM e 350mM, e preferibilmente di 150mM, ottenuta preferibilmente per aggiunta di NaCl in concentrazioni comprese tra 0,05M e 0,35M e più preferibilmente di 0,15M.
Gli agenti gelificanti possono essere scelti a seconda del tipo di polisaccaride anionico liotropico tra opportuni ioni monovalenti, bivalenti o trivalenti e per polisaccaridi termotropici tra temperature non superiori a 50°C oppure non inferiori a 10°C. Per i polisaccaridi termo-liotropici gli agenti gelificanti possono essere come noto sia agenti chimici come ioni, che agenti fisici come la temperatura. La scelta tra i due tipi di agenti gelificanti dipende sostanzialmente dal polisaccaride acido termo-liotropico da gelificare.
Per polisaccaridi quali l'alginato ed il pectato tali ioni sono ioni alcalino-terrosi, con esclusione del magnesio, e metalli di transizione e preferibilmente scelti nel gruppo consistente in calcio, bario, stronzio, piombo, rame, manganese e loro miscele, oppure sono ioni delle terre rare e preferibilmente scelti nel gruppo consistente in gadolinio, terbio, europio e loro miscele.
Le concentrazioni delle soluzioni acquose di tali ioni adatte alla gelificazione sono superiori a 10mM e preferibilmente comprese tra 10mM e 100mM e più preferibilmente di 50mM. Preferibilmente, la soluzione gelificante contiene una concentrazione di CaCl2pari a 50mM e una forza pari a 0.075M.
Nel caso dei carragenani sono utilizzabili ioni alcalini scelti preferibilmente nel gruppo consistente in potassio, rubidio e cesio, a concentrazioni non inferiori a 50mM e preferibilmente comprese tra 50mM e 200mM e più preferibilmente di 0.1M.
Nel caso di soluzioni polisaccaridiche che portano a idrogeli termotropici, come ad esempio l'agarosio, la preparazione idrogeli viene eseguita tramite raffreddamento, al di sotto della temperatura di formazione del gel. Le soluzioni polisaccaridiche vengono preparate ad una temperatura al di sopra della temperatura di formazione dell'idrogelo da parte del polisaccaride termotropico. A questa temperatura il polisaccaride termotropico non forma idrogeli. Preferibilmente la temperatura a cui vengono preparate le soluzioni polisaccaridiche à ̈ compresa nell'intervallo da 50°C a 30°C e più preferibilmente à ̈ di 37°C. La formazione dell'idrogelo avviene facendo gocciolare la soluzione polisaccaridica in un bagno gelificante raffreddato ad una temperatura inferiore a quella di formazione del gel. Preferibilmente, questa temperatura à ̈ compresa nell'intervallo da 10°C a 40°C e più preferibilmente à ̈ di 20°C.
Per gli scopi della presente invenzione le miscele almeno binarie di polisaccaride neutro o anionico e polisaccaride basico a struttura ramificata comprendente le nanoparticelle metalliche possono avere concentrazioni polimeriche complessive di polisaccaride neutro o anionico sino a al 4% (p/v). Preferibilmente tali concentrazioni polimeriche complessive sono comprese nell'intervallo da 1,5% e 3% (p/v) e più preferibilmente sono del 2% (p/v).
Per gli scopi della presente invenzione i rapporti in peso tra polisaccaridi acidi e polisaccaridi basici, comprendenti le nanoparticelle metalliche, sono comprese tra 8:1 e 1:1 (polisaccaride neutro o anionico:polissaccaride cationico) e preferibilmente compreso tra 8:1 e 5:1 e più preferibilmente di 7,5:1.
I materiali nanocompositi dell'invenzione sono ottenibili quindi secondo un metodo di preparazione che comprende almeno le seguenti fasi:
i. preparazione di una soluzione acquosa di una miscela di almeno un polisaccaride neutro o anionico, liotropico, termotropico o termo-liotropico, e di almeno un derivato oligosaccaridico del chitosano comprendente nanoparticelle metalliche (preparato come in precedenza riportato), avente detta soluzioni acquosa una forza ionica almeno di 50mM e non superiore a 350mM ed almeno un pH di 7;
ii. gelificazione del polisaccaride neutro o anionico, liotropico, termotropici o termo-liotropico, mediante trattamento della soluzione acquosa della miscela preparata al punto precedente con opportuni agenti gelificanti chimici o fisici, ad esempio mediante gocciolamento attraverso un ago in una soluzione contenente lo ione reticolante per i polisaccaridi anionici liotropici o in una soluzione ad una opportuna temperatura per i polisaccaridi termotropici, o mediante gelificazione “in situ†. Per i polisaccaridi termo-liotropici possono essere impiegate sia soluzioni ioniche che soluzioni ad opportune temperature per il processo di gelificazione. Con la metodica sopra descritta si possono ottenere materiali nanocompositi in cui la matrice polimerica formata dai polisaccaridi à ̈ tridimensionale ed à ̈ in forma di idrogel o non idrata se sottoposta a successivi processi di disidratazione. Tali matrici inoltre possono assumere varie forme come cilindri, microsfere, dischi, film essiccati, polveri, od essere estrusi per produrre fibre.
Nel caso dell'alginato, i cilindri possono essere preparati addizionando una forma inattiva dello ione reticolante, ad esempio CaCO3o il complesso Ca-EDTA, alla soluzione polisaccaridica. Viene poi addizionata una sostanza che si idrolizzi lentamente, come ad esempio il GDL (D-glucono-Î ́-lattone). Questa sospensione viene trasferita ad esempio all'interno dei contenitori cilindrici o discoidali e lì mantenuta per 24h. I cilindri di gel delle soluzioni polisaccaridiche binarie sono quindi estratti dai contenitori. Questa metodologia viene descritta come formazione di cilindri per rilascio di calcio in situ.
Per testare l'attività antimicrobica dei gel contenenti nanoparticelle metalliche sono stati condotti test di crescita batterica su supporto semisolido e test di conta delle colonie batteriche in presenza di microsfere di gel; à ̈ stato dimostrato che grazie alla presenza delle nanoparticelle i batteri non crescono né sulla superficie dei gel né in sospensione a contatto con le microsfere di gel, evidenziando quindi una marcata attività antibatterica.
Test di citotossicità su diverse linee cellulari eucariotiche dimostrano che questi gel nanocompositi non risultano essere citotossici pur mantenendo una efficace azione battericida.
A scopo illustrativo e non limitativo, di seguito à ̈ descritta in generale la preparazione di idrogeli o matrici 3D secondo l'invenzione anche in forma di microsfere e cilindri e l'attività biologica di tipo antimicrobico trovata.
Preparazione di idrogeli nanocompositi da una soluzione di un polisaccaride anionico e un derivato oligosaccaridico del chitosano con nanoparticelle metalliche Esempio 1: sintesi di derivati del chitosano con lattosio (di seguito “Chitlac†) Il chitosano (1,5g, grado di acetilazione 11%) viene disciolto in 110 mL di una soluzione di metanolo (55mL) e un tampone di acido acetico all'1% a pH 4,5 (55mL). Si aggiungono 60 mL di una soluzione di metanolo (30mL) e di tampone di acido acetico all'1% a pH 4,5 (30mL) contenente lattosio (2,2 g) e sodio cianoboroidruro (900mg). La miscela viene lasciata in agitazione per 24 ore, trasferita in tubi da dialisi (cut off 12'000Da) e dializzata contro NaCl 0,1M (2 cambi) e contro acqua deionizzata fino ad avere una conducibilità di 4µS a 4°C. Infine, la soluzione viene filtrata su filtri Millipore 0,45µm e liofilizzata.
Esempio 2: sintesi di derivati del chitosano con cellobiosio (di seguito “Chitcell†) Il chitosano (1,5g, grado di acetilazione 11%) viene disciolto in 110 mL di una soluzione di metanolo (55mL) e un tampone di acido acetico all'1% a pH 4,5 (55mL). Si aggiungono 60 mL di una soluzione di metanolo (30mL) e di tampone di acido acetico all'1% a pH 4,5 (30mL) contenente cellobiosio (2,2 g.) e sodio cianoboroidruro (900mg). La miscela viene lasciata in agitazione per 24 ore, trasferita in tubi da dialisi (cut off 12'000Da) e dializzata contro NaCl 0,1M (2 cambi) e contro acqua deionizzata fino ad avere una conducibilità di 4µS a 4°C. Infine, la soluzione viene filtrata su filtri Millipore 0,45µm e liofilizzata.
Esempio 3: Preparazione delle nanoparticelle di argento in Chitlac.
Le nanoparticelle si ottengono in seguito alla riduzione degli ioni metallici con acido ascorbico in soluzioni di Chitlac secondo la seguente procedura: si prepara una soluzione acquosa di Chitlac alla concentrazione di 0,4 % (p/V). Le soluzioni di Chitlac vengono in seguito miscelate a soluzioni di nitrato di argento in modo da ottenere una concentrazione finale di AgNO3pari 1 mM. Successivamente viene aggiunta una soluzione di acido ascorbico in modo da ottenere una concentrazione finale pari a 0,5 mM.
Esempio 4: Preparazione delle nanoparticelle di argento in Chitcel
Le nanoparticelle si ottengono in seguito alla riduzione degli ioni metallici con acido ascorbico in soluzioni di Chitcel secondo la seguente procedura: si prepara una soluzione acquosa di Chitcel alla concentrazione di 0,4 % (p/v). Le soluzioni di Chitcel vengono in seguito miscelate a soluzioni di nitrato di argento in modo da ottenere una concentrazione finale di AgNO3pari 1 mM. Successivamente viene aggiunta una soluzione di acido ascorbico in modo da ottenere una concentrazione finale pari a 0,5 mM.
Esempio 5: Preparazione delle nanoparticelle di oro in Chitlac
Le nanoparticelle si ottengono in seguito alla riduzione degli ioni metallici ad opera del polisaccaride Chitlac secondo la seguente procedura: si prepara una soluzione acquosa di Chitlac a concentrazione 0,4 % (p/V). La soluzione di Chitlac viene in seguito miscelata a una soluzione di acido tetracloroaurico in modo da ottenere una concentrazione finale di HAuCl4pari a 1 mM.
Esempio 6: Preparazione di idrogeli cilindrici a base di alginato-Chitlac e mediante gelificazione “in situâ€
Ad una soluzione di Chitlac si aggiunge una soluzione di alginato in presenza di NaCl ed Hepes in modo da ottenere le seguenti concentrazioni finali: alginato 1,5% (p/V), Chitlac 0,2% (p/V), NaCl 0,15M, Hepes 0.01M, pH 7,4). In seguito si aggiunge una soluzione di CaCO3(concentrazione 30mM) e successivamente si aggiunge D-glucono-Î ́-lactone (GDL) ([GDL]/[Ca<2+>]=2) per permettere una lenta gelificazione. Per i test antibatterici viene aggiunto terreno Mueller-Hinton al 20% finale (4,2 g/L). La soluzione finale viene trasferita in cilindri in plastica di dimensione a piacere (ad es. 16mm (Ã ̃) X 18mm (h)) e lasciata gelificare al buio per 24 ore.
Esempio 7: Preparazione di idrogeli nanocompositi a base di alginato-Chitlac e nanoparticelle metalliche mediante gelificazione “in situâ€
Una soluzione di Chitlac con nanoparticelle metalliche preparata secondo gli esempi 3 viene aggiunta ad una soluzione di alginato (concentrazioni finali di alginato fino a 4%(p/v) e preferibilmente comprese nell'intervallo tra 1%(p/v) e 2%(p/V)) in presenza di CaCO3(concentrazione finale fino 40mM e preferibilmente compresa tra 15 mM e 30mM) e successivamente si aggiunge D-glucono-Î ́lactone (GDL) ([GDL]/[Ca<2+>]= 2) per permettere una lenta gelificazione. Per i test antibatterici viene aggiunto terreno Mueller-Hinton al 20% finale (4,2 g/L).
Esempio 8: Preparazione di idrogeli cilindrici a base di alginato-Chitlac e nanoparticelle di argento mediante gelificazione “in situâ€
Ad una soluzione di Chitlac con nanoparticelle di argento preparata secondo l'esempio 3 si aggiunge una soluzione di alginato in presenza di NaCl ed Hepes in modo da ottenere le seguenti concentrazioni finali: alginato 1,5% (p/v), Chitlac 0,2% (p/v), AgNO30,5 mM, C6H8O60,25 mM, NaCl 0,15M, Hepes 0,01M, pH 7,4). In seguito si aggiunge una soluzione di CaCO3(concentrazione 30mM) e successivamente si aggiunge D-glucono-Î ́-lactone (GDL) ([GDL]/[Ca<2+>]=2) per permettere una lenta gelificazione. Per i test antibatterici viene aggiunto terreno Mueller-Hinton al 20% finale (4,2 g/L). La soluzione finale viene trasferita in cilindri in plastica di dimensione a piacere (ad es. 16mm (Ã ̃) X 18mm (h)) e lasciata gelificare al buio per 24 ore.
Esempio 9: Preparazione di idrogeli cilindrici a base di alginato-Chitlac e nanoparticelle di oro mediante gelificazione “in situâ€
Ad una soluzione di Chitlac con nanoparticelle di oro preparata secondo l'esempio 5 si aggiunge una soluzione di alginato in presenza di NaCl ed Hepes in modo da ottenere le seguenti concentrazioni finali: alginato 1,5% (p/v), Chitlac 0,2% (p/v), HAuCl40,5 mM, NaCl 0,15M, Hepes 0,01M, pH 7,4). In seguito si aggiunge una soluzione di CaCO3(concentrazione 30mM) e successivamente si aggiunge D-glucono-Î ́-lactone (GDL) ([GDL]/[Ca<2+>]=2) per permettere una lenta gelificazione. Per i test antibatterici viene aggiunto terreno Mueller-Hinton al 20% (4,2 g/L). La soluzione finale viene trasferita in cilindri in plastica di dimensione a piacere (ad es. 16mm (Ã ̃) X 18mm (h)) e lasciata gelificare al buio per 24 ore.
Un campione di idrogel ottenuto à ̈ mostrato in figura 6.
Esempio 10: preparazione mediante siringa di sfere da soluzioni di alginato-Chitlac (in mannitolo) con nanoparticelle di argento
È stata preparata una soluzione polisaccaridica con le seguenti concentrazioni finali: alginato 1,5% (p/v), Chitlac 0,2 % (p/v), AgNO30,5 mM, C6H8O60,25 mM, NaCl 0,15M, Hepes 0,01M, pH 7,4. La soluzione à ̈ stata fatta gocciolare, utilizzando una siringa equipaggiata con ago da 23G, in una soluzione contenente CaCl250mM e mannitolo 0,15M, Hepes 10mM (pH 7,4) sotto agitazione tramite una barra magnetica. Le sfere sono state mantenute in agitazione nel bagno gelificante per 10 minuti prima di essere rimosse e lavate con acqua deionizzata. Esempio 11: preparazione mediante siringa di sfere da soluzioni (in NaCl) di alginato-Chitlac con nanoparticelle di argento
È stata preparata una soluzione polisaccaridica con le seguenti concentrazioni finali: alginato 1,5% p/V, Chitlac 0,2 % (p/v), AgNO30,5 mM, C6H8O60,25 mM, NaCl 0,15M, Hepes 0,01M, pH 7,4. La soluzione à ̈ stata fatta gocciolare, utilizzando una siringa equipaggiata con ago da 23G, in una soluzione contenente CaCl250mM, NaCl 0,15M, Hepes 10mM (pH 7,4) sotto agitazione tramite una barra magnetica. Le sfere sono state mantenute in agitazione nel bagno gelificante per 10 minuti prima di essere rimosse e lavate con acqua deionizzata. Esempio 12: preparazione mediante siringa di sfere da soluzioni di alginato-Chitlac con nanoparticelle di oro
È stata preparata una soluzione polisaccaridica con le seguenti concentrazioni finali: alginato 1,5% (p/v), Chitlac 0,2 % (p/v), HAuCl40,5 mM, NaCl 0,15M, Hepes 0,01M, pH 7,4. La soluzione à ̈ stata fatta gocciolare, utilizzando una siringa equipaggiata con ago da 23G, in una soluzione contenente CaCl250mM e mannitolo 0,15M (bagno gelificante) sotto agitazione tramite una barra magnetica. Le sfere sono state mantenute in agitazione nel bagno gelificante per 10 minuti prima di essere rimosse e lavate con acqua deionizzata.
Esempio 13: preparazione mediante generatore elettrostatico (Electrostatic Bead Generator) di microsfere da soluzioni di alginato-Chitlac con nanoparticelle di argento
È stata preparata una soluzione polisaccaridica con le seguenti concentrazioni finali: alginato 1,5% (p/v), Chitlac 0,2 % (p/v), AgNO30,5 mM, C6H8O60,25 mM, NaCl 0,15M, Hepes 0,01M, pH 7,4. La soluzione à ̈ stata fatta gocciolare in un bagno gelificante contenente CaCl250mM e mannitolo 0,15M sotto agitazione tramite una barra magnetica.
La dimensione delle microsfere viene controllata attraverso l'utilizzo di un generatore elettrostatico che permette di agire sulla tensione superficiale delle gocce in modo da ridurne le dimensioni. Tipicamente le condizioni utilizzate erano: voltaggio 5kV, diametro interno dell'ago 0,7mm, distanza tra bagno gelificante e ago 4cm, velocità di flusso della soluzione polimerica binaria 10mL/min. Le microsfere sono state lasciate nella soluzione gelificante sotto agitazione per 10 minuti prima di essere rimosse e lavate con acqua deionizzata.
Campioni di microsfere ottenute sono mostrate in figura 4.
Esempio 14: preparazione mediante generatore elettrostatico (Electrostatic Bead Generator) di microsfere da soluzioni di alginato-Chitlac con nanoparticelle di oro È stata preparata una soluzione polisaccaridica con le seguenti concentrazioni finali: alginato 1,5% (p/v), Chitlac 0,2 % (p/v), HAuCl40,5 mM, NaCl 0,15M, Hepes 0,01M, pH 7,4. La soluzione à ̈ stata fatta gocciolare in un bagno gelificante contenente CaCl250mM e mannitolo 0,15M sotto agitazione tramite una barra magnetica.
La dimensione delle microsfere viene controllata attraverso l'utilizzo di un generatore elettrostatico che permette di agire sulla tensione superficiale delle gocce in modo da ridurne le dimensioni. Tipicamente le condizioni utilizzate erano: voltaggio 5kV, diametro interno dell'ago 0,7mm, distanza tra bagno gelificante e ago 4cm, velocità di flusso della soluzione polimerica binaria 10mL/min. Le microsfere sono state lasciate nella soluzione gelificante sotto agitazione per 10 minuti prima di essere rimosse e lavate con acqua deionizzata.
Esempio 15: Preparazione mediante gelificazione “in situ†di idrogeli a sviluppo superficiale a base di alginato-Chitlac e nanoparticelle di argento
Ad una soluzione di Chitlac con nanoparticelle di argento preparata secondo l'esempio 3 si aggiunge una soluzione di alginato in presenza di NaCl ed Hepes in modo da ottenere le seguenti concentrazioni finali: alginato 1,5% (p/v), Chitlac 0,2 % (p/v), AgNO30,5 mM, C6H8O60,25 mM, NaCl 0,15M, Hepes 0,01M, pH 7,4). In seguito si aggiunge una soluzione di CaCO3(concentrazione 30mM) e successivamente si aggiunge D-glucono-Î ́-lactone (GDL) ([GDL]/[Ca<2+>]=2 per permettere una lenta gelificazione. Per i test antibatterici viene aggiunto terreno Mueller-Hinton al 20% finale (4,2 g/L). La soluzione finale viene versata su superfici lisce (vetrini, piastre di Petri, etc.) e lasciata gelificare al buio per 24 ore. Esempio 16: Preparazione mediante gelificazione “in situ†di film a base di alginato-Chitlac e nanoparticelle di argento
Ad una soluzione di Chitlac con nanoparticelle di argento preparata secondo l'esempio 3 si aggiunge una soluzione di alginato in presenza di NaCl ed Hepes in modo da ottenere le seguenti concentrazioni finali: alginato 1,5% (p/v), Chitlac 0,2% (p/v), AgNO30,5 mM, C6H8O60,25 mM, NaCl 0,15M, Hepes 0.01M, pH 7,4. In seguito si aggiunge una soluzione di CaCO3(concentrazione 30mM) e successivamente si aggiunge D-glucono-Î ́-lactone (GDL) ([GDL]/[Ca<2+>]=2 per permettere una lenta gelificazione. Per i test antibatterici viene aggiunto terreno Mueller-Hinton al 20% finale (4,2 g/L). La soluzione finale viene versata su superfici lisce (vetrini, piastre petri, etc.) e lasciata gelificare al buio per 24 ore. Successivamente il gel viene essiccato all'aria in modo da ottenere un film solido. Esempio 17: Preparazione mediante gelificazione “in situ†di idrogeli a sviluppo superficiale a base di alginato-Chitlac e nanoparticelle di oro
Ad una soluzione di Chitlac con nanoparticelle di argento preparata secondo l'esempio 3 si aggiunge una soluzione di alginato in presenza di NaCl ed Hepes in modo da ottenere le seguenti concentrazioni finali: alginato 1,5% (p/V), Chitlac 0,2 % (p/v), HAuCl40,5 mM, NaCl 0,15M, Hepes 0,01M, pH 7,4. In seguito si aggiunge una soluzione di CaCO3(concentrazione 30mM) e successivamente si aggiunge D-glucono-Î ́-lactone (GDL) ([GDL]/[Ca<2+>]=2 per permettere una lenta gelificazione. Per i test antibatterici viene aggiunto terreno Mueller-Hinton al 20% finale (4,2 g/L). La soluzione finale viene versata su superfici lisce (vetrini, piastre petri etc.) e lasciata gelificare al buio per 24 ore.
Esempio 18: Preparazione mediante gelificazione “in situ†di film a base di alginato-Chitlac e nanoparticelle di oro
Ad una soluzione di Chitlac con nanoparticelle di argento preparata secondo l'esempio 3 si aggiunge una soluzione di alginato in presenza di NaCl ed Hepes in modo da ottenere le seguenti concentrazioni finali: alginato 1,5% (p/v), Chitlac 0,2 % (p/v), HAuCl40,5 mM, NaCl 0,15M, Hepes 0,01M, pH 7,4. In seguito si aggiunge una soluzione di CaCO3(concentrazione 30mM) e successivamente si aggiunge D-glucono-Î ́-lactone (GDL) ([GDL]/[Ca<2+>]= )2 per permettere una lenta gelificazione. Per i test antibatterici viene aggiunto terreno Mueller-Hinton al 20% finale (4,2 g/L). La soluzione finale viene versata su superfici lisce (vetrini, piastre petri, etc.) e lasciata gelificare al buio per 24 ore. Successivamente il gel viene essiccato all'aria in modo da ottenere un film solido.
Esempio 19: Preparazione di microsfere
Le microsfere degli esempi particolari 13 e 14 sopra riportati sono state preparate secondo metodi noti ed in particolare: a) mediante l'utilizzo di semplici siringhe con cui le soluzioni binarie di un polisaccaride anionico ed un derivato oligosaccaridico del chitosano con nanoparticelle metalliche sono fatte gocciolare manualmente in un opportuno bagno gelificante, b) utilizzando un Electronic Bead Generator, sviluppato dal Prof. Gudmund SkjÃ¥k-Bræk dell'Institute of Biotechnology dell'Università NTNU di Trondheim (Norvegia) descritto da Strand et al., 2002, J. of Microencapsulation 19, 615-630. Tale apparato à ̈ costituito da un generatore elettrostatico con un voltaggio regolabile (fino a 10kV) tramite un opportuno interruttore, collegato ad un supporto per ago autoclavabile contenuto in una gabbia di sicurezza in plexiglass.
Attraverso un sistema esterno alla gabbia, costituito da una siringa regolata da una pompa e collegata ad un tubo in lattice dal diametro interno di 1 mm, la soluzione di partenza viene fatta gocciolare in un cristallizzatore (all'interno della gabbia) contenente la soluzione gelificante nella quale viene inserito un elettrodo. Lo strumento genera una differenza di potenziale costante fra la punta dell'ago e la superficie libera della soluzione gelificante, che può essere regolata e che varia da 0 a 10 kV. La differenza di potenziale provoca il distacco repentino della goccia di polimero (carico negativamente) dalla punta dell'ago e permette quindi di avere capsule anche di piccole dimensioni (<200 µm). Le dimensioni delle capsule possono essere regolate anche variando altri fattori, quali il diametro interno dell'ago, la distanza dell'ago dalla superficie della soluzione gelificante, la velocità del flusso del polimero.
Esempio 20: Preparazione di cilindri
I cilindri e i dischi di gel degli esempi particolari 6, 8 e 9 sopra riportati sono stati preparati versando la soluzione polisaccaridica binaria contenente le nanoparticelle all'interno di contenitori cilindrici. Le dimensioni degli idrogeli cilindrici dipendono dalla dimensione degli stampi. Tipicamente le dimensioni dei contenitori cilindrici sono 18mm di altezza e 16mm di diametro interno mentre quelle dei contenitori discoidali sono 8mm di altezza e 16mm di diametro interno, anche se diverse dimensioni (altezza e diametro interno) sono possibili.
Esempio 21: Caratterizzazioni biologiche
A. Attività antibatterica
si à ̈ proceduto alla valutazione dell'attività antibatterica degli idrogeli nanocompositi. A questo scopo si à ̈ sfruttata la ionotropicità del polisaccaride anionico alginato per la realizzazione di idrogeli misti contenenti Chitlac con nanoparticelle di argento (AC-nAg gels). E' importante sottolineare che non si osservano aggregazione delle particelle o separazione di fase polimerica né durante né dopo la gelificazione. Come si vede nella figura 1 il materiale nanocomposito ottenuto à ̈ un idrogel di colore giallo-arancione (il colore varia in base alla concentrazione di argento). Per testare l'attività antibatterica dei gel, diversi ceppi batterici a varie concentrazioni sono stati strisciati sulla superficie dei gel. Sono stati testati sia ceppi Gram negativi (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa) che ceppi Gram positivi (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis).
I controlli sono rappresentati da gel di agar e gel di alginato-Chitlac senza nanoparticelle (AC gels). Dopo incubazione “overnight†le colonie batteriche sono chiaramente visibili sui controlli ma sono completamente assenti sui gel contenenti nanoparticelle (AC-nAg gels) (figura 2), provando quindi l'efficacia dell'azione battericida esplicata da questi materiali.
Inoltre sono state realizzate microsfere di gel contenenti nanoparticelle d'argento (AC-nAg) e poste a contatto con soluzioni batteriche (Escherichia coli); il controllo à ̈ rappresentato da microsfere di gel alginato-Chitlac (prive di nanoparticelle di argento). I risultati dimostrano che la concentrazione delle colonie batteriche aumenta nel controllo ma diminuisce di più di tre unità logaritmiche nel caso delle microsfere con nanoparticelle di argento.
Anche le microsfere ottenute secondo l'esempio 13 e gli idrogel ottenuti secondo gli esempi 6 e 9 si sono rivelati in grado di esercitare un'efficace azione antimicrobica, come mostrato in figura 5 e 7 rispettivamente.
B. CitotossicitÃ
Sono stati svolti test per valutare citotossicità dei gel nei confronti di linee di cellule eucariote come osteoblasti (MG63), epatociti (HEPG2) e fibroblasti (3T3). Nel test viene misurato il rilascio da parte delle cellule dell'enzima lattato deidrogenasi (LDH) che viene messo in relazione a danno e morte cellulare. I test LDH dimostrano che questi gel nanocompositi non causano effetti citotossici nei confronti delle cellule utilizzate, come si può vedere in figura 3 ad esempio nel caso dei fibroblasti. Infatti dopo 24 e 72 ore non si riscontra una significativa differenza nel rilascio di lattato deidrogenasi (LDH) tra le cellule trattate con AC-nAg ed i controlli (cioà ̈ cellule trattate con il gel alginato-Chitlac e cellule non trattate).
Si riportano risultati comparabili nel caso di gel analoghi a base di alginato e Chitlac contenenti nanoparticelle di oro (AC-nAu gels); come si vede dalla figura 8 anche questo tipo di gel non risulta essere citotossico per le cellule eucariote.
La combinazione di questi risultati permette di concludere che gli idrogeli a base di alginato e Chitlac contenenti le nanoparticelle formate e stabilizzate nel Chitlac sono dotati di struttura omogenea in cui le nanoparticelle non aggregano e possiedono una marcata attività battericida senza tuttavia essere tossici per le cellule eucariotiche.
Esempi di preparazione di idrogeli a partire da miscele polisaccaridiche binarie di chitosani modificati con oligosaccaridi e polisaccaridi liotropici o termotropici in presenza di nanoparticelle metalliche sono di seguito riportati.
Questi nuovi sistemi nanocompositi introducono i seguenti vantaggi:
- lo sviluppo di un sistema integrato che unisce la capacità dei derivati oligosaccaridici del chitosano di formare e stabilizzare nanoparticelle metalliche con attività battericida alle sue già comprovate proprietà biologiche nella stimolazione cellulare del chitosano (Marsich et al., “Alginate/lactose-modified chitosan hydrogels: A bioactive biomaterial for chondrocyte encapsulation†, Journal of biomedical materials research-Part A, 2008 Feb; 84(2):364-76). Questo nuovo approccio “Glico-Nanotecnologico†potrà fornire nuovi strumenti per progettare materiali che sfruttano la bioattività fornita dal componente “glico†e le speciali proprietà delle nanoparticelle;
- la possibilità di preparare gel tridimensionali a composizione mista polisaccaridi neutri o anionici/polisaccaridi cationici derivati oligosaccaridici del chitosano contenenti nanoparticelle metalliche, sfruttando la completa miscibilità in opportune condizioni tra i polimeri appartenenti alle due classi, nonostante questi posseggano cariche opposte (per i polianioni) e nonostante la presenza delle nanoparticelle metalliche. Fenomeni di coacervazione con l'alginato si verificano invece come noto utilizzando altri polimeri cationici come il chitosano;
- i gel nanocompositi ottenuti non risultano essere tossici per le cellule eucariotiche nonostante possiedano una marcata attività battericida;
- il metodo di gelificazione utilizzato consente di ottenere materiali con forme e dimensioni che possono essere adeguate alle diverse esigenze applicative (ad esempio film secchi ed umidi, scaffold, microsfere, fibre, etc..).
Claims (33)
- Rivendicazioni 1. Materiali nanocompositi comprendenti una matrice polimerica formata da almeno un polisaccaride neutro o anionico, liotropico o termotropico o termo-liotropico, e da almeno un polisaccaride cationico a struttura ramificata in cui sono comprese nanoparticelle metalliche, ed in cui il polisaccaride neutro o anionico à ̈ gelificato con opportuni agenti gelificanti chimici o fisici.
- 2. Materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 1, in cui i polisaccaridi anionici liotropici sono scelti nel gruppo consistente in alginati, pectati, pectinati.
- 3. Materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 1, in cui i polisaccaridi neutri termotropici sono scelti nel gruppo consistente in agarosio, scleroglucano, schizofillano e curdlano.
- 4. Materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 1, in cui i polisaccaridi anionici termo-liotropici sono scelti nel gruppo consistente in agarosio solfato, ι- e κ-carragenano, cellulosa solfato, gellano, ramsano, welano, xantano.
- 5. Materiali nanocompositi secondo le rivendicazioni 1-4, in cui i polisaccaridi neutri o anionici hanno un peso molecolare medio (MW) fino a 2'000kDa.
- 6. Materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 5, in cui i polisaccaridi neutri o anionici hanno un peso molecolare medio (MW) compreso tra 100kDa e 1'000kDa.
- 7. Materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 1, in cui i polisaccaridi cationici a struttura ramificata sono derivati alditolici od aldonici del chitosano in cui unità di D-Glucosammina formanti la catena lineare del chitosano legano mediante il gruppo funzionale –NH– residui uguali o diversi tra di loro mono od oligosaccaridici rappresentati dalla formula generale (I) in cui: - R può essere –CH2– oppure –CO–; - R1può essere idrogeno, un monosaccaride scelto tra galattosio, glucosio o N-acetilglucosammina oppure un oligosaccaride; - R2può essere -OH oppure -NHCOCH3.
- 8. Materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 7, in cui i residui oligosaccaridici di formula generale (I) sono scelti nel gruppo consistente in lattosio, cellobiosio, cellotriosio, maltosio, maltotriosio, maltotetraosio, chitobiosio, chitotriosio, mannobiosio ed acidi aldonici degli stessi.
- 9. Materiali nanocompositi secondo le rivendicazioni 7 e 8, in cui i derivati alditolici od aldonici del chitosano hanno un grado di sostituzione del gruppo amminico dell'unità D-Glucosammina almeno del 40%.
- 10. Materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 9, in cui il grado di sostituzione à ̈ compreso tra 50% e 80%.
- 11. Materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 7, in cui il chitosano ha un peso molecolare medio (MW) sino a 1'500kDa.
- 12. Materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 11, in cui il chitosano ha un peso molecolare medio (MW) compreso tra 400KDA e 700kDa.
- 13. Materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 1, in cui le nanoparticelle metalliche comprese nei polisaccaridi basici a struttura ramificata sono di metalli scelti nel gruppo consistente in argento, oro, platino, palladio, rame, zinco, nichel e miscele degli stessi.
- 14. Materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 1, in cui le nanoparticelle metalliche hanno una dimensione media compresa tra 5 nm e 150nm.
- 15. Materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 1, in cui la massa di metallo per grammo di polisaccaride cationico à ̈ compresa tra 3'000mg/g e 0,3 mg/g.
- 16. Materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 15, in cui la massa di metallo in mg per grammo di polisaccaride cationico à ̈ di 50 mg/g.
- 17. Materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 1, in cui i rapporti in peso tra polisaccaridi neutri o anionici e polisaccaridi cationici comprendenti le nanoparticelle metalliche sono compresi tra 8:1 e 1:1 (polisaccaridi neutri o anionici: polisaccaridi cationici).
- 18. Materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 17, in cui i rapporti in peso tra polisaccaridi neutri o anionici e polisaccaridi cationici comprendenti le nanoparticelle metalliche sono compresi tra 8:1 e 5:1.
- 19. Materiali nanocompositi secondo una delle rivendicazioni 1-18 aventi proprietà antimicrobiche.
- 20. Metodo di preparazione di materiali nanocompositi secondo le rivendicazioni 1-18, caratterizzato dal fatto che detti materiali nanocompositi sono ottenibili da soluzioni acquose di miscele di almeno un polisaccaride neutro o anionico, liotropico, termotropico o termo-liotropico, e di almeno un polisaccaride cationico ramificato comprendente le nanoparticelle metalliche, in cui tali soluzioni acquose hanno una forza ionica almeno di 50 mM e non superiore a 350 mM ed un pH almeno di 7 ed in cui tali soluzioni acquose sono trattate con agenti gelificanti chimici o fisici capaci di gelificare i polisaccaridi neutri o anionici liotropici o termotropici o termoliotropici.
- 21. Metodo di preparazione dei materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 20, in cui le soluzioni acquose hanno una osmolarità compresa tra 250 e 300mM.
- 22. Metodo di preparazione preparazione dei materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 20, in cui la forza ionica à ̈ ottenuta per aggiunta di NaCl in concentrazioni comprese tra 0,05M e 0,35M.
- 23. Metodo di preparazione preparazione dei materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 20, in cui per i polisaccaridi liotropici o termo-liotropici gli agenti gelificanti sono soluzioni acquose di sali di ioni scelti tra ioni monovalenti, bivalenti o trivalenti.
- 24. Metodo di preparazione dei materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 23, in cui le concentrazioni di tali soluzioni acquose sono superiori a 10mM.
- 25. Metodo di preparazione preparazione dei materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 24, in cui le concentrazioni di tali soluzioni acquose sono comprese tra 10mM e 100mM.
- 26. Metodo di preparazione preparazione dei materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 20, in cui per i polisaccaridi termotropici o termo-liotropici gli agenti gelificanti sono temperature comprese tra 10°C e 40°C.
- 27. Metodo di preparazione preparazione dei materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 26, in cui la temperatura à ̈ di 20°C.
- 28. Metodo di preparazione secondo la rivendicazione 20, in cui le concentrazioni polimeriche dei polisaccaridi neutri o anionici sono sino al 4% (p/v).
- 29. Metodo di preparazione secondo la rivendicazione 28, in cui le concentrazioni polimeriche sono comprese tra 1,5 e 3% (p/v).
- 30. Materiali nanocompositi ottenibili con il metodo di preparazione secondo una delle rivendicazioni da 20 a 29.
- 31. Materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 30, in cui le matrici polimeriche sono idrogel o matrici non idrate.
- 32. Materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 31, in cui le matrici polimeriche sono in diverse forme scelte tra cilindri, microsfere, scaffold, gel a sviluppo superficiale, film e fibre.
- 33. Uso dei materiali nanocompositi secondo una delle rivendicazioni da 1 a 19 e 30-32 come antimicrobici.
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